«НЕХАЕВА Татьяна Леонидовна ОПТИМИЗАЦИЯ ТЕХНОЛОГИИ И СТАНДАРТИЗАЦИЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ВАКЦИН НА ОСНОВЕ АУТОЛОГИЧНЫХ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК специальность – 14.01.12 – онкология – 14.03.09 – клиническая иммунология, ...»

Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение

«Научно-исследовательский институт онкологии имени Н.Н. Петрова»

(ФГБУ «НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России)

На правах рукописи

НЕХАЕВА

Татьяна Леонидовна

ОПТИМИЗАЦИЯ ТЕХНОЛОГИИ И СТАНДАРТИЗАЦИЯ ПОЛУЧЕНИЯ

ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ВАКЦИН НА ОСНОВЕ АУТОЛОГИЧНЫХ

ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК

специальность – 14.01.12 – онкология – 14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научный руководитель:

доктор медицинских наук И. А. Балдуева Санкт-Петербург Оглавление Введение

Глава 1

Дендритные клетки (ДК) и их роль в противоопухолевом иммунитете

(обзор литературы)

Фенотипическая и функциональная гетерогенность ДК

1.1.

Миелоидные ДК: иммунофенотип и функциональная активность

1.2.

Миелоидные ДК и противоопухолевый иммунный ответ

1.3.

Миелоидные ДК и противоопухолевая вакцинотерапия

1.4.

1.5. Требования надлежащей лабораторной практики (GLP) в получении противоопухолевых дендритноклеточных вакцин

Глава 2

Материалы и методы исследования

2.1. Материалы

2.2. Методы

2.2.1. Получение костномозговых и периферических дендритных клеток

2.2.2. Дифференцировка дендритных клеток из миелоидных предшественников ex vivo 2.2.3. Приготовление опухолевого лизата содержащего раково-тестикулярные антигены

2.2.4. Криоконсервация миелоидных предшественников и вакцинных дендритных клеток

2.2.5. Размораживание миелоидных предшественников и вакцинных дендритных клеток 2.2.6. Оценка количества и жизнеспособности (миелоидных предшественников, вакцинных дендритных клеток, мононуклеаров, опухолевых клеток)

2.2.7. Иммуноцитохимическая характеристика дендритных клеток

2.2.8. Иммунофенотипический анализ миелоидных предшественников, вакцинных дендритных клеток, опухолевых клеток

2.2.9. Мониторинг специфического поствакцинального иммунного ответа (ELISpot анализ)

2.2.10. Оценка поствакцинального гуморального иммунного ответа

(клеточный ИФА)

Глава 3

Стандартизация методов получения и криоконсервации миелоидных предшественников ДК из аферезного материала и периферической крови

3.1. Стандартизация оптимальных условий выделения МНК и моноцитов из аферезного материала и периферической крови

3.2. Стандартизация оптимальных условий криоконсервации МНК и моноцитов из аферезного материала и периферической крови

Глава 4

Оптимизация и стандартизация условий дифференцировки вакцинных ДК

4.1. Изучение влияния ростового фактора GM-CSF импортного (GM-CSF1) и отечественного (GM-CSF2) производства на дифференцировку ДК ex vivo

4.2. Изучение влияния различных концентраций IL-4 на дифференцировку ДК ex vivo..... 4.3. Изучение влияния IFN- на дифференцировку ДК ex vivo

4.4. Изучение влияния питательных сред на дифференцировку и созревание ДК................ 4.4.1. Оценка иммунофенотипа ДК, дифференцированных на различных питательных средах: контроль качества

Глава 5

Оптимизация и стандартизация условий нагрузки и активации ДК

5.1. Характеристика клеточных линий меланомы кожи человека, экспрессирующих РТА. 5.2. Нагрузка и активация незрелых CD14-CD1a+CD83- ДК

5.3. Оценка дифференцировки ДК по уровню экспрессии иммунофенотипических маркеров на разных стадиях созревания ДК

Глава 6

Стандартизация условий криоконсервации и хранения вакцинных ДК в соответствии иммунофенотипа, требований надлежащей лабораторной и клинической практики............... 6.1. Оценка жизнеспособности ДК до и после криоконсервации в ультранизких температурах

6.2. Продолжительное хранение криоконсервированной дендритноклеточной вакцины:

контроль качества

6.3. Оценка возможности использования бессывороточной среды для криоконсервации и хранения ДК

6.4. Оценка функциональной активности криоконсервированных вакцинных ДК............... 6.5. Скрининг вакцинного препарата ДК на наличие инфекционных агентов: контроль качества

6.6. Организация лаборатории длительного хранения криоконсервированных дендритноклеточных вакцин (криогенная лаборатория)

Глава 7

Активная специфическая иммунотерапия (вакцинотерапия) аутологичными костномозговыми и периферическими ДК больных диссеминированной меланомой кожи... 7.1. Оценка безопасности вакцинотерапии аутологичными дендритными клетками........... 7.2. Оценка клинической эффективности вакцинотерапии аутологичными дендритными клеткаими

7.3. Оценка иммунологической эффективности терапии

7.3.1. Оценка реакций ГЗТ у больных на фоне терапии ДКВ

7.3.2. Оценка содержания субпопуляций лимфоцитов у больных, получавших лечение аутологичными ДК

7.3.3. Оценка специфического иммунного ответа

Глава 8

Обсуждение результатов исследования

Выводы

Литература

Приложения

ПЕРЕЧЕНЬ ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АПК – антигенпрезентирующая клетка ГЗТ гиперчувствительность замедленного типа ДМСО – диметилсульфоксид ИФА – иммуноферментный анализ МкАт – моноклональные антитела МНК – мононуклеары периферической крови ОАА – опухолеассоциированные антигены НЯ – нежелательные явления ПЗ – прогрессирование заболевания РТА – раково-тестикулярные антигены СКПК – стволовая клетка периферической крови СЗ – стабилизация заболевания ОЦК – объем циркулирующей крови ЧСС – частота сердечных сокращений ЦТЛ цитотоксический Т-лимфоцит – надлежащая лабораторная практика GLP – надлежащая производственная практика GMP гранулоцитарный колониестимулирующий фактор G-CSF – гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор GM-CSF – надлежащая клиническая практика GCP – лейкоцитарные антигены человека HLA IL- TNF- – фактор некроза опухоли альфа распространенным опухолевым процессом является актуальной задачей современной онкологии. Высокий уровень смертности, недостаточная эффективность лекарственного лечения, прорыв в понимании молекулярно-генетических и иммунобиологических механизмов развития рака, становятся основополагающими факторами развития фундаментальной и клинической онкологии (Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2009). Анализ мировой литературы и информация ведущих сайтов в области онкологии (http://www.fda.gov/ U.S. Food and Drug Administration; http://www.cancer.gov/ the National Cancer Institute (NIH, USA); http://www.reportlinker.com/ Industry reports, Company profiles and Market Statistics) свидетельствует о перспективах развития иммунобиологических технологий, персонализации лекарственного лечения и иммунотерапии больных с местнораспространенными и метастатическими формами рака.

На современном этапе развития науки не представляет сомнений факт участия дендритных клеток (ДК) в «высокопрофессиональной» презентации низкоиммуногенных опухолеассоциированных антигенов (ОАА) (Михайлова И.Н. и соавт., 2007; Morel P.A., Turner M.S., 2010; Murphy J.F., 2010). ДК являются объектом широкого круга исследований, основной целью которых является создание клеточных вакцин, способных корректировать иммунный ответ у больных со злокачественными новообразованиями (Барышников А.Ю. и соавт., 2009; Кадагидзе З.Г. и соавт., 2011; Ridgway D., 2003; Mackiewicz J., Mackiewicz A., 2009; Palucka K. et al., 2010; Castiello L. et al., 2011; Tuyaerts S., 2011). Разработка отечественных инновационных (оригинальных) вакцин на основе аутологичных дендритных клеток (ДК-вакцина), обладающих эффективностью, безопасностью и надлежащим уровнем качества, отвечают задачам стратегической импортзамещающей программы Правительства РФ. Решение данной проблемы предполагает использование комплексного подхода к созданию аутологичных терапевтических вакцин современными высокотехнологичными методами на основе системного изучения биологических и технологических характеристик вакцинного препарата, и их рационального выбора. По данным электронного регистра клинических исследований Национального института здоровья США (www.clinicaltrial.gov) в настоящее время в мире проводится более 200 клинических испытаний I-II-III фаз с использованием ДК в лечении различных заболеваний (меланома, рак почки, множественная миелома, рак предстательной железы, толстой кишки, молочной железы, глиобластома, рак легкого, лимфома, рак пищевода, саркома, а также рассеянный склероз, вирусный гепатит, ВИЧ-инфекция и др.). Вместе с тем, использование ДК-вакцин, обладающих эффективностью, безопасностью и надлежащим уровнем качества в рутинной клинической практике, предполагает оптимизацию и стандартизацию рекомендованных методик (Моисеенко В.М., Балдуева И.А., 2011; Draube A. et al., 2010; Alfaro C. et al., 2011;

Chiang C.L.L. et al., 2011; Harada Y., Yonemitsu Y., 2011).

Дифференцировка вакцинных ДК из миелоидных предшественников in vitro с использованием различных питательных сред, ростовых факторов и факторов дифференцировки различной активности, выбор которых для каждой лекарственной формы ДК (зрелые, незрелые) основан на оценке иммунобиологических и технологических характеристик, изучении их влияния на эффективность, безопасность и стабильность лекарственной формы, в ряде случаев препятствует получению стандартного клеточного продукта охарактеризованного качества (Балдуева И.А., 2008; Toh H.C. et al., 2009; Koido S.

et al., 2011; Ning J. et al., 2011). Решение данной проблемы предполагает использование комплексного подхода к созданию аутологичных терапевтических вакцин современными высокотехнологичными методами на основе системного изучения биологических и технологических характеристик вакцинного препарата, и их рационального выбора.

Внедрение в производство и практическое использование терапевтических ДК-вакцин за рубежом (Provenge™, AVA, AVP), а также увеличение количества экспериментальных ДК-вакцин на российском рынке требуют оценки их биоэквивалентности. Для предварительной оценки иммуногенности разработанных ДК-вакцин в настоящее время рекомендованы иммунофенотипирование и различные функциональные тесты, в т.ч.

исследование сенсибилизированных поствакцинальных Т-лимфоцитов in vitro в тесте «ELISpot» (от англ. Enzyme-Linked Immunosorbent Spot) и выявление специфических опухолевых антител (IgG) методом клеточного ИФА («Whole cell ELISA»).

Выбор условий проведения исследования позволяет не только оценить качество лекарственной формы, но и контролировать стабильность технологии получения ДК-вакцин.

Обеспечение качества отечественных аутологичных ДК-вакцин предполагает стандартизацию и контроль качества на основе использования рекомендованных методик, а также испытаний, отвечающих требованиям гармонизации и унификации. Сочетание новых мощных инструментов иммуномониторирования с усовершенствованием протоколов ДК вакцинации и рационально выстроенные фундаментальные научные исследования обеспечат больше доверие к противоопухолевой вакцинотерапии и откроют новые возможности лечения онкологических больных (Демидов Л.В., Харкевич Г.Ю., 2003).

Внедрение в клиническую практику стандартизированных методов получения вакцин на основе аутологичных костномозговых и периферических ДК для лечения больных меланомой кожи.

1. Апробировать и оптимизировать получение миелоидных предшественников ДК из лейкаферезного материала и периферической крови.

2. Стандартизировать условия дифференцировки, нагрузки и активации аутологичных ДК на основе изучения иммунофенотипа незрелых и зрелых ДК и уровня экспрессии раково-тестикулярных антигенов (РТА) на опухолевых клеточных линиях, используемых для специфического созревания ДК.

3. Оценить стабильность иммунобиологических характеристик стандартизированныхДКвакцины на основе незрелых костномозговых и зрелых периферических ДК в процессе криоконсервации и хранения.

