Федеральное государственное унитарное предприятие

«Государственный научно-исследовательский институт

особо чистых биопрепаратов»

Федерального медико-биологического агентства

На правах рукописи

Варюшина Елена Анатольевна

ПРОВОСПАЛИТЕЛЬНЫЕ ЦИТОКИНЫ В РЕГУЛЯЦИИ

ПРОЦЕССОВ ВОСПАЛЕНИЯ И РЕПАРАЦИИ

03.03.03 – иммунология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор А.С. Симбирцев доктор биологических наук Г.О. Гудима Санкт-Петербург

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Провоспалительные цитокины 1.2. Интерлейкин-1 в процессах местного воспаления и заживления ран 1.3. Изучение роли цитокинов при хроническом риносинусите 1.4. Цитокины при воспалительных процессах в легких 1.5. Продукция цитокинов в миндалинах при воспалении 1.6. Роль цитокинов при инфекции Helicobacter pylori 1.7. Регуляция функций нейтрофилов цитокинами 1.8. Регуляторная роль цитокинов при заживлении ран

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Иммунологические методы 2.2. Методы экспериментального изучения действия мазевой формы IL-1 на мышах 2.3. Микроскопические методы исследования 2.4. Характеристики групп пациентов, методики применения IL-1 и получение биологического материала для исследований

ГЛАВА 3 ОСОБЕННОСТИ ПРОДУКЦИИ ЦИТОКИНОВ

ПРИ ГНОЙНО-ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ

ПРОЦЕССАХ У ЧЕЛОВЕКА

ГЛАВА 4 ПРОДУКЦИЯ ЦИТОКИНОВ В СЛИЗИСТОЙ

ОБОЛОЧКЕ ЖЕЛУДКА У ДЕТЕЙ С

ИНФЕКЦИЕЙ H.pylori ГЛАВА 5 ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ IL-1 НА

ЗАЖИВЛЕНИЕ РАН В ЭКСПЕРИМЕНТАХ У

МЫШЕЙ

ГЛАВА 6 ИССЛЕДОВАНИЕ МЕСТНОГО ДЕЙСТВИЯ

IL-1 У ПАЦИЕНТОВ С ХРОНИЧЕСКИМИ

РАНАМИ

ГЛАВА 7

ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМОВ ДЕЙСТВИЯ IL-

ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ГНОЙНОМ

РИНОСИНУСИТЕ

ГЛАВА 8 ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМОВ ДЕЙСТВИЯ

IL-1 У ПАЦИЕНТОВ С АБСЦЕССАМИ И

ФЛЕГМОНАМИ

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

CD кластеры дифференцировки EGF эпидермальный ростовой фактор ELAM E-cелектин FMLP формил-метионин-лейцин-фенилаланин GRO онкоген, связанный с ростом ICAM молекулы межклеточной адгезии IFN интерферон IGF инсулин-подобный ростовой фактор IL интерлейкин KGF фактор роста кератиноцитов LPS липополисахарид MCP моноцитарный хемотаксический белок MIP макрофагальный воспалительный белок mRNA матричная рибонуклеиновая кислота NK натуральные киллеры NFB ядерный транскрипционный фактор В PDGF тромбоцитарный фактор роста PMA форболмиристатацетат патогенную микрофлору TGF трансформирующий фактор роста Th1 T-лифоциты хелперы TLR Толл-подобные рецепторы TNF фактор некроза опухолей VCAM молекула адгезии сосудистого эндотелия VEGF фактор роста сосудистого эндотелия ZO-1 zonula occludens- БАЛ бронхоальвеолярный лаваж ВЭБ вирус Эпштейна-Барр ГК гидрокортизон ГК гидрокортизон ИФА иммуноферментный анализ МПО миелопероксидаза НСТ нитросиний тетразолий ПЦР полимеразно-цепная реакция СОЖ слизистая оболочка желудка ФЧ фагоцитарное число ХГРС хронический гнойный риносинусит ЦМВ цитомегаловирус ЧЛЛ челюстно-лицевая локализация ЭКМ экстраклеточный матрикс ЭПР эндоплазматический ретикулум

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы Изучение роли провоспалительных цитокинов в иммунном и воспалительном ответе представляет собой важное направление современной иммунологии. Взаимодействия между различными типами клеток обеспечивают стабильность тканей организма в норме и определяют исход патологических процессов. Важную роль в поддержании нормального тканевого гомеостаза и при воспалении играют цитокины. Провоспалительные цитокины, такие как интерлейкин-1 (IL-1) и фактор некроза опухолей (TNF-), продуцируются в ответ на внедрение патогенов и повреждение тканей, и стимулируют развитие местной воспалительной реакции, которая направлена на элиминацию патогена и заживление тканей (Dinarello C.A., 2000; Werner S., Grose R., 2003).

