«ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ НИМЕСУЛИДА И БЛИЗКИХ ПО СТРУКТУРЕ СОЕДИНЕНИЙ ...»

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего

профессионального образования «Курский государственный медицинский

университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

На правах рукописи

Герасимов Дмитрий Александрович

ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

НИМЕСУЛИДА И БЛИЗКИХ ПО СТРУКТУРЕ СОЕДИНЕНИЙ

Специальность: 14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия Диссертация на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Научные руководители:

Шорманов В.К., доктор фармацевтических наук, профессор Сипливая Л.Е., доктор биологических наук, профессор Курск –

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Получение и применение отдельных производных 4-нитроанилина......... 1.2 Физические свойства и установление химической структуры объектов исследования

1.3 Метаболизм и токсикологическая характеристика

1.4 Идентификация объектов исследования

1.5 Количественное определение

1.6 Изолирование, концентрирование и очистка нимесулида и близких по структуре соединений

1.7 Распределение в теплокровных организмах и сохраняемость в трупном материале объектов исследования

ГЛАВА 2 ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ, МАТЕРИАЛЫ, ОБОРУДОВАНИЕ,

РЕАКТИВЫ. СИНТЕЗ РАБОЧИХ СТАНДАРТОВ И ПОДТВЕРЖДЕНИЕ ИХ

СТРУКТУРЫ

2.1 Объекты исследования

2.1.1 Очистка и определение содержания нимесулида

2.1.2 Синтез, очистка и определение содержания 4-Н-2-ФА

2.1.3 Синтез, очистка и определение содержания 4-А-2-ФФМСА............... 2.1.4 Синтез, очистка и определение содержания 4-МСА-3-ФФА............... 2.1.5 Синтез, очистка и определение содержания 4-Г-2-ФФМСА............... 2.2 Приборы и оборудование

2.2 Реактивы

2.3 Материалы

2.4 Посуда

2.5 Подтверждение структуры рабочих образцов

2.5.1 Ядерный магнитный резонанс 1Н

2.5.2 Колебательная ИК-спектрофотометрия

2.5.3 Хроматография в тонком слое сорбента

2.6 Идентификация фотометрическими методами

2.6.1 Колебательная ИК-спектрофотометрия

2.6.2 Электронная УФ- и видимая спектрофотометрия

2.7 Идентификация хроматографическими методами

2.7.1 Нормальнофазовая ТСХ

2.7.2 Обращеннофазовая ТСХ

2.7.3 Нормальнофазовая ВЭЖХ

2.7.4 Обращеннофазовая ВЭЖХ

2.7.5 Капиллярная газовая хроматография с масс-спектрометрическим детектированием

ГЛАВА 3 КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ НИМЕСУЛИДА И БЛИЗКИХ ПО

СТРУКТУРЕ СОЕДИНЕНИЙ

3.1 Определение спектрофотометрическим методом

3.1.1 Анализ нимесулида, 4-нитроанилина, 4-Н-2-ФА в ДМФА.................. 3.1.2 Анализ 4-А-2-ФФМСА, 4-МСА-3-ФФА, 4-Г-2-ФФМСА в этаноле.... 3.2 Определение нормальнофазовой ВЭЖХ

3.2.1 Анализ нимесулида, 4-НА, 4-Н-2-ФА

3.2.2 Анализ нимесулида, 4-А-2-ФФМСА, 4-МСА-3-ФФА, 4-Г-2-ФФМСА 3.3 Определение обращеннофазовой ВЭЖХ в градиентном режиме элюирования

ГЛАВА 4 КОНЦЕНТРИРОВАНИЕ И ОЧИСТКА ОБЪЕКТОВ

ИССЛЕДОВАНИЯ

4.1 Экстракционные методы очистки и концентрирования

4.1.1 Жидкость-жидкостная экстракция гидрофобными экстрагентами...... 4.1.2 Жидкость-жидкостная экстракция гидрофобными экстрагентами в присутствии электролитов

4.2 Хроматографические методы очистки и концентрирования

4.2.1 Хроматография в тонком слое нормальнофазового сорбента.............. 4.2.2 Хроматография в тонком слое обращеннофазового сорбента............. 4.2.3 Макроколоночная нормальнофазовая хроматография

4.2.4 Макроколоночная обращеннофазовая хроматография

4.3 Моделирование очистки извлечений из биоматериала в контрольных опытах

4.3.1 Модель очистки в тонком слое нормальнофазового сорбента............. 4.3.2 Модель очистки в тонком слое обращеннофазового сорбента............ 4.3.3 Модель очистки с применением жидкость-жидкостной экстракции... 4.3.4 Модель очистки на макроколонке с нормальнофазовым сорбентом. 4.3.5 Модель очистки на макроколонке с обращеннофазовым силикагелем 4.3.6 Модель очистки комбинацией жидкость-жидкостной экстракции и макроколоночной нормальнофазовой хроматографии

4.3.7 Модель очистки комбинацией жидкость-жидкостной экстракции и макроколоночной обращеннофазовой хроматографии

ГЛАВА 5 ОПРЕДЕЛЕНИЕ НИМЕСУЛИДА И БЛИЗКИХ ПО СТРУКТУРЕ

СОЕДИНЕНИЙ В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ

5.1 Изолирование из биологической ткани настаиванием. Поиск оптимальных условий изолирования

5.1.1 Выбор изолирующего агента

5.1.2 Выбор времени настаивания с оптимальным изолирующим агентом 5.1.3 Выбор кратности настаивания и количества изолирующего агента при оптимальном времени изолирования

5.2 Методики изолирования из трупных органов и биожидкостей................ 5.2.1 Методика изолирования из ткани трупного органа (печени)............. 5.2.2 Методика изолирования из крови

5.2.3 Методика изолирования из плазмы крови

5.2.4 Методика изолирования из мочи

5.3 Определение на основе разработанных специальных схем очистки извлечений. Установление определяемого минимума в биоматериале......... 5.3.1 Определение с использованием очистки комбинацией жидкостьжидкостной экстракции и макроколоночной нормальнофазовой хроматографии

5.3.2 Определение с использованием очистки комбинацией жидкостьжидкостной экстракции и макроколоночной обращеннофазовой хроматографии

ГЛАВА 6 СОХРАНЯЕМОСТЬ В ТРУПНОМ МАТЕРИАЛЕ И

РАСПРЕДЕЛЕНИЕ В ОРГАНИЗМЕ ТЕПЛОКРОВНЫХ ЖИВОТНЫХ

ИССЛЕДУЕМЫХ СОЕДИНЕНИЙ

6.1 Распределение в организме теплокровных животных (крысы)................ 6.1.1 Характер распределения нимесулида и его метаболитов.................. 6.1.2 Характер распределения близких к нимесулиду структур................ 6.2 Сохраняемость анализируемых соединений в трупном материале.......... 6.2.1 Сохраняемость нимесулида и продуктов его трансформации в трупном материале

6.2.2 Сохраняемость 4-нитроанилина, 4-Н-2-ФА и 4-Г-2-ФФМСА........... ВЫВОДЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Нимесулид (N-(4-нитро-2-феноксифенил)метансульфонанилид) применяется в медицине как нестероидное противовоспали-тельное лекарственное средство. Близкими по структуре к нимесулиду являются 4-нитроанилин (базовая структура), N-(4-амино-2феноксифенил)-метансульфонанилид и N-(4-метансульфониламино-3-феноксифенил)-ацетамид (метаболиты нимесулида), 4-нитро-2-феноксианилин (фармакопейная примесь нимесулида), N-(4-гидрокси-2-феноксифенил)метансульфонанилид (вновь синтезированное вещество).

Рассматриваемые соединения токсичны для теплокровных и человека.

LD50 нимесулида для крыс при внутрижелудочном введении, например, составляет 200 мг/кг, LD100 4-нитроанилина – 600 мг/кг. Токсичность данной группы веществ чаще всего сопряжена с нарушением функций печени и почек.

Зарегистрированы частые случаи летального отравления человека нимесулидом и 4-нитроанилином. Отравления ими могут происходить в процессе производства веществ, при попадании их в атмосферу и сточные воды предприятий, при приме завышенных доз или суицидальных попытках.

Широкое применение нимесулида и 4-нитроанилина, их токсические свойства, наличие случаев отравлений с летальным исходом обуславливают необходимость изучения этих соединений в химико-токсикологическом отношении. Для более надежного доказательства отравлений нимесулидом необходимо изучение его близких структур, в том числе и его метаболитов, как потенциальных объектов химико-токсикологического анализа.

Степень разработанности темы исследования. До настоящего времени недостаточно разработаны вопросы изолирования рассматриваемых веществ из биоматериала, их очистки, обнаружения, идентификации и количественного определения. Недостаточно изучены закономерности их распределения в теплокровных организмах. В доступной литературе отсутствуют данные по сохраняемости рассматриваемых веществ в трупном материале.

Исходя из вышеизложенного, разработка методик химикотоксикологического исследования нимесулида и близких по структуре соединений является актуальной.

Цель исследования. Целью настоящего исследования является разработка методик химико-токсикологического анализа нимесулида и близких по структуре соединений.

Задачи исследования. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

провести подбор условий синтеза из нимесулида рабочих стандартных образцов 4-Н-2-ФА, 4-А-2-ФФМСА, 4-МСА-3-ФФА, 4-Г-2-ФФМСА и определить условия их очистки;

установить структуру и содержание основного вещества в полученных субстанциях;

изучить особенности электронных, колебательных и ЯМР объектов исследования;

определить характер хроматографической активности исследуемых веществ в тонких слоях и колонках различных сорбентов при использовании методов ТСХ, макроколоночной хроматографии низкого давления, ВЭЖХ и ГХ-МС;

несмешивающихся жидкостей;

биологического материала настаиванием с изолирующими агентами различной химической природы и различного состава, разработать схемы очистки извлечений;

изучить распределение исследуемых веществ в органах и биожидкостях теплокровных животных;

определить сроки сохранения рассматриваемых веществ в гнилостноразлагающемся трупном материале.

Научная новизна. Определены оптимальные условия синтеза из нимесулида рабочих стандартных образцов 4-Н-2-ФА, 4-МСА-3-ФФА, 4-Г-2ФФМСА и предложены схемы их очистки. Изучены особенности поглощения анализируемыми веществами УФ-, видимого и ИК-излучения. Исследованы ЯМР 1Н-спектры данных структур.

Изучены особенности масс-спектров изучаемых веществ, полученных методом электронного удара. Показана возможность селективного и высокочувствительного определения данных соединений по совокупности характеристических сигналов осколков молекулы в масс-спектре и времени удерживания в капиллярной колонке при идентификации методом ГХ-МС.

хроматографирования исследуемых веществ методами ТСХ, ВЭЖХ и макроколоночной хроматографии низкого давления в условиях применения нормальнофазовых и обращеннофазовых сорбентов.

Разработаны методики идентификации и количественного определения объектов исследования спектральными и хроматографическими методами.

Выявлены основные параметры и условия очистки нимесулида и близких по структуре соединений от соэкстрактивных веществ биоматериала методами жидкость-жидкостной экстракции и хроматографии.

Впервые обосновано применение ацетона в качестве универсального изолирующего агента для извлечения нимесулида и близких по структуре соединений из биоматериала. На основе использования ацетона как изолирующего агента и очистки методами жидкость-жидкостной экстракции и хроматографии в тонких слоях и колонках сорбентов разработаны оригинальные методики определения рассматриваемых соединений в ткани трупных органов и биожидкостях, приемлемые как для исследования свежего, так и гнилостноизмененного трупного материала.

В эксперименте на животных (крысы) исследованы особенности распределения рассматриваемых веществ в организме теплокровных.

Изучена сохраняемость рассматриваемых отравляющих агентов и их трансформация в гнилостно-разлагающемся трупном материале в зависимости от температурного режима и продолжительности сохранения.

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты химико-токсикологического исследования нимесулида и близких по структуре соединений позволяют расширить знания о химических и физико-химических свойствах анализируемых веществ. Полученные данные составляют основу для разработки и внедрения в практику методик химико-токсикологического анализа изучаемых веществ.

На основании проведенных исследований разработаны два варианта практических рекомендаций к проведению химико-токсикологических исследований при отравлении отдельными производными 4-нитроанилина и нимесулидом.

