ДЕПАРТАМЕНТ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ ГОРОДА МОСКВЫ

Государственное казенное учреждение здравоохранения города Москвы

МОСКОВСКИЙ ГОРОДСКОЙ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЙ ЦЕНТР

БОРЬБЫ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ

На правах рукописи

ХАХАЛИНА АНАСТАСИЯ АЛЕКСАНДРОВНА

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ МУТАЦИЙ

В ГЕНАХ gyrA и gyrB, СВЯЗАННЫХ С УСТОЙЧИВОСТЬЮ

MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS К ФТОРХИНОЛОНАМ

03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

кандидат медицинских наук Носова Елена Юрьевна доктор биологических наук Макарова Марина Витальевна Москва –

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ……………………………………....... 1.1. Фторхинолоны. Молекулярно-генетические механизмы развития устойчивости M. tuberculosis к фторхинолонам ………………. 1.2. Микробиологическое (фенотипическое) определение лекарственной чувствительности M. tuberculosis к препаратам фторхинолоного ряда…………………………………………………

1.2.1. Определение лекарственной чувствительности M.

tuberculosis к противотуберкулезным препаратам на плотных средах…………………………………………………………………………… 1.2.2. Определение лекарственной чувствительности M.

tuberculosis к противотуберкулезным препаратам на жидких средах.. 1.3. Молекулярно-генетические методы и современные технологии определения лекарственной чувствительности M. tuberculosis к фторхинолонам …………………………………………………………..... 1.3.1. Молекулярно-генетические методы с электрофоретической детекцией мутаций, обуславливающих развитие лекарственной устойчивости M. tuberculosis ……………………………………………. 1.3.2. Молекулярно-генетические методы, позволяющие определять тип мутаций ……………………………………………………… СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ……………………………………..

ГЛАВА 2. МОДИФИКАЦИЯ МЕТОДА SSCP И ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ КОММЕРЧЕСКИХ ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ

МУТАЦИЙ В ГЕНАХ gyrA и gyrB MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS ……………………………………

2.1. Модификация метода конформационного полиморфизма длин одноцепочечных фрагментов («M-SSCP») для выявления мутаций в гене gyrB ДНК M. tuberculosis, ответственных за устойчивость к фторхинолонам……………………………………………………………..

2.2. Эффективность применения тест-систем «ТБ-БИОЧИП-2», «GenoType MTBDRsl» и метода «M-SSCP» в образцах мокроты………

ГЛАВА 3. АНАЛИЗ МУТАЦИЙ В ГЕНАХ-МИШЕНЯХ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS, ОТВЕТСТВЕННЫХ ЗА ЛЕКАРСТВЕННУЮ УСТОЙЧИВОСТЬ К ФТОРХИНОЛОНАМ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ

БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА БОЛЬНЫХ ТУБЕРКУЛЕЗОМ

ЛЕГКИХ…………………………………………………………………….. 3.1. Анализ спектра мутаций в генах gyrA и gyrB с помощью тестсистемы «ТБ-БИОЧИП-2» и метода «M-SSCP» в культурах M. tuberculosis

3.2. Анализ мутаций в генах gyrA и gyrB и их связь с уровнем устойчивости M. tuberculosis к левофлоксацину и моксифлоксацину

3.3. Анализ спектра мутаций в генах gyrA и gyrB ДНК M.

tuberculosis, устойчивых к фторхинолонам, выделенных у больных с впервые выявленным туберкулезом легких и с хроническим течением процесса……………………………………………………………………..

ЗАКЛЮЧЕНИЕ…………………………………………………………… ВЫВОДЫ………………………………………………………………….. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ……………………………….. ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ………… СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ……………………………………………… СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………………..

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования Современная эпидемическая обстановка по туберкулёзу характеризуется увеличением числа больных, у которых выявляются штаммы Mycobacterium tuberculosis (МБТ) с множественной лекарственной устойчивостью (МБТ-МЛУ) или широкой лекарственной устойчивостью (МБТ-ШЛУ) как среди пациентов с хроническим течением процесса, так и у впервые выявленных лиц [74].

Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) – это одновременная устойчивость МБТ к препаратам первого ряда (изониазиду (INH) и рифампицину (RIF)). Широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ) называют одновременную устойчивость МБТ к основным препаратам первого ряда – INH и RIF и к препаратам второго (резервного) ряда – фторхинолонам и к одному из аминогликозидов и/или капреомицину.

В настоящее время в мире насчитывается около 600 тыс. больных туберкулезом с МЛУ. По данным ВОЗ, доля таких больных возросла с 11% в 2008 г. до 23% в 2012 г. В Российской Федерации (РФ) этот показатель увеличился с 18% до 44% в 2010 г., а доля больных туберкулезом с ШЛУ среди больных с МЛУ возросла с 4% до 19%. В 2012 г. показатель МЛУ среди впервые выявленных больных и больных с хроническим течением туберкулеза составил 3,6% и 20,2% соответственно [63, 79, 87, 115, 116, 117, 118].

Эпидемическая обстановка в Москве также остаётся непростой. Процент больных туберкулёзом с МЛУ среди впервые выявленных в 2009-2011 г. колебался от 12,6% до 14%, в 2012 г. составил 12,8%, а среди контингентов ПТД увеличился с 23,0% в 2008 г. до 30,0 % в 2012 г. [10, 11, 12, 19].

Фторхинолоны являются одними из основных препаратов, используемых для химиотерапии больных туберкулёзом с МЛУ [35, 40, 120, 121].

Наиболее эффективными из них являются препараты четвёртого поколения, такие как моксифлоксацин (MOX) и гатифлоксацин (GTX), которые показали высокую активность и низкие значения МИК в отношении не только МБТМЛУ, но и МБТ-МЛУ, устойчивых к офлоксацину (OFX) и ципрофлоксацину (CIP) [125].

Микробиологическое определение лекарственной чувствительности (ЛЧ) МБТ к фторхинолонам с использованием плотной среды ЛевенштейнаЙенсена (Л-Й) занимает в среднем два месяца. Кроме того, до сих пор не установлены критические концентрации (КК), позволяющие определять устойчивость МБТ к таким новым препаратам, как GTX и спарфлоксацин (SPFX).

Использование жидких питательных сред в автоматизированных системах типа Вactec MGIT 960 (Becton Dickinson, США) позволяет сократить время получения культуры МБТ до 7-14 дней. Однако в настоящее время зарегистрированных (сертифицированных) культуральных тестов для определения ЛЧ МБТ к фторхинолонам в автоматизированных системах Вactec нет, есть только рекомендованные КК к данным препаратам [9, 53, 62, 93].

В этом отношении молекулярно-генетические методы позволяют не только выявить ДНК МБТ непосредственно в диагностическом материале и охарактеризовать мутации в генах-мишенях, связанных с развитием устойчивости МБТ к противотуберкулезным препаратам (ПТП), но и сократить сроки получения результата до двух суток.

Мишенью действия фторхинолонов в МБТ является бактериальная АТФ-зависимая ДНК-топоизомераза ІІ типа (ДНК-гираза), которая катализирует образование суперспирали ДНК и состоит из двух субъединиц А и В, кодируемых генами gyrA и gyrB соответственно [52, 67, 97, 104, 105].

Регион, определяющий устойчивость к фторхинолонам (РОУФ) генов gyrA (320 п.н.) и gyrB (375 п.н.), является консервативной областью, где возникают нуклеотидные замены (мутации), связанные с устойчивостью МБТ к фторхинолонам.

Известно, что в 45-85% устойчивость МБТ к фторхинолонам связана с появлением мутаций в гене gyrA и около 7% в гене gyrB [101, 111, 122].