Интерлейкин-8 (IL-8) (СХС-хемокин) является основным хемоаттрактантом для нейтрофилов, которые первыми появляются в очаге воспаления и отвечают за элиминацию микроорганизмов. В случае, когда местное воспаление неэффективно, эти медиаторы продуцируются в тканях в больших количествах, появляются в циркуляции и активируют острофазовый ответ или воспалительную реакцию. Именно поэтому пристальное внимание исследователей привлекает изучение роли провоспалительных цитокинов, прежде всего в регуляции развития местного воспалительного процесса, а затем и регенерации тканей.

Среди провоспалительных цитокинов важнейшим медиатором развития воспаления считается IL-1. Он обладает широким спектром биологической активности и стимулирует функции практически всех клеток, участвующих к защитных реакциях, включая клетки центральной нервной, эндокринной и гематопоэтической систем. Действие IL-1 может реализовываться как на системном, так и на местном уровне. Важная роль IL-1 в фазе воспаления подтверждается тем, что экспрессия мРНК и уровни продукции белков IL-1 и IL-1 повышаются на ранних стадиях заживления ран (Grellner W., 2002; Sato Y., Ohshima T., 2000). В связи с этим и первые проявления биологического действия IL-1 сводятся к активации местных защитных реакций. Экспериментальное введение IL- в кожу вызывает покраснение, отек и инфильтрацию тканей лейкоцитами.

Поскольку практически все клетки организма имеют рецепторы к IL-1, этот цитокин очень быстро активирует практически все типы клеток, участвующих в формировании локальной воспалительной реакции.

Важные биологические функции IL-1 явились предпосылкой для его использования в качестве лекарственного препарата. Было предпринято несколько попыток использования IL-1 и IL-1 для восстановления костномозгового кроветворения у раковых пациентов после высоких доз химиотерапии (Гершанович М.А. с соавт., 2000). Системное применение IL-1 в этих исследованиях имело положительное клиническое действие, но было ограниченным из-за побочных эффектов введения IL-1 у человека, поскольку терапевтическая доза и токсическая были близкими. Кроме того, IL-1 может быть введен местно, непосредственно в воспалительный очаг, чтобы активировать местные защитные механизмы и избежать нежелательных проявлений острофазового ответа. Представляет большой интерес раскрытие возможных механизмов локального действия IL-1. В связи с этим, данная работа является актуальной и имеет не только теоретическое, но и практическое значение.

Цель работы:

Исследование механизмов регуляции цитокинами местных воспалительных процессов и заживления ран в экспериментальных моделях на животных и у человека.

Задачи работы:

1. Исследовать особенности продукции провоспалительных цитокинов при ряде гнойно-воспалительных процессов и их связь с функциональной активностью нейтрофилов и особенностями субпопуляционного состава лимфоцитов в периферической крови.

провоспалительных цитокинов в слизистой оболочке желудка у детей с хроническими гастродуоденальными заболеваниями при инфекции H.pylori.

рекомбинантного IL-1 человека на модели осложненных ран у мышей.

Оценить параметры иммунитета животных при локальном применении мазевой формы IL-1. Провести ультраструктурный анализ формирования эпителия, оценить экспрессию белков плотных контактов окклюдина, ZOи клаудина-1 иммуногистохимическими методами.

4. Изучить ранозаживляющее действие мазевой формы рекомбинантного IL-1 человека у пациентов с длительно незаживающими ранами и трофическими язвами. Исследовать изменения цитологической картины и функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов в раневом очаге под действием IL-1.

5. Исследовать механизмы лечебного действия рекомбинантного IL- человека при местном применении у пациентов с гнойновоспалительными процессами, оценить его влияние на содержание цитокинов в очаге воспаления, на цитологическую картину и на сравнительную динамику показателей иммунитета в очаге воспаления и в периферической крови.

Научная новизна работы продукции цитокинов IL-1, IL-1, IL-8 и TNF- с активностью воспаления, а также тяжестью заболевания у пациентов с гнойновоспалительными заболеваниями (абсцессами легких, эмпиемой плевры, лимфопролиферативным синдромом локальная продукция IL-1, IL-1, IL-6 и IL-8 в ткани глоточной миндалины существенно различается при вирусных и бактериальных инфекциях.

В работе впервые проведена комплексная оценка иммунного статуса у лиц с ХГРС и установлено наличие изменений, выражающихся в увеличении количества HLAII+, CD16+ и CD19+ лимфоцитов, повышении спонтанной продукции IL-8 и снижении индуцированной продукции IL- и IL-2 в крови, появлении высоких уровней IL-1, IL-6 и IL-8 в содержимом верхнечелюстных пазух.

