Главная >> Диссертации - все темы

Pages: | 1 |

«Оптимизация метода ВЭЖХ для терапевтического лекарственного мониторинга противосудорожных препаратов, метотрексата и циклоспорина А ...»

-- [ Страница 2 ] --

Эффективность колонки, измеренная сразу после проведения анализов, существенно ниже, чем эта же величина, измеренная после выдерживания колонки в ацетонитриле в течение 12 часов. Мы считаем, что это явление может быть связано с сорбцией мицеллярных структур пробы, которые прочно удерживаются на ОФ сорбенте. Сорбция таких структур снижает емкость сорбента, вследствие чего снижается эффективность колонки.

В процессе хранения сорбента в органическом растворителе сорбированные удерживающиеся гораздо слабее, элюируются из колонки, эффективность которой опять возрастает. Это явление имеет большее практическое значение. Обычно после проведения анализов рекомендуется в течение длительного времени промывать колонку "сильной" ПФ, что приводит к большому расходу дорогостоящих растворителей и не дает нужного результата, т.к. процесс разрушения сорбированных структур достаточно медленный.

Незначительное изменение максимального давления на входе в колонку и разрешения пары "фенантрен/антрацен" после проведения 400 анализов также свидетельствуют о стабильности хроматографической колонки. Таким образом, предварительная обработка сыворотки крови гексаном, удаляющая наиболее гидрофобные липиды, в сочетании с хранением в ацетонитриле позволяет заметно увеличить длительность эксплуатации колонки.

Осаждение белков является довольно распространенным методом подготовки пробы в ТЛМ. Наиболее часто для осаждения белка используется ацетонитрил при различных соотношениях ацетонитрил-сыворотка. В нашей работе мы выбрали соотношение 1:1 [122], так как при изменении соотношения до 2:1 степень осаждения белка возрастает незначительно: с 92 до 97% [65]. Уменьшение соотношения ацетонитрил-сыворотка ведет к меньшему разбавлению пробы и позволяет вводить пробу из растворителя с более высокой полярностью, что обеспечивает приемлемую эффективность разделения.

При осаждении белков важным параметром является консистенция образующегося осадка, который требуется отделить от раствора. Для получения после центрифугирования достаточно уплотненного осадка мы использовали раствор перхлората лития в ацетонитриле, содержащий 1% уксусной кислоты. При выборе концентрации перхлората лития критерием уплотненности осадка была прозрачность надосадочной жидкости при слабом встряхивании центрифужной пробирки. Экспериментальные данные приведены в таблице 9.

Таблица 9. Консистенция* образующегося осадка белков сыворотки в зависимости от концентрации перхлората лития в ацетонитриле.

Консистенция осадка оценивалась визуально по прозрачности супернатанта при легком встряхивании пробирки после центрифугирования.

4.5.3. Подготовка пробы для определения этосуксимида.

Этосуксимид – гидрофильное соединение, слабо удерживающееся на обращенной фазе. Для таких соединений эффективность разделения на колонке с ОФ сильно зависит от содержания ацетонитрила в инжектируемой пробе и от объема вводимой пробы. На рис. 10 приведены зависимости высоты пика этосуксимида от объема пробы (для кривых 1 и 2 растворитель содержит 50% ацетонитрила). При инжекции пробы из 50% ацетонитрила объем вводимой пробы не может этосуксимида.

1- растворитель – 50% МеCN 2- растворитель – 50% МеCN, 5 мкл предпробы (0,2 М LiClO4, рН 3);

3- растворитель – обработанная сыворотка после удаления МеCN.

Инжекция пробы с предпробой (кривая 2), когда в инжекционную иглу перед набором раствора образца набирают воду (или буферный раствор) для разбавления растворителя образца, практически не влияет на эффективность по пику этосуксимида и предел количественного определения для этосуксимида по данной методике составляет 3,3 мкг/мл. При необходимости определения более низких концентраций этосуксимида можно использовать такой простой прием, как удаление ацетонитрила из супернатанта экстракцией хлористым метиленом, который позволяет вводить пробы не менее 10 мкл без снижения эффективности гидрофильных соединений, в данном случае позволяет повысить чувствительность анализа в 10 раз. Кроме этого, он позволяет продлить "время жизни" колонки вследствие удаления липидных компонентов пробы [68].

4.5.4. Подготовка пробы для определения клоназепама.

Терапевтическая концентрация клоназепама в сыворотке крови составляет 40нг/мл и его определение требует стадии предварительного концентрирования.

Для извлечения этого препарата из сыворотки крови чаще всего используют жидко-жидкостную [70, 123, 124], реже – твердофазную экстракцию [125] или метод сочетания колонок [126].

Степень извлечения клоназепама (50 нг/мл) из сыворотки крови в при двукратной экстракции и соотношении сыворотка:экстрагент=1:1 составила в среднем 99% (n=5), что согласуется с данными авторов [70], которые используют однократную экстракцию при соотношении фаз сыворотка:экстрагент=1:10 и степень извлечения клоназепама при этом составила примерно 101%.

Клоназепам часто назначается в сочетании с карбамазепином, терапевтическая концентрация которого в 100-500 раз превышает концентрацию клоназепама – 6мкг/мл. Эти препараты обладают сходными физико-химическими свойствами и разделить их на стадии подготовки пробы не удается. Извлечение карбамазепина составило около 85% (n=5).

4.5.5. Подготовка пробы для определения циклоспорина А.

Терапевтическая концентрация циклоспорина А в сыворотке крови составляет 100-400 нг/мл. Определение этого соединения обычно проводится после стадии концентрирования с применением жидко-жидкостной [116, 118] или твердофазной [117, 119] экстракции.

Извлечение циклоспорина А из сыворотки крови мы выполняли экстракцией хлористым метиленом. Степень извлечения циклоспорина А (500 нг/мл) из сыворотки крови составила в среднем 89% (n=5). Обработка пробы гексаном в кислой среде, предложенная авторами [22], позволяет удалить большую часть УФпоглощающих соединений, мешающих определению циклоспорина А.

4.5.6. Подготовка пробы для определения вальпроевой кислоты.

Терапевтическая концентрация вальпроевой кислоты в сыворотке крови находится в интервале 50-100 мкг/мл и это соединение практически не поглощает свет в УФ-области спектра. Известны отдельные работы, предполагающие определение этого препарата в недериватизованном состоянии, но в ТЛМ такой метод определения вальпроевой кислоты не используется. Чаще всего она определяется в виде эфира с пара-бромфенацилбромистым [103] или 4-бромметилметоксикумарином [104].

Мы определяли вальпроевую кислоту в виде пара-бромфенацилового эфира.

На рис. 11 представлена схема реакции получения пара-бромфенацилового эфира вальпроевой кислоты, а на рис. 12 приведена зависимость площади пика образующегося эфира от времени.

HC COOH

Рис. 11. Реакция получения п-бромфенацилового эфира вальпроевой кислоты.

Рис. 12. Зависимость площади пика (при =260 нм) образующегося п-бромфенацилового эфира вальпроевой кислоты от времени. Начальная концентрация вальпроевой кислоты 70 мкг/мл. Объем пробы 5 мкл.

Как видно из рис. 12, время реакции 1 час при комнатной температуре является достаточным для проведения реакции. Степень извлечения вальпроевой кислоты из сыворотки крови (50 мкг/мл) гексаном (в присутствии 2М Н3РО4) составила, в среднем, 60% (n=5).

В данной работе предложены унифицированные хроматографические условия, позволяющие определять этосуксимид, гексамидин, фенобарбитал, ламиктал, дифенин, карбамазепин, бензонал, клоназепам и вальпроевую кислоту как в случае моно-, так и в случае комплексной терапии в любых сочетаниях. На рис. приведена типичная хроматограмма обработанной сыворотки крови пациента, принимающего лечение этосуксимидом.

Рис. 13. Определение этосуксимида в сыворотке крови. Концентрация этосуксимида в исходной сыворотке 28±2 мкг/мл.

Колонка: 2 x 75 мм; Nucleosil 100-5 C Элюент A: 0.2 M LiClO4 - H3PO4, pH 3; Элюент Б: MeCN Подвижная фаза: 10% Б Скорость потока: 150 мкл/мин Температура: 40oC Детектор: 196, 200, 210, 220 нм Проба: обработанная сыворотка крови Объем пробы: 2 мкл На рис. 14 приведены типичные хроматограммы обработанной сыворотки крови пациентов, проходящих лечение в фенобарбиталом или бензоналом.

