[ «ТРАНСФУЗИИ ЛИМФОЦИТОВ ДОНОРА ПРИ РЕЦИДИВЕ ЛЕЙКОЗА ПОСЛЕ ТРАНСПЛАНТАЦИИ АЛЛОГЕННОГО КОСТНОГО МОЗГА ...»
Федеральное государственное бюджетное учреждение
«Гематологический научный центр»
Министерства здравоохранения Российской Федерации
На правах рукописи
Богданов Рашит Фаргатович
«ТРАНСФУЗИИ ЛИМФОЦИТОВ ДОНОРА ПРИ РЕЦИДИВЕ
ЛЕЙКОЗА ПОСЛЕ ТРАНСПЛАНТАЦИИ АЛЛОГЕННОГО
КОСТНОГО МОЗГА»
14.01.21 – Гематология и переливание крови диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Научный руководитель:
доктор медицинских наук, профессор Л.П. Менделеева Москва Стр.
Оглавление Введение…………………………………………………………………. Глава 1. Обзор литературы. Трансфузии лимфоцитов донора (ТЛД) у реципиентов аллогенных гемопоэтических стволовых клеток………... 1.1. Рецидив гемобластоза после алломиелотрансплантации, значение иммунологических феноменов: реакции «трансплантат против хозяина» (РТПХ) и реакции «трансплантат против лейкоза» (РТПЛ)….. Лечение рецидивов после трансплантации аллогенных 1.2.
гемопоэтических стволовых клеток (алло-ТГСК)...……………………. Изменение содержания субпопуляций Т-лимфоцитов 1.3.
периферической крови у пациентов после алло-ТГСК и ТЛД…………. Глава 2. Характеристика больных и методы исследования…………….. Клиническая характеристика больных……………………………. 2.1.
Протокол трансплантации аллогенных гемопоэтических 2.2.
стволовых клеток………………………………………………………….. 2.3. Исследование гемопоэтического химеризма после алло-ТГСК….. 2.4. Адоптивная иммунотерапии после алло-ТГСК…………………… 2.5. Протокол адоптивной иммунотерапии……………………………. 2.6. Сбор и криоконсервирование лейкоконцентрата периферической крови донора костного мозга……………………………………………. 2.7. Диагностика и лечение реакции РТПХ после адоптивной иммунотерапии…………………………………………………………….. Исследование субпопуляций Т-лимфоцитов периферической 2.8.
крови на фоне трансфузий лимфоцитов донора…………………………. 2.9. Статистический анализ……………………………………………… Глава 3. Адоптивная иммунотерапия после алло-ТСГК………………. Адоптивная иммунотерапия гематологического рецидива 3.1.
гемобластоза после алло-ТГСК………………………………………….. 3.1.1. ТЛД как монотерапия гематологического рецидива гемобластоза после алло-ТГСК………………………………………….. 3.1.2. Химиотерапия с последующими ТЛД при гематологическом рецидиве гемобластоза после алло-ТГСК………………………………. 3.1.3. Эффективность адоптивной иммунотерапии, в зависимости от нозологической формы, фазы заболевания на момент алло-ТГСК, продолжительности ремиссии после алло-ТСГК……………………..…. 3.1.4. Показатели общей выживаемости в зависимости от эффективности адоптивной иммунотерапии…………………………….. 3.2. Повторная адоптивная иммунотерапия второго гематологического рецидива гемобластоза после алло-ТГСК ………………………….….. 3.2.1. ТЛД на фоне ремиссии, индуцированной курсом химиотерапии с последующим введением ИЛ-2………………………… 3.2.2. ТЛД с последующим введением ИЛ-2 в период миелотоксического агранулоцитоза после курса химиотерапии………. 3.3. Применение ТЛД при убывающем донорском химеризме после алло-ТГСК………………………………………………………………..… Глава 4. РТПХ после адоптивной иммунотерапии …………………….. 4.1. Острая форма РТПХ после адоптивной иммунотерапии ………….. 4.2. Хроническая форма РТПХ после адоптивной иммунотерапии …... 4.3. Влияние химиотерапии предшествовавшей ТЛД на частоту развития РТПХ……………………………………………………………... 4.4. Частота РТПХ после ТЛД в зависимости от диагноза, продолжительности ремиссии после алло-ТГСК, режима кондиционирования и наличия РТПХ после алло-ТГСК……................. Глава 5. Результаты адоптивной иммунотерапии, в зависимости от дозы перелитых лимфоцитов донора и режима их введения…………… 5.1. Сравнение эффективности адоптивной иммунотерапии и частоты развития РТПХ в зависимости от суммарного количества перелитых 5.2. Влияние конкретизации начальной дозы перелитых лимфоцитов донора с последующей их эскалацией на результаты адоптивной Глава 6. Субпопуляции Т-лимфоцитов периферической крови у больных гемобластозами на фоне ТЛД после трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток………………………... 6.1. Субпопуляции Т-лимфоцитов периферической крови больных гемобластозами на фоне ТЛД по поводу посттрансплантационного рецидива гемобластоза……………………………………………………. 6.2. Субпопуляции Т-лимфоцитов периферической крови больных гемобластозами на фоне ТЛД по поводу убывающего донорского химеризма…………………………………………………………………... Заключение……………………………………………………………….… Выводы……………………………………………………………………... Практические рекомендации…………………………………………..….. Список сокращений ………………………………………………..……… Список литературы……………………………………………………..….. Приложение 1………………………………………………………….…… Трансплантация аллогенных гемопоэтических стволовых клеток при гемобластозах является эффективным методом терапии, обеспечивающим не только достижение полной продолжительной ремиссии, но и в ряде случаев – биологического излечения за счет полной замены патологического кроветворения Л.С. Зубаровская и соавт., 2009; Л.С. Любимова и соавт., 2007; М.А. Масчан и соавт., 2011; Л.П. Менделеева и соавт., 2007; В.Г. Савченко и соавт., 2003;
А.Г. Румянцев и соавт., 2003]. Ежегодно в мире выполняется более алломиелотрансплантаций. При этом растет число алло-ТГСК не только от гистосовместимых сиблингов, но и от неродственных доноров [J.R. Passweg et al., 2012].
В настоящее время алло-ТГСК перешла из метода «терапии отчаяния»
прогрессирующих резистентных форм онкогематологических заболеваний в один противоопухолевого эффекта, достигнутого индукционной химиотерапией [Л.П. Менделеева и соавт., 2007; В.Г. Савченко и соавт., 2003].
Пятилетняя безрецидивная выживаемость после алло-ТГСК, выполненной при остром лейкозе (ОЛ) в период первой ремиссии, колеблется в пределах 65-75% [B.N. Savani et al., 2009; Y.J. Kim et al., 2010; C. Schmid et al., 2006;
E. Morris et al., 2004]. Анализ результатов алло-ТГСК у больных хроническим миелолейкозом (ХМЛ), выполненных на фоне первой хронической фазы показал, что общая выживаемость больных в течение 20 лет составляет 73%, а вероятность сохранения ремиссии на фоне полного донорского химеризма может достигать 96% [Л.С. Любимова и соавт., 2012].
Несмотря на попытки повысить противоопухолевую эффективность трансплантационного иммунологического феномена «трансплантат против лейкоза», рецидив гемобластоза после алло-ТСГК остается одной из основных причин неудач миелотрансплантации [A.J. Barrett et al., 2010; M. Duval et al., 2010; F. Dazzi et al., 2007; И.А. Демидова и соавт., 2007; Е.В. Семенова и соавт., 2011; Ю.Г. Иоффе и соавт., 2009, N.W. J van de Donk et al., 2006].
Посттрансплантационный рецидив развивается у 25 – 50% пациентов, при этом частота рецидивов зависит от степени гистосовместимости реципиента и донора, нозологического формы гемобластоза, а также фазы заболевания на момент алло-ТСГК [A.J. Barrett et al., 2010; M. Duval et al., 2010; F. Dazzi et al., 2007]. Рецидив является самой частой причиной летального исхода после аллоТГСК. Так, в 49% летальных исходов после алло-ТГСК от HLA-идентичного родственного донора (HLA – human leukocyte antigen, лейкоцитарный антиген человека) и 37% случаев после алло-ТГСК от неродственного донора обусловлены рецидивом заболевания [M.C. Pasquini et al., 2012].
В случае выполнения алло-ТГСК во время первой ремиссии острого лейкоза (ОЛ) или хронической фазы ХМЛ частота рецидивов не превышает 20%.
Если алло-ТГСК выполнена во второй и последующих ремиссиях или резистентном течении острого лейкоза, бластном кризе хронического миелолейкоза доля рецидивов достигает 40–70% [M. Duval et al., 2011].
Лечение посттрансплантационного рецидива гемобластоза всегда крайне затруднено, особенно в случаях рецидива, развившегося в ранние сроки после посттрансплантационного рецидива: прекращение иммуносупрессивной профилактики РТПХ, применение противорецидивной химиотерапии и выполнение повторной алло-ТСГК [B.E. Shaw et al., 2008; N. Kroger, 2011, R. Formankova et al., 2010].
посттрансплантационных рецидивов является адоптивная иммунотерапия трансфузиями лимфоцитов донора костного мозга, индуцирующая эффект «трансплантат против лейкоза» [H.J. Kolb et al., 1990; S. Slavin et al., 2002;
V. Savchenko et al., 1996; C. Schmid et al., 2007].
Результаты этого вида лечения зависят от многих причин, среди которых рассматриваются вариант заболевания, величина опухолевой массы и степень агрессивности рецидива, доза перелитых лимфоцитов донора. Так, у больных с молекулярным или цитогенетическим посттрансплантационным рецидивом ХМЛ частота достижения повторной ремиссии в результате применения ТЛД достигает 80%, при гематологическом рецидиве составляет 70-78%, а при рецидиве в виде бластного криза всего лишь 15 - 35% [P. Garland et al., 2010; M. Lubbert et al., 2010; H.J. Kolb et al., 2008; A. Deol et al., 2010]. При других нозологических формах результаты терапии посттрансплантационного рецидива весьма различны.
Так при остром миелобластном лейкозе (ОМЛ) ТЛД способствуют достижению ремиссии у 35 — 65% больных [A. Candoni et al., 2009; Z.A. Yegin et al., 2010;
A.W. Loren et al., 2008; M.R. Bishop et al., 2008], а при остром лимфобластном лейкозе (ОЛЛ) - 15-30% [M. Yoshimitsu et al., 2008; S.J. Choi et al., 2005].
У больных ОМЛ и ОЛЛ, которым проводились ТЛД на фоне развернутого рецидива частота повторных ремиссий, равнялась 15% и 18%, соответственно [R. Collins et al., 1997].
С целью оптимизации результатов адоптивной иммунотерапии и снижения риска наиболее тяжелого осложнения трансфузий лимфоцитов донора – РТПХ, посттрансплантационных рецидивов. Так, перед трансфузиями лимфоцитов донора применялась химиотерапия, назначалась кратковременная иммуносупрессивная терапия, использовались специфические субпопуляции Тлимфоцитов или гено-модифицированные эффекторные клетки, обсуждались варианты эскалации дозы переливаемых CD3+ клеток донора [G. Orti et al., 2009;
S.R. Riddell et al., 2002; M. Bornhuser et al., 2011; A.J. Barrett et al., 2010; K.
Rezvani et al., 2011; S. Mackinnon et al., 1995].
Однако до настоящего времени не найдено четких ответов на вопросы о схемах и интенсивности адоптивной иммунотерапии. Большое внимание в направленных на предупреждение посттрансплантационного рецидива. И в этой Предшествовавшими исследованиями убедительно доказано, что снижение донорского химеризма после алло-ТГСК свительствует о высоком риске рецидива гемобластоза.
В этой ситуации применение трансфузий лимфоцитов донора в качестве превентивной иммунотерапии может явиться единственным преимущественным терапевтическим подходом, опережающим развитие посттрансплантационного рецидива.
Приведенные сведения указывают на высокую актуальность проблемы, касающейся лечения и предупреждения посттрансплантационного рецидива трансплантологии, возможно, позволят разработать наиболее адекватный алгоритм терапии гемобластозов с помощью алло-ТГСК, включая ТЛД с лечебной и профилактической целью в посттрансплантационном периоде.
