[ «Пучков Илья Александрович РАЗРАБОТКА, ОПТИМИЗАЦИЯ И МАСШТАБИРОВАНИЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПРОИЗВОДСТВА ПЭГИЛИРОВАННОЙ ФОРМЫ РЕКОМБИНАНТНОГО ГРАНУЛОЦИТАРНОГО КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩЕГО ФАКТОРА Специальность 03.01.06 – ...»
Методики хроматографического разделения отрабатывали на колонках Tricorn 5/50, Tricorn 10/100 (GE Healthcare, Швеция) c сорбентами SP Sepharose Fast Flow, Octyl Sepharose 4 Fast Flow, Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (High Sub), Butyl Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare, США). Гель-фильтрацию проводили на колонках XK 26/60 (GE Healthcare, Швеция), наполненные сорбентом Sephadex G-25 Fine (GE Healthcare, Швеция).
Очистку и разделение проводили на полупрепаративном хроматографе КТА Purifier (GE Healthcare, США), а ОФ ВЭЖХ-анализ на аналитическом хроматографе Alliance, управляемом программным обеспечением Empower версии 6.10.01.00 (Waters, США). Для проведения твердофазного ИФА использовали планшетный фотометр Anthos 2010 (Anthos Labtec Instrument, Австрия), управляемым программным обеспечением ADAP 1.2 и набор E. coli Host Cell Proteins ELISA kit (Cygnus Technologies, США). А также использовали микроколоночную ОФ ВЭЖХ-систему Agilent 1200, оснащенную времяпролетным (ESI-TOF)-масс-анализатором серии Agilent 6224, MALDIТOF-масс-спектрометр Bruker Autoflex II (Bruker Daltonics Inc., Германия), программу для обработки данных масс-спектрометрического анализа GPMAW (General Protein/Mass Analysis for Windows) версии 10.0 (Protein Research Group at the University of Southern Denmark, Дания).
2.1. Аналитические методы 2.1.1. Определение концентрации ПЭГ-Г-КСФ и Г-КСФ Определение проводили с помощью ВЭЖХ на обращенно-фазовой колонке Symmetry 300 C4 (4.6250мм) (Waters, США) в системе, состоящей из элюентов А (0.1% ТФУ в Н2О) и В (20% ацетонитрил, 80% 1-пропанол, 0.1% ТФУ). Линейный градиент задавали от 40 до 50 % элюента В, скорость потока составляла 1 мл/мин, температура 35°С, длина волны 210 нм. В качестве стандартов использовали фармацевтические препараты «Нейпоген» (Amgen Inc., США) и «Неуластим»
(F.Hoffmann-La Roche Ltd., Швейцария).
2.1.2. Пептидное картирование Концентрированный рчГ-КСФ и очищенный ПЭГ-Г-КСФ обессоливали на одноразовых колонках NAP-5 с использованием в качестве элюента 100мМ NH4HCO3. К 1 мл раствора белка с концентрацией 1 мг/мл прибавляли 50 мкл 0.1% раствора трипсина. Гидролиз проводили при температуре 37°С в течение 4 ч и останавливали добавлением 50 мкл 1% раствора ТФУ. Анализ триптических гидролизатов проводили в градиентном режиме на обращенно-фазовой колонке Luna C18 (2) (Phenomenex, США). Подвижная фаза: A – 0,1 % ТФУ; Б – 90% ацетонитрил с 0,1 % ТФУ; градиент: 0–20 % B за 40 мин, 20–40 % В за 40 мин, 40–80 % В за 20 мин; скорость потока: 1 мл/мин, температура 30С; длина волны 214 нм.
2.1.3. Определение родственных примесей (метод EP) Хроматографию проводили в градиентном режиме на обращенно-фазовой колонке Symmetry 300 C4 (4,6250 мм) (Waters, США) в системе, состоящей из элюентов A (10% ацетонитрил, 0,1 % ТФУ в воде) и В (80% ацетонитрил, 0,1 % ТФУ в воде); градиент: 66–73% B за 35 мин, 73–90%В за 15 мин, 90–66% В за мин; скорость потока 0.6 мл/мин, температура 60 С; длина волны 215 нм.
2.1.4. Определение димеров и полимеров (метод EP) Определяли методом гель-фильтрации на колонке TSK-GEL G3000 SWXL (7.8300 мм) (Tosoh Bioscience, Япония). Подвижная фаза содержала 0.17 М гидрокарбоната аммония, рН 7.0. Скорость потока 0,5 мл/мин, температура 30°С, длина волны 215 нм.
2.1.5. ESI-ТОF LC/MS-анализ триптических гидролизатов Осуществляли в режиме on-line на микроколоночной ОФ ВЭЖХ-системе Agilent 1200, оснащенной времяпролетным ESI-TOF масс-анализатором серии Agilent 6224. Анализ выполняли на микроколонке YMC C8 300, 4.6250 мм.
Подвижная фаза: A – 0.1% ТФУ; Б – 70% ацетонитрил, 0.1% ТФУ; градиент:
10–100% B за 17 мин; скорость потока: 0.25 мл/мин, температура 40°С; длина волны 220 нм.
2.1.6. Определение содержания бактериальных эндотоксинов Качественное и количественное определение БЭ в образцах белков проводили с помощью гель-тромб теста ЛАЛ-реактивом Endosafe («Charles River Endosafe», США) с заявленной чувствительностью =0,03 ЕЭ/мл КСЭ 10 нг/мл согласно методам, описанным в Европейской Фармакопее и Фармакопее США.
2.1.7. Определение иммунореактивных белков штамма-продуцента Содержание остаточных белков штамма-продуцента E.coli определяли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа с использованием набора “Immunoenzymetric Assay for the Measurement of Е.coli Host Cell Proteins” (Cygnus Technologies Inc., США) с нижним пределом чувствительности 0.2 нг/мл согласно прилагаемой методике.
2.1.8. Определение специфической активности препаратов Определение биологической активность in vitro полученного препарата ПЭГ-Г-КСФ по сравнению с активностью препарата «Неуластим» (F.HoffmannLa Roche Ltd, Швейцария) было выполнено в ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН в лаборатории лучевых методов лечения опухолей методом МТТклеточной пролиферации с Г-КСФ-зависимой культурой клеток. Выявляли стимуляцию роста клеток после добавления препарата «Неуластим» и полученных образцов ПЭГ-Г-КСФ к лимфоидной линии клеток NFS-60, окрашенных красителем Alamar Blue. Проверку специфической активности, полученных препаратов проводили в сравнении с Международными стандартами (NIBSC, Великобритания).
2.1.9. MALDI-ТOF масс-спектрометрический анализ Масс-спектрометрический анализ пептидов проводили в ИБХ РАН в лаборатории протеомики на MALDI-ТOF-масс-спектрометре Bruker Autoflex II (Bruker Daltonics Inc., Германия). Обработка результатов проводилась с помощью программы масс-спектрометрического анализа GPMAW (General Protein/Mass Analysis for Windows) версии 10.0 (Protein Research Group at the University of Southern Denmark, Дания).