4. Изучить иммунологическую и клиническую эффективность стандартизированных ДКвакцин.

В диссертационной работе впервые:

стандартизированы методы получения ДК-вакцин на основе аутологичных костномозговых и периферических предшественников;

проведена оценка поствакцинального клеточного и гуморального иммунного ответа у больных диссеминированной меланомой кожи.

Обоснована целесообразность использования стандартизированных ДК-вакцин для лечения больных меланомой кожи.

Снижена себестоимость получения ДК-вакцин в 5 раз за счет оптимизированного отечественного производства.

Адаптированы, оптимизированы и внедрены в клинико-лабораторную практику ELISpot-анализ и клеточный ИФА.

Описаны стандартные операционные процедуры (СОП) для всех этапов получения ДК 1. В результате оптимизации процесса дифференцировки ДК in vitro установлено:

применение ростового фактора GM-CSF (72 нг/мл) отечественного производства (Фармсинтез, Россия) и GM-CSF (72 нг/мл) импортного производства (CellGenix, Германия) обеспечивает получение сопоставимых результатов и приводит к снижению стоимости ДК-вакцин в 5 раз.

2. Оптимальная концентрация IL-4 для дифференцировки ДК находится в пределах от до 20 нг/мл, что снижает производство ДК-вакцин в 3-5 раз.

3. Для получения стандартизированных ДК-вакцин рекомендуется использовать оптимизированную панель моноклональных антител: CD14, CD1а, CD83, CD86, CD80, окрашивание, что позволит корректно определить степень зрелости ДК.

4. Критерием контроля качества вакцинных ДК является: жизнеспособность, иммунофенотип незрелых и зрелых опухолеспецифических ДК, высокая функциональная активность, отсутствие в вакцине ксеногенной сыворотки и инфекционных агентов на всех этапах дифференцировки, криоконсервации, разморозки и готовой лекарственной формы аутологичной ДК-вакцины.

Дендритные клетки (ДК) и их роль в противоопухолевом иммунитете Первое упоминание о ДК (клетки с многочисленными отростками, ветвями) относится к 1868 г., когда Пауль Лангерганс впервые обнаружил их в эпидермисе и описал как «дендриты». Однако на тот момент не было сведений относительно их функций, в литературе обсуждался вопрос об их принадлежности к нервной системе.

В 1973 г. американские иммунологи Ральф Стейман и З. Кох обнаружили редкий тип клеток в селезенке мышей, которые обладали способностью индуцировать выраженный иммунный ответ (Steinman R., Cohn Z., 1973, 1975). Эти работы заложили фундамент современных представлений о ДК. Вместе с тем, изучение ДК началось только в 90-е годы XX века.

К наиболее важным достижением этого периода относят разработку методов получения ДК из моноцитов периферической крови и костномозговых предшественников in vitro, что привело к значительному расширению возможности изучения ДК, и открыло эру клинического применения дендритноклеточных вакцин (ДК-вакцин). Среди других достижений этого периода заслуживает внимание изучение различных типов ДК и их дифференцировка, установление роли ДК в регуляции клеточного и гуморального врожденного и адаптивного иммунного ответа, изучение ДК в патогенезе инфекционных, аутоиммунных и онкологических заболеваний.

1.1. Фенотипическая и функциональная гетерогенность ДК ДК редко встречаются среди лейкоцитов периферической крови (менее 1%) и обычно демонстрируют сложную фенотипическую и функциональную гетерогенность популяции.

Субпопуляции ДК активно исследуются. Установлено, что ДК очень мощные «профессиональные» антиген представляющие клетки (АПК), которые отвечают за захват, обработку и представление антигена Т-клеткам, тем самым запускают первичные и вторичные иммунные реакции (Bachereau J. et al., 2000; Ueno H. et al., 2010; Palucka K, Banchereau J., 2013).

Неоднородность ДК отражается на четырех уровнях: 1) предшественники, 2) анатомическая локализация, 3) функции и 4) конечный результат иммунной реакции (Lin Kah-Wai et al., 2006). В последние несколько лет проводятся попытки классифицировать ДК по разнообразию их фенотипа, функциональному анализу, но до сих пор не установлена полная модель.

ДК широко представлены в организме человека: клетки Лангерганса в эпидермисе, ДК периферической крови, лимфоидной и нелимфоидной ткани, интердигидатные ДК, ДК зародышевого центра лимфатического узла, плазмоцитоидный домен лимфоидной ткани и т.д. (Hart D.N., 1998; Vandenabeele S. et al., 2001; Pletinckx K. et al., 2011; 2013). Обнаружены иммуногенные и толерогенные зрелые и незрелые иммунофенотипы. В тимусе зрелые ДК вызывают толерантность тимоцитов к собственным тканевым антигенам путем негативной селекции. Имеется много исследований по субтипам плазмоцитоидных ДК в лимфоидной ткани мыши и немного исследований по данному типу ДК в тимусе человека. S.

Vandenabeele и др. (2001) выделил две популяции ДК в тимусе: более 65% ассоциированы с иммунофенотипом плазмоцитоидных ДК (CD11b-CD33loCD45lo) и менее 35% отнесены к миелоидным ДК (CD11b+CD33hiCD45hi). В более поздних работах ДК представлены как зрелые и незрелые, CD11b- продуцирующие IL-12 и CD11b+ не продуцирующие IL-12.

В работах N. Vermare представлены аналогичные результаты, описаны три субпопуляции ДК тимуса: 1) CD11c- плазмоцитоидные ДК, продуцирующие INF-; 2) CD11c+ незрелые миелоидные ДК; и 3) зрелые интердигитатные плазмоцитоидные ДК.

Однако L. Wu и совт. (2005) в результате исследования миндалин человека и зародышевых центров лимфоидной ткани описали пять типов ДК, в т.ч. три интердигидатных подтипа, плазмоцитоидные и ДК зародышевого центра.

Небольшое количество ДК в тканях и органах, трудность выделения способствовали изучению их в условиях in vitro. Многие результаты были получены на культурах ДК вне их естественной жизнедеятельности и имеют определенные отличия в зависимости от экспериментальных моделей (Duraisingham S.S. et al., 2010; Lpez-Bravo M. et al., 2013).

способствовал разделению их на:

фолликулярные ДК (изучается происхождение);

лимфоидные ДК (ассоциируют с лимфопоэзом);

миелоидные (моноцитопоэз) – миелоидные ДК1 и ДК2;

плазмацитоидные ДК – основные продуценты интерферона 1-го типа (IFN-, В тоже время многие авторы наиболее часто выделяют два основных типа ДК: 1) CD11c+CD123lo миелоидные ДК и 2) CD11c-CD123hi лимфоидные ДК, на основе пути их развития (Robinson S.P. et al., 1999; O’Neill D.W. et al., 2003; Redecke V. et al., 2013).

Функционально миелоидные ДК – иммуногены, запускают иммунный ответ; лимфоидные ДК – вызывают иммунологическую толерантность. Однако, T. Ito и соавт. (1999) выделили типа ДК периферической крови: 1) CD1a+CD11c+ и отнесли их к предшественникам клеток Лангерганса; 2) CD1a-CD11c+ моноцитарные интерстициальные предшественники; 3) CD1aCD11c- плазмоцитоидные ДК. В более поздних работах A. Dzionek и соавт. (2000), описали новые маркеры для плазмоцитоидных ДК периферической крови: BDCA-1 (CD1c) и BDCA- (CD141) среди субпопуляций миелоидного происхождения и BDCA-2 (CD303) и BDCA- (CD304), характерные для лимфоидных / плазмацитоидных ДК.

Было показано, что BDCA-1 (CD1c) антиген экспрессируется на субпопуляции ДК человека, которые по морфологическическим признакам сходны с моноцитами периферической крови. Эти клетки охарактеризованы как CD4, Lin, CD11c CD45RO+, CD2+ с выраженной экспрессией миелоидных маркеров (CD13+, CD33+). Кроме того, они экспрессируют Fc рецепторы (CD32, CD64, FceRI).

BDCA-2+ клетки обладают специфичностью и выявляются на лимфоидных (плазмацитоидных) ДК человека в сочетании с экспрессией CD4+, Lin-, CD11c-, CD123bright, CD45RA+, CD2- без миелоидных компонентов (CD13-CD33-) и Fc рецепторов. Эти клетки циркулируют в периферической крови и мигрируют в лимфоидные и нелимфоидные ткани (Jhn P.S. et al., 2010).

BDCA-3 антиген экспрессируется на CD11c+, CD123- миелоидных ДК.

BDCA-4+ ДК соответствуют иммунофенотипу лимфоидных / плазмацитоидных ДК с высокой экспрессией CD123hi и отсутствием на клетках CD11c миелоидного антигена.

Вместе с тем в литературе обсуждается характеристика ДК периферической крови по экспрессии других маркеров, таким как CD33, CD16, CD2, CD1, CD85, IL-3Ra, и т.д. K.P.

MacDonald и совт. (2002) использовали широкий спектр моноклональных антител (МоАт) и выделили пять неперекрывающихся подтипов ДК периферической крови с различным уровнем экспрессии CD123, CD1b/c, CD16, BDCA-3 и CD34 антигенов. Несомненно, это исследование увеличило специфику и расширило классификацию ДК периферической крови, однако, их функции и этап развития не были определены.

В результате многочисленных исследований и детализации иммунофенотипа различных типов и субтипов ДК, миелоидный путь развития ДК не вызывает сомнения.

Периферические CD14+ моноциты являются общим предшественником для макрофагов и ДК, в том числе полученных в экспериментах in vitro. На их основе изучается противоопухолевый иммунитет, и разрабатываются противоопухолевые вакцины.

1.2. Миелоидные ДК: иммунофенотип и функциональная активность циркулируют в периферической крови, мигрируют в ткани и дифференцируются в незрелые ДК. При распознавании чужеродных антигенов созревающие ДК мигрируют в лимфоидные органы, секретируют цитокины и инициируют иммунный ответ (McLellan AD, Kmpgen E., 2000; Steinbrink K., 2009). Миелоидные ДК обладают выраженной антиген представляющей функцией, играют решающую роль в активации врожденного и адаптивного иммунного ответа, стимулируют Т-, NK и B-клетки, но могут регулировать нарушения в активации иммунного ответа, способствовать развитию толерантности и, таким образом, предотвращать аутоиммунные заболевания.

Миелоидные ДК экспрессируют высокий уровень MHC (MHC от англ. Major стимулирующие молекулы (CD40, CD80, CD86) и адгезионные молекулы (CD11a, CD15s, CD18, CD29, CD44, CD49d, CD50, CD54), которые необходимы для образования иммунологического синапса и наиболее полной активации Т-лимфоцитов (Lin Kah-Wai et al., 2006; 2010). На ДК периферической крови не выявляются линейноспецифические антигены, но их распознают по высокой экспрессии MHC II класса (HLA DRhi) антигенов и отсутствии клональных маркеров, таких как CD8, TCR (Т-клеточного рецептора) и Т-клеточного линейного маркера CD90; B-клеточных антигенов CD10 и CD20; линейного маркера CD для NK-клеток; моноцитарного антигена CD14; гранулоцитарной клеточной линии с экспрессией CD15 и CD35 и гликофорина для эритроидной линии (Olweus J. et al., 1997;

Takeuchi S, Furue M., 2007). Циркулирующие ДК периферической крови могут быть или ДКпредшественниками, мигрирующими из костного мозга в периферические ткани, или созревающими ДК, нагруженными антигеном на пути в периферические лимфоидные органы (Romo L.F. et al., 2001; Xin H.M. et al., 2009).

M.B. Lutz и G. Schuler (2002) предложили выделять промежуточную группу ДК, полузрелую, толерогенную, на клетках которой обнаруживается высокий уровень MHC II и характеризуются низким уровнем продукции IL-1, IL-6, TNF- и IL-12. Частичное созревание ДК в результате положительной регуляции MHC и ко-стимулирующих молекул, встреча с Т-клетками в их анатомических Т-зависимых зонах лимфатических узлов способствовала укреплению термина «полузрелые» ДК. В исследованиях K.H. Mills и P.