трансплантации аллогенного костного мозга.
1. Оценить эффективность различных схем адоптивной иммунотерапии у больных с гематологическим рецидивом и убывающим донорским химеризмом после алло-ТГСК.
2. Изучить результаты применения трансфузий лимфоцитов донора после химиотерапии в период миелотоксического агранулоцитоза у больных ОМЛ.
Определить прогностические факторы, способствующие достижению максимальных результатов.
иммунотерапии в случае диагностики второго посттрансплантационного рецидива.
4. Оценить вероятность РТПХ после трансфузий лимфоцитов донора и ее клинические характеристики, а также влияние РТПХ на результаты адоптивной иммунотерапии.
5. Сопоставить эффективность адоптивной иммунотерапии и частоту РТПХ при переливании различных доз лимфоцитов донора. Проанализировать значение конкретизации начальной дозы переливаемых CD3+клеток.
6. Проанализировать изменение содержания субпопуляций Т-лимфоцитов периферической крови у больных гемобластозами на фоне трансфузий лимфоцитов донора по поводу посттрансплантационного рецидива гемобластоза или убывающего донорского химеризма Научная новизна и практическая ценность работы В данной работе показана эффективность трансфузий лимфоцитов донора при гематологическом рецидиве и убывающем донорском химеризме у больных гемобластозами после алло-ТГСК. Проанализированы результаты адоптивной иммунотерапии в зависимости от схемы применения ТЛД при гематологическом рецидиве. Показана эффективность лечения повторного гематологического рецидива после проведения второго эпизода ТЛД. Выделены факторы, определяющие эффективность ТЛД, а также длительность сохранения ответа после адоптивной иммунотерапии.
Изучена частота развития острой и хронической формы РТПХ после адоптивной иммунотерапии.
гемобластозами после алло-ТГСК. Определена начальная доза CD3+клеток, равная 1х107клеток/кг. Введена эскалация дозы CD3+клеток во время второй и CD3+клеток/кг, соответственно). В качестве поддерживающей терапии после достижения полного донорского химеризма и отсутствия РТПХ рекомендовано введение интерлейкина-2 (5-дневный курс, суммарная доза 10 млн.МЕ).
периферической крови у больных гемобластозами на фоне ТЛД по поводу посттрансплантационного рецидива гемобластоза или убывающего донорского химеризма.
Полученные результаты используются в работе отдела химиотерапии гемобластозов, депрессий кроветворения и трансплантации костного мозга ФГБУ ГНЦ Минздрава России (Генеральный директор - академик РАН, профессор, д.м.н. В.Г. Савченко, заведующая отделом – д.м.н. Е.Н. Паровичникова).
Разработан и внедрен в клиническую практику ФГБУ ГНЦ Минздрава России алгоритм адоптивной иммунотерапии гематологического рецидива, а также предупреждения рецидива при убывающем донорском химеризме после алло-ТГСК.
Показано, что адоптивная иммунотерапия посттрансплантационного рецидива, включающая ТЛД (+ИЛ-2) в период миелотоксического агранулоцитоза после курса химиотерапии, позволила повысить частоту полных ремиссий ОМЛ.
Частота достижения полного ответа и его продолжительность у пациентов с гематологическим рецидивом после алло-ТГСК зависит от нозологической формы заболевания, схемы адоптивной иммунотерапии (применение химиотерапевтических препаратов перед переливаем лимфоцитов донора) и длительности ремиссии после алло-ТГСК (более 6 месяцев).
Несмотря на то, что больные со вторым посттрансплантационным рецидивом гемобластоза относятся к группе с крайне неблагоприятным прогнозом, повторные ТЛД с предшествовавшей ХТ обеспечивают достижение очередной ремиссии.
Наличие РТПХ после ТЛД было ассоциировано с достижением ремиссии и восстановлением полного донорского химеризма, а длительность сохранения ответа зависела от наличия хронической формы РТПХ.
Клиническое течение хронической РТПХ аналогично коррелировало с величиной дозы перелитых большее число органов-мишеней вовлекалось в иммунологический конфликт, характеризующийся и более тяжелыми клиническими проявлениями.
Отмечено, что применение нового алгоритма ТЛД, основанного на конкретизации начальной дозы CD3+клеток, позволило достоверно снизить частоту острой РТПХ.
Результаты качественной и количественной оценки субпопуляций Т-лимфоцитов позволили охарактеризовать изменения содержания количества Т-хелперов, цитотоксических клеток, Т-регуляторных клеток и NK-клеток в зависимости от фазы заболевания и степени ответа на проводимую адоптивную иммунотерапию.
Основные положения диссертации представлены в постерных докладах на XXXVIII симпозиуме Европейской группы по трансплантации костного мозга (Париж, 2011г.); на Конгрессе гематологов России (Москва, 2012г.); на 55-м конгрессе Американского общества гематологов (Новый Орлеан, 2013г.);
включены в доклад на V международном симпозиуме «Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток у детей и взрослых» (Санкт-Петербург, 2011г.), а также в доклад на Конгрессе гематологов России (Москва, 2012г.).
По теме диссертации опубликовано 7 научных работах из них 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК. Подана заявка на получение патента на изобретение: «Способ лечения рецидива острого миелоидного лейкоза после трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток»
(регистрационный номер – 2013133428, от 19.07.2013г.).
Структура диссертации
Работа выполнена в клинике ФГБУ ГНЦ Минздрава России (Генеральный директор - академик РАН, профессор, д.м.н. В.Г. Савченко). Диссертация состоит из шести частей, включающих введение, обзор литературных данных, клиническую характеристику больных и методы исследования, результаты, заключение, выводы и список литературы. Работа изложена на 172 страницах машинописного текста. Текст работы содержит 41 таблицу, 13 рисунков и одно приложение. Указатель литературы включает 163 отечественных и зарубежных источников.
Глава 1. Обзор литературы. Трансфузии лимфоцитов донора у реципиентов аллогенных гемопоэтических стволовых клеток Рецидив гемобластоза после алло-ТГСК, значение иммунологических 1.1.
Трансплантация аллогенных гемопоэтических стволовых клеток в настоящее время занимает твердые позиции в клинической медицине, превратившись из метода «терапии отчаяния» крайне тяжелых резистентных форм онкогематологических заболеваний в один из этапов терапии [1, 14, 15, 16, 17, 20, 21]. Кроме гематологических заболеваний алло-ТГСК применяется при некоторых онкологических и наследственных заболеваниях [1, 6, 10]. С каждым годом увеличивается количество выполненных алло-ТГСК. Так, ежегодно в мире проводят более 25 000 алло-ТГСК от гистосовместимого родственного или неродственного, а также гаплоидентичного доноров [11, 28, 110, 111, 149].
миелотрансплантации колеблется от 65 до 75% для больных острыми лейкозами (ОЛ) в первой ремиссии и ХМЛ в хронической фазе. Данный показатель снижается до 7 - 20%, если алло-ТГСК была выполнена вне ремиссии ОЛ или бластном кризе и фазе акселерации ХМЛ [14, 55, 103].
Анализ результатов алло-ТСК у больных ХМЛ, выполненных в научноклиническом отделении высокодозной химиотерапии и трансплантации костного мозга ФГБУ Гематологический научный центр Минздрава России, показал, что общая выживаемость больных в течение 20 лет составила 73%, при этом частота рецидивов не превышала 11%. Вероятность сохранения ремиссии на фоне полного донорского химеризма может достигать 96%, если алло-ТГСК предпринималась в первой хронической фазе хронического миелолейкоза [15].
Преимущество алло-ТГСК перед стандартной высокодозной химиотерапией заключается в комбинированном эффекте химио- или радиотерапевтического воздействия предтрансплантационного кондиционирования и в способности иммунокомпетентных аллогенных донорских Т-лимфоцитов элиминировать остаточные опухолевые клетки в результате эффекта РТПЛ [70, 75].
Идея присутствия этого иммунологического эффекта была выдвинута в 1957г D. Barnes и J. Loutit, которые показали, что у всех мышей с ОЛ после проведения миелоаблативного облучения с последующей трансплантацией сингенного костного мозга развился рецидив, а у мышей, получивших аллогенный миелотрансплантат и погибших от тяжелой РТПХ, при аутопсии не было признаков ОЛ [32]. Из этого исследования было сделано два вывода.
Первый вывод заключался в том, что миелоаблативная радиотерапия не обеспечивает полной эррадикации лейкемических клеток, но существует противоопухолевый иммунный эффект. И второй вывод - именно присутствием иммунных механизмов объясняется сниженный риск рецидивов лейкоза после трансплантации аллогенного костного мозга, в сравнении с трансплантацией аутологичного или сингенного. Кроме того при развитии у реципиента РТПХ наблюдается меньшая частота рецидивов лейкоза [70, 75].
Успех алло-ТГСК ограничивают многочисленные посттрансплантационные осложнения. РТПХ является самым частым осложнением, возникающим в результате сложных взаимодействий между иммунокомпетентными клетками костного мозга донора и клетками органов-мишеней реципиента [6, 69].
Развитие РТПХ после алло-ТГСК является частью иммунологического ответа и служит маркером протекающей параллельно РТПЛ [156, 157]. Наличие острой или хронической РТПХ сопровождается меньшим риском рецидива после алло-ТСГК. [10, 37, 68, 146, 148]. В последующих исследованиях с целью индукции РТПХ и соответственно РТПЛ стали использовать раннюю отмену посттрансплантационной иммуносупрессии для профилактики рецидива, а также при смешанном химеризме [83, 118, 146].
РТПХ и РТПЛ реализуются при участии Т-лимфоцитов и клеток естественных киллеров, которые взаимодействуют с клетками реципиента.
Иммунологическая реакция после алло-ТГСК проходит фазы индукции, экспансии и непосредственного воздействия. В фазе индукции принимают участие CD4+ и CD8+ Т-клетки, взаимодействующие с антигенами I и II классов главного комплекса гистосовместимости антигенпрезентирующих клеток реципиента. Сигнал активации для Т-клеток осуществляется с участием Т-клеточного рецептора и рецепторов CD3, CD4 и CD8, а также молекул, обеспечивающих дополнительный (вторичный) стимулирующий эффект, к антигенпрезентирующих клетках, и CD28 на лимфоцитах [10, 59, 82].
интерлейкина-12 Т-клетки приобретают характеристики Т-хелперов (Th-1 и Th-2) или цитотоксических Т-лимфоцитов (Тс1- или Тс2), синтезирующих про- или противовоспалительные факторы. Активированные Т-лимфоциты донора повреждают клетки органов – мишеней реципиента, а также и злокачественные клетки, что приводит к развитию острой и хронической РТПХ и РТПЛ. При развитии острой РТПХ происходит преимущественная активация Th1 Т-хелперов, при возникновении хронической РТПХ - Th2 Т-хелперов [59, 68]. Однако, в некоторых случаях индукция РТПЛ может происходить при отсутствии РТПХ [92].
первичным неприживлением или отторжением миелотрансплантата, а также рецидивом заболевания [27, 35, 71]. Каждое из перечисленных осложнений может явиться причиной гибели больного.
Рецидив гемобластоза после алло-ТГСК остается дольно частой причиной неудач данного метода терапии. [35, 52, 61, 66, 119]. Так, 37% случаев летальных исходов при родственной и 49% случаев при неродственной алло-ТГСК обусловлены рецидивом заболевания. [110].
Несмотря на высокую интенсивность режимов кондиционирования и миелотрансплантации, аутологичные гемопоэтические клетки могут длительное время оставаться в организме реципиента [4, 13, 29, 34, 125, 147]. За счет этих резидуальных клеток в ряде случаев происходит полное или частичное восстановление кроветворения хозяина, в котором могут присутствовать как нормальные, так и опухолевые клетки [109].
В подавляющем большинстве случаев рецидив возникает из опухолевых клеток хозяина, «переживших» режим кондиционирования [46]. Состояние, при котором Т-клетки донора «контролируют» резидуальный клон опухолевых клеток и сдерживают развитие рецидива, может продолжаться длительное время. Однако персистенция остаточных опухолевых клеток всегда свидетельствует о высоком риске рецидива [9, 118, 121]. В очень редких случаях рецидив гемобластоза может возникнуть из донорских клеток [25, 101, 127].