(Бензонал –производное фенобарбитала – быстро метаболизируется в организме пациента в фенобарбитал и мониторинг ведется по концентрации фенобарбитала).

На рис.14 (I) – хроматограмма холостой пробы (обработанная сыворотка крови пациента, не принимающего фенобарбитал); 14 (II) – концентрация фенобарбитала в исходной сыворотке ниже терапевтической (5,8 мкг/мл); 14 (III) – в пределах терапевтического интервала (22 мкг/мл); 14 (IV) – выше терапевтической (33 мкг/мл).

Рис. 14. Определение фенобарбитала (ФБ) в сыворотке крови.

III - концентрация ФБ 22 мкг/мл; IV концентрация ФБ 33 мкг/мл.

Колонка: 2 x 75 мм; Nucleosil 100-5 C Элюент A: 0.2 M LiClO4 - H3PO4, pH 3; Элюент Б: МеCN Градиент: Линейный; 2000 мкл от 10%Б до 30%Б, 1000 мкл 30%Б Скорость потока: 150 мкл/мин Температура: 40oC УФ-детектор: 210, 220, 230, 240 нм Проба: обработанная сыворотка крови Объем пробы: 5 мкл На рис. 15-I приведена хроматограмма обработанной сыворотки крови карбамазепин). Мы видим, что на всех приведенных хроматограммах пики определяемых соединений симметричны и полностью отделены от эндогенных компонентов сыворотки. Идентификацию пиков определяемых соединений выполняли сравнением времен удерживания и спектральных отношений с соответствующими параметрами хроматограмм стандартных растворов. Во всем интервале терапевтических концентраций для всех определяемых соединений соответствующими значениями спектральных отношений стандартных растворов, что означает гомогенность пиков.

Рис. 15. Определение финлепсина (Ф) в сыворотке крови.

Колонка: 2 x 75 мм; Nucleosil 100-5 C Элюент A: 0.2 M LiClO4 - H3PO4, pH 3; Элюент Б: MeCN I - 30%Б; II - линейный градиент: 2000 мкл от 10%Б до 30%Б, 1000 мкл 30% Б Скорость потока: 150 мкл/мин Температура: 40oC УФ-детектор: 210, 220, 230, 240 нм Проба: обработанная сыворотка крови Объем пробы: 5 мкл На рис.15 (II) приведена хроматограмма обработанной сыворотки крови пациента, проходящего лечение финлепсином. Пик Ф - финлепсин, пик Пр неидентифицированная примесь, обладающая поглощением на длине волны = 210 нм и полностью не отделяющаяся от пика финлепсина в данных хроматографических условиях. Используя детекцию при длине волны 220, 230 или спектральных отношений стандартного раствора финлепсина, можно рассчитать площадь пика, соответствующую = 210 нм. Таким образом, применение одновременной многоволновой фотометрической детекции позволяет рассчитать хроматографического определения.

Рис. 16. Хроматограмма обработанной сыворотки крови пациента, принимающего 1 – гексамидин (2,9±0,2 мкг/мл); 2 - фенобарбитал (36±2 мкг/мл).

Колонка: 2 x 75 мм; Nucleosil 100-5 C Элюент A: 0.2 M LiClO4 - H3PO4, pH 3; Элюент Б: МеCN Градиент: Линейный; 2000 мкл от 10%Б до 30%Б, 1000 мкл 30%Б Скорость потока: 150 мкл/мин Температура: 40oC УФ-детектор: 210, 220, 230, 240 нм Проба: обработанная сыворотка крови Объем пробы: 5 мкл На рис. 16 приведена хроматограмма обработанной сыворотки крови пациента, проходящего лечение гексамидином. В организме пациента гексамидин медленно метаболизируется в фенобарбитал. На практике мониторинг гексамидина часто ведут только по концентрации фенобарбитала, так как фенобарбитал обладает большей противосудорожной активностью по сравнению с гексамидином.

Мониторинг фенобарбитала основан, как правило, на иммунологических методах.

Хроматографические методы позволяют одновременное определение как исходного гексамидина так и его активного метаболита фенобарбитала [100, 101, 108]. Применение градиентного элюирования позволяет одновременно определить оба этих соединения без существенного увеличения длительности анализа.

На рис. 17 и 18 приведены хроматограммы обработанных сывороток крови пациентов при комплексной терапии. Предлагаемые в данной работе условия позволяют определять любые сочетания УФ-поглощающих ПЭП, используемых при проведении комплексного лечения.

Рис. 17. Хроматограмма обработанной сыворотки крови пациента в случае гексамидин - 400 мг, ламиктал - 50 мг, карбамазепин - 600 мг.

1 – гексамидин (14,7±0,7 мкг/мл); 2 – фенобарбитал (21±1,0 мкг/мл);

3 – ламиктал (1,8±0,1 мкг/мл); 4 – карбамазепин (8,0±0,4 мкг/мл).

1 – фенобарбитал (19±1 мкг/мл); 2 – дифенин (1,9±0,2 мкг/мл);

Колонка: 2 x 75 мм; Nucleosil 100-5 C Элюент A: 0.2 M LiClO4 - H3PO4, pH 3; Элюент Б: МеCN Градиент: Линейный; 2000 мкл от 10%Б до 30%Б, 1000 мкл 30%Б Скорость потока: 150 мкл/мин Температура: 55oC УФ-детектор: 210, 220, 230, 240 нм Проба: обработанная сыворотка крови Объем пробы: 5 мкл мониторирование клоназепама в присутствии карбамазепина, концентрация которого в 100-500 раз превышает концентрацию клоназепама. Для решения этой проблемы используют ПФ, содержащие добавки алкиламинов, присутствие которых подавляет взаимодействие карбамазепина с силанольными группами сорбента, либо используют специальные фазы, практически не содержащие хроматографировать карбамазепин в виде "узкого" пика.

На рис. 19 (I) приведена хроматограмма экстракта стандартного раствора клоназепама в присутствии карбамазепина. Концентрация карбамазепина в терапевтическая концентрация), а клоназепама – 120 нг/мл. В данных условиях пик карбамазепина симметричен (несколько повышенное значение А10%=1,38 связано в данном случае с перегрузкой колонки по карбамазепину) и степень разделения карбамазепин/клоназепам даже при максимальной ширине пика карбамазепина равна 2,06 (при = 310 нм). Такое разрешение свидетельствует о разделении этих двух соединений до нулевой линии даже при максимально возможной концентрации карбамазепина в исходной сыворотке. На рис. 19 (II) приведена хроматограмма экстракта сыворотки крови пациента, проходящего лечение карбамазепином (600 мг/сутки) и клоназепамом (2 мг/сутки); на рис. 19 (III) – карбамазепин и клоназепам.

Рис. 19. Определение клоназепама в сыворотке крови.

I- хроматограмма экстракта стандартного раствора;

II- и III- хроматограммы крови пациентов, принимающего и не принимающего 1 - карбамазепин (6,4±0,4 мкг/мл); 2 - клоназепам (25±5 нг/мл).

Колонка: 2x75 мм; Nucleosil 100-5 C18.

Элюент A: 0.2 M LiClO4 - H3PO4, pH 3; Элюент Б: МеCN.

Градиент: Линейный; 2000 мкл от 10%Б до 30%Б, 1000 мкл 30%Б.

Скорость потока: 150 мкл/мин. Температура: 40oC.

УФ-детектор: 310, 320, 330, 340 нм.

Объем пробы: 20 мкл.

Пик клоназепама на хроматограмме экстракта сыворотки симметричен и спектральные отношения совпадают в пределах ошибки со спектральными отношениями стандартного раствора:

На рис. 20 приведена хроматограмма экстракта вальпроевой кислоты (ВК) после получения п-бромфенацилового эфира. Пик производного симметричен и полностью отделен от эндогенных соединений сыворотки.

Рис. 20. Определение вальпроевой кислоты в экстракте сыворотки крови 1 - п-бромфенациловый эфир ВК. Концентрация ВК в сыворотке 67±8 мкг/мл.