В настоящее время описаны следующие нуклеотидные замены в РОУФ гена gyrA: Ala74Ser, Ala90Val, Ser91Pro, Asp94Gly, Asp94Ala, Asp94Tyr, Asp94Asn, Asp94His, Gly88Cys и гена gyrB: Arg485His, Ser486Phe, Asn538Thr, Asn538Asp, Thr539Pro, Asp500Ala, Asp500His, Asp500Asn, Gly509Ala, Glu540Val, Glu540Asp [25, 50, 65, 84, 97]. Замены в гене gyrB встречаются как самостоятельно, так и в сочетании с геном gyrA [54]. Поэтому одновременное выявление мутаций в генах gyrA и gyrB может дать дополнительную информацию о ЛЧ к фторхинолонам исследуемого штамма, а также повысить корреляцию молекулярно-генетических данных с микробиологическими результатами ЛЧ МБТ к данным препаратам.

Определение мутаций в исследуемом участке гена может осуществляться различными молекулярно-генетическими методами, первым этапом которых является амплификация (накопление генетического материала) с помощью полимеразной цепной реакцией (ПЦР). На этапе детекции применяют различные варианты поиска мутантных фрагментов ДНК, ведущими из которых являются конформационный полиморфизм длин одноцепочечных фрагментов (single-stranded conformation polymorphism – SSCP), определение полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ), аллельспецифическая ПЦР, гетеродуплексный анализ, гибридизация на различных видах носителей, а также секвенирование как «золотой стандарт», с помощью которого можно определять тип мутаций.

Для анализа мутаций гена gyrA были использованы две коммерческие тест-системы, сертифицированные в РФ, для определения ЛЧ МБТ к препаратам второго (резервного) ряда.

Тест-система GenoType MTBDRsl («Hain Lifescience», Германия) основана на гибридизации ампликонов, полученных после проведения ПЦР, со специфическими ДНК-зондами, иммобилизованными на нейлоновом носителе (стрипе). Тест-система «ТБ-БИОЧИП-2» (ООО «БИОЧИП-ИМБ», Россия) – это технология гибридизационного анализа на биочипах, разработанная в Институте молекулярной биологии им. В.А Энгельгардта РАН и апробированная в отделе проблем лабораторной диагностики туберкулеза и патоморфологии Московского городского научно-практического центра борьбы с туберкулезом.

Для анализа мутаций в гене gyrB ДНК МБТ нами разработана модификация метода SSCP («M-SSCP»), которая позволяет выявлять нуклеотидные замены, ответственные за устойчивость к препаратам фторхинолонового ряда, непосредственно в диагностическом материале (мокрота) (Патент на изобретение РФ № 2439162 от 10.01.2012 «Способ диагностики чувствительности штаммов Mycobacterium tuberculosis к фторхинолонам по гену gyrB»).

Таким образом, применение тест-системы «ТБ-БИОЧИП-2» и метода «M-SSCP» позволит выявить и охарактеризовать наибольшее количество мутаций в генах gyrA и gyrB, связанных с лекарственной устойчивостью МБТ к фторхинолонам.

Степень разработанности темы исследования Большой вклад в изучение развития ЛУ МБТ к фторхинолонам внесли зарубежные ученые. В работах Takiff H.E, Ginsburg A, Shi R. было показано, что устойчивость МБТ к фторхинолонам связана с появлением мутаций в генах gyrA и gyrB [52, 97, 105]. В настоящее время охарактеризовано их значительное количество. В 85% штаммах, устойчивых к фторхинолонам, мутации сосредоточены в РОУФ гена gyrA (320 п.н.), содержащего полиморфные кодоны 88, 90, 91, 94 и 95. Кодон 95 содержит естественно-обусловленный полиморфизм Ser95Thr, не влияющий на ЛЧ МБТ к фторхинолонам [122]. Мутации в 90, 91 и 94 кодонах связаны с ЛУ ко всем препаратам группы фторхинолонов [25]. Также описаны мутации вне РОУФ gyrA, вызывающие ЛУ к фторхинолонам [44]. В последние годы в литературе широко обсуждается вопрос о влиянии мутаций в РОУФ гена gyrB (375 п.н.) на чувствительность МБТ к препаратам фторхинолонового ряда [42, 81]. Замены в гене gyrB могут встречаться как самостоятельно, так и в сочетании с мутациями в гене gyrA и составляют около 7% среди всех устойчивых МБТ к фторхинолонам [54, 111].

