«ОСОБЕННОСТИ ВЛИЯНИЯ АБИОТИЧЕСКИХ И БИОТИЧЕСКОГО ФАКТОРОВ НА РЕПРОДУКТИВНУЮ СИСТЕМУ РАСТЕНИЙ ТОМАТА LYCOPERSICON ESCULENTUM MILL. ...»

Российская академия сельскохозяйственных наук

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ

БИОЛОГИЧЕСКОЙ ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ

(ГНУ ВНИИБЗР Россельхозакадемии)

На правах рукописи

ХОХЛОВА Анна Александровна

ОСОБЕННОСТИ ВЛИЯНИЯ АБИОТИЧЕСКИХ И БИОТИЧЕСКОГО

ФАКТОРОВ НА РЕПРОДУКТИВНУЮ СИСТЕМУ РАСТЕНИЙ

ТОМАТА LYCOPERSICON ESCULENTUM MILL.

Специальность: 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор биол. наук, профессор, академик РАН и РАСХН А.А. Жученко Краснодар –

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ…………………………………………………………..

ХАРАКТЕРИСТИКА РАСТЕНИЯ ТОМАТА

(ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)……………………………………………..… Классификация и характеристика томатов……………..…… 1.1 Мейотическая рекомбинация и ее значение в селекции на 1. примере растений томата……………………………………… Влияние абиотических факторов на репродуктивную 1. систему растений томата……………………………………… Влияние биотического фактора на репродуктивную систему 1. растений томата………………………………………………..

МАТЕРИАЛ, МЕТОДИКИ И УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ

ИССЛЕДОВАНИЙ…………………………………………… Характеристика исследуемого материала………………..… 2.1 Условия проведения опыта………………..…….……….…… 2.2 Схема гибридизации………………………………………..….

2.3 Индуцированный биотический фактор ВТМ………….….....

2.4 Методика инокуляции растений томата ВТМ………..…..… 2.5 Методика морфологического описания растений….……......

2.6 Методика определения фертильности и жизнеспособности 2. пыльцевых зерен растений томата…………………….…….. Методика определения количества пыльцевых зерен в цветке 2. растения томата………………………………………… Метод электронной микроскопии……………………………..

2.9 2.10 Методика определения количества ДНК………………….….. 2.11 Методы статистического анализа экспериментальных данных……………………………………………………………

ХАРАКТЕРИСТИКА МУЖСКОГО ГАМЕТОФИТА У

ГИБРИДОВ РАСТЕНИЙ ТОМАТА ПОД

F

ВОЗДЕЙСТВИЕМ АБИОТИЧЕСКИХ И БИОТИЧЕСКОГО

ФАКТОРОВ…………………………………………………….. Морфологическая изменчивость гибридов F1 растений 3. томата под воздействием абиотических и биотического факторов …………………………………………………..……. Фертильность и жизнеспособность мужского гаметофита у 3. гибридов растений томата под воздействием F абиотических и биотического факторов…………………..…. Количества пыльцевых зерен у гибридов F1 растений томата 3. под воздействием абиотических и биотического факторов.... Классификация генотипов подвергнутых влиянию разных 3.

ВЛИЯНИЕ ВТМ НА ПЫЛЬЦЕВОЕ ЗЕРНО ГИБРИДОВ F

Влияние вируса табачной мозаики на пыльцевые зерна 4. 4. количество ДНК в пыльцевом зерне растения томата……..…

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Основные районы промышленного возделывания томата в России – Краснодарский и Ставропольский края, Ростовская область, Нижнее Поволжье. Особенно много выращивают в Молдове, на Украине, в Узбекистане, Азербайджане, в Средней Азии [Авдеев и др., 2008].

Томат, по данным ФАО [2012], занимает первое место в мире среди овощных культур (6 млн. га), в том числе и в защищенном грунте (60 % всей площади). Больше всего площадей в Китае – 1089 тыс. га (25 млн. тонн), в Индии – 620 тыс. га (8,2 млн. тонн), Турции – 325 тыс. га (10 млн. тонн), Египте – 190 тыс. га (7,2 млн. тонн), США – 177 тыс. га (12 млн. тонн). Всего в 2012 году в мире произведено 110,5 млн. тонн томатов, из которых перерабатывается 27 млн. тонн. Россия стоит на 6-ом месте по площади и на 11-ом по производству.

Для производства экологичной продукции данной культуры требуется соблюдение нескольких факторов: технологии производства, сортового разнообразия, средовых условий и устойчивости к эпифитотиям. На данный момент экологическим факторам уделяется второстепенное значение, хотя задачи экологизации производства постоянно декларируются в документах правительства. В наше время, когда воздух, вода и земля загрязнены продуктами жизнедеятельности человека и экологическая обстановка несмотря на все усилия человечества продолжает ухудшаться, люди все больше и больше начинают задумываться о своем здоровье [Жученко, 2001;

2009]. С каждым годом увеличивается число выявленных вирусов, заражение которыми вызывает ощутимые потери урожая и заметно ухудшает качество сельскохозяйственной продукции. В южных районах нашей страны поражаемость растений Tobacco mosaic tobaco virus – вирус табачной мозаики (ВТМ) повсеместно снижает урожайность плодов томата в 1,3-1, раза и более [Авдеев, 2004].

генотипов растений томата включающие: культурные, полукультурные сорта, дикорастущие и мутантные формы, и т.д. Это позволяет расширить спектр генетической изменчивости, а так же даёт возможность получение нетрадиционных форм растений томата с хозяйственно-ценными признаками. Так же наладить производство экологичной овощной продукции, путем создания новых устойчивых гибридов растений томата к вирусным болезням.

морфологического и генетического потенциала гибридного материала растений томата под воздействием абиотических и биотического факторов по качественным и количественным признакам.

Для достижения этой цели поставлены следующие задачи:

Получить гибриды между культурными сортами, дикорастущими видами и мутантными формами растений томата.

Изучить морфологические особенности генотипов растений томата под воздействием абиотических и биотического факторов.

Провести пыльцевой анализ качества и количества пыльцевых зерен у гибридов F1 растений томата.

Установить характер проникновения ВТМ в растительную клетку с помощью метода электронной микроскопии.

содержание ДНК ядре гибридных растений томата, пораженных ВТМ.

Научная новизна работы. В условиях Краснодарского края впервые получены гибридные формы растений культурного томата с дикорастущими видами (L. hirsutum var. glabratum C.H. Mull. и L. esculentum var. racemigerum (Lange) Brezh.) и мутантными формами (Mo 393; Mo 628; Mo 755). В результате внутри и межвидовой гибридизации получено 16 гибридных комбинаций между культурными сортами, дикорастущими видами и мутантными формами растений томата.

Проведена морфологическая идентификация гибридного материла по типу куста, длине междоузлия, высоте растений, типу соцветия, проценту пораженности ВТМ, размеру и окраске цветка, формы и окраске плода.

Впервые выявлен характер действия абиотических факторов, таких как температура и удобрения, а также биотического фактора поражение ВТМ, на характеристики репродуктивной системы гибридных форм растений томата.

Получены данные о фертильности, жизнеспособности и количестве пыльцевых зерен у 16 гибридных комбинаций растений томата.

Впервые предпринята попытка установить характер действия ВТМ на компоненты растительной клетки на основе данных методов электронной микроскопии и цитофотометрии.

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты исследований являются вкладом в изучение репродуктивной системы гибридных комбинаций растений томата, содержащих чужеродный генетический материал данных гибридных форм томата, подвергшиеся действию различных доз минерального удобрения, температур и действию ВТМ.

Изучены особенности формирования репродуктивной системы растений томата под воздействием абиотических и биотического факторов Проведен пыльцевой анализ 16 гибридных комбинаций, выявлена зависимость действия указанных факторов на качественные и количественные характеристики пыльцевого зерна, что дало возможность использовать пыльцевой тест как маркерную систему отбора генотипов, устойчивых к действию абиотических и биотического факторов.

Метод электронной микроскопии позволил установить характер действия ВТМ на растительную клетку, а метод цитофотометрии позволил установить количественное содержание ДНК в ядре клетки пораженного растения ВТМ.

Методы, использованные в работе, могут быть востребованы для проведения идентификационных работ по выявлению действия ВТМ на растительную клетку.

В результате проведенных исследований созданы уникальные гибридные комбинации межвидовых и внутривидовых форм растений томата. Собран иллюстративный материал и коллекция фотообразов пыльцевых зерен гибридных комбинаций растений томата, подвергшихся влиянию абиотических и биотического факторов.

Материалы диссертационной работы используются в Кубанском государственном аграрном университете при преподавании дисциплин «Цитология» и «Генетический мониторинг» для студентов и магистров агрономического факультета и факультета экологии.

Методология и методы исследования. В работе использованы дикие виды, мутантные формы, культурные сорта растений томата, взятые из генетической коллекции ГНУ ВНИИБЗР, созданной академиком РАСХН и РАН А.А. Жученко, а также 16 гибридных комбинаций, полученных непосредственно автором в период 2008-2011 гг. При создании гибридных комбинаций использовалась стандартная методика гибридизации. Пыльцевой анализ гибридных комбинаций растений томата проводили по общепринятым методикам. Исследования с помощью методов электронной микроскопии и цитофотометрии были проведены на базе ВНИИСБ (г.

Москва) по модифицированным методикам для данных растительных объектов.

Основные положения, выносимые на защиту.

Гибридные формы, с чужеродными геномами дикорастущих видов растений томата, характеризуются устойчивостью к ВТМ по сравнению с другими гибридными комбинациями.

Абиотические факторы, представленные различными дозами удобрений и температур, оказывают достоверное влияние на фертильность, жизнеспособность и количество пыльцевых зерен у всех исследуемых генотипов растений томата.

Гибридные комбинации F1 растений томата, пораженные ВТМ, качественно различаются по гетерогенности, жизнеспособности и количеству пыльцевых зерен.

Биотический фактор, представленный вирусом табачной мозаики, оказывает влияние растительную клетку, меняет структуру пыльцевого зерна, деформирует ее и вызывает изменение количества ДНК в ядре клетки.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на:

Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Молодые ученые агропромышленного комплекса Поволжья»

(г. Саратов, 2010); Международной конференции молодых ученых и специалистов, посвященной 145-летию РГАУ – МСХА имени К.А.

Тимирязева (г. Москва, 2010); 6-ой Международной научно-практической конференции «Биологическая защита растений как основа экологического земледелия и фитосанитарной стабилизации агроэкосистем» (г. Краснодар, 2010); Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Конкурентоспособная научная продукция – АПК России» (г. Казань, 2011);

Международной научно-практической конференции «Современные мировые тенденции в производстве и применение биологических и экологически малоопасных средств защиты растений «Биологическая защита растений основа стабилизации агроэкосистем» (г. Краснодар, 2012); Международной научно-практической конференции «Наука и образование» и XXI веке»

(г. Москва, 2013).

Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ, в т.ч. 2 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура работы.

Работа изложена на 116 страницах машинописного текста, включает 17 таблиц, 31 рисунка. Состоит из:

введения, четырех глав с описанием современного состояния проблемы на основании источников литературы, описанием исходного материала и методов, используемых при решении поставленных задач, экспериментальных результатов и их обсуждения, выводов, рекомендаций для селекционной практики. Список литературы включает 225 источника, в том числе 79 на иностранном языке.

Личный вклад автора. Автор непосредственно осуществил большую часть лабораторных опытов и исследований в камере искусственного климата и открытом грунте, а также в ходе работ с коллегами лаборатории «Изучение и поддержание генетической коллекции томата» ГНУ ВНИИБЗР (г. Краснодар). Часть результатов получена во время совместной работы с сотрудниками ГНУ ВНИИСБ (г. Москва).

Автор выражает большую благодарность научному руководителю и учителю академику РАН и РАСХН, д.б.н., профессору А.А. Жученко, признательность куратору лаборатории д.с.-х.н. Н.И. Бочарниковой за ценные советы при обсуждении полученных результатов и содействие в выполнении данной работы; директору ГНУ ВНИИ биологической защиты растений академику РАСХН В.Д. Надыкта, руководителю лаборатории «Изучение и поддержание генетической коллекции томата» к.с.-х.н.