Колонка: 2 x 75 мм; Nucleosil 100-5 C18.

Элюент A: 0.2 M LiClO4 - H3PO4, pH 3; Элюент Б: МеCN.

Подвижная фаза: 65%Б.

Скорость потока: 150 мкл/мин Температура: 40oC.

УФ-детектор: 250, 260, 270, 280 нм. Объем пробы: 5 мкл концентрации ПСП в сыворотке крови пациентов, проходящих лечение в Иркутской Государственной Областной детской клинической больнице. Было проанализировано более 700 проб сыворотки крови (см. Приложение 4).

лекарственных препаратов в процессе курсового лечения, выбора временных интервалов приема препарата. По данным мониторинга за 1997-2003 гг. около 25% пациентов, проходящих лечение в Областной Государственной детской клинической больнице г. Иркутска с диагнозом "эпилепсия" требуют изменения "стандартных" доз лекарственных препаратов.

4.7. Определение циклоспорина А в сыворотке крови.

На рис. 21 приведена хроматограмма обработанной сыворотки крови пациента, проходящего лечение циклоспорином А.

Рис. 20. Хроматограмма экстракта сыворотки крови пациента, принимающего Концентрация циклоспорина А в исходной сыворотке составляет 98± 10 мкг/мл.

Колонка: 2x75 мм; Nucleosil 100-5 C18.

Элюент A: 0.2 M LiClO4 - H3PO4, pH 3; Элюент Б: МеCN.

Градиент: Линейный, 2500 мкл от 50%Б до 80%Б, 1000 мкл 80%Б.

Скорость потока: 150 мкл/мин. Температура: 70oC.

УФ-детектор: 200, 204, 210, 214 нм.

Объем пробы: 100 мкл.

инжектируемой пробы (растворитель - 50% ацетонитрил) и полностью отделен от сопутствующих компонентов. Совпадение в пределах ошибки спектральных отношений пика циклоспорина А в экстракте сыворотки крови со спектральными отношениями пика стандартного раствора свидетельствуют о гомогенности пика определяемого соединения:

Методика использована для определения циклоспорина А в сыворотке (плазме) крови детей, проходящих лечение в Иркутской Государственной Областной детской клинической больнице. Было проанализировано 4 образца. Концентрация циклоспорина А в сыворотке во всех исследованных образцах находилась в интервале терапевтических концентраций.

4.8. Определение метотрексата в сыворотке крови.

На рис 21 приведены хроматограммы обработанной сыворотки крови пациентов, проходящих лечение высокими дозами метотрексата. Рис. 21 (I) и 21 (II) - пробы крови отобраны в процессе инфузии препарата (где концентрация метотрексата достаточно высока и для данных образцов составляет 1,2 и 0,7 мкМ, соответственно). Рис. 21(III) - концентрация метотрексата в исходной сыворотке составляет 0,2 мкМ (проба крови отобрана через 2 часа после окончания инфузии).

Рис. 21(IV) – концентрация МТХ менее 0,001 мкМ (через 18 часов после окончания инфузии). На всех хроматограммах пики МТХ симметричны и полностью отделены от эндогенных соединений сыворотки крови. Детектирование на длине волны 300 нм (второй максимум) значительно снижает число УФ-поглощающих (мешающих) компонентов сыворотки при достаточной чувствительности по определяемому компоненту.

III МТХ

Рис. 21. Хроматограммы обработанной сыворотки крови пациентов, проходящих лечение высокими дозами метотрексата (МТХ).

Колонка: 2x75 мм; Nucleosil 100-5 C18.

Элюент A: 0.2 M LiClO4 - H3PO4, pH 3; Элюент Б: ACN.

Градиент: Линейный; 2200 мкл от 5%Б до 20%Б, 1000 мкл 20% Б.

Скорость потока: 150 мкл/мин. Температура: 40oC.

УФ-детектор: 280, 300, 310, 320 нм.

Проба: обработанная сыворотка крови.

Объем пробы: 20 мкл.

Методика использована для определения концентрации МТХ в сыворотке крови детей, получающих лечение высокими дозами препарата. Лечение проводится в четыре приема с перерывами в две недели и заключается во внутривенном введении раствора МТХ в течение 36 часов. МТХ является сильнейшим системным ядом, поэтому через 6, 12, а при необходимости еще через 18 и 24 часа после окончания инфузии МТХ ребенку вводится противоядие – лейковорин.

Концентрация метотрексата в крови разных пациентов в процессе введения существенно различается, несмотря на то, что дети получают одинаковую “стандартную” дозу препарата – 1000 мг на 1 м2 поверхности тела. Различается также и скорость выведения метотрексата по окончании инфузии. Высокая концентрация метотрексата и (или) низкая скорость выведения препарата связаны с осложнениями - воспалением десен и отмиранием их тканей, повышением температуры, тошнотой, рвотой, поражениями кожи, а в некоторых случаях – с тяжелыми поражениями печени, почек, сердца, что может приводить к гибели детей.

Мониторинг концентрации МТХ в сыворотке крови выполнялся при проведении первой (из четырех) инфузии, для которой доза МТХ определялась из расчета 1000 мг/м2 поверхности тела ребенка.

На рис. 22 приведена зависимость концентрации МТХ от времени в образцах крови пациента, проходящего лечение МТХ по стандартной схеме (1000 мг/м2).

Максимальная концентрация метотрексата в процессе инфузии достигает 13 мкМ, а через 6 часов после окончания инфузии составляет 0,1 мкМ (точка "42 час".).

Быстрое снижение концентрации МТХ в образцах крови после окончания инфузии свидетельствует о нормальной скорости выведения препарата из организма ребенка. Тем, не менее, концентрация 0,1 мкМ высока и определяется высокой концентрацией МТХ в процессе инфузии, которая, в свою очередь, зависит от дозы вводимого препарата. Токсичность МТХ связана, в основном, с длительностью его воздействия, поэтому ребенку был дополнительно введен лейковорин (антидот МТХ). При проведении последующих инфузий доза МТХ была снижена до 900 мг/м2. Ранее было отмечено, что при снижении дозы на 10 % концентрация МТХ в крови пациента в процессе инфузии снижается в 3-5 раз. Концентрация МТХ в образцах крови данного пациента в процессе инфузии не превышала 4 мкМ, а через 6 часов после окончания инфузии составила 0,001 мкМ.

Рис. 22. Изменение концентрации МТХ в сыворотке крови пациента в процессе По разработанной методике был проведен мониторинг 30 пациентов онкогематологического отделения Областной Государственной детской клинической больницы г. Иркутска, проходящих лечение высокими дозами МТХ. Отмечено, что около 75% пациентов нуждаются в изменении "стандартной" схемы лечения.

использованы для изменения схемы дальнейшего лечения: для пациентов, имеющих высокие содержания МТХ в образцах крови в процессе инфузии, рекомендовано уменьшить дозу вводимого препарата на 5-10%; при низкой скорости выведения МТХ после окончания инфузии рекомендовано трижды вводить лейковорин, через каждые 6 часов. Отмечено, что при дальнейшем лечении по измененной схеме осложнений не было.

На рис. 23 приведена гистограмма, показывающая максимальную найденную концентрацию МТХ в крови в процессе инфузии для некоторых пациентов.

Концентрация МТХ, мкмоль/л Рис. 23. Максимальная найденная концентрация МТХ в крови пациентов (по данным ВЭЖХ) в процессе инфузии. Больные 3 и 5 умерли.

4.9. Метрологические характеристики разработанных методик.

4.9.1. Предел обнаружения, предел количественного определения и В табл. 10 приведены значения предела обнаружения и предела количественного определения для всех определяемых соединений. В УФ-ВЭЖХ обе этих величины зависят от параметров хроматографической системы (см. Главу 2). В данном случае эти величины рассчитаны для хроматографической колонки, эффективность которой составляет 3000 т.т. и которая достаточна для решения большинства задач рутинного анализа. Уровень шума при 196, 200 и 210 нм составлял 0,001 е.о.п.; при 300 и 310 нм - 0,0005 е.о.п. Пределы обнаружения указаны с соблюдением условия, что относительное стандартное отклонение (Sвосп.) и отклонение от номинального значения не превышают 20%, а пределы количественного определения – 15%. (Эти критерии являются общепринятыми для биоаналитических методик).