Внедрены и апробированы результаты работы:

методика идентификации нимесулида и его метаболитов (4-амино-2феноксифенилметансульфонамида и 4-ацетиламино-2-феноксифенилметансульфонамида) методами ТСХ и УФ-спектрофотометрии внедрена в учебную и научную работу кафедры фармацевтической химии и фармакогнозии Белгородского государственного национального исследовательского университета (акт внедрения №32 от 21.09.12 г.); методика очистки нимесулида и его метаболитов (4-амино-2-феноксифенилметансульфонамида и 4ацетиламино-2-феноксифенилметан-сульфонамида) методами жидкостьжидкостной экстракции и нормальнофазовой колоночной хроматографии внедрена в учебную и научную работу кафедры фармацевтической химии и фармакогнозии Белгородского государственного национального исследовательского университета (акт внедрения №31 от 21.09.12 г.); методика изолирования 4-нитроанилина и нимесулида из ткани печени и определения методами ТСХ и УФ-спектрофотометрией внедрена в учебную и научную работу кафедры фармацевтической химии и фармацевтической технологии Воронежской государственной медицинской академии им. Н.Н. Бурденко (акт внедрения №62 от 17.04.12 г.); методика изолирования 4-нитроанилина и нимесулида из крови, плазмы крови и определения методами ТСХ и УФспектрофотометрией внедрена в учебную и научную работу кафедры фармацевтической химии и фармацевтической технологии Воронежской государственной медицинской академии им. Н.Н. Бурденко (акт внедрения № от 17.04.12 г.); методика концентрирования и выделения в чистом виде нимесулида и 4-нитро-2-феноксианилина из растворов методом колоночной хроматографии низкого давления внедрена в учебную и научную работу кафедры биологической и химической технологии Курского государственного медицинского университета (акт внедрения №48 от 25.05.12 г.); методика концентрирования и количественного определения нимесулида и 4-нитро-2феноксианилина методом хроматоспектрофотометрии внедрена в учебную и научную работу кафедры биологической и химической технологии Курского государственного медицинского университета (акт внедрения №49 от 25.05. г.); методика изолирования нимесулида, 4-нитроанилина и 4-нитро-2феноксианилина из ткани печени и определения методами ТСХ и УФспектрофотометрией апробирована в экспертно-криминалистическом центре УМВД по Орловской области (акт апробации №3 от 01.06.12 г.); методика изолирования нимесулида, 4-нитроанилина и 4-нитро-2-феноксианилина из мочи и определения методами ТСХ и УФ-спектрофотометрией апробирована в экспертно-криминалистическом центре УМВД по Орловской области (акт апробации №4 от 01.06.12 г.).

Методология и методы исследования. Методологической составляющей диссертационного исследования стали фармакопейные статьи предприятия, а также труды отечественных ученых [В.К. Шорманова, 2004; А.С. Зайцевой, 2012].

В диссертационной работе использованы химические (титриметрия), физико-химические (ядерно-магнитный резонанс Н, спектрофотометрия, высокоэффективная жидкостная хроматография и газовая хроматография, жидкостная колоночная хроматография низкого давления, жидкость-жидкостная экстракция).

Основные положения, выносимые на защиту:

условия синтеза из нимесулида 4-Н-2-ФА, 4-А-2-ФФМСА, 4-МСА-3-ФФА, 4-Г-2-ФФМСА и особенности очистки указанных соединений;

особенности поглощения анализируемыми веществами электромагнитного излучения в УФ-, видимой, ИК-областях спектра и резонансного поглощения радиочастотной электромагнитной энергии (ЯМР 1Н);

результаты исследования хроматографического поведения рассматриваемых соединений в тонких слоях и колонках сорбентов с гидроксилированной и привитой поверхностями;

методики идентификации и количественного определения рассматриваемых веществ методами хроматографии, фотометрии и хромато-массспектрометрии;

результаты исследования особенностей очистки исследуемых веществ методами жидкость-жидкостной экстракции и хроматографии;

методики изолирования объектов исследования из тканей органов и соэкстрактивных веществ биоматериала;

распределение анализируемых соединений в организме теплокровных животных и сохраняемость исследуемых соединений в трупном материале.

Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность полученных результатов обусловлена использованием современных и высокотехнологичных методов исследования. Значительный объем проведенных исследований отражен в виде таблиц, графиков и рисунков. Достоверность разработанных методик количественного определения изучаемых веществ подтверждается путем их валидации и статистической обработки по требованиям ГФ XI с использованием пакета прикладных программ «Microsoft Excel 2013».

Основные положения работы представлены и доложены на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Традиции и инновации фармацевтической науки и практики» (Курск, 2011 г.), на Итоговых научных конференциях сотрудников КГМУ «Университетская наука: Взгляд в будущее» (Курск, 2011 г., 2013 г.), на IV, V и VI Всероссийских научнопрактических конференциях с международным участием: «Биомедицинская инженерия и биотехнология» (Курск, 2011 г., 2012 г., 2013 г.), на Четвертой международной дистанционной научной конференции «Инновации в медицине»

(Курск, 2011 г.), на Всероссийской научно-практической интернет-конференции с международным участием «Современные аспекты разработки и совершенствования состава и технологии лекарственных форм» (Курск, 2011 г.), на XVIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2011 г.), на Научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы судебно-медицинской экспертизы» (Москва, 2012 г.), на 77-ой Всероссийской научной конференции с международным участием «Молодежная наука и современность» (Курск, 2012 г.), на V Международной научно-методической конференции «Пути и формы совершенствования фармацевтического образования. Создание новых физиологически активных веществ» (Воронеж, 2013 г.), на IX Всероссийской конференции «Химия и медицина» с Молодежной научной школой (Уфа-Абзаково, 2013 г.).

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена по плану научно-исследовательских работ кафедры фармацевтической, токсикологической и аналитической химии Курского государственного медицинского университета и соответствует проблеме «Фармация» межведомственного научного совета № 36 РАМН и научной проблеме 35.04 «Научные проблемы судебно-медицинской токсикологии, токсикологической и судебной химии» по специальности «Судебная медицина» при РАМН. Номер госрегистрации 01201157804.

Публикации. Содержание работы отражено в 36 публикациях, 6 из них в журналах, рекомендуемых ВАК к опубликованию материалов диссертационных исследований. Имеется 1 положительное решение о выдаче патента.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), экспериментальной части (главы 2, 3, 4, 5 и 6), выводов, списка литературы, приложения, изложенного на 154 страницах.

Диссертационная работа изложена на 144 страницах машинописного текста, содержит 21 таблицу и 17 рисунков. Библиографический список состоит из источников, в том числе 151 – на иностранном языке.

Благодарности. Автор приносит отдельные благодарности Филипповой О.Э. за предоставление фармакопейного образца основного объекта исследования (нимесулида) и Безъязычной А.А. за ценные рекомендации при обработке экспериментальных результатов.

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Получение и применение отдельных производных 4-нитроанилина полупродуктов синтеза красителей, взрывчатых веществ и некоторых биологически активных соединений [41, 78, 79, 234].

4-нитроанилин входит в состав молекул некоторых лекарственных средств, а также является исходным продуктом синтеза [13, 73].

Первый способ получения 4-нитроанилина основан на ацетилировании анилина уксусным ангидридом и нитровании смесью азотной и серной кислот.

На следующей стадии синтеза проводят дезацетилирование. Вторым способом нитруют хлорбензол азотной кислотой и замещают атом хлора на аминогруппу аммиаком в среде этанола. В обоих случаях присутствует побочный продукт 2нитроанилин, который отделяют кристаллизацией [70].

химической структуре является производным 4-нитроанилина. Нимесулид обладает противовоспалительной, жаропонижающей, и ярко выраженной анальгетической активностью [2, 56, 93, 94].

Применяется при лечении гипертермий, различных форм артритов, остеоартрозов и болей различного генеза [6, 7, 57, 83, 178].

Имеются данные о применении нимесулида в виде натриевой соли или комплексов с аргинином, лизином и циклодекстринами [64, 228, 235].

Отмечается наличие нейропротективной и антиоксидантной активности нимесулида у теплокровных животных и человека [108, 134, 143, 180, 198].

Антиоксидантной активностью обладают и его метаболиты [135, 159].

Сообщается о противоопухолевой активности нимесулида в отношении некоторых штаммов раковых клеток [140, 184, 232].

В США зарегистрирован патент о лечении нимесулидом катаракты глаза человека [197].

Нимесулид синтезировал в 1972 году доктор George G. I. Moore. Как лекарственное средство, его реализуют в Италии с 1985 года [43, 196, 213].

Самый первый способ синтеза нимесулида был основан на нитровании 2феноксиметансульфонанилида азотной кислотой [196].

В 2005 году A. Prasad, M. L. Sharma, S. Kanwar, et al. [98] предложили современный метод синтеза нимесулида из 2-хлорнитробензола.

Из нимесулида описано получение 4-нитро-2-феноксианилина [167].

В доступной литературе имеются данные о получении активных метаболитов нимесулида путем восстановления ароматической нитрогруппы (4А-2-ФФМСА) и ее ацетилирования (4-МСА-3-ФФА). 4-А-2-ФФМСА получают из нимесулида восстановлением ароматической нитрогруппы в солянокислой среде водородом. Первый вариант синтеза 4-А-2-ФФМСА основан на взаимодействии нимесулида и железа с хлороводородной кислотой в присутствии дихлорметана и метанола. Выход продукта 19,5% [102].

Второй синтез основан на восстановлении нимесулида, оловом в хлороводородной кислоте. Синтез идет с количественным выходом [120].

Т.И. Давиденко, И.И. Котляр, Г.И. Бондаренко и др. [16] проводят восстановление производных 4-нитроанилина E. Сoli, на твердых носителях.

Ацетилирование 4-А-2-ФФМСА предложено в 2007 году хлорангидридом уксусной кислоты в присутствии триэтиламина. Выход продукта – 81% [120].

4-А-2-ФФМСА и 4-МСА-3-ФФА являются метаболитами нимесулида у теплокровных животных и человека. 4-А-2-ФФМСА впервые был обнаружен в крови лошадей в 1997 году и в крови крыс в 2000 году. 4-А-2-ФФМСА и 4МСА-3-ФФА найдены в плазме крови человека в 2007 году [102, 131, 141].

1.2 Физические свойства и установление химической структуры объектов 4-нитроанилин (синонимы – пара-нитроанилин, 1-амино-4-нитробензол) – ярко-желтый порошок. Структура 4-нитроанилина изображена в соответствии с рисунком 1. Брутто-формула С6H6N2O2. Молекулярная масса – 138,12 а.е.м.

Температура плавления – 146-149 С. Растворим в горячей воде [54, 170, 187].

4-нитро-2-феноксианилин (синоним – примесь D к нимесулиду) – желтозеленый порошок без запаха. Брутто-формула С12H10N2O3. Температура плавления – 114-116 С. Молекулярная масса – 230,22 а.е.м. Структура 4-нитрофеноксианилина изображена в соответствии с рисунком 2. 4-нитро-2феноксианилин хорошо растворим в ацетоне, ацетонитриле, диметилформамиде.

Растворим в кислотах и щелочах. Плохо растворим в воде [187].

Рисунок 1 – 4-нитроанилин Рисунок 2 – 4-нитро-2-феноксианилин Нимесулид (синонимы – 4-нитро-2-феноксифенилметансульфонанилид, флоговиталь, месулид, аулин, R-805) – желтоватый порошок без запаха. Бруттоформула С13H12N2O5S. Молекулярная масса – 308,31 а.е.м. Температура плавления 148-149 С, свойственен полиморфизм в соответствии с рисунком [98, 120, 185, 187].

4-А-2-ФФМСА 4-амино-2-феноксифенилметансульфоанилид, восстановленный нимесулид) – бесцветные игольчатые кристаллы, или белый с сероватым оттенком порошок. Брутто-формула С13H14N2O3S.

Молекулярная масса – 278,33 а.е.м. Температура плавления 161-162,5 С в соответствии с рисунком 4. Хорошо растворим в хлороводородной кислоте. При хранении возможно окисление на свету [87, 116, 146, 183].

4-МСА-3-ФФА N-(4-метансульфониламино-3-феноксифенил)-ацетамид) – белый или белый с телесным оттенком порошок. Бруттоформула С15H16N2O4S. Молекулярная масса – 320,36 а.е.м. Температура плавления 106 С в соответствии с рисунком 5. Растворим в ацетоне [120, 131].

4-Г-2-ФФМСА (синонимы – 4-гидрокси-2-феноксифенилметансульфоанилид) – белый с кремоватым оттенком порошок. Брутто-формула С13H13NO4S.

Молекулярная масса – 279,31 а.е.м. Температура плавления 153-156 С в соответствии с рисунком 6. Хорошо растворим в этаноле, ацетоне, ДМФА и растворах щелочей, плохо – в воде. Возможно окисление на свету [62, 86].

Для установления структуры применяют ядерный магнитный резонанс 1Н, инфракрасную спектроскопию, масс-спектроскопию [36, 37].

