«Пучков Илья Александрович РАЗРАБОТКА, ОПТИМИЗАЦИЯ И МАСШТАБИРОВАНИЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПРОИЗВОДСТВА ПЭГИЛИРОВАННОЙ ФОРМЫ РЕКОМБИНАНТНОГО ГРАНУЛОЦИТАРНОГО КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩЕГО ФАКТОРА Специальность 03.01.06 – ...»

Молекула содержит свободную сульфгидрильную группу цистеина в положении Cys17 и две внутримолекулярные дисульфидные связи в положениях Cys36–Cys42 и Cys64–Cys74 [7]. С помощью сайт-специфического мутагенеза было установлено, что в молекуле Г-КСФ свободный Cys не отвечает за активность белка, в то время как модификация цистеинов, формирующих дисульфидные связи, приводит к снижению биологической активности и нарушению вторичной и третичной структур молекулы [5].

Расчет вторичной структуры Г-КСФ показал, что молекула белка содержит 66% -спиралей и 17% -складок [10].

Третичная структура Г-КСФ, как и других членов семейства цитокинов, была установлена с высоким разрешением рентгеновской кристаллографией и ЯМР-спектроскопией. Молекула Г-КСФ представляет собой узел из четырех антипараллельных -спиралей с левовращающими витками с общим размером 452626 с короткой спиралью между первой и второй из этих структур.

Четыре спирали называются AD-спиралью, а их соединительные петли – AB-, BC- и CD-петлями. AB- и CD-петли – длинные вертикальные структуры, и только ВС-петля является наиболее типичной короткой U-образной петлей [11].

Структура узла рчГ-КСФ неизменна за счет углов пересечения спирали, размер которых варьируется между -167° и -159°. Средний угол пересечения очень близок к теоретически прогнозируемому (-161°) для идеального левозакрученного антипараллельного четырехспирального узла. Спирали А, В и С прямые, тогда как спираль D сгибается по направлению к самой короткой спирали В. Изменение в аксиальном направлении между концами спирали D составляет 35° с наибольшими изгибами в районе Gly149 и Ser159. Прямой взаимодействовать со спиралями А, В и С, а также часто используется для определения углов пересечения внутри молекулы [11]. В дополнение к четырем основным спиралям существует короткая спиральная секция E внутри петли AB (рис. 1).

Белковая цепь делает крутой поворот от спирали А, и 5 АКО переходят в 4 остатка спирали 310. В Leu47 есть сдвиг в направлении полипептидной цепи, и спираль 310 ведет непосредственно к 6-му остатку -спирали. Угол 45° между этими короткими спиралями оборачивает их вокруг N-конца цепи спирали D.

Они экспонированы вовне и выступают из основного каркаса белковой структуры. Остатки этого региона перекрываются с эпитопами, распознаваемыми нейтрализующими моноклональными антителами [11].

Рис. 1. Трехмерная структура Г-КСФ (-спирали изображены в виде цилиндров) Присутствие двух дисульфидных связей в рчГ-КСФ, Cys36–Cys42 и Cys64– Cys74, необходимо для биологической активности белка. Они расположены на противоположных концах длинной петли AB, где образуют короткие петли у Сконца спирали А и N-конца спирали B. Измерение кругового дихроизма молекулы Г-КСФ позволило установить, что в отсутствие Cys64–Cys формируется лишь около половины нативной структуры -спирали [11].

Существует два типа структур молекулы Г-КСФ (А и В), имеющих приблизительно одинаковые молекулярные веса порядка 20 кДа, и которые состоят соответственно из 177 (А-тип) и 174 АКО (В-тип). Эти два вида структур идентичны, кроме трех аминокислотных остатков (Val-Ser-Glu), отсутствующих или имеющихся в районе 35-й аминокислоты от N-конца.

аминокислотные остатки и имеют две дисульфидные связи [4].

Углеводный остаток на Thr133 составляет около 4% от общего молекулярного веса гликопротеина и представляет собой (2,6)галактозо-(1,3)N-ацетилгалактозамин сиаловой кислоты [4].

1.3. Применение рчГ-КСФ в медицине Очистка и молекулярное клонирование рчГ-КСФ (филграстима) были осуществлены в период между 1984 и 1986 гг., а разработка получения филграстима для клинических нужд началась в 1986 году, вместе с разрешением на его клиническое применение у онкологических больных, проходивших курс химиотерапии в Соединенных Штатах в феврале 1991 года.

Спустя 5 лет с момента его лицензирования как лекарственного средства, 1. миллиона пациентов прошли курс лечения с его помощью [12].

Первоначально филграстим использовался в качестве вспомогательного средства в клинических испытаниях после курса химиотерапии для предотвращения нейтропении или ее осложнений (лихорадка, инфекции, язвы ротовой полости) [13]. Исследования выявили, что Г-КСФ ускоряет восстановление нейтрофилов и снижает продолжительность нейтропении после химиотерапии цитостатическими препаратами и радиационной терапии опухолей [14]. Его использование привело к снижению частоты возникновения инфекций и к сокращению продолжительности госпитализации онкологических больных [13]. Помимо нейтропении, вызванной химиотерапией, филграстим был одобрен более чем в 70 странах для лечения миелосупрессии после трансплантации костного мозга, тяжелой хронической нейтропении, пневмонии, острого лейкоза, апластической анемии, миелодиспластического синдрома и для мобилизации периферической крови клеток-предшественников для трансплантации. В последнее время описаны случаи использования реваскуляризации сосудов при ишемической болезни сердца [12].

Клиническое применение Г-КСФ было преимущественно оправдано при лечении различных форм нейтропении: врожденной, циклической или идиопатической [13]. Например, при тяжелой врожденной нейтропении – заболевании, характеризующемся задержкой созревания миелоидных клеток в костном мозге и приводящем к резкому снижению уровня периферийных нейтрофилов и восприимчивости к оппортунистическим бактериальным инфекциям, которые могут быть фатальными. Еще одним важным и первоначально неожиданным преимуществом Г-КСФ является его способность индуцировать выход гематопоэтических стволовых клеток и клетокпредшественников из костного мозга в периферическую кровь. Это привело к использованию Г-КСФ для активации и изоляции периферических гемопоэтических стволовых клеток для их трансплантации и лейкофереза [12, 13]. Механизм, посредством которого Г-КСФ мобилизует эти клетки в периферию, до конца не изучен, но, как полагают, не является прямым, поскольку непосредственно Г-КСФ не воздействует на стволовые клетки и клетки-предшественники. Этот механизм опосредован его рецепторами, в том числе с помощью секреции матриксных металлопротеиназ, активации рецепторов хемокинов и модуляции различных адгезивных молекул [13, 15].

2. Полиэтиленгликоли (ПЭГ) 2.1. Преимущества, направления и перспективы использования пэгилирования в области создания новых классов биофармацевтических препаратов В настоящее время полиэтиленгликоль (ПЭГ) является одним из наиболее популярных биосовместимых полимеров, поскольку обладает множеством полезных свойств. Среди них – широкий диапазон растворимости в органических и водных средах, отсутствие токсичности и иммуногенности и полидисперсностью и коммерческой доступностью ПЭГ на рынке [17]. ПЭГ имеет самый низкий уровень белковой и клеточной адсорбции на своей поверхности из любых других известных полимеров. Это свойство объясняется минимальной энергией на поверхности раздела фаз его молекул в водном растворе [18].

Другой важной причиной возросшей популярности ПЭГ является его относительная структурная простота. Молекула полимера имеет химически инертную основу (каркас) и только две (или в случае моно-ПЭГ, одну) модифицированные концевые группировки [16].

биологическими механизмами узнавания in vivo, могут быть сведены к минимуму путем ковалентной модификации биологически активных молекул ПЭГ. Так, например, иммуногенность и антигенность белков может быть значительно снижена. Время циркуляции в крови липосом, наночастиц и белков может быть увеличено, а их усвоение ретикулоэндотелиальной системой (РЭС), печенью и селезенкой понижено. Также может быть уменьшена тромбогенность, адгезия клеток и белков на поверхности молекул [16]. Благодаря ковалентному присоединению ПЭГ к белкам, вокруг молекулы конъюгата образуется водное облако, которое способно затормозить или предотвратить действие протеолитических ферментов, антител и фагоцитов, а также увеличить гидродинамический объем молекулы, что позволяет снизить почечный клиренс [17]. Таким образом, может быть уменьшена частота введения препарата и соответственно количество лекарственного средства, что улучшает качество жизни пациента и уменьшает клинические расходы [19].

Выведение ПЭГ-конъюгатов и пэгилированных носителей почками снижается при использовании препаратов с более высокой молекулярной массой, что обусловлено эффектом повышенной проницаемости и удержания молекул в организме (пассивный таргетинг). Это явление в основном наблюдается в раковых или воспаленных тканях, которые отличаются гиперваскуляризацией и обладают особо проницаемой сосудистой сетью и представляют собой спонтанно расположенные, слабо связанные эндотелиальные клетки, позволяющие наноскопическим частицам проникать в опухолевые ткани и оставаться внутри в результате отсутствия или ослабления лимфодренажа [19].