Значение предела обнаружения для вальпроевой кислоты, приведенное в табл. 10 – 7 мкг/мл – в 1,4 раза превышает значение S/N=3, принятого для его оценки (при соблюдении этого условия ПрОВК должен быть 5 мкг/мл). Это связано с тем, что при концентрации вальпроевой кислоты в сыворотке крови 5 мкг/мл относительное стандартное отклонение метода превышает 20%. Причиной этого в данном случае может быть низкая степень извлечения вальпроевой кислоты из сыворотки крови (в среднем 60 %).

Приведенные значения пределов количественного определения показывают, что определение данных соединений возможно во всем интервале терапевтических концентраций. При необходимости некоторое повышение чувствительности возможно при увеличении объема инжектируемой пробы.

В табл. 10 приведена верхняя граница линейного диапазона для всех определяемых соединений при указанных в таблице длинах волн детектирования и объемах инжектируемых образцов.

При определении в сыворотке крови этосуксимида, гексамидина, фенобарбитала (бензонала), ламиктала, дифенина, карбамазепина и метотрексата в качестве верхней границы динамического линейного диапазона была выбрана концентрация 100 или 200 мкг/мл (10-3-10-4 Моль/л) по каждому соединению в исходной сыворотке.

Для определения в сыворотке крови циклоспорина А и клоназепама верхняя граница линейного диапазона указана с учетом стадии экстракции, а для определения вальпроевой кислоты – с учетом стадий экстракции и дериватизации.

Подтверждением линейной зависимости между концентрацией определяемого соединения в сыворотке и площадью пика этого соединения (или его производного для вальпроевой кислоты) в хроматографируемом образце могут быть коэффициенты корреляции градуировочных зависимостей для всех определяемых соединений в выбранном диапазоне концентраций (5 концентраций, n=10 для каждой концентрации), которые были не хуже 0,98. Таким образом, для всех определяемых соединений подтверждена линейная зависимость "концентрация в исходной сыворотке крови – площадь пика в инжектируемом растворе" в интервале ПрО – верхняя граница линейного диапазона. Для всех определяемых соединений линейный интервал шире интервала терапевтических концентраций.

Таблица 10. Линейный диапазон, предел детектирования и предел количественного определения.

Определяемое соединение 4.9.2. Оценивание характеристики воспроизводимости.

Воспроизводимость результатов определения содержания этосуксимида, гексамидина, фенобарбитала (бензонала), ламиктала, дифенина, карбамазепина и метотрексата в сыворотке крови оценивали по данным анализа реальных проб.

Образец сыворотки крови, содержащий исследуемое соединение, делили на частей и замораживали при -20°С.

Оценивание характеристики воспроизводимости определения вальпроевой кислоты, циклоспорина А и клоназепама в сыворотке крови готовили искусственные образцы на основе донорской сыворотки крови. Для их приготовления в образец донорской сыворотки крови вносили рассчитанное количество изучаемого ЛВ, перемешивали, образец делили на 10 частей и замораживали при -20°С.

Для оценивания характеристики воспроизводимости образцы обрабатывали и проводили хроматографическое определение в соответствии с прописью методики в условиях воспроизводимости (разное время). Характеристики погрешности результатов ВЭЖХ-анализа оценивались в соответствии с Рекомендацией "Характеристики погрешности результатов количественного химического анализа. Алгоритмы оценивания" МИ 2336-95 [127].

Относительное стандартное отклонение (Sвоспр.) для определения этих соединений в сыворотке крови по разработанным методикам (=0,05, n=10) приведено в таблице 11.

Для оценки систематической составляющей погрешности разработанных методик был использован метод добавок. Для проверки правильности результатов анализа рабочие пробы делили на две части, в одну вводили известное количество изучаемого ЛВ в виде стандартного раствора, другую оставляли без изменений. Обе пробы независимо анализировали в соответствии с прописью методики (число параллельных определений n=5 для проб, содержащих этосуксимид, гексамидин, фенобарбитал (бензонал), ламиктал, дифенин, карбамазепин и метотрексат; для проб, содержащих циклоспорин А и клоназепам n=3). Результаты приведены в табл. 12.

Таблица 11. Относительное стандартное отклонение (Sвоспр.) для определения ЛВ в сыворотке крови (=0,05, n=10).

Определяемое соединение Таблица 12. Контроль правильности результатов анализа образцов сыворотки крови методом добавки определяемого компонента.

Вальпроевая к-та Гексамидин Дифенин Карбамазепин Клоназепам* Ламиктал Фенобарбитал Этосуксимид Метотрексат Циклоспорин А* *)- число параллельных определений n= Результат контроля не превышает 15 %, допускаемых для биоаналитических методов при определении соединений, концентрация которых в исходной пробе выше предела количественного определения, что свидетельствует об отсутствии значимых систематических погрешностей в результатах анализа.

Таким образом, все разработанные методики удовлетворяют требованиям, предъявляемым к биоаналитическим методам и могут быть использованы для ТЛМ в рутинной клинической практике.

1. Разработана и оптимизирована унифицированная ВЭЖХ-методика для определения концентрации этосуксимида, гексамидина, фенобарбитала, бензонала, ламиктала, дифенина, карбамазепина, клоназепама, депакина, особенностями являются:

колонка: 2х75 мм с сорбентом Nucleosil 100-5 С18;

элюенты: 0,2 М перхлорат лития (рН 3, H3PO4) и ацетонитрил;

- многоволновое фотометрирование в УФ области спектра;

- продолжительность анализа: 10-15 мин.

Методика позволяет осуществлять лекарственный терапевтический мониторинг противосудорожных препаратов при проведении как моно-, так и комплексной терапии.

лекарственного терапевтического мониторинга этосуксимида, гексамидина, фенобарбитала, бензонала, ламиктала, дифенина, карбамазепина и метотрексата путем их прямого определения с помощью ВЭЖХ. Методика включает в себя стадии: удаление свободных липидов экстракцией гексаном и осаждение белков добавлением 0,6 М раствора перхлората лития в ацетонитриле (рН 2). Методика подготовки пробы требует не более 50 мкл сыворотки, и позволяет выполнить на одной колонке не менее 400 анализов.

3. Практическая применимость разработанных методик ВЭЖХ-анализа и подготовки проб сыворотки крови для лекарственного терапевтического мониторинга показана на примере мониторинга концентрации противосудорожных препаратов у более, чем 700 больных и на примере мониторинга концентрации метотрексата при химиотерапевтическом лечении 30 пациентов.

4. Метрологические характеристики разработанных методик анализа удовлетворяют требованиям, принятым для биоаналитических методов.

Относительное стандартное отклонение не превышает 15% в интервале терапевтических концентраций для всех соединений.

1. Об утверждении номенклатуры клинических лабораторных исследований.

Приказ МЗ РФ от 21 февр. 2000 г. № 64 // Рос. газ.- 2000.-28 февр.- С. 4.

2. Regenthal R., Krueger M., Koeppel C., Preiss R. Drug levels: Therapeutic and toxic serum/plasma concentrations of common drugs. // J. Clin. Monit. 1999. V.

15. P. 529-544.

3. Przybyclel M., Majors R.E. Phase Collapse in Reversed-Phase LC. // LC GC Europe, 2002. № 10. P. 2-5.

4. Nagae N., Enami T., Doshi S. The Retention Behavior of Reversed-Phase HPLC Columns with 100% Aqueous Mobile Phase. // LC GC North America, 2002.

V. 20. № 10. P. 964-972.

5. Kobayashi S., Tanaka I., Shirota O., Kanda T., Ohtsu Y. Synthesis and characterization of a polymer-coated C18 stationary phase with high carbon content for liquid chromatography. // J. Chromatogr. A. 1998. V. 828. P. 75–81.

6. Fairbank R.W.P., Wirth M.J. Role of surface-adsorbed water in the horizontal polymerization of trichlorosilanes. // J. Chromatogr. A. 1999. V. 830. P. 285–291.

7. Silva C.R., Jardim I.C.S.F., Airoldi C. Development of new urea-functionalized silica stationary phases. Characterization and chromatographic performance. // J. Chromatogr. A. 2001. V. 913. P. 65–73.