В России среди ученых, которые занимаются изучением этой проблемы в области диагностики и эпидемиологии лекарственно-устойчивых форм возбудителя, известны имена: Черноусова Л.Н., Грядунов Д.А., Антонова О.В., Мокроусов И.В. и другие. Однако работы данных авторов в основном посвящены выявлению мутаций в гене gyrA. В то же время остается мало изученным вопрос о роли мутаций в гене gyrB МБТ или в сочетании с заменами в gyrA в развитии устойчивости ко всем фторхинолонам или к отдельным из них, а также их связь с уровнем устойчивости.

Цель исследования Выявить мутации в генах gyrA и gyrB и определить их спектр с помощью биологических микрочипов и модификации метода конформационного полиморфизма длин одноцепочечных фрагментов («M-SSCP») для быстрого и точного определения лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis к фторхинолонам у больных туберкулезом легких.

Задачи исследования:

1. Разработать модификацию метода конформационного полиморфизма длин одноцепочечных фрагментов («M-SSCP») и оценить эффективность его применения для выявления мутаций в гене gyrB ДНК M. tuberculosis из диагностического материала (мокроты).

Провести сравнительный анализ результатов молекулярногенетического определения лекарственной чувствительности M. tuberculosis к фторхинолонам в гене gyrA с помощью коммерческих тест-систем «ТББИОЧИП-2» и «GenoType MTBDRsl» в диагностическом материале (мокроте).

3. Провести анализ мутаций в генах gyrA и gyrB M. tuberculosis с помощью «ТБ-БИОЧИП-2» и метода «M-SSCP» в культурах, выделенных из диагностического материала больных туберкулёзом легких.

4. Определить связь мутаций в генах gyrA и gyrB ДНК M. tuberculosis с уровнем устойчивости к левофлоксацину и моксифлоксацину с использованием модифицированных жидких сред Middlebrook 7Н9 в автоматизированной системе Вactec 960.

5. Изучить спектр мутаций в генах gyrA и gyrB ДНК M. tuberculosis, устойчивых к фторхинолонам, выделенных у впервые выявленных больных туберкулезом легких и с хроническим течением процесса.

Научная новизна Впервые с помощью метода «M-SSCP», разработанного в ГКУЗ МНПЦ борьбы с туберкулезом ДЗМ, определен вклад мутаций в гене gyrB в развитие лекарственной устойчивости M. tuberculosis к фторхинолонам (Патент на изобретение РФ № 2439162 от 10.01.2012 «Способ диагностики чувствительности штаммов Mycobacterium tuberculosis к фторхинолонам по гену gyrB»).

Впервые разработанный молекулярно-генетический метод «M-SSCP» в сочетании с коммерческой тест-системой «ТБ-БИОЧИП-2» позволил расширить анализируемый спектр мутаций в генах, ответственных за лекарственную устойчивость M. tuberculosis к фторхинолонам.

Установлена связь между типом мутаций в генах gyrA и gyrB ДНК M.

tuberculosis и уровнем устойчивости к левофлоксацину и моксифлоксацину.

На большом количестве биологического материала показано процентное распределение мутаций в двух генах M. tuberculosis, выделенных у впервые выявленных больных и с хроническим течением процесса, что имеет большое эпидемиологическое значение.

Теоретическая и практическая значимость работы Получены новые данные, демонстрирующие, что одновременное выявление мутаций в генах gyrA и gyrB позволяет расширить анализируемый спектр мутаций и дать более полную информацию о лекарственной чувствительности M. tuberculosis к фторхинолонам исследуемого штамма.

Установлено, что коммерческая тест-система «ТБ-БИОЧИП-2» позволяет с высокой чувствительностью одновременно выявлять ДНК M.

tuberculosis и определять как часто, так и редко встречающиеся мутации в гене gyrA. Применение ее для исследования диагностического материала позволит сократить время получения результата и тем самым своевременно скорректировать режим химиотерапии. Разработанный метод «M-SSCP»

можно применять как скрининг-тест для быстрого выявления мутаций в гене gyrB M. tuberculosis.