Н.А. Щербакову, сотрудникам, а также д.б.н. В.Ю. Полякову, к.б.н.

И.А. Чабан, к.б.н. Н.В. Кононенко (ГНУ ВНИИ сельскохозяйственной биологии) за совместные исследования и обсуждение результатов работы.

1 ХАРАКТЕРИСТИКА РАСТЕНИЯ ТОМАТА

Классификация и характеристика томатов Томат – Lycopersicon esculentum (Tourn.) Mill., как один из лучших моделей для цитологических исследований, принадлежит к царству растений отдела покрытосеменные (Angiospermae), классу двудольные (Dicotyledones), семейству пасленовые (Solanaceae), к роду Lycopersicon и виду Lycopersicon esculentum (Tourn.) Mill. Родина томата тропические районы южной центральной Америки. В Европу томат был завезен в XVI веке. В России его начали выращивать как овощное растение в XVIII веке [Матвеев и др., 1985;

Тахтаджян, 1987].

Ежегодное производство томатов в мире по данным ФАО [2012] составляет около 70 млн. тонн, а выращиваются они на площади более 2, млн. га при средней урожайности 23,5 тонн с 1 га. Ежегодная площадь под томатом в Российской Федерации составляет более 147 тыс. га при средней урожайности 2,13 тонн.

На данный момент существует несколько классификаций растений томата. В России считается традиционной классификация Д.Д. Брежнева [1964], которым в роде Lycopersicon было выделено три вида: перуанский томат, волосистый и обыкновенный томат.

К первому типу относится Lycopersicon peruvianum Mill. – многолетнее, стелющееся растение, с небольшим, тонким стеблем, относительно густоопушенным. Волоски короткие, нежелезистые, желтоватые. Листья небольшие 4-9 см длиной, 2-4 см шириной, перистые, конечная доля крупнее.

Длина соцветия от 3 до 10 см, количество цветков в соцветии 6-12 штук оранжево-желтого цвета, диаметром 1,0-1,3 см. Плоды: диаметром 1-2 см, шаровидной или сдавленно-округлой формы, светло зеленой окраски с бледно-лиловыми полосками, покрытые мелкими волоскам, несъедобные.

Родина северные районы Чили и Перу.

Ко второму типу относится Lycopersicon hirsutum Humb. et Bonp. – однолетние или многолетние растение, со стеблем густо покрытым жесткими волосками. Листья крупные, длиной 25–30 см, шириной 10–12 см, узкие, овальной формы, густо покрыты короткими волосками. Простое или вилкообразное соцветие среднего размера, длиною 15 см, также покрытое волосками. На каждом соцветии 10–15 цветков, желтого цвета. Плоды мелкие, диаметром 1,5–2,5 см, зеленовато-белой окраски с красными полосами, покрыты грубыми волосками. Этот вид обитает в горных районах Анд, на высоте 2200–2500 м.

Третий тип – Lycopersicon esculentum Mill. Однолетние растение с восходящим, полегающим или прямостоячим стеблем. Листья гладкие или морщинистые, непарноперисто-рассеченные, от светло-зеленого до темнозеленого цвета. Соцветие простое или сложное с мелкими, средними или крупными цветками. Плоды бывают: шаровидной, плоско - округлой или, удлиненной формы. Поверхность плода гладкая или покрытая желобками, или ребрами красного, малинового, оранжевого, желтого или белого цвета, глянцевые или матовые [Брежнев, 1964].

Наиболее широко распространен вид Lycopersicon esculentum Mill., благодаря своей ценности как сельскохозяйственной культуры. В пределах вида Lycopersicon esculentum Mill. выделено три подвида:

subsp. pimpinellifollium Brezh., дикий томат, с двумя разновидностями:

а) смородиновый томат (eupimpinellifollium);

б) кистевидный томат (racemigerum);

subsp. subspontaneum Brezh., разновидностями:

а) вишневидный томат (cerasiforme);

б) грушевидный томат (pyriforme);

в) сливовидный томат (pruniforme);

г) удлиненный томат (elongatum);

д) многогнездный томат (succenturiatum);

subsp. cultum Brezh., культурный томат, с тремя разновидностями:

а) обыкновенный (vulgare);

б) штамбовый (validum);

в) крупнолистный (grandifolium).

Полной классификацией рода Lycopersicon является классификация американского профессора C.M. Rick, описавшего 9 видов томатов:

Lycopersicon chilense Dunal;

Lycopersicon chmielewskii C.M. Rick, Kesicki, Fobes & M. Holle;

Lycopersicon cheesmanii L. Riley;

Lycopersicon esculentum Mill.;

Lycopersicon hirsutum Humb. et Bonp.;

Lycopersicon parviflorum C.M. Rick, Kesicki, Fobes and M. Holle;

Lycopersicon pennellii Correll.;

Lycopersicon peruvianum Mill.;

Lycopersicon pimpinellifolium (Mill.) Brezh. [Rick, 1959].

Выделенные виды растений томата характеризуются определенными морфологическими признаками и биологическими свойствами.

Одной из морфологических особенностей у растений томата является стебель, который в начале развития мягкий и очень сочный, а в процессе роста он твердеет до одеревенения. На стебле появляется много боковых побегов (пасынков), вырастающих в пазухах листьев до цветения.

Листья растений томата различны по форме и размеру, окраске и т.д. в зависимости от сорта и разновидностей растений томата. Листовая пластинка может быть гладкой или густо опушенной. Верхние листья растения томата днем слегка закручиваются, а ночью распрямляются [Брежнев, 1955;

Жученко и др., 1974].

Соцветие томата имеет форму завитка, у овощеводов принято называть кистью. Различают соцветие: простое, простое двухстороннее, промежуточное. Простое соцветие начинает расти и развиваться, когда у растения появляются второй-третий лист, т.е. в зависимости от сорта и внешних условий среды. На соцветии вначале раскрываются цветки, расположенные ближе к стеблю, а затем расцветают все остальные.

Одновременно в соцветии цветут два четыре цветка [Гавриш, 2005;

Богдановский и др., 1991].

Цветы растений томата обоеполые, самоопыляющиеся. Цветок, состоит из 5 сросшихся чашелистиков, венчика из 5 лепестков, сросшихся между собой, 5 тычинок и 1 пестика. Форма и окраска цветков варьируется в зависимости от сорта и форм. Часто у крупноплодных сортов растений томата встречаются фасциированные сросшиеся цветки, из которых впоследствии образуются многокамерные, ребристые и часто деформированные плоды. Рыльце имеют бугорчатую форму, бледно-зеленую окраску. Длина рыльца характерна для каждого сорта томата; для одних сортов характерно рыльце, которое не достигает верхнего края колонки, для других оно находится на уровне тычиночной колонки или выступает на 1-3 мм такое рыльце называют длинностолбчатым.

Тычинки состоят из тычиночных нитей, которые заканчиваются 2-мя камерными кожистыми пыльниками или пыльцевыми мешками, наполненные пыльцевыми зернами. Цветение происходит постепенно, снизу вверх. За весь вегетационный период, а это 90–190 суток на растении томата закладывается и развивается от 50–100 репродуктивных органов таких как:

бутон, цветок, плод на 10–20 соцветиях, что характерно для культурного вида L. esculentum Mill. и до 3000 репродуктивных органов на 200- соцветиях для полукультурной формы L. esculentum var. pimpenellifolium [Брежнев, 1955; Меркулов, 1987].

Плод томата – ягода. Плод заполнен сочной массой студенистой плаценты, в которую погружены семена. Плоды у растений томата различной формы: плоские, плоско-округлённые, округлые, округло-овальные, удлиненно-перцевидные. Плоды до 70 г считаются мелкими, от 70 до 90 г – средними, а свыше 100 г – крупными. Цвет плодов варьируется от лимонножелтого до темно-красного.

Семена томатов мелкие, плоские, яйцевидно-овальной формы, обычно опушенные, желтовато-серой окраски. В 1 г содержится 250-300 семян крупноплодных сортов и гибридов, а мелкоплодных (вишневидные) – 400Масса 1000 семян от 3 до 4 г. Семена дикорастущих видов и полукультурных разновидностей томатов в 1,52 раза мельче семян культурных сортов, но по форме и степени опушенности резких различий не наблюдается. Так, семена L. hirsutum в 34 раза мельче семян культурных сортов, не опушены, имеют коричневую или темно- коричневую окраску Количество семенных камер у разновидностей L. esculentum различаются:

плоды с гладкой и слаборебристой поверхностью имеют от 3 до 8 камер, а у средне ребристых и сильно ребристых – от 5 до 10 камер [Брежнев, 1964;

Жученко, 1973; Игнатьева, 1990; Загорулько и др., 2001].

Среди растений томата, используемых в производстве, имеются и партенокарпические, которые могут в неблагоприятных условиях завязывать плоды и без оплодотворения. Семян в таких плодах практически нет.

[Брежнев, 1964; Жученко, 1973; Гавриш, 1987; Куприянов, 1989; Горки, 1990] Таким образом, культура томата является благоприятным объектом не только для генетических, но и других (морфологических, физиологических, биохимических, фитопатологических) исследований, что оказывается особенно ценным при комплексном подходе к разработке теоретических и практических основ селекции.

1.2 Мейотическая рекомбинация и ее значение в селекции на Понимание механизмов мейотической рекомбинации важно при создании межсортовых и межвидовых гибридов растений томата, т.к. это позволяет получить новые сочетания генотипов, интересных для селекционной практики. Успешность прохождения мейоза является гарантом стабильности генетического материала, а появление фертильных пыльцевых зерен служит тому доказательством.

Исследования мейоза дают селекционеру полную картину процесса конъюгации хромосом, по этой информации можно судить об успешности рекомбинации, которая дает сочетание новых генотипов [Вавилов, 1965;

Жученко, 1973; Лосева и др., 1996; Li et al., 2001; Okamoto, 1989;

Domenichini et al., 2006;].

В мейозе различают четыре важных этапа в которые входят пусковые механизмы мейоза и дифференциировка мейоцита, механизмы конъюгации хромосом, механизмы кроссинговера, метаболизм, сопутствующие мейозу [Куперман, 1961; Kolloo, 1991; Domenichini et al., 2000].

Мейоз один из немногих биологических процессов, происходящих принципиально сходным образом у разных организмов. Универсальность мейоза позволяет предполагать, что у самых разных организмов он контролируется гомологичными генами, разными по своей иерархии [Davies, 1973; Feijo, 1989].

контролируется блоком генов. При этом можно выделить 7 относительно независимых ключевых цитогенетических этапов мейоза: 1) начальная стадия мейоза; 2) конъюгация гомологичных хромосом; 3) рекомбинация;

4) образование хиазм; 5) расхождение хромосом; 6) цитокинез; 7) второе деление мейоза [Шумный и др., 1972; Жученко и др., 1979; Stevens et al., 1986; Пивоваров и др., 1995; Chen et al., 1999; Albrecht, 2010].

постоянства числа хромосом при наличии полового процесса. Кроме того, вследствие кроссинговера происходит рекомбинация – появление новых сочетаний наследственных признаков в хромосомах.

Мейоз обеспечивает также комбинативную изменчивость – появление новых сочетаний наследственных задатков при дальнейшем оплодотворении Пухальский, 2007].

Рекомбинация является важным промежуточным этапом в процессе эволюции у высших эукариот, в основе которого лежит кроссинговер, происходящий в процессе мейоза [Rick, 1972; Hanawalt,1975; Голубовская, 1985; Jourdren et al., 1996; Schwacha et al., 1997; Ефремова и др., 2001;

Жученко, 2001].

Наиболее распространенным процессом, который обеспечивает обмен наследственных факторов. Биологическое значение кроссинговера, играет большую роль в генетической рекомбинации, так как, позволяет создавать новые, ранее не существовавшие комбинации [Жученко, 1973; Хачатуров, 1995; Anderson et al., 2001; Batygina et al., 2003; Богданов, 2008].