VcGuirk (2004), D. Braun и соавт. (2006), G. Frick и соавт. (2010), P.A. Morel и M.S. Turner (2011) «полузрелыми» формами миелоидных ДК.

Кроме того, показаны количественные различия в экспрессии генов в «полузрелых» и «зрелых» ДК. K. Pletinckx и соавт. (2011) сравнили экспрессию генов в «полузрелых» ДК (TNF) с полностью зрелыми ДК под воздействием липополисахарида (LPS). Авторы получили, главным образом, количественные различия между этими формами. Общим оказалась экспрессия только 24 генов провоспалительных цитокинов, характерных для «полузрелых» ДК от почти 5000 генов, регулируемых LPS в зрелых ДК (Pletinckx K. et al., 2011; 2013).

1.3. Миелоидные ДК и противоопухолевый иммунный ответ Эффективность противоопухолевого иммунного ответа определяется балансом Th1/Th2 лимфоцитов (Th – Т хелперы 1-го и 2-го типа) и продуцируемых ими цитокинов. ДК стимулируют образование Th1 и Th2 клеток в результате регуляции отрицательной обратной связи. Th1 лимфоциты продуцируют интерферон-гамма (INF-), поддерживают активность ДК1 и клеточный тип иммунного ответа; Th2 продуцируют IL-4, угнетают функциональную активность предшественников ДК в инициации образования Th2 клеток и гуморального типа иммунного ответа. Таким образом, хотя IL-4 стимулирует дифференцировку наивных Тклеток в Th2, его влияние не связывают со стимуляцией образования Th2 и ДК2 АПК.

Высокая экспрессия костимулирующих сигналов CD80 и CD86 на зрелых ДК одновременно с распознаванием Т-клеточным рецептором иммунногенного пептидного фрагмента антигена в контексте МНС молекул на ДК, секреция ДК IL-12, стимулирующего Тклеточные реакции, в частности дифференцировку клеток Th1 и продукцией ими IFN- и других воспалительных цитокинов.

Иммунная система обладает выраженной способностью элиминировать опухолевые клетки. На мышиных экспериментальных моделях показано, что генерация защитного противоопухолевого иммунитета зависит от презентации опухолеассоциированных антигенов (ОАА) ДК.

Процесс распознования ОАА незрелыми дендритными клетками происходит на основе рецепторного аппарата (Fc-рецепторы, С-лектины, Toll-подобные рецепторы (TLR), рецепторы для компонентов комплимента и др.). На миелоидных ДК наиболее полно представлены С-лектины и TLR. В функциональной активности ДК важное значение имеют рецепторы лектинового типа (DEC-205 или СD205, макрофагальный маннозный рецептор или СD206, лангерин или СD207, DC-SIGN или СD209). С-лектины - это трансмембранные белковые молекулы, взаимодействующие со специфическими углеводсодержащими структурами ОАА и играющие ключевую роль в осуществлении межклеточных контактов.

Важной особенностью DC-SIGN (СD209) рецептора является его способность связываться с молекулой межклеточной адгезии ICAM-3 – лигандом 2 – интегринов, что определяет его участие в процессах сосудистого роллинга и миграции миелоидных предшественников дендритных клеток из кровотока в ткани. DC-SIGN: DC-specific ICAM-3 grabbing nonintegrin (специфичный для дендритных клеток ICAM-3-связывающий неинтегрин) (Svajger U et al., 2010; Garcia-Vallejo J.J. et al., 2013). Присутствие С-лектиновых молекул на поверхности дендритных клеток дает им возможность, в отличие от многих других клеток организма, осуществлять большую работу по эндоцитозу. Созревание ДК сопровождается быстрым снижением поверхностной экспрессии рецепторов к восполительным хемокинам, а вместо них экспрессируются рецепторы хемокинов, направляющих клетки в лимфатические узлы.

Важную роль среди этих рецепторов отводят CCR7 – рецептору к лимфоидным (конституциональным) хемокинам CCL19 и CCL21. Кроме того, сами ДК продуцируют CCL19, который привлекает наивные Т-лимфоциты в непосредственную близость к ДК для презентации антигенов.

(протеосомальным) путем презентируются в составе молекул главного комплекса гистосовместимости МНС (от англ. Major Histocompatibility Complex), которые распознают в антигенах определенные последовательности аминокислот, более короткие, чем те, которые распознаются Т-клеточными рецепторами (Говалло В.И., 1971; Петров Р.В., 1976; Воробьев А.А., 1982; Зарецкая Ю.М., 1983; Alajez N.M. et al., 2005; Deng L. et al., 2007).

образуется иммунный синапс – сложный комплекс молекул адгезии, антигенпредставления и костимуляции, в котором происходит обмен информации между двумя клетками (рис. 1).

Рис.1. Взаимодействие CD4+ и CD8+ Т-лимфоцита с антигенпрезентирующей клеткой (ДК).

В процессе активации Т-клеток и образовании иммунологического синапса, наряду с CD3- и CD28-молекулами, важную роль отводят рецептору трасферрина (CD71), который в исследованиях A.Batista и соавт. (2004) снижал межклеточную кооперацию Т-лимфоцитов и АПК в присутствии специфических анти-CD71 моноклональных антител (МКА).

1.4. Миелоидные ДК и противоопухолевая вакцинотерапия иммунобиологического надзора при развитии опухоли связано с нарушением функции периферических ДК (Diao J. et al., 2010). Эти дефекты обусловлены, прежде всего, снижением экспрессии молекул I и II класса главного комплекса гистосовместимости (МНС), ответственного за презентацию ОАА, и костимулирующих молекул CD80 и CD86, регулирующих активность Т-лимфоцитов (Syme R. at al., 2005; Amigorena S., Savina A., 2010). Существует предположение, что это связано с факторами, продуцируемыми опухолевыми клетками. Действительно, в эксперименте получены данные, свидетельствующие о том, что развитие опухоли у экспериментальных животных приводит к нарушению созревания ДК, снижению экспрессии молекул МНС II класса на их поверхности (Kim R. et al., 2006; Tourkova I.L. et al., 2007). При этом вакцинация мышей ДК, выращенных из костномозговых предшественников ex vivo, тормозит рост опухоли, а введение зрелых ДК из селезенки, не оказывает на него влияния. Было также показано, что супернатант опухолевых клеток снижает способность ДК контролировать цитотоксическую функцию аллогенных Т-клеток, только в том случае, когда с ними инкубировали созревающие ДК, полученные из костного мозга, а не зрелые клетки, полученные из селезенки экспериментального животного с опухолью (Gabrilovich D.I., Hurwitz A., 2008).

При изучении функциональной активности ДК у больных с диссеминированной карциномой молочной железы было показано, что зрелые ДК этих больных не способны стимулировать цитотоксичность Т-клеток, в то время как способность Т-лимфоцитов колониестимулирующего фактора (GM-CSF) и интерлейкина-4 (IL-4) из костномозговых предшественников этих же больных, демонстрировали нормальный уровень функциональной активности или очень высокий при стимуляции специфическими ОАА, в том числе аутологичными опухолевыми клетками в апоптозе (Allan C.P. et al., 2004).

Положение о том, что прогрессирующе растущая опухоль является следствием иммунологической недостаточности и что своевременная коррекция такой недостаточности может обеспечить контроль над опухолевым ростом, открывает реальные перспективы эффективной иммунотерапии при злокачественных опухолях у человека. Учитывая центральную роль ДК и СD8+ цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) в противоопухолевом иммунном ответе в организме, наиболее подходящими для этой цели могут оказаться вакцины на основе ДК пациента с генетически индивидуальной опухолью (Bergman P.J., 2007; 2010; Kawakami Y. et al., 2008).

Правила безопасности требуют, чтобы новые иммунотерапевтические методы изучались у пациентов с распространенным опухолевым процессом, устойчивых к стандартным методам лечения или в случае их отсутствия. Эти исследования определяют токсичность, иммунологическую и клиническую эффективность. Однако даже самый оптимальный иммунный ответ, в конечном счете, может не преодолеть опухолевую прогрессию. Поэтому важным является проведение безопасных исследований у пациентов с наименьшим распространением опухолевого процесса, у которых реально можно оценить клиническую и иммунологическую эффективность, разработать дальнейшую тактику использования противоопухолевых вакцин.

Трудным аспектом иммунологических протоколов является идентификация иммунологических маркеров, которые коррелируют с клинической эффективностью. В настоящее время для исследования поствакцинального иммунного ответа используют оценку «bystander effect» (эффект свидетеля) в реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) in vivo, ELISpot-тест, тетрамерный анализ in vitro. Реакция ГЗТ развивается через 24 ч в месте введения опухолевых антигенов или зрелых ДК, вследствии инфильтрации кожи Т-хелперами, ЦТЛ, специфичными к антигену, представленному местными АПК, секретирующие цитокины, повышающие сосудистую проницаемость и привлекающие другие клетки воспаления (Janeway C. et al., 2011). Иммуногистохимическое окрашивание моноклональными антителами CD1a, CD3, CD4, CD8, CD14, CD20, CD83, CD86 кожных биоптатов реакции ГЗТ позволяет выявлять привлечение активированных ДК, ЦТЛ, В-лимфоцитов, макрофагов, Т-хелперов (de Vries I.J et al., 2005).

Изучение продукции цитокинов (IFN-, Gr-, IL-4,TNF-) опухоль-специфическими Т-лимфоцитами в ELISpot-тесте, визуализация активированных Т-лимфоцитов при помощи проточного цитофлюориметрического анализа с использованием меченного комплекса пептид-MHC, который специфично связывается с Т-клеточным рецептором лимфоцита и реакция гиперчувствительности замедленного типа, далеко не всегда сопровождается регрессом опухоли. Отсутствие такой корреляции между иммунологической и клинической эффективностью иммунотерапии (в том числе вакцинотерапии) даже при достижении «bystander effect’s» является одной из нерешенных проблем биотерапии злокачественных опухолей.

Показателем эффективности является объективный клинический ответ, безрецидивная выживаемость и время до прогрессирования, но для этого требуется достаточно много времени. Поэтому возникает необходимость в поиске «суррогатных маркеров», коррелирующих с клинической эффективностью.

Прогрессу вакцинации против инфекционных болезней способствовало определение уровня антител как «суррогатных маркеров», видимо, прогресс вакцинации против рака может быть связан с углубленным изучением «суррогатных маркеров» Т-клеточных реакций вакцинированных лиц. Кроме того, клиническая оценка эффективности вакцинотерапии злокачественных опухолей еще недостаточно изучена и нуждается в разработке критериев включения и исключения в исследование, большей градации в оценке клинического эффекта.

Например, увеличение времени до прогрессирования у ряда пациентов с IV стадией меланомы кожи может быть менее претенциозным, но более существенным клиническим признаком, чем совсем небольшое число пациентов с полным регрессом опухоли.

Кроме того, еще остаются неизученными механизмы, способствующие разрушению опухоли у пациентов с полным объективным ответом. Т-клетки некоторых пациентов не могут развивать адекватный иммунный ответ на сложные опухолеассоциированные антигены in vivo. Однако эксперименты in vitro демонстрируют, что Т-клетки большинства пациентов отвечают на индукцию сложных меланомаассоциированных антигенов и дифференцируются в ЦТЛ. В то же время, даже если Т-клетки отвечают in vivo, у пациентов с прогрессированием заболевания опухолевое микроокружение может увеличить агрессивность и способствовать элиминации опухоль-специфических Т-клеток in situ (Mantovani A. et al., 2008). Ответом на этот вопрос может быть дальнейшее изучение CD4+ Тклеточного иммунитета. Не исключено, что у пациентов с прогрессирующим опухолевым ростом могут быть нарушения в системе СD4+ Т-клеток, которые влияют на индукцию антиген-специфических CD8+ Т-клеток. В противоположность этому, прогрессия опухоли может быть ассоциирована с регуляторными клетками, такими как NKT- или Tr1-клетки (Zhang C. et al., 2006; Terable M., Berzofsky J.A., 2007). Предполагается, что эти иммунокомпетентные клетки регулируются различными субпопуляциями ДК (Ullrich E. et al., 2008). Поэтому крайне важно изучение генерации субпопуляций ДК с различными линейными признаками (миелоидные, плазмоцитоидные), полученных из моноцитов в GM-CSF, IL-4, IL-6, IFNпредшественников в присутствии GM-CSF.