8. Layne J. Characterization and comparison of the chromatographic performance of conventional, polar-embedded, and polar-endcapped reversed-phase liquid chromatography stationary phases. // J. Chromatogr. A. 2002. V. 957. P. 149–164.

9. Kirkland J.J., Van Straten M.A., Claessens H.A. Reversed-phase highperformance liquid chromatography of basic compounds at pH 11 with silicabased column packings. // J. Chromatogr. A. 1998. V. 797. P. 111–120.

10. Wilson N.S., Nelson M.D., Dolan J.W., Snyder L.R., Wolcott R.G., P.W. Carr.

Column selectivity in reversed-phase liquid chromatography. A general quantitative relationship. // J. Chromatogr. A. 2002. V. 961. P. 171–193.

11. Vervoort R.G.M., Debets A.J.J., Claessens H.A., Cramers C.A., De Jong G.J.

Optimisation and characterisation of silica-based reversed-phase liquid chromatographic systems for the analysis of basic pharmaceuticals. // J. Chromatogr. A. 2000. V. 897. P. 1–22.

12. Vervoort R.J.M., Derksen M.W.J., Maris F.A Selection of stationary phases for the liquid chromatographic analysis of basic compounds using chemometrical methods. // J. Chromatogr. A. 1994. V. 678. P. 1-15.

13. Visky D., Heyden Y.V., Ivanyi T., Batten P., De Beer J., Kovacs Z., Noszal B., Roets E., Massart D.L., Hoogmartens J. Сharacterisation of reversed-phase liquid chromatographic columns by chromatographic tests. Evaluation of 36 test parameters: repeatability, reprodusibility and correlation. // J. Chromatogr. A.

2002. V. 977. P. 35-58.

14. Dorsey J.G., Rogers S.D. Chromatographic silanol activity test procedures: The Quest for a universal test. // J. Chromatogr. A. 2000. V. 892. P. 57-65.

15. Dolan J.W., Snyder L.R., Jupille T.H., Wilson N.S. Variability of column selectivity for reversed-phase high-performance liquid chromatography.

Compensation by adjustment of separation conditions. // J. Chromatogr. A. 2002.

V. 960. P. 51–67.

16. Введение в микромасштабную высокоэффективную жидкостную хроматографию. // Ред. Д. Исии, М., Мир, 1991. - 240 стр.

17. Baram G.I. Portable liquid chromatograph for mobile laboratories. I. Aims. // J. Chromatogr. A. 1996. V. 728. P. 387–399.

18. Vissers J.P.C. Recent developments in microcolumn liquid chromatography. // J. Chromatogr. A. 1999. V. 856. P. 117–143.

19. Done J.N. Sample loading and efficiency in adsorption, partition and bondedphase high-speed liquid chromatography. // J. Chromatogr. 1976. V. 125. P. 43– 20. Количественный анализ хроматографическими методами. // Ред. Э. Кец, М., Мир, 1990. – 320 стр.

21. Basic liquid chromatography. N. Hadden, F. Baumann, F. MacDonald, et al. Varian Aerograph, 1971.

22. Brozmanova H., Grundmann M., Safarck K., Jegorov A. High-performance liquid chromatographic method for therapeutic drug monitoring of cyclosporine A and its two metabolites in renal transplant patients. // J. Chromatogr. B. 2000. V.

749. P. 93–100.

23. Chow D.S.-L., Bhagwatwar H.P., Phadungpojna S., Andersson B.S. Stabilityindicating high-performance liquid chromatographic assay of busulfan in aqueous and plasma samples. // J. Chromatogr. B. 1997. V. 704. P. 277–288.

24. Ong C.P., Chow K.K., Ng C.L., Ong F.M., Lee H.K., Li S.F.Y. Use of overlapping resolution mapping scheme for optimization of the high-performance liquid chromatographic separation of pharmaceuticals. // J. Chromatogr. A. 1995.

V. 692. P. 207–212.

25. Wolcott R.G., Dolan J.W., Snyder L.R. Computer simulation for the convenient optimization of isocratic reversed-phase liquid chromatographic separations by varying temperature and mobile phase strength. // J. Chromatogr. A. 2000. V. 869.

26. Torres-Lapasio J.R., Garcia-Alvarez-Coque M.C., Baeza-Baeza J.J. Global treatment of chromatographic data with MICHROM. // Anal. Chim. Acta. 1997.

V. 348. P. 187-196.

27. Wilson N.S., Morrison R., Dolan J.W. Buffers and baselines. // LC GS Europe.

2001. № 7. P. 1-3.

28. Tindall G.W. Mobile-Phase Buffers, part II-buffer selection and capacity. // LCGC North America. 2002. V. 20. № 12. P. 1-7.

29. Kimura M., Kanehira K., Yokoi K. Highly sensitive and simple liquid chromatographic determination in plasma of B6 vitamers, especially pypidoxal 5phosphate. / J. Chromatogr. A. 1996. V. 722. P. 295-301.

30. Sergeev N.V., Gloukhova N.S., Nazimov I.V., Gulyaev V.A., Shvets S.V., Donetsky I.A., Miroshnikov A.I. Monitoring of recombinant human insulin production by narrow-bore reversed-phase high-performance liquid chromatography, high-performance capillary electrophoresis and matrix-assisted laser desorption ionisation time-of-flight mass spectrometry. // J. Chromatogr. A.

2001. V. 907. P. 131–144.

31. Кожанова Л.А., Федорова Г.А., Барам Г.И. Определение водо- и жирорастворимых витаминов в поливитаминных препаратах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. // Журнал аналитической химии, 2002. Т. 57. № 1. С. 49-54.

32. Li H.B., Chen F. Simultaneous determination of twelve water- and fat-soluble vitamins by high-performance liquid chromatography with diode-array detection.

// Chromatographia. 2001. V. 54. № 3-4. P. 270-273.

33. Van Heeswijk R.P.G., Hoetelmans R.M.W., Meenhorst P.L., Mulder J.W., Beijnen J.H. Rapid determination of nevirapine in human plasma by ion-pair reversed-phase high-performance liquid chromatography with ultraviolet detection. // J. Chromatogr. B. 1998. V. 713. P. 395–399.

34. Marzolini C., Telenti A., Buclin T., Biollaz J., Decosterd L.A. Simultaneous determination of the HIV protease inhibitors indinavir, amprenavir, saquinavir, ritonavir, nelfinavir and the non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor efavirenz by high-performance liquid chromatography after solid-phase extraction. // J. Chromatogr. B. 2000. V. 740. P. 43–58.

35. Svensson J.-O., Barkholt L., SaWe J. Determination of acyclovir and its metabolite 9-carboxymethoxymethylguanine in serum and urine using solid-phase extraction and high-performance liquid chromatography. // J. Chromatogr. B.

1997. V. 690. P. 363–366.

36. Hosotsubo H., Takahara S., Kokado Y., Permpongkosol S., Wang J.-D., Tanaka T., Matsumiya K., Kitamura M., Okuyama A., Sugimoto H. Rapid and simultaneous determination of mycophenolic acid and its glucuronide conjugate in human plasma by ion-pair reversed-phase high-performance liquid chromatography using isocratic elution. // J. Chromatogr. B. 2001. V. 753. P. 315– 37. Burger D.M., De Graaff M., Wuis E.W., Koopmans P.P., Hekster Y.A.

Determination of indinavir, an HIV-protease inhibitor, in human plasma by reversed-phase high-performance liquid chromatography. // J. Chromatogr. B.

1997. V. 703. P. 235–241.

38. Zhu P.L., Snyder L.R., Dolan J.W., Djordjevic N.M., Hill D.W., Sander L.C., Waeghe T.J. Combined use of temperature and solvent strength in reversed-phase gradient elution. I. Predicting separation as a function of temperature and gradient conditions. // J. Chromatogr. A. 1996. V. 756. P. 21–39.

39. Zhu P.L., Dolan J.W., Snyder L.R., Hill D.W., Van Heukelem L., Waeghe T.J.

Combined use of temperature and solvent strength in reversed-phase gradient elution. III. Selectivity for ionizable samples as a function of sample type and pH.

// J. Chromatogr. A. 1996. V. 756. P. 51–62.

