1

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего

профессионального образования «Башкирский государственный медицинский

университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

На правах рукописи

Самородова Альбина Илдаровна

ПОИСК НОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ 1-ЭТИЛКСАНТИНА, ВЛИЯЮЩИХ НА

СИСТЕМУ ГЕМОСТАЗА

14.03.06 – Фармакология, клиническая фармакология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научный руководитель:

Камилов Феликс Хусаинович Заслуженный деятель науки РФ и РБ, доктор медицинских наук, профессор Челябинск –

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Сосудисто­тромбоцитарный компонент гемостаза

1.2. Реакция высвобождения тромбоцитов

1.3. Современные антитромбоцитарные препараты

ГЛАВА 2. СКРИНИНГ НОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ 1-ЭТИЛКСАНТИНА, ВЛИЯЮЩИХ

НА СИСТЕМУ ГЕМОСТАЗА

2.1. Материалы и методы исследования

2.2. Определение скрининговой концентрации исследуемых соединений для экспериментов в условиях in vitro

2.3. Функциональная активность тромбоцитов под влиянием производных 1­этилксантина 2.4. Коагуляционный компонент гемостаза под влиянием производных 1­этилксантина.. 2.5. Некоторые закономерности зависимости антиагрегационной и антикоагуляционной активности производных 1­этилксантина от их химической структуры

ГЛАВА 3. ЭФФЕКТИВНОСТЬ ДЕЙСТВИЯ СОЕДИНЕНИЯ М-26 НА

ТРОМБОЦИТАРНЫЙ И КОАГУЛЯЦИОННЫЙ КОМПОНЕНТЫ ГЕМОСТАЗА IN

VITRO

3.1. Материалы и методы исследования

3.2. Действие соединения М­26 на систему гемостаза, регистрируемое методом тромбоэластографии

3.3. Влияние соединения М­26 на тромбоцитарный компонент гемостаза

3.4. Исследование действия соединения М­26 на реакцию высвобождения тромбоцитов

ГЛАВА 4. ДЕЙСТВИЕ СОЕДИНЕНИЯ М-26 НА СОСУДИСТО-ТРОМБОЦИТАРНЫЙ И

КОАГУЛЯЦИОННЫЙ КОМПОНЕНТЫ ГЕМОСТАЗА IN VIVO

4.1. Материалы и методы исследования

4.2. Острая токсичность соединения М­26

4.3. Оценка дозы М­26 и пентоксифиллина для экспериментов на животных

4.4. Влияние соединения М­26 на ключевые звенья системы гемостаза

4.5. Влияние соединения М­26 на сосудисто­тромбоцитарный компонент гемостаза........ ГЛАВА 5. ВЛИЯНИЕ СОЕДИНЕНИЯ М-26 НА ГЕНЕРАЛИЗОВАННЫЙ КОЛЛАГЕНАДРЕНАЛИНОВЫЙ ТРОМБОЗ

5.1. Материалы и методы исследования

5.2. Влияние соединения М­26 на выживаемость животных при генерализованном коллаген­ адреналиновом тромбозе

ГЛАВА 6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность. По современным представлениям, система гемостаза — совокупность функционально­морфологических и биохимических механизмов, обеспечивающих сохранение жидкого состояния крови, предупреждение и остановку кровотечений, а также контролирующих целостность кровеносных сосудов [39]. Нарушения в системе гемостаза являются промежуточным звеном патогенеза многих заболеваний, характеризующихся повреждением внутренней выстилки сосудов, нарушением взаимодействия эндотелия с клетками крови и плазменными ферментными системами, сдвигами реологии крови. Широкое распространение патологических состояний, проявляющихся тромбогеморрагическими осложнениями [7], требует поиска средств направленного воздействия на гемостаз.

В исследованиях, проведенных за последние десятилетия, показана необходимость и эффективность снижения угрозы тромбообразования с помощью специфических воздействий, в частности, применением антиагрегантов и антикоагулянтов [3]. Профилактическое использование антитромботических средств стастически значимо снижает риск тромбоэмболических осложнений, течение и исход основного заболевания [4].

Исследования в области поиска новых средств коррекции системы гемостаза не прекращаются уже много лет. Найдены перспективные вещества среди активаторов фибринолиза [72], ингибиторов тромбина [195], ферментов и специфических моноклональных антител [46, 55], субстратов растительного происхождения [61], пептидных ингибиторов тромбинзависимого превращения фибриногена [11]. Но, несмотря на успех исследователей и широкий выбор коммерческих препаратов на рынке, селективных антитромботических средств, имеющих практическое применение, не существует. Применяемые на практике лекарственные препараты, помимо гемостаза, оказывают влияние и на другие системы организма [73].

Синтез аналогов и производных применяемых препаратов является одним из современных направлений в разработке новых лекарственных средств. Данная работа является продолжением поиска селективных антитромботических средств среди производных ксантина [26, 27]. Предыдущие исследования подтвердили наличие у ряда производных ксантина выраженной антитромботической активности, эффект которых реализуется путем ингибирования самосборки фибрин­мономеров и блокирования рецепторов тромбоцитов GP IIb­IIIa [65].

Результаты этих работ мотивируют дальнейшие исследования влияния производных ксантина на систему гемостаза. Они являлись основой для направленного поиска селективных ингибиторов функциональной активности тромбоцитов среди впервые синтезированных N7­замещенных производных ксантина, содержащих этильный радикал в положении N1, и разработки на их основе высокоэффективных, избирательно действующих лекарственных препаратов для коррекции системы гемостаза, превосходящих пентоксифиллин.

Цель исследования. Оценка эффективности и изучение биохимического механизма действия на систему гемостаза в эксперименте наиболее активного из впервые синтезированных производных 1­этилксантина.

Задачи исследования:

1. Провести скрининг 18 впервые синтезированных производных 1­ этилксантина для выявления антиагрегационной и антикоагуляционной активности in vitro.

2. Определить зависимость биологической активности исследованных веществ от характера замещающих радикалов производных 1­этилксантина.

3. Оценить противосвертывающее действие in vitro на донорской крови человека наиболее перспективного из синтезированных соединений.

4. Изучить биохимические механизмы действия in vivo на интактных животных наиболее перспективного из изучаемых производных 1­этилксантина.

5. С использованием модельных состояний, сопровождающихся повышением адгезии и агрегации тромбоцитов, оценить противосвертывающее действие наиболее перспективного соединения.

экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (Москва, 2005).

Эксперименты в условиях in vitro выполнены на крови 227 здоровых доноров­мужчин в возрасте 18­24 лет. Экспериментальные исследования in vivo выполнены на 129 белых беспородных половозрелых крысах­самцах. Изучение профилактического эффекта соединения М­26 и пентоксифиллина при моделировании генерализованного коллаген­адреналинового тромбоза, выполнена на 60 белых беспородных мышах­самцах.