Однако следует иметь в виду, что выведение полимера не напрямую зависит от его молекулярной массы, но, скорее, от его гидродинамического объема, на который влияет архитектура полимера. Например, звездообразные полимеры и дендримеры имеют меньшие объемы, чем таковые у линейных с аналогичными молекулярными массами [19].

Также пэгилирование обеспечивает препараты большей физической и термической стабильностью и предотвращает или снижает агрегацию их в организме или во время хранения, что является результатом стерической изоляции и/или маскирования зарядов, обеспеченного образованием «конформационного облака» [19].

Эти полезные свойства, передающиеся биомолекулам с помощью присоединения ПЭГ, имеют огромное значение для любой системы, требующей контакта с кровью [16].

биологических свойств ПЭГ и его производные стали одними из наиболее востребованных модификаторов биологически значимых молекул.

Производные ПЭГ также широко используются в качестве растворимых матриц для жидкофазного пептидного синтеза, как лиганды для водорастворимых комплексов переходных металлов, как водорастворимые агенты для слияния клеток [18]. В настоящее время арсенал применения ПЭГ-конъюгатов продолжает расширяться. Некоторые из ПЭГ-модифицированных молекул, например, белки и липосомы, уже являются коммерчески успешными зарегистрированными фармацевтическими препаратами [16].

показывает, что такие системы требуют особенно тщательной степени разработки. Спектр сложных ПЭГ-реагентов, предназначенных для сайтселективной модификации биологических макромолекул, безусловно, будет расширяться для создания пролонгированных форм препаратов направленного действия. Опыт работы с модифицированными ПЭГ в последние десятилетия показал, что введение соответствующих реакционноспособных групп в молекулу полимера может быть успешно описано довольно простыми схемами присоединения [16].

За последние 30 лет было создано несколько различных классов ПЭГ, которые позволяют заранее сконструировать конъюгат с заданными терапевтическими свойствами. Кроме того, за это время были разработаны и оптимизированы различные методики для очистки и анализа конъюгатов, которые необходимы при разработке подобных фармацевтических препаратов.

фармацевтическом рынке стали доступны многие активированные полимеры, лабораториях, которые не снабжены химическими и технологическими средствами, необходимыми для активации ПЭГ [20].

пэгилированного препарата Управлением по контролю за продуктами и лекарствами (FDA) в США в 1990 году, а именно пэгилированной формы аденозиндезаминазы «Адаген» для лечения тяжелого комбинированного иммунодефицита, пэгилирование стало широко использоваться в качестве метода модификации на стадии пост-производства для улучшения биомедицинской эффективности и физико-химических свойств терапевтических белков [21]. С тех пор девять различных пэгилированных препаратов получили одобрение FDA: из них восемь пэгилированных белков и один аптамер пэгилированного фактора роста сосудистого эндотелия (ФРСЭ) «Пэгаптаниб» для лечения глазных сосудистых заболеваний. Стоит отметить, что четыре из этих восьми утвержденных пэгилированных биопрепаратов являются фармацевтическими «блокбастерами» – теми препаратами, которые генерируют доход более $ 1 млрд. в год: «Пэгинтрон» (пэгилированная форма интерферона-2b); «Пегасис» (пэгилированная форма интерферона-2a), «Ньюласта» (пэгилированная форма рчГ-КСФ) и «Мирцера» (пэгилированный эпойетин-), утвержденный FDA в 2007 году для лечения анемии, связанной с хронической почечной недостаточностью у взрослых [22].

зарегистрирован пэгилированный фрагмент антитела, который относится к семейству ингибиторов фактора некроза опухоли (ФНО). Препарат «Кимзия»

(пэгилированный анти-ФНО--Fab`) был утвержден в апреле 2008 года для лечения заболевания Крона и в мае 2009 года – для лечения ревматоидного артрита. Другой пэгилированный фрагмент антитела был создан из ди-Fab'анти-агрегантного производного фактора роста (CDP860) для применения на последних этапах клинических испытаний [22].

биофармацевтическим препаратам в ближайшем будущем к выпуску готовятся многие другие новые пролонгированные формы, находящиеся сейчас на разных стадиях клинических испытаний. Некоторые фармацевтические компании активно разрабатывают пэгилированные формы IFN-: пэгилированный по Nконцу человеческий IFN-, разработанный компанией «Biogen Idec» (BIIB017), в настоящее время находится на III фазе клинических испытаний, и ПЭГ-IFN-, разработанный «Toray» (ТRК-560), в настоящее время на первой фазе клинических испытаний [23]. Кроме того, новая версия пэгилированного ГКСФ с улучшенным фармакокинетическим профилем «Маxy-G34», разработанная компанией «Maxygen Inc.», успешно прошла вторую стадию клинических испытаний [24].

Есть также несколько докладов о применении пэгилированных белков, которые находятся на различных этапах разработки. Фармацевтической компанией «Novo Nordisk» проведены испытания производных гликопэгилированных факторов свертываемости крови, из которых аналог VIIго фактора N7-GP уже прошел II фазу клинических испытаний [25], как и аналог фактора VIII N8-GP, прошедший испытания на пациентах из 7 стран, страдающих тяжелой формой гемофилии типа А [26]. Также ведется разработка фармакокинетической модели для базовых и хирургических испытаний III фазы гликопэгилированной формы рекомбинантного фактора IX нонакога бета N9GP по данным однократного введения препарата пациентам, страдающим гемофилией типа В и прошедшим I фазу клинических исследований [27].

Компанией «BioMarin Pharmaceutical Inc.» проводится II фаза клинических испытаний пэгилированной формы фенилаланинаммонийлиазы в качестве потенциального препарата для инъекций больным фенилкетонурией [28].

Также компанией «Halozyme Therapeutics» успешно проводятся испытания препарата пэгилированной человеческой рекомбинантной гиалуронидазы PEGPH20, расщепляющей гиалуроновую кислоту, входящую в состав внеклеточного матрикса, и способной провоцировать несколько клеточных линий человеческой панкреатической карциномы. PEGPH20 способствует опухолеспецифическому увеличению макромолекулярной проницаемости и индуцирует порозность и межэндотелиальные и соединительные пробелы в эндотелии опухоли. Комбинированная терапия PEGPH20 и гемцитабина ингибирует рост опухоли и продлевает выживание популяции генноинженерных мышей [29].

Каркасные белки представляют собой новое поколение универсальных связывающих рецепторов для конструирования биофармацевтических лекарственных препаратов. Сконструированные каркасные белки образованы небольшими растворимыми мономерными белками, такими как липокалины («Антикалин»), фибронектин III («Аднектин»), белок А («Аффибоди»), тиоредоксин и BPTI/LACID1/ITI-D2 (домен Куница) [22], и представляют собой домены антител, в частности, их наименьшие функциональные единицы, способные к специфическому связыванию. Липокалины – функционально разнообразные белки, содержащие 160–180 АКО, с довольно слабой гомологией аминокислотной последовательности. Эти протеины со сконструированными лиганд-связывающими сайтами представляют собой привлекательную альтернативу рекомбинантным фрагментам антител, сочетающими в себе преимущества молекул значительно меньших размеров с одной полипептидной цепью, и обладают терапевтическим потенциалом внутриклеточных мишеней с высокой структурной пластичностью вследствие изменения аминокислотной последовательности [30, 31]. Чтобы продлить время их циркуляции в организме, их также часто подвергают пэгилированию.

Несколько препаратов на основе каркасных белков в данный момент проходят пэгилированный Аднектинтм CT-322, связывающий рецептор-2 сосудистого эндотелиального фактора роста, применяющийся в терапии саркомы Юинга (компания «Adnexus, A Bristol-Myers Squibb R&D Company») [32], и пэгилированный домен антитела, связывающий фактор некроза опухоли-, разработанный совместно компаниями «PolyTherics Ltd.» и «Fujifilm Diosynth Biotechnologies» [33].

антигенсвязывающих фрагментов с высокой избирательностью сфокусирован на использовании однодоменных VHH-фрагментов антител, названных нанотелами, полученными из тяжелой цепи последних, обнаруженными только у семейства верблюдовых. Свойства рекомбинантных однодоменных нанотел позволяют беспрепятственно проводить синтез, выработку и молекулярнобиологические манипуляции, такие как модификация аминокислотной последовательности, создание «фьюжн»-молекул с другими белками и даже перенос антигенной специфичности от одного нанотела к другому [34].