Разработанные методические рекомендации «Определение лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis с помощью биочипов», утвержденные Департаментом Здравоохранения города Москвы от 29.09.2008 года, применяются в клинической практике противотуберкулезных учреждений.

Полученные данные анализа мутаций в генах gyrA и gyrB с помощью метода «M-SSCP» и секвенирования были использованы в разработке тестсистемы «ТБ-ТЕСТ», основанной на технологии гидрогелевых биочипов в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (

Работа поддержана государственным контрактом с Министерством образования и науки РФ № 16.522.11.2003 и программой фундаментальных исследований президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология»). В настоящее время данная тест-система проходит клинические испытания.

Методология и методы исследования Методология настоящего исследования спланирована согласно поставленной цели. Предметом исследования стали проблемы, связанные с лекарственной устойчивостью M. tuberculosis к препаратам резервного ряда (фторхинолонам). Анализ научной литературы, посвященной проблеме, проведен на основе формально-логических методов исследования. Планирование и проведение исследований, направленных на решение поставленных задач, осуществлялось на основе общенаучных и специфических методов. Основным объектом исследования являлся респираторный материал (мокрота) и культуры M. tuberculosis, полученные от больных туберкулезом легких.

Исследование проводилось в отделе проблем лабораторной диагностики туберкулеза и патоморфологии ГКУЗ МНПЦ борьбы с туберкулезом ДЗМ.

Пациенты и клинические образцы Исследовано 390 проб ДНК МБТ, выделенных из 316 культур и 74 образцов мокроты, полученных от 154 больных с впервые выявленным туберкулезом легких и 162 больных с хроническим течением процесса. Все больные находились на лечении в филиалах и клиниках ГКУЗ МНПЦ борьбы с туберкулезом ДЗМ. Образцы были отобраны путем случайного выбора по результатам микробиологического определения ЛЧ МБТ к INH и RIF с МЛУ, монорезистентные, а также чувствительные к препаратам первого ряда, так как по данным литературы, среди них встречаются штаммы МБТ, уже устойчивые к фторхинолонам [43].

Данные микробиологического определения ЛЧ МБТ, из которых были выделены 390 образцов ДНК, анализируемые в работе, представлены в таблице 1.

Данные микробиологического определения лекарственной чувствительности M. tuberculosis к изониазиду, Лекарственная Число образцов ДНК M. tuberculosis чувствительность M. tuberculosis Примечание: INHЧ – изониазид-чувствительные, RIFЧ – рифампицинчувствительные, OFXЧ – офлоксацин-чувствительные, INHУ – изониазид-устойчивые, RIFУ – рифампицин-устойчивые, OFXУ – офлоксацин-устойчивые.

По данным микробиологического определения ЛЧ МБТ, представленным в таблице 1, видно, что из 316 культур МБТ, из которых были выделены образцы ДНК, 185 были чувствительными и 131 устойчивыми к OFX. Среди устойчивых культур МБТ к OFX 128 были также устойчивыми к INH и RIF (МБТ-МЛУ), две – устойчивые к RIF и одна – чувствительная к обоим препаратам. Из 185 чувствительных к OFX штаммов МБТ 59 были чувствительными к INH и RIF, 99 устойчивыми к обоим препаратам, 8 – устойчивыми к RIF и 19 – устойчивыми к INH. Результаты выявления ДНК МБТ из 74 образцов мокроты были подтверждены ростом МБТ в Вactec 960. По данным микробиологического определения ЛЧ, все 74 культуры МБТ были устойчивыми к INH и RIF (МБТ-МЛУ), из которых 31 были чувствительными и устойчивыми к OFX.

Специфичность метода «M-SSCP» оценивали, используя музейные штаммы нетуберкулезных микобактерий (M.avium АТСС35712, M.

intracellulare АТСС35761, M. scrofulaceum АТСС35787), грамотрицательных (E. coli ATCC25922, P. aeruginosa ATCC27853) и грамположительных (S.aureus ATCC25923) микроорганизмов, а также культуры, выделенные из диагностического материала больных (K. pneumoniae, S. pneumoniae, S. intermedius, S. agalactiae).