2.2. Препаративные методы 2.2.1. Солюбилизация рчГ-КСФ из ТВ 9 г ТВ рчГ-КСФ растворяли в 300 мл раствора 2 М мочевины рН 9.0, и оставляли перемешиваться в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем смесь гомогенизировали в течение 1 мин на лабораторном гомогенизаторе фирмы «Waring» (США) на скорости 15 тыс. об/мин.
2.2.2. Ренатурация рчГ-КСФ рН полученной после солюбилизации суспензии доводили с помощью раствора 1 М NaOH до значения 12.2 и оставляли перемешиваться на магнитной мешалке в течение 10 мин. Затем понижали рН раствора с помощью 1 М CH3COOH до значения 11,0 и разбавляли водой в 5 раз. При перемешивании концентрированного раствора Н2О2. Реакционную смесь оставляли перемешиваться при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем медленно доводили рН раствора до значения 6.0 раствором 1 М CH3COOH. Осадок отделяли центрифугированием в течение 1 ч при 4°С при 12 тыс. об/мин.
2.2.3. Концентрирование филграстима Выполняли из субстанции «Филграстим» при комнатной температуре методом ионообменной хроматографии на колонке Tricorn 5/50, заполненной SP Sepharose FF, объемом 1 мл. Раствор препарата в концентрации 0.3 мг/мл уравновешенную 20 мМ буферным раствором. После нанесения и промывки элюирование белка проводили буферным раствором, содержащим 0.3 М NaCl.
Концентрация белка в элюате, определенная с помощью ОФ ВЭЖХ составляла 35–40 мг/мл. Необходимая концентрация белка в экспериментах по масштабированию достигалась последовательным разведением полученного раствора.
2.2.4. Ионообменная хроматография ренатурированного рчГ-КСФ Хроматографическую очистку раствора ренатурированного рчГ-КСФ проводили на колонке XK 26/40 (GE Healthcare, Швеция), заполненной сорбентом SP Sepharose FF объемом 100 мл. Перед нанесением колонку уравновешивали буферным раствором А (50 мМ ацетат натрия, рН 6.0) V=500 мл. После нанесения ренатурата колонку уравновешивали буферным раствором А (V=500 мл).
Скорость потока 22.2 мл/мин (250 см/ч), =280 нм; буферный раствор B (50 мМ ацетат натрия, 2 М NaCl рН 6.0); градиент 0–50% В за 14 мин.
2.2.5. Модификация рчГ-КСФ В охлаждённый до 4°С раствор белка (10 мг/мл) в буферном растворе 5 мМ цитрат натрия рН 6.0 добавляли необходимые количества метил-ПЭГпропиональдегида и цианборгидрида натрия до концентраций 1.6 и 10.6 мМ соответственно. Реакцию выполняли при постоянном перемешивании на магнитной мешалке в течение 18 ч при 4°С.
2.2.6. Выделение образцов ПЭГ-Г-КСФ для пептидного картирования и ESI-ТОF LC/MS Осуществляли на обращенно-фазовой колонке Jupiter C4 300 10250мм (Phenomenex, США). Элюент А (0.1% ТФУ в Н2О); элюент В (20% ацетонитрил, 80% 1-пропанол, 0.1% ТФУ); градиент от 35 до 55% по элюенту В, скорость потока 2 мл/мин, температура 35°С, длина волны 220 нм.
2.2.7. Гидрофобная хроматография Очистку образцов реакционной смеси ПЭГ-Г-КСФ проводили при температуре 6°С на колонках Tricorn 10/100 (GE Healthcare, Швеция) объемом мл, заполненных сорбентами Butyl Sepharose 4 FF, Octyl Sepharose 4 FF и Phenyl Sepharose 6 FF (high sub) (GE Healthcare, Швеция). Перед нанесением колонки уравновешивали стартовым буферным раствором V=40 мл. После нанесения смеси колонку уравновешивали буферным раствором А (V=24 мл). Скорость потока 1.3 мл/мин (100 см/ч), = 280 нм; градиент 0–100% В за 62 мин.
Элюирование белка с колонки вели снижающимся линейным градиентом концентрации соли.
2.2.8. Гель-фильтрация на сорбенте Sephadex G-25 Fine Обессоливание препарата ПЭГ-Г-КСФ после стадии гидрофобной хроматографии проводили на колонке XK 26/40 (GE Healthcare, Швеция), заполненной сорбентом Sephadex G-25 Fine (GE Healthcare, Швеция) объемом мл. Скорость потока 10.6 мл/мин (120 см/ч), =280 нм; буферный раствор 50 мМ ацетат натрия рН 4.5.
2.2.9. Ионообменная хроматография ПЭГ-Г-КСФ (заключительная стадия очистки) Заключительную стадию хроматографической очистки препарата ПЭГ-ГКСФ проводили на колонке XK 16/20 (GE Healthcare, Швеция), заполненной сорбентом SP Sepharose FF объемом 28 мл. Перед нанесением колонку уравновешивали буферным раствором А (50 мМ ацетат натрия, рН 4.5) V=140 мл.
После нанесения препарата колонку уравновешивали буферным раствором А (V=140 мл). Скорость потока 10.1 мл/мин (300 см/ч), =280 нм; буферный раствор B (50 мМ ацетат натрия, 1 М NaCl рН 4.5); градиент 0–50% В за 5.5 мин.
2.2.10. Перевод препарата в фармакологическую буферную систему Проводили на колонке XK 26/40 (GE Healthcare, Швеция), заполненной сорбентом Sephadex G-25 Fine (GE Healthcare, Швеция) объемом 130 мл. Скорость потока 11.5 мл/мин (170 см/ч), =280 нм; буферный раствор 10 mM ацетат натрия, 5% сорбитол, 0.004% Tween-20 pH 4.0.
2.2.11. Выделение и алкилирование пептидов для массспектрометрического анализа Производили на обращенно-фазовой колонке Luna C18 (2) 100, 4.6250мм. Элюент A – 0.1 % ТФУ в воде; элюент В – 90% ацетонитрил, 10% H2O, 0.1% ТФУ; градиент от 10 до 25% элюента B за 15 мин, от 25 до 50% элюента В за 40 мин, от 50 за 80% элюента В за 10 мин; скорость потока 1 мл/мин, температура 30 С; =214 нм. Собирали фракцию пептида 5 с 12.6–12.8 мин и фракцию пептида 6 с 13.8–14.1 мин.
Алкилирование осуществляли в соответствии с методикой [208], для чего 30–50 мг пептида растворяли под азотом в 2–3 мл Tris-НС1-буферного раствора (рН 7.5), содержащего 8 М мочевину, добавляли 4-винилпиридин (20-кратный избыток) и инкубировали при перемешивании в течение 2–3 ч. Затем реакционную смесь подкисляли ледяной уксусной кислотой до рН 3.0, диализовали против 0.01 М уксусной кислоты и лиофилизовали.