Нанотела обладают высокой стабильностью при комнатной или повышенной температурах и имеют слабую способность к агрегированию по сравнению с любыми одноцепочечными вариабельными фрагментами (scFv), полученными из обычных антител, могут быть легко получены в бактериях, в дрожжах и мицелиальных грибах и имеют низкую иммуногенность (данные для мышей) [35]. Кроме того, из-за их небольших размеров (15 кДа) нанотела могут атаковать гликозилированные и скрытые антигены, недоступные для крупных антигенсвязывающего сайта позволяют взаимодействовать с эпитопами, которые не являются узнаваемыми для обычных антител. На настоящий момент уже описано применение нанотел in vivo для терапевтических целей, в том числе для воздействия на паразитов и на раковые клетки [34]. Поэтому стало очевидным, что пэгилирование нанотел сможет подавить клиренс макрофагов и увеличить время циркуляции введенных векторов, что жизненно важно для экстравазации нанополимеров в опухоли для обеспечения эффективной системной доставки трансгенов. Не так давно был синтезирован конъюгат антиDF3/Муцин1-нанотела со сложным ПЭГ-полиэтилениминовым комплексом (полиплекс) для доставки летальных трансгенов к сверхпродуктивным раковым клеткам Муцин1 [36] и конъюгаты трех различных факторов некроза опухолис ПЭГ 40 кДа для лечения аутоиммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит [37].

макромолекул с измененными физико-химическими характеристиками. Эти модификации, как правило, отражаются на способности связывания рецептора, на in vivo и in vitro биологической активности, скорости сорбции и биодоступности, как и биораспределении, фармакокинетическом и фармакодинамическом профиле, а также снижении иммуногенности и токсичности.

Пэгилирование защищает пептиды и белки от протеолитического расщепления, однако высокомолекулярные и разветвленные виды ПЭГ способны оказывать негативное воздействие на биологическую активность конъюгатов из-за стерических помех [38–40]. В условиях in vivo этот эффект компенсируется значительно увеличенным клиренсом, который обычно составляет основное преимущество пэгилированных белков перед нативными [41–43]. Как правило, чем длиннее цепь ПЭГ [44–46] и выше его молекулярный вес [47–49], тем больше время полувыведения ПЭГ-конъюгата (рис. 2) [22]. В фармакокинетические и фармакодинамические показатели, скорость сорбции, объем распределения препарата в организме и период полувыведения [50–52].

Было установлено, что конъюгаты белков с разветвленными видами ПЭГ имеют более длительную циркуляцию in vivo, чем их линейные аналоги, при одинаковой молекулярной массе засчет более эффективного экранирования поверхности белка, но также и больший гидродинамический объем [53–56], хотя в последнее время появились результаты, оспаривающие эту гипотезу [57].

Проблемы, которые встают при разработке пэгилированных белков, также как и других пэгилированных молекул, часто связаны с контролем сайта конъюгации ПЭГ и количеством продуктов различной степени пэгилирования.

Терапевтические препараты должны быть полностью гомогенны, с четко установленной активностью и минимизированными побочными эффектами.

Изменение соотношения продуктов реакции пэгилирования, как и их конформации, приводит к изменению биологической активности и фармакокинетического профиля [58–60]. Активность, стабильность, фармакокинетика, а также биораспределение и иммуногенность биоконъюгатов могут зависеть от нескольких параметров, таких как размер и форма полимера, положение сайта конъюгации, число присоединенных молекул ПЭГ, природа химической связи и количество задействованных аминокислот [61–65].

Рис. 2. Влияние молекулярной массы пэгилированных по N-концевой аминокислоте конструктов интерферона--2b с линейными (10, 20 и 30 кДа) и разветвленным (45 кДа) ПЭГ на их активность in vitro, определенную с помощью RGA (ангиогенный анализ гена-репортера), и на период полувыведения у крыс после введения данных препаратов.

Доступные в настоящее время ПЭГ-реагенты позволяют проводить селективное присоединение к наиболее распространенным функциональным группам, присутствующим в белках, а именно: к первичным аминам, карбоксильным группам, тиоловым или углеводным остаткам [66, 67]. Тем не менее, проведение селективных модификаций по определенным аминокислотам в белковой последовательности (например, для сохранения первоначальной биологической активности) является довольно сложной процедурой, и на данный момент невозможно вывести какую-то одну унифицированную стратегию для присоединения ПЭГ ко всем белкам или пептидам [22].

2.2. Свойства ПЭГ как модифицирующего агента Уникальные химические и медико-биологические особенности полиэтиленгликоля в течение длительного времени были успешно использованы для различных практических целей, в том числе для присоединения к биологическим молекулам без изменения их биомедицинских свойств. ПЭГ может быть легко химически модифицирован и присоединен к другим молекулам с незначительным воздействием на их химические свойства, но с заметным изменением их растворимости, размера и стабильности. Этот полимер, на первый взгляд, является очень простой молекулой, но, по сути, он представляет собой линейный нейтральный полиэфир с общей структурой [68]:

R–O–(CH2–CH2–О)n–CH2–CH2–OH, где R = CH3, H Одной из наиболее ярких особенностей ПЭГ является растворимость: до 50% в большинстве растворителей, применяемых в органической химии, а также в воде. ПЭГ имеет низкую собственную токсичность. К тому же не каждый неионный гидрофильный полимер может обеспечить безопасное, не вызывающее побочных реакций воздействие. ПЭГи с молекулярной массой от 20 до 50 кДа в основном используются для конъюгации с низкомолекулярными препаратами, такими как олигонуклеотиды и малые интерферирующие РНК. В результате образуются конъюгаты, имеющие повышенный почечный клиренс из-за резко увеличенной молекулярной массы образованной молекулы, не способной преодолеть порог почечного выведения. ПЭГи с более низкими молекулярными массами 1–5 кДа часто используются для конъюгации с высокомолекулярными препаратами, такими как антитела или наночастицы [19].

С теоретической точки зрения, биоразлагаемый полимер является наиболее удобным в применении, так как трудности в достижении полного выведения можно было бы преодолеть, хотя должны быть рассмотрены и другие проблемы, такие как токсичность продуктов разложения и ограниченный период хранения препарата.

Что касается химической модификации ПЭГ, то на концах его молекула имеет первичную, легко модифицируемую гидроксильную группу, в то время как полиэфирная основа химически инертна.

В случае, когда требуется присоединить только одну молекулу вещества к молекуле ПЭГ или прикрепить сложные цепи ПЭГ к субстрату во избежание возможного кросс-линкинга белка, часто используется моно-метиловый эфир ПЭГ (мПЭГ). Ковалентная связь между ПЭГ и молекулой белка образуется с участием ОН-групп полимера. Кроме того, новые функциональные молекулы ПЭГ могут быть получены или путем прямого преобразования гидроксильных фрагментов в требуемую функциональную группу, либо реакцией полимера с бифункциональной молекулой, где одна функциональная группа используется для присоединения к полимеру, а другая остается доступной для конъюгации с интересующей молекулой [68].

непосредственной близости от активного центра, может привести к стерическим препятствиям или незначительным конформационным изменениям в функциональной части белка. С помощью иммобилизации маскирующих агентов на твердые носители, пространство вокруг активного центра становится защищенным от химического воздействия во время проведения пэгилирования. После снятия защиты субстрат беспрепятственно достигает активного центра пэгилированного белка [69].

Для использования ПЭГ в качестве модифицирующего агента для присоединения к пептиду или белку, он должен быть активирован с помощью функциональных групп, которые являются реакционноспособными по отношению к некоторым группировкам белка [68].

Несмотря на успех клинических испытаний многих ПЭГ-конъюгатов, присоединение ПЭГ-реагента к биомолекуле, также как и придание конъюгату требуемой структуры и его дальнейшая очистка, остаются довольно проблематичными [70]. В частности, в результате реакции конъюгации может образовываться примесь побочных продуктов, если в молекуле белка имеется еще одна функциональная группа, которая является активной по отношению к ПЭГ-реагенту. Например, при взаимодействии с обычными белками даже монофункциональных ПЭГ реакция конъюгации часто приводит к образованию смеси моно-, ди- и полипэгилированных форм. В связи с вышеизложенными соображениями, недоступность ПЭГ-реагентов, способных обеспечить сайтнаправленное пэгилирование, является основной преградой для разработки биофармацевтических молекул-конъюгатов. К сожалению, сайт-специфичных реагентов немного. Довольно часто приходится встраивать конкретный специфичный сайт в биомолекулу для дальнейшего сайт-направленного присоединения [71]. Несмотря на это, выбор соответствующего реагента становится проблемой для создания методики пэгилирования [68].

Поскольку фолдинг белковых цепей регулируется термодинамическими факторами, доступность и реакционная способность боковых цепей может быть изменена путем варьирования условий протекания реакции. Например, лизин является более реакционноспособным в непротонированной форме, т.е. при рН>рКа. Следовательно, при более высоких значениях рН реакция протекает быстрее [72], но ОН-группы становятся более конкурентоспособными, при низких значениях рН реакция протекает медленнее с более высокой селективностью. Кроме того, «спрятанные» аминокислоты могут быть выведены на поверхность благодаря частичной денатурации белка. Но поскольку биологические функции белков определяются их формой и структурой, то следует принимать меры предосторожности, чтобы предотвратить неблагоприятные изменения конформации в результате проведения модификации [69].