Установлена взаимосвязь между повышением продукции IL-1 и IL- в слизистой оболочке желудка и наличием инфекции H.pylori у детей с хроническими гастродуоденальными заболеваниями.

Впервые показано, что мазевая лекарственная форма для местного применения, содержащая рекомбинантный IL-1 человека, усиливает заживление ран в экспериментах на мышах, что проявляется в уменьшении размеров раны и осуществляется за счет повышения количества клеток в грануляционной ткани, усиления эпителизации, эпидермального барьера.

В работе впервые изучены механизмы иммуностимулирующего действия рекомбинантного IL-1 человека при местном применении для терапии гнойно-воспалительных заболеваний (абсцесс легкого, хронический гнойный риносинусит, флегмоны челюстно-лицевой области), а также исследовано влияние мазевой формы IL-1 на репарацию длительно незаживающих ран и трофических язв нижних конечностей у человека.

Теоретическая и практическая значимость Теоретическая значимость обусловлена тем, что в работе расширены представления об участии провоспалительных цитокинов в процессах местного воспаления и репарации. Описаны особенности иммунного статуса, в том числе продукции цитокинов, а также состояния фагоцитарной системы, приводящие к нарушениям в протекании воспалительного процесса и заживления ран. Предложено использовать экзогенный рекомбинантный IL-1 человека, который вносится непосредственно в очаг поражения. Выявлено, что IL-1 играет ключевую роль в процессах локального воспаления и заживления ран в экспериментах на животных и у человека.

Значение полученных результатов исследования для практики подтверждается тем, что разработаны и внедрены: способ лечения повреждений слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта (Патент на изобретение № 2355415 от 10.01.2009), композиция для лечения повреждений слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта (Патент на изобретение № 2361606 от 10.01.2009), интерлейкинсодержащая композиция (Патент на изобретение № 2432170 от 10.10.2010).

На основании полученных результатов выявлена значимость определения локальной продукции цитокинов в очаге воспаления для оценки особенностей протекания воспалительного процесса. Показана информативность метода иммуногистохимии для изучения продукции цитокинов при воспалительных процессах в ЖКТ и респираторном тракте.

В работе показано, что IL-1 обладает ранозаживляющей и местной иммуностимулирующей активностью, раскрыты возможные механизмы действия цитокина.

Внедрение результатов работы в практику Результаты внедрены в практическое здравоохранение в ФГБУ "СПб НИИ ЛОР" МЗ России, г. Санкт-Петербург, в клинике торакальной хирургии Военно-Медицинской Академии им. С.М. Кирова, г. СанктПетербург; в Центре лечения хирургических инфекций, г. СанктПетербург, Балтийской клинической центральной бассейновой больнице им. Чудновского, г. Санкт-Петербург, в клинике челюстно-лицевой и пластической хирургии СПбГМУ им. Павлова, г. Санкт-Петербург.

Результаты диссертационной работы могут быть использованы в научно-исследовательских институтах, занимающихся изучением цитокинов: ФГБУ «ГНЦ «Институт иммунологии» ФМБА России, г.

Москва, Военно-Медицинской Академии им. С.М. Кирова, г. СанктПетербург, ФГБУ «НИИ экспериментальной медицины» СЗО РАМН, г.

Санкт-Петербург и других.

Основные положения, выносимые на защиту 1. Уровни провоспалительных цитокинов в очаге воспаления отражают особенности протекания воспалительных процессов (активность, распространенность процесса, наличие инфекции) у человека.

2. При гнойно-воспалительных заболеваниях у человека выявляется снижение функций нейтрофилов в очаге воспаления, эти нарушения затрудняют разрешение воспаления.

3. Применение мазевой формы, содержащей рекомбинантный IL- человека, усиливает заживление ран в экспериментальной модели у мышей. Под действием IL-1 происходит уменьшение размеров ран, увеличивается количество клеток в грануляционной ткани и усиливается эпителизация.

4. Местная терапия с применением мазевой формы, содержащей рекомбинантный IL-1 человека, не оказывает действия на такие параметры как лейкоцитарный состав периферической крови, размер селезенок и количество спленоцитов в экспериментах на мышах.

5. Применение мазевой формы, содержащей рекомбинантный IL- человека, у пациентов с длительно незаживающими ранами и трофическими язвами нижних конечностей активирует нейтрофильные гранулоциты, а также вызывает увеличение относительного количества макрофагов и клеток соединительной ткани в раневом очаге.

6. Местное применение рекомбинантного IL-1 человека приводит к усилению местных факторов защиты в очаге воспаления у пациентов с гнойно-воспалительными заболеваниями. Механизмы действия IL- связаны с увеличением продукции провоспалительных цитокинов и стимуляцией за их счет функций нейтрофилов. Действие IL-1 при местном применении у человека ограничивается воспалительным очагом.