С течением времени существование резидуального клона опухолевых клеток приводит к селекции субклонов клеток с измененным фенотипом.
Основные механизмы иммунологического «избегания» опухолевыми клетками реципиента взаимодействия с иммунокомпетентными клетками донора представлены в работе H.J. Kolb и соавт. [82]. Так, авторы отмечают, что клетки центральной нервной системы, кожи, яичек, подкожной жировой клетчатки, признаны иммунологически «привилегированными» и экстрамедуллярное распространение опухолевых клеток является наиболее неблагоприятным признаком при посттрансплантационном рецидиве. Среди других факторов авторы выделяют снижение экспрессии костимуляторных молекул (CD80, CD83, CD86, CD40, LFA-1) на опухолевых клетках, секрецию опухолевыми клетками ингибиторных цитокинов (Интерлейкина-10, трансформирующего фактора ростабета), резистентность опухолевых клеток к провоспалительным цитокинам (Фактор некроза опухоли–альфа (ФНО-альфа), ИНФ-гамма.
В результате присутствия указанных процессов, в костном мозге реципиента отбираются опухолевые субклоны, резистентные к воздействию иммунокомпетентных клеток донора, бесконтрольная пролиферация которых приводит к развернутому рецидиву лейкоза [54].
Активация естественных киллерных клеток (NK-клетки) также является частью иммунологической реакции и происходит в ранний период после алло-ТГСК. Клетки натуральные киллеры выделяют цитокины, ответственные за регуляцию Т-клеток (ИНФ-альфа, ФНО-альфа), и отвечают за противовирусный и противоопухолевый иммунитет. Клетки натуральные киллеры экспрессируют антигены CD56 и CD16, посредством которых осуществляется антителозависимая цитотоксическая реакция. Функция этих клеток зависит от присутствия иммуноглобулиноподобных рецепторов естественных киллеров – KIRs (killer immunoglobulin–like receptors), взаимодействующих с I классом HLA- системы на клетках мишенях реципиента. Несовместимость KIRs-лиганда, выявляемая на основании различия антигенов HLA-системы I класса пары донор-реципиент приводит к развитию аллореактивности естественных киллеров донора с последующим лизисом клеток – мишеней, в том числе опухолевой природы [10, 106].
Высокая вероятность развития рецидива при наличии смешанного химеризма и маркеров остаточной болезни, объясняется тем, что сосуществование резидуальных опухолевых клеток и клеток донора приводит к ослаблению РТПЛ за счет формирования взаимной толерантности [72, 90, 147].
Большое значение при изучении механизмов таких феноменов, как развитие посттрансплантационной толерантности, РТПХ и РТПЛ, а также приживления или отторжения миелотрансплантата, придается исследованию гемопоэтического химеризма после алло-ТСГК [2, 9, 23, 94].
В трансплантологии термин «химера» впервые был использован в 1956 г., К. Ford и соавт. применили этот термин при описании мышей, которым после облучения были введены гемопоэтические клетки другого животного [60].
В настоящее время термин «гемопоэтический химеризм» включает в себя несколько понятий, принятых Международным регистром трансплантации костного мозга (International Bone Marrow Transplant Registry, IBMTR) [27]. Так, «полный донорский химеризм» подразумевает обнаружение в костном мозге реципиента 100% клеток донора. Термин «смешанный химеризм» используют для описания ситуаций, когда после алло-ТГСК в костном мозге обнаруживают клетки реципиента и донора одновременно.
Стабильный смешанный химеризм диагностируется при обнаружении относительно постоянного соотношения клеток донора и реципиента (колебания менее 5%) в двух и более последовательно исследованных образцах крови или костного мозга. При этом содержание донорских клеток может составлять около 80%. Возрастающий (или убывающий) донорский химеризм устанавливается при выявлении увеличения (или уменьшения) числа донорских клеток более, чем на 5% от предыдущего уровня.
В исследовании, проведенном Е.И. Желновой и соавт., обнаружена высокая корреляция возникновения посттрансплантационных рецидивов с наличием смешанного гемопоэтического химеризма хотя бы в одной клеточной популяции у больных в течение года после алло-ТГСК (р = 0,005). Наиболее значимой оказалась взаимозависимость наличия смешанного гемопоэтического химеризма с возникновением рецидива у пациентов из группы высокого риска, страдающих ОЛ и МДС (р = 0,0005) [9].
В работе G. Rossi и соавт. также указывалось на тесную связь наличия смешанного химеризма и резидуальной болезни после алло-ТСГК. Так, у больных ОЛ при наличии смешанного химеризма чаще выявлялись признаки остаточной болезни (75% против 33%) и экспрессия гена WT1 (58% против 29%), чем у пациентов с полным донорским химеризмом. При этом двухлетняя безрецидивная выживаемость и общая выживаемость были выше в группе пациентов без признаков резидуальной болезни [125].
Лечение посттрансплантационного рецидива, особенно в ранние сроки после алло-ТГСК, всегда затруднено. По данным исследования, проведенного A.
Loren и соавт., однолетняя общая выживаемость больных ОМЛ, рецидив у которых развился через 6 и более месяцев после алло-ТГСК, составила 44%, по сравнению с 10% для больных, рецидив у которых был диагностирован в первые 6 месяцев после алло–ТГСК [87].
В качестве терапии гематологического рецидива гемобластоза после алло-ТГСК в различное время предлагали следующие методики: химиотерапия, вторая алломиелотрансплантация, цитокиновая терапия и адоптивная иммунотерапия [53, 57, 61, 80, 103, 130, 140, 151]. При изолированном экстрамедуллярном или сочетанном рецидиве (экстрамедуллярный + костномозговой) проводится также лучевая терапия или оперативное вмешательство, как правило, в сочетании с перечисленными выше методами [13, 47, 129].
посттрансплантационного рецидива гемобластоза, невысока и напрямую зависит от нозологической формы гемобластоза и сроков возникновения рецидива [105, 136]. Результаты исследования S. Sica и соавт. свидетельствовали о том, что при позднем посттрансплантационном рецидиве (более 9 месяцев после алло-ТГСК) продолжительность этих ремиссий была короткой (14 месяцев) [140].
По оценкам большинства специалистов, в случае рецидива лейкоза на ранних сроках (на протяжении 6-12 месяцев после алло-ТГСК) результаты терапии значительно хуже, что обусловлено, в том числе тем, что в эти сроки интенсивная химиотерапия сопровождается крайне высокой летальностью. У пациентов с рецидивом, возникшим в более поздние сроки после алло-ТСГК, повторные ремиссии удается индуцировать чаще. Однако эти результаты лечения нельзя считать удовлетворительными вследствие краткосрочности достигнутых трансплантации костного мозга показало, что стандартная химиотерапия позволяет достигнуть повторной ремиссии у 40% больных с ОЛ, но продолжительность ее составляет не более 8-14 месяцев. Всего у 3% пациентов период ремиссии превышает 2 года [53].
Вторая алло-ТГСК может рассматриваться в качестве эффективного метода терапии посттрансплантационного рецидива. Однако выполняется вторая аллогенная миелотрансплантация только 2-20% реципиентов с рецидивом после алло-ТГСК [57]. Это обусловлено высокой летальностью, связанной с повторной трансплантацией (36%-50%) и весьма скромными показателями двухлетней общей выживаемости (27%). Среди прогностических факторов, влияющих на результат второй алло-ТГСК, наиболее важными являются интервал времени между первой алло-ТГСК и рецидивом и наличие хронической РТПХ после второй алло-ТГСК [130].
По данным B.E. Shaw и соавт. после второй алло-ТГСК, выполненной с посттрансплантационных рецидивов в течение первого года у больных ОЛ лимфопролиферативными заболеваниями (18%) [138].
Наиболее эффективным методом лечения посттрансплантационного рецидива является адоптивная иммунотерапия [80, 131, 145].
Иммунотерапия - это метод лечения, основанный на стимулировании иммунокомпетентных клеток, атакующих, в том числе опухолевые клетки.
подразумевает воздействие на иммунную систему организма человека с целью получения эффективного иммунного ответа против опухолевых клеток. К ней относится активная специфическая иммунотерапия с использованием различных противоопухолевых вакцин.
Пассивная иммунотерапия подразумевает введение в организм больного рекомбинантных цитокинов или иммунокомпетентных клеток. В соответствии с основным компонентом, используемым при лечении, пассивная иммунотерапия подразделяется на клеточную и цитокинотерапию [12].
используют: ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-12; ФНО-альфа; Интерферон-альфа (ИНФальфа) и гамма (ИНФ-гамма) [12, 26, 63, 155, 158].
стимулирующая рост Т-клеток [88]. ИЛ-2 вырабатывается активированными Т-хелперами I типа (Th1) (90% продукции эндогенного ИЛ-2), а также цитотоксическими CD8+ лимфоцитами (10% продукции эндогенного ИЛ-2) [30].
ИЛ-2 обладает выраженным стимулирующим эффектом на NK-клетки и лимфокинактивированные киллеры клетки [26].
Основное иммуномодулирующее свойство ИЛ-2 состоит в активации цитотоксических Т-лимфоцитов при взаимодействии со специфическими рецепторами на их мембране [26].
С целью предупреждения рецидива после трансплантации аутологичных гемопоэтических стволовых клеток в начале 1990-х годов были предприняты попытки использования посттрансплантационной цитокиновой терапии. При применении этого метода рассчитывали на достижение лучшего контроля над минимальной резидуальной болезнью (МРБ) за счет активации различных звеньев неспецифического противоопухолевого иммунитета. В публикациях этого контролировать миелоидные лейкемические клетки, а терапия ИЛ-2 способна восстанавливать нарушенные функции аутологичных NK- клеток [143, 144].
Иерусалиме в 1986 г. [142]. Через несколько лет опубликованы результаты успешного применения переливаний донорских лимфоцитов в Германии. По данным клинического исследования Н.J. Kolb и соавт. [80], у больных с гематологическим рецидивом ХМЛ после алло-ТГСК, удалось достичь полную цитогенетическую ремиссию в результате ТЛД без использования химио- или лучевой терапии. Лечение посттрансплантационного рецидива с помощью ТЛД позже было описано и другими учеными [48, 88, 131].
Впервые результаты успешного применения ИЛ-2 в сочетании с ТЛД при рецидиве гемобластоза после алло-ТГСК были опубликованы S. Slavin и соавт. в 1996г [144]. Пациенту с посттрансплантационным рецидивом ОЛЛ были перелиты лимфоциты донора после предварительного их инкубировали с ИЛ-2. В результате у больного была достигнута полная длительная ремиссия заболевания.
В исследовании, представленном E. Nadal и соавт., была описана эффективность применения рекомбинантного ИЛ-2 у больных гемобластозами, не ответивших на монотерапию лимфоцитами донора по поводу рецидива гемобластоза после алло-ТГСК. В результате терапии ИЛ-2 у 38% больных получена полная ремиссия и у 31% больных частичная ремиссия [103]. Позднее было проведено несколько клинических исследований сочетанного использования ИЛ-2 и ТЛД [8, 43, 154, 163]. Рекомендуемая доза ИЛ-2 в сочетании с ТЛД для индукции ремиссии была равна 1 МЕ/м2/день [76].
Переливания лимфоцитов донора как способ индукции иммунного ответа против опухолевых клеток при рецидиве лейкоза после алло-ТГСК в нашей стране применяют c 1993года. В научно-клиническом отделении высокодозной химиотерапии и трансплантации костного мозга ФГБУ ГНЦ Минздрава России впервые в России получены успешные результаты лечения пациентов с посттрансплантационным рецидивом ОЛ [131].
посттрансплантационном гематологическом рецидиве осуществлялись в виде монотерапии и выполнялись на развернутой картины лейкоза. Лейкоконцентрат, полученный из периферической крови донора, вводился большими дозами клеток еженедельно до достижения полной ремиссии или развития РТПХ.
выполнялось после достижения ремиссии.