Сбор материала Сбор материала проводили согласно методическим рекомендациям «Определение лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis с помощью биочипов» разработанным в ГКУЗ МНПЦ борьбы с туберкулезом ДЗМ в 2008 г. [14].

Процедура получения анализируемого материала, ограничения по его использованию и условия возможного хранения полученных образцов были следующими:

- мокроту собирали в стерильную пробирку в объеме 5-6 мл.

- культуры МБТ получали из централизованной бактериологической лаборатории (ЦБЛ) МНПЦБТ в пробирках с плотной средой Л-Й и в фирменных пробирках MGIT 960 с жидкой средой M7Н9.

Определение лекарственной чувствительности M. tuberculosis Определение ЛЧ МБТ бактериологическими методами осуществляли согласно приказу №109 от 21марта 2003 года «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации» в ЦБЛ МНПЦБТ.

При исследовании ЛЧ МБТ к фторхинолонам методом абсолютных концентраций на среде Л-Й использовали концентрации OFX 2 и 10 мкг/мл.

Определение ЛЧ МБТ к фторхинолонам (выявление мутаций в генах gyrA и gyrB) проводили с использованием двух коммерческих тест-систем, метода «M-SSCP» и секвенирования. Мутации в гене gyrA определяли с помощью тест-систем ТБ-БИОЧИП-2 и GenoType MTBDRsl, а в гене gyrВ с помощью метода «M-SSCP».

Подготовка проб Пробоподготовку (деконтаминацию и разжижение мокроты), экстрагирование ДНК M. tuberculosis из диагностического материала (мокроты) и культур МБТ, выделенных с плотной Л-Й и жидкой M7Н9 среды, проводили согласно руководству «Руководство по применению набора реагентов для выявления микобактерий туберкулезного комплекса и определения их лекарственной чувствительности к фторхинолонам на биологических микрочипах «ТБ-БИОЧИП-2» (Федеральная служба по надзору в сфере здравоохранения и социального развития № ФРС 2010/08555, 03.10.2010).

Проведение полимеразной цепной реакции и гибридизации Проведение ПЦР и гибридизации на биологических микрочипах для выявления мутаций в гене gyrA проводили согласно прилагаемому руководству, указанному выше, с использованием набора реагентов к тест-системе «ТББИОЧИП-2» («БИОЧИП – ИМБ», Россия).

Проведение ПЦР и гибридизации на стрипах для выявления мутаций в гене gyrA проводили согласно прилагаемому протоколу GenoType MTBDRsl (GenoType, Hain Lifescience, Германия) [51].

Секвенирование ДНК секвенирование полученных ампликонов РОУФ генов gyrA и gyrB проводили с использованием праймеров gyrA F (5' CTA TGC AAT GTT CGA TTC CGG CTT C 3') и gyrA R (5' ACT GTC TCC TCG TCG ATT TCC CT 3'), gyrB F (5 AGA GTT GGT GCG GCG TAA GA 3) и gyrB R (5 AAC ACA TGC CCG TTC TCG AT 3) на автоматическом секвенаторе GS Junior («Roche», Германия).

Регистрация результатов гибридизации Результаты гибридизации на биологических микрочипах регистрировали с помощью аппаратно-программного комплекса для анализа изображений биологических микрочипов «Чипдетектор-01». Инсталляцию и эксплуатацию комплекса осуществляли в соответствии с инструкцией по его использованию.

Интерпретацию результатов осуществляли с помощью программы «Imageware» (БИОЧИП-ИМБ, Россия). Результаты гибридизации на стрипах регистрировали визуально с помощью эталона оценки, который поставляется в наборе GenoType MTBDRsl (Hain Lifescience, Германия).

фторхинолонам путем выявления мутаций в гене gyrВ методом конформационного полиморфизма длин одноцепочечных фрагментов (SSCP) Предлагаемая нами модификация метода SSCP состоит в следующем:

для гена gyrВ были подобраны пары праймеров и программа амплификации.