Для решения поставленных цели и задач исследования использовались следующие методы: тромбоэластография, индуцированная агрегация тромбоцитов, стандартные клоттинговые тесты, иммунотурбидиметрический и метод хромогенных субстратов.

Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора.

Достоверность результатов и обоснованность выводов базируется на адекватности экспериментальных моделей in vitro и in vivo, достаточном объеме исследований, использовании сертифицированного оборудования и современных методов исследования, обработкой результатов исследованиям с применением статистического пакета Statistica 10,0 (StatSoft Inc, США).

Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на: 76­й, 77­й, 78­й Республиканских научных конференциях студентов и молодых ученых «Вопросы теоретической и практической медицины» (Уфа, 2011, 2012 и годы), XIX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2012 год), 72 научно­практической конференции молодых ученых и студентов «Медицина и фармация XXI столетия – шаг в будущее» (Украина, 2012), Всероссийской молодежной конференции «Фармакологическая коррекция процессов жизнедеятельности. Доклинические и клинические исследования новых лекарственных препаратов» (Уфа, 2012 год), III Международной научной конференции "Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологий" (Казань, 2012 год), Всероссийской научно­практической конференции студентов и молодых ученых, посвященной 80­летию БГМУ «Итоги и перспективы молодежной и фармацевтической науки» (Уфа, 2013 год), IX Всероссийской конференции «Химия и Медицина» (Уфа, 2013 год), Российской научно­ практической конференции с международным участием, посвященной памяти профессора Д.М. Зубаирова «Актуальные вопросы медицинской биохимии и клинической лабораторной диагностики» (Казань, 2013 год), совместном заседании кафедр биологической химии, фармакологии №1 с курсом клинической фармакологии, фармацевтической химии с курсами аналитической и токсикологической химии и кафедры лабораторной диагностики ГБОУ ВПО БГМУ Минздрава России (Уфа, 2013 год).

Содержащиеся в диссертации данные получены при личном участии автора на всех этапах работы: анализ литературы, составление плана, постановки задач, выбор методов, постановки экспериментальных исследований, статистическая обработка и оценка полученных результатов, написание статей, оформление диссертационной работы.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Среди 18 изученных впервые синтезированных производных 1­этилксантина наиболее активны соединения по положению С8 ­ циклогексиламмониевые соли, по положению N7, содержащие диоксотиетанильный радикал.

2. Соединение М­26 проявляет более выраженную антиагрегационную активность по сравнению с пентоксифиллином.

3. Антиагрегационный механизм действия соединения М­26 заключается в ингибировании реакции высвобождения тромбоцитов.

Научная новизна исследования. Впервые на основании изучения антиагрегационной, дезагрегационной и антикоагуляционной активности выделены соединения, являющиеся наиболее перспективными среди впервые синтезированных производных 1­этилксантина. Охарактеризована зависимость фармакологической активности этих производных от структуры. Установлено, что наиболее активными среди исследованных производных 1­этилксантина являются соединения, содержащие в положении N7 – диоксотиетанил, в частности, циклогексиламмониевая соль 2-[3-метил-1-этил-7-(диоксотиетанилксантинил-8-тио] уксусной кислоты (лабораторный шифр - М-26). На соединение М-26, превосходящее по действию на гемостаз пентоксифиллин, получен патент РФ (№ 2504546 от 20.01.2014). По результатам проведенной экспериментальной работы выдвинута рабочая гипотеза о вероятном биохимическом механизме действия на систему гемостаза соединения М-26, связанным с подавлением реакции высвобождения тромбоцитов.

антиагрегационной, антикоагуляционной активностью позволяют осуществлять целенаправленный поиск и оптимизацию синтеза новых соединений с заданной антиагрегационная активность производного 1-этилксантина под лабораторным шифром М-26, превоходящая препарат сравнения-пентоксифиллин, характеризует его как перспективное средство коррекции гемостаза и определяет необходимость его дальнейшего изучения.

Внедрение результатов исследования в практику. Ряд положений теоретического и практического характера, сформулированных в диссертации внедрены в учебный и научный процессы на кафедрах фармацевтической химии с курсами аналитической и токсикологической химии, биологической химии, фармакологии №1 с курсом клинической фармакологии ГБОУ ВПО Башкирский государственный медицинский университет» Минздрава России.

Публикации. Соискатель имеет 15 опубликованных работ, из них по теме диссертации опубликовано 15 научных работ общим объёмом 3,4 печатных листа, в том числе 6 статей в научных журналах и изданиях, которые включены в перечень российских рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертаций, из них 1 патент на изобретение (патент РФ № 2504546 от 20.01.2014). 9 работ опубликованы в материалах всероссийских и международных конференций и симпозиумов.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста, иллюстрирована 17 рисунками, 22 таблицами. Состоит из введения, обзора литературы, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 82 отечественных и зарубежных источников.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Сосудисто-тромбоцитарный компонент гемостаза Гемостаз – это система организма, обеспечивающая сохранение крови в системе кровеносных сосудов в жидком агрегатном состоянии и остановку кровотечения при нарушении их целостности [40, 245]. Органы и ткани, реализующие это свойство, образуют систему гемостаза.

Условно принято выделять первичный или сосудисто­тромбоцитарный и вторичный или коагуляционный гемостаз. В основе системы гемостаза лежат функционирование кровеносных сосудов, клеток и белков плазмы крови. В то время как каждый компонент триады выполняет определенную функцию в гемостатическом процессе, они тесно «сотрудничают», чтобы сохранить постоянство агрегатного состояния крови [51, 56, 186].

нецелесообразно, так как эти сведения детально изложены в современных работах [2, 6, 12, 17, 20, 23, 39, 73, 230]. Поэтому основное внимание данного обзора будет сконцентрировано на сосудисто­тромбоцитарном компоненте системы гемостаза и анализе роли адгезивно­агрегационной функции тромбоцитов.

Сосудисто­тромбоцитарный компонент гемостаза представлен сочетанным действием сосудистой стенки и клеток крови (рисунок 1) [15, 37]. Сосудистая стенка имеет активную поверхность, с внутренней стороны выстланную эндотелиальными клетками [35, 81]. Эндотелий обладает рядом свойств, обеспечивающих постоянство агрегатного состояния крови [8, 23]:

• Механическое ограничение кровотока. Эндотелий предотвращает контакт крови с субэндотелиальными структурами, обладающими выраженными прокоагулянтными свойствами.

• Интактный эндотелий синтезирует, выделяет в кровь или представляет на своей поверхности биологически активные вещества, регулирующие состояние тромбоцитов и белков коагуляции.