К 2003 году была разработана и внедрена в клиническую практику новая методика адоптивной иммунотерапии посттрансплантационных рецидивов, основанная на применении лимфоцитов донора в период миелотоксического агранулоцитоза после курса ХТ, причем после каждой процедуры ТЛД осуществлялось введение ИЛ-2 в дозе 6 млн.МЕ. Предполагалось, что именно в период миелотоксического агранулоцитоза опухоль максимально угнетена и для восстановления донорского кроветворения созданы наилучшие условия. Введение ИЛ-2 предложено в расчете на его активизирующее влияние на донорские иммунокомпетентные клетки. Кроме того, указанная методика лечения посттрансплантационного рецидива предполагала поддерживающую терапию ИЛ-2 в течение нескольких лет, с целью контроля над минимальной резидуальной болезнью [8].
наилучшими результатами лечения посттрансплантационного рецидива гемобластоза, однако в данной группе больных была зафиксирована весьма высокая частота РТПХ.
С целью снижения риска РТПХ при ТЛД в 2011г была модифицирована предыдущая схема адоптивной иммунотерапии. Новый алгоритм терапии заключался в конкретизации начальной дозы переливаемых CD3+клеток на уровне 1х107клеток/кг с последующей эскалацией дозы CD3+клеток при каждом переливании на 5х107клеток/кг [18].
На основании результатов многочисленных исследований по применению ТЛД были сформулированы факторы, определяющие эффективность данного метода [22, 87, 120]. Одними из первых были выделены нозологическая форма заболевания и фаза заболевания на момент ТЛД (цитогенетический или гематологический рецидив). Позднее выделен временной фактор – интервал от трансплантации аллогенных гемопоэтических клеток до рецидива, а также фаза заболевания на момент алло-ТГСК и другие.
В первых исследованиях в этой области было показано, что эффективность ТЛД зависела от величины опухолевой массы на момент начала трансфузий [76].
Так, у больных с молекулярным или цитогенетическим посттрансплантационным рецидивом ХМЛ частота достижения повторной ремиссии в результате применения ТЛД более 80%, при гематологическом рецидиве составляет 50-70%, а при рецидиве в виде бластного криза всего лишь 15 - 35% [62, 81]. При других нозологических формах результаты терапии посттрансплантационного рецидива весьма различны. Так при ОМЛ переливания лимфоцитов донора способствуют достижению ремиссии у 35 — 65% больных [45, 56, 115, 130], а при ОЛЛ - 15Важное значение величины опухолевой массы перед началом ТЛД подтвердило ретроспективное исследование, в котором были проанализированы посттрансплантационным рецидивом гемобластоза. Так, частота ремиссий после завершения адоптивной иммунотерапии была выше у пациентов с цитогенетическим рецидивом и хронической фазой ХМЛ (76%). Если адоптивная иммунотерапия выполнялась в фазу акселерации или бластного криза результаты адоптивной иммунотерапии были хуже (33% и 17%, соответственно). У больных с ОМЛ и ОЛЛ, которым проводились ТЛД на фоне развернутого рецидива, частота повторных ремиссий равнялась 15% и 18%, соответственно [48].
У больных с лимфопролиферативными заболеваниями ТЛД обеспечивают более оптимистичные результаты. Так, частота повторных ремиссий при множественной миеломе (ММ) колеблется от 40% до 65% [102, 153], при лимфогранулематозе (лимфома Ходжкина) – от 45% до 55% больных [114], при фолликулярной лимфоме – от 75% до 85% больных [39, 132] и при диффузной В-крупноклеточной лимфоме равна 60% [38, 95].
Существенные отличия частоты достижения повторной ремиссии в результате терапии лимфоцитами донора у больных с разными заболеваниями обусловлены несколькими причинами: различной кинетикой опухолевых клеток при определенных формах гемобластозов, более выраженной экспрессией антигенов комплекса гистосовместимости и костимуляторных молекул на опухолевых клетках ХМЛ по сравнению с ОЛ, секрецией цитокинов опухолевыми клетками, ингибирующими активированные лимфоциты, экспрессией FASL (FAS ligand, лиганд рецептора смерти), предотвращающего апоптоз клетки, и наличием специфических опухолевых антигенов на злокачественных клетках, позволяющих избегать контакта с донорскими цитотоксическими Т-лимфоцитами [82].
Другим объяснением более низкой эффективности ТЛД при ОЛ является высокая скорость пролиферации лейкемического клона во время рецидива и относительно медленное действие эффекта РТПЛ. Для индукции эффекта «трансплантат против лейкоза» требуется несколько недель. За это время предшественники цитотоксических клеток донора активируются комплексом антигена и молекул MHC I класса MHC (major histocompatibility complex, главный комплекс гистосовместимости), пролиферируют и дифференцируются под действием ИЛ-2. Сформированные цитотоксические клетки донора циркулируют в кровеносной и лимфатической системах. При получении сигнала активации от Т-хелперов начинает пролиферировать определнный клон цитотоксических клеток [62, 75].
Высокая частота достижения ремиссий после ТЛД на фоне хронической фазы ХМЛ, цитогенетического и/или молекулярного рецидивов гемобластозов может быть объяснена более медленной скоростью пролиферации опухоли и наличием времени, необходимого для формирования РТПЛ. У пациентов с развернутым рецидивом гемобластоза опухолевые клетки прогрессируют намного быстрее, таким образом, быстропрогрессирующие гемобластозы менее чувствительны к иммунотерапии [35]. В этом случае для эррадикации опухолевых клеток и индукции повторной ремиссии проводится химиотерапия.
В работе, проведенной J. Miller и соавт., отмечено, что применение ТЛД после предварительного выполнения курсов ХТ, сопряжено с более высокой частотой развития РТПХ, по сравнению с монотерапией лимфоцитами донора. У больных, которым до ТЛД проводилась химиотерапия циклофосфамидом и флударабином, острая РТПХ I –II степени была диагностирована в 60% случаев, а III – IV степени - 47% случаев. При этом в группе больных, получивших только ТЛД, частота острой РТПХ была значительно ниже и составляла 24% и 14% соответственно [98].
Таким образом, для достижения максимального противоопухолевого эффекта за счет РТПЛ при минимальном риске развития РТПХ и токсичности, T. Guillaume и соавт. предложили не только эскалировать дозу CD3+клеток при последующих трансфузиях, а также увеличивать дозы химиотерапевтических препаратов, вводимых до ТЛД [65].
В настоящее время среди подходов, направленных на уменьшение частоты РТПХ, рассматривается селективное удаление CD8+ клеток из лейкоконцентрата [107]. Также в качестве метода, повышающего эффективность РТПЛ, было предложено переливать лимфоциты от гаплоидентичного донора [106, 126].
Проводятся исследования по определению и выделению для последующих трансфузий Т-лимфоцитов, специфичных к антигенам бластных клеток (WT1, PR1) [41] или к минорным антигенам гистосовместимости (mHAgs) [124]. В модифицированных лимфоцитов донора [40, 77, 152] и противоопухолевых вакцин [33, 34, 123].
ТЛД для лечения посттрансплантационных рецидивов гемобластоза могут химиотерапевтических препаратов [113]. Для определенных нозологических форм ТЛД могут комбинироваться с противоопухолевыми препаратами биологически направленного действия. Так для больных с рецидивом Ph-позитивного ОЛ или ХМЛ после последовательного применения ХТ и ТЛД назначают ингибиторы тирозинкиназ (иматиниб, нилотиниб, дазатиниб) [62, 137, 141, 150, 161]. При посттрансплантационном рецидиве ОМЛ, трансформировавшегося из МДС, или МДС переливания лимфоцитов донора комбинируют с гипометилирующими препаратами (азацитидин) [50, 89]. При посттрансплантационном рецидиве множественной миеломы (ММ) в качестве препаратов биологически направленного действия после ТЛД применяют ингибиторы протеасом (бортезомиб) [102, 153] или иммуномодулирующие препараты (леналидомид, талидомид) [84]. При рецидиве лимфопролиферативных заболеваний кроме ХТ и ТЛД дополнительно включают моноклональные антитела [104, 114].
В случае гематологического рецидива гемобластоза после алло-ТГСК, в большинстве трансплантационных центров лечебный процесс начинается с назначения 1-2 курсов ХТ, которые направлены в первую очередь на уменьшение опухолевой массы. Однако пока еще не существует единого мнения об интенсивности проводимой химиотерапии: высокие или малые дозы цитарабина, FLAG-Ida, «7+3-Ida» [3, 22, 96, 105, 134]. Не определены четкие сроки выполнения первой ТЛД после курса ХТ: в период аплазии или после достижения повторной ремиссии [52, 97]. Не уточнено необходимое количество переливаемых CD3+клеток. Не определена необходимость и целесообразность сочетания ТЛД с таргентными препаратами (ингибиторы тирозинкиназ, ингибиторы протеасом) [102, 150], цитокинами (ИЛ-2, ИНФ-альфа) [76, 103, 117].
Некоторыми учеными рекомендовано выполнять первую ТЛД после достижения с помощью ХТ повторной ремиссии и восстановления полного донорского химеризма. Несмотря на значительную частоту повторной ремиссии (42-65%) у больных с посттрансплантационным рецидивом ОМЛ общая выживаемость остается низкой (19-30%). Основными причинами высокой летальности являются рецидив и прогрессия ОМЛ, а также тяжелое течение РТПХ [35, 45]. Повторная ремиссия может быть достигнута после трансфузий лимфоцитов донора без использования предварительной химиотерапии, однако это характерно для заболеваний с медленной опухолевой прогрессией, например ХМЛ, ММ [51, 82, 102].
Большинство исследователей, изучавших эффективность адоптивной иммунотерапии при посттрансплантационном рецидиве гемобластоза, убедительно доказали совместное существование двух иммунологических феноменов: РТПХ и РТПЛ. Авторы выявили прямую корреляцию между эффективностью переливаний лимфоцитов донора и развитием РТПХ [22, 82]. По данным D. Porter и соавт. у 89% больных, достигших ремиссию после адоптивной иммунотерапии, была диагностирована острая РТПХ [116].
A. Raiola и соавт. в своей работе показали, что острая РТПХ после адоптивной иммунотерапии является показателем длительного сохранения полученного эффекта [120].
В работе О.А. Слесарчук и соавт. отражено статистически достоверное влияние хронической РТПХ, развившейся после переливаний лимфоцитов донора, на длительность сохранения ответа. Так, четырехлетняя общая выживаемость всех пациентов и двухлетняя безрецидивная выживаемость пациентов, ответивших на адоптивную иммунотерапию и получивших профилактические ТЛД, при развитии хронической РТПХ после ТЛД составила 64% и 53%, соответственно. У больных без хронической РТПХ после адоптивной иммунотерапии данные показатели были равны 11% и 13%, соответственно [22].
Однако не во всех работах была выявлена зависимость эффекта после адоптивной иммунотерапии от частоты манифестации РТПХ [85].
Попытки разделения этих двух иммунологических феноменов (РТПЛ и РТПХ) предпринимаются различными методами: использование небольших доз лимфоцитов донора с последующей эскалацией количества перелитых клеток, выделение (селекция) для переливания популяции лимфоцитов ответственных за иммуносупрессивной терапии [92].
определение оптимальной дозы переливаемых лимфоцитов донора, до сих пор нет единого мнения о дозе CD3+клеток, которая индуцировала бы РТПЛ при минимальном риске развития острой РТПХ.
Так, в публикациях зарубежных авторов представлены противоположные мнения в отношении зависимости результатов адоптивной иммунотерапии от дозы перелитых CD3+клеток. В одних работах утверждалось, что доза CD3+клеток не оказывала влияние на эффективность адоптивной иммунотерапии, длительность сохранения ответа и частоту РТПХ. Однако, в других работах была показана зависимость частоты достижения ремиссии и диагностирования РТПХ от количества перелитых лимфоцитов донора [22, 93, 116, 139, 160].
посттрансплантационным рецидивом ХМЛ была определена оптимальная доза 1х107CD3+клеток/кг веса больного [92].