Также был подобран состав амплификационной реакционной смеси, где важными составляющими являются тип буфера, концентрация трифосфатов, ионов магния, праймеров, ДНК полимеразы и условия денатурации полученных ампликонов (соотношение ампликонов и денатурирующего раствора, время денатурации), состав полиакриламидного геля (процентное содержание полиакриламида с глицерином и состав буфера), условия разделения (напряжение, время электрофореза, температура), позволяющие повысить эффективность разделения одноцепочечных фрагментов исследуемых амликонов.

Условия проведения полимеразой цепной реакции Двухстадийную ПЦР участка гена gyrB размером 414 п.н. проводили в два последовательных этапа с «внешними» и «внутренними» парами праймеров по одной программе амплификации. Размер ампликонов после второй стадии ПЦР составил 371 п.н.

Приготовление реакционной смеси для ПЦР-1 с «внешними» праймерами Объём реакционной смеси для проведения амплификации одной пробы составил 27 мкл для ДНК, выделенной из респираторного материала (ДНК-1) и 29 мкл для ДНК, выделенной из культур МБТ (ДНК-2). Реакционную смесь готовили с учетом числа пробирок с диагностическими пробами (Х) и двух дополнительных пробирок, необходимых для постановки положительного (раствор очищенной ДНК МБТ Н37Rv) и отрицательного контроля (без внесения матрицы). Общее число пробирок (N), необходимое для подготовки нужного объема реакционной смеси, должно составлять N=X+2.

В пробирку объёмом 0,5 мл вносили отдельно для каждого компонента пипеткой следующие реагенты набора в указанной ниже последовательности и количестве:

Вода, дистиллированная (для ПЦР) ПЦР – буфер (х10): 67 мМ трис-HCl pH 8,6; 2,5 мМ MgCl2; 16,6 мМ (NH4)2SO4;

ДНК-полимераза (BIOTAQ ДНК-полимераза) 1,5U UDG (Урацил-ДНК-гликозилаза) 0,15U Общий объем (27 х n) (ДНК-1) или (29 x n) мкл (ДНК-2) ПЦР проводили со следующими «внешними» олигонуклеотидными праймерами:

1-ый – 5 AGA GTT GGT GCG GCG TAA GA 2-ой – 5 AAC ACA TGC CCG TTC TCG AT Полученную реакционную смесь тщательно перемешивали и разносили пипеткой микродозатора по пробиркам, подготовленным для постановки ПЦР, из расчета 27,0 мкл (ДНК-1) или 29,0 мкл (ДНК-2) на пробирку. В каждую пробирку вносили 30 мкл минерального масла для предохранения реакционной смеси от испарения при амплификации. Последовательность пробирок маркировали.

В контрольные пробирки с реакционной смесью вносили по 3 мкл или 1 мкл «К+» (ДНК H37Rv) и «К-» (дистиллированная вода). В остальные пробирки вносили по 3 мкл (ДНК-1) или 1 мкл (ДНК-2) матрицы. Капли в пробирках собирали центрифугированием в течение 10 с при 1000 об/мин.

Пробирки помещали в амплификатор и проводили амплификацию по следующей программе:

Приготовление реакционной смеси для ПЦР-2 с «внутренними праймерами»

Реакционную смесь, полученную после первой реакции амплификации, использовали в качестве матрицы во второй реакции амплификации с «внутренними» праймерами:

1-ый – 5 TAA GAG CGC CAC CGA CAT CG 2-ой – 5 GCG TGA ACC GGA ACA ACA AC Реагенты вносили в стерильную пробирку в той же последовательности, без внесения урацил-ДНК-гликозилазы:

Вода, дистиллированная (для ПЦР) ПЦР – буфер (х10): 67 мМ трис-HCl pH 8,6; 2,5 мМ MgCl2; 16,6 мМ (NH4)2SO4;

Праймеры по 5 мкМ ДНК-полимераза (BIOTAQ ДНК-полимераза) 1,5U Общий объем (27 х n) мкл (ДНК-1) или (29 х n) мкл (ДНК-2) Полученную реакционную смесь тщательно перемешивали и разносили пипеткой микродозатора по пробиркам, подготовленным для постановки ПЦР, из расчета 27,0 мкл (ДНК-1) или 29,0 мкл (ДНК-2) на пробирку. В каждую пробирку вносили 30 мкл минерального масла для предохранения реакционной смеси от испарения при амплификации. Последовательность пробирок маркировали.