2.2.12. Выделение и очистку винилпиридилированных пептидов для масс-спектрометрического анализа Проводили с помощью ОФ ВЭЖХ, для чего лиофилизованные пептиды растворяли в элюенте А. Очистку выполняли на обращенно-фазовой колонке Eclipse XDB-C18 90, 4.6150мм (Agilent, США). Элюент А – 0.1 % ТФУ в воде;
элюент B – 0.09% ТФУ в ацетонитриле; скорость потока 1 мл/мин, длина волны 214 нм; линейный градиент по элюенту В 040% за 40 мин. Для массспектрометрического анализа собирали пептид в максимуме оптической плотности.
3. Математические расчеты 3.1. Определение динамической емкости сорбентов Динамическую емкость сорбентов определяли на модельных колонках Tricorn 5/50 (GE Healthcare, Швеция) следующим образом: осуществляли сорбцию целевого белка на 1 мл геля до наблюдения десорбции. Количество сорбировавшегося белка рассчитывали по формуле:
где ДЕ – динамическая емкость сорбента в г белка/л сорбента, Сисх – исходная концентрация целевого белка в мг/мл, Vисх – объем исходного раствора белка в мл, Vост. – объем раствора белка не прошедшего через колонку в мл.
3.2. Коэффициент селективности протекания реакции пэгилирования Коэффициент селективности протекания процесса () рассчитывали как отношение количества образовавшегося в ходе реакции ПЭГ-Г-КСФ к общему количеству побочных продуктов и невступившего в реакцию Г-КСФ.
где Мп – количество образовавшегося ПЭГ-Г-КСФ, Мпп – общее количество побочных продуктов, Мг – количество непрореагировавшего Г-КСФ.
3.3. Коэффициент распределения белка (Kd) Коэффициент распределения белка (Kd) равен отношению связавшегося с сорбентом препарата к не связавшемуся (или отношение концентраций препарата в неподвижной и подвижной фазах):
где C1 – количество белка в неподвижной фазе, C0 – количество белка в элюате.
3.4. Коэффициент разрешения (RS) максимумами времени выхода соседних пиков, деленное на полусумму их ширин у основания:
где tR – время удерживания пика, Wb – ширина пика на его полувысоте.
Оптимальное значение RS должно составлять не менее 1.5, но для большинства практических приложений, достаточно RS=1.2 и даже несколько меньше.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Изучение и оптимизация условий проведения конъюгации ПЭГГ-КСФ 1.1. Введение Присоединение ПЭГ к молекуле рчГ-КСФ как правило происходит за счет образования ковалентной связи между активированной гидроксильной группой ПЭГ и -аминогруппой лизина, а также -аминогруппой N-концевого метионина или имидазольной группой гистидина в молекуле рчГ-КСФ. Ранее было установлено, что присоединение ПЭГ к N-концевому АК-остатку рчГ-КСФ повышает время циркуляции препарата в крови и не влияет на его активность, поскольку не происходит нарушения нативной пространственной организации белковой молекулы [126]. Конъюгацию по аминогруппе N-концевого Met рчГКСФ возможно осуществить с помощью двух реакций – ацилирования и алкилирования. В результате реакции ацилирования происходит образование амидной связи, сопровождающееся потерей заряда на аминогруппе N-концевого метионина рчГ-КСФ, вследствие чего происходит агрегация молекул белка.Алкилирование с сохранением заряда аминогруппы проводится с помощью модифицированного акцептора ПЭГ-альдегида с образованием по N-концевому метионину вторичного амина. Таким образом, удается избежать образования агрегатов белка и потери активности полученного конъюгата.
Восстановительное N-алкилирование рчГ-КСФ с образованием активной пэгилированной формы проводили с помощью модифицированного акцептора моно-метил-ПЭГ-пропиональдегида (-метил--[3-оксопропокси]полиоксиэтилен) с молекулярной массой 21.5 кДа, способного селективно взаимодействовать со свободной -аминогруппой N-концевого Met при значениях рН раствора 5.0–6.0. Схема реакции представлена на рис. 9.
1.2. Оптимизация условий и масштабирование пэгилирования рчГКСФ В первоначальных экспериментах для модификации рчГ-КСФ использовали условия, описанные в литературе, согласно которым реакцию конъюгации проводили в течение 18 ч при температуре 4°С в буферном растворе 0.1 М фосфат натрия рН 5.0 в присутствии 80-кратного избытка цианборгидрида натрия (1. мг/мл) и 5-кратного избытка ПЭГ (28.65 мг/мл) при концентрации белка 5 мг/мл [12, 126].
Рис. 9. Схема реакции модификации рчГ-КСФ по -аминогруппе Nконцевого остатка метионина методом восстановительного N-алкилирования.
Для оценки эффективности методики проводили масштабирование процесса конъюгации в 5, 10 и 50 раз, что соответствовало 50, 100 и 500 мл реакционной смеси. Как видно из результатов, представленных в табл. 3, в данных условиях масштабирование процесса приводило к снижению выхода ПЭГ-Г-КСФ и к образованию в ходе реакции конъюгатов с более высокой степенью модификации.
Поскольку в результате масштабирования процесса пэгилирования рчГ-КСФ не удалось воспроизвести показатели, соответствующие первоначальной методике реакции присоединения ПЭГ-альдегида (см. табл. 3), то проводили ряд экспериментов по оптимизации факторов, влияющих на ход данной реакции, а именно: значений рН (в области 4.0–8.0) и состава буферной системы, исходной концентрации белка, конъюгационного агента ПЭГ и восстановителя NaCNBH3.
Поскольку уже на первой ступени масштабирования выход ПЭГ-Г-КСФ снижался (с 59.5 до 48.3%), то оптимизацию условий осуществляли в объеме реакционной смеси равном 50 мл.
Оценка масштабирования процесса модификации рчГ-КСФ, (k*– коэффициент масштабирования) Для поддержания значений рН реакционной смеси от 4.0 до 5.5 использовали 50 мМ CH3COONa; для рН 6.0 – 5 мМ цитрат натрия; для рН 6.5 – 20 мМ Na2НPO4; для рН 7.0 – 20 мМ Tris; для рН 8.0 – 20 мМ HEPES. Выбор диапазона значений рН 4–8 объясняется разницей значений pKa -аминогрупп N-концевого Met (7.8), по которому происходит селективное присоединение ниже данного значения pKa, и -аминогрупп Lys (10.1) [126, 209], а также неустойчивостью модифицированного ПЭГ-альдегида в кислых средах ниже рН 4.0, вызванной гидролизом ацетальной группы, и выше 7.5 – засчет альдольной конденсации.
На рис. 10 показано влияние рН среды на выход ПЭГ-Г-КСФ (в %) от исходного количества белка, взятого в реакцию.
Как следует из представленных данных на рис. 10, наиболее полному протеканию реакции с выходом ПЭГ-Г-КСФ около 58% соответствует диапазон значений рН 5.8–6.4, что объясняется селективным присоединением ПЭГальдегида в данных условиях к -аминогруппе N-концевого Met рчГ-КСФ.