исследования, проведенного M. Bar и соавт. в нескольких трансплантационных центрах США, в котором было оценено влияние начальной дозы CD3+клеток на посттрансплантационного рецидива гемобластоза. Полученные результаты доказали эффективность и низкий риск развития РТПХ после ТЛД в начальной дозе менее 10х107CD3+клеток/кг. [31]. Наиболее важным прогностическим фактором, влияющим на показатели выживаемости после терапии лимфоцитами донора, оказалось время от алло-ТГСК до констатации рецидива ОЛ.
Поскольку одним из основных осложнений терапии лимфоцитами донора является РТПХ, частота которой может составлять от 10% до 50% [159], S. Mackinnon и соавт., с целью снижения частоты РТПХ предложил новую посттрансплантационным рецидивом ХМЛ выполнялось несколько последовательных трансфузий, начиная с низких доз с последующей эскалацией дозы клеток через определенные интервалы времени [92]. Авторы показали, что используя небольшие дозы клеток возможна индукция РТПЛ без развития РТПХ.
В дальнейшем эффективность данной схемы терапии изучалась и другими исследователями [52, 65].
С целью повышения эффективности адоптивной иммунотерапии, а также предупреждения иммунного конфликта в виде РТПХ возможно применение селектированной субпопуляции Т-лимфоцитов. Данный метод позволяет выделить из лейкоконцентрата те популяции лимфоцитов, которые обладают наиболее выраженным противоопухолевым эффектом (Т-хелперы, NK-клетки) и удалить иммунокомпетентные клетки, ответственные за развитие РТПХ (цитотоксические Т-лимфоциты). [43, 79, 107, 126, 128].
Применение трансфузий NK–клеток рассматривается в настоящее время в качестве перспективного инновационного метода иммунотерапии. Основным преимуществом NK – клеточной терапии является способность индукции РТПЛ, не вызывая при этом РТПХ [92].
Наиболее выраженный эффект «трансплантат против лейкоза» после трансфузий NK – клеток от гаплоидентичного донора, особенно в условиях несоответствия KIR-лиганда между донором и реципиентом [64, 126].
В исследовании J.E. Rubnitz и соавт. пациентам с высоким риском посттрансплантационного рецидива ОМЛ выполнялись трансфузии NK–клеток после введения малых дозах флюдарабина и циклофосфамида. Все больные в течение двух лет после адоптивной иммунотерапии были живы без признаков лейкоза и РТПХ, сохраняя полный донорский химеризм. Таким образом, было показано, что трансфузии NK – клеток являются безопасным и эффективным методом профилактики рецидива после алло-ТГСК [126].
В литературе представлены также сведения о том, что этот метод может быть использован для лечения посттрансплантационного рецидива гемобластоза[58]. S. Nguyen и соавт. описали клинический случай достижения ремиссии у больного с рецидивом ОМЛ после гаплоидентичной алло-ТГСК с помощью трансфузий NK – клеток. До трансфузий NK – клеток больному была проведена циторедуктивная терапия, а после трансфузии вводился рекомбинантный ИЛ-2 [106].
Среди других методом, направленных на снижение частоты РТПХ после адоптивной иммунотерапии является переливание лимфоцитов донора в комбинации с иммуносупрессивной терапией. В работе X.J. Huang и соавт. 2- недельное применение циклоспорина и метотрексата во время профилактических ТЛД позволило статистически достоверно снизить частоту острой РТПХ (p = 0,002) не увеличивая частоту рецидивов и не снижая показатели общей выживаемости [75].
ТЛД могут быть использованы и с профилактической целью при высоком риске рецидива гемобластоза после алло-ТГСК. Первое сообщение о профилактическом назначении адоптивной иммунотерапии было опубликовано E. Naparstek и соавт. в 1995 г [104].
Данное направление адоптивной иммунотерапии в настоящее время активно развивается в связи с увеличением количества алло-ТГСК, выполняемых с использованием режимом кондиционирования пониженной интенсивности или использованием миелотрансплантата, с удаленными Т-лимфоцитами [7, 100, 104, 114].
В работе А. Spyridonidis и соавт., опубликованы результаты проспективного исследования по профилактическому применению ТЛД у 56 больных ОЛ после алло-ТГСК. Кондиционирование проводилось в режиме пониженной интенсивности с использованием алемтузумаба. Критериями включения в исследование являлись высокий риск рецидива ОЛ и убывающий донорский химеризм после алло-ГТСК. В результате профилактических ТЛД полный донорский химеризм был восстановлен у 75% больных, однако у 47% больных развилась РТПХ после трансфузий CD3+клеток в суммарной дозе 2х106клеток/кг.
Ни у одного больного, получившего профилактические ТЛД, не было констатировано рецидива ОЛ. Таким образом, выполнение профилактических ТЛД обеспечивает снижение частоты рецидивов ОЛ, однако данный метод сопряжен с высокой частотой развития РТПХ [148].
C. Lutz и соавт. в своем исследовании отметили, что у больных, которым выполнялись профилактические ТЛД по поводу убывающего донорского химеризма, отмечалась более высокая частота РТПХ, чем у больных, которым ТЛД выполнены на фоне полного донорского химеризма [90].
Применение молекулярного, цитогенетического, иммунофенотипического методов, для подтверждения полноты ремиссии, мониторинга МРБ, динамического исследования химеризма после алло-ТГСК, позволило разработать алгоритм своевременной отмены иммуносупрессивной терапии и включения в тактику терапии профилактические и лечебные ТЛД [2, 23].
Изменение содержания субпопуляций Т-лимфоцитов у пациентов Выполнение алло-ТГСК сопровождается чрезвычайно глубокой и продолжительной лимфопенией, снижением содержания в крови всех субпопуляций лимфоцитов и, как следствие – выраженными нарушениями противоинфекционного и противоопухолевого иммунного ответа [5, 42, 49].
Поэтому своевременное приживление миелотрансплантата, а также полноценное восстановление всех ростков гемопоэза является залогом успеха этого вида терапии [109, 122].
Впервые состояние иммунодефицита после алло-ТГСК было описано более 40 лет назад. За это время клинические и фундаментальные исследования в трансплантологии шагнули далеко вперед. Однако поиск новых, наиболее эффективных подходов к профилактике и лечению РТПХ, снижению частоты рецидивов и инфекционных осложнений в посттрансплантационном периоде продолжается по настоящее время [36, 42, 91, 162].
На восстановление параметров клеточного иммунитета после алло-ТГСК оказывают влияние такие факторы как возраст реципиента, нозологическая форма заболевания, степень гистосовместимости донора гемопоэтических стволовых клеток, а также интенсивность предтрансплантационного кондиционирования, источник гемопоэтических стволовых клеток и манипуляции (удаление Тлимфоцитов из миелотрансплантата). Кроме того, отрицательной воздействие на состояние иммунитета могут оказывать инфекционные осложнения и РТПХ в посттрансплантационном периоде [109, 115].
Исследования В.Н. Вавилова и соавт., также указывали, что на кинетику восстановления кроветворения после алло-ТГСК влияют продолжительность заболевания до трансплантации, совместимость донора и реципиента по системе антигенов HLA, содержание лимфоцитов в миелотрансплантате, применение иммуносупрессивных препаратов в посттрансплантационном периоде [4].
Отсроченное восстановление клеточного иммунитета и, в частности длительное отсутствие нормализации содержания клеток различных субпопуляций лимфоцитов может явиться прогностическим фактором раннего рецидива гемобластоза или высокого риска инфекционных осложнений [42, 78].
Pavletic Z. и соавт. в своей работе показали, что общая выживаемость больных после алло-ТГСК находится в прямой зависимости от скорости восстановления абсолютного числа лимфоцитов периферической крови.
Однолетняя общая выживаемость у больных, восстановивших абсолютное число лимфоцитов до 500 клеток /мкл и более на 17-й день после алло-ТГСК, составила 79%, в то время как у больных с более поздним восстановлением абсолютного количества лимфоцитов данный показатель был равен 19% [112].
Полноценность восстановления Т-клеточного звена иммунного ответа после алло-ТГСК играет важную роль в обеспечении противоопухолевого иммунитета, и соответственно снижении частоты рецидивов. В исследовании, проведенном Bosch M. и соавт., представлены убедительные данные, подтверждающие, что вероятность рецидива зависит от времени и полноценности реконституции Т-клеточного звена лимфоцитов после аллогенной миелотрансплантации [42].
Таким образом, подавление функциональной активности Т-клеток после алло-ТГСК, приводит к потере контроля над резидуальными опухолевыми клетками и, в дальнейшем, к развитию рецидива [4, 118].
Основную роль в осуществлении противоопухолевого ответа играют Т-лимфоциты, а именно цитотоксические лимфоциты и клетки натуральные киллеры. Именно за счет активности лимфоцитарного звена иммунитета осуществляется эррадикация резидуальных опухолевых клеток [40, 115].
Среди иммунологических признаков РТПХ определены такие как экспансия цитотоксических лимфоцитов донора и повышенная продукция ИНФ-гамма цитотоксическими CD8+ и CD4+ Т-лимфоцитами донора [10]. Предполагается [74], что острая РТПХ развивается в результате воздействия цитотоксических Т-лимфоцитов донора, на клетки реципиента, что сопровождается элиминацией лимфоцитов реципиента и тяжелым иммунодефицитом.
донорских цитотоксических лимфоцитов и, следовательно, препятствовать этой субпопуляции Т-лимфоцитов индуцировать острую РТПХ. Характерным признаком Т- регуляторных клеток является высокий уровень экспрессии -цепи к ИЛ-2. Клетки с высокой экспрессией антигена СD25 (СD25high), рецептора Foxp3+ обладают наибольшей иммуносупрессивной активностью. Количество Т-регуляторных клеток в норме составляет 2,6 – 5,2% [86]. Показано, что эти клетки способны пролиферировать в ответ на стимулирующие антигены только в присутствии ИЛ-2 и при активации подавляют пролиферацию как наивных CD4+, CD8+ Т-клеток, так и эффекторных Т-клеток CD4+CD25-, цитотоксических Т-клеток памяти, а также клеток натуральных киллеров и В-лимфоцитов через контактзависимый механизм [5, 73].
По данным Q. Li и соавт. количество Т-регуляторных клеток снижается при РТПХ. Так, у реципиентов с нормальным или высоким числом CD4+СD25high клеток РТПХ не развивалась или была легкой степени, при этом все больные выжили. Напротив, у реципиентов с низким содержанием Т-регуляторных клеток или их отсутствием, развивалась тяжелая РТПХ и все больные умерли в течение года после трансплантации [86].
Клетки натуральные киллеры (NK- клетки) мигрируют в зону локализации опухолевых клеток под воздействием ИНФ-гамма, продуцируемого Т-хелперами I типа. ИНФ-гамма обеспечивает направленную миграцию NK-клеток. Они не обладают антигенной специфичностью, не требуют антигензависимой воздействие, обнаружив злокачественную клетку [108].
Таким образом, определение абсолютного количества субпопуляций Т-лимфоцитов периферической крови после алло-ТГСК может выявить пациентов с высоким риском рецидива. Вероятно, именно этим больным целесообразно проведение иммунотерапии, направленной на стимуляцию механизмов иммунного ответа и контроль над резидуальными опухолевыми клетками [118].
Одним из вариантов адоптивной иммунотерапии является цитокиновая терапия, с применением, например ИЛ-2 или ИНФ-альфа [19, 103]. Другим наиболее эффективным способом являются переливания лимфоцитов донора, которые используются у реципиентов для профилактики и лечения рецидива после алло-ТГСК [81, 116, 133].
Несмотря на большое количество исследований, посвященных изучению эффектов РТПХ и РТПЛ, индуцированных трансфузиями лимфоцитов донора, опубликованные данные об изменениях количественного и качественного состава популяций Т-лимфоцитов при рецидиве гемобластоза после алло-ТГСК немногочисленны [42, 65, 82].
Итак, многочисленные исследования, посвященные изучению различных аспектов, касающихся развития рецидива и возникновения РТПХ после алломиелотрансплантации при гемобластозах, свительствует о высокой актуальности этой проблемы. Не меньшее внимание уделяется поиску наиболее эффективных лечебных методик, направленных на купирование и предупреждение посттрансплантационных рецидивов. До сих пор не найдено четких ответов на вопросы о схемах и интенсивности адоптивной иммунотерапии.
