WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

Pages:     || 2 |

«АНАЛИЗ МЕТИЛИРОВАНИЯ ДНК ПРИ РАКЕ ШЕЙКИ МАТКИ (Онкология - ...»

-- [ Страница 1 ] --

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

ГУ РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

им. Н.Н. БЛОХИНА

На правах рукописи

ПЕТРЕНКО АНАТОЛИЙ АНАТОЛЬЕВИЧ

АНАЛИЗ МЕТИЛИРОВАНИЯ ДНК ПРИ РАКЕ ШЕЙКИ МАТКИ

(Онкология - 14.00.14)

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

профессор, д.б.н. Ф.Л. Киселев Москва 2003 -2ОГЛАВЛЕНИЕ Стр.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

МЕТИЛИРОВАНИЕ ДНК

Распространение метилирования ДНК

Функция метилирования ДНК

Метилирование во время развития

Ферменты метилирования

Метилирование как динамический процесс

Роль метилирования в канцерогенезе

Генетическая роль метилирования ДНК в канцерогенезе

Эпигенетическая роль метилирования ДНК в канцерогенезе

Сравнительный анализ современных методов определения статуса метилирования ДНК

Методы анализа статуса метилирования CpG динуклеотидов

Методы идентификации CpG-островков, аберрантно-метилированных в опухолях

Заключение

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Список использованных реактивов

2. Клинические материалы

3. Выделение ДНК и РНК из клеточных культур

4. Выделение ДНК из лейкоцитов

5. Рестрикция геномной ДНК

6. Бисульфитная модификация ДНК

7. Полимеразная цепная реакция

7.1. Праймеры

7.2. Метилчувствительная ПЦР со статистическими GC-богатыми праймерами

-3Метилчувствительная ПЦР со специфическими праймерами

7.4. Метилспецифическая ПЦР

8. Выделение продуктов ПЦР из гелей

8.1. Выделение продуктов ПЦР из полиакриламидного геля

8.2. Выделение продуктов ПЦР из агарозного геля

9. Клонирование продуктов ПЦР…

9.1. Вектор

9.2. Получение компетентных клеток Escherichia coli

9.3. Трансформация клеток Escherichia coli

9.4. Выделение плазмидной ДНК

10. Гель-электрофорез

10.1. Электрофоретическое разделение ДНК в агарозном геле

10.2. Электрофоретическое разделение РНК в агарозном геле

10.3. Электрофорез ПЦР-амплифицированной ДНК в денатурирующем полиакриламидном геле

11. Блот-гибридизация

11.1. Перенос ДНК на нейлоновую мембрану

11.2. Перенос РНК на нитроцеллюлозную мембрану

11.3. Получение меченого зонда

11.4. Гибридизация ДНК (РНК), иммобилизованной на мембране

12. Обратная транскрипция

13. Переосаждение ДНК (РНК)

14. Анализ нуклеотидных последовательностей

14.1. Поиск гомологий в банках данных

14.2. Критерии CpG-островков

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Поиск CpG-островков, гиперметилированных в опухолях шейки матки..... -4Принцип метода метилчувствительной ПЦР со статистическими GC-богатыми праймерами

1.2. Анализ фрагментов, выявленных с помощью метилчувствительной ПЦР со статистическими GC-богатыми праймерами

1.3. Определение статуса метилирования CpG-островка 32 при раке шейки матки

1.4. Определение полного размера CpG-островка гена 3А-адаптина............ 2. Исследование экспрессии и статуса метилирования гена 3А-адаптина при раке шейки матки

2.1. Исследование экспрессии мРНК гена 3А-адаптина в опухолях шейки матки и в клеточных линиях рака шейки матки

2.2. Изучение статуса метилирования CpG-островка гена 3А-адаптина в опухолях шейки матки и в клеточных линиях рака шейки матки

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

ЛИТЕРАТУРА

MOPS – морфолинпропансульфокислота ДМСО – диметилсульфоксид TEMED – N, N, N’, N’- тетраметилэтилендиамин ПСА – персульфат аммония SDS – додецилсульфат натрия IPTG – изопропилтио--D-галактозид X-gal – 5-бром-4-хлор-3-индолил--галактозид ЭДТА – этилендиаминтетраацет натрия ГТЦ – гуанидинтиоционат ПААГ – полиакриламидный гель СП-ПЦР – метилчувствительная ПЦР со статистическими GC-богатыми праймерами МЧР – метилчувствительная рестриктаза МЧ-ПЦР – метилчувствительная ПЦР со специфическими праймерами ОТ-ПЦР – обратная транскрипция в сочетании с ПЦР н.п. – нуклеотидных пар Актуальность темы: Рак шейки матки занимает второе место среди всех онкологических заболеваний у женщин. Этиологическим фактором рака шейки матки (РШМ) признаны вирусы папиллом человека (HPV) из так называемой группы высокого риска (типы 16, 18 и другие). После вирусной инфекции РШМ может развиться через стадии дисплазии, рака in situ на протяжении нескольких лет, в течение которых в прогрессию опухоли вносят вклад возникающие и накапливающиеся изменения в клеточных генах, регулирующих такие важные для нормальной жизнедеятельности клетки процессы, как пролиферация, апоптоз, ангиогенез, поддержание генетической стабильности.