Рис. 10. Изучение влияния рН среды реакционной смеси на выход ПЭГ-ГКСФ; а – оптимальный диапазон рН для проведения реакции (5.8–6.4).
Далее изучали влияние типа аниона буферной системы на выход ПЭГ-ГКСФ. Реакцию проводили в растворах, сохраняющих свою буферную емкость при рН 6.0. Реакцию проводили в течение 18 ч при 4°С в присутствии 80-кратного избытка NaCNBH3 (1.34 мг/мл) и 5-кратного избытка ПЭГ (28.65 мг/мл) при концентрации белка 5 мг/мл. В табл. 4 представлены результаты изучения влияния различных буферных систем на степень селективности () протекания процесса пэгилирования, а именно – на отношение количества ПЭГ-филграстима, образовавшегося в ходе реакции, к общему количеству образовавшихся побочных продуктов и не вступившего в реакцию рчГ-КСФ.
Как следует из представленных в табл. 4 данных, использование буферной системы содержащей цитрат-ион приводило к наиболее селективному протеканию процесса конъюгации ПЭГ-Г-КСФ. Таким образом, впервые было установлено, что селективность протекания реакции пэгилирования рчГ-КСФ определяется не только свойствами белка, но и типом использованной буферной системы.
Влияние анионов на коэффициент селективности реакции модификации () Установление исходной оптимальной концентрации рчГ-КСФ проводили в буферной системе 5 мМ цитрат натрия при значении рН 6.0. Исследовали диапазон значений концентрации рчГ-КСФ от 1.0 до 20 мг/мл.
В табл. 5 приведены данные, показывающие влияние концентрации рчГ-КСФ в реакционной смеси на выход ПЭГ-Г-КСФ. Из анализа этих данных следует, что увеличение исходной концентрации рчГ-КСФ в растворе от 1 до 13 мг/мл приводит к более высокому выходу конечного продукта и, как следствие, селективному протеканию реакции. При этом выделяли два диапазона значений концентраций белка в растворе, при которых выход ПЭГ-Г-КСФ остается практически неизменным: от 5 до 8 мг/мл – диапазон I, и от 10 до 12 мг/мл – диапазон II.
Реакция модификации с исходными концентрациями рчГ-КСФ в диапазоне I имеет коэффициент селективности равный 1.41–1.45 и характеризуется наименьшими потерями белка. Коэффициент селективности с использованием концентраций диапазона II значительно выше (2.19–2.27), однако при высоких концентрациях взятого в реакцию рчГ-КСФ из-за ограничения растворимости данного белка его потери увеличиваются, а равновесие реакции смещается в сторону образования побочных продуктов.
Влияние исходной концентрации рчГ-КСФ на выход ПЭГ-Г-КСФ Определяемый параметр после проведения реакции модификации Определение концентрации общего белка после проведения реакции показало, что степень преципитации его из раствора при 5-кратном избытке ПЭГ и 80-кратном избытке цианборгидрида натрия повышается при концентрации рчГ-КСФ > 9.0 мг/мл, а максимальная концентрация ПЭГ-Г-КСФ в данных условиях составляла 10–12 мг/мл. Скорее всего, это определяется механизмом взаимодействия ПЭГ с белком, который заключается в стерическом вытеснении молекулы ПЭГ из «белковой зоны» за счет связывания воды полимером. Кроме того, на растворимость рчГ-КСФ в реакционной смеси отрицательно сказывается избыточная концентрация модифицирующего агента [210-213]. Исходя из того, что селективность реакции достигала своего максимального значения в диапазоне II, то оптимальной концентрацией рчГ-КСФ в реакции было принято значение мг/мл.
Далее проводили ряд опытов, в ходе которых варьировали концентрацию ПЭГ и NaCNBH3, сохраняя при этом постоянными время реакции (18 ч) и объем реакционной смеси (50 мл). Реакцию проводили при температуре 4°С в буферной системе 5 мМ цитрат натрия при рН 6.0 и концентрации рчГ-КСФ 10 мг/мл.
Рис. 11. Трехмерная диаграмма влияния концентрации компонентов реакции на степень модификации филграстима.
Исследовали влияние значений молярных избытков компонентов реакции пэгилирования: для NaCNBH3 в 1, 5, 10, 20, 30, 40, 80 раз; и для ПЭГ в 1, 2, 3, 4, раз по отношению к количеству рчГ-КСФ, взятого в реакцию. На рис. представлены данные в виде трехмерной зависимости степени пэгилирования рчГ-КСФ от концентрации NaCNBH3 и ПЭГ.
Проведенные эксперименты показали, что при концентрации белка 10 мг/мл существуют молярные соотношения этих реагентов, при которых степень конъюгации рчГ-КСФ с ПЭГ достигает 90%. Это соотношение реагентов составило 20 (0.67 мг/мл) и 3 (34.37 мг/мл) (NaCNBH3:ПЭГ).
Анализ с помощью ОФ ВЭЖХ состава реакционной смеси, полученной в результате проведения реакции подтвердил правильность выбора условий проведения модификации ПЭГ-Г-КСФ. Результаты ОФ ВЭЖХ хроматограмм представлены на рис. 12.
Рис. 12. ОФ ВЭЖХ-анализ стандарта рчГ-КСФ (а) и реакционной смеси (б), полученной после проведения реакции в оптимизированных условиях. Пик 2 – побочные продукты, получаемые в процессе реакции (5–7 %); Пик 3 – непрореагировавший рчГ-КСФ (5%, б); Пик 1 – ПЭГ-Г-КСФ.
непрореагировавшего рчГ-КСФ составляла 5% от площади общего белка, а пика 2, соответствующего побочным продуктам реакции конъюгации (продуктам с более высокой степенью модификации) – 5–7%.
Для оценки эффективности полученной методики в препаративных условиях проводили повторное масштабирование процесса конъюгации ПЭГ-Г-КСФ в оптимизированной системе: в буферном растворе 5 мМ цитрат натрия рН 6.0 в присутствии 20-кратного избытка NaCNBH3 и 3-кратного избытка ПЭГ с исходной концентрацией белка 10 мг/мл. Результаты ОФ ВЭЖХ анализа полученных реакционных смесей приведены в табл. 6.
оптимизированных условиях Начальные условия Определяемые параметры после проведения реакции Объем реакц.
Как следует из приведенных данных, высокий выход конечного продукта реакции – конъюгата ПЭГ-Г-КСФ – сохранялся вплоть до 10-кратного увеличения работоспособности полученной методики конъюгации ПЭГ-Г-КСФ в полупромышленных масштабах.
1.3. Идентификация сайта конъюгации ПЭГ Для подтверждения селективности связывания ПЭГ c -аминогруппой рчГКСФ осуществляли трипсинолиз очищенного конъюгата ПЭГ-Г-КСФ при соотношении фермент:субстрат 1:50 при рН 7.5 в течение 4 ч. Разделение полученного гидролизата проводили с помощью микроколоночной ОФ ВЭЖХ в системе, оснащенной времяпролетным масс-анализатором в режиме on-line. Для сравнения использовали гидролизат немодифицированного рчГ-КСФ. В результате удалось выделить 12 фракций, каждая из которых представляла индивидуальный пептид. Пептидные карты белков представлены на рис. 13 (а, б), а распределение соединений по фракциям и результаты их анализа методом ESITOF LC/МS – в табл. 7.