Личный вклад соискателя состоит в участии во всех этапах выполнения диссертационного исследования; проведении анализа состояния вопроса по данным современной литературы; статистической обработки данных; интерпретации полученных результатов; подготовке основных публикаций по выполненной работе. Цитологические исследования, оценка бактерицидной, фагоцитарной функций нейтрофилов, иммуногистохимическое исследование продукции цитокинов, гистохимические исследования, оценка субпопуляций лимфоцитов методом проточной цитометрии при ХГРС выполнены автором. Экспериментальные исследования на животных выполнялись автором вместе с соавторами работ.

Апробация работы Основные результаты диссертационной работы доложены на российских и международных конференциях: Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (6-ом, г. Новосибирск, 1996 г., 13-ом, г.

Санкт-Петербург, 2003 г., 16-ом, г. Санкт-Петербург, 2006 г.), 2nd Joint Meeting of the ICS and ISICR (Иерусалим, 1998 г.), Научной конференции с международным участием им. акад. В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», (г. Санкт-Петербург, 2-ой, 1998г; 3-ей, 1999 г; 5-ой, 2001 г; 6-ой, 2002; 7-ой, 2003г; 11-ой, 2007 г,), 4th World Congress on Inflammation (Рaris, France, 1999 г.), 2-ом Съезде иммунологов России (Сочи, 1999 г.), 5th World Congress on Trauma, Shock, Inflammation and Sepsis – Pathophysiology, Immune Consequences and Therapy (Munich, 2000), Euroconference on molecular aspects of the initiation and regulation of immune response “Communication within the immune system” (San Feliu de Guixoils, 2001), European Respiratory Society Annual Congress (12th, Stockholm, 2002;

17th, Stockholm, 2007; 19th,, Vienna, 2009; 21st, Amsterdam, 2011), 10-ом Всероссийском научном форуме «Санкт-Петербург – Гастро» (г. СанктПетербург, 2008 г), 8-ом Конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (г. Москва, 2007 г), Объединенном иммунологическом форуме (г. Санкт-Петербург, 2008г.), 1-ом съезде российского общества хирургов-гастроэнтерологов «Актуальные вопросы хирургической гастроэнтерологии», (г. Геленджик, 2008), Межрегиональном форуме «Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии – междисциплинарные проблемы» (г. Санкт-Петербург, 2010 г.), Межрегиональном форуме «Клиническая иммунология и аллергология – междисциплинарные проблемы» (Казань, 2012).

Основные результаты диссертации опубликовано в 71 печатной работе, из которых 21 статья в журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации материалов докторских и кандидатских диссертаций («European Cytokine Network», «Иммунология», «Вестник хирургии», «Российский иммунологический журнал» («Russian Journal of Immunology»), «Цитокины и воспаление», «Медицинская иммунология», оториноларингология», «Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии»), 6 статей в научных журналах, 40 публикаций в материалах научных конгрессов и конференций, одна глава в книге, три патента.

Структура и объем диссертации

Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, шести глав изложения результатов исследований, обсуждения результатов и списка литературы. Диссертация изложена на страницах, включает в себя 20 таблиц и 30 рисунков. Список цитируемой литературы состоит из 368 источников, из них 62 отечественные и иностранных.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Цитокины - это группа регуляторных пептидов, продуцируемых клетками организма (Кетлинский С.А. с соавт., 1992; Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., 2008; Симбирцев, 2002). К цитокинам в настоящее время относят около 200 полипептидов. К основным характеристикам цитокинов, которые позволяют объединить их в самостоятельную группу, относятся следующие. Цитокины – это полипептиды или белки с молекулярной массой 5-50 кДа. У цитокинов отсутствует антигенная специфичность действия. Экспрессия большинства цитокинов начинается в ответ на инфекцию или повреждение тканей, при этом вне воспалительной реакции и иммунного ответа большинство цитокинов клетками не синтезируется. Для цитокинов характерны плейотропность и взаимозаменяемость биологического действия, а также формирование цитокиновой сети. Один и тот же цитокин может синтезироваться различными клетками в разных тканях. Биологические эффекты цитокинов опосредуются через специфические клеточные рецепторные колониестимулирующие факторы, хемокины, трансформирующие ростовые факторы, фактор некроза опухолей, интерлейкины и некоторые другие.