Вместе с тем, ДК, генерированные ex vivo как вакцина с помощью различных методов, представляют собой различные клеточные популяции, и это, несомненно, затрудняет оценку клинической и иммунологической эффективности ДК-вакцины (Guida M., Colucci G., 2007; Kochenderfer J.N., Gress R.E., 2007; Kawakami Y. et al., 2008). Прогресс в области эффективного клинического использования ДК требует стандартизации апробированных методов с целью дальнейшего изучения у больных с максимальным уменьшением объема опухолевой массы (циторедуктивные операции), минимальной остаточной болезнью, достаточной иммунокомпетентностью.

1.5. Требования надлежащей лабораторной практики (GLP) в получении По данным отраслевой целевой программы «Создание биомедицинской платформы злокачественных новообразований», представленной на рассмотрение Департаментом инновационной политики и науки Минздравсоцразвития РФ в июле 2011 года, в настоящее время в России не развита полноценная инфраструктура и кадровое обеспечение, отвечающее требованиям GLP для проведения крупномасштабных биомедицинских НИР.

Разработка системных подходов в области создания банков биологического материала для онкологических исследований является задачей международного уровня.

Нестандартизованная работа научных и клинических лабораторий является серьезным препятствием для совместного проведения научных исследований с зарубежными научными центрами и затрудняет обобщение современных достижений. Переход российских доклинических и клинических исследований на международные стандарты GLP и GCP (good clinical practice) диктует необходимость разработки стандартов.

Сложность системы ДК требует исключительной ответственности и осторожности при манипуляции с этими клетками, а расширяющееся использование вакцин на основе аутологичных ДК - стандартизации методов получения, активации, введения, клинической и иммунологической оценки (разработки методических рекомендаций и оформление стандартных операционных процедур (СОПов).

Правила надлежащей лабораторной практики распространяются на работу фармакологических, токсикологических и других лабораторий биологического профиля и имеют целью обеспечение приемлемости научных исследований на этапе доклинического изучения новых препаратов. Требования GLP регламентируют весь «жизненный цикл»

лекарственного средства: изготовление, изучение и контроль качества, лечебное применение.

Все три этапа правильной практики необходимо рассматривать, как единый механизм достижения эффективности системы качества.

Важность разработки СОПов подчеркивается и в документах, определяющих требования к качественной клинической практике (GCP), там это обусловлено целью добиться наибольшей достоверности получаемой информации путем ее унификации и формализации.

В настоящее время в мире проводятся значительные количества клинических исследований вакцин на основе дендритных клеток для лечения различных онкологических эффективности, чтобы считать ДК-вакцинотерапию перспективным и достойным дальнейшего изучения методом. Однако, результаты клинических исследований противоречивы, возможно из-за отсутствия стандартизированных протоколов получения вакцин на основе аутологичных ДК. Процесс приготовления вакцин на основе ДК состоит из нескольких этапов, что требует разработать критерии оценки контроля качества препарата ДК, в основу которого будет заложен контроль: получения предшественников ДК, дифференцировки ДК in vitro, жизнеспособности ДК, иммунофенотипических характеристик вакцинных ДК, стерильность вакцинного препарата и др.

Характеристика гемопоэтических предшественников дендритных клеток (ДК) при получении их из стимулированного гранулоцитарно-колониестимулирующим фактором (Г-КСФ) и нестимулированного свежевыделенного или криоконсервированного лейкаферезного материала или периферической крови больных злокачественными опухолями требует научно-обоснованного изучения уровня экспрессии миелоидных дифференцировочных антигенов, отражающих степень зрелости (качества) клеточного субпродукта (Papatriantafyllou M., 2011; Wong K.L. et al., 2011).

Большинство классических антигенпрезенетирующих клеток (АПК), включая макрофаги, клетки Лангерганса, интрдигитатные и дендритные клетки, присутствуют в организме уже при рождении (Lijima N. et al., 2007; Bordon Y., 2011). По всей вероятности, основная их масса образуется из стволовых клеток костного мозга. Возможно, они происходят из одной и той же колониеобразующей единицы гранулоцитов, эритроцитов, дифференцировки гемопоэтической стволовой клетки (ГСК), за исключением клеток лимфоидного ряда. Другая возможность состоит в том, что АПК образуются из разных стволовых клеток и по разным направлениям дифференцировки (Ziegler-Heitbrock L. et al., 2010; Senju S. et al., 2011).

Однонаправленная дифференцировка стволовых клеток в моноциты или ДК обусловлена появлением у них на разной стадии развития рецепторов для специфических факторов роста и дифференцировки (Bordon Y., 2010; Dorshking K., 2010). По мере созревания в их цитоплазме и на поверхности появляются и исчезают маркеры дифференцировки, увеличивается экспрессия молекул MHC II класса. Наиболее важная роль отводится экспрессии CD34, CD33, CD14, CD11 и HLA-DR антигенам, участвующих в созревании и активации миелоидных предшественников ДК, формировании врожденного иммунитета (Ярилин А.А., 2010; Clanchy F.I. et al., 2006; Gorczyca W. et al., 2011).

В связи с этим, актуальным становится разработка лабораторной методики оценки и контроля качества экспрессии вышеперечисленных антигенов в свежевыделенном, криоконсервированном или криоконцентрированном лейкаферезном материале больных злокачественными опухолями.

предшественников аферезного материала и периферической крови ex vivo с использованием различных питательных сред, сывороток, ростовых факторов и факторов дифференцировки для создания противоопухолевых вакцин становится важной стратегической задачей, и действия по ее реализации представляют исследования условий инкубации/культивирования моноцитов in vitro (среды, ростовые факторы, опухолевые антигены) (Cheryl L-L. Chiang. et al., 2011).

инновационных подходов позволят определить оптимальные условия культивирования моноцитов, созревание вакцинных ДК, что приведет к снижению затрат при их производстве.

При получении терапевтических ДК-вакцин важную роль играют ростовые факторы, выбор которых для каждой лекарственной формы ДК (зрелые, незрелые, иммуногенные, толерогенные) основан на оценке иммунобиологических и технологических характеристик, изучении их влияния на эффективность, безопасность и стабильность лекарственной формы.

Большое число ДК может быть получено in vitro в присутствии соответствующих цитокинов предшественников. Чаще всего в клинических исследованиях используют протокол получения ДК путем дифференцировки моноцитов периферической крови в присутствии GM-CSF и IL-4 в течение 5-7 дней (незрелые ДК) с последующей стимуляцией их созревания в течение 48 часов с различными ростовыми факторами (зрелые ДК) (Thurner B.

et al., 1999; Hettihewa L. M. et al., 2011). Для полного созревания к незрелым дендритным клеткам добавляют индукторы дифференцировки. На сегодняшний день известно довольно много ростовых факторов вызывающих дифференцировку дендритных клеток: CD40 лиганд, кондиционированная среда моноцитов, липополисахарид и др. В экспериментальной интерлейкина-6 (IL-6) и простагландин Е (ПГЕ2) (Dieckmann D. et al., 2005). Между тем было показано, что для дифференцировки дендритных клеток достаточно присутствие только ФНОа и ПГЕ2 (Се11а M. et al., 1997; Ridolfi R. et al., 2004). Гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) гликопротеин, гемопоэтический ростовой фактор, который регулирует образование функционирование иммунокомпетентных клеток:

дендритных клеток, макрофагов, гранулоцитов. In vitro GM-CSF используется для увеличения выхода незрелых ДК из моноцитов периферической крови человека. В 1990 г.

Koch F. и соавторы впервые продемонстрировали образование клеток с фенотипическими и функциональными свойствами, типичными для ДК, из гемопоэтических предшественников CD34+ с использованием GM-CSF и TNF- (Mukherji B. et al., 1997). Кроме того, по данным различных авторов используют широкий спектр ростовых факторов для дифференцировки и созревания ДК (Zou G.M., Tam Y.K., 2002). Такие цитокины как IL-2, IL-6, IL-7, IL- (Piemonti L. et. al., 1995; Lopez M. et. al., 1997), IL-15 и фактор роста гепатоцитов (Ovali E. et.

al., 2000) в комбинации или отдельно могут способствовать дифференцировки ДК из моноцитов или CD34+ клеток. Особый интерес представляют данными об ускоренном созревании ДК в присутствии интерферона-альфа (IFN-) (KorthalsM. et al., 2007). IFNострофазный провосполительный цитокин является главным сигналом для дифференцировки и созревания ДК, in vitro обеспечивает быструю дифференцировку моноцитов крови, предварительно культивируемых в среде с GM-CSF (Banchereau J., et al.

2001; Felzmann T. et al. 2005; Xia CQ. et al. 2007; Dudek A.M. et al. 2013). Для дифференцировки ДК из моноцитов периферической крови чаще используют GM-CSF в сочетании с IL-4 и их синергизм в индукции созревания (Justin A. et al., 2005; Hettihewa L.M., 2011). ИЛ- 4 участвует в развитии костномозговых клеток-предшественников. Один ИЛ-4 не изменяет интенсивность пролиферации этих клеток, но усиливает митотические процессы в сочетании с другими ростовыми факторами. ИЛ-4 в сочетании с GM-CSF обеспечивает более активное размножение клеток гранулоцитарного и моноцитарного ростков дифференцировки. При этом используются различные концентрации IL-4 и GM-CSF без достаточно обоснованной аргументации, что свидетельствует о различном диапазоне их активности. Использование широкого спектра ростовых факторов для дифференцировки ДК может приводить к получению разнообразных по фенотипам и функциям субпопуляций ДК.

Активация ДК. В поиске эффективных вакцин предложены разнообразные методы активации антигенпрезентирующих клеток (АПК) с целью преодоления иммунологической толерантности. Основными из этих методов являются:

а) использование вирусных, бактериальных векторов;

б) активация ДК синтетическими белками или пептидами, для этого необходимо проводить HLA-типирование больных, так как пептидные последовательности могут взаимодействовать только с соответствующими аллельными формами МНС;

в) нагрузка ДК опухолевыми антигенами (сокультивирование с опухолевыми клетками или их лизатами) (Somersan S. et al., 2001; Brusa D. et al., 2008);

г) трансфекция ДК с использованием ДНК или РНК (Palena C. et al., 2006).

Созревание ДК означает изменение функции клетки с захвата, фиксации и переработки антигена на антигенпрезентацию. Зрелые ДК превращают антиген в иммуногенную форму, экспрессируют необходимые цитокины и костимулирующие молекулы, обеспечивая, таким образом, инициацию специфического приобретенного иммунитета. Достаточно сложная методика получения и манипуляций с ДК требует не только использования дорогого оборудования, реактивов, трудоемких методов производства, высококвалифицированного персонала, но и, контроля и стандартизации. Кроме того, требуется разработка критериев и параметров стандартизации как компонентов, применяемых в производстве вакцины, так и зрелых ДК Разработка требований по хранению препарата дендритных клеток (ДК) имеет исключительно важное значение для широкого внедрения в лечебную практику противоопухолевых ДК вакцин. Реализация методов криоконсервации ДК вакцин стала возможной благодаря теоретическим разработкам проблем криобиологии, а также техническому прогрессу в области создания специальной аппаратуры для замораживания и хранения клеток и тканей при низкой и ультранизкой температуре (Heo Y.J. et al., 2009; Buhl T. et al., 2012). В результате фундаментальных исследований и разработки теоретических основ криоконсервирования вакцинных ДК, изучения реакций живых клеток на воздействие ультранизких температур, экспрессию поверхностных антигенов и продукцию цитокинов, были разработаны методы защиты клеток от повреждающего действия замораживания, изучены возможности осуществления обратимости жизнедеятельности замороженных ДК, выявлены оптимальные криозащитные среды, разработаны способы криоконсервации, которые диктуют необходимость разработки требований по хранению препарата ДК (Nicolette C.A. et al., 2007; Butterfield L.H., 2013).