Все вещества, секретируемые эндотелием и участвующие в гемостазе и тромбозе, условно делятся на две группы – тромбогенные и атромбогенные [52, 57]. Так, к веществам, инициирующим адгезию и агрегацию тромбоцитов, относятся фактор Виллебранда, фактор активации тромбоцитов, АДФ, тромбоксан­А2. В физиологических условиях секреция атромбогенных веществ значительно превосходит секрецию тромбогенных. Это предопределяет постоянство жидкого состояния крови при повреждениях сосудистой стенки, в том числе, незначительных, случайных, которые могут иметь место в физиологических условиях. Тромборезистентность кровеносных сосудов простациклина, эктоаденозиндифосфатазы и оксида азота (NO), которые препятствуют активации, адгезии и агрегации тромбоцитов [13, 24, 28, 58, 74, 191].

Тромбоциты ­ дискообразные безъядерные клетки диаметром 2­3 мкм, первая линия защиты от кровопотери при нарушении целостности сосудистой стенки [73, 183].

Основными функциями тромбоцитов в системе гемостаза являются [44, 79]:

• формирование первичной тромбоцитарной пробки в зоне повреждения сосуда за счет адгезии и последующей агрегации;

• катализ гуморальных реакций гемостаза за счет:

а) предоставления фосфолипидной поверхности (фактор 3 тромбоцитов или тромбоцитарный тромбопластин), необходимой для взаимодействия большинства плазменных белков гемостаза;

б) выброса прокоагулянтов из пулов хранения;

• ретракция сгустка крови;

• стимуляция локальной вазоконстрикции и репарации тканей, регулирование соответствующих медиаторов из пулов хранения тромбоцитов.

Рисунок 1 ­ Схема сосудисто­тромбоцитарного гемостаза (по Баркагану, 1989) На основании данных электронной микроскопии тромбоцит может быть разделен на условные анатомические зоны – мембрану тромбоцитов, цитоплазматический матрикс и зону органелл [9, 240].

Наружная поверхность тромбоцита покрыта гликокаликсом, богатым гликопротеинами. В пространствах многослойной мембраны расположены микротрубочки, формирующие цитоскелет тромбоцита. Цитоплазматическая мембрана тромбоцитов внедряется внутрь клетки в виде многочисленных переплетенных канальцев, связанных с внеклеточным пространством, образуя открытую канальцевую систему [16].

Следует отметить, что фосфолипидный состав наружной и внутренней поверхностей клеточной мембраны отличается. Основные фосфолипиды, входящие в состав тромбоцитов, можно разделить на 2 группы [17, 229]:

1) не обладающие прокоагулянтной активностью: фосфатидилхолин и сфингомиелин – расположены как на внутренней, так и на наружной поверхности кле­ точной мембраны.

2) обладающие прокоагулянтными свойствами: фосфатидилсерин, фосфатидилэтаноламин и фосфатидилинозитол – расположены только на внутренней поверхности клеточной мембраны.

В процессе активации тромбоцита концентрация фосфатидилсерина, фосфатидилэтаноламина и фосфатидилинозитола на наружной поверхности значительно возрастает и образует прокоагулянтную поверхность, необходимую для фиксации, активации и взаимодействия плазменных белков гемостаза.

Кислые фосфолипиды мембраны тромбоцитов ­ фосфатидилсерин, фосфатидилэтаноламин и фосфатидилинозитол формируют фактор 3 тромбоцитов (ф. 3, P3 или тромбоцитарный тромбопластин) [2].

Цитоскелет тромбоцитов формируют и плотная микротубулярная система, нити актина, спектрина и других протеинов, связанные с мембраной. Плотная микротубулярная система расположена в подмембранном пространстве и обеспечивает увеличение площади поверхности тромбоцита [19]. Эта система микротрубочек, помимо образования цитоскелета, является местом депонирования кальция и синтеза простагландинов [238].

Функциями белков цитоскелета тромбоцитов являются:

• поддержание формы интактных тромбоцитов;

• изменение формы при активации тромбоцитов;

• «фиксация» плазматической части трансмембранных гликопротеинов;

• передача сигнала от внутренних структур к рецепторам;

• участие в «направленном» внутритромбоцитарном движении органелл, белков;

• передача внутриклеточных сигналов;

На мембранах тромбоцитов расположено множество различных рецепторов, посредством которых реализуются основные функции тромбоцитов [66].

Большинство рецепторов являются гликопротеинами (ГП), фиксированными на цитоплазматической мембране тромбоцита. Один конец молекулы рецепторных ГП находится во внеклеточном пространстве, а другой «пронизывает» мембрану и контактирует со структурами тромбоцита, расположенными на внутренней стороне цитоплазматической мембраны. На наружных частях ГП молекул располагаются рецепторные локусы, специфичные для разных веществ [192].

Третья анатомическая область ­ зона органелл тромбоцитов. Она представлена, главным образом, ­гранулами и плотными тельцами, но также содержит и лизосомы, пероксисомы, митохондрии и включения гликогена. Зона внутритромбоцитарных биологически активных веществ, которые способствуют адгезии и агрегации тромбоцитов [177].

образованиями, содержащими внутри электронно­плотную тонкогранулярную субстанцию [169]. ­Гранулы служат местом хранения секретируемых из тромбоцитов белков, среди которых можно выделить несколько основных групп в соответствии с их функциональной активностью:

2. Факторы свертывания и фибринолиза.

3. Провоспалительные цитокины и хемокины.

5. Белки, участвующие в мобилизации стволовых клеток.

Секретируемые белки могут попадать в ­гранулы двумя способами – в результате синтеза и соответствующего процессинга в мегакариоцитах (P4, ­ тромбоглобулин, тромбоспондин и др.) и путем эндоцитоза из плазмы крови (факторы свертывания и системы фибринолиза, иммуноглобулины, альбумин и др.) [173, 179, 215].

низкомолекулярные соединения – АДФ, АТФ, серотонин, ионы кальция и магния, ГТФ, ГДФ и др. Эти вещества высвобождаются при активации тромбоцитов [152].

В мембранах плотных гранул содержатся белки CD63 и CD107b. Появление данных белков в плазме служит маркером реакции высвобождения [215, 238, 264].

­гранулы (гранулы накопления) диффузно расположены в гель­зоне тромбоцитов, представляют собой лизосомы. В тромбоцитарных лизосомах содержатся кислые гликогидролазы (­гексаминидаза, ­глюкуронидаза и др.), а также протеазы (катепсины D и E) и некоторые другие белки [76].

Гемостатическая функция тромбоцитов обусловлена тромбоцитарными факторами свертывания. Тромбоцитарные факторы свертывания представлены одиннадцатью биологически активными веществами [199].