В последнее десятилетие было установлено, что в многостадийном процессе образования опухолей нарушение функций клеточных генов может происходить не только в результате генетических событий (точечные мутации, делеции, амплификация и реарранжировка генов), но и в результате эпигенетических изменений, в том числе локального гиперметилирования ДНК. Аберрантному метилированию в опухолевых клетках подвергаются специфические последовательности – CpG-островки, ассоциированные с 5’ регуляторными районами многих генов. В нормальных клетках большинство CpG-островков не метилировано, а их метилирование в опухолевых клетках, как правило, сопровождается подавлением транскрипции соответствующего гена, наследуемой при делении клетки. Механизмы инициации локального метилирования CpG-островков в опухолях пока не ясны.

гиперметилированных районов ДНК, основанные на дифференциальном статусе метилирования CpG-островков в нормальных и опухолевых клетках.

Во многих случаях с помощью этих методов были идентифицированы гены, инактивируемые в опухолях путем аберрантного метилирования ассоциированных с ними CpG-островков. Среди них обнаружены как новые гены, утрата функций которых оказалась существенной для развития в отсутствии инактивирующих мутаций уже было продемонстрировано.

эпигенетический механизм инактивации в опухолях, постоянно растет, что свидетельствует о широком распространении этого механизма в процессе канцерогенеза.

Цель настоящей работы: Идентификация гиперметилированных в опухолях шейки матки CpG-островков и ассоциированных с ними генов, экспрессия которых может быть подавлена вследствие нарушения метилирования ДНК.

экспериментальные задачи:

1) Провести скрининг аберрантно-метилированных GC-богатых метилчувствительной ПЦР со статистическими GC-богатыми праймерами, определить нуклеотидную последовательность обнаруженных GCбогатых фрагментов ДНК, выявить среди них CpG-островки.

2) Провести поиск в базах данных гомологий выявленных CpG-островков с известными последовательностями ДНК.

последовательностями в базах данных, провести клонирование и определение нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК, фланкирующих CpG-островок для его локализации в геноме человека.

4) В случае установления ассоциации выявленных CpG-островков с генами, провести анализ статуса метилирования и экспрессии соответствующих генов в первичных опухолях и клеточных линиях карцином шейки матки.

Научная новизна и практическая ценность работы:

С помощью метода метилчувствительной ПЦР со статистическими GCбогатыми праймерами было выявлено 7 GC-богатых фрагментов ДНК длиной от 300 до 1200 пар оснований, пять из которых (более двух третей) два оказались непредставленными в опубликованных версиях генома человека: фрагмент 26 был представлен неполностью (отсутствовала область, фланкирующая 5' конец гена 3А-адаптина), фрагмент 22 до сих пор отсутствует в опубликованных базах данных.

В работе впервые показано подавление экспрессии мРНК гена 3Аадаптина в клеточных линиях рака шейки матки. Продукт гена 3Аадаптина представляет собой одну из субъединиц адаптерного комплекса АР-3, вовлеченного во внутриклеточный транспорт белков. Показана возможность восстановления экспрессии мРНК 3А-адаптина под действием деметилирующего агента 5-азацитидина, что указывает на связь процессов метилирования и транскрипции гена. Впервые определена нуклеотидная последовательность района, прилегающего к 5’ концу гена. Установлены размер первого экзона гена 3А-адаптина и размер CpG-островка, ассоциированного с геном. CpG-островок гена 3А-адаптина включает 5’ нетранскрибируемый район гена, первый экзон и начало первого интрона.

Теоретическое значение работы заключается в получении новых данных об участии клеточных генов в механизме злокачественной трансформации под действием вирусов папиллом человека. Обнаруженное подавление экспрессии гена 3А-адаптина в клетках карцином шейки матки указывает на необходимость дальнейшего исследования роли белковых комплексов, вовлеченных в эндо/экзоцитоз белков, в канцерогенезе.

Показана возможность идентифицикации CpG-островков, до сих пор не представленных в опубликованных версиях нуклеотидных последовательностей генома человека, с помощью метода метилчувствительной ПЦР со статистическими GC-богатыми праймерами, что позволяет получить информацию о GC-богатых трудноклонируемых районах генома человека.