Все это указывает на целесообразность выполнения новых исследований, которые позволят разработать наиболее адекватный алгоритм лечения гемобластозов с помощью применения трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток.
Глава 2. Характеристика больных и методы исследования Исследование выполнено в научно-клиническом отделе химиотерапии гемобластозов, депрессий кроветворения и трансплантации костного мозга ФГБУ Гематологический научный центр Минздрава России (Генеральный директор академик РАМН, профессор, д.м.н. В.Г. Савченко, заведующая отделом – д.м.н.
Е.Н. Паровичникова) в период с октября 2010 года по октябрь 2013года.
Исследование одобрено Локальным этическим комитетом ФГБУ Гематологический научный центр Минздрава России.
В работу включены 52 больных, которым проводилась адоптивная иммунотерапия после трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток от гистосовместимого родственного (n=49) или неродственного донора (n=3).
У 35 больных был диагностирован ОМЛ, у 4-х больных - ОЛЛ, у 9 больных – ХМЛ и у 4 больных МДС (Рисунок 1).
Возраст больных на момент проведения терапии лимфоцитами донора составлял от 16 до 60 лет (медиана 31 год), 32 мужчины и 20 женщин.
Рисунок 1. Распределение пациентов в зависимости от диагноза В соответствии с классификацией FAB, цитохимические варианты ОМЛ были представлены следующим образом: недифференцированный (М0) – в (17%) случаях, миелобластный с минимальным созреванием (М1) – в 5 (14%), миелобластный с созреванием (М2) – в 6 (17%), промиелоцитарный (М3) – в (9%), миеломонобластный вариант (М4) – в 13 (37%), эритробластный (М6) – в (6%) случаях. Среди 4-х больных ОЛЛ в одном случае был определен ранний преВ-вариант и в 3 случаях - преВ-вариант.
На момент проведения алло-ТГСК 23 из 39 (59%) больных ОЛ находились в первой клинико-гематологической ремиссии, 5 (13%) больных - во второй полной ремиссии ОЛ, 11 (28%) больных - вне ремиссии заболевания (у 8 был констатирован рецидив и у 3 - резистентное течение).
Среди 9 больных ХМЛ к моменту выполнения алло-ТГСК у 5 была диагностирована первая хроническая фаза (ХФ), у 3-х больных - фаза акселерации (ФА) и у 1-го больной - бластный криз ХМЛ.
Среди 4 больных МДС у 1 больной была диагностирована рефрактерная анемия, у второй - рефрактерная анемия с избытком бластов I (РАИБ I), у третьей больной - рефрактерная анемия с избытком бластов II (РАИБ II) и у четвертой q- синдром.
У 42 из 52 (81%) больных, как дебют заболевания, так и последующее течение гемобластоза сопровождалось наличием одного или нескольких факторов неблагоприятного прогноза, свидетельствующих о высоком риске рецидива заболевания. Так, в 3-х случаях в дебюте заболевания был выявлен гиперлейкоцитоз, в 12 случаях - неблагоприятные хромосомные аномалии в виде моносомии 7 или 5 хромосомы, а также делеции 5 хромосомы. В 5 случаях ОМЛ был диагностирован после завершения химиотерапии по поводу другого онкологического заболевания (так называемый вторичный ОМЛ), в 7 случаях трансформировался из МДС. В 3-х случаях алло-ТГСК выполнялась в период второй ремиссии ОЛ и еще в 15 случаях вне ремиссии гемобластоза. У больных течение гемобластоза осложнилось первичной резистентностью к проводимой химиотерапии. У 4 больных ХМЛ алло-ТГСК выполнялась в фазе акселерации или бластного криза (Таблица 1).
Таблица 1. Факторы высокого риска развития рецидива, отмечавшиеся в дебюте заболевания и перед алло-ТГСК (n = 42) (ОМЛ + ОЛЛ) МДС (n=4) Неблагоприятными хромосомными аномалиями 2.2. Протокол трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых Совместимость родственного донора и реципиента по антигенам HLA –А,– В,–С,–DR,–DQ выявляли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) (лаборатория молекулярной гематологии ФГБУ ГНЦ Минздрава России, зав. лаб.
д.б.н. Судариков А.Б.) и/или в реакции смешанной культуры лимфоцитов, заключавшейся в совместном культивировании лимфоцитов реципиента и донора (лаборатория иммуногематологии ФГБУ ГНЦ Минздрава России, зав. лаб. д.м.н.
Головкина Л.Л.).
При отсутствии у пациента родственных HLA–совместимых сиблингов поиск неродственных доноров проводили в Международном регистре доноров потенциальных доноров, сбор гемопоэтических стволовых клеток периферической крови осуществляли в зарубежных трансплантационных центрах, имеющих право осуществлять вышеуказанную деятельность по подготовке и обследованию донора, а также заготовке миелотрансплантата. Все три реципиента неродственных гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) были полностью гистосовместимы с донором.
Предтрансплантационное кондиционирование по миелоаблативной программе выполнено 33 больным. Кондиционирование в режиме пониженной интенсивности проведено 19 больным. Схемы кондиционирования и дозы препаратов указаны в таблице 2.
Таблица 2. Режимы кондиционирования режим циклофосфамид 60мг/кг/сутки 2 дня Режим пониженной флюдарабин 30мг/м2/сутки 6 дней интенсивности бусульфан 4мг/г/сутки 2 дня (n=19) Всем реципиентам, имевшим HLA-совместимого родственного сиблинга, неродственного донора (n= 3) источником ГСК была периферическая кровь.
Забор костномозговой взвеси осуществлялся в условиях операционной при строгом соблюдении правил асептики. Количество трансплантированных миелокариоцитов варьировало от 2,2 до 7,0х108клеток/кг (медиана - 3,5х клеток/кг).
У неродственных доноров мобилизацию ГСК осуществляли с помощью гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ). Процедуру сбора проводили методом автоматического лейкоцитафереза на сепараторах клеток крови. Количество трансплантированных гемопоэтических стволовых клеток составило от 5,3 до 8,1х106 CD34+клеток/кг.
Профилактика РТПХ осуществлялась по стандартной схеме метотрексатом предтрансплантационное кондиционирование проводили в миелоаблативном режиме. У 7 больных ХМЛ в схему профилактики дополнительно включали интенсивности, дополнительно назначали мофетил микофенолат. Одному пациенту со вторым рецидивом ОМЛ профилактика РТПХ осуществлена только циклофосфамидом.
2.3. Исследование гемопоэтического химеризма после алло-ТГСК алломиелотрансплантата проводили через 1, 3, 6, 9 и 12 месяцев, а затем каждые 6-12 месяцев после алло-ТГСК.
молекулярно-биологического (лаборатория молекулярной гематологии, зав. лаб.
д.б.н. А.Б. Судариков), стандартного цитогенетического и молекулярноцитогенетического методов исследования (научно-клиническая лаборатория кариологии ФГБУ ГНЦ Минздрава России, зав. лаб. к.м.н. Т.Н. Обухова).
Анализ гипервариабельных участков ДНК, содержащих тандемные повторы STR/VNTR (short tandem repeat/variable number tandem repeats – короткие тандемные повторы/варьирующие числом тандемные повторы) выполняли с помощью метода ПЦР. В случае различия донора и реципиента по полу контроль донорского химеризма осуществляли с помощью стандартной цитогенетики и методом флюоресцентной in situ гибридизации (FISH) с исследованием прямых ДНК-зондов к центромерным участкам Х и Y хромосом.
Кроме того, у больных ХМЛ использовались методики FISH и ПЦР для контроля за цитогенетическими и молекулярными маркерами заболевания.
При оценке результатов исследования донорского химеризма ориентировались на следующие понятия [26]:
Так, «полный донорский химеризм» подразумевает обнаружение в костном мозге реципиента 100% клеток донора. Термин «смешанный химеризм»
используют для описания ситуаций, когда после алло-ТГСК в костном мозге обнаруживают клетки реципиента и донора одновременно.
Стабильный смешанный химеризм диагностируется при обнаружении относительно постоянного соотношения клеток донора и реципиента (колебания менее 5%) в двух и более последовательно исследованных образцах костного мозга. При этом содержание донорских клеток может составлять около 80%.
Возрастающий (или убывающий) донорский химеризм устанавливается при выявлении увеличения (или уменьшения) числа донорских клеток более чем на 5% от предыдущего уровня.
Поскольку стандартные методы изучения химеризма характеризуются чувствительностью от 1-5% до 0,1% [2], мы использовали понятие «полный донорский химеризм» при содержании донорских клеток в костном мозге 97% и более.
В момент констатации рецидива после алло-ТГСК исследование кроветворения включало как подсчет количества бластных клеток в миелограмме (клинико-диагностическая лаборатория ФГБУ ГНЦ Минздрава России, зав. лаб.
к.м.н. В. Н. Двирнык), так и определение состояния донорского химеризма. В течение всего периода проведения адоптивной иммунотерапии костный мозг реципиента исследовали каждые 2-4 недели с целью контроля противоопухолевого ответа и мониторинга гемопоэтического химеризма.
2.4. Адоптивная иммунотерапия после алло-ТГСК ТЛД после алло-ТГСК выполнялись 52 больным с гемобластозами.
Показанием для адоптивной иммунотерапии послужили гематологический рецидив (у 44 больных) или убывающий донорский химеризм (у 8 больных).
Убывающий донорский химеризм подтверждался снижением содержания донорского кроветворения на 5 и более процентов в 2-х исследованиях костного мозга реципиента с интервалом 2-3 недели. В 6 случаях был предпринят второй эпизод адоптивной иммунотерапии ТЛД в связи с повторным гематологическим рецидивом гемобластоза.
Таким образом, в исследование было включено 58 эпизодов адоптивной иммунотерапии. Число всех переливаний лимфоцитов донора составило 183.
Адоптивная иммунотерапия посттрансплантационного рецидива выполнялась по двум основным схемам:
1. Монотерапия ТЛД (n= 15);
2. ТЛД после введения химиотерапевтических препаратов (n= 29):
- ТЛД после неэффективной предшествующей химиотерапии (n= 2);
- ТЛД на фоне ремиссии, после проведенной химиотерапии (n= 4);
- ТЛД в период миелотоксического агранулоцитоза после курса химиотерапии (n= 23).
Доза перелитых лимфоцитов донора и кратность трансфузий колебалась в широких пределах. Так, количество CD3+клеток, перелитых за одну трансфузию равнялось от 1 до 29х107CD3+клеток/кг. При этом у 18 пациентов однократная доза перелитых клеток составляла от 1 до 5,0 х107 CD3+клеток/кг; в 22 случаях однократная доза CD3+клеток колебалась от 5,0 до 10х107CD3+клеток/кг и в случаях - от 10 до 29х107CD3+клеток/кг.
Суммарное количество перелитых CD3+клеток за весь период адоптивной иммунотерапии у каждого больного составляло от 1 до 76х107клеток/кг. В случаях суммарная доза CD3+клеток составила менее 10х107клеток/кг, пациентам было перелито от 10 до 25х107клеток/кг, 15 пациентам - от 25 до х107клеток/кг и в 6 случаях суммарная доза достигала уровня от 50 до 76х клеток/кг.
Каждому больному было выполнено от 1 до 8 трансфузий лимфоцитов донора. Однократно лимфоциты донора были перелиты в 9 случаях, дважды лимфоциты донора переливали в 13 случаях, трижды – в 11 случаях, четыре и более раз – в 19 случаях.
В отделении трансплантации костного мозга ФГБУ ГНЦ Минздрава России для лечения посттрансплантационного рецидива гемобластоза ТЛД используются более 20 лет. Первоначально лимфоциты донора переливали в виде монотерапии без предшествующего введения химиотерапевтических препаратов. В этот период времени доза перелитых лимфоцитов за 1 трансфузию составляла от 3,5 до х107CD3+/кг, а суммарная доза за все переливания - от 18 до 76 х107CD3+/кг.
Переливали лимфоциты донора 1 раз в неделю, число трансфузий колебалось от 4 до 8.
Критерии прекращения иммунотерапии были следующими: достижение ремиссии с восстановлением полного донорского химеризма, отсутствие эффекта и прогрессия лейкоза, возникновение острой РТПХ (II и более степени).