40. Dimov N., Simova M. Unexpected behavior of digoxin at elevated temperatures in reversed-phase liquid chromatography. // Chromatographia. 1999. V. 49. P. 306Dolan J.W., Snyder L.R., Djordjevic N.M., Hill D.W., Saunders D.L., Van Heukelem L., Waeghe T.J. Simultaneous variation of temperature and gradient steepness for reversed-phase high-performance liquid chromatography method development. Application to 14 different samples using computer simulation. // J. Chromatogr. A. 1998. V. 803. P. 1–31.

42. Cela R., Lores M. Preopt-W: A simulation program for off-line optimisation of binary gradient separation in HPLC-I. Fundamentals and overview. // Comp.

Chem. 1996. V. 20. P. 175-191.

43. Rozman E., Galceran M.T., Albet C. Determination of ebrotidine and its metabolites in human urine by reversed-phase ion-pair high-performance liquid chromatography. // J. Chromatogr. B. 1997. V. 688. P. 107-115.

44. Hartter S., Weigmann H., Hiemke C. Automated determination of reboxetine by high-performance liquid chromatography with column-switching and ultraviolet detection. // J. Chromatogr. B. 2000. V. 740. P. 135–140.

45. Хубер Л. Применение диодно-матричного детектирования в ВЭЖХ. // М., Мир, 1993. – 34 стр.

46. Gaillard Y., Pepin G. Use of high-performance liquid chromatography with photodiode-array UV detection for the creation of a 600-compound library.

Application to forensic toxicology. // J. Chromatogr. A. 1997. V. 763. P. 149-163.

47. Maier R.D., Bogusz M. Identification power of standardized HPLC-DAD system for systematic toxicological analysis. // J. Anal. Toxicol. 1995. V. 19. P. 79-83.

48. Wilhelm M., Battista H.-J., Obendorf D. Selective and sensitive assay for the determination of benzodiazepines by high-performance liquid chromatography with simultaneous ultraviolet and reductive electrochemical detection at the hanging mercury drop electrode. // J. Chromatogr. A. 2000. V. 897. P. 215–225.

49. Yamada H., Yoshizawa K., Hayase T. Sensitive determination method of estradiol in plasma using high-performance liquid chromatography with electrochemical detection. // J. Chromatogr. B. 2002. V. 775. P. 209–213.

50. Hara S., Mochinaga S., Fukuzawa M., Ono N., Kuroda T. Simple and highly sensitive determination of morphine in rat plasma by liquid chromatography with fluorescence detection. // Anal. Chim. Acta. 1999. V. 387. P. 121-126.

51. Albertione F., Pettersson B., Beck O., Rask C., Seideman P., Peterson C.

Simultaneous quantitation of methotrexate and its two main metabolites in biological fluids by a novel solid-phase extraction procedure using highperformance liquid chromatography. // J. Chromatogr. B. 1995. V. 665. P. 163– 52. Ofner B., Winterstaiger R. Minimization of plasma interferences by liquid chromatography with electrochemical detection after ultraviolet irradiation using chlordiazepoxide as model substance. // Anal. Chim. Acta. 1995. V. 305. P. 318Macher M., Winterstaiger R. Improved electrochemical detection of diuretics in high-performance liquid chromatographic analysis by postcolumn on-line photolysis. // J. Chromatogr. A. 1995. V. 709. P. 257–264.

54. Bogusz M.J., Maier R.-D., Kruger K.-D., Fruchtnicht W. Determination of flunitrazepam and its metabolites in blood by high-performance liquid chromatography–atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry. // J. Chromatogr. B. 1998. V. 713. P. 361–369.

55. Marquet P., Lachatre G. Liquid chromatography-mass spectrometry:potential in forensic and clinical toxicology. // J. Chromatogr. B. 1999. V. 733. P. 93-118.

56. Drummer O.H. Chromatographic screening techniques in systematic toxicological analysis. // J. Chromatogr. B. 1999. V. 733. P. 27–45.

57. Lu J., Cwik M., Kanyok T. Determination of paromomycin in human plasma and urine by reversed-phase high-performance liquid chromatography using 2,4dinitrofluorobenzene derivatization. // J. Chromatogr. B. 1997. V. 695. P. 329– 58. Zhu Z., Neirinck L. High-performance liquid chromatographic method for the determination of gabapentin in human plasma. // J. Chromatogr. B. 2002. V. 779.

P. 307–312.

59. Tawa R., Matsunaga H., Fujimoto T. High-performance liquid chromatographic analysis of aminoglycoside antibiotics. // J. Chromatogr. A. 1998. V. 812. P. 141– 60. Eggenreich K., Zeipper U., Schwendenwein E., Hadju S., Kaltenecker G., Laslo I., Lang S., Roschger P., Vecsei V., Wintersteiger R. Determination of bone and tissue concentrations of teicoplanin mixed with hydroxyapatite cement to repair cortical defects. // J. Biochem. Biophys. Methods. 2002. V. 53. P. 51–59.

61. Погодаева Н.Н., Трофимов В.Н., Горшков А.Г., Барам Г.И., Зайков К.Л., Сырчина А.И., Семенов А.А. Количественное определение глицинбетаина в надземной части Salsolla collna pall. // Хим.-фарм. журнал. 1992. № 9-10. С.

62. Saleg N., Pertat N., Dutertre H., Dumontet M. Rapid, specific and sensitive method for isoniazid determination in serum. // J. Chromatogr. B. 1996. V. 675. P.

113–117.

63. Steiner F., Beck W., Engelhardt H. Optimization of indirect ultraviolet detection in high-performance liquid chromatography and capillary electrophoresis. // J.

Chromatogr. A. 1996. V. 736. P. 11–23.

64. Wahlung K.-G. Separation of acidic drugs in the µg/ml range in untreated blood plasma by direct injection on liquid chromatographic columns. // J.Chromatogr, 1981. V. 218. P. 671-679.

65. Murtaza R., Jackman H.L., Alexander B., Lleshi-Tali A., Winnie A.P., Igic R.

Simultaneous determination of mepivacaine, tetracaine, and p-butylaminobenzoic acid by high-performance liquid chromatography. // J. Pharmacol. and Toxicol.

Methods. 2002. V. 46. P. 131–136.

66. Polson C., Sarkar P., Incledon B., Raguvaran V., Grant R. Optimization of protein precipitation based upon effectiveness of protein removal and ionization effect in liquid chromatography–tandem mass spectrometry. // J. Chromatogr. B. 2003. V.

785. P. 263–275.

67. Sato J., Amizuka T., Niida Y., Umetsu M., Ito K. Simple, rapid and sensitive method for the determination of indomethacin in plasma by high-performance liquid chromatography with ultraviolet detection. // J. Chromatogr. B. 1997. V.

692. P. 241–244.

68. Cociglio M., Peyriere H., Hillaire-Buys D., Alric R. Application of a standardized coextractive cleanup procedure to routine high-performance liquid chromatography assays of teicoplanin and ganciclovir in plasma. // J. Chromatogr.

B. 1998. V. 705. P. 79–85.

69. Shin J.-G., Kim K.-A., Yoon Y.-R., Cha I.-J., Kim Y.-H., Shin S.-G. Rapid simple high-performance liquid chromatographic determination of paroxetine in human plasma. // J. Chromatogr. B. 1998. V. 713. P. 452–456.

70. Guellec C.L., Gaudet M.L., Breteau M. Improved selectivity for high-performance liquid chromatographic determination of clonazepam in plasma of epileptic patients. // J. Chromatogr. B. 1998. V. 719. P. 227–233.

71. De Cazanove F., Kinowski J-M., Audran M., Rochette A., Bressole F.

Determination of nalbuphine in human plasma by high-performance liquid chromatography with electrochemical detection. Application to a pharmacokinetic study. // J. Chromatogr. B. 1997. V. 690. P. 203-210.

72. Foglia J.P., Sorisio D., Kirshner M., Pollock B.G. Quantitative determination of paroxetine in plasma by high-performance liquid chromatography and ultraviolet detection. // J. Chromatogr. B. 1997. V. 693. P. 147–151.

73. Teitz D.S., Khan S., Powell M. L., Jemal M. An automated method of sample preparation of biofluids using pierceable caps to eliminate the uncapping of the sample tubes during sample transfer. // J. Biochem. Biophys. Methods. 2000. V.