На продолжительность мейоза оказывают сильное влияние условия рекомбинация присуща всем классам живых существ, от вирусов до высших растений и животных [Цицин, 1954; Загорулько и др., 2001; Пухальский, 2007; Paigen и др., 2010].

Известно, что первоначальной функцией рекомбинации является репарация повреждений ДНК, на этом основании была выдвинута гипотеза, согласно которой аналогичную функцию рекомбинация выполняет в процессе мейоза [Brown, 1949; Жученко, 1980; Santucci-Darmanin et al., 2010;

Хасанова и др., 2012]. Исходя из этой гипотезы, формирование новых генов и их комбинаций считается побочным эффектом репарации ДНК, а не причиной, по которой рекомбинация и половое размножение возникли в эволюции. Анализ молекулярных процессов, происходящих во время мейоза показывает, что гомологичная рекомбинация действительно осуществляет репарацию ДНК, однако появление этих ДНК в мейозе запланировано, т.е.

они создаются самой клеткой [Король, и др., 1988; Хачатуров, 1995; Tanaka et al., 2008; Albrecht et al., 2010; ].

Если рекомбинационные преобразования, происходящие в мейозе, запрограммированы, то у них есть еще одна специфическая черта, необъяснимая с точки зрения репарационной гипотезы. В митотических клетках в рекомбинационной репарации участвуют сестринские хроматиды, тогда как в мейозе, рекомбинация происходит преимущественно между гомологами [Голубовская, 1975; Жученко и др., 1979; Schleif et al., 1993;

Богданов и др., 2007; Bhullar et al., 2010].

Рекомбинация между сестринскими хроматидами не создает новых комбинаций, поскольку они являются копиями друг друга [Caetano-Pereira et al., 2001]. Новые комбинации возникают в том случае, когда гомологичные хромосомы различаются по набору аллельных форм генов. События, которые происходят в мейозе, на первый взгляд, как нельзя лучше соответствуют требованиям, необходимым для осуществления комбинативной изменчивости, которая происходит под влиянием условий внешней среды [Grun et al., 1966; Feijo et al., 1989; Brown et al., 1998; Caetano-Pereira et al., 2001; Sanchez-Moran et al., 2005;].

Ранее проводимые исследования на различных видах организмов показали, что нарушение мейотической рекомбинации сопровождается не просто отсутствием рекомбинантов, а ведет к серьезным нарушениям гаметогенеза. Цитологические события, наблюдающиеся в процессе мейотической рекомбинации, модифицируются под влиянием экологических и генетических факторов. Каждая из фаз мейоза проходит в строгой последовательности и характеризуется специфичной метаболической активностью [Palmerr et al., 1980; Pedersen et al., 1987; Жученко и др., 1985;

Голубовская, 1982].

кроссоверных обменов в зоны хромосом, где они в норме ингибированы, является резервом увеличения спектра доступной генотипической изменчивости. Наличие такого резерва особенно вероятно у межвидовых Brown et al., 1996].

Например, при скрещивании разных видов томата в отдельных зонах генома наблюдается уменьшение уровня обменов в 510 раз. Только правильное распределение хромосом по гаметам в мейозе (рисунок 1) [Король и др., 1988; Жученко мл. и др., 1989; Кильчевский и др., 1989;

Жученко, 2001].

Каждый ключевой этап мейоза контролируется в свою очередь многими независимо действующими генами, которые запускаются одним общим для всего блока «ключевым» геном. В то же время существуют гены, контролирующие поведение отдельных хромосом и видоспецифичные характеристики мейоза. Каждый ключевой этап мейоза контролируется в свою очередь многими независимо действующими генами, которые [Куперман, 1961; Мюнтцинг, 1963; Жученко и др., 1974; Kuzin et al., 1994;

Лосева и др., 1996; Ma, 2005; Пухальский и др., 2007].

64, Рисунок 1 Схема процесса мейотической рекомбинации [Поглазов, 1970] В то же время существуют гены, контролирующие поведение отдельных хромосом и видоспецифичные характеристики мейоза [Куперман, 1961; Мюнтцинг, 1963; Жученко и др., 1974; Kuzin et al., 1994;

Лосева и др., 1996; Ma, 2005; Пухальский и др., 2007].

В настоящее время новые сорта томата с заданными признаками и свойствами создаются с помощью разных методов: гибридизации, химического мутагенеза, генетико-физиологического направленного индивидуального отбора, искусственного инфицирования растений в разные фазы роста и развития, с использованием сортов дифференциаторов и массового отбора при размножении семян с целью госсортоиспытания для внедрения сорта в производство [Брежнев, 1955; Жученко и др., 1981;

Авдеев, 1982; Анохина и др., 2001; Бухарова и др., 2009].

Основным и наиболее результативным, проверенным практикой методом селекции томата, остается искусственная гибридизация в сочетании с последующим непрерывным отбором семенных растений обладающих минимальным наличием нежелательных признаков [Брежнев, 1964; Гавриш, 2005; Kessler, 2001; Бухарова и др., 2008; Бочарникова, 2011].

В зависимости от цели селекции гибридизация может быть межсортовая, и отдаленная. Межсортовая гибридизация; когда путем скрещивания признаки одного родительского сорта сочетают с дополняющими признаками другого сорта, гибрида, относящегося к тому же ботаническому виду. Отдаленная гибридизация; когда используются экологически и географически отдаленные между собой формы растений, разновидностям вида L. esculentum Mill. Гибриды их обладают богатой наследственностью и лучшей адаптацией к условиям произрастания [Гавриш, 2003; Izmaiow, 2000; Пехов, 1993; Жученко, 2009].

Неоднократно обсуждалась гипотеза возникновения рекомбинации как особого механизма, восстанавливающего двунитевые повреждения ДНК.

Репарация двунитевых разрывов ДНК возможна при выполнении двух условий:

а) необходимо наличие не менее 2-х наборов хромосом;

б) способность клетки к гомологичной рекомбинации [Карпеченко, 1935; Жученко и др., 1986; Pedersen et al., 1987; Жученко и др., 1988; Bhullar et al., 2010].

Таким образом, большая часть хромосомных изменений происходит в ходе профазы I мейоза и опосредована механизмом гомологичной рекомбинации. В результате чего происходит синапсис хромосом, т.к.

благодаря ему успешно проходит кроссинговер, между гомологами осуществляется редукция числа хромосом и их перераспределение между дочерними клетками в первом делении мейоза.

1.3 Влияние абиотических факторов на репродуктивную систему Актуальным направлением научных исследований в генетике и селекционной практике растений томатов является поиск и создание генотипов растений устойчивых к воздействию стрессов, вызванных неблагоприятным влиянием факторов окружающей среды: освещенность, температура, минеральное питание и др. [Palmerr et al., 1980; Авдеев, 1982;

Жученкои др., 1982; Александров, 2009].

Для формирования органов репродуктивной системы, оптимальная освещенность 20 кЛк. В условиях недостаточной освещенности нарушается процесс усвоения углекислоты, вследствие чего приостанавливается рост и развитие растений томата. Стебель растения томата вытягивается, образуя мелкие светло-зеленые листья. Для соцветий, сформированных в таких условиях, характерно небольшое количество цветков. Качество пыльцы у растений томата снижается, а общая ее масса увеличивается на 5-15 %.

Плоды практически не завязываются. Растение томата нуждается в среднем в 14-16 ч освещении [Журбицкий, 1968; Алпатьев, 1981; Гавриш, 2005;

Жученко, 2008] По отношению к влажности воздуха растения томата относятся к относительно засухоустойчивым [Брежнев, 1955]. Но несмотря на это посчитано, что в течение всего вегетационного периода растениям томата требуется около 7000 м3 воды на 1 га. площади [Гавриш, 2005]. Для нормального прорастания пыльцевых зерен и завязываемости плодов необходима относительная влажность воздуха 6080 % [Горанько, 1985].

При более высокой влажности воздуха пыльцевые зерна набухают, затем происходит слипание, и опыление цветков затрудняется. При недостатке влаги скорость прорастания пыльцы и роста пыльцевых трубок снижается.

Пыльца при этом часто оказывается нежизнеспособной или не высыпается из пыльников [Жученко мл, 1990].

Температура является одним из важных факторов, которая влияет на рост и развития генеративных органов растения томата. Оптимальная температура для роста и развития растений томата +2025 °С днем и +18С ночью. Резкие перепады температуры, противопоказанные в этот период, способствуют образованию стерильной пыльцы и снижают способность пыльцевых зерен к прорастанию и росту пыльцевых трубок. При температуре ниже +12 °С растение томата перестает цвести, а при температуре ниже +10 °С останавливается в росте. При температуре ниже 1 °С большинство растений томата гибнет. При повышение температуры, выше +30 °С происходит нарушение физиологических процессов, пыльцевые зерна теряют свою жизнеспособность, становятся стерильными. Полная стерильность наблюдается уже после суток воздействия высоких температур, большинство цветков растений томата осыпаются, оставшиеся образуют мелкие пустотелые партенокарпические плоды. Ночную температуру поддерживают ниже дневной с разницей больше 5 °С. Это необходимо для сокращения расхода веществ растением томата на дыхание ночью.

Температура существенно влияет на поступление минеральных веществ из почвы в растение. С повышением температуры питательного раствора (до определенного предела) количество поглощаемых растением веществ увеличивается. Так при температуре выше +25°С хуже усваивается фосфор, а азот и калий лучше. Сумма активных температур (>10 °С) для нормального роста и развития растений томата 1800-2000 °С. [Boncroft et al., 1954;

Доспехов, 1979; Гавриш, 1987; Болотских, 2003; Александров, 2005].

Таким образом, устойчивость к температурным стрессам это одна из наиболее важных характеристик при оценке генотипа устойчивости культивируемых видов и сортов томата [Андреев, 2003].

благоприятные условия это почва рыхлая по структуре, с достаточным количеством содержания азота [Алпатьев, 1981]. Азот усиливает рост и развитие у томатов всех вегетативных органов растений томата. Азотистое удобрение нужно в умеренном количестве в начале роста до периода цветения, а затем после завязывания плодов. От избыточного внесения азотистого удобрения растение замедляет созревание плодов, понижает устойчивость к болезням, растения томата наращивают вегетативную массу [Pound et al., 1955]. Недостаток азотистого удобрения приводит к карликовости растений томата и пожелтению листовой пластинки. Фосфор обеспечивает рост корней, образование плодов и семян, ускоряет созревание плодов, способствует повышению их сахаристости. Калия требуется больше, чем азота и фосфора, особенно в период формирования вегетативных органов. Калий повышает устойчивость растений к холоду, болезням, улучшая качество плодов. При его недостатке листья начинают скручиваться, ветки опадать, происходит нарушения процесса оплодотворения и как следствие отклонение, от типичного процесса мейоза.

По разным данным на образование одной тонны плодов томатов растение потребляет 4,5-7,9 кг калия, 3,3-4,0 кг азота, 1,1-2,5 кг фосфора, 1,7-4,4 кг кальция, 0,7-0,8 кг магния [Шафранский, 2009].

Таким образом, при неблагоприятных условиях окружающей среды нарушается процесс развития генеративных органов растения, что оказывает негативное влияние на репродуктивный потенциал растения томата в целом.

1.4 Влияние биотического фактора на репродуктивную систему Одной из распространенных и опасных болезней томата является вирус табачной мозаики Tomato Mosaic Virus (ВТМ). Вирус табачной мозаики был открыт биологом Д.И. Ивановским в 1892, что привело к возникновению специальной науки – вирусологии. Потери урожая от ВТМ находятся в прямой зависимости от времени года, возраста растений, сорта, штамма вируса и способа выращивания. Поражаемость растений вирусом табачной мозаики повсеместно снижает урожайность плодов в 1,3-1,6 раза и более [Авдеев, 2008].