Фактор P1 – проацеклерин. Участвует в образовании протромбиназы и ускоряет образование тромбина из протромбина, подобно фактору V плазмы. Находится в неактивном состоянии. Для его перевода в активное состояние необходимы коллаген или малые дозы АДФ и тромбин в следовых концентрациях [263]. Он ускоряет свертывание цельной крови, сокращает время рекальцификации, инициируя активацию протромбина фактором Ха в присутствии Са2+ и фактора Р3 [269].

Фактор Р2 – фибринопластический фактор. Основная функция заключается в ускорении трансформации фибриногена в фибрин [111].

Фактор Р3 – тромбоцитарный тромбопластин. Служит матрицей для взаимодействия плазменных факторов гемокоагуляции. По своим свойствам этот фактор идентичен кефалину и мембранному фактору эритроцитов – эритроцитину, эритрофосфатиду [202]. Необходим для эндогенного образования протромбиназы, способствующей превращению протромбина в тромбин. Аналогично факторам Va и Ха обеспечивает протромбиназную активность, потенцируя активацию фактора X [197]. Фактор 3 выделяется при реакции высвобождения тромбоцитов. Определяя активность фактора Р3 до и после агрегации тромбоцитов, можно получить представление о реакции высвобождения тромбоцитов [2].

Фактор Р4 – антигепариновый фактор, содержится в ­гранулах.

Нейтрализация гепарина P4 происходит за счет двух пар лизиновых остатков, расположенных на С­конце молекулы [34, 109]. Один тетрамер P может соединяться с одной молекулой гепарина низкой молекулярной массы и с двумя и более молекулами гепарансульфатов высокой гепарансульфатов с P4 нарушает его взаимодействие с антитромбином, ингибирует стимуляцию антитромбина P4. Фактор тромбоцита 4 является антиангиогенным ELR­отрицательным хемокином. P4 ингибирует миграцию, пролиферацию эндотелиальных клеток и процесс ангиогенеза in vitro и в естественных условиях. Согласно [109, 182, 185], предложены три различных механизма, чтобы объяснить антиангиогенные эффекты P4. Во­ первых, P4 может напрямую связывать протеогликаны и/или вмешаться в эффект посредника протеогликана, ингибируя активность фактора роста.

Во­вторых, P4 в состоянии взаимодействовать непосредственно с факторами роста ангиогенеза, такими как факторы роста фибробласта или сосудистые факторы эндотелиального роста и ингибировать их взаимодействие с рецепторами поверхности клеток [179]. В­третьих, P4 может активизировать рецепторы поверхности клеток на эндотелиальных клетках и стимулировать подавляющие рост сигналы. При сердечно­сосудистых заболеваниях P может вмешиваться в коллатеральное кровообращение, образование новых атеросклеротических бляшек, усугублять вызванную гепарином тромбоцитопению [85, 107]. Согласно последним исследованиям [223], в условиях эксперимента на мышах доказаны атеросклеротические свойства P4. Эти данные дополняются клиническими наблюдениями [150, 184, 222] и подчеркивают, что Р4 способствует развитию атеросклеротического поражения сосудов. Установлены другие биологические роли Р4 за пределами системы гемостаза, в том числе стимуляция высвобождения гистамина из базофилов [114, 234], созревания мегакариоцитов [153, 162], ингибирование опухолевого роста [194], иммуносупрессивные свойства [137, 180], активация фибробластов [101] и способность повышать реакционный ответ полиморфноядерных лейкоцитов на активирующий пептид Met­Leu­Phe и моноцитов на липополисахариды [94, 142], а также способность ингибировать коллагеназу [17].

Фактор Р5 – агглютинабельный фактор. Высвобождение фактора 5 из ­ гранул тромбоцитов происходит под влиянием тромбина [254]. По структурному строению аналогичен фибриногену плазмы и принимает участие в процессах адгезии и агрегации тромбоцитов, способствуя созданию функционально­полноценного тромба за счет высокого сродства с ГП IIb­IIIa [154].

Фактор Р6 – антифибринолитический. Действует по типу антиплазминов [199].

Фактор Р7 – антитромбопластический фактор. Ингибирует трансформацию протромбина в тромбин за счет подавления активной протромбиназы.

Присутствие гепарина потенциирует его антикоагулянтное действие [111].

Фактор P8 – ретрактозим, подобный актомиозину мышечных волокон.

Обеспечивает сокращение и уплотнение тромбинового сгустка под действием Са2+ [86].

Фактор Р9 – серотонин ­ биологически активное вещество из группы индолилалкиламинов [188]. Поддержание оптимального уровня серотонина осуществляется связыванием свободного серотонина белками сыворотки крови, клетками тканей легких, тучными клетками, гепатоцитами и эритроцитами, а также тромбоцитами ­ на долю последних приходится 95­ 99 % всего серотонина крови [37, 87, 134, 263].

Фактор Р10 – пластиночный кофактор (котромбопластин). Котромбопластин котромбопластина в процессе свертывания крови в нормальных условиях не определена [268].

Фактор Р11 – фибринстабилизирующий фактор. По химической структуре идентичен фактору ХIII. Основная функция ­ ускорение образования поперечных ковалентных сшивок фибринмономеров, что приводит к уплотнению фибринового сгустка [75].

Фактор Р12 – АДФ, локализованный в ­гранулах. Является универсальным индуктором агрегации тромбоцитов [146].

Основная гемостатическая функция тромбоцитов реализуется в результате процесса, который можно условно разделить на следующие стадии: адгезия, агрегация, активация и «реакция высвобождения» тромбоцитов.

В процессе адгезии важную роль играют 2 механизма [33]:

1) Механизм, обеспечивающий адгезию в условиях низкого кровотока, непосредственно через рецепторы ГП Ia­IIa и ГП VI к коллагену субэндотелия.

Однако это взаимодействие недостаточно для удержания тромбоцитов в местах воздействия высоких скоростей кровотока ­ артериях и артериолах.

2) Механизм, эффективно удерживающий тромбоциты при высокой скорости кровотока, включает адгезию тромбоцитов, опосредованную молекулами адгезии ­ фактором Виллебранда, фибронектином, витронектином, ламинином, тромбоспондином и др. Следует отметить, что в условиях реального кровотока эти механизмы работают параллельно и разделение их достаточно условно.

Взаимодействие субстрата с рецепторами тромбоцита приводит к процессу активации [38, 46]. Основную роль в первичной активации тромбоцитов играет сигнал с рецепторов ГП Ia­IIa, ГП Ib­V­IX и ГП VI, которые контактируют со своими агонистами, в первую очередь с коллагеном, фактором Виллебранда и тромбином. Практически все вещества взаимодействуют с тромбоцитами через специфические рецепторы [1, 174]. Несмотря на многообразие агонистов активации тромбоцитов и большое количество рецепторов к ним, клетка имеет ограниченное ко­ личество эффекторных механизмов. Реакция тромбоцита на активирующие воздействия однотипна [50, 135]:

• Тромбоцит меняет форму: появляются псевдоподии, за счет открытой канальцевой системы увеличивается площадь его поверхности.