Рисунок 3 – Нимесулид Рисунок 5 – 4-МСА-3-ФФА ЯМР Н использовали для установления структуры производных 4нитроанилина и 4-нитро-2-феноксифенилметансульфонанилида. Средой для анализа явился дейтерированный диметилсульфоксид или дейтерированный хлороформ, а внутренним стандартом – тетраметилсилан [45, 59, 120, 201].

ИК-спектроскопию использовали в качестве дополнительного метода, подтверждающего структуру веществ – производных 4-нитроанилина и 4-нитрофеноксифенилметансульфонанилида [36, 59, 137].

Масс-спектроскопию применяли для установления массы исследуемого вещества и косвенно подтверждали химический состав [201].

1.3 Метаболизм и токсикологическая характеристика Ароматические соединения с нитро-, амино- и сульфо- группами токсичны для теплокровных животных и человека [3, 11, 32, 53, 68].

Для данных веществ характерны токсические изменения в печени, крови, почках теплокровных животных и человека [26, 56, 60, 81, 103].

При их попадании в кровь происходит образование метгемоглобина, сульфогемоглобина и нитрозогемоглобина. В результате наступает кислородное голодание клеток и тканей организма [3, 10, 26, 44, 229].

Угнетаются функции центральной нервной системы, наблюдаются апатия, вялость, заторможенность, снижение условных рефлексов. Они являются гепатотоксичными, ингибируя в печени ферменты цитохрома P450 и ферменты, содержащие –SH группы. [8, 27, 75, 80, 116].

Имеются данные о мутагенных и канцерогенных свойствах некоторых аминопроизводных бензола [20, 231].

Для нитро- и амино- соединений ароматического ряда характерен общий ход метаболизма в печени теплокровных. Образуются продукты восстановления и гидроксилирования. Затем, данные продукты подвергаются ацетилированию по аминогруппе и глюкуронированию по гидроксигруппе. Восстановление ароматической нитрогруппы основано на взаимодействии с НАДФНхиноноксиредуктазой. В некоторых случаях возможно окисление ароматической аминогруппы [22, 79,141, 215, 231].

При длительном (хроническом) воздействии ароматических нитро- и аминопроизводных возможны дискинезии желчевыводящих путей, вегетососудистые нарушения, уробилинурия и тромбоцитопения [48, 49].

В.Д. Тонкопий [75] рекомендует при этом в качестве антидотов цистамин, унитиол или глютаминовую кислоту.

Нитроанилины являются метгемоглобинобразующими ядами, угнетая окислительно-восстановительные процессы, они снижают уровень – SH-групп сыворотки крови. Токсические эффекты являются результатом ингибирования электронно-транспортной цепи и разобщения окислительного фосфорилирования. В высоких концентрациях (более 0,05 мг/мл) нитроанилины обладают мутагенным, гонадотоксическим и эмбриотоксическим эффектами [8, 55, 203].

4-нитроанилин самый токсичный из мононитроанилинов. LD50 для крыс при внутрижелудочном введении составляет от 750 мг/кг до 1410 мг/кг. По другим данным LD100 для крыс составляет от 600 мг/кг. Для мышей LD50 при внутрижелудочном введении от 940 мг/кг [9, 54].

Отмечены острые и хронические отравления людей 4-нитроанилином.

Смертельное отравление произошло осенью 2005 года в Берлине [170].

Н.М. Василенко, В.И. Звездай, Ф.А. Колодуб [9] сообщают о способности метгемоглобинобразования (до 67%) и сульфогемоглобинобразования (до 4,79%) у крыс после введения 4-НА.

ароматического кольца во втором положении относительно аминогруппы, восстановлению нитрогруппы и ацетилированию аминогруппы. Наиболее токсичным метаболитом является 1,4-фенилендиамин. После летального отравления у человека в венозной крови были обнаружены 4-нитроанилин (4, мкг/мл) и его метаболиты: 1,4-фенилендиамин (0,33 мкг/мл), 4-аминоацетанилид (0,25 мкг/мл), 2-гидрокси-4-нитроанилин (1,5 мкг/мл) и 4-нитроацетанилид (0, мкг/мл). Уровень метгемоглобина составил 36,8%.

затрудненное дыхание, атаксия, рвота, аритмия, и остановка сердца [155].

Нимесулид – нестероидное противовоспалительное средство, производное 4-нитроанилина, широко применяемое в ревматологии [43, 63].

Механизм его действия основан на селективном ингибировании циклооксигеназы-2, фермента участвующего в синтезе медиаторов воспаления – простагландинов Н и Е2. Нимесулид подавляет высвобождение фактора некроза опухоли, вследствие чего снижается образование провоспалительных факторов – цитокинов и подавляет синтез интерлейкина-6 и урокиназы, препятствуя разрушению хрящевой ткани [7, 14].

При приеме внутрь в терапевтических дозах (100-200 мг) нимесулид быстро и полностью всасывается в желудке и тонком кишечнике. В крови он циркулирует вместе с метаболитом 4'-гидроксинимесулидом. Связь нимесулида с альбуминами плазмы крови составляет 95%, с эритроцитами – 2%, с липопротеинами – 1%, с кислыми 1-гликопротеидами – 1%. В неизменном виде выводится с мочой и калом, в виде метаболитов – с мочой [15, 31, 114, 115, 213] В организме лошадей в печени возможно восстановление ароматической нитрогруппы нимесулида [102].

При введении нимесулида в организм мышей, в гепатоцитах вначале образуется восстановленная форма, затем дииминохинонная [165].

В печени крыс возможно гидроксилирование, восстановление и ферментами цитохрома Р 450. В отличие от мышей, у крыс окисления 4-А-2ФФМСА в дииминохинон не выявлено [120, 128, 144].

Наиболее полно метаболизм нимесулида изучен у человека. В печени, возможно присутствие метаболитов, характерных для теплокровных животных (мыши, крысы, лошади). Пути метаболизма нимесулида у человека:

гидроксилирование монозамещенного бензольного кольца в положении 4', восстановление нитрогруппы и ее ацетилирование, или окисление до дииминохинона [87, 128, 146, 147, 166].

При применении нимесулида в качестве лекарственного средства у теплокровных животных и человека возможно наличие нежелательных токсических реакций со стороны печени, почек и желудочно-кишечного тракта [40, 105, 142, 153, 183].

Выделяют несколько ключевых патогенетических механизмов развития гепатопатий на фоне приема нимесулида [58, 174]. К ним относятся:

• блокада ферментов цикла Кребса, ингибирование электронно-транспортной цепи, и разобщение окислительного фосфорилирования;

• нарушение функции гепатоцитов из-за их гипоксии;

• блокада фосфодиэстераз IV типа;

• накопление продуктов перекисного окисления липидов;

• возникновение ультраструктурных изменений митохондрий, гипераммониемия, повышение уровня АСТ, АЛТ в сыворотке крови при нормальном уровне билирубина (сходство с синдромом Рейе);

• иммунные нарушения, связанные с образованием комплекса нимесулида или его метаболитов (как гаптенов) с белками гепатоцитов.

Признаки отравления нимесулидом: тошнота, диспепсия, сонливость, желтушность кожных покровов, в тяжелых случаях гепатит, печеночная или почечная недостаточность [190, 191, 193].

Нимесулид – наиболее токсичное лекарственное средство из группы нестероидных противовоспалительных средств. LD50 для крыс составляет мг/кг и 200 мг/кг, для мышей – 216 мг/кг и 392 мг/кг при внутрибрюшинном и внутрижелудочном введении соответственно. Зарегистрированы многочисленные острые и хронические отравления нимесулидом человека, в том числе и с летальным исходом [145, 173, 190, 191, 194].

Токсические эффекты возникают у лиц различных возрастных групп, и характеризуются гепато- или нефротоксичностью. Так у трехмесячной девочки при приеме 30 мг нимесулида возникла кровяная рвота [187].

W. Van Steenbergen, P. Peeters, D. De Bondt Staessen et al. [192] сообщают о шести случаях острого гепатита на фоне приема нимесулида.

По данным L. Peruzzi, B. Gianoglio, M.G. Porcellini, R. Coppo [179] при приеме нимесулида в терапевтических дозах может наступить почечная недостаточность у беременных женщин.

В 2003 году два летальных отравления детей произошли в Португалии.

гепатотоксическими эффектами. У одного из этих пациентов обнаружена почечная недостаточность. M. Bocchia, G. Bertola, D. Morganti et al. сообщают об аккумуляции лития, на фоне ниме Нимесулид токсичен для крыс, кошек и собак.

После трехкратного приема нимесулида по 100 мг в течение трех дней у котенка массой 350 г обнаружена печеночная недостаточность [186, 189].

В эксперименте на крысах массой 25-30 г введение разовой дозы нимесулида 30 мг/кг вызывало повышение уровня ферментов щелочной фосфатазы, глутаматпируваттрансаминазы и глутаматоксалоацетаттрансаминазы в сыворотке крови [154].

В связи с многочисленными случаями отравлений нимесулид запрещен во многих странах мира. В некоторых странах ограничено его применение. В ряде европейских стран его запрещено применять детям до 12 лет [150, 173, 188, 194, 219].

Нимесулид полностью запрещен к применению или реализации в Австралии, Австрии, Аргентине, Великобритании, Израиле, Ирландии, Испании, Канаде, Нигерии, Португалии, Сингапуре, США, Финляндии и некоторых других странах [163, 211].

Возможна идентификация исследуемых веществ путем измерения их температуры плавления [59, 102, 120, 187].

К химическим методам идентификации относят цветные химические реакции. В качестве реагента используют азореактивы, 2,4,6-тринитробензолсульфоновую кислоту, общеалкалоидные реактивы [33, 51, 66, 76].

Л.А. Чекрышкина, Л.И. Парфенова и Н.И. Эвич [82] предлагают реакцию конденсации ароматических аминов с 4-диметиламинобензальдегидом после восстановления ароматических нитросоединений.

диметиламином или с раствором натрия гидроксида [29, 30, 33].

Перечисленные реакции являются недостаточно селективными. К более селективным относят спектральные и хроматографические методы.

Спектрофотометрия в ультрафиолетовой области спектра используется для идентификации неокрашенных соединений в растворах. В качестве растворяющих сред для производных 4-нитроанилина и сульфонамида использовали водные растворы (кислые, щелочные) [36, 52, 164, 227].

Идентификацию ароматических аминов и производных 4-нитроанилина проводили по электронным спектрам поглощения в метаноле, этаноле, пропаноле-2, бутаноле-1, их водных растворах, бензоле, диоксане, этилацетате, хлороформе, ацетоне, ДМФА и ДМСО [1, 41, 72, 205].

S. Chandran, S. Saggar, K.P. Priya, R.N. Saha [182] предлагают используют для повышения чувствительности определения нимесулида в таблетках ацетонитрил и смесь вода-ацетонитрил (1:1).

Европейская фармакопея предлагает обнаруживать нимесулид в субстанции в ацетоне при 450 нм [187].

Фотометрируют окрашенные продукты ароматических аминосоединений и 4-нитроанилина после реакции с диазотированным анилином или с соединением, имеющим фенольный гидроксил (-нафтол или 8-гидроксихинолин-5-сульфоновая кислота). Реакцию с -нафтолом проводят в воднощелочной или этанольной среде в присутствии натрия карбоната. В последнем случае чувствительность возрастает в четыре раза. Перед азосочетанием замещенные ароматические амины подвергают гидролизу [5, 41, 118, 152, 212].

Диазотирование 4-нитроанилина в ацетилацетоне Revanasiddappa, Kiran Kumar, Mahesh Bilwa [216] проводят с нитрит-ионом.

Ароматические амины обнаруживали по реакции с 4-N,N-диметиламинобензальдегидом в растворах уксусной или серной кислот [4, 71].

После взаимодействия с гексадецилтриметиламмония бромидом нимесулид идентифицировали в хлороформном экстракте при 404 нм [230].

Нимесулид после восстановления обнаруживали с 3-метилбензотиазолинонгидразоном в присутствии железа (III) хлорида при 600 нм или с 4N,N-диметилфенилендиамином и хлорамином «Т» при 560 нм [123, 168].

нафтилэтилендиамином имеет максимум при длине волны 560 нм [122].

Идентификация по спектрам поглощения с использованием реакций, как правило, занимает значительное количество времени.

Спектрофотометрию в инфракрасной области спектра (400-4000 см-1) применяют для исследования производных 4-нитроанилина. Идентифицируют исследуемое вещество по совпадению характеристических полос поглощения со спектром стандарта [36, 58, 59, 161].

ИК-спектрофотометрию применяли в качестве подтверждающего метода для идентификации нимесулида и 4-А-2-ФФМСА [120, 147].

Наличие 4-А-2-ФФМСА у лошадей подтверждали сравнением ИКспектров стандартного вещества и извлеченного продукта из мочи [102].