Рис. 13. ESI-ТОF LC/MS анализ пептидных фрагментов, полученных в ходе трипсинолиза: (а) – рчГ-КСФ, (б) – ПЭГ-Г-КСФ.
Как видно из табл. 7, пептиды с одинаковой структурой идентифицированы во фракциях 1–7, 9, 11–13 и 1а–7а, 9а, 11а–13а. Пептиды, находящиеся в составе этих фракций имели близкие времена удерживания на колонке и по значениям данных [M+H]+ соответствовали немодифицированным участкам полипептидной цепи молекулы рчГ-КСФ. Однако величины m/z для двух компонентов гидролизатов (фракции 5 и 5а, 6 и 6а) 1491.78 и 1619.84 Да, соответственно, не были сопоставимы ни с одним из рассчитанных значений ожидаемых масс пептидов. Так как молекула рчГ-КСФ содержит в своей структуре одну свободную сульфгидрильную группу цистеина в положении Cys18 [214], а фрагмент Cys18–Arg23 с молекулярной массой 746.38 Да не был обнаружен в гидролизатах ни рчГ-КСФ, ни его конъюгата с ПЭГ, было предположено, что пептиды 5 и 5а, 6 и 6а образуются в результате окисления остатка Cys18 в процессе трипсинолиза и являются дисульфидными производными фрагмента Cys18–Arg23.
Сравнительный анализ пептидов, полученных в ходе трипсинолиза рчГ-КСФ и ПЭГ-Г-КСФ хроматограммах, рис. последовательности цепи Для подтверждения этого предположения оба компонента из фракций 5 и гидролизата рчГ-КСФ были выделены в препаративном количестве и алкилированные производные фрагментов 5 и 6 дополнительно очищали и анализировали методом тандемной масс-спектрометрии. Величина алкилированного продукта фракции 5 составляла значение 852.5 Да и точно соответствовала молекулярной массе винилпиридилированного фрагмента Cys18– Arg23, а 6 – 980.65 Да и соответствовала молекулярной массе Cys18–Lys24. Таким образом, полученные данные позволили подтвердить предположение, что при образовании конъюгата ПЭГ-Г-КСФ остаток Cys18 не затрагивается.
Уникальными для состава гидролизатов рчГ-КСФ и ПЭГ-Г-КСФ оказались фракции 8 и 10. Поскольку различие молекулярных масс фрагментов (гидролизат рчГ-КСФ, пептид Met1–Lys17) и 10 (гидролизат ПЭГ-Г-КСФ) составляло 21524.6 Да и соответствовало массе моно-метил-ПЭГпропиональдегида, то был сделан вывод, что присоединение ПЭГ к рчГ-КСФ происходит по N-концевому фрагменту цепи рчГ-КСФ. Поскольку при трипсинолизе конъюгата ПЭГ-Г-КСФ в составе смеси других фрагментов рчГКСФ, содержащих ПЭГ, обнаружено не было, то явилось очевидным, что присоединение моно-метил-ПЭГ-пропиональдегида в данных условиях синтеза осуществляется только по N-концевому остатку Met полипептидной цепи рчГКСФ.
Таким образом, установлены условия селективной модификации рчГ-КСФ с помощью ПЭГ (21.5 кДа) по N-концевому остатку полипептидной цепи белка с выходом целевого продукта не менее 85% от общего белка, взятого в реакцию; а также доказано, что присоединение ПЭГ идет по -аминогруппе рчГ-КСФ.
2. Очистка препарата ПЭГ-Г-КСФ 2.1. Основные подходы к очистке пэгилированных препаратов Получение и очистка пэгилированных лекарственных препаратов на практике представляет собой достаточно сложную задачу, требующую комплексного подхода. Основной проблемой разработки схемы очистки модифицированного белка является получение высокого выхода целевого продукта, изоляция «пэгамеров» и обеспечение биологической активности конечного препарата [58, 65]. Как правило, сложность разработки обусловлена еще и тем, что модифицированная молекула обладает физико-химическими свойствами, кардинально не отличающимися от таковых у нативной, что вызывает затруднения при получении чистого лекарственного препарата. В настоящее время многие физико-химические свойства ПЭГ-коньюгатов ещё не изучены в полной мере, поэтому основные пути очистки таких макромолекул основываются на классических методах разделения их немодифицированных аналогов [194, 215]. Часто условия разделения сложных реакционных смесей, как и некоторые специфические свойства присоединяемого в каждом отдельном случае индивидуального модифицированного ПЭГ, затрудняют перенос схемы очистки нативного белка на схему модифицированного препарата. При разработке технологий очистки пэгилированных препаратов, прежде всего, принимаются во внимание различия в физико-химических свойствах нативной и модифицированной форм, таких как, размер молекулы – в случае очистки с помощью гель-фильтрации, изоэлектрическая точка и распределение поверхностного заряда – в случае ионообменной хроматографии (ИОХ), и условная гидрофобность – при гидрофобной хроматографии (ГХ).
К сожалению, на данный момент в научной литературе отсутствует исчерпывающая информация о схеме очистки ПЭГ-Г-КСФ, поэтому с увеличением потребности в этом препарате появилась необходимость детально исследовать процесс очистки для разработки отечественных промышленных и полупромышленных технологий его получения.
2.2. Первичная очистка ренатурированного рчГ-КСФ для получения В 2007 году фармацевтическая компания ЗАО «Мастерклон» разработала схему выделения и очистки рчГ-КСФ, которая включала в себя стадию солюбилизации рчГ-КСФ из ТВ, ренатурацию, ионообменную хроматографию на сорбенте SP Sepharose FF при рН 6.0, гидрофобную хроматографию на Butyl Sepharose 4 FF при рН 6.0 и гель-фильтрацию на сорбенте Sephadex G-25 [216, 217].
Основываясь на полученных ранее данных, значение рН раствора рчГ-КСФ после ренатурации понижали до значения 4.0 с помощью 1 М уксусной кислоты.
В результате данной операции препарат подвергался первичной очистке за счет исследование осаждения белковых фракций рчГ-КСФ из ренатурата, по результатам ОФ ВЭЖХ установили, что уже при значении рН 6.0 основная масса примесей выпадает из раствора. А при значении рН ниже 6.0 происходит осаждение рчГ-КСФ, в результате чего понижается его концентрация, уменьшается выход и увеличивается общий объем раствора, что затрудняет дальнейший процесс очистки (табл. 8). Также, как видно из данных в табл. 8, при понижении рН до значений рН 4.0 и рН 5.0 увеличивались значения электропроводности раствора белка, что создавало дополнительную помеху при дальнейшей очистке его на стадии ионообменной хроматографии.