Синтез цитокинов начинается в ответ на повреждение тканей или проникновение инфекции. Продукция цитокинов является частью клеточного ответа, который связан с распознаванием структурных компонентов патогенов, так называемых патоген-ассоциированных молекулярных паттернов (Хаитов P.M. с соавт., 2009). К ним относятся структурные компоненты внешней мембраны грам-отрицательных бактерий - липополисахариды (LPS), мембранные компоненты грамположительных бактерий, пептидогликаны, вирусные РНК, бактериальные ДНК (Aderem A., Ulevitch, R. J., 2000; Takeda K., et al., 2003). Лейкоциты экспрессируют паттерн-распознающие рецепторы, которые называются Toll-подобными рецепторами (TLR, Toll-like receptors). После взаимодействия с TLR микробов или микробных компонентов происходит запуск передачи сигнала внутри клетки. Это приводит к повышению функциональной активности лейкоцитов, а также к экспрессии генов цитокинов. Активация TLR приводит к синтезу провоспалительных цитокинов и IFN-/. Провоспалительные цитокины стимулируют дальнейшее развитие воспалительной реакции (Симбирцев А.С., 2002; Dinarello C.A., 2000). Ключевыми цитокинами являются IL-1, IL-6, TNF, а также хемокины, одним из основных хемокинов является IL-8. При развитии системной воспалительной реакции (острофазового ответа) цитокины оказывают влияние на все органы и ткани организма, участвующие в регуляции гомеостаза. На тканевом уровне цитокины регулируют развитие местной воспалительной реакции и регенерации тканей.

Наиболее известные члены семейства интерлейкина-1 – это интерлейкин-1 (IL-1) и IL-1 (). Эти два полипептида с молекулярной массой около 18 кДа кодируются разными генами, у человека большинство генов семейства IL-1 находятся в составе 2 хромосомы.

Гомология в аминокислотной последовательности у IL-1 и IL- составляет 26%. Оба цитокина связывают одни и те же рецепторы.

Рецепторы для IL-1 обозначают как рецепторы IL-1 I типа и II типа (Sims J.et al., 1994). Рецепторы I типа служат для передачи сигнала, а рецепторы II типа существуют для блокады биологических эффектов, связанных с гиперпродукцией IL-1 (Sims J. et al., 1994). IL-1 и IL- обладают одинаковым спектром биологической активности. У человека главной формой секреторного IL-1 является IL-1, а IL-1 находится преимущественно в виде мембранной формы. У мышей, напротив, главной формой секретируемого клетками IL-1 служит IL-1. Кроме того, еще один член семейства - рецепторный антагонист IL- (IL-1RA) - обладает способностью связываться с рецепторами IL-1 и блокировать биологическую активность IL-1. К этому же семейству относятся IL-18 и IL-33.

Синтез IL-1 начинается в ответ на внедрение микроорганизмов либо повреждение тканей и необходим для развития местного воспаления и осуществления острофазового ответа. Индукция синтеза IL-1 может быть вызвана компонентами клеточных стенок бактерий:

LPS и пептидогликанами. Основными клетками, продуцирующими IL- в организме, являются моноциты и макрофаги, а также клетки, имеющие с макрофагами общее происхождение. До 90% моноцитов периферической крови человека могут продуцировать IL-1 (Симбирцев А.С. и соавт., 1991). IL-1 также продуцируется фибробластами, лимфоцитами, NK-клетками, кератиноцитами, клетками эндотелия и нейтрофилами (Hanson D., Murphy P. 1984; Lord P. et al., 1991). Клетки мыши и человека экспрессируют рецепторы, связывающие IL-1 и IL- человека, а также IL-1 мыши с равной аффинностью. Это подтверждает отсутствие видовой специфичности действия IL-1.

У IL-1 существует около 50 различных биологических функций, а мишенями служат клетки практически всех органов и тканей (Dinarello C.A. et al., 1986). Благодаря столь широкому спектру биологической активности, IL-1 является одним из ключевых цитокинов развития воспалительного и иммунного ответов в организме. При этом его действие может реализовываться как на системном, так и на местном уровне. На системном уровне IL-1 вызывает активацию нейроэндокринной системы, влияет на иммунопоэз, иммуностимуляцию, синтез острофазовых белков в печени и стимуляцию костномозгового кроветворения. На местном уровне IL-1 может регулировать функции практически всех типов клеток, вовлеченных в локальное воспаление и репарацию. Роль IL-1 и других цитокинов при развитии местного воспаления и заживлении ран в настоящее время вызывает большой интерес исследователей.

Существуют две формы TNF - трансмембранная форма про-TNF (26 кДа) и зрелая секреторная форма (17 кДа). Биоактивный TNF представляет собой тример с молекулярной массой 52 кДа. Рецепторы TNF относятся к 1 типу трансмембранных цитокиновых рецепторов.

Есть два типа рецепторов для TNF тип 1 (р60 или р55) с молекулярной массой 60 кДа и тип 2 (р80 или р75) с молекулярной массой 80 кДа.