спектрофотометрией в ближней ИК-области спектра (4000-10000 см-1) [129].

Предлагаемые варианты идентификации сложно адаптировать к анализу образцов из биологического материала, так как необходима дополнительная разработка схем очистки извлечений.

Для предварительной идентификации и дополнительной очистки образцов используют хроматографические методы [23, 35, 95, 151].

Ароматические амино- и нитросоединения идентифицируют методом нормальнофазовой тонкослойной хроматографии (ТСХ). В качестве сорбента используют силикагель (пластины Sorbfil®, Merck® 60 F254 или Silufol® UV-254), иногда смесь силикагель-гипс [1, 21, 33, 42, 97].

Подвижными фазами для 4-нитро-феноксианилина, ароматических нитрои аминосоединений явились системы типа гексан-ацетон (3:2), толуол-ацетонаммиак 25% (50:50:1), этилацетат-циклогексан (45:55), хлороформ-ацетон (9:1) [23, 111, 167, 199].

Нимесулид идентифицировали в подвижных фазах хлороформ-толуол (9:1), хлороформ-метанол-толуол (6:1:1,5), толуол-метанол (4:1) пластины Merck® 60 F254, толуол-этилацетат (4:1) на силикагеле марки «G», а также в подвижной фазе циклогексан-этилацетат (3:2) [97, 109, 218, 233].

M. Carini, G. Aldini, R. Stefani, et al [175] проводили обнаружение нимесулида и пяти его метаболитов в моче человека на пластинах Kieselgel®.

Анализ нимесулида в плазме крови человека проводили на пластинах Merck® 60 F254 в подвижной фазе толуол-ацетон (10:1) [210].

Идентифицировали нимесулид в биологических тканях (трупная печень) и биожидкостях (кровь, моча) методом ТСХ на пластинах Sorbfil® в подвижных фазах ацетон, хлороформ-ацетон (9:1), толуол-ацетон-этанол-аммиак 25% (5:5:1:0,2), хлороформ-этанол-аммиак 25% (20:5:1). Пластины проявляли в УФсвете или проводили детекцию реактивом Бушарда – желто-оранжевая окраска, с 10% раствором натрия гидроксидом – желто-лимонная, с сульфатом ртути – белая, при последующем проявлении хлороформным раствором дифенилкарбазона наблюдалась розово – голубая окраска [29, 33].

В качестве подвижных фаз для разделения и идентификации нимесулида и близких по структуре соединений в обращеннофазовой ВЭЖХ использовали разбавленные растворы буферных систем или электролитов в смеси с метанолом или ацетонитрилом [61, 106, 128, 206, 221].

При этом использовали фотометрические, диодно-матричные, массселективные и вольтамперометрические детекторы. Идентифицировали по времени удерживания [126, 151, 157, 208].

A. Bakdash, M. Ganswindt, S. Herre, et al. [170] обнаруживали 4нитроанилин при 225 нм в почках, печени, мозге, желудочном содержимом и крови человека после летального отравления, используя ВЭЖХ.

С помощью ВЭЖХ обнаруживали нимесулид и производные 4нитроанилина при их совместном присутствии [113, 155, 158, 214, 239].

4-нитро-2-феноксианилин исследован методом ОФ-ВЭЖХ на сорбентах с привитыми алкильными радикалами (С 18). Подвижные фазы: метанол-водный раствор натрия дигидрофосфата с рН 4,0 (60:40), метанол-водный раствор калия дигидрофосфата с рН 7,0 (11:9), ацетонитрил-аммонийный буфер с рН 7, (35:65), ацетонитрил-водный раствор аммония дигидрофосфата с рН 7,0 (35:65) и ацетонитрил-триэтиламин-вода (45:0,5:54,5) с муравьиной кислотой до рН 5, [167, 177, 195, 223, 238].

Для идентификации нимесулида и близких структур методом ВЭЖХ применяли монолитные обращенно-фазовые колонки с силикагелем марок «FastGradient» и «Chromolith» различной длины (50 и 100 мм) [144, 237, 245].

Лекарственные средства 4-нитроанилиновой структуры и их метаболиты идентифицировали методом ВЭЖХ после пробоподготовки в волосах, слюне, плазме, крови и моче человека [124, 139, 217, 220, 236].

E.N.M. Ho, D.K.K. Leung, T.S.M. Wan, N.H. Yu [125] обнаруживали нимесулид в моче лошадей методом ВЭЖХ с масс-селективной детекцией.

Нимесулид обнаруживали с помощью ОФ-ВЭЖХ в биожидкостях кролика УФ-детекцией при 300 нм, подвижная фаза – ацетонитрил с 1% водным раствором триэтиламина с ортофосфорной кислотой до рН 3,2 [174].

M.C. Carrasco-Portugal, V. Granados-Soto, G.A. Camacho-Vieyra, et al. [100] анализировали нимесулид в плазме крови крыс методом ВЭЖХ.

Идентификацию нимесулида и его метаболитов в моче и плазме крови человека проводили на обращеннофазовом силикагеле [33, 101, 104, 194, 211].

Анализировали нимесулид в сыворотке и плазме крови человека УФдетекцией при длинах волн 230 и 240 нм [117, 149, 160, 166, 207].

В сыворотке и плазме крови человека диодно-матричной детекцией обнаруживали нимесулид и его метаболиты при 230 и 300 нм [112, 131, 133].

Идентифицировали лекарственные средства, производные 4-нитроанилина в плазме крови и моче человека по временам удерживания с использованием газохроматографических капиллярных колонок марок HP-5 и RTX-200, газыносители – азот и гелий соответственно [130, 171, 245].

А.М. Доброриз [29] обнаруживал нимесулид в трупной печени, крови и моче человека методом газовой хроматографии (время удерживания 14 мин сек). Газ-носитель – азот, колонка CP Sil 5CB (30м х 0,25мм х 250мкм).

Обнаружение 4-А-2-ФФМСА в моче лошадей P. Sarkar, J.M. McIntosh, R.

Leavitt, H. Gouthro [102] проводили на газовом хроматографе Hewlett Packard 5890 GC с масс-селективным детектором 5970A, колонка марки DB XLB- (30м х 0,32мм х 250 мкм). 4-А-2-ФФМСА идентифицировали по ионам массспектра (m/z 278 и 199) и времени удерживанию (12,748 мин).

A. Bakdash, M. Ganswindt, S. Herre, et al. [170] исследовали ткани и биожидкости человека после летального отравления 4-нитроанилином.

Обнаружение проводили методом газовой хроматографии после переведения 4нитроанилина и его метаболитов в трифторацетаты. Условия анализа: колонка HP-5MS, масс-селективный детектор. 4-нитроанилин-трифторацетат имел массионы c m/z 234, 205 и 165. Нативный 4-нитроанилин обнаруживали по массионам с m/z 138, 65 и 108 в базе данных Wiley.

Для идентификации ароматических амино- и нитросоединений в воздухе использовали неподвижные фазы Chromatone N-AW-DMCS 5% SE-30 (газноситель – гелий), Chromatone-Super 3% OV-1 (газ-носитель – азот), для идентификации в воде ароматических аминов использовали Chromatone N-AWDMCS 5% Carbowax-M c 2% по массе гидроксида калия в растворе (газ-носитель – гелий). Длина колонок – 2м, внутренний диаметр – 3мм, детектор – пламенноионизационный [17, 18, 28].

Анализ лекарственных средств, производных 4-нитроанилина проводили на газовом хроматографе с пламенно-ионизационным детектором на стеклянной колонке длиной 3 м с неподвижной фазой Chromatone N-AW-DMCS 3% OV-17, подвижная фаза – гелий [35].

Обнаруживали лекарственные средства, производные 4-нитроанилина методом газо-жидкостной хроматографии на сорбенте Gas-Chrom Q 3% OV-17.

При анализе в образцах мочи крыс и кроликов использовали пламенноионизационный детектор и газ-носитель – аргон, при анализе плазмы крови человека – детектор электронного захвата и газ-носитель – азот [23, 127].

Идентификацию нимесулида газо-жидкостной хроматографией с фотоионизационной детекцией проводили на металлической колонке длиной 3м с неподвижной фазой ChromoSorb WAW 10% SE-30 с размером частиц 150- мкм и подвижной фазой – азотом [96].

В целом, сложность использования хроматографических методов объясняется длительным подбором условий хроматографирования.

Для лекарственных средств, производных 4-нитроанилина описана возможность применения вариантов ЯМР 1Н и 13С [37, 45]. В образце конской мочи в 1997 году после приема нимесулида методом ЯМР 1Н P. Sarkar, J.M.

Растворяющая среда – дейтерированный хлороформ.

В 2009 году F. Li, M.D. Chordia, T. Huang, T.L. Macdonald [161] идентифицировали 4-А-2-ФФМСА методами ЯМР 1Н и принимавшего нимесулид. ЯМР метод довольно перспективен, однако применяется редко из-за дорогостоящего оборудования.

Классическим количественным химическим методом является титрование.

Титровали ароматические амины раствором йода в соляной кислоте в йодиде калия. Избыток оттитровывали натрия тиосульфатом [19].

Титрование лекарственного средства, производного 4-нитроанилина (нитразепам) по фармакопейной статье проводят кислотой хлорной в среде уксусного ангидрида. Индикатор – кристаллический фиолетовый [59].

Европейская фармакопея предлагает титриметрическое определение нимесулида в субстанции раствором натрия гидроксида в водно-ацетоновой среде. Конечную точку титрования определяют потенциометрически [187].

I.C. Constantinescu, M. Florea, C.-C. Aram, et al. [110] титровали нимесулид тетрадецилтриметиламмония бромидом (цетримидом).

Титрование сложно адаптировать к образцам биоматериала.

Возможно определение ароматических амино- и нитросоединений фотометрическими методами [24, 42, 52, 69, 243].

Определение ароматических аминосоединений проводили в средах этилацетата, диметилформамида, диметилсульфоксида, бутанола-1 и воды, в УФ-области спектра. Интервал концентраций определения в этилацетате составил от 0,6 до 100 мкг/мл. Ароматические амины в воздухе определяли на спектрофотометре в среде этанола, используя метод Фирордта Описаны фотометрические методики определения ароматических аминов в воздухе после реакции конденсации с 4-N,N-диметиламинобензальдегидом (от 0,04 мкг/мл) и азосочетания с -нафтолом (от 0,15 мкг/мл) [4, 5, 41, 71, 72].

4-нитроанилин в воздухе определяли диазотированием и азосочетанием с дихлоранилином или с -нафтолом в растворе натрия гидроксида и с -нафтолом в среде этанола в присутствии натрия карбоната. Предел обнаружения с нафтолом в среде натрия гидроксида – 1 мкг/мл, с -нафтолом в среде этанола – 0,25 мкг/мл и с дихлоранилином – 0,5 мкг/мл [5].

Лекарственные средства, производные 4-нитроанилина определяли в печени, крови и моче человека производной спектрофотометрией. Определение в трупной печени проводили флюоресцентно-поляризационным иммуноанализом. Предел обнаружения – 0,5 мкг в 100 г печени [12, 84, 136].

Нимесулид определяли спектрофотометрически в УФ-области спектра. В средах метанол-фосфатный буфер с рН 7,4 в соотношении 9:1 (при 396 нм), смесь ацетонитрил-натрия гидроксид 2н. в соотношении 1:1 (при 399 нм, предел определения 5 мкг/мл), смесь ацетонитрил-вода в соотношении 1:1 (при 300 нм, предел обнаружения 0,46 мкг/мл), водный раствор натрия гидроксида (при нм, предел обнаружения 1 мкг/мл) и ацетонитрил (при 300 нм, предел обнаружения 1,04 мкг/мл [58, 99, 182, 227].

Определяют нимесулид восстановлением цинком в соляной кислоте и диазотированием натрия нитритом. Затем проводят азосочетание с крезоловым фиолетовым, 4-N,N-диметилфенилендиамина дигидрохлоридом и хлорамином «Т», 3-метилбензотиазолинон гидразона гидрохлоридом и железа (III) хлорида, M. Florea, C.-M. Monciu, A.M. Laura, B.L. Gabriela [230] определяли нимесулид экстракционной фотометрией. При 404 нм измеряли оптическую плотность хлороформного слоя, содержащего продукт взаимодействия с гексадецилтриметиламмония бромидом в щелочной среде. Предел определения составил 0,137 мкг/мл, предел обнаружения – 0,045 мкг/мл.

R.K. Prasad, R. Sharma [205] определяли нимесулид производной спектрофотометрией при 331,5 нм в метаноле. Предел определения составил 0,190 мкг/мл, предел обнаружения – 0,063 мкг/мл.