Суммируя приведенные данные литературы, можно сделать следующее заключение.

Во-первых, данные о взаимодействии опухоли с Т-лимфоцитами, NK-клетками, макрофагами, ДК достаточно разноречивы. В отличие от ранних работ, в которых состоянию этих клеток отводилась ведущая роль в противоопухолевом иммунитете, в работах последних лет более пристально изучаются возможные воздействия на иммунную систему с помощью специфических противоопухолевых вакцин. Во-вторых, эффективность неспецифической противоопухолевой иммунотерапии, как одного из методов лечения злокачественного образования, рассматривается уже не только с точки зрения непосредственных цитотоксических эффектов, но и с учетом иммуномодулирующих эффектов адъюванта антигенспецифических противоопухолевых вакцин. Выраженность таких эффектов зависит от многих параметров, характеризующих и сам вакцинный препарат, и клинико-биологические свойства опухоли, и состояние иммунной системы пациента с опухолью. Пока очевидно лишь, что различные иммунокомпетентные клетки неоднозначно реагируют на одни и те же вакцины, что, вероятно, и определяет иммуномодулирующие эффекты. Это может найти отражение в количестве иммунокомпетентных клеток и их отдельных субпопуляций, в уровне функциональной активности. Поэтому наблюдение за представляется актуальным и практически значимым.

Кроме того, следует выделить отсутствие в доступной литературе сведений об особенностях иммунитета у больных с солидными опухолями в связи с приготовлением особенностями опухоли, может определить их взаимоотношение, клиническое течение заболевания и прогноз.

Наконец, следует отметить неизученную проблему получения оптимального количества, выращивания и активации в соответствующих условиях in vitro ДК, которые становятся важным стратегическим направлением развития противоопухолевой иммунотерапии.

В соотетствии с задачами исследования работа была разделена на 2 части:

лабораторная и клиническая.

В исследование включено 42 больных меланомой кожи, получавших лечение в НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова с 2008 по 2013 г. (9 больных меланомой кожи III стадии и больных – стадии). Произведена оценка иммунологической и клинической эффективности: 1) вакцины на основе зрелых периферических дендритных клеток (ДКВ) у 28 больных с гистологически верифицированным диагнозом меланомы кожи, 13 мужчин и 15 женщин, средний возраст больных составил 53,7 (от 24 до 74 лет); 2) вакцины на основе незрелых костномозговых ДК с фотодинамической терапией (ФДК-вакцинотерапия) у больных, 11 мужчин и 3 женщины, средний возраст пациентов составил 46 лет (от 25 до лет). От всех пациентов было получено информированное согласие на проведение исследования. Объектом исследования были образцы биологического материала, изученные в ходе всех этапов проведения исследования (рис. 2): 1) мононуклеары (МНК) периферической крови (146 образцов); 2) МНК лейкаферезного материала (18 образцов); 3) незрелые костномозговые ДК (134 образца); 4) незрелые ДК периферической крови ( образцов); 5) образцы аутологичной опухоли; 6) аллогенные клеточные линии меланомы кожи человека, полученные в лаборатории иммунотерапии опухолей отдела терапевтической онкологии НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова, депонированные во Всероссийской Коллекции клеточных культур позвоночных (НИИ цитологии РАН) (4 клеточные линии); 6) зрелые вакцинные ДК (226 образцов); 7) сыворотка и плазма периферической крови (96 образцов).

Образцы МНК периферической крови доноров-контрольная группа (36 образцов).

Рис. 2. Схема получения вакцины на основе дендритных клеток.

Характеристика пациентов, получавших противоопухолевую вакцинотерапию на основе миелоидных дендритных клеток Для отбора больных использовали общепринятые в клинической практике критерии включения и невключения.

Критерии включения в исследование:

морфологически подтвержденный диагноз диссеминированной меланомы проведение ранее стандартной лекарственной терапии (для больных IV наличие поверхностных опухолевых очагов, доступных для лазерного облучения, размер которых достаточен для введения 1 мл ДК-вакцин (для адекватная сердечная функция (XCH II ФК класс по NYHA), гипертоническая болезнь II стадии или артериальная гипертензия 2 степени;

адекватная гемопоэтическая функция: абсолютное содержание нейтрофилов (ANC) 1,5x109/л; тромбоциты 100x109/л; уровень гемоглобина 90 г/л;

адекватная функция печени (отсутствие повышения трансаминаз и билирубина более 1 ст. (NCICTCAE v4.0), за исключением пациентов с метастатическим поражением печени у которых допустима 2 ст. повышения указанных адекватная функция почек: креатинин в периферической крови 115 мкмоль/л согласие пациенток применять надежные методы контрацепции на протяжении наличие добровольно подписанного пациентом информированного согласия на использование медицинской технологии.

Критерии невключения в исследование:

наличие метастазов в головном мозге или его оболочках (за исключением больных после стереотаксическлй лучевой терапии);

вторичный (приобретенный) иммунодефицит (по клинико-лабораторным данным), включая заболевания, приводящие к иммунодефициту, в т.ч.

системное использование кортикостероидов или других иммуносупрессивных сопутствующее заболевание;

невыполнению процедур исследования или риску НЯ в ходе исследования несоблюдение больным процедур исследования или наличие препятствий к их иммунобиологического препарата;

аллергическая реакция на компоненты терапии.

Все пациенты произвольным образом включались в когорты, получавшие один из изучаемых методов терапии. Схема исследования представлена на рис. 3.

Рис. 3. Схема проведения исследования.

Характеристика пациентов, получавших противоопухолевую вакцинотерапию на основе миелоидных дендритных клеток представлена в табл. 1. Перед началом вакцинотерапии все пациенты подвергались хирургическому лечению. 7 пациентов (25 %) получили химиотерапию дакарбазином, 13 (46%) – иммунотерапию интерфероном-, пациенту (4%) проводилась лучевая терапия. Все пациенты прошли комплексное обследование: стандартные клинические, лучевые и лабораторные методы исследования.

Таблица 1. Характеристика пациентов, получавших противоопухолевую вакцинотерапию на Пол:

Предшествующее лечение:

Локализация метастазов до начала терапии Стадия заболевания Как видно из таблицы, вакцинотерапия проводилась у больных из групп с неблагоприятным прогнозом: более половины пролеченных пациентов, получавших адъювантную иммунотерапию имели IIIC стадию. У 59% больных, получавших лечебную вакцинотерапию во 2-й и последующих линиях лечения наблюдалось метастатическое поражение внутренних органов.

Больным, получавшим ДКВ, проводили забор крови перед каждой нечетной вакциной. После получения стандартизированного препарата производили введение аутологичных зрелых ДК внутрикожно паравертебрально в 4 точки. Вакцину вводили внутрикожно паравертебрально в дозе 5-10 млн. клеток на одну инъекцию с интервалом для 1-й, 2-й вакцинации – 2 нед, для 3-й, 4-й вакцинации – 3 нед и 5-12 вакцинации – недели. Перед 1, 3, 5, 7 и 12-й вакцинацией за 3 дня до введения вакцины в/в в течение 2 ч вводился циклофосфамид в дозе 300 мг/м2.

Перед началом лечения больных, получавших ФДК-вакцинотерапию, проводили мобилизацию предшественников ДК из костного мозга в периферическую кровь с помощью гранулоцитарного колониестимулирующего фактора G-CSF (5 мкг/кг массы тела подкожно в течение 4-5 дней), операцию афереза, дифференцировку ДК в течение дней в безсывороточной сбалансированной питательной среде «СellGro DC» (СellGenix, Германия) в присутствии гранулоцитарно-макрафагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF, 72 нг/мл, Фармсинтез, Россия) и IL-4 (45 нг/мл, СellGenix, Германия), сеанса фотодинамической терапии и 5-дневного цикла внутриопухолевого введения аутологичных ДК (106/кг массы тела пациента) в предварительно ФДТ-облученный метастатический очаг. Интервал между циклами терапии составлял 21 день.

Для элиминации иммуносупрессирующей популяции Т-лимфоцитов за 3 дня до начала лечения вводили циклофосфамид (ЦФ) в дозе 300 мг внутримышечно.

Исследование иммунологических показателей проводили перед каждым циклом вакцинотерапии с помощью метода проточной цитофлюориметрии, ELISpot-анализа и клеточного иммуноферментного анализа (ИФА).

Для оценки клинической эффективности вакцинотерапии использовали критерии RECIST v1.1 (Приложение 1). Оценка нежелательных явлений проводилась по шкале токсичности CTC AE v.3.

Работу с ДК человека проводили в условиях стерильного модуля с жестким режимом, использованием потолочных воздушных фильтров HEPA/ULPA (ультравысокая очистка), обладающих эффективностью 99,9995% по частицам размером 0,12 микрон. Рабочее место оснащено ламинарно-потоковым шкафом с вертикальным потоком воздуха, для создания в рабочей зоне стерильной среды (II класс биологической защиты).

Использовали:

сепаратор компонентов крови «COBE Spectra» (Gambro BCT, Inc., США);

ламинарно-потоковый бокс (Faster, Германия) – степень очистки рабочей зоны бокса соответствует классу II биологической опасности;

автоматический счетчик клеток «Countess» (Invitrogen, США) определяет количество живых и мертвых клеток, а также общее количество клеток, используя трипановый синий;

проточный лазерный цитофлуориметр BD «FACSCalibur» (BD Biosciense, США) для клинических, лабораторных, биологических и медицинских научных исследований; медимашина с разовыми стерильными наборами ножей и клеточных фильтров (медиконы, филконы) для дезагрегации образцов опухолевой ткани (Dako, Дания);

инкубатор медицинский «Heracel» для культивирования клеток в атмосфере 5% CO2, (Termo Electron LTD GmbH, Германия);

аппарат лазерный медицинский «Латус-2», с длиной волны 661-662 нм и мощностью 2,0 Вт используется для проведения лечения методом ФДТ, (Актус, Россия);

инвертированный микроскоп c цифровой камерой (Leuca DMIL, Германия) и микроскоп для лабораторных исследований универсальный с проходящим и отраженным светом «Axio Imager M1», набором опций для наблюдения и записи изображений объектов в различных режимах контраста, с модулем для флуоресцентного анализа (Carl Zeiss, Германия);

AxioImager, цифровой камерой высокого разрешения и специализированным программным обеспечением;

фотометр «Multiskan EX» (Thermo Electron Corparation, США) для всех типов колориметрических измерений;

система наблюдения за живыми клетками «Cell-IQ» (Chip Man Technologies, Финляндия), предназначена для изучения изменений клеточной морфологии в течение длительного времени (часы и дни), проведения кинетического анализа (с возможностью перевода данных в графическую или табличную формы);

лабораторный холодильник 20 оС и +4оС для хранения питательных сред и растворов «ПОЗиС» (Россия), морозильная камера 70оС, холодильный шкаф 35 оС, (Sanyo, Япония);

программный криозамораживатель «Ice-Cube 14S», (SY-Lab Gerate GmbH, Австрия) с контролируемой скоростью охлаждения; стационарные и переносные бункеры для хранения криоконсервированного биоматериала в жидком азоте (-196оС);

криохранилище Банка долговременного хранения биологического материала НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова;

механические и электронные, одноканальные и многоканальные дозаторы mLINE, объемом 1-10 µl, 2-20 µl, 10-100 µl, 100-1000 µl, 500-5000 µl (Biohit, Финляндия);

сбалансированная бессывороточная среда «СellGro DC» (CellGenix, Германия) для дифференцировки миелоидных предшественников в ДК в условиях GLP (произведена в условиях GMP); культуральная среда RPMI-1640 (Биолот, РФ);