• Меняются соотношения различных фосфолипидов между наружным и внутренним листками клеточной мембраны. Это приводит к появлению на наружной поверхности тромбоцита большого количества кислых фосфолипидов с прокоагулянтными свойствами ­ фактор 3 тромбоцитов (P3).

• На мембране тромбоцитов экспрессируются или повышают аффинность интегрины.

• Происходит секреция содержимого пулов хранения тромбоцитов во внешнюю среду (происходит «реакция высвобождения»).

• Тромбоциты фиксируются на поверхностях и соединяются друг с другом и другими клетками крови (происходит адгезия и агрегация).

Активация тромбоцитов может быть обратимой: происходят лишь частичные конформационные изменения, обратимое соединение с другими клетками и частичная секреция гранул. Спустя небольшое время тромбоцит возвращается в интактное состояние и поступает в ток крови [213]. После обратимой активации и возвращения в неактивное состояние тромбоцит снова может активироваться и вступать во взаимодействие с другими клетками и структурами. Обратимая агрегация возникает при кратковременном воздействии слабого стимула [2].

При воздействии интенсивной стимуляции происходит необратимая активация тромбоцита. В этом случае тромбоцит прочно фиксируется к другим клеткам или внеклеточным структурам, происходит полная дегрануляция и секреция содержимого пулов хранения [266]. Если тромбоцит после необратимой активации поступает в ток крови, он не может в дальнейшем вступать во взаимодействие с другими клетками – наступает период рефрактерности тромбоцитов [199, 206].

Процесс агрегации заключается в присоединении активированных тромбоцитов, находящихся в токе крови, друг к другу и ранее фиксированным в области повреждения [52]. Основным рецептором агрегации является ГП IIb­IIIa.

После активации тромбоцита ГП IIb­IIIa значительно повышает свою аффинность по от­ ношению к фибрину и меняет антигенную структуру. После этого происходит соединение тромбоцитов, опосредованное фибрином и фактором Виллебранда.

Агрегация тромбоцитов происходит под действием агонистов – первичных и вторичных. Первичные индукторы агрегации ­ тромбин, катехоламины и коллаген, а вторичные, появляющиеся в ходе активации ­ АДФ, серотонин, тромбоксан А2 и другие [2].

Согласно данным ряда исследователей [29, 39], одним из ключевых механизмов в развитии адгезивно­агрегационной функции тромбоцитов, а следовательно, и реализации сосудисто­тромбоцитарного гемостаза является метаболизм арахидоновой кислоты (рисунок 2). Тромбин, АДФ, коллаген и другие агонисты активируют фосфолипазу А2 мембран, высвобождая арахидоновую кислоту из состава фосфолипидов [133]. 95% арахидоновой кислоты этерифицировано в С2­позиции фосфолипидов, следовательно обеспечить синтез PG, лейкотриенов и тромбоксана субстратом способна лишь фосфолипаза А2.

Далее под влиянием циклооксигеназы из арахидоновой кислоты образуются простагландины (PGG2, PGH2). PGG2 и PGH2 изменяют в тромбоцитах уровень стимулирующую фосфорилирование белков­энзимов в тромбоцитах. Сдвиги активности энзимов изменяют заряд и структуру периферических белков простагландинов в тромбоцитах под действием тромбоксан­синтетазы образуется тромбоксан А2, а в сосудистой стенке под влиянием простациклин­синтетазы – простациклин (простагландин I2, PGI2) [18]. Продолжительность жизни тромбоксана, простациклина и родственных им других простагландинов коротка, а активность исчезает после их метаболизма в неактивные производные – тромбоксан В2 и другие конечные продукты [128, 246].

Активность тромбоцитов определяет содержание АТФ. Пополнение её фосфорилирования (20%) [64].

Рисунок 2 ­ Каскад арахидоновой кислоты (по Баркагану, 1989) Одна из ведущих ролей в реализации активации, адгезии и агрегации тромбоцитов отводится Са2+. Основной локализацией внутриклеточного Са2+ являются плотная тубулярная система и наружная мембрана. Внутриклеточный Са2+ необходим для реализации агрегации тромбоцитов, индуцированной АДФ, тромбином и нефизиологическими агонистами [92]. Адреналин­индуцированная агрегация тромбоцитов возможна лишь в присутствии внеклеточного Са2+, также как и последующие этапы (агрегация и «реакция высвобождения») независимо от исходного агониста агрегации [1, 69].

Механизм участия Са2+ в процессе передачи сигнала внутрь клетки заключается в следующем. При стимуляции тромбоцитов физиологическими агонистами активируются фосфолипазы А2 и С. Активация фосфолипазы С, продуцирует мессенджеры, мобилизующие Са2+ из внутриклеточных депо:

образуется 1,4,5­инозитолтрифосфат и 1,2­диацилглицерол. Диацилглицерол участвует в активации протеинкиназы С, разрушается диглицеридлипазой с высвобождением арахидоновой кислоты [224]. Внутриклеточное перераспределение Са2+ предшествует изменению формы клеток, высвобождению и образованию ТхВ2. При этом, перераспределение Са2+ ведет к разрушению активации фосфолипаз, изменению концентрации PG [84].

В итоге перераспределение Са2+ опосредует активацию тромбоцита через следующие стадии [54, 60]:

1) изменение структуры субмембранных трубочек, поддерживающих дисковидную форму клетки;

2) активация фосфолипазы А2 (ускорение высвобождения арахидоновой кислоты, следовательно, накопления циклических эндоперекисей и тромбоксана А2);

сократительных белков, участвующих в секреции и ретракции кровяного сгустка [232].

высвобождения тромбоцитов единственным необходимым двухвалентным катионом, согласно [91], являются ионы Ca2+. Катионы Ba2+ и Mg2+ [108, 146] ингибируют реакцию высвобождения, и лишь ионы Sr2+ способны частично заменить Ca2+ [242].

Таким образом, с помощью вторичных посредников происходит передача сигнала внутрь тромбоцита, приводящая к изменениям практически всех внутриклеточных систем кровяных пластинок.

Реакция высвобождения сопутствует адгезии и агрегации и как их высвобождения являются многие из агонистов адгезии и агрегации [47]. При действии индукторов агрегации из тромбоцитов высвобождается содержимое гранул тромбоцитов, происходит трансформация мембранных белков (CD лиганд, Р­селектин и др.), поэтому реакция высвобождения характеризует целый комплекс последовательных процессов, завершающийся выделением из активированных тромбоцитов в окружающую среду различных биологически активных соединений [169, 179, 238].