Поражение растений томатов ВТМ выражается в неравномерной окраске листьев, на которых чередуются светлые и темно зеленые пятна различной формы. Сочетание темно и светлоокрашенных участков создает мозаичность окраски листовой пластинки, откуда болезнь получила свое название [Taylor et al., 1961; Сухов и др., 1983].

По литературным данным, вирус табачной мозаики поражает точку роста главного стебля растения томата. Последующее развитие пазушных побегов придает растению характерную кустистость. Листья, особенно верхние и пасынков, деформируются, мельчают, приобретают мозаичную расцветку. Часто наблюдается асимметрия листа вдоль центральной жилки, морщинистость. Жилки на нижней стороне листа имеют антоциановую окраску. Края листовых пластинок закручиваются вовнутрь, в результате чего, листья нередко скручены [Рыжков и др., 1934; Власов, 1970; Гиббс и др., 1978]. Плоды на больных растениях томатов не образуются или их бывает мало: мелкие, деформированные и некротические. У некоторых растений томата, в плодах, не образуются семена [Брежнев и др., 1997, Hall, 1980; Mercer, 1982].

При поражении вирусом табачной мозаики растения томата теряют репродуктивный потенциал [Гольдин, 1947; Taylor et al., 1961; Власов и др., 1975].

Дикий виды томата Lycopersicon hirsutum var. glabratum содержат ген толерантности Тm-1, который находится в хромосоме 5 [Дьяченко, 1959;

Авдеев, 1982]. Он впервые был обнаружен в потомстве от скрещивания культурного томата Lycopersicon esculentum Mill. с диким видом L. hirsutum Humb. [Боуден, 1957; Бочарникова, 2007]. Тm-1 картирован в позиции, близкой к рибосомальным РНК-генам [Bohmert et al., 1998]. Кодируемый им белок распознается как продукт гена авирулентности (Аvr-гена). РНКзависимая, РНК-полимеразы вируса, контролирует устойчивость к патогену на клеточном уровне [Davies, 1973]. Гены Тm-2 и Тm-2a, которые находятся в хромосоме 9, также происходят от дикого вида L. peruvianum L. Все выше приведенные гены эффективны в доминантном состоянии.

Гены Тm-2 и Тm-2a контролируют устойчивость к ВТМ на тканевом уровне, при передвижении вируса от клетки к клетке по плазмадесмам [Niemyski, 1963; Eshed et al., 2001]. Несмотря на некоторые негативные характеристики для селекции, такие как нарушения процесса мейоза и впоследствии препятствие образования семян в плодах предполагается, что аллели Тm-2 и Тm-2а обеспечивают более длительную защиту от ВТМ, чем ген Тm-1 [Щелкунов и др., 2004].

Химические средства борьбы практически бессильны против ВТМ.

Одно из решений проблемы заключается в введении и использовании биоразнообразных генотипов томата, включающих как культурные формы, мутанты, дикорастущие, полукультурные разновидности, сорта разного географического происхождения, гибриды культурного томата [Жученко, 2004, 2009]. Это позволит расширить спектр генетической изменчивости, а также даст возможность получения нетрадиционных форм с хозяйственно-ценными признаками.

В природе ВТМ в основном передается при контакте больного растения со здоровым, изредка семенами, вегетативным размножением, через почву, прививками, а также в результате сельскохозяйственной деятельности человека. В последние годы появились данные, что ВТМ может переноситься на большие расстояния туманами и облаками [Pelham, 1966; Mercer et al., 1980].

Таким образом, селекцию на устойчивость к болезням, так же как и первичное семеноводство, следует рассматривать в качестве взаимосвязанных и непрерывных процессов прежде всего; в силу динамичности биотической структуры популяций вредных видов, а также появления новых генетических источников устойчивости растений. Кроме того, селекция на устойчивость к действию абиотических и биотических стрессоров требует качественно разных подходов, между соответствующими генетическими детерминантами онтогенетической и филогенетической адаптации и предопределяет необходимость постоянного повышения устойчивости сортов и гибридов растения томата.

2 МАТЕРИАЛ, МЕТОДИКИ И УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ

ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1 Характеристика исследуемого материала В качестве контроля был взят сорт Marglob, который используют, как пример для описания генетической коллекции растений томата, так как он [Жученко, 1973].

Начиная с начала XX века сорт Marglob выращивался во многих странах и интенсивно использовался в селекционных программах. Из широко известных сортов в результате скрещивания с ним были получены такие сорта как Break o’Day в 1923 году и Pritchard в 1926 году.

Сорт Marglob выделен из коллекции ВИРа и отселектирован на Майкопской станции в условиях юга Кубани под №1644. Стебель у сорта Marglob высокий, хорошо гнущийся, гладкий, тип куста полулежащий, сильно облиственный, Листья обыкновенные, светло зеленые, слабо гофрированные, доли крупные, сильно рассеченные. Кисть короткая, простая, иногда слабоветвистая, средней компактности. Цветки средней величины, желтого цвета, плодов в кисти 5-8. Плод крупный, в среднем вес 120 г, красного цвета. Сорт относится к среднеспелым сортам, период вегетации 112-116 дней (рисунок 2а) [Гавриш, 1987].

Сорт Гаидас в работе использовался в качестве второго контроля, районированный для Юга Кубани. Стебель прямостоячий, гладкий, тип куста детерминатный. Листья крупные, доли сильно рассеченные, гладкие.

Соцветие простое иногда слабоветвистое, цветки крупные, желтого цвета.

Плоды округлые, слаборебристые, массой 101-114 г. Гаидас относится к среднеспелым, высокоурожайным сортам, устойчив к перезреванию, транспортабелен. Период вегетации 96-101 дней. Растение детерминантное, Сорт включен в Госреестр селекционных достижений (рисунок 2б) [Шмаль, 2013].

Рисунок 2 – а) куст сорта Marglob, выращенный в камере искусственного климата; б) куст сорта Гаидас, выращенный в камере искусственного климата.

В исследования также были вовлечены мутантные образцы и дикорастущие формы коллекции Института генетики Республики Молдова.

Описание мутантных форм и мутаций из каталога «Мутантные формы томатов» представлены в таблице 1.

Таблица 1 – Список маркерных томатов используемых в исследованиях составлено по каталогу Бочарниковой Н.И [2011] Описание диких и полукультурных разновидностей проводилось по использование их в селекции» [Жученко и др., 1974].

L. esculentum var. racemigerum (Lange) Brezh. – это кистевидный томат.

Стебли прямостоячие, восходящие или стелющиеся, покрыты редкими длинными волосками. Листья мелкие или средней величины. Листовая пластинка гладкая, доли листа варьируют от тупоконечных до оттянутых, заостренных. Соцветие средней длины, цветки не большие 1,5-2 см в диаметре, от 12 до 26 штук. Тычиночная колонка длиной 0,6-0,8 см. Плоды мелкие около 12-20 мм в диаметре, вначале плодообразования темнозеленые, в зрелом состоянии становятся темно-красными или желтыми, в плоде от 20 до 50 штук семян. По мнению А.А. Жученко [1973], в красноплодными разновидностями вида L. esculentum Mill.

Эта разновидность обладает рядом положительных свойств. Плоды L. esculentum var. racemigerum (Lange) Brezh. содержат большое количество пектиновых веществ. Этот вид обладает сравнительной устойчивостью к почвенной засухе, что является немало важным для создания сортов пригодных для механизированной уборки и транспортировки. Кистевидный томат представляет собой источник устойчивости к альтернариозу, септориозу и фитофторозу.

L. hirsutum var. glabratum C.H. Mull. – это волосистый томат. Обладает мощным, опушенным стеблем, с сильным проявлением антоциановой псевдоприлистниками у основания, светло зеленые с желтоватым оттенком, L. hirsutum var. glabratum обладает вилкообразным соцветием длиной от до 21 см, на соцветии от 18 до 30 мелких цветков. Тычиночная колонка 0, см высоты, столбик превышает ее не более чем на 3 мм. Плоды томата темно зеленого цвета, опушенные длинными белыми волосками несъедобные, горькие на вкус и содержат солонин. Одной из особенности является темно зеленая линия на плоде, которая делит его пополам. Семена темнокоричневые, гладкие [Брежнев, 1955].

Разновидность L. hirsutum var. glabratum C.H. Mull. является донором генов хозяйственно ценных признаков. Так, он содержит ген Tm, обуславливающий устойчивость к ВТМ в условиях естественного заражения, который находится в гомозиготном состоянии и сцеплен с нежелательным фактором, контролирующим пониженную фертильность, с геном, обуславливающим пожелтение листьев и прекращение роста, а также ещё с одним летальным рецессивным геном. У гибридов F1 L. esculentum L. hirsutum var. glabratum гомозигота по гену Tm устойчива даже в условиях искусственного заражения. Вид нетребователен к теплу, переносит длительные понижения температуры до 0- 3 °С, а также заморозки до 2 °С [Жученко и др., 1973; Бухарова и др., 2008] 2.2 Условия проведения опыта Закладка экспериментов проводилась в период 2008 – 2012 гг. в лаборатории «Изучения и поддержания генетической коллекции томата», а также на экспериментальной базе ГНУ ВНИИБЗР (г. Краснодар) (поле, камера искусственного климата). Исследования электронной микроскопии и цитофотометрии были проведены на базе ВНИИСБ (г. Москва).

Для выращивания рассады томатов семена сначала проращивали в чашках Петри на фильтровальной бумаге, помещая их в термостат при температуре +22-25 °С. Перед проращиванием семена обеззараживали перманганатом калия. Через 3-5 суток закладки проросшие семена высаживали в грунт.

Гибридизацию проводили на первых трех кистях, методом кастрации бутонов [Веселовский, 1965]. Один из компонентов для скрещивания выращивали в полевых условиях (L. hirsutum var. glabratum), остальные в камере искусственного климата.

Для кастрации отбирали бутоны с зелено-желтыми пыльниками; для получения пыльцы – полностью раскрывшиеся цветки. Удаление пыльников и нанесение свежесобранной пыльцы на рыльце пестика осуществляли пинцетом; опыленные цветки изолировали ватным изолятором, маркировали пергаментными этикетками с указанием комбинации.

Растения F1 выращивали в камере искусственного климата с заданными условиями: освещенность 20 кЛк, температура +25 °С, влажность 65 %, световой режим: день 16 часов, ночь 8 часов, в 5 л сосудах по методике постановки вегетационного опыта. Влажность почвы поддерживали на уровне 7080 % от ее общей влагоемкости, а относительную влажность воздуха контролировали в пределах 4560 % проветриванием и поливом [Журбицкий, 1968].

Для препаровальных работ в опыте использовали стереоскопический микроскоп (бинокуляр) Olympus SZ61.

Цитологический анализ проводили на световом микроскопе Olympus BX41. Готовые препараты анализировали при увеличении объективов 100,25, 400,65. Объекты просматривались в пяти полях зрения.

Опыт проводился в следующей последовательности, которая представлена в таблице 2.

Таблица 2 – Условия проведения опыта в климакамере, ГНУ ВНИИБЗР, 2008 – 2013 гг.

В условиях пониженной температуры (to +12 °C) с нормальным В условиях пониженной температуры (to +12 °C) с повышенным содержанием азота (доза азота увеличена в 2 раза) В условиях оптимальной температуры (to +25 °C) с нормальным В условиях оптимальной температуры (to +25 °C) с повышенным содержанием азота (доза азота увеличена в 2 раза) В условиях повышенной температуры (to +30 °C) с нормальным В условиях повышенной температуры (to +30 °C) с повышенным содержанием азота (доза азота увеличена в 2 раза) В качестве азотистого удобрения для проведения опыта использовали аммиачную селитру. В этом удобрении азот находится и в аммиачной и в нитратной формах, его содержание составляет 34,6 %. Промышленность выпускает аммиачную селитру в двух видах – в виде гранул и в виде чешуек.