Определение чистоты ренатурированного рчГ-КСФ и его потерь при понижении рН раствора Из полученных данных следует, что оптимальное значение рН раствора для дальнейшей очистки на ионообменном сорбенте SP Sepharose FF составляет рН 6.0. В качестве подвижной фазы использовали оптимизированную буферную систему для проведения реакции пэгилирования рчГ-КСФ – 5 мМ цитрат натрия.
Скорость потока выбирали, основываясь на данных, полученных ранее – 250 см/ч.
Подбор условий разделения проводили на хроматографических колонках XK (GE Healthcare, Швеция) 100 мл.
Рис. 14. Сравнение хроматограмм первой стадии очистки рчГ-КСФ на сорбенте SP Sepharose FF при рН 6.0: А) по методике получения филграстима; Б) для получения пэгилированной формы рчГ-КСФ.
На рис. 14 представлены хроматограммы очистки рчГ-КСФ на первой стадии на сорбенте SP Sepharose FF по методике получения филграстима и ПЭГГ-КСФ. Поскольку разработанные ранее условия не позволяли получить препарат с концентрацией выше 5 мг/мл рчГ-КСФ, которая требовалась для осуществления реакции модификации по новой, наиболее технологичной методике, то для получения раствора рчГ-КСФ с концентрацией выше 9 мг/мл градиент проводили в 3 объемах колонки, а также изменили конечную концентрацию соли в градиенте (с 0.5 до 1 M NaCl). Содержание примесей в препаратах рчГ-КСФ, полученных как по одной, так и по другой схеме, составило 5–10 %, что подтвердилось данными ОФ ВЭЖХ анализа.
Таким образом, была разработана схема первичной очистки препарата рчГКСФ от основных клеточных компонентов в буферной системе 5 мМ цитрат натрия рН 6.0 на ионообменном сорбенте SP Sepharose FF, позволяющая получить белок с концентрацией 11–12 мг/мл для последующего проведения реакции пэгилирования. Потери на данном этапе составили 10–15% от общего белка.
2.3. Гидрофобная хроматография ПЭГ-Г-КСФ 2.3.1. Очистка ПЭГ-Г-КСФ от рчГ-КСФ и ПЭГ-олигомеров Для очистки препарата после стадии конъюгации требовались такие условия разделения, которые позволили бы очистить монопэгилированный препарат от основной массы полипэгилированных примесей и немодифицированного рчГКСФ. Применение ГХ в данном случае объяснимо довольно заметным различием гидрофобных свойств моно-ПЭГ-Г-КСФ и его «нативной» формы, а также высокомолекулярных олигомеров [70].
Для очистки ПЭГ-Г-КСФ на стадии гидрофобной хроматографии, согласно разработанной ранее методике очистки рчГ-КСФ, требовалась тщательная подготовка пробы наносимого белка, в том числе точное соответствие значений электропроводности раствора белка и буферной системы для проведения ГХ.
Поскольку в реакционной смеси оставалось избыточное количество ПЭГ, которое вызывало повышенную вязкость раствора, это служило дополнительной преградой для ГХ полупродукта сразу после проведения реакции конъюгации.
Для обессоливания реакционной смеси перед стадией ГХ использовали хроматографическую колонку Sephadex G-25 Fine (GE Healthcare, Швеция); в качестве буферной системы служил раствор 5 мМ цитрат натрия, 1.5 M NaCl рН 6.0.
Существует общепринятое мнение, что степень разделения различных пэгилированных форм белка с использованием ГХ основывается на степени его пэгилирования и длине цепи конъюгированного ПЭГ [196, 218, 219]. По этой причине применение ГХ оправдывается ещё и тем, что молекулярная масса используемого -метил-ПЭГ-пропиональдегида приблизительно равна массе молекулы рчГ-КСФ, что значительно уменьшает условную величину степени пэгилирования n (где n – отношение молекулярной массы конъюгированного ПЭГ к молекулярной массе «нативного» белка). Использование же ионообменной хроматографии в данном случае накладывало бы определенные ограничения на процесс очистки на первой стадии, поскольку различия в зарядах «нейтральных»
белков типа рчГ-КСФ со значением pI между 6 и 8 и его ПЭГ-изомеров незначительны, что, таким образом, существенно затруднило бы фракционирование [70].
Гидрофобную хроматографию конъюгата ПЭГ-Г-КСФ проводили согласно ранее выработанной схеме [217] на тестовой колонке Tricorn 10/100 объемом 8 мл Butyl Sepharose 4 FF (GE Healthcare, Швеция) при линейной скорости потока см/ч в буферной системе 5 мМ цитрат натрия рН 6.0. На рис. 15 представлены хроматограммы очистки рчГ-КСФ и ПЭГ-Г-КСФ на Butyl Sepharose 4 FF.
Рис. 15. Сравнение хроматограмм очистки рчГ-КСФ (В) и ПЭГ-Г-КСФ (А) на сорбенте Butyl Sepharose 4 FF в ранее изученных условиях при рН 6.0 при скорости потока 100 см/ч. Буферные системы: А – 5 мМ цитрат натрия, рН 6.0; В – 5 мМ цитрат натрия, 1.5 M NaCl, рН 6.0. Градиент: 0100% буферной системы В в 10-ти объемах колонки. Крупным штрихом обозначен обратный градиент NaCl, мелким – условная линия градиента.
Как видно из рис. 15, более гидрофильный мономер ПЭГ-Г-КСФ не сорбируется на гидрофобной матрице в данных условиях (см. рис. 15А), в то время как время выхода примесного «нативного» рчГ-КСФ полностью совпадает со временем выхода рчГ-КСФ на хроматограмме, соответствующей методике очистки препарата рчГ-КСФ (см. рис. 15В). Из этих данных следует, что для проведения гидрофобной хроматографии препарата ПЭГ-Г-КСФ требовалась разработка новых условий, отличных от выделения «нативного» рчГ-КСФ. В связи с этим исследовали влияние следующих факторов, определяющих процесс ГХ: состава и рН буферной системы, а также свойств лиганда гидрофобного сорбента.
Как известно, молярная концентрация нейтральной соли и повышение поверхностного натяжения с увеличением молярности в буферной системе для проведения ГХ являются важнейшими параметрами, определяющими степень удерживания биомолекул на гидрофобной матрице, как и их последующее разделение [220, 221]. В связи с этим для повышения выхода целевого белка, коэффициента распределения и коэффициента разрешения было исследовано влияние состава и значений рН различных буферных систем для проведения ГХ на очистку препарата ПЭГ-Г-КСФ. В качестве основы буферных систем в интервале рН 6.0–7.0 использовали 5 мМ трехзамещенный цитрат Na, а также мМ Tris – в интервале рН 7.0–8.0. Использовали наиболее часто применяющиеся в гидрофобной хроматографии системы, содержащие соли с высоким коэффициентом поверхностного натяжения и большим зарядом аниона [222]: 0. М (NH4)2SO4, 1.5 М KF и 1.5 M NaCl.