Определение нимесулида проводили после последовательного восстановления, диазотирования, и сочетания с N-(1-нафтил)-этилендиамина дигидрохлоридом, измеряя флюоресценцию при 427 нм. Определение концентраций проводили в интервале 0,55-2,75 мкг/мл [169].

Возможно определение нимесулида ИК-спектрофотометрией в ближней области спектра (4000-10000 см-1). Относительная ошибка 4% [129].

А.М. Доброриз проводил определение нимесулида в ткани трупной печени, крови и моче человека при 392 нм в среде натрия гидроксида.

Определение возможно в интервале концентраций 2-25 мкг/мл [29].

Предлагаемые варианты фотометрического определения сложно адаптировать к анализу образцов из биологического материала, так как необходима дополнительная очистка извлечений.

Одним из простейших хроматографических методов определения производных 4-нитроанилина является денситометрический анализ [111].

Денситометрическое определение нимесулида проводили в метаноле при аналитических длинах волн 270, 295, 300 и 324 нм. Предел обнаружения нимесулида при длине волны 324 нм составил 0,26 мкг/мл [97, 109, 200, 218].

B. Miljkovic, B. Brzakovic, I. Kovacevic, et al. [210] денситометрически определяли нимесулид в плазме крови человека при длине волны 310 нм.

Чувствительность методики составила 0,1 мкг/мл.

В настоящее время наиболее популярным методом количественного определения является обращеннофазовый вариант высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ) [155, 187, 233].

Содержание производных 4-нитроанилина устанавливали методом ВЭЖХ при 254 нм. Интервал определения – от 25 до 51 мкг/мл [106, 148, 157, 172, 221].

Лекарственные средства, производные 4-нитроанилина определяли методом ОФ-ВЭЖХ в моче и слюне человека, используя масс-селективный детектор. Предел определения в моче – 1,2 нг/мл, в слюне – 0,1нг/мл [124].

Некоторые лекарственные средства, производные 4-нитроанилина определяли в плазме крови человека методом ВЭЖХ при 230 и 313 нм. Во втором случае предел обнаружения составил 4 нг/мл [127, 236].

Определение лекарственных средств, производных 4-нитроанилина в крови человека проводили с использованием масс-селективной и диодноматричной детекции. Предел обнаружения от 1 до 8 нг/мл [139, 151, 217].

Методом ОФ-ВЭЖХ с масс-селективным детектированием проводили определение содержания соединений 4-нитроанилиновой структуры в волосах человека после предварительной пробоподготовки [128, 220].

Посмертное определение 4-нитроанилина в почках, печени, желудке человека проводили с использованием ОФ-ВЭЖХ [61, 170].

Определение 4-нитро-2-феноксианилина проводили методом ОФ-ВЭЖХ, используя УФ-детекцию при длинах волн 230, 245 и 254 нм. Предел обнаружения 4-нитро-2-феноксианилина при длине волны 245 нм составил нг/мл, при длине волны 230 нм – 2,6 нг/мл [167, 177, 223, 244].

Содержание нимесулида методом ОФ-ВЭЖХ в лекарственных препаратах проводили при 210, 215, 230 и 254 нм [58, 147, 155, 195, 233].

S.S. Zarapkar, N.P. Bhandari, U.P. Halkar [245] определяли нимесулид в лекарственных препаратах методом ВЭЖХ с использованием раствора фосфорной кислоты рН 3,5 – ацетонитрил (2:3) при 240 нм. Относительная ошибка при этом составила 4%, а предел обнаружения – 300 нг/мл.

Содержание нимесулида в лекарственных формах проводили методом ВЭЖХ при 239 и 276 нм. Предел обнаружения – 26,56 и 50 нг/мл [113, 204].

A. Panusa, G. Multari, G. Incarnato, L. Gagliardi [156] количественно определяли нимесулид методом ОФ-ВЭЖХ с масс-спектрометрической детекцией. Предел обнаружения составил 0,18 нг/мл.

Применение монолитных колонок с силикагелем в экспресс-анализе ВЭЖХ нимесулида сокращает время анализа до нескольких секунд [144].

обращеннофазовые колонки (Chromolith®, Merck) длиной 50 мм и внутренним диаметром 4,6 мм. Время удерживания нимесулида – 60 сек.

Для определения нимесулида A. Alvarez-Lueje, P. Vasquez, L.J. NunezVergara, J.A. Squella [158] использовали обращеннофазовый вариант ВЭЖХ с электрохимической детекцией в пульсовом режиме при 1200 мВ.

теплокровных животных и человека. Нимесулид определяли ОФ-ВЭЖХ в биожидкостях кролика при 300 нм в элюенте содержащем 1% триэтиламина, раствор ортофосфорной кислоты с рН 3,2 и ацетонитрил. Предел обнаружения – 50 нг/мл. Время удерживания – 4,5 мин [100, 117, 125, 174].

D. Castoldi, V. Monzani, O. Tofanetti [119] определяли нимесулид и 4'гидроксинимесулид в моче и плазме крови человека методом ОФ-ВЭЖХ при 240 нм. Подвижная фаза – фосфатный буфер с рН 5,0 – метанол (1:1).

Относительная ошибка – 4%, предел обнаружения соединений по 50 нг/мл.

M. Carini, G. Aldini, R. Stefani, et al. [175] определяли нимесулид и его метаболиты в моче человека при 230 нм в градиентном режиме смесью ацетонитрил – фосфатный буфер с рН 3,0. Предел обнаружения – 10 нг/мл.

Методом ОФ-ВЭЖХ после пробоподготовки в сыворотке и плазме крови человека определяли нимесулид при 230 нм. Предел обнаружения в плазме крови составил от 30 нг/мл [101, 112, 133, 149, 207].

Нимесулид количественно определяли в плазме крови человека и крыс при детектирующих длинах волн 235 и 240 нм соответственно [160, 226].

P. Ptacek, J. Macek, J. Klima [207] определяли нимесулид методом ВЭЖХ в плазме крови человека при 404 нм. Предел обнаружения 80 нг/мл.

I. Sora, T. Galaon, V. David, A. Medvedovici [131] определяли нимесулид и 4'-гидроксинимесулид в плазме крови человека используя диодно-матричную детекцию при 300 нм. Пределы обнаружения нимесулида и 4'гидроксинимесулида – 19,3 и 12,3 нг/мл соответственно.

Нимесулид в плазме крови человека определяли ОФ-ВЭЖХ с массспектрометрической детекцией. Предел определения составил 10 нг/мл [209].

Н. А. Заздравных, И. В. Стаценко, Л. Г. Воронкова [33] определяли нимесулид в трупной печени, используя длины волн 210, 220, 230, 240, 250, 260, 280 и 300 нм. Открываемый минимум – 400 нг в 1 г печени.

Методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором определяли ароматические амины в воздухе и воде после получения их метилированных производных. Предел обнаружения – 16,6 нг/г [17, 18, 28, 107].

Нимесулид методом газовой хроматографии определяли в лекарственных препаратах, используя металлическую колонку длиной 3 м, и пламенноионизационный детектор. Предел обнаружения – 500 нг/мл [96].

Определяли лекарственные средства, производные 4-нитроанилина в моче крыс и человека газовой хроматографией с масс-селективным детектором.

Открываемый минимум в моче человека 2,8 нг/мл [23, 132, 171].

Лекарственные средства, производные 4-нитроанилина анализировали в моче человека переводом их в трет-бутилдиметилсилил производные. При этом повышалась чувствительность, открываемый минимум 1 нг/мл [245].

Используя газовый хроматограф с детектором электронного захвата, проводили определение лекарственных средств, производных 4-нитроанилина в плазме крови и в моче человека. Открываемый минимум в моче составил 1,7, в плазме крови 2,5–4 и 3,2 нг/мл [127, 130].

J. Hackett, A.A. Elian [151] определяли производные 4-нитроанилина в крови человека (от 1 нг/мл), используя газовый хроматограф с массселективным детектором. А.М. Доброриз [29] определял нимесулид в крови (от 50-100 нг/мл) и ткани трупной печени человека на газовом хроматографе с электронозахватным детектором.

A. Bakdash, M. Ganswindt, S. Herre, et al. [170] определяли 4-нитроанилин и его метаболиты в виде трифторацетильных производных газовой хроматографией с масс-селективной детекцией в венозной крови, тканях печени, мозга, почек, содержимом желудка человека после летального отравления 4нитроанилином. Предел обнаружения – 1 нг/мл.

Полярографический метод позволил определить ароматические амино- и нитросоединения в количестве от 7,14 мкг/мл в исследуемой пробе [39].

A. Alvarez-Lueje, P. Vasquez, L.J. Nunez-Vergara, J.A. Squella [240] определяли нимесулид полярографически. Предел обнаружения 770 мкг/мл.

Вольтамперометрическое определение нимесулида на стеклянном углеродном электроде позволяет обнаружить 9,28 нг/мл [104, 146].

Возможно определение нимесулида методом капиллярного зонного электрофореза. Предел обнаружения составляет от 6,17 мкг/мл [121, 138].

Мицеллярная электрокинетическая капиллярная хроматография позволяет обнаружить ароматические нитро- и аминосоединения в моче человека в концентрации от 1-5 мкг/мл. Нимесулид определяли, используя в качестве подвижной фазы смесь ацетонитрила, буферного раствора с рН 9,5-9,7 и некоторого количества анионного детергента натрия додецилсульфата. Предел обнаружения составил от 0,25-1,6 мкг/мл [222, 224, 225].

1.6 Изолирование, концентрирование и очистка нимесулида и близких по При изолировании ароматических аминопроизводных из биоматериала перегонкой с водяным паром может быть найдено до 73,5-93,5% токсиканта.

Однако, этот метод применим для соединений с высокой летучестью [24].

Н.Ф. Казаринова, И.С. Духовная, Л.Э. Мянник [42] изолировали производные анилина из водных объектов с использованием трехкратной экстракции дихлорметаном и трихлорметаном из сильнощелочной среды.

Разделение и очистка ароматических нитросоединений проводилась в тонком слое силикагеля в системе петролейный эфир-диэтиловый эфир-уксусная кислота ледяная (90:10:1). Слой силикагеля с веществом счищали, и элюировали исследуемое вещество диэтиловым эфиром [95].

Для очистки производных 4-нитроанилина от соэкстрактивных веществ биоматериала на колонке с силикагелем КСК-1 применялся ступенчатый режим элюирования подвижными фазами: гексан, тетрахлорметан, тетрахлорметанхлороформ (1:4), гексан-ацетон (4:1), хлороформ-ацетон (4:1) [69].

И.А. Фурсова, В.К. Шорманов [77] для очистки ароматических амино- и нитропроизводных от соэкстрактивных веществ биоматериала рекомендуют экстрагенты этилацетат и диэтиловый эфир насыщенный водой.

Изолировали лекарственные средства производные 4-нитроанилина из мочи крыс и кроликов экстракцией хлороформом, диэтиловый эфиром, дихлорметаном, дихлорэтаном, этилбензоатом, бензолом, смесью диэтилового эфира и этилацетата в соотношении 2:1 и 1:2. Заслуживает внимания изолирование ацетоном. Очистку от соэкстрактивных веществ основного характера проводили экстракцией 3н. раствором кислоты хлороводородной и хроматографированием на колонке с силикагелем КСК-1, предварительно промытой гексаном. Дополнительную очистку проводили на пластинах ТСХ.

Хроматографировали сначала в гексане, а затем в системе толуол-ацетон-25% раствор аммиака в соотношении 50:50:1 [23].

Для изолирования из мочи лекарственных средств производных 4нитроанилина и их метаболитов применяли картриджи для твердофазной экстракции марки Sep-Pak® C18. Пробу в щелочи вводили в картридж, затем элюировали смесью гексан-пропанол-2 в соотношении 9:1 [225].

Для предварительного разрушения глюкуронидов производных 4нитроанилина к моче добавляли -глюкуронидазу и 0,6 M боратный буфер с pH 9,5 и вносили в картридж Bond Elut C2. Элюировали метанолом [171].

Имеются данные об экстракции производных 4-нитроанилина из мочи с использованием твердофазной колоночной хроматографии в слое обращеннофазового силикагеля С 18. Пробы в колонке промывали смесью водаметанол (1:1) и элюировали исследуемые соединения метанолом [176].

M. Carini, G. Aldini, R. Stefani, et al. [175] предлагают две схемы изолирования для нимесулида и его несвязанных метаболитов, а также для глюкуронидов метаболитов. В случае с глюкуронидами, к образцу мочи добавляется 0.1M раствор буфера натрия ацетата с pH 4,5 и смесь глюкуронидазы и арилсульфатазы, образец выдерживается при 37 С в течение 36 часов. Образец доводят до рН 7,0 и вносят в картридж Extrelut SPE.