В нашей работе расчет дозы удобрения на сосуд осуществлялся с учетом массы сухой почвы и дозы г д.в. удобрения на 1 кг почвы по методике Б.А. Ягодин и др. [2007].

В ходе работы было получено 10 межвидовых гибридов и внутривидовых гибридов F1 растений томата (таблица 3).

Таблица 3 Схема гибридизации Marglob L. esculentum var. racemigerum 2.4 Индуцированный биотический фактор ВТМ Macias, 1980; Mercer et al., 1982]. Заболевание ВТМ распространено как в условиях открытого, так и защищенного грунтах. Симптомы заболевания варьируются от штамма, фазы заражения растений томата и условий окружающей среды. окружающих условий [Taylor et al., 1961; Власов, 1975;

Авдеев, 1987] Плотноупакованные хромосомы представляют собой кристаллическую структуру, образованную белками, содержащими от 50 до 200 аминокисгидрофобных связей. Структура белковых субъединиц такова, что при их сборке образуется спиральный желобок, закрученный вокруг длинной оси стержня, в центре которой находится цилиндрическая полость диаметром примерно 2 нм (рисунок 3) [Воробьев, 1999].

Рисунок 3 Схема частицы ВТМ из изолированных субъединиц белка оболочки и молекулы РНК вируса [Воробьеву, 1999].

В этом желобке укладывается одна одноцепочечная молекула рибонуклеиновой кислоты (РНК, в которой хранится генетическая информация вируса) длиной 6400 нуклеотидов. Частица BTM имеет длину 300 нм, диаметр 18 нм, наглядно представлена на рисунке 4 [Воробьев, 1999].

Температура инактивации вируса 90–93 °С, предельное разведение 1:100 000, потеря инфекционности при выстраивании в соке около 3000 дней.

ВТМ принадлежит к группе типичных контактных патогенов и является одним из наиболее распространенных и вредоносных фитовирусов.

Вирус не имеет определенной связи с переносчиком, передается механической инокуляцией, контактом между больными и здоровыми растениями, с семенами томата и перца, не передается пыльцой.

Рисунок 4 Схема изображения структуры ВТМ [По Воробьеву, 1999] По последним данным список растений-хозяев ВТМ включает представителей более 9 семейств [Valleau et al.,1930; Niemyski, 1963;

Чебышев, 2007].

На территории России вирус табачной мозаики распространен повсеместно. Вредоносность зарегистрирована в республиках Прибалтики, на Северном Кавказе, в республиках Закавказья, Средней Азии, Белоруссии, а также в Молдове, на Украине, в Краснодарском и Хабаровском краях, Нижнем Поволжье и на Дальнем Востоке.

Повсеместное распространение ВТМ свидетельствует о независимости развития вируса от экологических факторов, хотя наличие семенной инфекции существенно влияет на частоту возникновения эпифитотий [Van Winckel, 1968; Wetzler Chr et al., 1983; Авдеев, 2008].

2.5 Методика инокуляции растений томата ВТМ Для заражения образцов использовали обычный (зеленый) штамм ВТМ, полученный из лаборатории вирусологии ВНИИФ, (г. Москва), поддерживаемый на растениях турецкого табака (N. tabacum L.).

Заражение сеянцев проводилось в фазе 2 настоящих листьев, перед инокуляцией на листья был напылен карборунд с размером частиц 500 мкм.

Затем стеклянным шпателем был нанесен инокулюм ВТМ на листа, предварительно разведенный в дистиллированной воде 1:500 мкл. По каждому варианту заражалось по 10-16 растений [Smith, 1988].

2.6 Методика морфологического описания растений Визуальное обследование и диагностику по симптомам заболевания проводили по методике European Handbook of Plant Diseases [1989]. Описание зараженных растений томата проводили по следующим признакам в соответствии с методикой: тип куста, длина междоузлия, высота растений, % пораженной листовой пластинки, количество цветков в соцветии, число завязавшихся плодов.

2.7 Методика определения фертильности и жизнеспособности пыльцевых зерен растения томата искусственной питательной среде. В чашке Петри с увлажненной фильтровальной бумагой на предметное стекло наносили каплю (15 % раствор сахарозы, подкисленный 0,006 % раствором борной кислоты) на нее кончиком иглы наносили пыльцу, и выдерживали в термостате при +25 °С в течение 3 часов. Жизнеспособность определяли по проценту проросших пыльцевых зерен, наблюдаемых под микроскопом в 10-15 полях зрения, при этом анализировали 400-500 случайно выбранных пыльцевых зерен. Пыльцу считали проросшей, если ее трубка имела длину равную диаметру пыльцевого зерна и более [Паушева, 1988]. Изучалось по 10-16 растений томата в каждом из 6 вариантов условий их выращивания.

Пыльцевые зерна выполненные, полностью заполненные крахмалом, окрашиваются в темно-коричневый цвет, являются фертильными.

Пыльцевые зерна морщинистые, неокрашенные не содержат следов крахмала, такие зерна являются стерильными.

2.8 Методика определения количества пыльцевых зерен в цветке Количество пыльцы в цветке растений томата определяли по методике, разработанной на кафедре РГАУ – МСХА им. К.А. Тимирязева [Иванова и др., 1996]. Изучалось по 10-16 растений томата в каждом из 6 вариантов условий их выращивания.

Свежесобранные пыльники подсушивали в течение суток при температуре 25-26 °С. Пыльники помещали в стеклянные бюксы и измельчались пинцетом, в него приливали 2 мл сахарозы, затем брали микропипеткой 4 мкл. взвешенной смеси и каплю переносили на предметное стекло. Для подсчета количества пыльцевых зерен использовали камеру Горяева.

В каждом препарате подсчитывали пыльцевые зерна в пяти больших квадратах. Определение количества пыльцевых зерен рассчитывали по формуле:

а – среднее количество подсчитанных пыльцевых зерен в 5 больших квадратах;

b – количество исходной суспензии пыльцевых зерен;

50000 – коэффициент пересчета объема 5 больших квадратов на 1 мкл.

2.9 Метод электронной микроскопии В качестве материала для исследования в опыте электронной микроскопии использовали пыльники растений томата размером 1-3 мм. Эти размеры пыльников представляют стадии тетрад [Pacinie et al., 1985].

Пыльники растений томата были первоначально зафиксированы в 1,5 % глютаровом альдегиде, затем переведены в 2 % параформальдегид и установлены в 1 %-ом осмии (рисунок 5 а, б) [Polowick et al., 1992].

Рисунок 5 – а, б) Пыльцевые зерна гибрида Мо 393 L. hirsutum var.

glabratum.

Перед просмотром тонкие срезы пыльников, предварительно обезвоживали в ацетоне и соли лимонной кислоты. Готовые препараты рассматривались на электронном микроскопе марки Hitachi H500, при разрешении около 0,5 нм. (увеличении 2500) Изображения были сфотографированы на Kodak 489.

2.10 Методика определения количества ДНК Фиксацию пыльников растений томата проводили по методике.Н. Хачатурова [1980]. Пыльники выдерживали в спирте в соотношении 1:3, при температуре +4 °С – от 3 ч до 1 суток. Затем проводили отмывку в70 % спирте, в 3-х кратной повторности. После пыльники томатов выдерживали в 50 % и 30 % спирте по 10 мин. Промывку пыльников проводили дистиллированной водой после окраски раствором Шифа при +4 °С. Затем пыльники переводили в постоянный препарат с помощью жидкого азота и смолы. Препараты были просмотрены на цитофотометре Opton, в режиме:

I=5мА, изображения были сфотографированы на Kodak 489.

2.11 Методы статистического анализа экспериментальных данных В работе были применены различные методы статистической обработки данных. С помощью дисперсионного анализа определяли существенные различия между генотипами под влиянием определенных факторов [Доспехов, 1979]. Оценку достоверности различий между средними значениями признаков образцов проводили с помощью рангового теста [Тюрин, 2010]. Классификация данных растений томата по нескольким признакам одновременно, в нашем случае фертильности, жизнеспособности и продуктивности пыльцевых зерен, произведена в результате кластерного анализа [Олдендерфер и др., 1989].

В основе кластерного анализа лежит построение таблиц – матриц.

Сходства, в которых указаны все по парные расстояния каждого объекта.

Термин расстояния означает вычисления меры сходства между гибридами, чем больше сходства, тем меньше расстояние и наоборот. В результате обработки в нашем случае матрица сходства будет иметь размерность 18, что соответствует числу сравниваемых генотипов. В результате обработки матриц строится график – иерархический кластерный дендрит, в котором по оси "X" указываются имена гибридов в порядке их сходства, по оси "Y" горизонтальными линиями расстояния между генотипами или их группами. Разрезание дендрита по "большим расстояниям" приводит к разделению сравниваемых объектов на группы сходных – кластеры.

Использовались пакеты программ Statistica 7, MS Excel 2000.

3 ХАРАКТЕРИСТИКА МУЖСКОГО ГАМЕТОФИТА У ГИБРИДОВ F

РАСТЕНИЙ ТОМАТА ПОД ВОЗДЕЙСТВИЕМ АБИОТИЧЕСКИХ И

БИОТИЧЕСКОГО ФАКТОРОВ

3.1 Морфологическая изменчивость гибридов F1 растений томата под воздействием абиотических и биотического факторов Отдаленная гибридизация необходима селекции растений, так как она позволяет обогащать геном вида новыми сочетаниями генов [Жученко, 2004;

Цэрану и др., 2005]. При этом, начав широкое вовлечение новой зародышевой плазмы в скрещивание с культивируемыми формами растений, селекционеры получили богатые источники разнообразия, и на первый взгляд проблема генетической изменчивости казалась решенной [Воробьева, 1980; Цицин, 1981; Прохоров 1997; Аллашов, 2006]. Практика показала, что эти выводы были преждевременными, а исследования в области генетики позволили выявить причины возникших затруднений, обусловлены ингибированием рекомбинаций в отдаленных скрещиваниях, блочной организацией адаптивных комплексов генов, резким нарушением сбалансированности генотипов по наиболее существенным участкам генома.

Генотипическая изменчивость, наблюдаемая в родственных и видовых скрещиваниях, является лишь небольшой частью общего скрытого потенциала изменчивости [Пивоваров, 2007].

Устойчивые к вирусам, болезням и вредителям сорта не только повышают урожайность и качество продукции, но и экономят значительные средства на защитные мероприятия и уменьшают или даже исключают загрязнение окружающей среды ядохимикатами. Возможности в селекции каждой культуры зависят от ее генетической изученности [Лудилов, 1973;

Руденко, 1978; Сухов, 1983; Azhar, 2004].

В нашей работе проводили скрещивания между культурными сортами, мутантными формами и дикорастущими видами растений томата.

межвидовых и гибридов F1 растений томата, подвергшихся влиянию абиотических и биотическому факторов проводили в следующей последовательности: 1) тип куста, 2) длина междоузлия, 3) высота растения, 4) тип соцветия, 5) процента пораженности ВТМ, 6) размеру и окраске цветка, 7) формы и окраске плода. (Приложение 17; рисунки 623).

Сорт Marglob растение темно-зеленого цвета, детерминантный тип куста, сильно облиственный, полулежащий, длина междоузлия 5,56 см, высота растения 15,45 см (рисунок 6а).

Листья обыкновенные, крупные, слабо гофрированные; сегменты сильно рассеченные, крупные (рисунок 6б).

Процент поражения растений томата вирусом табачной мозаики растений томата составил 51 %, процент реализованной продуктивности 12,51 % (Приложение 17).

Рисунок 6 – Сорт Marglob: а) растение в фазе 34-х настоящих листьев;

б) лист растения томата.

Сорт Гаидас растение темно-зеленого цвета, детерминантный тип куста, длина междоузлия 5,49 см, высота растения 16,96 см (рисунок 7а).

Листья обыкновенные, крупные, слабо гофрированные; сегменты сильно рассеченные, крупные (рисунок 7б).

Процент поражения растений томата вирусом табачной мозаики растений томата составил 50 %, процент реализованной продуктивности 10,11 % (Приложение 17).