Из каждой пробирки после ПЦР-1 по 3 мкл или по 1 мкл амплификационной смеси вносили под масло в пробирки с приготовленной реакционной смесью для ПЦР-2.

Пробирки помещали в амплификатор и проводили амплификацию по программе, указанной для ПЦР-1.

Регистрация и анализ продуктов амплификации По окончании второй стадии ПЦР проводили горизонтальный электрофорез в 2 % агарозном геле, с этидиум бромидом, при 10B/см в течение минут, в 1-кратном TBE буфере (0,089мМ трис-бората; 0,089М борной кислоты; 2мМ EDTA, рН 8,0). По окончании электрофореза гель просматривали в свете ультрафиолетовой лампы трансиллюминатора. При наличии в биологической пробе ДНК МБТ в соответствующих дорожках наблюдались светящиеся полоски, состоящие из выделенных фрагментов ДНК возбудителя, размером 371 п.н. и находящиеся на одном уровне с полоской в дорожке положительного контроля. При этом в дорожке отрицательного контроля светящиеся полоски наблюдаться не должны.

Выявление мутаций в гене gyrB Проведение тепловой денатурации ПЦР-продукта Денатурацию проводили при 95С в течение 10 мин., для этого смешивали 4 мкл образца и 6 мкл денатурирующего раствора (95% формамид, 20мМ EDTA (Boehringer Mannheim, Германия), 0,05% бромфеноловый синий, 0,05% ксиленцианол). По окончании денатурации пробирки немедленно помещались на лед.

Проведение вертикального высокоразрешающего электрофореза Разделение денатурированных ампликонов проводили в 8% полиакриламидном геле с 5% глицерином при температуре 8С, под напряжением В, в течение 5 часов, в 2хТВЕ буфере (рН 8,0). В качестве контроля использовали ампликоны ДНК МБТ Н37Rv, чувствительного ко всем ПТП.

Окраска геля Окраску геля проводили с помощью азотнокислого серебра. Для этого гель переносили в стеклянную посуду с 100 мл 10% этанола для фиксации (40 мл 96% этилового спирта и 344 мл дистиллированная вода) на 5 мин. Затем спирт сливали, гель заливали 1% азотной кислотой на 3 мин, после чего кислоту сливали и дважды споласкивали гель дистиллированной водой в течение 3 сек. Далее проводили окрашивание геля в холодном (8°С) растворе 0,012М нитрата серебра (Boehringer Mannheim, Германия) 20 мин, постоянно помешивая на шейкере (Elmi, Латвия), затем дважды промывали дистиллированной водой. Проявляли гель в растворе 0,28М карбоната натрия (Хеликон, Россия) и 0,019% формалина до появления окрашенных полос денатурированной ДНК. Останавливали проявление 10% уксусной кислотой.

Интерпретация результатов После окраски гель оценивали при белом свете (визуально) без специального оборудования. Интерпретацию результатов осуществляли путем визуального сравнения расстояния между цепочками ДНК в контроле и исследуемых образцах. Для подтверждения полученных данных использовали секвенирование. Результаты регистрировали в журнале.

Статистическая обработка результатов и программное обеспечение Сбор и обработка информации о пациенте, учет данных микробиологических и молекулярно-генетических исследований осуществлялись с помощью лабораторной информационной системы «Алиса» (ЗАО «Фирма Гален»). Подбор олигонуклеотидных праймеров проводили с помощью компьютерной программы Oligo v.6.31. Специфичности выбранных праймеров оценивали с помощью базы данных BLAST WWW-сервиса в NCBI