Элюируют смесью дихлорметан-пропанол-2 с содержанием 2,5% пропанола-2.

P. Sarkar, J.M. McIntosh, R. Leavitt, H. Gouthro [102] проводили изолирование 4-А-2-ФФМСА из мочи лошадей прибавления к 100 мл 3 г. смолы XAD-2, пробу перемешивали, отфильтровывали смолу и вносили е в колонку.

Затем промывали колонку водой и элюировали 4-А-2-ФФМСА смесью дихлорметан-этилацетат (7:3). Дополнительную очистку проводили на ТСХ, в системах дихлорметан-этилацетат (90:10) и хлороформ-метанол (92:8), элюировали исследуемые соединения диэтиловым эфиром в присутствии небольшого количества 1% раствора аммония гидроксида.

Изолировали нимесулид и 4'-гидроксинимесулид из мочи и плазмы крови человека экстракцией бензолом, толуолом, дихлорметаном или смесью диэтиловый эфир-дихлорметан (7:3). Известен вариант изолирования нимесулида толуолом из плазмы крови человека после ее подкисления 1М раствором ортофосфорной кислоты [119, 160, 166, 209, 210].

P. Ptacek, J. Macek, J. Klima [207] проводили пробоподготовку плазмы крови человека осаждением белков метанолом, с последующим прямым анализом пробы содержащей нимесулид без изолирования.

Лекарственные средства производные 4-нитроанилина изолировали из крови человека двумя способами используя картриджи для твердофазной экстракции. В первом в картридж вносили раствор образца крови в фосфатном буфере с рН 6,0. Затем промывали фосфатным буфером с рН 6,0, содержащим 5% ацетонитрила. Элюирование проводили этилацетатом. Во втором способе использовали картриджи Samplex C-18. Пробу в картридже промывали дистиллированной водой, затем раствором калия дигидрофосфата с рН 8,5.

Элюировали исследуемые вещества хлороформом [148, 151].

Изолировали лекарственные средства производные 4-нитроанилина из крови человека бутилхлоридом после подщелачивания 0,2М раствором карбонатного буфера с рН 11,5. Из мочи и плазмы крови человека – экстракцией смесью бензол-изоамиловый спирт (98,5:1,5) с карбонатным буфером до рН 10,8. Из плазмы крови изолирование проводили экстракцией хлороформом, диэтиловым эфиром или смесью толуол-дихлорметан (9:1) [127, 130, 217, 236].

После смертельного отравления человека 4-нитроанилин изолировали из крови смесью 0,1М раствора трис буфера и экстрагента этилацетат-хлороформ в соотношении 1:1 [170].

Изолирование нимесулида из крови крыс проводили экстракцией диэтиловым эфиром с 1н. раствором кислоты хлороводородной [100].

А.М. Доброриз [29] изолировал нимесулид из крови человека толуолом в присутствии 10% кислоты хлороводородной при рН 1,0. Из трупных органов – настаиванием в течение 30 минут с 1% раствором гидроксида натрия. Затем проба подкислялась кислоты хлороводородной до рН 1,0-2,0. Очистка извлечения проводилась экстракцией хлороформом. Дополнительная очистка проводилась на колонке с оксидом алюминия. Колонка промывалась хлороформом. Элюенты: этанол или 0,1н. раствор гидроксида натрия. В случае элюирования гидроксидом натрия, элюат подкислялся кислотой хлороводородной до рН 1-2 и экстрагировался толуолом. В крови было найдено 86% нимесулида, а в печени – 36%.

Некоторые лекарственные средства производные 4-нитроанилина изолировали из биоматериала непосредственно диэтиловым эфиром или диэтиловым эфиром в щелочной среде и хроматографировали на пластине с тонким слоем силикагеля, в системе гексан-ацетон (3:2) [164, 199].

Из трупного материала месячной давности лекарственные средства производные 4-нитроанилина изолировали водой с 6н. раствором хлороводородной кислоты, экстрагировали хлороформом и хроматографировали метанолом в тонком слое забуференного силикагеля 0,1М раствором калия гидросульфата, элюент – метанол [1].

Нимесулид и лекарственные средства производные 4-нитроанилина изолировали из трупного материала по методу Стаса-Отто, этанолом подкисленным щавелевой кислотой, и по методу Васильевой – водой подкисленной щавелевой кислотой. Очистку проводили экстракцией хлороформом в широком интервале рН (для нимесулида – диэтиловым эфиром из кислой среды). Очищали хлороформные извлечения в тонком слое силикагеля КСК, элюент – хлороформ-ацетон (9:1). Количество извлеченного нимесулида по методу Стаса-Отто составило 23,9%, а по методу Васильевой – 5,2% [12, 33].

Больший процент извлечения лекарственных средств производных 4нитроанилина из биоматериала (до 71,59%) наблюдается при изолировании этанолом 96% в присутствии аммония сульфата или натрия хлорида [84].

R. Wieboldt, J. Zweigenbaum, J. Henion [242] был предложен вариант изолирования производных 4-нитроанилина, основанный на иммуноафинном взаимодействии с антителами. Комплексы с антителами осаждали и фильтровали. После подкисления высвобождался изолированный токсикант.

1.7 Распределение в теплокровных организмах и сохраняемость в трупном Распределение отдельных ароматических нитросоединений было изучено на мышах, крысах, морских свинках и кроликах. Данные соединения присутствовали в головном мозге, печени, почках, легких, тимусе, поджелудочной железе, крови и желчи. Некоторые производные 4-нитроанилина обнаружены в организме человека после летального отравления. Исследуемые вещества были найдены в желудке с содержимым, печени и почках [1, 65, 241].

Исследовано распределение ароматического амина (анилина) после перорального введения в организм кролика. Вещество обнаруживалось в желудке с содержимым, кишечнике, печени и мышцах животного [24].

При пероральном отравлении крыс нитропроизводными анилина при токсиканты проникают через плацентарный барьер, присутствуют в желудке, кишечнике, почках с надпочечниками, мочевом пузыре с мочеточниками, яичках, селезенке, бедренных мышцах и жировой клетчатке [34, 55].

обнаружены у человека в венозной крови, печени, головном мозге, почках [170].

Имеются данные о распределении сульфамидов в глазах кролика. Влияние ароматических сульфопроизводных на состояние ЦНС, печени и почек указывает на нахождение данных соединений в перечисленных органах [25, 60].

Информация о распределении нимесулида в организме теплокровных в доступной литературе встречается крайне редко и носит отрывочный характер.

Имеются данные о присутствии нимесулида в печени, крови и моче человека. В моче человека возможно присутствие некоторых метаболитов нимесулида [33].

В доступной литературе отсутствуют данные о трансформации 4нитроанилина, нимесулида и его метаболитов в трупном материале в процессе хранения. Некоторые производные 4-нитроанилина способны сохраняться в трупном материале по крайней мере, в течение одного месяца [1].

Описаны особенности сохранения токсичных нитропроизводных анилина в гнилостно-разлагающемся трупном материале в зависимости от их структуры и температурного режима сохранения. Исследуемые вещества сохраняются от одной недели до двух месяцев при температурном интервале 8-36 °С [34].

На основании проведенного обзора научной литературы можно сделать заключение о том, что многие вопросы, связанные с особенностями изолирования нимесулида и близких по структуре соединений из биообъектов, очистки выделяемых веществ, их обнаружения, идентификации и количественного определения требуют дальнейшей разработки. Остаются недостаточно изучены отдельные аспекты распределения рассматриваемых веществ в теплокровных организмах и сохраняемость в трупном материале. В связи с этим было проведено химико-токсикологическое исследование 4нитроанилина, нимесулида и близких по структуре соединений.

ГЛАВА 2 ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ, МАТЕРИАЛЫ,

ОБОРУДОВАНИЕ, РЕАКТИВЫ. СИНТЕЗ РАБОЧИХ СТАНДАРТОВ И

ПОДТВЕРЖДЕНИЕ ИХ СТРУКТУРЫ

4-нитроанилин 4-нитро-2-феноксифенилметансульфонанилид (Нимесулид, субстанция), соответствует НД N 012824/03нитро-2-феноксианилин (4-Н-2-ФА) синтезированный и очищенный образец, содержание основного вещества не менее 99,9%; 4-амино-2феноксифенилметансульфоанилид (4-А-2-ФФМСА) синтезирован-ный и очищенный образец, содержание основного вещества не менее 99,9%; N-(4метансульфониламино-3-феноксифенил)-ацетамид (4-МСА-3-ФФА) синтезированный и очищенный образец, содержание основного вещества не ФФМСА) синтезированный и очищенный образец, содержание основного вещества не менее 99,9%. Нитразепам, субстанция (ФСП-0034632105).

2.1.1 Очистка и определение содержания нимесулида Очистка перекристаллизацией. Субстанцию нимесулида 12,0 г растворяют в колбе в минимальном количестве ацетона (около 120-130 мл), нагревая раствор до 36-37 °С, немедленно приливают 450-500 мл ледяной воды с мелкими кусочками льда. Смесь отфильтровывают, кристаллы нимесулида (Tпл = 148-149 °С) собирают и высушивают.

Определение содержания нимесулида в субстанции. Около 0,5 г нимесулида (точная навеска) растворяют в 50 мл диметилформамида, добавляют 4-5 капель спиртового раствора бромтимолового синего и титруют 0,1 М спиртовым раствором калия гидроксида (Кп=1,02041) до устойчивого в течение 30 секунд зеленовато-желтого окрашивания [91].

1 мл 0,1 М спиртового раствора калия гидроксида соответствует 0,030831 г нимесулида. Результаты определения представлены в таблице 1 (приложение).

2.1.2 Синтез, очистка и определение содержания 4-Н-2-ФА Синтез 4-Н-2-ФА. 200 мл 60% серной кислоты (1,68 моль) нагревают в колбе до кипения. Помещают в смесь термометр, и контролируют температуру кипения 145-155 °С. В кипящую смесь постепенно добавляют 2,156 г нимесулида (7 ммоль) до полного растворения. При повышении температуры кипения смеси выше 155 °С в нее по каплям добавляют воду. Через 2-4 минуты после растворения нимесулида нагревание прекращают и смесь в колбе охлаждают до комнатной температуры на ледяной бане. Затем рН смеси доводят до 6,5 медленно добавляя по каплям 25% раствор натрия гидроксида и постоянно охлаждая колбу на ледяной бане. Выпавший осадок отфильтровывают, многократно промывают водой на фильтре до отрицательной пробы на сульфаты (отсутствие белого осадка или опалесценции после добавления 5% раствора бария хлорида). Осадок на фильтре высушивают и фильтр аккуратно промывают ацетоном, собирая ацетоновый раствор в чашку.

Упаривают ацетон в чашке в токе воздуха до сухого остатка при комнатной температуре.

Очистка экстракцией. Остаток в чашке растворяют в минимальном количестве толуола (230-240 мл), добавляют равный объем буферного раствора с рН 8,0 и экстрагируют в течение 3-5 минут. Водную фазу отбрасывают.

Процесс экстракции повторяют с новой порцией буферного раствора.

Толуольную фазу отделяют и дважды экстрагируют равным объемом воды очищенной. Водную фазу отбрасывают, а толуол помещают в выпарительную чашку и упаривают в токе воздуха до сухого остатка при комнатной температуре. Выход 95% (1,53 г).

Очистка на колонке с силикагелем. 750 мг 4-Н-2-ФА растворяют в мл ацетона. и присыпают к раствору 8 г сорбента Silicagel L 100/250 мкм («LaChema», Чехия). В колонку внутренним диаметром 15 мм вносят 41 г того же сорбента. После полного улетучивания ацетона 8 г подготовленного сорбента переносят в колонку, уплотняют и хроматографируют, используя подвижную фазу гексан-этилацетат (7:3). Первые 15 мл элюента отбрасывают. Затем собирают 7 фракций по 5 мл. Фракции объединяют, и упаривают в токе воздуха до сухого остатка. Кристаллы очищенного 4-Н-2-ФА кристаллизуют из ацетона и собирают в склянку из темного стекла. Полученная субстанция представляет собой желто-зеленый кристаллический порошок, температура плавления 114С.

Определение содержания 4-Н-2-ФА в субстанции. Около 0,5 г 4-Н-2-ФА (точная навеска) растворяют в 50 мл 8,3% раствора кислоты хлороводородной, добавляют 200 мл воды и 1 г калия бромида. После растворения калия бромида полученную смесь охлаждают до 0-5 °С, добавляют 4-5 капель раствора тропеолина 00 и титруют 0,1 М раствором натрия нитрита (Кп=1,01291) до устойчивого в течение одной минуты желтого окрашивания. Параллельно проводят контрольный опыт.

1 мл 0,1 М раствора натрия нитрита соответствует 0,023022 г 4-Н-2-ФА.