Рисунок 7 – Сорт Гаидас: а) растение в фазе 34-х настоящих листьев;

б) лист растения томата.

Межвидовой гибрид F1 Мо 393 L. esculentum var. racemigerum (Lange) Brezh. растение темно-зеленого цвета, индетерминантный тип куста, длина междоузлия 5,54 см, высота растения 20,34 см (рисунок 8а).

Наличие большого количества белых пятен (m-2) на слабо рассеченных листьях (с) (рисунок 8б).

Процент поражения растений томата вирусом табачной мозаики растений томата составил 46 %, процент реализованной 10,11 % (Приложение 17).

Рисунок 8 – Гибрид F1 Мо 393 L. esculentum var. racemigerum (Lange) Brezh.: а) растение в фазе 34-х настоящих листьев; б) лист растения томата.

Межвидовой гибрид F1 Мо 393 L. hirsutum var. glabratum C.H. Mull.

Растение имеет индетерминатный тип куста, 4,45 см, высота растения 23,18 см (рисунок 9а).

Листья с большим количеством белых пятен (m-2), слабо рассеченные (c) (рисунок 9б).

Рисунок 9 – Гибрид F1 Мо 393 L. hirsutum var. glabratum C.H. Mull.:

а) растение в фазе 34-х настоящих листьев; б) лист растения томата.

Процент поражения растений томата вирусом табачной мозаики 40 %, процент реализованной продуктивности составил 15,23 % (Приложение 17).

Межвидовой гибрид F1 Мо 628 L. esculentum var. racemigerum (Lange) Brezh. – растения темно-зеленого цвета, индетерминатный тип куста. Стебли покрытые густыми короткими волосками, длина междоузлия 5,01 см, высота растения 12,34 см (рисунок 10а).

Листья 3035 см длины, прерывистоперестые. Сегменты листа заостренные, мелкогородчатые по краям (рисунок 10б).

Процент поражения растений томата вирусом табачной мозаики 45 %, процент реализованной продуктивности составил 5,52 % (Приложение 17).

Рисунок 10 – Гибрид F1 Мо 393 L. esculentum var. racemigerum (Lange) Brezh.: а) растение в фазе 34-х настоящих листьев, б) лист растения томата.

Межвидовой гибрид F1 Мо 628 L. hirsutum var. glabratum C. H. Mull.

– растения темно-зеленого цвета, индетерминатный тип куста. Стебли покрытые густыми короткими волосками, длина междоузлия 4,87 см, высота растения 11,23 см (рисунок 11а).

Листья 2530 см длины, рассеченные. Сегменты листа заостренные, мелкогородчатые по краям (рисунок 11б).

Процент поражения растений томата вирусом табачной мозаики 40 %, процент реализованной продуктивности составил 13,61 % (Приложение 17).

Рисунок 11 – Гибрид F1 Мо 628 L. hirsutum var. glabratum C.H. Mull.:

а) растение в фазе 34-х настоящих листьев, б) лист растения томата.

Межвидовой гибрид F1 Мо 755 L. esculentum var. racemigerum (Lange) Brezh.

индетерминатный тип куста.

Стебель покрыт густыми короткими волосками, длина междоузлия 5,09 см, высота растения 10,98 (рисунок 12а).

Листья 2025 см в длину, прерывистоперестые. Сегменты листа расположены на сравнительно длинных черешках 1,02,0 см; концы сегментов острые, у основания форма неравнобокая (рисунок 12б).

Рисунок 12 – Гибрид F1 Мо 755 L. esculentum var. racemigerum (Lange) Brezh.: а) растение в фазе 34-х настоящих листьев; б) лист растения томата.

Процент поражения растений томата вирусом табачной мозаики 45 %, процент реализованной продуктивности составил 4,45 % (Приложение 17).

Межвидовой гибрид F1 Мо 755 L. hirsutum var. glabratum C.H. Mull. – растения темно-зеленого цвета, индетерминатный тип куста. Стебли покрытые короткими железистыми волосками, длина междоузлия 4,56 см, высота растения 12,09 см (рисунок 13а).

Листья крупные, длиною 2530 см, с псевдоприлистниками у основания, темно-зеленые. Основные сегменты удлиненно-яйцевидной формы, заостренные, неравнобокие у основания, мелкогородчатые по краям (рисунок 13б).

Процент поражения растений вирусом табачной мозаики 45 %, процент реализованной продуктивности составляет 15,23 % (Приложение 17).

Рисунок 13 – Гибрид F1 Мо 755 L. hirsutum var. glabratum C.H. Mull.:

а) растение в фазе 34-х настоящих листьев, б) лист растения томата.

Внутривидовой гибрид F1 Marglob Мо 393 растения томата темнозеленого цвета, детерминатный тип куста, междоузлия в фазе 34-х настоящих листьев 4,56 см, высота растения 12,98 см. Стебель, опушенный короткими железистыми волосками (рисунок 14а).

Листья очень крупные 2535 см в длину и около 2528 cм ширины, доли удлиненно-яйцевидные, рассеченные (рисунок 14б).

Процент поражения растений вирусом табачной мозаики 50 %, процент реализованной продуктивности составляет 16,74 % (Приложение 17).

Рисунок 14 – Гибрид F1 Marglob Мо 393: а) растение в фазе 34-х настоящих листьев; б) лист растения томата.

Внутривидовой гибрид F1 Гаидас Мо 393 растения томата темнозеленого цвета, детерминатный тип куста, междоузлия в фазе 34-х настоящих листьев 4,9 см, высота растения 14,98 см.

Рисунок 15 – Гибрид F1 Гаидас Мо 393: а) растение в фазе 34-х настоящих листьев; б) лист растения томата.

Стебель опушенный короткими железистыми волосками (рисунок 15а).

Листья крупные 2030 см в длину, сегменты листа удлиненнояйцевидные, рассеченные (рисунок 15б).

Процент поражения растений вирусом табачной мозаики 48 %, процент реализованной продуктивности составляет 5,55 % (Приложение 17).

Внутривидовой гибрид F1 Marglob Мо 628 – растения томата темнозеленого цвета, детерминатный тип куста, длина междоузлия 4,08 см, высота растения 13,67 см. Стебель, опушенный короткими железистыми волосками (рисунок 16а).

Рисунок 16 – Гибрид F1 Marglob Мо 628: а) растение в фазе 34-х настоящих листьев; б) лист растения томата.

Листья крупные, удлиненные 2430 см длиной, сегменты листа крупные, удлиненно яйцевидной формы, острые, гладкие, у основания неравнобокие (рисунок 16б).

Процент поражения растений вирусом табачной мозаики 48 %, процент реализованной продуктивности составил 6,32 % (Приложение 17).

Внутривидовой гибрид F1 Гаидас Мо 628 растения томата темнозеленого цвета, детерминатный тип куста, междоузлия в фазе 34-х настоящих листьев 4,0 см, высота растения 12,45 см. Стебель, опушенный короткими железистыми волосками (hl) (рисунок 17а).

Листья крупные, удлиненный 2025 см в длину, сегменты листа уменьшены (e) (рисунок 17б).

Процент поражения растений вирусом табачной мозаики 48 %, процент реализованной продуктивности составил 10,11 % (Приложение 17).

Рисунок 17 – Гибрид F1 Гаидас Мо 628: а) растение в фазе 34-х настоящих листьев; б) лист растения томата.

Внутривидовой гибрид F1 Marglob Мо 755 темно-зеленого цвета, детерминатный тип куста, высота растения 10,56 (d).

Рисунок 18 – Гибрид F1 Marglob Мо 755: а) растение в фазе 34-х настоящих листьев; б) лист растения томата.

Листья крупные 3035 см в длину, сегменты листа крупные, морщинистые, заостренные, у основания неравнобокие (рисунок 18б).

Стебель, слегка опушенный короткими железистыми волосками. Длина междоузлия в фазе 34-х настоящих листьев 4,05 см (рисунок 18а).

Процент поражения растений вирусом табачной мозаики 50 %, процент реализованной продуктивности составил 9,33 % (Приложение 1–7).

Внутривидовой гибрид F1 Гаидас Мо 755 темно-зеленого цвета, детерминатный тип куста, высота растения 10,34 (d). Стебель, слегка опушенный короткими железистыми волосками. Длина междоузлия в фазе 34-х настоящих листьев 3,18 см (рисунок 19а).

Листья крупные 30-35 см в длину, сегменты листа крупные, морщинистые, заостренные, у основания неравнобокие (рисунок 19б).

Процент поражения растений вирусом табачной мозаики 48 %, процент реализованной продуктивности составил 10,34 % (Приложение 17).

Рисунок 19 – Гибрид F1 Гаидас Мо 755: а) растение в фазе 34-х настоящих листьев; б) лист растения томата.

Межвидовой гибрид F1 Marglob L. hirsutum var. glabratum C.H. Mull.

растения светло-зеленого цвета, индетерминатный тип куста, стелющиеся, сильно ветвящиеся.

Стебель, густо покрытый железистыми волосками, длина междоузлия 4,19 см, высота растения в фазе 34-х настоящих листьев 17,34 см (рисунок 20а).

Рисунок 20 – Гибрид F1 Marglob L. hirsutum var. glabratum C.H. Mull.: а) растение в фазе 34-х настоящих листьев; б) лист растения томата.

широколанцетные с многочисленными мелкими зубчиками по краю, покрытые короткими железистыми волосками (рисунок 20б).

Соцветие среднего размера, длиной до 15 см, на одном соцветии 810 опушенных цветков (рисунок 20в).

Плод 1,52,5 см в диаметре, округлой формы, красного цвета, партенакарпический (рисунок 20г).

Процент поражения растений вирусом табачной мозаики равен 40 %, процент реализованной продуктивности составил 25,21 % (Приложение 17).

Межвидовой гибрид F1 Marglob L. esculentum var. racemigerum (Lange) Brezh. растение темно-зеленого цвета, индетерминатный тип куста.

Стебель покрыт густыми короткими волосками, междоузлия 3,78 см, высота растения 16,34 см (рисунок 21а).

Листья длиною 2528 см, рассеченные. Сегменты листа яйцевидной или широкояйцевидной формы, мелкогородчатые, с заостренными концами, основание неравнобокое (рисунок 21б).

Рисунок 21– Гибрид F1 Marglob L. esculentum var. racemigerum (Lange) Brezh.: а) растение в фазе 34-х настоящих листьев; б) лист растения томата.

Соцветие простое, рыхлое, многоцветковое (1014 цветков), длиной 15 см и более.

Лепестки цветка узкие заостренные длиной 1011 мм, лимонножелтого цвета (рисунок 21в).

Плоды округлой формы, глянцевые, гладкие, ярко-красные, партенокарпические (рисунок 21г).

соответствовал 45 %, процент реализованной продуктивности составил 18,66 % (Приложение 17).

Межвидовой гибрид F1 Гаидас L. hirsutum var. glabratum C.H. Mull.

растения светло-зеленого цвета, индетерминатный тип куста, стелющиеся, сильно ветвящиеся.

Рисунок 22 – Гибрид F1 Гаидас L. hirsutum var. glabratum C.H. Mull.:

а) растение томата в фазе 34-х настоящих листьев; б) лист растения томата.

Стебель, густо покрытый железистыми волосками, длина междоузлия 3,89 см, высота растения в фазе 34-х листьев 17,89 (рисунок 22а). Листья крупные, длиной до 2530 см, сегменты листа широколанцетные с многочисленными мелкими зубчиками по краю, покрытые короткими железистыми волосками (рисунок 22б). Соцветие среднего размера, длиной до 15 см, на одном соцветии 810 опушенных цветков (рисунок 22в).

Плод 11,5 см в диаметре, округлой формы, красного цвета, партенакарпический (рисунок 22г). Процент поражения растений вирусом табачной мозаики 40 %, процент реализованной продуктивности составил 16,72 % (Приложение 17).