45. P. 193–204.

74. Cheng Y.-F., Neue U.D., Bean L. Straightforward solid-phase extraction method for the determination of verapamil and its metabolite in plasma in a 96-well extraction plate. // J. Chromatogr. A. 1998. V. 828. P. 273–281.

75. Huck C.W., Bonn G.K. Recent developments in polymer-based sorbents for solidphase extraction. // J. Chromatogr. A. 2000. V. 885. P. 51–72.

76. Arcelloni C., Lanzi R., Pedercini S., Molteni G., Fermo I., Pontiroli A., Paroni R.

High-performance liquid chromatographic determination of diclofenac in human plasma after solid-phase extraction. // J. Chromatogr. B. 2001. V. 763. P. 195– 77. Mutlib A.E., Strupczewski J.T. Picogram determination of iloperidone in human plasma by solid-phase extraction and by high-performance liquid chromatography-selected-ion monitoring electrospray mass spectrometry. // J. Chromatogr. B. 1995. V. 669. P. 237–246.

78. Stanley S.M.R., Owens N.A., Rodgers J.P. Detection of flunixin in equine urine using high-performance liquid chromatography with particle beam and atmospheric pressure ionization mass spectrometry after solid-phase extraction. // J. Chromatogr. B. 1995. V. 667. P. 95–103.

79. Cosbey S.H., Craig I., Gill R. Novel solid-phase extraction strategy for the isolation of basic drugs from whole blood. Preliminary stady using commercially available extraction cartridges. // J. Chromatogr. B. 1995. V. 669. P. 229–235.

80. Olesen O.V., Plougmann P., Linnet K. Determination of nortriptyline in human serum by fully automated solid-phase extraction and on-line high-performance liquid chromatography in the presence of antipsychotic drugs. // J. Chromatogr. B.

2000. V. 746. P. 233–239.

81. Christians U., Jacobsen W., Serkova N., Benet L.Z., Vidal C., Sewing K.-F., Manns M.P., Kirchner G.I. Automated, fast and sensitive quantification of drugs in blood by liquid chromatography–mass spectrometry with on-line extraction:

immunosuppressants. // J. Chromatogr. B. 2000. V. 748. P. 41–53.

82. Brunetto M.R., Obando M.A., Fernandez A., Gallignani M., Burguera J.L., Burguera M. Column-switching high-performance liquid chromatographic analysis of carbamazepine and its principal metabolite in human plasma with direct sample injection using an alkyl-diol silica (ADS) precolumn. / Talanta.

2000. V. 58. P. 535-542.

83. Vielhauer S., Rudolphi A., Boos K.-S., Seidel D. Evaluation and routine application of the novel restricted-access precolumn packing material Alkyl-Diol Silica: coupled-column high-performance liquid chromatographic analysis of the photoreactive drug 8-methoxypsoralen in plasma. // J. Chromatogr. B. 1995. V.

666. P. 315-322.

84. Yu Z., Westerlung D. Direct injection of large volumes of plasma in a columnswitching system for the analysis of local anaesthetics. II. Determination of bupivacaine in human plasma with an alkyl-diol silica precolumn. // J. Chromatogr. A. 1996. V. 725. P. 149-155.

85. Chiap P., Rbeida O., Christiaens B., Hubert Ph., Lubda D., Boos K.-S., Crommen J. Use of a novel cation-exchange restricted-access material for automated sample clean-up prior to the determination of basic drugs in plasma by liquid chromatography. // J. Chromatography A. 2002. V. 975. P. 145–155.

86. Yu Z., Westerlung D. Direct injection of large volumes of plasma in a columnswitching system for the analysis of local anaesthetics. I. Optimisation of semipermeable surface precolumn in the system and characterization of some interference peaks. // J. Chromatogr. A. 1996. V. 725. P. 137-147.

87. Misl’anova C., Hutta M. Influence of various biological matrices (plasma, blood, microdialysate) on chromatographic performance in the determination of blockers using an alkyl-diol silica precolumn for sample clean-up. // J.

Chromatogr. B. 2001. V. 765. P. 167–177.

88. Guidance for Industry. Bioanalytical Method Validation. // Center for Drug Evaluation and Research, U.S. Food and Drug Administration, U.S. Department of Health and Human Services, Rockville, Maryland, May 2001.

89. ОСТ 42-510-98. Правила организации производства и контроля качества лекарственных средств (GMP): Стандарт отрасли, М., 1998.

90. О системе мер по повышению качества клинических лабораторных исследований в учреждениях здравоохранения Российской Федерации:

Приказ МЗ РФ от 7 февр. 2000г. №45. // Рос. газ. – 2000. – 20 февр. – С. 4.

91. Maurer H.H. Systematic toxicological analysis procedures for acidic drugs and/ or metabolites relevant to clinical and forensic toxicology and/ or doping control. // J. Chromatogr. B. 1999. V. 733. P. 3–25.

92. De Zeeuw R.A. Drug screening in biological fluids. The need for a systematic approach. // J. Chromatogr. B. 1997. V. 689. P. 71–79.

93. Peyrin E., Guillaume Y.C., Morin N., Guinchard C. Retention behavior of D,Ldansyl-amino acids on a human serum albumin chiral stationary phase: effect of a mobile phase modifier. // J. Chromatogr. A. 1998. V. 808. P. 113–120.

94. Барам Г.И., Грачев С.А. Использование перхлората лития при выделении и анализе олиго- и полинуклеотидов. //Биоорганич. химия. 1985. Т. 11. №. 10.

С. 1420-1422.

95. Guan F., Uboh C. E., Soma L. R., Birks E. K., Teleis D., Rudy J. A., Watson A.

O., Tsang D. S. Quantification of phenytoin and its metabolites in equine plasma and urine using high-performance liquid chromatography. // J. Chromatogr. B.

2000. V. 746. P. 209–218.

96. Moriyama M., Yamashita S., Domoto H., Furuno K., Araki H., Gomita Y.

Determination of plasma phenobarbital concentration by high-performance liquid chromatography in rat offspring. // J. Chromatogr. B. 1999. V. 723. P. 301–305.

97. Chollet D., Castella E., Combe P., Arnera V. High-speed liquid chromatographic method for the monitoring of carbamazepine and its active metabolite, carbamazepine-10,11-epoxide, in human plasma. // J. Chromatogr. B. 1996. V.

683. P. 237–243.

98. Romanyshyn L.A, Wichmann J.K, Kucharczyk N, Shumaker R.C, Ward D, Sofia R.D. Simultaneous determination of felbamate, primidone, phenobarbital, carbamazepine, two carbamazepine metabolites, phenytoin, and one phenytoin metabolite in human plasma by high-performance liquid chromatography. // Ther.

Drug Monit. 1994. V. 16. № 1. P. 90-99.

99. Cooper J.D.H., Shearsby N.J., Taylor J.E., Fook Sheung C.T.C. Simultaneous determination of lamotrigine and its glucuronide and methylated metabolites in human plasma by automated sequential trace enrichment of dialysates and gradient high-performance liquid chromatography. // J. Chromatogr. B. 1997. V.

702. P. 227–233.

100. Ferranti V., Chabenat C., Menager S., Lafont O. Simultaneous determination of primidone and its three major metabolites in rat urine by high-performance liquid chromatography using solid-phase extraction. // J. Chromatogr. B. 1998. V. 718.

P. 199–204.

101. Bugamelli F., Sabbioni C., Mandrioli R., Kenndler E., Albani F., Raggi M.A.

Simultaneous analysis of six antiepileptic drugs and two selected metabolites in human plasma by liquid chromatography after solid-phase extraction. // Anal.

Chim. Acta. 2002. V. 472. P. 1–10.

102. Matar K.M., Nicholls P.J., Tekle A., Bawazir S.A., Al-Hassan M.I. Liquid chromatographic determination of six antiepileptic drugs and two metabolites in microsamples of human plasma. // Ther. Drug Monit. 1999. V. 21. P. 559-566.

103. Nakamura M., Kondo K., Nishioka R., Kawai S. Improved procedure for the high-performance liquid chromatographic determination of valproic acid in serum as its phenacyl ester. // J. Chromatogr. 1984. V. 310. P. 450–454.