Проводили изучение предельной концентрации соли в буферной системе, при которой не происходит преципитации белка из раствора препарата ПЭГ-ГКСФ при общей концентрации белка 3–4 мг/мл. Максимальная динамическая емкость сорбента, установленная ранее, составила 20 мг белка на 1 мл геля.
Скорость потока выбирали, основываясь на данных, также полученных ранее – 100 см/ч [217]. Градиент проводился до 100% по буферной системе B, протекающий в 10 объемах колонки. Разделение проводили на тестовых колонках Tricorn 10/100 объемом 8 мл. Степень очистки образцов препарата ПЭГ-Г-КСФ при изучении стадии ГХ была проанализирована с помощью ОФ ВЭЖХ на колонке Symmetry C4 300 (4.6250мм) (Waters, США).
Эффективность хроматографической очистки ПЭГ-Г-КСФ оценивали по выходу препарата (% от общего белка) после проведения элюции обратным линейным градиентом концентрации соли, коэффициенту распределения белка (K), равному отношению количеств связавшегося и не связавшегося с сорбентом препарата, а также по коэффициенту разрешения RS (время между максимальным выходом выбранных соседних пиков, деленное на полусумму их ширины у основания). Оптимальное значение RS должно составлять не менее 1.5, но для большинства практических приложений, достаточным значением RS является 1. или меньше. Для уменьшения ошибки при определении характеристик, описывающих процесс ГХ, таких как степень очистки и коэффициента разрешения (RS), в препарат ПЭГ-Г-КСФ, содержащий после стадии конъюгации не более 15% примесей добавляли нативный рчГ-КСФ до концентрации 30–40%.
Влияние гидрофобного лиганда, состава и рН буферной системы на важнейшие хроматографические характеристики очистки препарата ПЭГ-Г-КСФ Sepharose 5 мМ цитрат натрия, 0.8 M (NH4)2SO4 pH 7.0 67.7 19.7 0. (high sub) Octyl Sepharose 4 FF, 20 мМ Tris, 0.8 M (NH4)2SO4 pH 7.0 18 0.9 0. Как видно из результатов, представленных в табл. 9, наилучшие показатели хроматографической очистки ПЭГ-Г-КСФ были получены при использовании в качестве буферной системы 20 мМ Tris, 0.8 M (NH4)2SO4 pH 7.0 для проведения ГХ на сорбенте Butyl Sepharose 4 FF, что отразилось в сочетании высокого выхода моно-конъюгата ПЭГ-Г-КСФ с высокими коэффициентами распределения (K) и разрешения (RS). В то время как при очистке ПЭГ-Г-КСФ в этой же системе при значении рН 8.0 наблюдалось образование примесных форм, что, по-видимому, связано с нестабильностью рчГ-КСФ и ПЭГ-Г-КСФ при данном значении рН.
Рис. 16. Сравнение хроматограмм очистки препарата ПЭГ-Г-КСФ на гидрофобных сорбентах Butyl Sepharose 4 FF (А), Octyl Sepharose 4 FF (B) и Phenyl Sepharose 6 FF (high sub) (C) (GE Healthcare, Швеция) в буферной системе 20 мМ Tris, 0.8 M (NH4)2SO4 pH 7.0. Скорость потока 100 см/ч. Градиент:
0100% по буферной системе В, протекающий в 10 объемах колонки.
Для исследования влияния сорбента на процесс очистки ПЭГ-Г-КСФ на стадии ГХ использовали наиболее часто применяющиеся для выделения белков гидрофобные матрицы: Octyl Sepharose 4 FF и Phenyl Sepharose 6 FF (high sub) (GE Healthcare, Швеция). Очистку проводили в условиях описанных выше для выделения препарата рчГ-КСФ на сорбенте Butyl Sepharose 4 FF. Основываясь на данных, представленных в табл. 9, можно сделать заключение, что наилучшими хроматографическими характеристиками для очистки препарата ПЭГ-Г-КСФ обладает сорбент Butyl Sepharose 4 FF, несмотря на то, что очистка препарата на Phenyl Sepharose 6 FF протекала гораздо эффективнее, чем на Octyl Sepharose 4FF, на котором модифицированный белок практически не сорбировался (что, повидимому, объясняется меньшим сродством к нему ПЭГ-Г-КСФ). Сводные результаты хроматографии препарата ПЭГ-Г-КСФ на различных гидрофобных сорбентах представлены на рис. 16.
Несмотря на то, что коэффициент разрешения RS в случае использования гидрофобного сорбента Phenyl Sepharose 6 FF по сравнению с Butyl Sepharose FF был намного ниже, было проведено дополнительное исследование сорбции ПЭГ-Г-КСФ на этом сорбенте при различных значениях рН в буферной системе, содержащей 0.8 M (NH4)2SO4, в которой происходило наилучшее разделение на Butyl Sepharose 4 FF. Условия очистки (скорость потока, динамическая емкость, градиент) уже описаны выше. Разделение также проводили на тестовых колонках Tricorn 10/100 с максимальным объемом 8 мл. Результаты представлены в табл. 9.
Как следует из результатов, представленных в табл. 9, наилучшее разделение смеси ПЭГ-Г-КСФ и рчГ-КСФ на сорбенте Phenyl Sepharose 6 FF осуществлялось при значении рН 7.5, однако выход пэгилированного препарата составил две трети от исходного количества, что, по-видимому, связано с частичной денатурацией белка при данном значении рН.
2.3.2. Очистка от белков E. coli Важнейшей характеристикой степени очистки препарата является отсутствие в нем белков грамотрицательных бактерий, которые в большинстве случаев даже в микроколичествах (более 10 нг/мл) способны вызывать побочные реакции и снижать эффективность действия препарата. Как правило, при использовании в качестве реципиентов культур микроорганизмов для экспрессии рекомбинантных препаратов требуется дополнительная стадия очистки от белков штаммапродуцента.
высокопродуктивный штамм E. coli BL21(DE3) [216], применение которого повышало вероятность обнаружения белков E. coli в препарате ПЭГ-Г-КСФ. В литературе было неоднократно описано применение ГХ для очистки белков и ДНК от белков E. coli [223, 224], и, поскольку в схеме очистки нативного препарата рчГ-КСФ белки E. coli отсутствовали именно после стадии ГХ [217], то степень очистки препарата от этих контаминантов служила дополнительным фактором, определяющим чистоту препарата ПЭГ-Г-КСФ после данной стадии.
Для определения иммуногенных белков E. coli использовали метод иммуноферментного анализа (ИФА) (Cygnus Technologies, США), основанного на специфической реакции «антиген-антитело» и позволяющего определить контаминантные белки с чувствительностью до 0.2 нг/мл, которую невозможно установить с помощью таких методов как ОФ ВЭЖХ или электрофорез.
Также проводили анализ препарата ПЭГ-Г-КСФ полученного нами после стадии ГХ на Butyl Sepharose 4 FF в оптимизированных условиях на содержание БЭ (ЛПС клеточных стенок грамотрицательных бактерий, способных вызывать повышение температуры тела, лихорадку, шок) с помощью ЛАЛ-теста [225].