Межвидовой гибрид F1 Гаидас L. esculentum var. racemigerum (Lange) Brezh. растение темно-зеленого цвета, индетерминатный тип куста.

Рисунок 23 – Гибрид F1 Гаидас L. esculentum var. racemigerum (Lange) Brezh.: а) растение в фазе 34-х настоящих листьев; б) лист растения томата.

Стебель покрыт густыми короткими волосками, междоузлия 4,46 см, рассеченные. Сегменты листа яйцевидной или широкояйцевидной формы, мелко городчатые, с заостренными концами, основание неравнобокое (рисунок 23б). Соцветие простое, рыхлое, многоцветковое 10-14 цветков, длиной 1520 см (рисунок 23в). Плоды округлой формы, от 12 см в диаметре, глянцевые гладкие, ярко-красные, партенокарпические (рисунок 23).

Процент поражения растений вирусом табачной мозаики 45 %, процент реализованной продуктивности составил 16,71 % (Приложение 17).

Таким образом, проявление у внутривидовых гибридов F1 растений томата проявление фенотипических признаков: тип куста, длина междоузлия, высота растений, тип соцветия, процент пораженности ВТМ, размер и окраска цветка, форма и окраска, шло по материнскому компоненту, представленному культурными сортами Marglob и Гаидас.

У межвидовых гибридов F1 наследование этих же признаков, шло по отцовскому компоненту, в качестве которого использовались дикорастущие виды Процент поражения вирусом табачной мозаики у межвидовых гибридов F1 с дикорастущими формами составляет 4045 %, в отличие от других генотипов, у которых процент поражения растения томата составлял 50 % и более.

Из 16 гибридных комбинаций полученных в ходе работы только у четырех гибридов F1 растений томата отмечено образование плодов, где в качестве отцовской формы использовались дикорастущие виды.

3.2 Фертильность и жизнеспособность мужского гаметофита у гибридов F1 растений томата под воздействием абиотических и В селекционно-генетических исследованиях анализ традиционно начинается с изучения структуры изменчивости признаков, который позволяет оценить вклады изучаемых факторов. Важное условие получения плодообразования, где одним из показателей является энергия плодообразования — процент вызревших плодов от количества цветковых почек [Яндовка и др., 2006]. Вызревшие плоды образуются лишь при оплодотворении семяпочек. Слабое образование плодов или его отсутствие может быть следствием нескольких факторов: недоразвитость цветка, пыльцеобразование, низкая фертильность пыльцы и стерильность мужского гаметофита, от повышенной температуры и зараженности растений томата неблагоприятных условиях образуются мелкие пустотелые соцветия [Серебряков, 1960; Валько и др., 2000; Анюхина и др., 2001; Batygina, 2003].

Также многое зависит от генотипа растений томата. Лучшее образование плодов наблюдается у малокамерных (от 2-х до 4-х камер), относительно мелкоплодных сортов и гибридов. К ним относятся все гибриды, одной из родительской формы которых является дикорастущий вид растения томата. Для них характерно большое количество пыльцы и ее высокий процент фертильности, т.е. способности пыльцы к оплодотворению.

Другой показатель качества пыльцы жизнеспособность, т.е.

способность пыльцы к прорастанию на рыльце пестика [Симоненко, 1983;

Прохоров, 1997]. Хорошее образование плодов обеспечивается при поддержании оптимальных условий микроклимата: температуры и минерального питания [Нокс, 1985].

В нашей работе были рассмотрены эффекты различия генотипов, температур и фонов удобрений растений томатов, зараженных вирусом ВТМ.

Результаты выполнены в рамках трехфакторного дисперсионного анализа и представлены в таблице 4.

Таблица 4 – Результаты трехфакторного дисперсионного анализа степени воздействием абиотических и биотического факторов, ГНУ ВНИИБЗР, – 2013 гг.

генотипов + температур генотипов + удобрение температур + удобрение генотипов + температур +удобрение Примечание: df – степень свободы; mS – средний квадрат; F – критерий Фишера; Fst – критерий Фишера (табличный); d2 – дисперсия В нашей работе по анализу полученных данных видно, что наибольшее достоверное влияние на фертильность пыльцевых зерен у всех исследуемых генотипов оказали температура и совокупность факторов: – температуры и удобрение. Доля дисперсии соответственно составила 61,3 и 27,3 %.

Одной из главных задач для успешной селекции растений является обеспечение и определение устойчивости репродуктивной системы и ее качества. К качеству репродуктивной системы относят процент прорастания пыльцы на рыльце пестика, который в свою очередь зависит от особенностей генотипа, влияния окружающей среды, и других структурноморфологических показателей пыльцы [Симоненко, 1982; Цаценко и др., 2012]. Пыльца, сформировавшаяся в экстремальных условиях, а также пыльца межвидовых гибридов практически не прорастает [Сладков, 1967]. В период формирования мужского гаметофита влияние повышенной и пониженной температур приводит к элиминации микроспор, не обладающих устойчивостью к данному фактору [Лобанов, 1985; Атабекова, 1987].

Причиной снижения жизнеспособности пыльцевых зерен может быть потеря питательных веществ пыльцы на фоне заражения вирусом табачной мозаики [Козлова, 1985]. Имеются немногочисленные данные о возможности отбора пыльцы на устойчивость к вирусам [Брежнев и др., 1977].

В работе установлено, что жизнеспособность пыльцевых зерен, зараженных растений томата при оптимальных условиях роста и развития на искусственной питательной среде in vitro, составляла 1233 %.

Оценка эффектов различия генотипов, температур и фонов удобрений проведена с помощью трехфакторного дисперсионного анализа (таблица 5).

жизнеспособности пыльцевых зерен имело преимущество роль средовых факторов, таких как температура 40,2 % и удобрения 19,5 %.

Вклад различий совместного влияния температур и фонов минерального питания также был велик и составил 28,5 %. Влияние генотипа оказалось незначительным, как по отдельному признаку (0,9 %), так и по совместному (1,6 %; 0,3 %; 0,8 %).

Таблица 5 – Результаты трехфакторного дисперсионного анализа степени жизнеспособности пыльцевых зерен гибридов F1 растений томата под воздействием абиотических и биотического факторов, ГНУ ВНИИБЗР,2008 – 2013 гг.

генотипов + температур генотипов + удобрения температур удобрения генотипов + температур удобрения Примечание: df – степень свободы; mS – средний квадрат; F – критерий Фишера; Fst – критерий Фишера (табличный); d2 – дисперсия Таким образом, по результатам трехфакторного дисперсионного анализа установлены статистически достоверные эффекты всех изучаемых факторов. Однако, их доля в общей изменчивости признаков разная и заслуживает отдельного обсуждения. Так, вклад различий генотипов по признакам фертильность и жизнеспособность пыльцевых зерен крайне мал и не превышал 1 %. Для этих показателей превалировала роль средовых факторов – температурного режима и дозы удобрений. Для признака «фертильность» вклад различия температур составил 61,3 %, а для жизнеспособности – 40,2 %. Вклад совместных различий температур и фонов минерального питания также был велик для фертильности пыльцевых зерен 27,3 %, для жизнеспособности пыльцы 28,5 %.

3.3 Количество пыльцевых зерен у гибридов F1 растений томата под воздействием абиотических и биотического факторов При меняющейся экологической ситуации для селекционной практики, стоит задача отбора генотипов с высокой пыльцевой продуктивностью, а также устойчивых по фертильности и жизнеспособности пыльцевых зерен к действию абиотических и биотических стрессоров [Тараканов, 1994].

Наибольшее влияние на пыльцевую продуктивность, т.е. количество пыльцевых зерен, оказывает температура. Количество пыльцевых зерен в пыльниках цветка возрастает в течение трех-четырех дней от начала цветения, несмотря на то, что часть пыльцы высыпается. Во втором и третьем соцветиях у растений томата, по сравнению с первым, ее бывает больше.

Однако, если цветки раскрываются одновременно, независимо от их местоположения на растении, количество пыльцы в них одинаковое [Цаценко и др., 2009].

Репродуктивная система растений находится в прямой зависимости от условий выращивания растений и генотипа. При отдаленной гибридизации у растений томата, по мнению С.Ф. Гавриш и С.Н. Галкина [1990] изменяется в первую очередь количество пыльцевых зерен, за счет вовлечения дикорастущих видов растений томата в селекционный процесс.

Эффективность опыления и оплодотворения определяется количеством пыльцевых зерен в цветке. Количество пыльцы у томата на каждую яйцеклетку приходится от 1 до 5 тыс. пыльцевых зерен [Бочарникова, 2007].

В одной завязи растений томата закладывается 200-300 и более семяпочек, в каждой завязи в оптимальных условиях может образовываться от 22 до семяпочек [Жученко мл., 1990]. Для завязывания плода томата, необходимо оплодотворение примерно 6 % семяпочек [Жученко, 1973]. По количеству пыльцы дикие виды томатов превосходят культурные сорта. Дикие виды оплодотворяются перекрестным опылением в отличие от культурных сортов, которые склонны к самоопылению [Бочарникова, 2007]. Однако каким бы ни был сорт или вид томатов, их способность к самоопылению в любом случае ограничена, так как она производится вследствие воздействия сторонних факторов, например: температуры, вируса и т.д. [Pacinie, 1985].

В нашей работе анализ количества пыльцевых зерен растений томата, зараженных ВТМ, подвергшихся влиянию температур и различным дозам минерального удобрения, выполнен с помощью схемы трехфакторного дисперсионного анализа (таблица 6).

Таблица 6 – Результаты трехфакторного дисперсионного анализа степени количества пыльцевых зерен гибридов F1 растений томата под воздействием абиотических и биотического факторов, ГНУ ВНИИБЗР, 2008 – 2013 гг.

генотипов + температур генотипов + удобрения температур +удобрения генотипов + удобрения Примечание: df – степень свободы; mS – средний квадрат; F – критерий Фишера; Fst – критерий Фишера (табличный); d2 – дисперсия.

Проведенные нами исследования показали статистически достоверные различия для всех изучаемых факторов. Наибольшее влияние на признак количество пыльцевых зерен оказывают различия между генотипами 11,6 %. На взаимодействие факторов температуры и минерального удобрения приходится 16,7 %, а генотипа и температуры 10,9 % от общей изменчивости. Для данного показателя наиболее существенным оказался эффект остаточной изменчивости, который составил 43 %. Таким образом, при исследовании пыльцеобразующей способности под воздействием абиотических и биотического факторов установлено статистически достоверное влияние генотипа на количество пыльцевых зерен 11,6 %. В структуре данного эксперимента ее источником являлась метамерная изменчивость и индивидуальная изменчивость отдельных растений.

3.4 Классификация генотипов, подвергнутых влиянию разных Создание и сохранение генетически устойчивых гибридов растений томата является необходимым условием для повышения эффективности селекции и генетических исследований. Крупные коллекции важнейших сельскохозяйственных культур созданы в Голландии, Германии, США и других странах. Банки генов не всегда представлены образцами, в которых локализованы гены, отвечающие за морфологические, адаптивные и хозяйственные признаки, необходимые для проведения селекционных работ [Бочарникова, 2008].

культурных, полукультурных и диких видов томатов является принцип создания коллекций, их правильная организация и классификация на группы, качественно отличающиеся по специфике источников и маркированию генов [Яшина и др., 1965; Щелкунов и др., 2004]. В наших исследованиях была предпринята попытка провести классификацию генотипов растений томата, подвергшихся влиянию различных температур по признакам фертильность, дисперсионного анализа. По результатам дисперсионного анализа установлено, что температура является важнейшим фактором, влияющим на анализируемые признаки.

Так, вклад различия температур для признака фертильность составил 61,3 %, для признака жизнеспособность – 40,2 %, а признака количество пыльцевых зерен 5,7 %. Однако, для последнего признака выявлен значительный эффект взаимодействия генотип-температура – 10,9 %.

Характер температурных различий раскрывают результаты множественного сравнения средних значений признаков, выполненные по принципу рангового теста (таблица 7, 8, 9).