полная питательная среда DMEM-F12 (Биолот, РФ) с добавлением 20% телячьей эмбриональной сыворотки, глутамина, пенициллина, стрептомицина, трансферрина (5 мкг/мл), инсулина (5 мкг/мл), селена (5нг/мл); трипсина раствор 0,25% (Биолот, РФ); версена раствор 0,02%, стерильный (Биолот, РФ);

градиент плотности «Ficoll-Paque Premium» (GE Healthcare, Великобритания);

официнальная сыворотка АВ человека IV группы (Sigma, США); телячья эмбриональная сыворотка тестирована на отсутствие микоплазм и вирусов (Биолот, РФ); бессывороточная криосреда (Биолот, Россия)для работы в условиях GLP;

антибиотики, L-глутамин для клеточных культур (Sigma, США); суплемент жидкий для культуральной среды SITE+3 (Sigma, США); суплемент жидкий для культуральной среды ITS (Sigma, США); диметилсульфоксид (ДМСО) (Sigma, США); трипановый синий (Sigma, США);

ростовые факторы и факторы дифференцировки GM-CSF (CellGenix, Германия), GM-CSF (Фармсинтез, Россия), IL-4 (CellGenix, Германия), TNFBD, США), IFN- «Роферон-А» (Roche, Швейцария) для работы в условиях GLP, произведены в условиях GMP;

фотосенсибилизатор «Фотодитазин» (Вета-Гранд, Россия);

набор моноклональных антител коньюгированных с флюорохромами к поверхностным антигенам гемопоэтических клеток человека CD11c, HLA DR, CD14, CD19, CD3, CD4, CD8, CD33, CD34, CD16, CD56, CD45; дендритных клеток CD83, CD1а, CD80, CD86, CD14, CCR7, CD209, HLA-DR (BD Biosciences, США); опухолевых клеток NY-ESO-1, MAGE, BAGE. GAGE (Santa Cruz Biotechnology, США) для иммунофенотипирования методом проточной цитометрии, «BD Biosciences» (США);

моноклональные антитела к линейным антигенам миелоидных клеток, моноцитов, Т- и В-лимфоцитов, NK-клеток, незрелых, зрелых и активированных ДК (CD11c, CD14, CD3, CD19, CD20, CD16, CD56, HLA DR, CD1a, CD83, CD80; моноклональные антитела к опухолевым антигенам S100, tyrosinase, MITF, MAGE1, NY-ESO-1, MART/MelanA, CD63. (DAKO, Дания;

Novocastra, Великобритания) для иммунофенотипирования непрямым иммуноцитохимическим методом с использованием систем визуализации «In vision» и «Novostain detection kit NCL-RTU-D» (DAKO, Дания; Novocastra, Великобритания);

стерильная разовая лабораторная посуда: культуральные флаконы для клеточных культур на 25 см2, 75 см2, 175 см2 активированная поверхность культивирования, вентилируемая крышка с гидрофобной фильтрующей мембраной 0,2 мкм (Sarstedt, Германия); вакутейнеры наполнитель EDTA «Vacutest Kima srl» (Италия); криопробирки на 1,5 мл, 4,5 мл Nunc «CryoTube»

(Thermo Fisher Scientific, США) и центрифужные пробирки 15 мл, 50 мл (Sarstedt, Германия); серологические пипетки на 2 мл, 5 мл, 10 мл, 25 мл (Sarstedt, Германия); наконечники на 100 мкл, 300 мкл, 1000 и 5000 мкл (Biohit, Финляндия); стекла для культивирования клеток (BD Falcon, США).

2.2.1. Получение костномозговых и периферических дендритных клеток Миелоидные предшественники получали из лейкаферезного материала и периферической крови. Аферез костномозговых предшественников периферической крови проводили на аппарате CobeSpectra. Использовали программу афереза с визуальным контролем качества во время процедуры по цветовой шкале для исключения примеси эритроцитов периферической крови (рис. 4 А и Б). Это является обязательным условием при выделении миелоидных предшественников ДК. Разделение крови происходит в 2 этапа, в полностью автоматическом режиме: 1-й - отделение эритроцитов и лейкоцитов от плазмы с тромбоцитами и накопление МНК в определенной зоне камеры, и 2-й – продавливание МНК плазмой в сборный контейнер (плазма отсекается от попадания в контейнер). Принцип разделения периферической крови основан на различной плотности клеток и скорости их осаждения за счет различного размера. Разделение происходит при непрерывном центрифугировании путем отбора требуемых слоев расслоившейся клеточной массы и плазмы. Оставшиеся компоненты возвращаются пациенту.

Для получения 2,4–6,2х1010 миелоидных предшественников (гемопоэтические стволовые клетки, ранние предшественники моноцитопоэза, дендроцитопоэза, моноциты) производили забор от 200 до 220 мл лейкаферезного материала, в зависимости от выхода в периферическую кровь предшественников ДК, мобилизованных с помощью G-CSF(5 мкг/кг массы тела подкожно в течение 4-5 дней). Периферические миелоидные предшественники получали с помощью венопункции 120 мл венозной крови, что позволяет выделять 100клеток.

Мононуклеарные клетки (МНК) выделяли стандартным методом, путем центрифугирования в градиенте плотности «Ficoll-Paque Premium» «GE Healthcare»

(Великобритания) согласно Boyum, 1968. Моноциты (CD14+) выделяли методом адгезии на пластике.

Рис. 4. Аферез миелоидных предшественников ДК с использованием системы Сobe Spectrа (А). Использование цветовой шкалы для контроля качества аферезного продукта (Б).

2.2.2. Дифференцировка дендритных клеток из миелоидных предшественников ex vivo Методика приготовления вакцины на основе аутологичных ДК, нагруженных РТА+ опухолевым лизатом, представлена на рис. 5.

Рис. 5. Приготовление вакцины на основе аутологичных ДК, нагруженных РТА+ лизатом.

разбавляли равным объемом питательной среды RPMI-1640, после чего проводили центрифугирование в градиенте плотности «Ficoll-Paque Premium» в 15-мл стерильных центрифужных пробирках при 1500 об/мин в течение 40 мин при комнатной температуре. Во время центрифугирования эритроциты и гранулоциты оседают на дно пробирки, а на границе раздела фаз находятся мононуклеарные клетки (МНК).

Прозрачный слой среды, расположенный непосредственно над опалесцирующим слоем МНК удаляли, МНК собирали по всей площади сечения пробирки. При этом достигается примерно 1000-кратная очистка МНК от других клеток.

Взвесь МНК вносили в стерильные 15-мл центрифужные пробирки и разбавляли не менее чем четырехкратным избытком неполной питательной среды RPMI-1640, тщательно ресуспендировали. Отмывали МНК в неполной питательной среде RPMI-1640 двукратным центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин.

Проводили подсчет и оценку жизнеспособности МНК с помощью автоматического счетчика клеток «Countess™» и 0,4% трипанового синего, получали 10-15х106 и более клеток, с жизнеспособностью не менее 98%.

Для получения ДК из МНК периферической крови, последние помещали в неполную питательную среду RPMI-1640 (посевная доза 5х106 кл/мл) и 2 плоскодонных культуральных флакона 75 см2 с вентилируемыми пробками. Инкубировали в условиях контролируемого 5% СО2 и 98% влажности при 37°C.

Через 2 часа среду с неприлипшими клетками (преимущественно лимфоцитами) аккуратно отбирали, а к клеткам адгезированным на пластике, (преимущественно моноцитам) добавляли свежую бессывороточную среду «СellGro DС». Ростовые факторы и факторы дифференцировки – GM-CSF (72 нг/мл) и IL-4 (20-45 нг/мл) (СellGenix, Германия) вносили на 1-й, 3-й и 5-й дни культивирования.

На 7-е сутки культивирования для созревания ДК вносили опухолевые антигены, исходя из соотношения 1 ДК:3 лизированные опухолевые клетки, ростовые факторы – GMSCF, IL-4 и TNF-. Инкубацию проводили в течение 48 часов.

Через 48 часов ДК собирали, осаждали центрифугированием, отмывали в 10 мл 0,9% раствора хлорида натрия, содержащего 10% альбумина человека, производили подсчет и оценку жизнеспособности с помощью автоматического счетчика клеток «Сountess» и 0,4% трипанового синего.

Для приготовления ДК вакцины 1/2 клеток (от 5 до 10х106) ресуспендировали в 1,5 мл 0,9% изотонического раствора NaCl, содержащего 10% альбумина человека, переносили в ампулу и доставляли в клиническое отделение для введения больному. Другую 1/2 ДК криоконсервировали и хранили в жидком азоте до следующей вакцинации.

Методика приготовления вакцины на основе незрелых костномозговых предшественников ДК представлена на рис. 6.

Индукция апоптоза для презентации антигена ДК ФДТ Рис. 6. Приготовление вакцины на основе незрелых костномозговых предшественников ДК.

1. Суспензию МНК помещали в стерильные 50-мл пробирки и разбавляли равным объемом питательной среды RPMI-1640.

2. 10 мл разбавленной клеточной суспензии наслаивали на 3 мл градиента плотности Центрифугировали при 1500 об/мин в течение 40 мин при комнатной температуре.

3. Прозрачный слой среды, расположенный непосредственно над опалесцирующим слоем МНК, удаляли, МНК собирали по всей площади сечения пробирки.

4. МНК (5 х 106 клеток в 1 мл) помещали в свежую питательную среду RPMI-1640 с 2мМ L-глютамина и плоскодонные культуральные флаконы 75 см3 для адгезионных культур с вентилируемыми пробками, культивировали при 37 оС, 5% СО2 и 100% влажности в течение 2 часов с целью получения адгезионной культуры моноцитов.

криоконсервировали, прикрепившиеся клетки, около 4,8 х 10 (44%) отмывали неполной питательной средой RPMI-1640.

6. Дифференцировку МНК в незрелые ДК проводили в сбалансированной безсывороточной среде «СellGro DС», произведенной в условиях GMP и рекомендованной для культивирования ДК человека.

7. Ростовые факторы и факторы дифференцировки – GM-CSF (72 нг/мл) и IL-4 (20- нг/мл) вносили на 1-й и 3-й день культивирования.

8. На 5-й день культивирования ДК собирали пастеровской пипеткой, незначительную часть прикрепившихся клеток снимали скрепером, отмывали двукратным центрифугированием в 10 мл 0,9% изотонического раствора NaCl, содержащего альбумин человека (конечная концентрация 2%), при 1000 об/мин в течение 10 мин.

9. Производили подсчет, оценку жизнеспособности, определяли иммунофенотип и уровень дифференцировки. При соблюдении вышеуказанных условий получали 5х109 и более клеток; жизнеспособность не менее 98%, с иммунофенотипом несенсибилизированных (незрелых) ДК – CD14-/CD1a+/CD83-. Это количество криоконсервировали и использовали для 4-х или более 5-дневных циклов вакцинацинотерапии.

Прижизненное исследование ДК проводили на всех этапах культивирования с помощью инвертированного микроскопа и системы наблюдения за живыми клетками CellIQ v.2 (Chip Man Technologies, Финляндия) (рис. 7 А и Б). Экспрессию наиболее значимых антигенов на зрелых ДК исследовали с помощью моноклональных антител и светового микроскопа или проточного цитофлюориметра BD FACSCalibur (tm) (BD Biosciense). При соблюдении вышеуказанных условий получали 10-20х106 клеток, с жизнеспособностью не менее 98% и иммунофенотипом зрелых ДК (CD14-, CD1alow, CD83high, HLA-DRhigh, CD80high, CD86high, CCR7high ). Это количество ДК использовали для 2-х вакцинаций.

Рис. 7. Система наблюдения за живыми клетками Cell- IQ v.2 (Chip Man Technologies, Финляндия) (А) и количественная оценка созревания дендритных клеток в процессе приготовления индивидуальной вакцины больной М., 54 г. х10 (Б).