ЛАЛ-тест считается надежным, широко применяемым, перспективным способом проверки потенциальной пирогенности лекарственных препаратов. Результаты ИФА и ЛАЛ-теста образцов препарата ПЭГ-Г-КСФ после очистки на сорбентах Butyl Sepharose 4 FF и Phenyl Sepharose 6 FF представлены в табл. 10.
Как следует из данных, приведенных в табл. 10, наименьшее количество белков штамма E. coli BL21 было обнаружено после очистки препарата ПЭГ-ГКСФ на сорбенте Butyl Sepharose 4 FF в буферной системе 20 мМ Tris, 0.8 M (NH4)2SO4 pH 7.0, однако содержание БЭ во всех образцах превышало допустимое значение.
Влияние гидрофобного лиганда, состава и рН буферной системы на степень очистки препарата ПЭГ-Г-КСФ от белков штамма E. coli BL
ТРЕБУЕМОЕ ЗНАЧЕНИЕ
Итак, после исследования влияния на процесс ГХ ПЭГ-Г-КСФ состава, значения рН буферной системы и свойств лиганда гидрофобного сорбента, было установлено, что наилучшее разделение препарата происходит на сорбенте Butyl Sepharose 4 FF в буферной системе 20 мМ Tris, 0.8 M (NH4)2SO4 pH 7.0 при линейной скорости потока 100 см/ч и максимальной динамической емкости сорбента 20 мг белка на 1 мл геля. Также с помощью твердофазного метода ИФА было установлено, что препарат содержал допустимое согласно нормам Европейской Фармакопеи количество белков штамма-продуцента E. coli BL21.2.4. Ионообменная хроматография ПЭГ-Г-КСФ Поскольку после стадии ГХ очищенный моно-конъюгат ПЭГ-Г-КСФ содержал примеси бактериальных эндотоксинов (по результатам ЛАЛ-теста), то для получения на его основе препарата надлежащего фармакопейного качества требовалась дополнительная стадия очистки.
В настоящее время существует множество различных способов очистки препаратов белков от эндотоксинов. Как правило, большинство из них основано на хроматографическом разделении, например, с использованием неионных детергентов в аффинной хроматографии [226], или с добавлением в буферные системы хелатирующих и хаотропных агентов в ГХ [227]. Однако в первом случае требуется дополнительная очистка препарата белка от примеси детергента, а во втором – довольно трудоемкие условия проведения хроматографии, связанные с использованием высоких концентраций солей, что делает процесс очистки препарата дорогостоящим и энергозатратным.
Ввиду того, что конечная форма препарата, в соответствии с зарубежным аналогом «Неуластим» (F.Hoffmann-La Roche Ltd., Швейцария), должна содержать не менее 10 мг/мл моно-пэгилированного рчГ-КСФ, то на завершающей стадии предлагаемой технологии очистки должно также происходить и концентрирование препарата.
В качестве такого метода – для получения АФС моно-пэгилированного препарата филграстима была выбрана ионообменная хроматография. Основными преимуществами использования ИОХ в технологическом процессе очистки являются высокая рабочая скорость, значительная сорбционная и разделяющая способности сорбента.
ПЭГ – это нейтральный полимер, но он может влиять на общий заряд конъюгата тремя различными способами. В одних случаях, присутствие ПЭГ может экранировать заряженную поверхность белка, таким образом, ослабляя связывание с ионообменной смолой. В других случаях, конъюгация ПЭГ с теми АКО, которые влияют на суммарный заряд белка (например, при превращении аминогрупп в амиды), либо приобретают заряд при определенном значении рН, изменяет потенциальный заряд модифицированного белка и значение его pI [70].
Было установлено, что изменения в pI могут быть вычислены из аминокислотной последовательности «нативного» белка, как и потери его заряда после модификации с ПЭГ. В третьих случаях, в составе молекулы белка ПЭГ способен образовывать водородные связи с ацильными и другими группами, таким образом, увеличивая их pKa [228].
В результате изучения поведения модифицированных белков в процессе ионообменной хроматографии было установлено, что пэгилированные препараты имеют четкий профиль разделения на анионообменных и катионообменных сорбентах, хотя довольно часто их динамическая емкость ниже, чем ожидается, что связано со слабой диффузионной способностью пэгилированных белков [70, 196, 215]. Также описаны методики очистки конъюгатов Г-КСФ с различными видами ПЭГ (в том числе с Мr=20000) от поликонъюгатов и нативного Г-КСФ с помощью катионообменной хроматографии [229, 230]. Кроме того, очистка на ионообменных сорбентах позволяет получать препараты белков с низким содержанием бактериальных эндотоксинов 0.5 ЕЭ на 1 мкг белка [227, 231].
Поскольку большинство БЭ имеет pI~2, то при проведении очистки положительно заряженных белков, таких как ПЭГ-Г-КСФ (pI 5.8~6.6) на катионнообменном сорбенте в буферных системах с рН 45 основная часть этих контаминантов не сорбируется на носителе. Это основные причины, по которым было оправдано использование ИОХ для очистки препарата ПЭГ-Г-КСФ от БЭ, а также от незначительных примесей поликонъюгатов и нативного рчГ-КСФ, и для концентрирования белка перед приготовлением его АФС.
В литературе уже описано использование катионообменного сорбента SP Sepharose FF для очистки пэгилированного препарата рчГ-КСФ [229, 230]. И, поскольку метод очистки его немодифицированного аналога был ранее осуществлен с использованием данного сорбента, продемонстрировавшего хорошие показатели очистки рчГ-КСФ от эндотоксинов и белков E. coli за одну стадию [216], то было принято решение использовать именно SP Sepharose FF (GE Healthcare, Швеция).
Для изучения оптимального значения рН буферной системы для очистки ПЭГ-Г-КСФ на SP Sepharose FF проводили хроматографию в буферном растворе 50 мМ ацетат натрия в диапазоне рН 45, поскольку известно, что при значениях близких к рН 4.0 Г-КСФ [232, 233] и ПЭГ-Г-КСФ [209, 234] проявляют максимальную конформационную стабильность. Эффективность осуществления процесса очистки оценивали по выходу препарата и коэффициенту распределения белка (K). В качестве стартовых условий использовали условия очистки рчГ-КСФ, разработанные ранее [216].
При элюировании препарата использовали линейный градиент 50% по буферной системе В (50 мМ ацетат натрия, 1 М NaCl), протекающий в 2 объемах колонки, что было обусловлено высокой концентрацией финальной формы – мг/мл. Раствор ПЭГ-Г-КСФ после ГХ переводили с помощью дополнительно введенной стадии гель-фильтрации на сорбенте Sephadex G-25 Fine (GE Healthcare, Швеция) в буферные системы, содержащие 50 мМ ацетат натрия со значениями рН 4.0, 4.5. и 5.0.
Выход ПЭГ-Г-КСФ после стадии катионообменной хроматографии на SP Sepharose FF в буферной системе 50 мМ ацетат натрия при различных значениях рН раствора Выход, Динамическая Потери Содержание Концентрация
«