Полученные данные подтверждают, что наибольшее среднее значение фертильности пыльцевых зерен у зараженных растений томата ВТМ было в оптимальных условиях выращивания при +25 °С, и составило 48,3 %, при этом самые низкие показатели фертильности выявлены при критической температуре +12 °С и они не превышали 1 %. При температуре выращивания +30 °С, среднее значение показателя составило 31,8 %.

Таблица 7 – Результаты множественного рангового теста различия среднего значения фертильности пыльцевых зерен растений томата, пораженных ВТМ в условиях разных температур, ГНУ ВНИИБЗР, 2008 – 2013 гг.

Примечание: Здесь и в других подобных таблицах расположение знака «*» на разных вертикалях указывает на достоверность различия средних значений признака Таблица 8 – Результаты множественного рангового теста различия среднего значения жизнеспособности пыльцевых зерен растений томата, пораженных ВТМ в условиях разных температур, ГНУ ВНИИБЗР, 2008 – 2013 гг.

Из представленных данных следует, что наибольшее среднее значение жизнеспособности пыльцевых зерен растений томата наблюдалось при +25 °С и составило 3,6 % и достоверно отличалось от других средних значений 0,8 % и 2,4 % при +12 °С и +30 °С соответственно.

Таблица 9 – Результаты множественного рангового теста различия среднего значения количества пыльцевых зерен растений томата, пораженных ВТМ в условиях разных температур, ГНУ ВНИИБЗР, 2008 – 2013 гг.

Согласно представленных данных наибольшее количество пыльцевых зерен у растений томата выявлено при температуре +25°С и составило 5, тыс. шт., это значение достоверно отличается от значений при +12 °С и +30 °С.

подтверждают, что оптимальной температурой для процесса микроспорогенеза является +25 °С, так как при этом отмечаются достоверно высокие качественные и количественные показатели пыльцы. Наименьшие средние значения изучаемых признаков наблюдались при температуре +12 °С. В дальнейших исследованиях эта температура не рассматривалась, так как была неблагоприятна для роста и развития растений томата и их репродуктивной системы.

Для решения задачи выбора лучших генотипов, выращенных в условиях +25°C и +30°С, проведена их классификация методом кластерного анализа (рисунок 24). При кластеризации использовались не собственно сами значения признаков, а их линейные комбинации, полученные в рамках метода главных компонентов. Причина заключается в значительных различиях значений признаков. Так, значения фертильности превосходили значения жизнеспособности и продуктивности на порядок величин. В этом обеспечивается в главных компонентах [Тюрин, 2010].

Коэффициент слияния усл. ед.

Рисунок 24 Кластеризация генотипов, выращенных при температуре +25 °C:

1) Marglob; 2) Гаидас; 3) Мо 393 L. esculentum var. racemigerum; 4) Мо L. hirsutum var. glabratum; 5) Мо 628 L. esculentum var. racemigerum;

6) Мо 628 L. hirsutum var. glabratum; 7) Мо 755 L esculentum var.

racemigerum; 8) Мо 755 L. hirsutum var. glabratum; 9) Marglob Мо 393;

10) Гаидас Мо 393; 11) Marglob Мо 628; 12) Гаидас Мо 628; 13) Marglob Мо 755; 14) Гаидас Мо 755; 15) Marglob L. hirsutum. var. glabratum;

16) Marglob L. esculentum var. racemigerum; 17) Гаидас L. hirsutum var.

glabratum; 18) Гаидас L. esculentum var. racemigerum.

При разрезании кластерного дендрита по уровню сходства в 30 усл. ед.

генотипы разделяются на три кластера. В первый из них входит 5 генотипов:

Гаидас Мо 755, Marglob Мо 628, Marglob L. esculentum var.

racemigerum, Marglob L. hirsutum. var. glabratum, Гаидас Мо 393. Во второй – 7 генотипов: Мо 755 L. hirsutum var. glabratum, Мо L. esculentum var. racemigerum, Гаидас Мо 628, Marglob Мо 393, Мо L. hirsutum var. glabratum, Marglob Мо 755, Гаидас. В третий кластер вошло 6 генотипов: Гаидас L. hirsutum var. glabratum, Мо 755 L. esculentum var.

racemigerum, Мо 628 L. esculentum var. racemigerum, Гаидас L. esculentum var. racemigerum, Мо 393 L. hirsutum var. glabratum, Marglob.

Проверка кластерного решения была выполнена нами с помощью однофакторного дисперсионного анализа, где в качестве фактора выступала кластерная принадлежность генотипов (таблица 10).

Таблица 10 – Результаты однофакторного дисперсионного анализа признаков с фактором кластер генотипов, выращенных при температуре +25 °C, ГНУВНИИБЗР, 2008 – 2013 гг.

Изменчивость между кластерами между кластерами между кластерами Примечание: df – степень свободы; mS – средний квадрат; F – критерий Фишера; Fst – критерий Фишера (табличный); d2 – дисперсия.

дисперсионного анализа полностью подтверждают различия между кластерами по всем признакам.

Доля соответствующей дисперсии между кластерами варьирует от 47,7 % до 77,9 %. Доля в общей дисперсии остаточной изменчивости варьирует от 22,1 % до 52,3 %.

Завершением дисперсионного анализа был ранговый тест, который позволил выявить лучший кластер между средними значениями каждого из изучаемых признаков (таблицы 11-13).

Таблица 11 – Ранговый тест средних значений фертильности пыльцевых зерен растений томата пораженных ВТМ, выращенных в условиях 25°C в разных кластерах Таблица 12 – Ранговый тест средних значений жизнеспособности пыльцевых зерен растений томата пораженных ВТМ, выращенных в условиях 25°C в разных кластерах Таблица 13 – Ранговый тест средних значений количества пыльцевых зерен растений томата пораженных ВТМ, выращенных в условиях 25°C в разных кластерах Генотипы, относящиеся к первому кластеру: Гаидас Мо 755, Marglob Мо 628, Marglob L. esculentum var. racemigerum, Marglob L. hirsutum.

var. glabratum, Гаидас Мо 393, характеризуются низкой фертильностью, но имеют высокие показатели жизнеспособности и количества пыльцевых зерен.

Генотипы второго кластера: Мо 755 L. hirsutum var. glabratum, Мо 393 L. esculentum var. racemigerum, Гаидас Мо 628, Marglob Мо 393, Мо 628 L. hirsutum var. glabratum, Marglob Мо 755, Гаидас, имели низкие показатели жизнеспособности и количества пыльцевых зерен, но характеризовалась высокими значениями фертильности пыльцевых зерен гибридов F1 растений томата.

В число лучших входят генотипы кластера 3 Marglob, Мо 393 L.

hirsutum var. glabratum, Мо 628 L. esculentum var. racemigerum, Мо 755 L.

esculentum var. racemigerum, Гаидас L. hirsutum var. glabratum, Гаидас L.

esculentum var. racemigerum, характеризующихся высокими показателями фертильности, жизнеспособности и количества пыльцевых зерен.

Аналогичным образом был выполнен поиск лучших генотипов, зараженных ВТМ, выращенных в условиях +30 °С. Результат кластеризации генотипов для данного варианта данных представлен на рисунке 25.

При разрезании кластерного дендрита по уровню сходства в 6 усл. ед.

также выделяется три кластера генотипов. В первый из них входит генотипов: Marglob Мо 755, Мо 628 L. esculentum var. racemigerum, Гаидас Мо 628, Мо 628 L. hirsutum var. glabratum, Мо 393 L. hirsutum var. glabratum, Мо 393 L. esculentum var. racemigerum. Во второй только генотипа: Marglob Мо 393, Гаидас, Гаидас Мо 393.

В третий кластер вошли остальные 9 генотипов: Marglob L. esculentum var. racemigerum, Мо 755 L.hirsutum var. glabratum, Гаидас L. hirsutum var.

glabratum, Мо 755 L. esculentum var. racemigerum, Marglob L.hirsutum.

var. glabratum, Гаидас Мо 755, Гаидас L. esculentum var. racemigerum, Marglob Мо 628, Marglob.

Коэффициент слияния усл. ед.

Рисунок 25 Кластеризация генотипов, выращенных при температуре +30 С: 1) Marglob; 2) Гаидас; 3) Мо 393 L. esculentum var. racemigerum;

4) Мо 393 L. hirsutum var. glabratum; 5) Мо 628 L. esculentum var.

racemigerum; 6) Мо 628 L. hirsutum var. glabratum; 7) Мо 755 L esculentum var. racemigerum; 8) Мо 755 L. hirsutum var. glabratum; 9) Marglob Мо 393;

10) Гаидас Мо 393; 11) Marglob Мо 628; 12) Гаидас Мо 628; 13) Marglob Мо 755; 14) Гаидас Мо 755; 15) Marglob L. hirsutum. var. glabratum;

16) Marglob L. esculentum var. racemigerum; 17) Гаидас L. hirsutum var.

glabratum; 18) Гаидас L. esculentum var. racemigerum.

кластерами по признакам фертильности, жизнеспособности, и количеству пыльцевых зерен. Результаты представлены в таблице 14.

Таблица 14 Результаты однофакторного дисперсионного анализа признаков с фактором кластер генотипов, выращенных при температуре +30 °C между кластерами между кластерами между кластерами дисперсионного анализа подтверждают различия между кластерами по всем признакам.

Доля влияния генотипов на признак фертильности пыльцевых зерен в условиях +30 °C составила 51,2 %, на жизнеспособность 61,2 %, количество пыльцевых зерен 80,9 %.

В заключение дисперсионного анализа был проведен ранговый тест, который позволил выявить различия между средними значениями каждого из изучаемых признаков (таблицы 15-17).

Таблица 15 – Ранговый тест средних значений фертильности пыльцевых зерен растений томата пораженных ВТМ, выращенных в условиях 30°C в разных кластерах Таблица 16 – Ранговый тест средних значений жизнеспособности пыльцевых зерен растений томата пораженных ВТМ, выращенных в условиях 30°C в разных кластерах Таблица 17 – Ранговый тест средних значений количества пыльцевых зерен растений томата пораженных ВТМ, выращенных в условиях 30°C в разных кластерах В результате анализа исследуемые образцы разделились на три кластера. В первый кластер вошли генотипы: Marglob Мо 755, Мо 628 L.

esculentum var. racemigerum, Гаидас Мо 628, Мо 628 L. hirsutum var.

glabratum, Мо 393 L. hirsutum var. glabratum, Мо 393 L. esculentum var.

racemigerum с высокими показателями жизнеспособности и количества пыльцевых зерен 6,33 тыс. шт.

Во второй кластер вошли генотипы: Гаидас, Marglob Мо 393, Гаидас Мо 393 характеризующиеся низкими показателями фертильности и жизнеспособности и количеством пыльцевых зерен, 25,71 % и 2,18 % соответственно.

В третий кластер вошли генотипы: Marglob, Marglob L. esculentum var. racemigerum, Мо 755 L.hirsutum var. glabratum, Гаидас L. hirsutum var.

glabratum, Мо 755 L. esculentum var. racemigerum, Marglob L.hirsutum.

var. glabratum, Гаидас Мо 755, Гаидас L. esculentum var. racemigerum, Marglob Мо 628 характеризующиеся высокими показателями фертильности пыльцевых зерен 34,25 %, жизнеспособности 2,44 % пыльцевых зерен растений томата.

Таким образом, можно сделать заключение, что в число лучших генотипов вошли представители первого и третьего кластеров. Именно они имели максимальные статистически достоверно отличающиеся значения по признакам фертильность и жизнеспособность пыльцевых зерен растений томата от генотипов второго кластера. По количеству пыльцевых зерен растений томата был выделен один культурный сорт томата Marglob и гибридов F1: Мо 755 L. esculentum var. racemigerum, Мо 755 L. hirsutum var. glabratum, Marglob Мо 628, Гаидас Мо 755, Marglob L. hirsutum. var.

glabratum, Marglob L. esculentum var. racemigerum, Гаидас L. hirsutum var.