Процесс присоединения ПЭГ к белкам обычно происходит с вовлечением аминокислотного остатка лизина, поскольку его -аминогруппы, всегда присутствующие в белках, довольно реакционноспособны и гидрофильны [73, 74, 75]. Также существует множество работ, посвященных сайт-направленному пэгилированию аминокислотных остатков в белках [42, 66, 76]. Тиоловые модификации c помощью таких реагентов, как малеимид [77, 78], пиридилдисульфид [79, 80], винилсульфон [81], представляют особый интерес, но поскольку цистеин редко присутствует в белках, то их применение ограничено [82, 83]. Другие аминокислотные остатки также могут представлять собой активные сайты конъюгации, такие как гуанидиновые группы аргинина, карбоксильные и карбоксамидные группы глутаминовой кислоты и глутамина [84, 85, 86], а также углеводные остатки – в случае гликопротеинов [87]. Иногда случайное присоединение также может произойти по тирозину [88] или гистидину [72, 89]. В одном из случаев происходит модификация серина с образованием сложного эфира. Любой нежелательный продукт присоединения по тирозину может быть расщеплен обработкой гидроксиламином [90].

Присоединение по карбоксильным группам белка описано только для нескольких конкретных случаев, как в случае косвенного присоединения ПЭГгидразида при низких значениях рН [91, 92], поскольку при реакции с аминогруппами ПЭГ одновременно происходит кросс-линкинг белка по этим же аминогруппам [93, 94, 95].

Необходимым требованием для всех этих методов является создание условий для сохранения активности биомолекулы: определенное значение рН, температуры и концентрации белка и соли [68, 96], с целью предотвращения неспецифичного присоединения ПЭГ.

Известно, что образование прочной связи между биологической молекулой и молекулой ПЭГ является причиной существенной потери биологической активности белка или полипептида [54, 58]. Однако даже если в результате реакции остается около 5% от первоначальной биологической активности, то этого, как правило, вполне достаточно для функционирования in vivo пэгилированной формы со стабильной связью в той же степени, что и нативной [68].

2.3. Виды ПЭГ-реагентов 2.3.1. Обзор современных ПЭГ-реагентов Коммерчески доступные ПЭГ-реагенты имеют различные длину и геометрию молекул и химические свойства, что позволяет взаимодействовать с особыми функциональными группами белков для создания ковалентной связи.

Существует несколько коммерческих поставщиков, например, «NOF Corporation» (Япония), «SunBio» (Южная Корея), «Chirotech Technology Ltd.»

(Великобритания), «JenKem» (Китай), «Creative PEG Works» (США) [22].

Полимерные ПЭГ, как правило, не подвержены биодеградации, но, по некоторым данным, подтвержден процесс их окислительного расщепления с помощью различных ферментов, таких как алкоголь- и альдегиддегидрогеназа [97] или цитохром-Р450-зависимая оксидаза. Цепи ПЭГ с молекулярной массой менее 400 Да деградируют in vivo под воздействием алкогольдегидрогеназ до довольно токсичных метаболитов [98]. Более длинные цепи, которые используются для пэгилирования белков, не подвергаются метаболизму, и механизм выведения их конъюгатов зависит от их молекулярной массы [22, 99].

Молекулы ПЭГ и ПЭГ-белков с присоединенным ПЭГ, имеющим молекулярную массу ниже 20 кДа, выводятся через почки, в то время как белковые конъюгаты с большими молекулярными весами удаляются из организмами другими способами: через печень, с помощью иммунной системы и протеолитическим перевариванием белковой части конъюгата [100]. Эти пути представляют собой природные механизмы выведения крупных белковых молекул с молекулярной массой более 70 кДа [22].

Различные виды ПЭГ, как модифицированные, так и нет, имеющие широкий спектр полидисперсности, использовались в прошлом, в то время как в настоящее время степень полидисперсности около 1.05 является общепринятым стандартом для ПЭГ-реагентов с молекулярной массой до кДа. Для высокомолекулярных форм приемлемо значение полидисперсности, равное 1.1, однако общая тенденция направлена на разработку ПЭГ с узким диапазоном распределения. Большой разброс молекулярных масс в составе полимера является одним из факторов, усложняющих анализ конъюгатов ПЭГ с белками. В сегодняшней практике часто используют линейные и разветвленные виды ПЭГ с молекулярной массой до 40 кДа, что приводит к ожидаемому улучшению фармакокинетических свойств белков [54, 56, 100]. Тем не менее, новые формы ПЭГ, например, раздвоенные, «многорукие» [101] и гребнеобразные [102], имеют перспективу дальнейшего применения в создании пролонгированных форм препаратов. Гребнеобразные ПЭГ содержат многочисленные короткие цепи ПЭГ, прикрепленные к остову полимера с помощью металл-опосредованной свободно-радикальной полимеризации [103], что добавляет дополнительные преимущества к плотно-упакованной структуре полимера [22].

Перспективным подходом к направленному пэгилированию является присоединение ПЭГ с дальнейшим удалением группы, связывающей его с белком [63, 104, 105]. Этот метод позволяет преодолевать инактивацию белка во время реакции пэгилирования и создавать препарат со сравнительно высокой биологической активностью, повышенной растворимостью и биодоступностью, а с помощью селекции сшивающего агента делает возможным контроль фармакокинетики [22].

Высвобождаемые ПЭГ-линкеры (или сшивающие агенты), как правило, предназначены для контролируемого высвобождения препаратов, содержащих аминогруппы [106]. Этот способ наиболее подходит для пептидов [107], небольших молекул и олигонуклеотидов. Для большей эффективности неактивная форма препарата («пропрепарат»), полученная c помощью «высвобождаемого» пэгилирования, должна быть химически или ферментативно преобразована в свою активную форму после введения в организм пациента. С этой целью Залипски и др. [108], а также Гринвальд и др.

[109, 110], создали in vivo высвобождаемые виды ПЭГ, различающиеся механизмом отщепления. Молекулы ПЭГ, разработанные группой Залипски, использовавшей пара- или орто-дисульфиды бензилуретана, подвергались расщеплению в эндосомальном пространстве клетки в довольно мягких условиях. В ПЭГах, синтезированных группой Гринвальда, использовалась система, состоящая из спейсера, содержащего инициатор или спецификатор, и ферментативно высвобождаемого линкера, присоединенного к молекуле препарата. Скорость, с которой препарат отщепляется от линкера, зависит от стерических препятствий, заданных химической структурой самого линкера [59].

Улучшенные физико-химические характеристики ПЭГ-конъюгата объясняются увеличением гидродинамического объема молекулы, что обеспечивается способностью ПЭГ координировать вокруг себя молекулы воды, а также вследствие гибкости его цепи. Цепи полимера могут разворачиваться вокруг белка для ограждения его от окружающей среды (или наоборот), но они также оказывают влияние на его взаимодействие с другими молекулами, что важно для проявления его биологических функций. Это свойство считается качественной основой для определенной разницы между активностью пэгилированных белков in vitro и in vivo. Как правило, in vitro активность после пэгилирования снижается, иногда очень существенно; тем не менее, фармакологические свойства in vivo обычно улучшаются [22, 58, 59, 63].

Поскольку большинство реакций пэгилирования проводится с участием довольно нестабильных молекул, то для проведения реакции конъюгации требуются мягкие условия, подходящие для проведения в водных растворах. В случае полипептидов наиболее распространенными для присоединения реактивными группами являются N-конец полипептидной цепи или аминогруппы лизина [74]. Первые синтезированные аналоги ПЭГ, как правило, содержали большое количество примесей, имели низкие молекулярные массы, нестабильные связи, а также не обладали ярко выраженной селективностью.

Примерами первого поколения производных ПЭГ являются: (а) ПЭГдихлортриазин [111, 112], (б) ПЭГ-трезилат [113], (в) ПЭГсукцинимидилкарбонат (СК-ПЭГ) [114, 115], (г) ПЭГ-бензотриазолилкарбонат [116], (д) ПЭГ-п-нитрофенилкарбонат [112, 117], (е) ПЭГтрихлорфенилкарбонат [112], (ж) ПЭГ-карбонилимидазол [112], (з) ПЭГсукцинимидилсукцинат (СС-ПЭГ) [112, 115, 118]. В табл. 1 и 2 приведены различные ПЭГ-производные, взаимодействующие с аминогруппами:

алкилирующие агенты сохраняют заряд нативного белка в образующемся конъюгате, в то время как при использовании ацилирующих агентов происходит его потеря. Производные ПЭГ-хлортриазина могут реагировать с несколькими нуклеофильными функциональными группами лизина, серина, тирозина, цистеина и гистидина, что приводит к удалению хлоридной группировки, и в результате образуется конъюгат с сохраненным зарядом в виде вторичного амина [119, 120]. Остаточная хлоридная группа менее восприимчива к реакции с нуклеофильными остатками. К сожалению, реакционная способность ПЭГ-хлортриазинов довольно велика, что вызывает кросс-линкинг молекул белка, содержащих дополнительные нуклеофильные остатки. Другими алкилирующими агентами, использующимися для неспецифической модификации многочисленных аминогрупп и образующими связи по вторичным аминогруппам с белками, вирусами и липосомами, является ПЭГ-трезилат (или ПЭГ-тозилат) [68, 121].