Позднее с целью уменьшения объема опухолевой массы стали проводить курсы химиотерапии, а переливания лимфоцитов донора выполняли после достижения ремиссии.
Схема химиотерапии и ее интенсивность при посттрансплантационном гематологическом рецидиве зависели от нозологической формы гемобластоза и соматического состояния пациента. Различные схемы химиотерапевтических препаратов, применявшихся перед ТЛД, представлены в таблице 3.
В 2003 году был разработан и внедрен в клинику алгоритм лечения посттрансплантационных рецидивов, основанный на применении ТЛД в период миелотоксического агранулоцитоза после курса ХТ, причем каждая процедура ТЛД сопровождалась введением ИЛ-2 в дозе 6 млн.МЕ. Предполагалось, что именно в период миелотоксического агранулоцитоза опухоль максимально угнетена и для восстановления донорского кроветворения созданы наилучшие условия. Введение ИЛ-2 предложено в расчете на его активизирующее влияние на донорские иммунокомпетентные клетки.
В случае достижения полного ответа, то есть ремиссии с восстановлением полного донорского химеризма, и при отсутствии РТПХ проводилась поддерживающая терапия ИЛ–2 (5-дневный курс по 2 млн. МЕ/день). Интервал между курсами 4-5 недель, длительность поддерживающей терапии ориентировочно 2 года [3, 8, 93].
В 2011 году протокол адоптивной иммунотерапии был модифицирован.
Первая ТЛД по-прежнему выполнялась в период миелотоксического агранулоцитоза после противорецидивного курса ХТ. Но был систематизирован объем переливаемых клеток. Так, доза CD3+клеток, переливаемых в первую процедуру, была определена в пределах 1х107CD3+клеток/кг массы тела реципиента, последующие трансфузии осуществлялись с увеличением (эскалацией) дозы клеток: при второй трансфузии - 5х107CD3+клеток/кг массы тела реципиента, при третьей трансфузии - 10х107CD3+клеток/кг массы тела реципиента. После каждой трансфузии внутривенно вводился ИЛ-2 в дозе млн.МЕ. Интервал между трансфузиями составлял 2-4 недели [18].
Таблица 3. Курсы химиотерапии, проводимой перед ТЛД у пациентов с посттрансплантационным рецидивом МДС (с идарубицином) колониестимулиющий Представленная модификация алгоритма адоптивной иммунотерапии была предпринята с целью индукции РТПЛ при минимальном риске развития РТПХ, за счет использования небольших систематизированных доз лимфоцитов донора в сочетании с ИЛ-2.
периферической крови донора костного мозга Сбор лейкоконцентрата из периферической крови донора костного мозга (лейкоцитаферез) осуществляли на сепараторах непрерывного тока крови по программе стандартного лейкоцитафереза или программе сбора стволовых клеток крови в научно-клиническом отделении донорского и лечебного гемафереза ФГБУ ГНЦ Минздрава России (зав.отд. д.м.н. Н.Н. Калинин). Перерыв между процедурами составлял не менее 4 недель. За один сеанс лейкоцитафереза обрабатывали 1,5-2 объема циркулирующей крови.
Допуск доноров костного мозга к лейкоцитаферезу проводили на основании дополнения к инструкции по медицинскому освидетельствованию доноров крови, плазмы, клеток крови утвержденной Минздравом России 16.11.1998г.
Оценка дозы заготовленных лимфоцитов донора основывался на подсчете иммунофенотипирования с проточной цитофлюориметрией. Подсчет количества CD3+клеток выполнялся совместно с сотрудниками научно-клинической лаборатории иммунофенотирования клеток крови и костного мозга ФГБУ ГНЦ Минздрава России (зав. лаб., к.м.н. И.В. Гальцева), лаборатории молекулярной биотехнологии ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи (зав. лаб., д.м.н. Б.С. Народицкий).
формирование терапевтических CD3+клеток/кг массы тела реципиента.
CD3+клеток, превышал 100 мл, его уменьшали путем центрифугирования ( минут, при температуре +4С, 850g) и удаления плазмы до достижения конечного объема лейкоконцентрата в пределах 40,0-60,0 мл.
Подготовленные терапевтические дозы CD3+клеток замораживали в лаборатории криоконсервирования стволовых клеток и костного мозга ФГБУ ГНЦ Минздрава России (зав. лаб., к.м.н. Т.В. Гапонова). В качестве криопротектора использовали диметилсульфоксид в конечной концентрации 10%.
Для глубокой заморозки применяли криоконтейнеры Hemofreeze DF («Fresenius», Германия) и CryoMACS (Miltenyi Biotec GmbH, Германия), процедура осуществлялась в соответствии с инструкцией производителя. Для заморозки использовали программный замораживатель. Лейкоконцентрат хранился в парах жидкого азота.
размораживателе по программе для стволовых клеток или на водяной бане, при температуре 37-39С. Размороженный лейкоконцентрат вводили больному внутривенно, струйно, непосредственно после разморозки, без отмывки от диметилсульфоксида. С целью дезинтоксикации и выведения переливаемого форсированного диуреза, контролируя электролитный состав и кислотнощелочное равновесие крови.
Для профилактики токсических, пирогенных и аллергических реакций во время ТЛД больному проводили премедикацию десенсибилизирующими препаратами (антигистаминные, глюкокортикостероиды, в некоторых случаях наркотические анальгетики).
Побочными реакциями на трансфузию размороженного лейкоконцентрата в ряде случаев являлись тошнота, спастические боли в животе, затрудненное дыхание, покраснение кожи лица и шеи, брадикардия и гипотония. Все эти проявления были обусловлены токсическим действием криопротектора и, в большинстве случаев, проходили самостоятельно.
2.7. Диагностика и лечение РТПХ после адоптивной иммунотерапии Диагноз острой и хронической РТПХ устанавливали на основании морфологического исследования биоптатов пораженного органа.
Острая РТПХ диагностировалась в течение первых 100 дней после первой ТЛД. Тяжесть е течения определялась в соответствии с классификацией H.
Glucksberg. [67] (Таблица 4, 5).
Таблица 4. Классификация острой РТПХ I степень Сыпь покрывает Уровень билирубина – 20- Диарея более II степень Сыпь покрывает 25- Уровень билирубина 31-60 Диарея более III степень Генерализованная Уровень билирубина 61-150 Диарея более IV степень Генерализованная Уровень билирубина более Диарея более Таблица 5. Стадии тяжести острой РТПХ Хроническая РТПХ – клинико-патологический синдром, появляющийся спустя 100 и более дней после первой ТЛД. Классификация хронической РТПХ основана на наличии предшествовавшей острой РТПХ (развившаяся de novo, персистирующая, прогрессирующая), количестве вовлеченных органов (локализованная - ограниченное поражение кожи или печеночная дисфункция, экстенсивная - генерализованное поражение кожи или дисфункция печени в сочетании с поражением других органов).
Лечение острой и хронической РТПХ после алло-ТГСК и адоптивной иммунотерапии проводилось согласно стандартным схемам, включающих циклоспорин (2-5 мг/кг в сутки), метилпреднизолон (1,5-2мг/кг в сутки), мофетил микофенолат (1-2 г в сутки).
2.8. Исследование субпопуляций Т-лимфоцитов периферической крови количественный и качественный состав субпопуляций Т-лимфоцитов периферической крови 15 больных гемобластозами на фоне ТЛД. Исследование выполнялось с помощью метода иммунофенотипирования с проточной цитофлюориметрией. Материалом исследования служила венозная кровь, стабилизированная К2-ЭДТА. Использовались моноклональные антитела к следующим антигенам: CD3 (PerСP), CD4 (PE), CD8 (FITC), CD25 (FITC), CD (FITC) («Becton Dickinson», США).
Для определения экспрессии исследуемых белков применяли панель моноклональных антител (мкАТ), меченых одним из 4 флюорохромов:
изотиоцианат флуоресциина (FITC), с max эмиссией при =525 нм, фикоэритрин (РЕ), с max эмиссией при =575 нм, перидинин-хлорофилл протеин (PerCP), с max эмиссией при =660 нм (Таблица 5).
Для окраски клеток моноклональными антителами использовали два протокола («Becton Dickinson» и «Beckman Coulter», США).
Таблица 6. Характеристики используемых моноклональных антител Для определения экспрессии поверхностных антигенов (CD3, CD4, CD8, CD25, CD56) 100 мкл периферической крови распределяли одноканальной пипеткой в пробирки (соответственно количеству комбинаций антител) и добавляли в требуемом объеме мкАТ. В пробирки с изотипическим контролем добавляли неспецифические мышиные иммуноглобулины, меченые соответствующими флюорохромами. Пробы инкубировали 30 минут при температуре 2-8С. После инкубации для лизиса эритроцитов в пробирки вносили 1 мл лизирующего раствора (FACS Lysing Solution, BD). Инкубировали 10- минут при комнатной температуре в темноте и затем центрифугировали пробирки 5 минут в режиме 1500 оборотов в минуту. Удаляли надосадочную жидкость, добавляли 1 мл раствор фосфатного буфера (pH =7,4) для отмывания образца от разрушенных клеток. Ресуспензировали и центрифугировали 5 минут в режиме 1500 оборотов в минуту. Удаляли надосадочную жидкость, добавляли 1 мл раствор фосфатного буфера (pH =7,4). Затем выполняли анализ проб на проточном цитофлюориметре Cytomics FC 500 («Beckman Coulter», США) и FACS Canto II («Becton Dickinson», США). Обработка данных осуществлялась с помощью программного обеспечения BD FACS Diva 6.1.3. Анализируемая область, лимфоцитарный гейт, выбирался на основании характеристик прямого светорассеяния FSC и бокового светорассеяния SSC.
Проточная цитофлюориметрия основана на проведение оптических и флюоресцентных измерений отдельных клеток. Сигналы светорассеивания, характеризующие размер клетки (FSC) и цитоплазматические особенности (SSC), позволяют связать данные иммунофенотипического анализа с определенными популяциями клеток. Лимфоциты располагаются в нижней части точечного светорассеивания. Для моноцитов характерно расположение несколько выше и правее, а нейтрофилы располагаются в его верхней части, так как дают высокие значения показателей FSC и SSC. С помощью точечных графиков определяли процентное соотношение клеток, несущих специфические антигены.
Для анализа были использованы комбинации антител, характеризующие иммунофенотип следующих субпопуляций лимфоцитов: Т-лимфоциты (CD3+);
Т-хелперные клетки (СD3+/CD4+); Т-цитотоксические клетки (СD3+/CD8+);
Т-регуляторные клетки (CD4+/СD25high); клетки натуральные киллеры - NKклетки (СD3 /CD56+); Т–клетки натуральные киллеры - T-NK (СD3+/CD56+).
Подсчет абсолютного количества Т-лимфоцитов каждой субпопуляции выполняли с учетом данных гемограммы, полученных на автоматическом лаборатории отдела анестезиологии и реаниматологии и интенсивной терапии ФГБУ ГНЦ Минздрава России (зав. лаб., к.м.н. А.В. Кречетова).
Результаты подсчета абсолютного количества Т-лимфоцитов у пациентов на фоне ТЛД представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения. В иммунофенотипирования периферической крови условно здоровых людей [24].
Исследование субпопуляционного состава Т-лимфоцитов проводили в момент констатации посттрансплантационного рецидива или при снижении содержания донорских клеток в костном мозге реципиента до начала ТЛД, затем пятикратно каждые 2 недели после первой ТЛД.
При статистическом анализе данных использовали анализ выживаемости (метод Каплана-Мейера). Результаты считались статистически значимыми при р 0,05. Результаты были обработаны с помощью программы SAS, Statistica version 6 (Stat Soft Inc). Работа выполнена совместно с сотрудниками лаборатории биостатистики ФГБУ ГНЦ Минздрава России (зав. лаб., к.т.н. С.М. Куликов).
Глава 3. Адоптивная иммунотерапия после трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток миелотрансплантата были выполнены ТЛД по поводу посттрансплантационного рецидива гемобластоза (n=44) или убывающего донорского химеризма (n=8), который характеризовался появлением уменьшением содержания клеток донорского кроветворения в костном мозге. В 6 случаях была предпринята вторая процедура иммунотерапии ТЛД в связи повторным гематологическим рецидивом гемобластоза.