Результаты определения представлены в таблице 2 (приложение).

2.1.3 Синтез, очистка и определение содержания 4-А-2-ФФМСА Синтез 4-А-2-ФФМСА. 15,4 г нимесулида (50 ммоль) растворяют в колбе в 55-60 мл этанола, добавляют 150 мл хлороводородной кислоты конц. (37%).

Смесь нагревают до кипения и в нее аккуратно высыпают 29,75 г (250 ммоль) мелкоизмельченного металлического олова. Присоединяют к колбе обратный холодильник. Синтез ведут 2-2,5 часа при постоянном перемешивании реакционной смеси. Реакцию считают законченной, когда нимесулид полностью растворится, а раствор приобретет розовый цвет. Затем раствор сливают с непрореагировавшего олова в колбу. Колбу помещают в кристаллизатор со льдом, охлаждают до комнатной температуры, и при постоянном охлаждении и перемешивании нейтрализуют смесь, добавляя по каплям 40% раствор натрия гидроксида, доводя рН смеси до 6,5-7. Полученный раствор трехкратно экстрагируют по 200 мл этилацетата в течение нескольких минут. Этилацетатные извлечения объединяют и упаривают в выпарительной чашке.

Очистка перекристаллизацией. Кристаллы 4-А-2-ФФМСА собирают с чашки и растворяют в колбе в минимальном количестве ацетона (около 220- мл), нагревая раствор до 36-37 °С, немедленно приливают 900-1000 мл ледяной воды с мелкими кусочками льда. Смесь отфильтровывают, кристаллы 4-А-2ФФМСА собирают и высушивают. Выход 94% (13,07 г).

Очистка на колонке с силикагелем. 800 мг 4-А-2-ФФМСА растворяют в 15 мл ацетона и присыпают к раствору 8 г сорбента Silicagel L 100/250 мкм («LaChema», Чехия). В колонку внутренним диаметром 15 мм вносят 41 г того же сорбента. После полного улетучивания ацетона 8 г подготовленного сорбента переносят в колонку, уплотняют и хроматографируют, используя подвижную фазу гексан-ацетон (1:1). Колонку оборачивают светонепроницаемой бумагой (!) во избежание окисления зоны вещества на сорбенте при попадании света.

Первые 20 мл элюента отбрасывают. Затем собирают 30 фракций по 5 мл.

Фракции объединяют, и упаривают в токе воздуха до сухого остатка. Кристаллы очищенного 4-А-2-ФФМСА кристаллизуют из ацетона и собирают в склянку из темного стекла. Полученная субстанция представлет собой бесцветные игольчатые кристаллы или белый с сероватым оттенком кристаллический порошок, способен окисляться на свету, температура плавления 164-166 °С.

Определение содержания 4-А-2-ФФМСА в субстанции. Около 0,5 г 4А-2-ФФМСА (точная навеска) растворяют в 50 мл 8,3% раствора кислоты хлороводородной, добавляют 200 мл воды и 1 г калия бромида. После растворения калия бромида полученную смесь охлаждают до 0-5 °С, добавляют 4-5 капель раствора тропеолина 00 и титруют 0,1 М раствором натрия нитрита (Кп=1,01291) до устойчивого в течение одной минуты желтого окрашивания.

Параллельно проводят контрольный опыт.

1 мл 0,1 М раствора натрия нитрита соответствует 0,027833 г 4-А-2ФФМСА. Результаты определения представлены в таблице 2 (приложение).

2.1.4 Синтез, очистка и определение содержания 4-МСА-3-ФФА Синтез 4-МСА-3-ФФА. 5,0 г 4-А-2-ФФМСА (17,96 ммоль) растворяют в 10,0 мл уксусного ангидрида (105,98 ммоль, =1,082 г/см 3) в выпарительной чашке. После полного растворения 4-А-2-ФФМСА избыток уксусного ангидрида отгоняют при температуре 25 °С в токе воздуха до сухого остатка.

Выход продукта 4-МСА-3-ФФА составил 99% (5,7 г).

Очистка на колонке с силикагелем. 800 мг 4-МСА-3-ФФА растворяют в 5 мл ацетона и присыпают к раствору 8 г сорбента Silicagel L 100/250 мкм («LaChema», Чехия). В колонку внутренним диаметром 15 мм вносят 41 г того же сорбента. После полного улетучивания ацетона 8 г подготовленного сорбента переносят в колонку, уплотняют и хроматографируют, используя подвижную фазу гексан-этилацетат (35:65). Первые 100 мл элюента отбрасывают. Затем собирают 20 фракций по 5 мл. Фракции объединяют, и упаривают в токе воздуха до сухого остатка. Кристаллы очищенного 4-МСА-3-ФФА кристаллизуют из ацетона и собирают в склянку из темного стекла. Полученная субстанция представлет собой белый или белый с телесным оттенком кристаллический порошок, температура плавления 104-106 °С.

Определение содержания 4-МСА-3-ФФА в субстанции. Около 0,5 г 4МСА-3-ФФА (точная навеска) растворяют в 50 мл 18,3% раствора кислоты хлороводородной, добавляют 10 капель концентрированной серной кислоты и кипятят с обратным холодильником в течение двух часов. Затем холодильник промывают 50 мл воды, содержимое колбы количественно переносят в сосуд для диазотирования, промывая колбу 150 мл воды и добавляют 1 г калия бромида.

После растворения калия бромида полученную смесь охлаждают до 0-5 °С, добавляют 4-5 капель раствора тропеолина 00 и титруют 0,1 М раствором натрия нитрита (Кп=1,01291) до устойчивого в течение одной минуты желтого окрашивания. Параллельно проводят контрольный опыт.

1 мл 0,1 М раствора натрия нитрита соответствует 0,032036 г 4-МСА-3ФФА. Результаты определения представлены в таблице 2 (приложение).

2.1.5 Синтез, очистка и определение содержания 4-Г-2-ФФМСА Приготовление катализатора. 9,0 г хлорида меди (I) добавляют к 18 мл 25% раствора натрия гидроксида. Полученную смесь при постоянном перемешивании кипятят в течение нескольких минут (15-25 мин) до появления желтого осадка гидроксида меди (I) и перехода его в кирпично-красный осадок оксида меди (I). Выпавший осадок отфильтровывают и промывают водой на фильтре до нейтральной реакции фильтрата на лакмусовой бумаге. Полученный оксид меди (I) на фильтре высушивают. Для приготовления катализатора 39 г сульфата меди (II) пентагидрата растворяют в 100 мл кипящей воды и добавляют к раствору полученный оксид меди (I).

Синтез 4-Г-2-ФФМСА. 16,5 г 4-А-2-ФФМСА (59,3 ммоль) растворяют в 206,25 мл 4 н. раствора серной кислоты (825 ммоль). Колбу с раствором помещают в снежную баню и охлаждают раствор до температуры 0-5 °С. К охлажденному раствору медленно добавляют 100 мл 6,16 % раствора нитрита натрия (89,19 ммоль), не превышая температуру смеси в колбе выше 5 °С. Затем выдерживают при данной температуре смесь в колбе 15 мин. Процесс диазотирования контролируют нанося каплю смеси на бумагу с конго красным (синее окрашивание) и на йодкрахмальную бумагу (сине-фиолетовое окрашивание). Образование диазосоединения контролируют нанося каплю смеси на бумагу со щелочным раствором -нафтола (красно-фиолетовое окрашивание). На следующем этапе в колбу добавляют 500 мл 50% раствора карбамида, и дополнительно добавляют в колбу еще 150 г карбамида и 150 г мелкого льда. Через 5-10 минут при слабо-фиолетовом или отсутствующем окрашивании на йодкрахмальной бумаге, смесь ко каплям медленно добаляют в кипящий раствор катализатора в колбе с широким дном. Через 3-5 минут после удаления пузырьков газа из смеси (азота) и появления голубого окрашивания смесь охлаждают до комнатной температуры и экстрагируют четырехкратно порциями этилацетата по 350 мл. Извлечения объединяют и упаривают в токе воздуха до сухого остатка. Остаток растворяют в 150 мл ацетона, фильтруют в выпарительную чашку и упаривают в токе воздуха до сухого остатка. Выход 20,4% (3,37 г).

Первая очистка на колонке с силикагелем. 1,0 г 4-Г-2-ФФМСА растворяют в 7-8 мл ацетона и присыпают к раствору 8 г сорбента Silicagel L 100/250 мкм («LaChema», Чехия). В колонку внутренним диаметром 15 мм вносят 52 г того же сорбента. После полного улетучивания ацетона 8 г подготовленного сорбента переносят в колонку, уплотняют и хроматографируют, используя подвижную фазу гексан-ацетон (1:1). Колонку оборачивают светонепроницаемой бумагой (!). Первые 25 мл элюента отбрасывают. Затем собирают 5 фракций по 5 мл. Фракции объединяют, и упаривают в токе воздуха до сухого остатка. Кристаллы очищенного 4-Г-2ФФМСА собирают.

Вторая очистка на колонке с силикагелем. 800 мг 4-Г-2-ФФМСА растворяют в 5 мл ацетона и присыпают к раствору 8 г сорбента Silicagel L 100/250 мкм («LaChema», Чехия). В колонку внутренним диаметром 15 мм вносят 41 г того же сорбента. После полного улетучивания ацетона 8 г подготовленного сорбента переносят в колонку, уплотняют и хроматографируют, используя подвижную фазу гексан-этилацетат (1:1).

Колонку оборачивают светонепроницаемой бумагой (!) во избежание окисления зоны вещества на сорбенте при попадании света. Первые 50 мл элюента отбрасывают. Затем собирают 11 фракций по 4 мл. Фракции объединяют, и упаривают в токе воздуха до сухого остатка. Кристаллы очищенного 4-Г-2ФФМСА кристаллизуют из ацетона и собирают в склянку из темного стекла.

Полученная субстанция представлет собой белый с кремоватым оттенком кристаллический порошок, способен окисляться на свету, температура плавления 153-156 °С.

Определение содержания 4-Г-2-ФФМСА в субстанции. Около 0,5 г 4-ГФФМСА (точная навеска) растворяют в 50 мл диметилформамида, добавляют 4-5 капель спиртового раствора бромтимолового синего и титруют 0,1 М спиртовым раствором калия гидроксида (К п=1,02041) до устойчивого в течение 30 секунд зеленовато-желтого окрашивания [91].

1 мл 0,1 М спиртового раствора калия гидроксида соответствует 0,027931 г (приложение).

Жидкостный хроматограф «Милихром 5-03» (производственное объединение «Научприбор», г. Орл) с дополнительным блоком термостата колонки; жидкостный хроматограф модели LC-10 Avp (фирма «Shimadzu», Япония); ИК – Фурье спектрометр IR Prestige-21 (фирма «Shimadzu», Япония);

сканирующий спектрофотометр UV-1800 (Shimadzu, Япония); спектрофотометр СФ-2000 (ЗАО «ОКБ СПЕКТР», г. Санкт-Петербург); хромато-масс-спектрометр (ГХ-МС) модели 6850 N с масс-селективным квадрупольным детектором модели 5973 Network (фирма «Agilent Technologies», США); ЯМР-спектрометр (ЯМР Н) модели АМ-300 (фирма «Bruker», Германия); рН-метр Portlab 102 (ЗАО "Портлаб СПб", г. Санкт-Петербург); потенциометр ЭВ-74; лабораторные механические весы ВЛКТ-500 (ФГУП «Санкт-Петербургский завод «Госметр», г. Санкт-Петербург); аналитические весы ВЛР-200 (ФГУП «СанктПетербургский завод «Госметр», г. Санкт-Петербург); аналитические весы модели CP225D (фирма «Sartorius», Германия); электронные аналитические весы «KERN 770-13» и электронные лабораторные весы «KERN 440-33» (фирма «KERN & Sohn», Германия); высокоскоростная центрифуга с блоком управления модели high speed centrifuge type 310 (фирма «Mechanika precyzyjna Warszawa», Польша); ультрафиолетовый облучатель Л-80 или другой модели;

плитка электрическая ГОСТ 14919-83; водяная баня; вакуумный испаритель;

термостат ТС-80М-2, сушильный шкаф.

Аммиак водный 25% х.ч. ГОСТ 3760-79; аммония бромид ч.д.а. ГОСТ 19275-73; аммония сульфат х.ч. ГОСТ 3679-78; аммония фторид ч. ГОСТ 4518ацетилацетон ч. ГОСТ 10259-78; ацетон о.с.ч. ТУ 6-09-3513-86; ацетон ч., ч.д.а. ГОСТ 2603-79; ацетонитрил для жидкостной хроматографии о.с.ч. сорт ТУ 2634-002-04715285-2012; ацетонитрил ч. ТУ 6-09-3534-87; бария хлорид х.ч.