Морфологические исследования показали, что при активации тромбоцита происходят изменения его формы, реорганизация внутриклеточных компонентов ­ централизация гранул, микротрубочек [204, 244, 260]. Эти наблюдения позволили ряду авторов предположить ведущую роль актина и микротрубочек в экзоцитозе гранул тромбоцитов. Однако, эксперименты с использованием цитохалазина E в концентрациях, ингибирующих полимеризацию актина и трансформацию формы тромбоцитов, показали, что реакция высвобождения изменений не претерпевает [189]. А механизм действия фармакологических препаратов, предположительно влияющих на организацию микротрубочек и ингибирующих секрецию гранул, согласно ряду исследований, в конечном итоге реализовывался через иные механизмы, чем нарушение реорганизации микротрубочек [261, 262]. Кроме того, в определенных экспериментальных условиях реакция высвобождения и изменение формы тромбоцитов могут быть разделены между собой [98, 214, 259].

высвобождения тромбоцитов заключается в экзоцитозе гранулярных структур при участии белков семейства SNARE [169, 267]. SNARE (от англ. soluble NSF attachment receptor) — большая группа белков, осуществляющих слияние внутриклеточных везикул с клеточной мембраной или органеллой­мишенью.

Определено более 60 белков группы SNARE [216, 238]. Общим для данной группы является наличие цитозольного домена из 60­70 аминокислот, называемого SNARE motif (SNARE-домен), способного к образованию обратимой, но прочной четырёхспиральной структуры. Белки группы делятся на следующие категории: везикулярные белки (v­SNARE), белки принимающей органеллы (t­SNARE) и цитозольные белки NSF и SNAP­белок (адаптор к NSF) [140, 231].

В следующей работе [149] установлены три главных SNARE белка ­ высвобождения тромбоцитов. Среди VAMP­семейства в тромбоцитах дифференцированы следующие белки: synaptobrevin/VAMP­2 [145, 196, 233], cellubrevin/VAMP­3 [99], endobrevin/VAMP­8 [90, 258] и TI­VAMP/VAMP­7 [151, 196]. Роль белков TI­VAMP/VAMP­7 в реакции высвобождения точно не установлена. Согласно исследованию [217], VAMP­2 и ­3 не ответственны за реакцию высвобождения тромбоцитов, а VAMP­8­/­ влияет на высвобождение плотных гранул и лизосом [156].

Механизм экзоцитоза универсален во всех клетках и реализуется благодаря комплементарности v­SNARE и t­SNARE. Эти белки­рецепторы взаимодействуют друг с другом по принципу «антиген­антитело». После контакта оба белка становятся рецепторами для SNAP, который в свою очередь присоединяет NSF. При этом комплекс v­SNARE + t­SNARE + Са2+­канал является осью, на которую нанизываются другие молекулы, участвующие в экзоцитозе [115].

Далее с участием NSF происходит гидролиз АТФ, который ведет к приводит синаптическую везикулу в состояние прайминга. Вход кальция дестабилизирует SNARE­комплекс везикулы и приводит к экзоцитозу [116].

Общую последовательность событий можно представить следующим образом: v-SNARE + t-SNARE докирование везикулы v- SNARE + t-SNARE + SNAP прайминг везикулы [252].

составляющей реакции высвобождения. Ряд исследователей полагают, что энергия ATФ требуется для полноценного ответа тромбоцитов на действие агонистов агрегации. Торможение продукции ATФ заметно ингибирует изменение формы тромбоцитов, агрегацию, метаболизм арахидоновой кислоты, секрецию из плотных гранул и секрецию из гранул, содержащих кислые гидролазы, а также адгезию тромбоцитов, обусловленной действием АДФ, и ретракцию сгустка [167]. В результате проведенных H. Holmsen и соавт. [167] исследований установлено, что потребность в энергетических субстратах убывает в следующем порядке: изменение формы тромбоцитов > первичная агрегация тромбоцитов > вторичная агрегация тромбоцитов (эквивалент секреции из плотных гранул и/или метаболизм арахидоновой кислоты) > секреция из гранул, содержащих гидролитические ферменты тромбоцитов [161, 240].

С разработкой метода количественного определения энергетических субстратов на этапах активации, адгезии, агрегации и реакции высвобождения из гранул тромбоцитов появилась возможность изучить особенности метаболизма тромбоцитов в момент высвобождения биологически активных веществ [2].

Среди первых попыток оценить метаболизм тромбоцитов в момент реакции высвобождения и агрегации относятся работы [120, 168, 187]. Авторы изучили метаболизм АТФ при действии основных физиологических индукторов – АДФ и адреналина. В результате исследования ими было установлено, что в процессе агрегации тромбоцитов и реакции высвобождения идет быстрое превращение внутриклеточного АТФ во внеклеточный гипоксантин. Причем данная цепь биохимических превращений сопровождает преимущественно именно реакцию высвобождения [187].

Следующим этапом были изучены особенности метаболизма тромбоцитов при действии тромбина. J.M.A. Verhoeven et al. [253] определяли секрецию из плотных гранул (серотонин), ­гранул (­тромбомодулин) и гранул, содержащих кислые гидролазы (N­ацетил­­D­глюкозамидаза), в плазму при действии тромбина разных концентраций, с параллельным расчетом затрачиваемой энергией на каждый из указанных процессов. По результатам исследования установлено, что секреция из гранул, агрегация тромбоцитов и потребление АТФ не зависят от силы возбуждения, не оказывают влияние на интенсивность и скорость высвобождения биологически активных веществ из ­, ­ и ­гранул [120].

При активации тромбоцитов содержимое ­гранул высвобождается в околотромбоцитарное пространство, повышая локальную концентрацию факторов свертывания, что эффективнее реализует адгезию и агрегацию тромбоцитов [165]. Высвобождаемые из ­гранул про­ и противовоспалительные цитокины, хемокины и факторы роста участвуют в процессах регуляции воспаления, репарации тканей, формировании атеросклеротических бляшек и ремоделировании сосудистой стенки [169, 173, 178, 216, 238, 267].

Тромбоцитарные белки ­гранул являются выявляемыми растворимыми маркерами активации тромбоцитов. К наиболее значимым относятся белки ­ гранул – P4 и ­тромбоглобулин. Повышение содержания этих белков в плазме, отсутствующих в нормальных условиях, является специфическим показателем активации тромбоцитов [106, 238]. Мембранным маркером ­гранул является белок клеточной адгезии Р­селектин (CD62P) [104, 200, 238].