ПЭГ-трезилат наиболее специфичен по отношению к аминогруппам, чем ПЭГ-дихлортриазин, и его химические свойства хорошо изучены. Смесь полимеров, которые образуются в результате присоединения ПЭГ-трезилата к белкам, может содержать конъюгаты с легко разрушающимися связями. Для второго поколения пэгилирующих агентов были устранены следующие проблемы: загрязнение диольными производными, ограничение на использование низкомолекулярных мПЭГ, возникновение нестабильных связей, протекание побочных реакций и отсутствие избирательности к заменам.

Одним из первых представителей второго поколения ПЭГ-производных является мПЭГ-пропиональдегид [16, 68].

Алкилирующие производные ПЭГ, взаимодействующие с аминогруппами с образованием вторичных аминов с сохранением заряда белка Ацилирующие производные ПЭГ взаимодействующие с аминогруппами с образованием амидов или уретановых связей со снижением заряда белка пропорционально количеству присоединенных цепей ПЭГ мПЭГ-пропиональдегид легко синтезируется и удобен в использовании [126] по сравнению с ПЭГ-ацетальдегидом, так как ацетальдегид очень чувствителен к димеризации через альдольную конденсацию [132, 125]. Его основным свойством является то, что в кислой среде (рН около 5) его альдегидная группа высокоселективна по отношению к N-концевой аминогруппе, поскольку значение рКа -амина ниже по сравнению с другими нуклеофилами. Присоединение электрофильных видов ПЭГ к аминокислотным остаткам белков очень сильно зависит от их нуклеофильности; нуклеофильная атака происходит, только если значение рН раствора белка приблизительно равно или выше рКа самого аминокислотного остатка [68].

Взаимодействие альдегидов с первичными аминами происходит через образование оснований Шиффа, которые восстанавливаются до стабильных вторичных аминов, как показано на рис. 3. Это удобный способ конъюгации, поскольку положительный заряд аминокислоты имеет решающее значение для сохранения биологической активности белка [68].

Рис. 3. Схема образования стабильной C–N связи между мПЭГ и белком В качестве альтернативных алкилирующих агентов также могут быть использованы эпокси-ПЭГ [133], но это нереакционноспособные и, кроме того, неспецифичные агенты, поскольку в случае их применения присоединение может идти и по гидроксильным группам [68].

Большинство ПЭГ первого поколения являются ацилирующими агентами (см. табл. 2). Два из них широко используются – ПЭГ-сукцинимидилкарбонат (СК-ПЭГ) [114, 115] и ПЭГ-бензотриазолилкарбонат (БТЗ-ПЭГ) [116]. СК-ПЭГ и БТЗ-ПЭГ реагируют преимущественно с остатками лизина с образованием амидной связи, но также вступают в реакцию с гистидином и тирозином; СКПЭГ несколько более устойчив к гидролизу, чем БТЗ-ПЭГ. Другие ацилирующие ПЭГ-реагенты образуют карбаматные связи с белками – п-ПЭГнитрофенилкарбонат (пНФК-ПЭГ) [112, 117], ПЭГ-трихлорфенилкарбонат (ТХФ-ПЭГ) [112] и ПЭГ-карбонилимидазол (КБИ-ПЭГ) [112]. Эти реагенты получают путем взаимодействия хлорформиатов или карбонилимидазола с концевой гидроксильной группой мПЭГ, и их реакционная способность гораздо ниже, чем СК-ПЭГ или БТЗ-ПЭГ. Образование карбаматной связи показано на рис. 4 [68].

Рис. 4. Схема образования карбаматной (А) и амидной (Б) связей между мПЭГ и белком (Y = п-нитрофенил, трихлорфенил, бензотриазолил) Другой ПЭГ-реагент первого поколения – ПЭГ-сукцинимидилсукцинат (СС-ПЭГ) [112, 118, 128]. СС-ПЭГ образуется в ходе реакции мПЭГ с янтарным ангидридом с последующей активацией сукцинимидного эфира карбоновой кислоты. Цепи полимера содержат вторую эфирную связь, которая образуется после конъюгации с белком и очень чувствительна к гидролизу [134]. Но не только гидролиз приводит к потере фармакокинетических свойств конъюгата, но и сукцинатный «хвост», который остается на белке после гидролиза и может выступать в качестве гаптена, что в конечном счете приводит к повышению иммуногенных свойств белка [115, 135]. В целом, активированные эфиры ПЭГкарбоновых кислот – наиболее часто используемые ацилирующие агенты для модификации белков. Они взаимодействуют с первичными аминами в условиях, близких к физиологическим, с образованием стабильных амидов, как показано на рис. 4 [68, 136].

карбоксиметилированные виды ПЭГ (КМ-ПЭГ). Их сукцинимидильные реакционноспособность, что затруднило их использование в создании конъюгатов [68, 112, 137].

Для создания активированного эфира, который бы имел наиболее предпочтительный кинетический профиль для модификации белков, были использованы производные пропионовой (ПЭГ-O-[CH2]2-COOH) и масляной (ПЭГ-O-[CH2]3-COOH) кислот [132]. Изменение расстояния между активированным эфиром и остовом ПЭГ с добавлением метиленовой единицы в функциональную группу оказало сильное влияние на реакционную способность ПЭГ-реагентов по отношению к аминам. Например, СБА-ПЭГ, в структуру которого введены две дополнительные метиленовые группы, имеет большее время гидролитического полураспада, чем СПА-ПЭГ, у которого есть только одна дополнительная метиленовая группа. Кроме того, присутствие аминокислотного или пептидного участка между ПЭГ и макромолекулой дает ряд преимуществ благодаря разнообразию свойств, которые могут быть привнесены с помощью подходящей аминокислоты или пептида [138]. Среди наиболее часто используемых аминокислот особый интерес представляют норлейцин для удобства анализа пэгилированных белков [139] и метионин - для идентификации сайта пэгилирования [68, 140].

2.3.2. Линейные пэгилирующие реагенты Для образования конъюгатов с линейными ПЭГ одну или несколько линейных цепей ПЭГ с молекулярной массой от 1 до 40 кДа химически пришивают к поверхности белка (рис. 5А) [17, 141]. Пэгилирующие агенты, как правило, получают химической модификацией концевого гидроксильного остатка цепи полимера [18, 115]. За некоторыми исключениями [142, 143], в первые годы разработки методик пэгилирования в арсенале биохимиков не имелось обширного потенциала путей синтеза для получения чистых монофункциональных ПЭГ-производных с высокой молекулярной массой.

Поскольку диольная составляющая у высокомолекулярных ПЭГ может достигать 15%, первые этапы разработки модифицированных реагентов, как правило, были неэффективными из-за неизбежного кросс-линкинга [95]. Еще одним недостатком первых пэгилирующих агентов являлось отсутствие сайтспецифичности при сопряжении, что приводило к гетерогенным смесям региоизомеров. Несмотря на это, несколько модифицированных ПЭГ-препаратов получили официальное одобрение в связи с их исключительной и воспроизводимой эффективностью по сравнению с исходными молекулами [21, 23, 144].

Рис. 5. Виды молекул ПЭГ-полимеров для создания препаратов на основе ПЭГбелковых конъюгатов: А. Линейные. Б. Разветвленные. В.

Сильноразветвленные.

В настоящее время пэгилирование свободных остатков цистеина, вероятно, остается наиболее эффективной стратегией для сайт-специфичной конъюгации – в основном, с использованием малеимид- или 2-пиридилдисульфид-модифицированных полимеров (рис. 6) [79, 80, 82, 83], а также, проводя присоединение в нестационарных денатурирующих условиях [145].

Свободные остатки цистеина довольно редко встречаются у нативных полипептидов, и, поэтому, их необходимо вводить тем или иным методом белковой инженерии [144]. В случае интерферона--2a было обнаружено несколько аналогов цистеина с высокой активностью in vitro и в дальнейшем использовано для специфичного пэгилирования [22, 146, 147].

Рис. 6. Примеры сайт-направленной конъюгации ПЭГ с белками Направленная атака N-концевого остатка пептидной цепи достигается путем восстановительного аминирования с использованием пэгилирующих агентов с активной альдегидной группой, которые способны вступать в реакцию с первичными аминами белков для формирования оснований Шиффа, которые затем подвергаются восстановлению в реакционной смеси с образованием стабильных вторичных аминов [57, 126, 142]. Было установлено, что при относительно низких значениях рН (обычно ниже 6), большинство аминогрупп остатков лизина находятся в протонированном состоянии, в то время как N-концевой атом азота остается непротонированным и способен взаимодействовать с альдегидной группой ПЭГ [136, 148]. Не так давно Броккини с соавт. предложили схему реакции, в которой дисульфидные мостики сначала восстанавливаются, а затем реагируют с метокси-ПЭГ, образуя бифункциональную группу на конце цепи [83, 149]. Бис-алкилирование образующихся свободных тиолов дает впоследствии трехуглеродный мостик, к которому ковалентно присоединяется ПЭГ (см. рис. 6) [82, 144].