104. Liu H., Forman L.J., Montoya J., Eggers C., Barham C., Delgado M.

Determination of valproic acid by high-performance liquid chromatography with photodiode-array and fluorescence detection. // J. Chromatogr. 1992. V. 576. P.

163-169.

105. Barbosa N.R., Mdio A.F. Validated high-performance liquid chromatographic method for the determination of lamotrigine in human plasma. // J. Chromatogr.

B. 2000. 741. P. 289–293.

106. Cooper J.D.H., Shearsby N.J., Taylor J.E., Fook Sheung C.T.C. Simultaneous determination of lamotrigine and its glucuronide and methylated metabolites in human plasma by automated sequential trace enrichment of dialysates and gradient high-performance liquid chromatography. // J. Chromatogr. B. 1997. V.

702. P. 227–233.

107. Castel-Branco M.M., Almeida A.M., Falcao A.C., Macedo T.A., Caramona M.M., Lopez F.G. Lamotrigine analysis in blood and brain by high-performance liquid chromatography. // J. Chromatogr. B. 2001. V. 755. P. 119–127.

108. Bugamelli F., Sabbioni C., Mandrioli R., Kenndler E., Albani F., Raggi M.A.

Simultaneous analysis of six antiepileptic drugs and two selected metabolites in human plasma by liquid chromatography after solid-phase extraction. // Anal.

Chim. Acta. 2002. V. 472. P. 1–10.

109. Cociglio M., Hillaire-Buys D., Alric C. Determination of methotrexate and 7hydroxymethotrexate by liquid chromatography for routine monitoring of plasma levels. // J. Chromatogr. B. 1995. V. 674. P. 101-110.

110. Hirai T., Matsumoto S., Kishi I. Determination of methotrexate and its main metabolite 7-hydroxymethotrexate in human urine by high-performance liquid chromatography with normal solid-phase extraction. // J. Chromatogr. B. 1997. V.

690. P. 267-273.

111. Florida L., Pietropaolo A.M., Tavazzani M., Rubino F.M., Colombi A. Highperformance liquid chromatography of methotrexate for environmental monitoring of surface contamination in hospital departments and assessment of occupational exposure. // J. Chromatogr. B. 1999. V. 726. P. 95-103.

112. Yu Z., Westerlund D. Ion-pair chromatography of methotrexate in a columnswitching system using an alkyl-diol silica precolumn for direct injection of plasma. // J. Chromatogr. А. 1996. V. 742. P. 113-120.

113. Aboleneen H., Simpson J., Backes D. Determination of methotrexate in serum by high-performance liquid chromatography. // J. Chromatogr. B. 1996. V. 681. P.

317-322.

114. Howell S.K., Wang Y.M., Hosoya R., Sutow W.W. Plasma methotrexate as determined by liquid chromatography, enzyme-inhibition assay, and radioimmunoassay after high-dose infusion. // Clin. Chem. 1980. V. 26. P. 734Sharma P., Chawla H. P. S., Panchagnula R. Analytical method for monitoring concentrations of cyclosporin and lovastatin in vitro in an everted rat intestinal sac absorption model. // J. Chromatogr. B. 2002. V. 768. P. 349–359.

116. Chimalakonda A.P., Shah R.B., Mehvar R. High-performance liquid chromatographic analysis of cyclosporin A in rat blood and liver using a commercially available internal standard. // J. Chromatogr. B. 2002. V. 772. P.

107–114.

117. Kabra P.M., Wall J.H., Blanckaert N. Solid-phase extraction and liquid chromatography for improved assay of cyclosporine in whole blood or plasma. // Clin. Chem. 1985. V. 31. P. 1717-1720.

118. Khoschsorur G., Semmelrock H.J., Rodl S., Auer T., Petek W., Iberer F., Tscheliessnigg K.H. Rapid, sensitive high-performance liquid chromatographic method for the determination of cyclosporine A and its metabolites M1, M17 and M21. // J. Chromatogr. B. 1997. V. 690. P. 367–372.

119. Golabi N., Tajerzadeh H., Ghassempour A. A rapid and selective LC method for simultaneous determination of cyclosporin a and its major metabolite (AM1) in human serum at room temperature. // Talanta. 2003. V. 59. P. 1089-1094.

120. Bowers L.D., Mathews S.E. Investigation of the mechanism of peak broadening observed in the high-performance liquid chromatographic analysis of cyclosporine. // J. Chromatogr. 1985. V. 333. P. 231-238.

121. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии. Ред. А.

Хеншен, К.-П. Хупе, Ф. Лотшпайх, В. Вельтер. М., Мир, 1998.

122. Fedorova G.A., Baram G.I., Grachev M.A, Aleksandrov Yu.A, Tyuleneva G.N., Starodubtsev A.V. Application of Micro-Column HPLC to the Determination of Phenobarbital and Carbamazepine in Human Blood Serum. // Chromatographia, 2001. V.53, No.9-10. Р. 495-497.

123. Robertson M.D., Drammer O.H. High-performance liquid chromatographic procedure for the measurement of nitrobenzodiazepines and their 7-amino metabolites in blood. // J. Chromatogr. B. 1995. V. 667. P. 179–184.

124. Tanaka E., Terada M., Misawa S., Wakasugi C. Simultaneous determination of twelwe benzodiazepines in human serum using a new reversed-phase chromatographic column on a 2-µm porous microspherical silica gel. // J. Chromatogr. B. 1996. V. 682. P. 173–178.

125. Sallustio B.C., Kassapidis C., Morris R.G. High-performance liquid chromatography determination of clonazepam in plasma using solid-phase extraction. // Ther. Drug Monit. 1994. V. 16. P. 174-178.

126. El Mahjoub A., Staub C. High-performance liquid chromatographic method for the determination of benzodiazepines in plasma or serum using the columnswitching technique. // J. Chromatogr. B. 2000. V. 742. P. 381–390.

127. Характеристики погрешности результатов количественного химического анализа. Алгоритмы оценивания: Рекомендация. Государственная система обеспечения единства измерений. МИ 2336-95 (изд. второе). Екатеринбург, ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография ДМД – детектор с диодной матрицей ЖЖЭ – жидко-жидкостная экстракция ЖХ – жидкостная хроматография ЛВ – лекарственное вещество МС – масс-спектрометрический детектор ОФ – обращенная фаза, обращено-фазный ПСП – противосудорожные препараты ПФ – подвижная фаза СО – стандартный образец ТЛМ – терапевтический лекарственный мониторинг ТФЭ – твердофазная экстракция УФ – ультрафиолетовый ФЛ – флуоресцентный ФМ – фотометрический ЭХ – электрохимический Таблица 1. Структурные формулы и молекулярные массы ЛВ, подлежащих мониторингу в РФ.

Мексилетин (Седуксен) Таблица 1 (продолжение) Имипрамин (Тазепам) Хлорпромазин Карбамазепин Фенитоин Таблица 1 (продолжение) (Парацетамол)

HO O OH OH OH OH O

N CH2 N C NH CH COOH

CH COOH

Таблица 1 (продолжение)

H3C N C CO N C C N C CO N C C N CH

H CO H CO

CH3 N CO C N CO C N C C N C C N CO C

Таблица 1. Структурные формулы и молекулярные массы ЛВ, рекомендованных для мониторинга в США.

Carbamazepine Etinil Estradiol/Progestin Isoetharine Mesylate* сульфат) Таблица 1 (продолжение).

Phenytoin (Новокаин-амид) (Депакин) Desoxyphenobarbitone, Lepimidin, Lespiral, Liskantin, Mizodin, Mylepsin, Mysoline, Primaclon, Primidone*, Primoline, Prisoline, Sedilen, Sertan и др.

* Международные непатентованные названия, принятые ВОЗ (МНН) О.Е.

Депакин, Конвулекс, Конвульсофин, Convulex*, Convulsofin, Depaken, Depakin, Deprakine, Epilim, Labazene, Propymal, Valproate sodium и др.

* Международные непатентованные названия, принятые ВОЗ (МНН) Определение выполняется в виде пара-бромфенацилового эфира:

Ax/A О.Е.

Alepsin, Dihydantoin, Dilantin sodium, Diphedan, Diphentoin, Epanutin, Eptoin, Hydantal, Hydantoinal, Phenytoinum*, Sodanton, Solantoin, Solantyl и др.