Рецепторы TNF присутствуют на всех клетках организма, исключая эритроциты (Brockhaus M. et al., 1990).

Высокая продукция TNF является характерной для септического шока. Введение TNF повторяет все признаки септического шока в организме. TNF и рецепторы TNF играют важную роль в защите организма от инфекций, главным образом от внутриклеточных инфекций и туберкулеза. Основными продуцентами TNF являются макрофаги, но и другие клетки могут продуцировать TNF при воспалении, например, нейтрофилы (Tracey K., Cerami A., 1994).

Основными биологическими функциями IL-6 являются активация пролиферации Т- и В-лимфоцитов, стимуляция гранулоцитарного ростка кроветворения, провоспалительное действие за счет стимуляции экспрессии адгезионных молекул на эндотелиальных клетках и хемотаксиса лейкоцитов, активации острофазового ответа, а также пирогенное действие (Kishimoto T., 2006). Зрелый секреторный IL- включает 184 аминокислотных остатка и имеет молекулярную массу 21 кДа.

IL-6 синтезируется T-лимфоцитами, моноцитами, макрофагами, клетками эндотелия, фибробластами и другими клетками. Экспрессия гена IL-6 происходит под действием вирусов, бактерий, а также провоспалительных цитокинов. Возможно также, что IL-6 играет роль регулятора развития иммунитета, поскольку при остром воспалении в противовоспалительные свойства (Ulich T.R. et al., II, 1991).

Хемокины – это белки с молекулярной массой 8-12 кДа, которые имеют гомологию в первичной аминокислотной последовательности 20-80%. На основании положения дисульфидных связей между остатками цистеина хемокины разделяются на 4 группы: СХС (хемокины), СС (-хемокины), С (-хемокины) и СХ3С (-хемокины).

Основным биологическим свойством хемокинов является регуляция миграции различных типов клеток в воспалительный очаг. Действие хемокинов является избирательным. СХС-хемокины, в их числе IL-8, являются хемоаттрактантами для нейтрофилов, тогда как СС-хемокины действуют преимущественно на моноциты.

IL-8 является одним из наиболее важных хемокинов, который (Симбирцев А.С., 1999; Baggiolini M., et al., 1992). Ген IL-8 человека расположен на 4 хромосоме в одном кластере с генами других СХСхемокинов. Транскрипция гена приводит к появлению единичной mRNA, а сам IL-8 синтезируется в виде предшественника из аминокислотных остатков. Зрелый IL-8 существует в нескольких формах, наибольшей активностью обладает форма из 72 аминокислот. У IL-8 есть два типа высокоаффинных рецепторов, I и II типа, нейтрофилы человека конститутивно экспрессируют рецепторы, связывающие IL-8.

IL-8 играет ключевую роль в индукции миграции нейтрофилов в очаге воспаления. Основными клетками-продуцентами IL-8 являются активированные моноциты, макрофаги и клетки эндотелия. Другие клетки, такие как нейтрофилы, эпителиальные клетки, фибробласты, также могут продуцировать IL-8 при воспалении (Baggiolini M. et al., 1992; Goodman R.B. et al., 1998; Matsushima K., Oppenheim J.J., 1991;

Strieter R.M., Kunkel SL. et al., 1989; Strieter R.M., Phan S.H. et al., 1989).

IL-8 вызывает повышение концентрации внутриклеточного Ca2+, полимеризацию актина, изменение формы нейтрофилов для процесса миграции, дегрануляцию лейкоцитов (Peveri P., et al., 1988; Schroeder J.

et al., 1987) Внутрикожное введение IL-8 индуцирует накопление нейтрофилов в месте введения через 30 минут (Van Damme J. et al., провоспалительных цитокинов IL-1, IL-6 и TNF- моноцитами, принимая участие в регуляции воспаления.

1.2. Интерлейкин-1 в процессах местного воспаления Важная роль IL-1 в фазе воспаления подтверждается тем, что продукция IL-1 в пораженных тканях резко возрастает, начиная уже с первых минут после нанесения раны. Экспрессия mRNA и уровни продукции белков IL-1 и IL-1 повышаются в очаге на самых ранних стадиях раневого процесса (Fahey III T.J. et al., 1990; Sato Y., Ohshima T., 2000). В интактной коже у человека IL-1 не определяется, но значительная экспрессия этого медиатора происходит в тканях через 30минут после нанесения раны, а через 2 часа – в инфильтрирующих рану лейкоцитах (Grellner W., 2002). Эпидермис человека в норме содержит биологически активный IL-1 (Mizutani H., et al., 1989).

Внутриклеточный IL-1 обнаруживается в нейтрофилах через 4 часа после нанесения раны, а затем - в макрофагах и фибробластах.