2.2.3. Приготовление опухолевого лизата содержащего раково-тестикулярные 1. Клетки Mel 226, Mel 515, Mel 519, Mel 520 культивировали в пластиковых флаконах в полной питательной среде DMEM/F12 с 20% телячьей эмбриональной сыворотки с добавлением глутамина, пенициллина, стрептомицина, трансферрина (5 мкг/мл), инсулина (5 мкг/мл), селена (5нг/мл), в условиях контролируемого 5% СО 2 и 98% влажности при 37°C. При достижении конфлюэнтного монослоя, производили пересев клеток и дальнейшее пассирование культуры с рассевом 1:2 или 1: (определяли индивидуально для каждой культуры клеток).

2. Производили отбор проб для подсчета, оценки жизнеспособности, бактериалогического исследования культуральной среды, определения иммунофенотипа клеток и уровня продукции иммуносупрессирующих факторов.

Для приготовления опухолевого лизата клетки Mel 226, Mel 515, Mel 519, Mel смешивали в равных пропорциях и проводили:

a) 6 последовательных циклов моментального замораживания до –196оС и оттаивания до комнатной температуры в фосфатно-солевом буфере без криопротектора (качество лизиса клеток контролировали с помощью 0,1% трипанового синего и светового микроскопа);

b) осаждение клеточного детрита центрифугированием (10 мин, 3000 об./мин);

c) фильтрацию надосадочной фракции через миллипоровый фильтр (0,2 мкм);

d) расфасовку РТА+ опухолевого лизата в криопробирки и хранение при –20оС до использования.

2.2.4. Криоконсервация миелоидных предшественников и вакцинных дендритных Криоконсервировали миелоидные предшественники и вакцинные ДК с помощью контролируемой скоростью охлаждения, которая составляет –1 С/мин в диапазоне от +4 С до –4оС, и –5оС/мин в диапазоне от –40 до –12оС. Для этого клетки помещали в криосреду (90% аутологичной плазмы и 10% ДМСО, 90% сыворотки АВ человека и 10% ДМСО или бессывороточная криосреда) и индивидуально маркированные криопробирки. После чего клетки переносили в индивидуальные контейнеры с жидким азотом (-196оС) и хранили в криобанке до использования.

2.2.5. Размораживание миелоидных предшественников и вакцинных дендритных Криопробирку с ДК помещали на 3 мин в водяную баню +42оС, далее ex tempore переносили в стерильную 15-мл пробирку и разбавляли не менее чем десятикратным избытком 0,9% изотонического раствора NaCl, содержащего альбумин человека (конечная концентрация 2%). Отмывали ДК двукратным центрифугированием (1000 об/мин в течение 10 мин) в 10 мл 0,9% изотонического раствора NaCl, производили подсчет и оценку жизнеспособности. В результате получали контрольное криоконсервированное количество ДК, с жизнеспособностью не менее 96%, переносили в ампулу и доставляли в клиническое отделение для введения больному.

2.2.6. Оценка количества и жизнеспособности (миелоидных предшественников, вакцинных дендритных клеток, мононуклеаров, опухолевых клеток) Подсчет и оценку жизнеспособности клеток проводили с помощью автоматического счетчика клеток «Сountess» и трипанового синего, получали от 1,0-4,0 х106 в 1 мл клеток, жизнеспособность – не менее 95% (рис. 8).

1. Смешивали 10 мкл суспензии клеток и 10 мкл 0,4% раствора трипанового синего, который окрашивает только мёртвые клетки;

2. полученный образец вносили в камеру рабочего слайда и вставляли в прибор;

3. Countess® выводит увеличенное изображение образца на экран, обрабатывает и отображает на экране результаты, которые можно сохранить в электронном Рис. 8. Анализ количества и жизнеспособности свежевыделенных МНК на автоматическом счетчике клеток «Сountess» (Invitrogen, США).

Лабораторное прижизненное исследование аутологичных (индивидуальных) ДК проводили на всех этапах культивирования с помощью инвертированного микроскопа, экспрессию наиболее значимых антигенов на вакцинных ДК исследовали с помощью моноклональных антител, светового микроскопа и проточного цитофлюориметра.

2.2.7. Иммуноцитохимическая характеристика дендритных клеток Для иммуноцитохимической оценки полученных ДК проводили цитологическую и иммунологическую верификацию ДК, изучали тип роста клеток. Для этого ДК: 1) выращивали на культуральных стеклах (BD, США); 2) фиксировали с помощью ацетона; 3) окрашивали моноклональными антителами к линейным антигенам миелоидных клеток, моноцитов, Т- и В-лимфоцитов, NK-клеток, незрелых, зрелых и активированных ДК (CD11c, CD14, CD3, CD19, CD20, CD16, CD56, HLA DR, CD1a, CD83, CD80 (DAKO, Дания;

Novocastra, Великобритания) с помощью непрямого иммуноцитохимического метода и системы визуализации «In vision» и «Novostain detection kit NCL-RTU-D» (DAKO, Дания;

Novocastra, Великобритания) (рис. 9).

Рис. 9. Незрелые ДК больного Г., 50 лет, дифференцированные из костномозговых предшественников in vitro, экспрессирующие CD45, CD11c, HLA DR, CD1а антигены (световой микроскоп, 100х и 40х) 2.2.8. Иммунофенотипический анализ миелоидных предшественников, вакцинных Иммунофенотипический анализ проводили на проточном лазерном цитофлуориметре BD FACSCalibur (tm) (BD Biosciense). ДК после культивирования двукратно отмывали в фосфатно-солевом буфере, осаждали центрифугированием в течение 10 мин при об/мин. Далее, 1106 клеток инкубировали со специфическими моноклональными антителами (20 мкл/1 образец) anti-CD83-PE-Cy5, anti-CD1а-PE, anti-CD80-FITC, anti-CD86FITC, anti-CD14-FITC, anti-CD209-FITC и изотипическим контролем (BD Biosciences, США) при комнатной температуре в течение 30 мин, в темном месте. Обработка результатов проводили с использованием программного обеспечения CellQuest Pro (tm). Изучение экспрессии антигенов проводили на образцах ДК, дифференцированных из МНК лейкаферезного продукта или периферической крови в присутствии GM-CSF и IL-4 (рис.10).

Рис. 10. Незрелые ДК больного Г., 50 лет, дифференцированные из костномозговых предшественников in vitro, экспрессирующие CD1a, CD80, CD86 антигены (проточный цитофлюориметр BD FACSCalibur, США).

Оценка специфического поствакцинального иммунного ответа Для изучения специфической активации Т-клеток и выявления РТА-специфических антител (IgG) у пациентов перед каждой вакцинацией производили забор крови на исследования (ELISpot анализ, клеточный ИФА). Схема забора образцов периферической крови представлена на рис. 11.

Рис. 11. Схема забора образцов периферической крови у больных диссеминированной меланомой кожи, получавших дендритноклеточную вакцинотерапию.

2.2.9. Мониторинг специфического поствакцинального иммунного ответа (ELISpot Предварительно за 24 часа до постановки метода производили размораживание необходимых образцов МНК на водяной бане. Отмывали МНК в неполной питательной среде RPMI-1640 двукратным центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин и оставляли на ночь при 37С в 5% СО2-инкубаторе. Производили подсчет и оценку жизнеспособности, в работу брали образцы МНК с жизнеспособностью не менее 70%.

Исследуемые образцы МНК добавляли в лунки планшеты (триплетами), с предварительно сорбированными антителами к соответствующему цитокину (anti-human INF-, Gr-) в концентрации 100 тыс. клеток/лунку. Для стимуляции максимального уровня специфической продукции цитокинов добавляли ростовые факторы Т-клеток (IL-7, IL-12) в различных сочетаниях (Балдуева И.А. и др., 2010; Нехаева Т.Л. и др., 2010). Мишенями для активации специфических Т-клеток был коктейль из 4-х аллогенных клеточных линий меланомы (Mel 226, Mel 263, Mel 253, Mel 515), эксперссирующих РТА (NY-ESO-1, MAGE, HAGE, GAGE), их лизат и синтетические пептиды (ГНЦ Институт особо чистых биопрепаратов, Санкт-Петербург), которые соответствовали антигенному профилю аутологичной опухоли.

В качестве положительного контроля для стимуляция исследуемых образцов МНК использовали поликлональный активатор Т-лимфоцитов фитогемагглютинин («Sigma», США). Клетки инкубировали в условиях контролируемого 5% СО2 и 98% влажности (СО2инкубатор) в течение 24-48 часов для определения продукции INF- и Gr-. Во время инкубации клетки активируются и начинают продуцировать цитокин, который присоединяется к иммобилизованным антителам. По окончании инкубации клетки удаляли, отмывали планшет и добавляли вторичные биотилированные антитела, специфичные к тому же самому цитокину, но направленные к другому эпитопу. Инкубировали 2 часа при стрептавидинферментный коньюгат. Далее планшеты отмывали и добавляли субстрат, который образует окрашенное пятно (spot). Реакцию останавливали, промывая планшету дистиллированной водой. Поэтапное изображение постановки исследования представлено на рис. 12.

Визуализацию результатов проводили с помощью автоматизированной системы ELISpot компании Carl Zeiss.

1 этап 2 этап Под воздействием антигена клетки продуцируют цитокины, которые специфично связываются с первичными антителами и добавляют вторичные антитела, конъюгированные с ферментом или 3 этап появляется окрашенное пятно в Рис. 12. Постановка ELISpot анализа (в нашей модификации).

2.2.10. Оценка поствакцинального гуморального иммунного ответа Для выявления РТА-специфических антител (IgG) в сыворотке крови больных диссеминированной меланомой кожи в ответ на введение противоопухолевой дендритноклеточной вакцины использовали метод клеточного иммуноферментного анализа (ИФА). Основанный на высокой избирательности и специфичности иммунологической реакции «антиген-антитело». В качестве антигена использовали аллогенные клеточные линии меланомы (Mel 226, Mel 263, Mel 253, Mel 515), эксперссирующие РТА (NY-ESO-1, MAGE, HAGE, GAGE) и/или аутологичные клетки меланомы с экспрессией этих антигенов (Балдуева И.А. и др., 2011; Нехаева Т.Л. и др., 2012). Схема постановки эксперимента для выявления РТА-специфических антител (IgG) в сыворотке крови больных представлена на рис. 13.

Рис. 13. Постановка клеточного ИФА (в нашей модификации).

Нанесение и фиксация культуры опухолевых клеток в планшете Предварительно, за 12-24 часа до постановки метода на поверхность лунки культурального планшета «Costar» (Corning Incorporated, США) дублями вносили по 10- тыс. в лунку в 100 мкл полной питательной среды DMEM/F12 опухолевых клеток (Mel 226, Mel 263, Mel 253, Mel 515), эксперссирующие РТА (NY-ESO-1, MAGE, BAGE, GAGE) или аутологичные клетки меланомы с экспрессией этих антигенов и оставляли на ночь в условиях 5% СО2 и 98% влажности при 37°C. Для постановки метода необходимо не менее 70% прикрепившихся клеток. Промывали трижды фосфатно-солевым буфером (ФСБ, pH 7,2) по 200 мкл в лунку, экспозиция 5 мин.

параформальдегида, экспозиция 25 мин. при комнатной температуре, далее планшет промывали трижды стерильным фосфатно-солевым буфером (ФСБ, pH 7,2) по 200 мкл в лунку, экспозиция 5 мин.

Разморозка и внесение в лунки планшета исследуемых образцов 1. Перед началом анализа заполняли протокол исследования, на схеме планшета отображали последовательность внесения проб.

2. Образцы сывороток размораживали при комнатной температуре.

3. Согласно протоколу исследования в лунки нового планшета вносили образцы сывороток.

В 1-й ряд планшета вносили по 270 мкл 2% бычьего сывороточного альбумина и 30 мкл исследуемого образца сыворотки в лунку, далее со 2-го по 8 ряд титровали 8-канальным дозатором по 150 мкл в лунку.