околотромбоцитарное пространство и содержимого плотных гранул. Действие сильных индукторов агрегации вызывает полную секрецию содержимого плотных гранул. Высвобождаемые в окружающую среду из плотных гранул индукторы агрегации потенцируют процессы адгезии и агрегации, запускают активацию раннее покоящихся тромбоцитов [77, 176]. При этом угнетение секреции или несостоятельность плотных гранул приводит к подавлению второй, необратимой волны агрегации даже при действии сильных агонистов агрегации в высоких концентрациях. Таким образом, основное значение высвобождения из плотных гранул эндогенных агонистов заключается в аутокринном усиление активации тромбоцитов, индуцированной первичными, экзогенными агонистами [80].

Лизосомальные ферменты, аналогично содержимому других типов гранул, высвобождаются в околотромбоцитарное пронстранство. Но секреция из лизосом возможна только при действии сильных индукторов агрегации тромбоцитов в высоких концентрациях. При этом секретируется не более 30­50% лизосомальных ферментов [127, 169, 200, 216, 238, 267].

Активация тромбоцитов, помимо высвобождения содержимого гранул, соповождается экспонированием в окружающую среду растворимых форм некоторых мембранных белков. Наиболее известные из них – растворимые формы Р­селектина и CD40 лиганда [130].

Р­селектин ­ белок клеточной адгезии семейства селектинов. Р­селектин в нормальных условиях локализован в мембранах ­гранул тромбоцитов, но при тромбоцитарную поверхность [67, 172, 212]. Растворимый Р­селектин образуется протеолитическим отщеплением нерастворимой формы от мембраны, а также присутствует в тромбоцитах в специальной растворимой форме, синтезируемой на мРНК, не содержащей экзона, кодирующий трансмембранный домен.

Тромбоциты являются главным источником Р­селектина, несмотря на его значительное присутствие в эндотелиальных клетках [211]. Функция растворимого Р­селектина остается неясной. Однако, результаты последних исследований демострируют его противовоспалительное действие за счет взаимодействия с лейкоцитами [67, 170, 238].

CD40 (CD40L, CD154) лиганд относится к семейству факторов некроза лимфоцитах, базофилах, тучных клетках, но, в большом количестве представлен и в тромбоцитах. Белок CD40 является одним из лигандов ГП IIb­IIIa, ответственного за конечный этап свертывание крови и стабилизацию сгустка [107, 126].

обязательным компонентом нормального функционирования системы гемостаза тромбоцитов приводит к разрыву цепи последовательных ответов, начинающейся с действия агонистов и заканчивающейся образованием тромба. Это позволяет считать «реакцию высвобождения» перспективной точкой приложения потенциальных антиагрегантов [208, 239].

1.3. Современные антитромбоцитарные препараты Тромбоциты запускают коагуляционный каскад, регулируют агрегатное состояние крови на всех участках кровотока. Результаты многочисленных клинических исследований демонстрируют необходимость проведения длительной терапии антиагрегантами при различных заболеваниях [2, 45, 88, 89].

На сегодняшний день существует большое количество лекарственных препаратов, различных по биохимическому механизму действия, позволяющих корректировать функциональную активность тромбоцитов. При этом важным условием, определяющим область применения того или иного лекарственного средства, является механизм по которому он реализует свою антиагрегационную активность [209]. Официально применяемые антиагреганты и механизмы их действия представлены в таблице 1.

Таблица 1 – Основные антиагреганты Наиболее распространенной, длительно применяющейся в практической медицине группой лекарственных препаратов являются нестероидные противовоспалительные средства (НПВС). НПВС проявляют антиагрегационную активность, ингибируя циклооксигеназу (ЦОГ) ­ фермент, катализирующий превращение свободных полиненасыщенных жирных кислот в простагландины, а также другие эйкозаноиды ­ тромбоксаны и простациклин.

Ацетилсалициловая кислота является единственным из НПВС препаратом, который в настоящее время по результатам крупномасштабных клинических исследований [70, 129, 148, 210, 218, 249] рекомендован для первичной профилактики сердечно­сосудистых осложнений. Механизм антиагрегационной активности АСК заключается в необратимом ингибировании циклооксигеназы.

Ацетилсалициловая кислота действует как ацетилирующий агент и присоединяет ацетильную группу к остатку серина в активном центре циклооксигеназы.

Тромбоциты, являясь безъядерными клетками, лишены способности синтезировать ферменты, поэтому синтез TxA2 восстанавливается только за счёт появления новых популяций тромбоцитов.

Нелинейная зависимость TxA2–ассоциированной антиагрегационной активности аспирина и ингибирование тромбоцитарного ЦОГ­1 обуславливает его следующие особенности [226]:

1. Клинически значимое снижение функциональной активности тромбоцитов связана практически с максимальный инактивацией ЦОГ­1.

2. Стойкое необратимое ингибирование ЦОГ­1 тромбоцитов не может быть достигнуто применением большинства традиционных нестероидных противоспалительных препаратов без проявления их нежелательного действия на ЦОГ­2.

3. Ингибирование TxA2­зависимой функциональной активности тромбоцитов аспирином оставляет другие пути реализации их гемостатической функции (посредством аденозин (АДФ)­P2Y12, рецептора к тромбину и др.) [181].

Результаты рандомизированного исследования ISIS­2, проведенного при участии 17 187 пациентов, показали эффективность приема аспирина в дозе мг/кг по снижению частоты острого инфаркта миокарда (ИМ), коронарной смерти и частоты ишемических инсультов (ОНМК) на 23% относительно плацебо­ демонстрируют стойкую десятилетнюю выживаемость [89].

Мета­анализ Antithrombotic Trialists' Collaboration (2002), контролирующий распределение пациентов с высоким риском развития сердечно­сосудистой катастрофы при длительных курсах антиагрегантной терапии, демонстрирует снижение интегрального показателя нефатального тромбоза (ОИМ и ОНМК) на 25% по сравнению с плацебо. Показатели частоты эпизодов тромбозов по нозологиям снижались в следующем порядке: инфаркт миокарда снизился на одну треть, нефатальный инсульт на одну четверть, а синдром внезапной смерти на одну шестую [88].

профилактики сердечно­сосудистых катастроф на общей выборке пациентов с низким уровнем риска и средним периодом наблюдения 6,9 лет аспирин на 12% снижал частоту тромбозов с 0,57 до 0,51%. Этот эффект в основном реализовывался за счет снижения нефатального ИМ с 0,23 до 0,18% в год [89].

профилактике на 17 тыс. больных с высоким риском сердечно­сосудистых осложнений демонстрирует высокую эффективность АСК в профилактике атеротромбоза. Прием аспирина приводил к снижению риска сосудистых осложнений примерно на 20% при отсутствии достоверного увеличения частоты геморрагического инсульта [89].

кардиологии. К настоящему времени результаты клинических исследований убедительно доказали высокую эффективность применения аспирина у пациентов с нестабильной [190, 219] и стабильной стенокардией [163], у пациентов, перенесших хирургические вмешательства на коронарных сосудах [88, 89].