Максимальные значения продукции IL-1 отмечены через 7 часов после ранения (Kondo T. et al., 1999). Через несколько часов экспрессия IL- и IL-1 несколько снижается, а экспрессия IL-1 появляется снова спустя несколько дней в грануляционной ткани (Grellner W., 2002;

Kondo T. et al., 1999). Усиленная продукция провоспалительных цитокинов, IL-1 и TNF-, на ранних этапах заживления раны служит для запуска каскада синтеза других цитокинов и ростовых факторов, а также для регуляции и координации функций клеток, принимающих участие в раневом процессе.

IL-1 продуцируется главным образом макрофагальными клетками, а при воспалении – нейтрофильными гранулоцитами и резидентными типами клеток (Grellner W., 2002; Lord P.C.W., 1991; Mizutani H. et al., 1989). Высвобождение IL-1 и TNF- приводит к экспреcсии адгезионных молекул на эндотелии капилляров и способствует выходу лейкоцитов из кровяного русла в подлежащие ткани (Hakkert B.C. et al., 1991).

Нейтрофилы первыми мигрируют в раневой очаг в течение нескольких минут, за ними следуют моноциты и лимфоциты. Они продуцируют различные протеиназы и свободнорадикальные формы кислорода для защиты от микроорганизмов, а также осуществляют активный фагоцитоз. Под действием IL-1 происходит индукция продукции основных хемотактических факторов для нейтрофилов - IL-8 и MIP-2, а также TNF-, который обладает хемотактическими свойствами для нейтрофилов и моноцитов (Figari I.S., et al., 1987; Larsen C.G., et al., 1989 ; Ohno Y., et al., 1997). IL-1 не оказывает прямого стимулирующего действия на нейтрофилы, но может действовать опосредованно через индукцию IL-8 и TNF-. Преинкубация нейтрофилов человека с IL- («прайминг») повышает способность лейкоцитов отвечать на IL-8, FMLP и другие стимулы, усиливая хемотаксис, высвобождение ферментов и супероксидных радикалов и фагоцитоз (Brandolini L. et al., 1997; Ogle провоспалительные медиаторы, удлиняют срок функциональной активности нейтрофилов в очаге воспаления за счет модуляции апоптоза (Lee A. et L., 1993). Полиморфоядерные лейкоциты сами могут синтезировать и высвобождать IL-1 и IL-1 (Lord P.C.W., et al., 1991).

После нейтрофилов в очаге воспаления появляются моноциты, которые дифференцируются в тканях в макрофаги. В первые дни после нанесения раны среди ряда хемоаттрактантов для моноцитов преимущественно экспрессируется моноцитарный хемотакcический белок-1 (MCP-1), продукция которого индуцируется IL-1 (Sica A. et al., 1990). Лимфокины, секретируемые Т-лимфоцитами - IL-2, IFN- и TGFрегулируют основные функции фибробластов (Thornton S.C. et al., 1990). Одной из основных функций IL-1 является стимуляция пролиферации лимфоцитов и продукции IL-2 этими клетками (Ketlinsky S., et al, 1991).

стимулировать рост и метаболизм соединительной ткани, а также реэпителизацию ран. Показано, что IL-1 and IL-1 повышают фибробластами кожи in vitro (Thornton S.C. et al.,1990). IL-1 также стимулирует продукцию ростовых факторов и IL-8 фибробластами (Larsen C.G. et al., 1989; Maas-Szabowski N. et al., 2000). IL-1 является основным аутокринным фактором, стимулирующим кератиноциты, поскольку кератиноциты продуцируют IL-1 (Mizutani H. et al., 1989). ILстимулирует миграцию кератиноцитов in vitro, и ускоряет заживление повреждений эпидермиса in vivo (Chen J.D. et al., 1995;

дифференцировку эпидермальной ткани за счет стимуляции продукции фактора роста кератиноцитов (KGF) фибробластами (Chen J.D. et al., 1995). При заживлении раны в грануляционной ткани происходит массивное образование новых кровеносных сосудов. Основными регуляторами ангиогенеза являются IL-8, TNF-, а также фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF). IL-1 значительно повышает экспрессию mRNA и секрецию этого фактора макрофагами (Perez-Ruiz M. et al., 1999). В третью фазу, при переходе от грануляционной ткани к образовании рубца, происходит продолжительный синтез и распад коллагена. Влияние IL-1 на продукцию коллагена может быть разнонаправленным. IL-1 может увеличивать синтез коллагеназ. IL-1 и IL-1 могут усиливать продукцию коллагена фибробластами человека in vitro (Goldring M.B., Krane S.M., 1987), а IL-1 увеличивает прочность раневого рубца in vivo (Sauder D.N. et al., 1990).