4. В планшет с фиксированными опухолевыми клетками переносили разведенные образцы сывороток по 100 мкл в лунку, начиная с меньшего разведения. Помещали в термостат на 1 час при температуре 37°С, затем затем трижды промывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ, pH 7,2) по 200 мкл в лунку, экспозиция 5 мин.

Для выявления образовавшихся иммунных комплексов 1. В каждую лунку планшета вносили по 100 мкл антитела (IgG) коньюгированные с ферментом (пероксидаза хрена), инкубировали в течение 1 часа при 37С и затем трижды промывали ФСБ по 200 мкл в лунку, экспозиция 5 мин.

2. Для проявления цветовой реакции в лунки планшета вносинли по 100 мкл субстрата.

Субстрат представляет собой 0,2 %-й раствор пероксида водорода и тетраметилбензидина (ТМБ) в цитратном буфере. Реакцию останавливали добавлением 100 мкл стоп-реагента.

3. Абсорбцию регистрировали при длине волны 450 нм после добавления в реакционную смесь стоп-реагента на многопараметровом фотометре «Multiskan EX» (Thermo Electron Corparation, США). Каждое исследование дублировалось.

Для статистической обработки материалов исследования использовали методы описательной статистики, корреляционного и регрессионного анализа, достоверность различий оценивали методами параметрической (критерии Стьюдента, Фишера) и непараметрической (критерий Вилкоксона) статистики, для определения длительности времени до прогрессирования (ВДП) заболевания и общей выживаемости (ОВ) применяли метод Каплана-Майера. Обработку результатов проводили с помощью прикладных статистических программ Statgraphics Plus и SPSS for Windows.

Стандартизация методов получения и криоконсервации миелоидных предшественников ДК из аферезного материала и периферической крови Теоретическим обоснованием использования миелоидных предшественников костного мозга и периферической крови в качестве субстрата для получения ДК ex vivo является малоизученный феномен «пластичности», т.е. способность гемопоэтических клеток дифференцироваться в клетки различных типов (Zhao Y. et al., 2003; Wong K.L. et al., 2011).

Исследования взаимодействия регуляторных программ, обеспечивающих дифференцировку CD34+ гемопоэтических предшественников и CD14+ моноцитов в ДК, открывают новые возможности развития стратегий клеточной терапии в онкологии (Nguven X.D. et al., 2002;

Clanchy F.I., et al., 2006; Kim W.K. et al., 2010). В связи с этим, актуальным становится разработка и оптимизация лабораторной методики выделения миелоидных предшественников ДК из лейкоконцентрата (аферезного материала) и периферической крови с целью получения большого количества ДК для клинического применения. Изучению этой проблемы посвящено настоящее исследование.

Стандартизация оптимальных условий выделения МНК и моноцитов Аферезный материал получали с помощью аппарата «COBE Spectra» и использования программы выделения фракции МНК периферической крови. Работу с МНК человека проводили в условиях GLP (Good Laboratory Practice – Надлежащая лабораторная практика).

Для получения высокообогащенной популяции жизнеспособных МНК в качестве предшественников периферических ДК использовали метод центрифугирования в градиенте плотности Ficoll-Paque Premium, который позволяет выделить из популяции лейкоцитов 96МНК (рис.14 А и Б). Седиментация в изокинетическом градиенте Ficoll-Paque Premium проводится как на основе плавучей плотности клеток, так и их диаметра, обеспечивает возможность удобного разделения клеток в стерильных условиях с использованием стандартного и доступного в РФ оборудования. При этом в соответствие требованиям GMP и GLP к продукту подобного качества нами были разработаны критерии стандартной операционной процедуры (СОП), представленные в Приложение 2.

МНК (2-3 х 106 клеток в 1 мл) помещали в свежую питательную среду RPMI-1640 с 2мМ L-глютамина и плоскодонные культуральные флаконы 75 см3 для адгезионных культур с вентилируемыми пробками, культивировали при 37оС, 5% СО2 и 100% влажности в течение 2 часов с целью получения адгезионной культуры, которая подвергалась количественному и качественному анализу.

Для получения ДК из моноцитов необходимо их предварительное прикрепление к твердому субстрату. При культивировании клеток на пластике обнаруживается их тенденция к дифференцировке, что проявляется в изменении морфологии и иммунофенотипа (рис. 14 А и Б).

Рис. 14. Прижизненное изображение суспензионной (А) и адгезионной фракции (Б) МНК периферической крови, х400, инвертированный микроскоп (Leuca DMIL, Германия).

Всего в исследование включено 18 образцов лейкаферезного материала и 17 образцов МНК периферической крови больных диссеминированными злокачественными новообразованиями, и 9 образцов периферической крови здоровых лиц (доноры). Оценку качества материала проводили на гематологическом анализаторе крови «SysmexXT-2000i»

(Sysmex, Япония), с помощью светового микроскопа «AxioImager.M1» (CarlZeiss, Германия) и проточного цитофлюориметра «FACSCalibur» с использованием специфических МкАт к CD45, CD14, CD34, CD33, CD13, HLA-DR, CD3, CD19 и изотипического контроля с учетом количества МНК в каждой пробе.

Нами изучалось несколько способов выделения МНК и моноцитов периферической крови (табл. 2-4).

автоматический метод лейкафереза;

выделение концентрированного количества МНК в градиенте плотности FicollPaque Premium;

Таблица 2. Основные субпопуляции МНК периферической крови здоровых лиц (доноры) Примечание:M–среднее значение экспрессии дифференцировочных антигенов, m–ошибка среднего значения, –стандартное отклонение.

Таблица 3. Основные субпопуляциии моноцитов периферической крови здоровых лиц (доноры), выделенные на градиенте плотности Ficoll-Paque Premium и адгезией на пластике, Международные протоколы получения ДК из моноцитов периферической крови методом адгезии на пластике не учитывали потерю неадгезированных моноцитов, что свидетельствует о недостаточно полном знании субпопуляций моноцитов, дифференцированных в вакцинные ДК. Более того, потеря неадгезированной фракции миелоидных предшественников ДК может отражаться на качестве вакцинного препарата у разных категорий больных.

Таблица 4. Основные субпопуляции моноцитов периферической крови здоровых лиц (доноры), выделенные из МНК в градиенте плотности Ficoll-Paque Premium, методом Потерю неадгезированных моноцитов рассчитывали по формуле:

Таблица 5. Основные субпопуляции моноцитов периферической крови больных диссеминированными злокачественными новообразованиями, выделенные из МНК в градиенте плотности Ficoll-Paque Premium, методом адгезии и неадгезированные моноциты Как видно из представленных данных в таблице 5, концентрированное количество моноцитов основных субпопуляций МНК, выделенных в градиенте плотности Ficoll-Paque Premium, обладает различной способностью к адгезии на пластике, что сопровождается их потерей в качестве неадгезированной фракции.

Таким образом, наши исследования показали, что у больных злокачественными новообразованиями содержание адгезированных моноцитов было сниженным по сравнению с аналогичными образцами, полученными от здоровых лиц (доноры). Потеря неадгезионной фракции миелоидных предшественников ДК (%) составила 46,82±13,52 в образцах онкологических больных по сравнению с 29,78±9,24 – в группе здоровых лиц (доноры), статистически значимых различий не обнаружено ( р=0,36; >0,05). Это означает, что для дифференцировки ДК можно использовать периферическую кровь онкологических больных.

3.2. Стандартизация оптимальных условий криоконсервации МНК и моноцитов из аферезного материала и периферической крови Технология получения дендритноклеточных вакцин в ряде случаев предполагает криоконсервацию аутологичных миелоидных предшественников в аферезном материале, периферической крови, моноцитов выделенных в градиенте плотности Ficoll-Paque Premium МНК или адгезированных на пластике (Cabezudo E. et al., 2000; Strasser E.F., 2010). Для криоконсервации объекта исследования мы использовали: 1) аутологичную плазму; 2) АВ (IV) гр. сыворотки человека; 3) бессывороточную криосреду и 10% диметилсульфоксид.

Суспензию клеток в криосреде, в мешках для глубокой заморозки клеток и тканей (-195), изготовленных из специального пластика (OriGen Biomedical, США) или пропиленовых криопробирках (4,5 мл и 1,8 мл), криоконсервировали с помощью программного замораживателя «Ice-Cube 14S», (SY-Lab Gerate GmbH, Австрия). В ряде экспериментов в качестве первого этапа использовали пенопластовый контейнер с толщиной стенок не менее 15 мм и выдерживали в парах жидкого азота или помещали в холодильную камеру -80оС с последующим хранением в жидкой среде азота (-196оС).

Во всех случаях изучали рецепторы для специфических факторов роста и дифференцировки, так как по мере созревания миелоидных предшественников ДК в их цитоплазме и на поверхности появляются и исчезают маркеры дифференцировки, увеличивается уровень экспрессии молекул MHC II класса. Наиболее важная роль отводится экспрессии CD34, CD33, CD14, CD11с и HLA-DR антигенов (Ярилин А.А., 2010; Clanchy F.I.

et al., 2006; Gorczyca W. et al., 2011).

В связи с этим, актуальным становится разработка лабораторной методики оценки и контроля качества экспрессии вышеперечисленных антигенов в свежевыделенном, криоконсервированном или криоконцентрированном (концентрирация в градиенте плотности Ficoll-Paque Premium) лейкаферезном материале больных злокачественными новообразованиями. Изучению этой проблемы посвящено настоящее исследование.

Было изучено 18 образцов лейкаферезного материала больных диссеминированными злокачественными новообразованиями, образцы 15 из которых были криоконсервированы с помощью программного замораживания клеток и помещены в криохранилище Банка долговременного хранения биологического материала НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова.

Исследовали содержание основных субпопуляций моноцитов периферической крови в лейкаферезном материале больных диссеминированными злокачественными новообразованиями до и после криоконсервации, а также субпопуляций моноцитов, концентрированных на градиенте плотности Ficoll-Paque Premium после криоконсервации (криоконцентрация) с помощью моноклональных антител и проточной цитофлюориметрии (табл. 6).

Таблица 6. Содержание основных субпопуляций моноцитов периферической крови больных диссеминированными злокачественными новообразованиями в лейкаферезном материале до и после криоконсервации и после криоконцентрации антигены криоконсервации, криоконсервации, криоконцентрации, Примечание:M–среднее значение экспрессии дифференцировочных антигенов, m–ошибка среднего значения, –стандартное отклонение.

Как видно из представленных данных содержание изучаемых субпопуляций моноцитов периферической крови в лейкаферезном материале больных диссеминированными злокачественными новообразованиями до и после криоконсервации, а также после криоконцентрации, претерпевает видимые изменения. Это стало предпосылкой для углубленного изучения обнаруженного феномена в связи с разработкой технологии получения ДК человека контролируемого качества.

Был проведен сравнительный анализ относительного содержания CD14+ моноцитов периферической крови в образцах лекаферезного материала до и после криоконсервации, который позволил выявить статистически значимое снижение содержания CD14+CD11с+HLA-DR- клеток [45,33±2,33 и 26±4,98 (p0,05) Примечание:M–среднее значение экспрессии дифференцировочных антигенов, m–ошибка среднего значения, –стандартное отклонение.

Исследование экспрессии дифференцировочных антигенов на CD14+ моноцитах после криоконсервации и криоконцентрации не выявило статистически значимых изменений (табл.

8) и может свидетельствовать о нецелесообразности концентрации моноцитов для повышения качества клеточного субпродукта после криоконцентрации.

Таблица 8. Содержание основных субпопуляций моноцитов периферической крови больных диссеминированными злокачественными новообразованиями в лейкаферезном материале антигены криоконсервации, криоконцентрации, уровень значимости (p) Примечание:M–среднее значение экспрессии дифференцировочных антигенов, m–ошибка среднего значения,–стандартное отклонение.

Сравнительный анализ относительного содержания основных субпопуляций моноцитов периферической крови у больных диссеминированными злокачественными новообразованиями в лейкаферезном продукте после криоконсервации и криоконцентрации представлен в табл. 9.