Достижение ремиссии с восстановлением полного донорского химеризма в результате адоптивной иммунотерапии оценивалось по показателям гемограммы, миелограммы, а также по результатам молекулярного и цитогенетического исследования химеризма.
Адоптивная иммунотерапия расценивалась нами как эффективная только в тех случаях, когда кроветворение реципиента было полностью замещено донорским, т.е. был достигнут полный донорский химеризм.
Кривые, иллюстрирующие общую выживаемость больных в зависимости от показаний для начала адоптивной иммунотерапии, представлена на рисунке 2.
Пятилетняя общая выживаемость в результате адоптивной иммунотерапии, включавшей ТЛД, составляет 25% для больных с посттрансплантационным посттрансплантационном периоде у которых выявлен убывающий донорский химеризм.
Кривая общей выживаемости больных, получивших ТЛД по поводу посттрансплантационного рецидива, после пятилетнего наблюдения «выходит»
на «плато», что указывает на возможность сохранения полного донорского химеризма в течение более 10 лет у 15% больных гемобластозами.
Общая выживаемость Рисунок 2. Общая выживаемость больных гемобластозами после адоптивной иммунотерапии по поводу посттрансплантационного гематологического рецидива (а) и убывающего донорского химеризма (б) 44 пациентам адоптивная иммунотерапия, включавшая ТЛД, проводилась по поводу гематологического рецидива гемобластоза после алло-ТГСК. В результате терапии у 25 (57%) из 44 больных была достигнута повторная ремиссия с восстановлением полного донорского химеризма, продолжительность которой составила от 2 до 162 месяцев (медиана 7 месяцев). На момент проведения анализа живы 12 (27%) больных, полный донорский химеризм сохраняется у них в течение 3 - 162 месяцев (медиана 26 месяцев). В остальных 19 (43%) случаях через 1-2 месяца от начала иммунотерапии была констатирована прогрессия гемобластоза, что расценивалось нами как отсутствие эффекта.
выполнялась по двум схемам. Первая схема включала применение трансфузий лимфоцитов донора в виде монотерапии на фоне развернутого рецидива гемобластоза.
Вторая схема лечения гематологического рецидива гемобластоза после алло-ТСГК состояла из применения одного курса химиотерапевтических препаратов с последующим переливанием лимфоцитов донора. При этом каждая ТЛД сопровождалась введением ИЛ-2.
3.1.1. ТЛД в виде монотерапии посттрансплантационного рецидива Переливания лимфоцитов донора в виде монотерапии выполнялись больным. Среди них были 6 пациентов с ОМЛ, 5 пациентов с ХМЛ, 3 пациентов с МДС и 1 пациент с ОЛЛ. Алло-ТГСК была выполнена больным ОМЛ в одном случае в ремиссии, в остальных 5 случаях вне ремиссии. Больному ОЛЛ во 2-ой ремиссии заболевания. Из 5 больных ХМЛ на момент алло-ТГСК 2 больных были в хронической фазе и 3-м больных в фазе акселерации. Всем больным МДС алломиелотрансплантация выполнена вне ремиссии.
У пациентов с ОЛ интервал от алло-ТСГК до развития гематологического рецидива был значительно короче, чем у больных ХМЛ. Так, у больных ОЛ рецидив был диагностирован в ранние сроки после алло-ТГСК: через 2-4 месяца (медиана 3 месяца). Лишь в одном случае рецидив ОМЛ отмечен в более поздние сроки – через 18 месяцев после алло-ТГСК. У больных ХМЛ и МДС ремиссия с полным донорским химеризмом после алло-ТГСК сохранялась значительно дольше. У больных ХМЛ рецидив был диагностирован в среднем через месяцев (от 5 до 48 месяцев), а у больных МДС – через 4, 36 и 45 месяцев после алло-ТГСК.
Гематологический рецидив ОЛ характеризовался высоким бластозом в костном мозге, а также низкими показателями донорского химеризма. При ОМЛ медиана содержания бластных клеток составила 32% (от 8 до 70%), при этом у 3-х из 6 больных количество бластных клеток превышало 50%. При ОЛЛ количество бластных клеток равнялось 52%. Медиана содержания донорских клеток в костном мозге составляла 50% при ОМЛ и 20% при ОЛЛ. У пациентов с ХМЛ и МДС количество бластных клеток в миелограмме в момент рецидива было ниже (медиана количества бластных клеток составила 15% при ХМЛ и от 1% до 6% при МДС), а показатели донорского химеризма в основном не снижались менее 75% (от 45% до 90%) (Таблица 7).
Параметры, характеризующие интенсивность адоптивной терапии у больных с различными диагнозами, не имели значимых различий. Так, медиана количества перелитых донорских CD3+клеток за одну трансфузию (7х CD3+клеток/кг) и числа трансфузий лимфоцитов донора (3 ТЛД) у пациентов различных нозологических форм было примерно одинаковым.
У 5 (33 %) пациентов ТЛД на фоне развернутого посттрансплантационного рецидива гемобластоза обеспечили достижение ремиссии с восстановлением полного донорского химеризма. В остальных 10 случаях была отмечена дальнейшая прогрессия гемобластоза.
Таблица 7. Характеристика гематологического рецидива гемобластоза после алло-ТГСК и интенсивность адоптивной иммунотерапии при различных формах гемобластозов Интервал от алло-ТГСК до рецидива, 3 (2-18) 3 23 (5-48) 4-36- месяцы Количество бластных клеток в костном 32 (8-70) 52 15 (8-52) 4-1- мозге при рецидиве, % Донорский химеризм в момент рецидива, % 50 (50-90) 20 85 (45-90) 75-80- Количество CD3+клеток за одну ТЛД, 7 (1-14,6) 11 7 (4,7- 10) 6-5- х107клеток/кг Суммарное количество CD3+клеток, 27 (1-76) 22 28 (18-47) 16-15- х107клеток/кг Наилучшие результаты применения переливаний лимфоцитов донора в монорежиме были достигнуты при лечении гематологического рецидива ХМЛ (Таблица 8). Так, полная ремиссия с восстановлением полного донорского химеризма была диагностирована у 3-х из 5 пациентов. Следует отметить, что диагностирован в поздние сроки после алло-ТГСК (через 23, 26 и 48 месяцев), а средние дозы перелитых CD3+клеток за одну ТЛД были весьма высокими и равнялись 7, 8 и 10х107клеток/кг. При этом суммарное количество CD3+клеток достигало 27, 34 и 47х107клеток/кг.
Длительность повторной ремиссии составила 8, 44 и 162 месяц. Следует отметить, что у пациентки с наибольшей продолжительностью эффекта после адоптивной иммунотерапии (162 месяца) длительность противоопухолевого эффекта в 7 раз превышает продолжительность посттрансплантационной ремиссии. В остальных случаях пациенты находились в ремиссии с полным донорским химеризмом во время последнего контакта (8 и 44 месяца), однако дальнейшая их судьба не известна.
Таблица 8. Эффективность трансфузий лимфоцитов донора в виде монотерапии посттрансплантационного рецидива гемобластоза Диагноз Ремиссия с восстановлением полного Общая выживаемость Два случая неэффективной иммунотерапии рецидива ХМЛ возможно объясняются ранними сроками развития этих рецидивов (через 5 и 13 месяцев после алло-ТГСК). Несмотря на значительные дозы перелитых CD3+клеток, ремиссия достигнута не была.
При МДС монотерапия посттрансплантационного гематологического рецидива ТЛД индуцировала ремиссию с восстановлением полного донорского химеризма лишь у 1-го из 3 больных. Интервал от алло-ТГСК до рецидива у этого больного был весьма продолжительным и составил 36 месяцев. Количество бластных клеток в момент констатации рецидива равнялось 4%, процент донорского химеризма составлял 80%. Выполнено 3 переливания лимфоцитов донора в сочетании с ИЛ-2, медиана количества CD3+клеток за одну трансфузию была равна 5х107клеток/кг, а суммарное количество - 15х107клеток/кг.
Продолжительность достигнутого эффекта в настоящее время составляет месяца. Больной жив и находится под наблюдением. Ему проводится поддерживающая терапия ИЛ-2.
При посттрансплантационном рецидиве ОМЛ эффективность трансфузий лимфоцитов донора в качестве единственного терапевтического агента оказалась низкой. Лишь, в одном случае из 6 (16,7%) удалось индуцировать повторную ремиссию, продолжительность которой оказалась значительно больше ремиссии, наблюдавшейся после алло-ТГСК (30 месяцев против 4 месяцев). Ранний посттрансплантационный рецидив у этой пациентки характеризовался агрессивным течением: количество бластных клеток в костном мозге достигало 70%, а донорский химеризм снижался до 30%. Можно предположить, что столь яркий и продолжительный эффект у этой больной обусловлен большим количеством перелитых CD3+клеток: за одну трансфузию переливали в среднем 10,5х107клеток/кг, а суммарная доза лимфоцитов донора за 8 трансфузий составила 76 х107клеток/кг.
неэффективными.
Результаты адоптивной иммунотерапии гематологического рецидива ОЛ и эффективности этого терапевтического подхода, хотя единичные случаи длительных ремиссий, сопровождающихся восстановлением полного донорского химеризма, указывают на наличие сложных иммунологических механизмов реакции «трансплантат против лейкоза».
3.1.2. Химиотерапия с последующими трансфузиями лимфоцитов донора при гематологическом рецидиве гемобластоза после алло-ТГСК препаратов (1 курса ХТ) осуществлены у 29 больных. Этот терапевтический метод выполнялся нами по 3-м схемам:
1. Лимфоциты донора переливали после неэффективной предшествующей химиотерапии (т.е. проведенный курс химиотерапии не обеспечил переливали на фоне развернутого рецидива);
2. ТЛД выполняли в период ремиссии, достигнутой в результате проведенной химиотерапии;
3. ТЛД применяли в период миелотоксического агранулоцитоза после ТЛД после неэффективной предшествующей химиотерапии предпринята двум пациентам с ХМЛ и МДС. Рецидив заболевания у этих больных был диагностирован в отдаленные сроки после алло-ТГСК (через 33 и месяцев) и характеризовался невысоким бластозом в костном мозге (8% и 15% бластных клеток), но весьма низкими показателями донорского химеризма (15% и 40%).
Курс специфической противоопухолевой терапии (малые дозы цитарабина при МДС и «7+3» (цитарабин+идарубицин) с последующей терапией иматинибом в дозе 800 мг в сутки при ХМЛ) не обеспечили достижение гематологической ремиссии.
У больного МДС положительным моментом после химиотерапии являлось повышение показателей донорского химеризма с 15% до 65%. Однако, проводившиеся затем ТЛД в сочетании с ИЛ-2 не привели к стойкому результату, несмотря на значительное суммарное количество перелитых CD3+клеток, которое составило 39х107 клеток/кг. Наблюдалась дальнейшая прогрессия заболевания и отторжение миелотрансплантата, что подтверждалось снижением донорского химеризма до 50%.
У больной ХМЛ после 4-х трансфузий лимфоцитов донора, несмотря на нормализацию показателей гемограммы и снижение количества бластных клеток в костном мозге до 4%, сохранялся смешанный химеризм (30% клеток донорского генотипа и 70% клеток костного мозга, содержащих химерный ген BCR-ABL).
Пациентка погибла от прогрессии основного заболевания (Таблица 9).
Применение трансфузий лимфоцитов донора после неэффективного химиотерапевтического воздействия, не оказало достаточного эффекта для восстановления полного донорского химеризма, несмотря на большое количество перелитых CD3+клеток.
ТЛД на фоне ремиссии, индуцированной курсом химиотерапии Лечение посттрансплантационного рецидива по данной схеме проведено 4м пациентам: 3-м с ОМЛ и 1-му с ХМЛ. Интервал времени от алло-ТГСК до констатации рецидива колебался от 3,5 до 24 месяцев (медиана 19 месяцев).
Количество бластных клеток в костном мозге в момент констатации рецидива ОМЛ равнялось 25%, 92% и 93%, у больного ХМЛ - 34%.
«