ГОСТ 4108-72; бензол ч.д.а. ГОСТ 5955-75; борная кислота х.ч. ГОСТ 9656-98;

бутанол-1 ч.д.а. ГОСТ 6006-78; бутилацетат х.ч. ГОСТ 22300-76; вода очищенная ФС 42-2619-97; гептан эталонный ГОСТ 25828-83; н-гексан х.ч. для хроматографии, сорт второй ТУ 6-09-4521-77; н-гексан ч. ТУ 6-09-3375-78;

деканол-1 ч. ТУ 6-09-1514-75; диметилсульфоксид (ДМСО) х.ч. ТУ 6-09-3818N,N-диметилформамид (ДМФА) х.ч. ГОСТ 20289-74; 1,4-диоксан ч.д.а.

диметилсульфоксид-d6, 100%, 99,96 atom % D «Sigma-Aldrich»; диэтиловый эфир ч.д.а. ТУ 2600-001-43852015-10; изобутанол ч.д.а. ГОСТ 6016-77;

изоамиловый спирт ч. ГОСТ 5830-79; калия бромид ч.д.а. ГОСТ 4160-74; калия сульфат ч. ГОСТ 4145-74; калия фторид, дигидрат ч. ГОСТ 20848-75; калия хлорид х.ч. ГОСТ 4234-77; карбамид ч.д.а. ГОСТ 6691-77; о-ксилол х.ч. ТУ 2631-010-29483781; меди сульфат, пентагидрат ч.д.а. ГОСТ 4165-88; меди хлорид (I) ч. ГОСТ 4164-79; метанол-яд х.ч. ГОСТ 6905-77; метилацетат extra pure, 99% «Acros Organics»; метилен хлористый х.ч. ТУ 2631-019-44493-179-98;

муравьиная кислота 85% ч. ГОСТ 5848-73; натрия бромид ч. ТУ 6-09-5331-87;

натрия гидроксид ч.д.а. ГОСТ 4328-77; натрия нитрит х.ч. ГОСТ 4168-79; натрия сульфат, декагидрат ч. ГОСТ 4171-76; натрия сульфатиазол, субстанция НД 42натрия фторид ч. ГОСТ 4463-76; натрия хлорид х.ч. ГОСТ 4233-77; 2нафтол ч.д.а. ТУ 6-09-5418-89; олово гранулированное ч. ТУ 6-09-2704-88;

пентанол-1 ч. ТУ 6-09-3467-79; пропанол-1 ч. ТУ 2632-106-44493179-07;

пропанол-2 о.с.ч. ТУ 2632-001-29483781-09; пропилацетат ч. ТУ 6-09-07-4905серная кислота х.ч. ГОСТ 4204-77; тетраметилсилан analytical standard for NMR-spectroscopy, 99,5% «Fluka»; тетрахлорметан х.ч. ГОСТ 20288-74; толуол х.ч. ТУ 2631-002-29483781-05; уксусная кислота ледяная х.ч. ГОСТ 61-75;

уксусный ангидрид ч.д.а. ГОСТ 5815-77; фосфорная кислота 85% ч.д.а. ГОСТ 6552-80; хлороводородная кислота х.ч. ГОСТ 3118-77; хлороформ х.ч. ТУ 2631этанол 96%; этилацетат х.ч. ГОСТ 22300-76.

Азот; гелий; лед; снег; бумага индикаторная универсальная («Lachema», Чехия) ПНД 50-975-84; колонка хроматографическая размерами 2504,6 мм для жидкостного хроматографа, сорбент «Luna C зернистостью 5 мкм; колонка аналитическая для ВЭЖХ размерами 1002 мм, сорбент «Silasorb-600» (ООО «Медикант», г. Орел) ТУ 4215-001-05451931-94;

колонка для хромато-масс-спектрометра капиллярная кварцевая газохроматографическая DB-5 MS EVIDEX длиной 25 м, внутренним диаметром 0, мм, толщиной 0,33 мкм с неподвижной фазой представляющей собой 5%фенил-95%-метилполи-силоксан; пластины хроматографические «Сорбфил»

ПТСХ-АФ-В-УФ 1010 см, 1015 см ТУ 4215-002-43636866-2007; пластины широкопористый силикагель по Питри марки Silpearl, связующее вещество – крахмал, фирма «Kavalier», Чехия); сорбенты Silicagel L 40/100 мкм, Silicagel L 100/250 мкм и сорбент «Silasorb С-18» 30 мкм (фирма «Chemapol», Чехия);

фильтры бумажные обеззоленые «Белая лента» ТУ 2642-001-42624157-98;

кварцевые кюветы для спектрофотометра с длиной рабочего слоя 10 мм.

Бюретки стеклянные, градуированные на 25 мл; воронки делительные на 25, 50, 100 и 500 мл; камеры хроматографические, стеклянные, с внутренним объмом около 600 см3; колбы конические на 250 мл; колбы мерные на 25, 50, 100, 250, 500, 1000 и 2000 мл; стаканы химические на 50, 100 и 250 мл; пипетки градуированные на 0,1; 0,2; 1; 2; 5 и 10 мл; пробирки стеклянные на 20 мл;

пробирки центрифужные, стеклянные, градуированные на 10 мл; воронки стеклянные; цилиндры мерные, градуированные на 10, 50, 100 и 250 мл; чашки выпарительные, фарфоровые, вместимостью 50, 100, 250 и 500 мл. Склянки из темного стекла объемом 1000 мл.

2.5 Подтверждение структуры рабочих образцов Для установления химической структуры исследуемых соединений, содержащих в составе своих молекул протоны, применяли метод ЯМР 1Н.

Средой анализа явился апротонный растворитель дейтерированный диметилсульфоксид (ДМСО-d6), внутренним стандартом – тетраметилсилан.

Исследуемое вещество растворяли в ДМСО-d6, содержащем ТМС, и помещали в кювету ЯМР-спектрометра Bruker-AM 300. Рабочая частота прибора – 300,13 Мгц. Регистрировали ЯМР 1Н спектры и определяли величины сдвигов милионных долей, соответствующие сигналам протонам определенных функциональных групп в молекуле. Интегрируя площади пиков, производили количественную оценку протонов атомов, входящих в состав молекулы.

Полученные спектры ЯМР 1Н изображены в соответствии с рисунками 1- (приложение). Характеристики ЯМР 1Н спектров и соответствия химических сдвигов определенным фрагментам молекул исследуемых соединений приведены в таблице 3 (приложение).

Анализ полученных результатов позволил подтвердить соответствие структур синтезированных соединений теоретически предполагаемым структурам веществ.

2.5.2 Колебательная ИК-спектрофотометрия Химическую структуру синтезированных образцов нимесулида и близких к нему структур исследовали методом ИК-спектрофотометрии, основанным на поглощении химическими связями данных соединений электромагнитного излучения в инфракрасном диапазоне. Полосы поглощения на спектрах данных соединений характеризуют колебания химических связей различных функциональных групп входящих в состав молекул. Таким образом, в результате расшифровки полученных данных возможно получение информации о химическом составе молекул и характере расположения групп атомов относительно друг друга. Для получения ИК-спектров несколько миллиграмм каждого из веществ запрессовывали в диск с калия бромидом и проводили измерение пропускания на ИК – Фурье спектрометре «Shimadzu» IR Prestige- в интервале 4000-400 см-1 через 1 см-1.

На ИК-спектрах исследуемых веществ в соответствии с рисунками 7- (приложение) отмечали максимумы характеристических полос пропускания и находили соответствие полос определенным колебаниям атомов и групп атомов в молекуле. Результаты представлены в таблицах 4-9 (приложение).

Общими для 4-нитроанилина, нимесулида, 4-Н-2-ФА, 4-А-2-ФФМСА и 4МСА-3-ФФА, 4-Г-2-ФФМСА являются колебания –С=С– связей бензольных ядер в интервалах частот 1624-1446 см-1, а также валентные (3072-3010 см-1) и деформационные колебания –С–Н связей (1182-690 см-1).

В ИК-спектрах нимесулида, 4-А-2-ФФМСА и 4-МСА-3-ФФА, 4-Г-2ФФМСА наблюдаются колебания –С–О– связей бифенилового простого эфира в интервале частот 1274-1068 см-1, валентные колебания –С–Н метильной группы (1463-1433 см-1; 2939-2837 см-1) и –S=О связей (698-594 см-1; 1328-1157 см-1), а также валентные колебания ароматической аминогруппы метансульфонамидного фрагмента молекул.

Характерными для нимесулида, 4-Н-2-ФА и 4-нитроанилина являются асимметрические (1521-1504 см-1) и симметрические (1340-1327 см-1) валентные колебания ароматической нитрогруппы.

Колебательные спектры 4-нитроанилина, 4-Н-2-ФА и 4-А-2-ФФМСА имеют характеристические полосы, соответствующие валентным колебаниям – N–Н связей свободной (3481 и 3361 см -1) и ассоциированной (3237 и 3198 см -1) первичной ароматической аминогруппы, а также полосы асимметрических (3473-3398 см-1) и симметрических (3350-3329 см-1) валентных колебаний первичной ароматической аминогруппы.

Несмотря на схожесть структур 4-нитроанилина, 4-Н-2-ФА, 4-А-2ФФМСА, 4-МСА-3-ФФА и 4-Г-2-ФФМСА с нимесулидом, в их ИК-спектрах имеются характерные отличия. У 4-Г-2-ФФМСА присутствуют колебания, связанные с группой –O–H (1388 и 1317 см-1). В ИК-спектре 4-МСА-3-ФФА выявлены валентные колебания –N–Н связей свободной (3574 см-1) и ассоциированной (3354 и 3269 см -1) вторичной ароматической аминогруппы, а также колебания связей –С=О (1672 см-1) ацетиламиногруппы (полоса «Амид 1»).

2.5.3 Хроматография в тонком слое сорбента Исследование чистоты синтезированных образцов нимесулида и близких по структуре соединений проводили методом нормальнофазовой тонкослойной хроматографии на пластинах «Сорбфил» с УФ-индикатором 254 нм (неподвижная фаза – силикагель марки СТХ-1 ВЭ, размер частиц 8-10 мкм, связующее вещество – силиказоль).

Чистоту 4-Г-2-ФФМСА дополнительно исследовали на пластинах Silufol UV-254 (неподвижная фаза – широкопористый силикагель по Питри марки Silpearl, связующее вещество – крахмал, фирма «Kavalier», Чехия).

На линию старта хроматографической пластины размером 107,5 см наносили по 5-10 мкл 0,04% этанольных растворов исследуемых веществ.

Хроматографировали в камерах с внутренним объемом около 600 см 3.

Пластины по окончании хроматографирования высушивали в токе воздуха при комнатной температуре и проявляли в УФ-свете. 4-Г-2-ФФМСА на пластинах Silufol UV-254 проявляли в УФ-свете, а также реактивом на фенольный гидроксил. Состав реактива: 0,5 мл смеси 10 объемных частей 0,1% раствора натрия сульфатиазола в 0,1 М растворе кислоты хлороводородной и 4% водного раствора нитрия нитрита; 0,5 мл аммония гидроксида 25%; 1 мл этанола и 8 мл воды очищенной. Пятно 4-Г-2-ФФМСА после опрыскивания пластины указанным реактивом окрашивалось в розовое с коричневатым оттенком, через несколько часов переходило в коричневое. Результаты хроматографирования представлены в таблице 19 (приложение).

Образцы 4-Н-2-ФА хроматографировали на пластинах «Сорбфил» в системах гексан-пропанол-2 (8:2) и гексан-этилацетат (8:2), 4-А-2-ФФМСА – толуол-ацетонитрил (8:2) и гексан-ацетон (6:4), 4-МСА-3-ФФА – гексан-диоксан (5:5) и гексан-этилацетат (5:5) и 4-Г-2-ФФМСА – гексан-пропанол-2 (8:2) и толуол-этилацетат (8:2). Образцы 4-Г-2-ФФМСА дополнительно анализировали на пластинах Silufol UV-254 в элюенте гексан-этилацетат (6:4). Результаты анализа выявили присутствие только одного пятна на хроматографических пластинах при анализе синтезированных рабочих образцов.

2.6 Идентификация фотометрическими методами 2.6.1 Колебательная ИК-спектрофотометрия Идентификацию методом спектрофотометрии в инфракрасной области спектра по схеме указанной в разделе 2.1.2. В ходе исследования устанавливали максимумы характеристических полос пропускания и их интенсивность.

Вещество идентифицировали по совпадению значений максимумов спектра исследуемого вещества со спектром стандарта, а также формы кривых анализируемых спектров.

Результаты представлены в соответствии с рисунками 7-12 и в таблицах 4приложение).