2.3.3. Разветвленные пэгилирующие агенты Функциональные Y-образные (вилкообразные) виды ПЭГ (рис. 5Б) в последнее время привлекают большое внимание в связи с научными отчетами об улучшенной биологической активности конъюгатов на их основе по сравнению с используемыми линейными образцами [55, 105, 150]. Было доказано, что макромолекулярная (в данном случае разветвленная) структура полимера имеет решающее значение для улучшения свойств соответствующих биоконъюгатов. По сравнению с линейными ПЭГ разветвленные модификации увеличивают устойчивость конъюгата к протеолизу и снижают его иммуногенность благодаря своей зонтикообразной форме [95, 144, 151].

2.3.4. Сильноразветвленные пэгилирующие агенты Гребнеобразные полимеры с одним сайтом присоединения представляют собой новый тип пэгилирующих агентов. Одним из таких полимеров является зарегистрированный реагент Поли-ПЭГ, в котором «зубцы» ПЭГ сшиты с метакрилатным каркасом через сложноэфирные связи (рис. 5В). Молекула Поли-ПЭГ имеет большую степень подвижности, чем линейные ПЭГ, благодаря тщательному конструированию ее структуры [144].

Наиболее часто используемые пэгилирующие агенты получают с помощью полимеризации раскрытого кольца этиленоксида, обычно взаимодействующего с алкоксид-производными соответствующих спиртов. В зависимости от выбранного метода синтеза, последующие химические трансформации приводят к образованию целевого ПЭГ, использующегося для конъюгации. Эта полимеризация открытого кольца осложняется неизбежным присутствием следов протон-содержащих группировок, которые предоставляют конкурирующие пути для взаимодействия с образованием гидроксильных групп на обоих концах цепи полимера. Кроме того, часто требуется множество дополнительных химических трансформаций для получения требуемой функциональной единицы полимера. Поскольку в любом случае невозможно получить 100%-ную гомогенную модификацию ПЭГ или разделить ее полимеры, которые отличаются только функциональными концевыми группами, то образующийся ПЭГ всегда представляет собой смесь из целевого конъюгационного агента и различных модификаций. Эти осложнения усиливаются в том случае, если молекулярная масса полимера увеличивается – из-за проблем, связанных с полимеризацией открытого кольца эпоксидов, что приводит к присоединению по различным группам. Новые поколения полимеров получают с помощью транзиционной металл-опосредованной радикальной полимеризации (ТММ LRP, часто – ATRP) [103, 152] метода, который позволяет жестко контролировать молекулярную массу полимера и его высокомолекулярную структуру по сравнению с другими методами химической полимеризации [144, 153].

ПЭГ-реагенты существуют также в форме имеющихся в продаже метакриловых мономеров различных молекулярных масс [154, 155]. Эти функциональную группу. Количество ПЭГ-хвостов можно варьировать, изменяя длину «зубцов» ПЭГ с использованием всевозможных ПЭГметакрилат-мономеров различных молекулярных масс (обычно 0,5–2 кДа).

Подобным образом, с изменением позиционного отношения мономера к инициатору, длина метакрилатного каркаса также может варьироваться. Не содержащий «зубцов» сегмент спейсера также может быть вставлен для сохранения «гребенки» как можно дальше от белка. Таким образом, полимеры могут быть адаптированы для объединения активированных концевых групп с последующей ориентацией на конкретные аминокислоты. Например, смоделированная молекула Поли-ПЭГ позволяет проводить пэгилирование с задействованием ряда активных концевых групп, таких как альдегидная, сукцинимидил-эфирная и малеимидная, которые реагируют с N-концевым амином, лизином и цистеином соответственно [144, 156].

Линейные виды ПЭГ обычно имеют одну гидроксильную концевую группу, которая может быть химически преобразована в любую другую функциональную группу, способную присоединяться к белковой цепи. Для некоторых ПЭГ также возможен вариант двух функциональных групп на обоих концах цепи, что может привести к нежелательному присоединению с образованием гибридного продукта [17]. В отличие от линейных ПЭГ метод радикальной полимеризации, использующийся для синтеза гребневидных полимеров, гарантирует, что каждая полимерная молекула содержит только одну концевую функциональную группу [157]. В настоящее время в ходе текущих исследований изучается, насколько конъюгаты на основе этих гибридных гребневидных полимеров улучшают фармакокинетический профиль, снижают иммуногенность и токсичность, и увеличивают период естественного полувыведения по сравнению с материнской молекулой белка и другими пэгилированными формами [158, 159]. Тем не менее, до сих пор открыт вопрос о биодеградации этих гребневидных полимеров и высвобождении пептида [160]. Поли-ПЭГ содержит эфирные связи, служащие коннектором между «зубцами» ПЭГ и остовом метакрилата, который должен деградировать, когда эти связи взаимодействуют с протеазами [161, 162]. Также недавно было проведено присоединение легко удаляющегося сшивающего агента (линкера) между пептидом и ПЭГ-полимером, и эта технология может быть применена к гребневидным полимерам, таким как Поли-ПЭГ [104, 144, 163].

Другие гребневидные полимеры с акрильным каркасом также находятся в процессе изучения, такие как рН-чувствительный поли[2-(диэтиламино)этилметакрилат], модифицированный боковой цепью поли(L-лизина) (ПЛ), который может применяться в качестве носителя молекул ДНК. Хотя он и не является пэгилирующим агентом, этот полимер имеет уникальные свойства, поскольку его активность сильно зависит от рН раствора [164]. Продолжением этой работы является синтез гребневидных сополимеров, состоящих из основной цепи ПЛ, ДНК-связывающего сайта, боковых цепей гиалуроновой кислоты (ГК) и клеточно-специфичных лигандов [157]. С помощью ПЛ-вшитых ГК-гребневидных сополимеров можно управлять свойствами ДНК, такими как размер, растворимость и степень упаковки. Оба этих типа гребневидных сополимера могут быть использованы для усиления направленности доставки короткой интерферирующей РНК в цитозоль. В другом исследовании Шривидия и соавт. [165] синтезировали амфифильные гребневидные полимеры с ПЭГ, пришитым к поли(диметилсилоксанам) (ПДС-ПЭГ) посредством гидросилилирования реактивных эпоксигрупп, для присоединения к белку.

Подготовленные тонкие мембраны, насыщенные БСА, пришивались к ПДСПЭГ, отчего период циркуляции высвобожденного пептида был довольно продолжительным и составлял более 72 ч. Термочувствительный поли(Nизопропилакриламид) (поли[NIPAM]) также был конъюгирован со стрептавидином, делая возможным термозависимое высвобождение при температуре тела в условиях in vivo [166, 167]. Конъюгаты также используются для проведения самосборки в гигантские амфифилы и для объединения различных свойств функциональных групп каркаса полимера при конъюгации с БСА [144, 168].

2.4. Пэгилированные биофармацевтические препараты 2.4.1. Препараты, полученные с помощью неспецифического Первые пэгилированные фармацевтические препараты «Адаген» (ПЭГадемаза) и «Онкаспар» (ПЭГ-аспарагиназа, ПЭГ-аспаргаза) на самом деле представляли собой сложные смеси различных пэгилированных изомеров [22, 54]. Было доказано, что воздействие препарата ПЭГ-адемазы на организм переливаниями крови, которые использовались в качестве стандартной терапии [169]. ПЭГ-аспаргаза служит для лечения различных видов лейкемии и разрешения проблемы нейтрализующих антител, связанных с использованием нативной аспарагиназы [22, 170].

Однако впоследствии были зарегистрированы фармацевтические препараты, «Пегинтрон» и «Пегасис», полученные ненаправленным пэгилированием. Оба препарата представляют собой смеси монопэгилированных позиционных изомеров, содержащих линейную цепь 12 кДа ПЭГ, связанную с различными сайтами интерферона--2b - в случае «Пегинтрона» [171], и разветвленную 40 кДа цепь ПЭГ, связанную главным образом с четырьмя лизиновыми остатками интерферона--2a - в случае «Пегасиса» [22, 172].

препаратом, произведенным методом неспецифического пэгилирования, является ПЭГ-висомант («Сомаверт»), который был зарегистрирован в функционирования в качестве антагониста рецептора гормона роста человека (Р-ГРЧ) путем замены некоторых аминокислот в основной цепи ГРЧ.

Модификации включают в себя несколько мутаций белка и конъюгацию с 4- цепями молекулы ПЭГ (5 кДа) на одну молекулу белка [22, 173].

Также «Мирцера», которая была утверждена FDA в 2007 году, представляет собой смесь моно-пэгилированных конъюгатов эритропоэтина с 30 кДа ПЭГ, присоединенным к остаткам лизина (в основном Lys52 и Lys45) или к N-концевой аминокислоте белка [22, 174].

2.4.2. Препараты, полученные с помощью сайт-направленного (сайтспецифичного) пэгилирования Одной из перспективных групп белков для цистеин-направленного пэгилирования являются Fab'-фрагменты. Пэгилирование стало идеальным методом для снижения их антигенности и продления периода циркуляции в организме [175, 176]. Тем не менее, главным преимуществом использования пэгилированных Fab`-фрагментов вместо целых антител является устранение нежелательных побочных эффектов, вызванных Fc-регионом [177]. Остатки цистеинов в шарнирной области Fab'-фрагментов, находящиеся на большом расстоянии от антиген-связывающей области, представляют возможность проведения специфического присоединения, приводящего к образованию продукта с четко заданными свойствами. Наиболее ярким примером этого подхода стал препарат «Кимзия», пэгилированный Fab'-фрагмент человеческого анти-ФНО--моноклонального антитела, направленно присоединенного к 40 кДа разветвленному ПЭГ по свободному цистеину [178].