Системное применение глюкокортикоидов снижает нормальную экспрессию провоспалительных цитокинов, в том числе IL-1, которая необходима при заживлении раны (Barnes P. J. 1998; Hbner G. et al., глюкокортикоидов, который индуцирует синтез KGF фибробластами, поэтому происходит уменьшение эпителизации ран.

репаративных процессов в ранах - с другой. При экспериментальном диабете у мышей наблюдают повышенную экспрессию мRNA IL-1 и TNF- в раневом очаге (Wetzler C. et al., 2000). При этом наблюдается дисрегуляция продукции хемотактических факторов для лейкоцитов, что приводит к пролонгированному присутствию нейтрофилов и макрофагов в ране и удлинению воспалительной фазы раневого процесса. При трофических язвах на фоне венозной недостаточности и при диабете у человека снижено количество Т-лимфоцитов в раневом очаге и наблюдаются дефекты функциональной активации раневых макрофагов (Loots M.A.M. et al.,, 1998). При экспериментально индуцированном диабете наблюдается тяжелый дефицит эпителизации, связанный с нарушениями продукции KGF (Werner S. et al.,1994). При диабете часто происходит инфицирование ран, так как снижены функции нейтрофилов, играющих основную роль в очищении раневой области. Высокие уровни хронических ран у человека. Концентрации IL-1 в раневой жидкости, взятой из длительно незаживающих ран, значительно превышали уровни этих цитокинов в заживающих ранах. Показано, что разница в продукции провоспалительных цитокинов не зависела от разницы в степени бактериальной обсемененности ран (Werner S. et al., 1994). В то же время, в хронических ранах присутствуют в высоких концентрациях противовоспалительные цитокины – IL-1RA (Trengove N.J. et al., 2000) и IL-10. Очевидно, для успешного заживления хронических ран важен баланс позитивными и негативными стимулами в раневом очаге.

Эксперименты по применению IL-1 для лечения осложненного заживления ран у животных дали положительный результат. Sauder et al.

показали, что местные аппликации человеческого рекомбинантного ILзначительно ускоряют заживление кожных ран у свиней (Sauder D.N.

et al., 1990). Гистологическое исследование биоптатов показало, что применение IL-1 приводило к полной и нормальной регенерации эпидермиса. Vegesna et al. использовали человеческий рекомбинантный IL-1 для лечения осложненных ран у облученных мышей. Данные свидетельствовали, что местное применение IL-1 в дозах 103 U и выше приводит к повышению прочности раневого рубца (Vegesna V. et al., 1995).

Таким образом, IL-1 является одним из важнейших цитокинов, регулирующих местный воспалительный процесс и заживление ран.

Ключевая роль IL-1 заключается в регуляции функций практически всех типов клеток и продукции ростовых факторов и других цитокинов, вовлеченных в раневой процесс. Нарушения продукции IL-1 отражают осложненное течение заживления ран. IL-1 обладает выраженным ранозаживляющим потенциалом и его применение может быть перспективным направлением для лечения хронических ран различного генеза у человека.

1.3. Изучение роли цитокинов при хроническом риносинусите повторяющимся или постоянным воспалительным процессом в слизистой оболочке полости носа и придаточных пазух. Хронический риносинусит в наше время остается одной из значительных проблем медицины, при этом увеличивается число случаев заболевания во всем мире. Несмотря на распространенность этого заболевания и большой интерес исследователей, патогенетические и иммунологические особенности течения воспалительного процесса при риносинуситах остаются недостаточно изученными. Хронический риносинусит характеризуется отеком слизистой оболочки носа, наличием гнойного отделяемого из носа и инфильтрацией слизистой оболочки синусов лейкоцитами, главным образом, нейтрофилами. Воспаление играет ключевую роль в патогенезе хронического риносинусита (Benninger M.S., et al., 2003). В последние годы растет интерес исследователей к изучению роли цитокинов в патогенезе хронического риносинусита. Тем не менее, участие цитокинов в этих процессах является недостаточно изученным. Более того, результаты, полученные ранее, остаются противоречивыми из-за недостаточной характеристики пациентов, а также различий методов исследования.

В смывах из носовой полости у здоровых неинфицированных людей, не страдающих аллергией, эпителиальные клетки составляют 50%-60%, нейтрофилы - 35%-40%, а лимфоциты, макрофаги и эозинофилы менее 5% (Tedeschi A., et al., 1994). Сходные результаты получены при исследовании смывов, полученных после пункции из верхнечелюстных пазух у здоровых людей. В верхнечелюстных пазухах в норме содержится 63% эпителиальных клеток, 28% нейтрофилов, 9%