Ряд исследований выявили разницу антиагрегационного эффекта аспирина незначительное число эпизодов сердечно­сосудистых катастроф на фоне длительного приема аспирина у женщин, что свидетельствует о половых различиях в метаболизме салицилатов [203]. Возможно, в том числе и половые аспиринорезистентности [164]. По данным ряда авторов аспирин оказывается неэффективным в 5­48% случаев длительного приема ацетилсалициловой кислоты [123, 141, 157­160, 208].

При этом длительное применение аспирина в качестве антиагреганта приводило к проявлению побочных эффектов. Неблагоприятные эффекты аспирина являются дозозависимыми [220]. Как правило, причиной отмены ацетилсалициловой кислоты является проявления синдрома желудочной диспепсии с частотой от 5,2% до 40%. АСК увеличивала риск кровотечений желудочно­кишечного тракта (или другой экстракраниальной локализации) с 0, до 0,1% в год. Частота серьезных внечерепных кровотечений усугублялась общими факторами риска, аналогично факторам провоцирующим тромбоз (возраст, мужской пол, диабет, курение, артериальное давление и высокий индекс массы тела) [93].

Таким образом, клиническая эффективность ацетилсалициловой кислоты исследованиями. Однако не существует окончательного ответа на вопрос о целесообразности ее применения больше с позиции безопасности, нежели эффективности.

Тиенопиридины ингибируют аденозин (АДФ)­зависимый путь агрегации тромбоцитов по механизму необратимой модификации рецепторов P2Y12 [166, 228]. Тиклопидин, клопидогрел и прасугрел являются пролекарствами, неактивными в условиях in vitro [144, 175]. Ингибирование рецептора происходит активными метаболитами тиенопиридинов, производимых в печени под действием цитохрома Р­450, образуя ковалентные связей с остатками цистеина в рецепторе P2Y12. Ингибирование АДФ­зависимой функции тромбоцитов клопидогрелем меньше предсказуемо, чем ингибирование TxA2­зависимые функции тромбоцитов аспирином. Инактивация P2Y12 и ингибирование АДФ­ зависимой агрегации тромбоцитов носит линейный характер, восстановление функции тромбоцитов после отмены препарата происходит линейно в течение 7­ дней [255]. Генетическая изменчивость ферментов печени, ответственных за метаболизм клопидогреля является определяющим факторам активности циркулирующих метаболитов, что в свою очередь, обуславливает непостоянство клинической эффективности монотерапии клопидогрелем [113, 122, 171, 237].

Исследована антиагрегационная активность тиклопидина и клопидогреля против аспирина у больных перенесших ИМ [119, 235]. Клопидогрел 75 мг в день является альтернативой для пациентов с коронарной, цереброваскулярной патологией или заболеваниями периферических артерий, которым противопоказан прием аспирина. Эффективность и безопасность клопидогреля была установлена в нескольких крупных рандомизированных контролируемых исследованиях. В исследовании CAPRIE (The Clopidogrel versus Aspirin in Patients at Risk of Ischemic Events) [119] у пациентов с высоким риском ишемических событий, включая ишемический инсульт, инфаркт миокарда и заболевания периферических артерий, продемонстрировано превосходство клопидогреля над ацетилсалициловой кислотой.

Однако лучшие результаты, согласно проведенным исследованиям CURE (The Clopidogrel in Unstable Angina to Prevent Recurrent Events) [265], COMMIT (The Clopidogrel and Metoprolol in Myocardial Infarction Trial) [124] и CLARITY­ TIMI 28 (The Clopidogrel as Adjunctive Reperfusion Therapy­Thrombolysis in Myocardial Infarction) [221], получены при добавлении клопидогреля к стандартной терапии [236]. Сочетанное применение аспирина [117, 190, 248] и тиклопидина [95] снижали на 50% частоту развития ИМ или смерти пациентов с нестабильной стенокардией в рандомизированных контролируемых исследованиях. Проведенное в 2002 году исследование CREDO (The Clopidogrel for the Reduction of Events During Observation) [243] демонстрирует снижение острых сосудистых событий при сочетании клопидогреля + АСК в течение месяцев (против 1 месяца) после чрезкожных коронарных вмешательств.

сопоставление различных нагрузочных и поддерживающих доз клопидогреля (600 против 300 мг загрузку и 150 против 75 мг в день в течение 7 дней) для достижения максимально­оптимального ингибирования функциональной стандартных и повышенных доз клопидогреля не изменял показатели частоты развития острых сосудистых катастроф, но значительно повышал показатели кровотечения [199].

Согласно международным рекомендациям [83, 96], в исследовании COGENT (The Clopidogrel and the Optimization of Gastrointestinal Events Trial) предпринята первая попытка оценить комбинацию клопидогреля (75 мг) и омепразола (20 мг) на 3873 пациентах с острым коронарным синдромом периодом наблюдения в 133 дня. Согласно предварительным результатам никаких доказательств неблагоприятного взаимодействия между омепразолом и клопидогрелем зафиксировано не было, но исследование прекращено досрочно, не набрав заявленную статистическую мощность [103].

концентрации активных метаболитов клопидогреля и прасугреля одинаково подавляют функциональную активность тромбоцитов в условиях in vitro. Однако, принципиально различается количества метаболитов, генерируемых в условиях in vivo после нагрузочной дозы клопидогреля (300 мг) и прасугреля (60 мг).

Концентрация активных метаболитов при действии нагрузочной дозы прасугреля превышает клопидогрель в 10 раз. Это обуславливает быструю и более стойкую добровольцев [175] и пациентов с ишемической болезнью сердца [143, 201, 257].

Прасугрел, эффективнее клопидогреля, предотвращал нефатальный ИМ и тромбоз стента при эндоваскулярных вмешательств, но провоцировал клинически значимое кровотечение [102]. Неприемлемым считается замена клопидогреля на тиклопидин ­ увеличивается проявление токсичности на костный мозг. Согласно, проведенному исследованию CLASSICS (The Clopidogrel Aspirin Stent International Cooperative Study) [100], тромбоцитопения и нейтропения были в раза выше в группе тиклопидина, чем у пациентов, получавших клопидогрел.

Токсичность тиклопидина была подтверждена в исследовании [205] и мета­ анализе при участии 11 668 пациентов [121].

Выделяют 3 обратимых антагонистов P2Y12 ­ Тикагрелор (per os), cangrelor (инъекционная форма) и elinogrel (пероральная и инъекционная форма) [122, 160, 257]. Принципиальное отличие от тиенопиридинов – не связанная с трансформацией в печени активность в условиях in vivo. Единственное клиническое исследование PLATO (The Platelet Inhibition and Patient Outcomes), проведенное в 2009 году обнаружило, что тикагрелор эффективнее клопидогреля