Недавно было описано, что эффективность пэгилирования Fab'-фрагментов может быть существенно усилена введением в реакцию дисульфидной связи после ее химического восстановления. Финальный же Fab'-ПЭГ конъюгат не содержит дисульфидной связи. Такие молекулы, хотя и без ковалентных связей между обеими цепями антитела, сохраняют очень высокий уровень химической и термической стабильности, привычные фармакокинетические показатели и свойственную биологическую активность [22, 179].

Новым подходом к пэгилированию дисульфидных связей белков стали методы, использующие специальные ПЭГ-моносульфоновые реагенты [83, 176]. С помощью сайт-направленного бис-алкилирования двух атомов серы в нативной дисульфидной связи сшивающий агент ПЭГ взаимодействует с дисульфидной связью и формирует трехуглеродный пэгилированный мостик [82, 149].

Недавно были опубликованы результаты по пэгилированию с использованием аффинных маркеров гистидина в качестве мишеней для присоединения ПЭГ [33, 180]. Учитывая, что аффинные маркеры гистидина являются одними из наиболее часто используемых инструментов для создания простой и быстрой методики очистки рекомбинантных белков, данный подход несет в себе определенный потенциал для последующего применения [22, 181].

Пэгилирование с участием ненативных аминокислот требует генетических манипуляций с последовательностью белка и предусматривает возможность включения ненативных аминокислот в последовательность организма-хозяина (так называемая, технология «Amber»), которые также могут быть направленно присоединены к соответствующим ПЭГ-реагентам [22, 182, 183].

Большой интерес представляют азидо- и этинил-производные серина, первые – полученные в ходе реакции образования триазола с помощью циклического присоединения алкина, поскольку они способны реагировать с соответствующими этинил-ПЭГ или азидо-ПЭГ реагентами [22, 184].

Благодаря применению технологии «Amber», была получена монопэгилированная молекула ГРЧ с улучшенными фармакологическими характеристиками [185]. Фазы I и II клинических исследований показали, что пролонгированные формы ГРЧ стабилизируют уровень инсулиноподобного фактора роста I (ИФР-I), обеспечивая при этом безопасность и переносимость у взрослых с дефицитом гормона роста [22, 186].

Вместо осуществления традиционной процедуры реакции конъюгации химическим способом, для достижения направленного пэгилирования также могут быть использованы ферменты. Например, трансглутаминаза способна катализировать присоединение ПЭГ-алкиламина к глутаминовой кислоте белков, которая может быть как нативной, так и генетически введенной [187].

Реакция имеет высокую степень специфичности, поскольку модифицируются только те остатки глутаминовой кислоты, которые окружены гибкими или развернутыми регионами [188]. Более перспективным также представляется двухшаговое ферментное гликопэгилирование, которое позволяет проводить Исходными молекулами являются негликозилированные рекомбинантные полипептиды, полученные из Escherichia coli. Белки должны содержать один сайт О-гликозилирования, в котором серин или треонин функционируют как акцепторы для селективного присоединения N-ацетилгалактозамина (NAcGal) к рекомбинантному ферменту – O-NAcGal-трансферазе [190]. На следующем этапе гликозилированный белок пэгилируется по O-NAcGal с помощью ПЭГцитидинмонофосфат-производных сиаловой кислоты с использованием другого рекомбинантного фермента, сиалилтрансферазы [191]. На сегодняшний день эта методика была протестирована на различных фармацевтических белках, в том числе на Г-КСФ [22].

3. Пэгилированный гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (ПЭГ-Г-КСФ) 3.1. Краткое описание препарата ПЭГ-Г-КСФ Ковалентное присоединение цепи полиэтиленгликоля (ПЭГ) к Nконцевому метионину филграстима посредством восстановительного алкилирования приводит к образованию ПЭГ-филграстима. ПЭГ-филграстим является пролонгированной формой филграстима, требующей только одной инъекции препарата за весь курс лечения, направленного на устранение последствий химиотерапии, в том числе нейтропении. Ковалентное присоединение ПЭГ к N-концевой аминогруппе материнской молекулы достигается с помощью сайт-направленного восстановительного алкилирования. Пэгилирование увеличивает размер молекулы филграстима настолько, что она становится слишком большой для почечного выведения (клиренса). Следовательно, нейтрофил-опосредованный клиренс является преимущественным путем выведения препарата. Таким образом, средний период естественного полувыведения препарата ПЭГ-филграстима увеличивается до 42 ч, по сравнению с 3.5–3.8 ч для филграстима, хотя на самом деле этот параметр непостоянен и зависит от абсолютного числа нейтрофилов, который, в свою очередь, отражает способность препарата поддерживать производство этих же клеток [12].

ПЭГ-филграстим сохраняет первоначальную биологическую активность рчГ-КСФ и связывается с тем же рецептором, стимулируя пролиферацию, дифференциацию и активацию нейтрофилов. Одноразовое за весь цикл продолжительность тяжелой формы нейтропении, при этом сохраняя результаты ежедневного применения неконъюгированного препарата. В ходе клинических испытаний у пациентов, получающих ПЭГ-филграстим, частота возникновения фебрильной нейтропении снижалась, по сравнению с пациентами, получающими филграстим [12].

3.2. Пэгилирование рчГ-КСФ алкилирования белков с линейными, монофункциональными метокси-ПЭГальдегидами нескольких молекулярных масс. Некоторые из них отбирают по результатам тестов in vivo и in vitro.

На сегодняшний день описано множество методик пэгилирования рчГКСФ для получения N-концевых пэгилированных производных цитокинов.

Согласно наиболее часто применяемой из них [136] к охлажденному раствору рчГ-КСФ (5 мг/мл) в буферной системе, содержащей 100 мМ ацетата натрия, рН 5.0 и 20 mM цианоборгидрида натрия добавляют раствор, содержащий пятимолярный избыток мПЭГ-альдегида. Реакционную смесь подвергают постоянному перемешиванию при тех же условиях. Пример схемы данной реакции пэгилирования рчГ-КСФ приведен на рис. 7. Также недавно была описана масштабированная, более технологичная методика пэгилирования рчГКСФ по -концевой аминогруппе с сокращенным количеством, взятого в реакцию ПЭГ-альдегидом [192].

Рис. 7. Схема реакции пэгилирования рчГ-КСФ по -аминогруппе N-концевого метионина Степень модификации белка контролируется методом ВЭЖХ на колонке Bio-Sil SEC 250-5 «Bio-Rad» с подвижной фазой, содержащей 100 мМ натрия фосфата, 150 мМ хлорида натрия, 10 мМ азида натрия рН 6.8 при скорости потока 1 мл/мин [136]. После 10 часов инкубации, согласно ВЭЖХ анализу примерно 92 % белка специфично присоединяется к моно-метокси-ПЭГ.

Мономер ПЭГ-Г-КСФ был выделен с помощью ионообменной хроматографии на сорбенте SP Sepharose, уравновешенной в буферной системе 20 мМ ацетат натрия рН 4.0 с последующим затем линейным градиентом 0–1M NaCl [136].

Различные мономеры ПЭГ-Г-КСФ были получены аналогичным образом с использованием селективного отбора мПЭГ-альдегидов различных молекулярных весов (между 12 и 30 кДа).

Рис. 8. Трехмерная модель молекулы ПЭГ-Г-КСФ Расположение присоединенной ПЭГ-субъединицы в пространственной структуре полученной молекулы было определено методом эндопротеиназного пептидного картирования. Дополнительные результаты с использованием различных методов характеристики физико-химических свойств белка (ультрацентрифугирование, MALDI-TOF-MS, ВЭЖХ на гель-фильтрационных колонках с он-лайн контролем под несколькими ракурсами рассеяния лазерного света) подтвердили прогнозируемый состав и структуру этих конъюгатов, а именно, что одна линейная макромолекула ПЭГ присоединяется к N-концевому остатку белковой последовательности (рис. 8) [136].

Поскольку в результате реакции пэгилирования белков, как правило, образуются очень специфические молекулы конъюгатов, то на практике нельзя выработать общий подход для процессов, как конъюгации, так и их очистки [70, 193].

Наиболее часто применяемый для очистки пэгилированных белков метод катионообменной хроматографии используется благодаря сродству к аминогруппам ПЭГ-конъюгата [194]. Ультрафильтрация и диализ используются редко и в основном для установления требуемой концентрации или перевода в другую буферную систему, а не для разделения нативной и пэгилированной форм белка [69, 195]. Гидрофобная хроматография ПЭГ-модифицированных белков ещё до конца не изучена, принимая во внимание тот факт, что модификация воздействует на гидрофобность белка, уменьшая или увеличивая ее в зависимости от его структуры [58, 70]. Обращённо-фазовая хроматография применяется в основном в промышленном производстве для анализа реакционной смеси на примеси. Аффинная хроматография задействует довольно дорогостоящие материалы и не может быть использована в промышленных масштабах [70]. Гельфильтрация также может быть использована для разделения пэгилированных изоформ, но имеет очень низкую производительность в промышленных масштабах [196], и ее эффективность сильно зависит от молекулярных масс разделяемых белков [60].

В настоящий момент в литературе описана только одна полная схема очистки ПЭГ-Г-КСФ, разработанная на основе схемы очистки рчГ-КСФ и состоящая из четырех основных стадий [197]: ионообменной хроматографии на SP Sepharose FF при значении рН 6.0, позволяющей очистить рчГ-КСФ от клеточных примесей и сконцентрировать выше 10 мг/мл для проведения реакции конъюгации c -метил-ПЭГ-пропиональдегидом [192], гидрофобной хроматографии на Butyl Sepharose 4 FF, позволяющей удалить из препарата белки E. coli, родственные примеси и непрореагировавший рчГ-КСФ, и хроматографии на SP Sepharose FF в ацетатном буфере при значении рН 4.5 для очистки препарата от эндотоксинов, и позволяющей сконцентрировать белок до значения 13 мг/мл перед стадией гель-фильтрации на сорбенте Sephadex G-25 Fine при рН 4.0 [197].

3.3. Доклинические и клинические испытания ПЭГ-Г-КСФ Привычная лечебная практика для онкологических больных, проходящих курс химиотерапии, начинается с ежедневной дозировки филграстима на следующий день после начала химиотерапии и продолжается до достижения безопасного уровня нейтрофилов в сыворотке крови – около нейтрофилов/мл [198]. В доклинических испытаниях на животных было показано, что разовая доза филграстима, независимо от ее количества, не может заменить повторного ежедневного введения из-за короткого периода полувыведения циркулирующего белка [199]. Пэгилированные производные филграстима в испытаниях in vivo на мышах почти без исключений проявили пролонгированную активность молекулы, увеличивая абсолютное число нейтрофилов (АЧН) гораздо сильнее, чем немодифицированная молекула.

Окончательный выбор кандидата, включающий в себя 20 кДа молекулу ПЭГ, основывался на пролонгированной in vivo-активности по сравнению с низкой активностью in vitro и такими факторами, как доступность субстрата, выход и устойчивость процесса [70]. ПЭГ-филграстим имеет аналогичные фармакодинамическое и биологическое воздействие на нейтрофилы как и филграстим, стимулируя выработку и созревание прекурсоров нейтрофилов, а также повышение активности зрелых нейтрофилов с помощью тех же механизмов, что и филграстим [200]. Доклинические исследования показали, что ожидаемые свойства новой формы достигнуты моделированием параметров, описанных выше, – сравнимого профиля безопасности и пролонгированной, с возможностью контроля уровня нейтрофилов фармакокинетикой [12].

Первая фаза клинических испытаний прошла без осложнений на здоровых добровольцах и была отмечена поялением нейтрофилии и небывалой мобилизацией клеток-предшественников в периферической крови [201]. Во второй фазе исследований на больных раком легких сравнивали действие одноразовой дозы ПЭГ-филграстима за весь цикл химиотерапии с ежедневным введением филграстима; обе схемы вызвали быстрый рост АЧН, хотя, как и было спрогнозировано, исходя из доклинических исследований и первой фазы клинических испытаний, продолжительность иммунного ответа была больше у пациентов, получающих ПЭГ-филграстим [202]. Кроме того, период циркуляции ПЭГ-филграстима был больше, чем у филграстима даже в отсутствии нейтрофилов [12].

После второй фазы клинических испытаний, течение которых полностью совпало с прогнозируемыми результатами, были проведены два рандомных этапа третьей фазы с одноразовым введением ПЭГ-филграстима больным раком молочной железы, получающим доксорубицин (60 мг/м2) и доцетаксел исследований была продолжительность тяжелой нейтропении (в дни с АЧН ниже 0.5109/л). В испытаниях было использовано несколько различных методов расчета дозировки. В одном из исследований ПЭГ-филграстим вводили, исходя из массы тела больного (100 мкг/кг на 1 цикл), в то время как во втором пациенты получали фиксированную дозу – 6 мг ПЭГ-филграстима. В обоих исследованиях в качестве контроля использовали стандартные инъекции филграстима 5 мкг/кг в день, который дозировался стандартным образом – начиная с 24 часов после начала химиотерапии до АЧН больше чем 10109/л или на срок до 14 дней [12, 203, 204].

В испытаниях на основании веса больных средняя продолжительность тяжелой нейтропении в цикле 1 была одинаковой как в случае группы, получающей ПЭГ-филграстим, так и филграстим (1.7 дня против 1.8±0.5), и сопоставима в последующих циклах для каждой группы лечения, хотя, как правило, короче в группе ПЭГ-филграстима. Исследования на основе фиксированных доз также проявили одинаковую эффективность у пациентов, получавших как ПЭГ-филграстим, так и филграстим [204]. Среди 77 пациентов в группе ПЭГ-филграстима и 75 пациентов в группе филграстима средняя продолжительность тяжелой нейтропении в течение цикла 1 составляла 1.8 и 1.6 дней соответственно. ПЭГ-филграстим имел сопоставимую эффективность с ежедневными дозами филграстима независимо от массы тела пациентов при введении 6 мг фиксированной дозы. Фиксированные дозировки были частью ожидаемого профиля и были более эффективны засчет снижения возможности ошибок и значительному упрощению лечения. Восстановление АЧН у пациентов в группе ПЭГ-филграстима было сравнимо с тем же показателем у пациентов, которые получали филграстим, но без отклонений, связанных с ежедневными инъекциями филграстима. Имеют ли эти отклонения какое-либо биологическое значение – остается неясным. Это отразил опыт доклинических исследований, в которых частый забор крови позволил подробнее продемонстрировать суточное колебание АЧН и влияние ежедневного дозирования филграстима на протекание цикла химиотерапии [201]. Возможно предположить, что отсутствие ПЭГ-филграстима в сыворотке крови и АЧН после терапии с использованием пролонгированной формы может иметь профилактическое преимущество, остается определить, является ли соответствующее АЧН полезным параметром; например, где аккумулируются нейтрофилы, когда они не циркулируют – просто мигрируют в отдаленные области клеток или безвозвратно теряются [12].

сопровождающаяся температурой более 38.2°С), как правило, связана с серьезными инфекциями и зачастую требует госпитализации и введения антибактериальных средств [205]. В дополнение к угрозе для жизни пациента и потенциальной задержке дозированной химиотерапии лечение фебрильной нейтропении само по себе может оказывать негативное влияние на качество жизни пациентов в связи с необходимостью госпитализации и внутривенной антиинфекционной терапией. Фебрильная нейтропения была определена как предельно допустимый параметр на обоих этапах третьей фазы клинических испытаний. На этих этапах (в зависимости от веса пациентов и на основе фиксированных доз) появление фебрильной нейтропении при применении ПЭГ-филграстима было ниже на каждом цикле по сравнению с филграстимом (18% против 9% и 13% против 20% соответственно) [203, 204]. Комбинируя данные из двух типов испытаний (включая большое количество находящихся в лечении и контрольных больных), частота возникновения фебрильной нейтропении была значительно уменьшена в случае пациентов, получающих ПЭГ-филграстим, по сравнению с теми, кто получал филграстим (11% против 19%). Кроме того, продолжительность периодов фебрильной нейтропении значительно короче в случае применения ПЭГ-филграстима, в результате чего значительно снижается тенденция риска госпитализации и использования внутривенных антибактериальных средств [12].

Переносимость ПЭГ-филграстима и филграстима была одинаковой на обоих этапах третьей фазы клинических испытаний. Слабая или умеренно сильная боль в костях была описана как единственный побочный эффект, связанный с лечением (25% против 26%) [203, 204]. Также было показано, что ПЭГ-филграстим во второй фазе испытаний на основании веса пациентов имел удовлетворительные результаты по сравнению с применением филграстима на пациентах с лимфомой типа Нон-Ходжкинс, а также с лимфомой типа Ходжкинс, получающих ESHAP-химиотерапию (этопозид, метилпреднизолон, цисплатин и цитарабин) [12, 206].

Пэгилирование филграстима замедляет выведение материнской молекулы белка, не влияя на его биологическую активность. Одиночные инъекции ПЭГфилграстима за весь цикл химиотерапии оказались не менее эффективны, чем ежедневное введение филграстима в целях снижении продолжительности и частоты возникновения тяжелой нейтропенией. Улучшенный график введения ПЭГ-филграстима может иметь преимущества перед введением филграстима с точки зрения соблюдения режима, простоты и улучшения качества жизни пациентов [207]. В результате тщательного изучения конструктивных параметров пролонгированной формы, ее преимущества были признаны выигрышными, несмотря на то, что ПЭГ-филграстим, как и филграстим, имеют схожие профили побочных эффектов [12, 202].

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