Метилирование оснований в ДНК было открыто свыше 50 лет назад и наблюдается практически во всех классах живых организмов. ДНК прокариот содержит модифицированные основания N6-метиладенин и 5метилцитозин, тогда как для эукариот характерно наличие в основном 5метилцитозина. Он присутствует в ДНК грибов и растений (Finnegan et al.

2000; Martienssen and Colot 2001). В царстве животных наблюдается широкий спектр уровня метилирования генома. На одном из полюсов располагается нематода Caenorhabditis elegans, чей геном лишен 5-метилцитозина и не кодирует соответственно ДНК-метилтрансферазы. Рядом с ней располагается плодовая мушка Drosophila melanogaster. Долгое время считали, что ее геном также не подвергается метилированию. Однако у нее имеется ген, млекопитающих (Hung et al. 1999; Tweedie et al. 1999). Недавно было показано, что 5-метилцитозин в ДНК D. melanogaster присутствует в очень противоположной стороне от C. elegans находятся позвоночные животные.

Их геном имеет самый высокий уровень 5-метилцитозина во всем животном распространено в геноме, что говорят о его тотальном метилировании.

У млекопитающих 5-метилцитозин в геноме встречается практически динуклеотидов снижено из-за высокой мутабильности 5-метилцитозина, дезаминированию и превращению в тимин. Это обстоятельство привело в процессе эволюции к многочисленным заменам пар G:C на A:T, в результате чего в геноме млекопитающих динуклеотидов CpG в ~ 5-раз меньше, чем следовало бы ожидать (Gardiner-Gardner and Frommer 1987). У человека динуклеотиды рассредоточены по геному в виде одиночных сайтов (Bird 1995).

В то же время в геноме позвоночных существуют скопления неметилированных CpG динуклеотидов, именуемых CpG-островками (у человека ~20% от всего числа CpG динуклеотидов). Эти последовательности обладают длиной от 0.5 до 5 т.п.н. (в среднем 1 т.п.н.), встречаются приблизительно один раз на 100 т.п.н., имеют высокую плотность CpG динуклеотидов (близкое к расчетному 1:16), их GC состав превышает 0.55, а отношение экспериментально найденного числа CpG к теоретически возможному составляет не менее 0.6 (Antequera and Bird 1993; Takai and Jones 2002). На основании компьютерного анализа в геноме человека предсказано существование 29 тыс. CpG-островков (Lander et al. 2001; Venter et al. 2001).

CpG-островки расположены вблизи генов, преимущественно в 5’ области (регуляторные последовательности, промоторы, последовательности первого экзона). Считается, что ~60% человеческих генов содержат CpG-островки (Antequera and Bird 1993). Они имеются, по-видимому, у всех генов, выполняющих базовые клеточные функции (гены "домашнего хозяйства"), и (тканеспецифические гены). Большинство из CpG-островков остаются неметилированными на всех стадиях развития организма и во всех типах тканей, даже когда ассоциированный с ними ген не функционирует.

Например, тканеспецифические гены человека -глобин (Bird et al. 1987) и 2(1)-коллаген (McKeon et al. 1982) имеют CpG-островки, которые остаются неметилированными во всех протестированных тканях, независимо от статуса экспрессии гена. В то же время в клетке может происходить метилирование CpG-островка, что сопровождается стабильной инактивацией связанного с ним гена. Так, во время развития метилирование CpG-островков наблюдается при установлении геномного импринтинга и инактивации Х процессах, например при канцерогенезе.

Считается, что метилирование CpG-островков в регуляторных областях приводит к перестройке хроматина в неактивное состояние, что вызывает инактивацию транскрипции метилированного гена (см. обзор Baylin and Herman 2000; Jaenisch and Bird 2003). Показано, что важную роль в этом метилированному локусу ДНК гистоновые деацетилазы, которые, в свою очередь, удаляют ацетильные группы у гистонов в составе нуклеосом. Такая модификация гистоновых белков приводит к превращению открытой, транскрипционно-неактивную (рис. 1).

Рисунок 1. Влияние метилирования ДНК на структуру хроматина. При ацетилированных гистонах хроматин имеет открытую конфигурацию, которая ассоциируется с транскрипционной активностью. Метилированные цитозины распознаются метил-CpG-связывающими белками (MBDs), которые привлекают гистоновые деацителазы (HDACs) в район метилированной ДНК. Это приводит к перестройке хроматина в недоступную для транскрипционного аппарата клетки форму (по Worm and Guldberg 2002).

одиночных CpG динуклеотидов, расположенных в области промотора в зоне сайта связывания ряда транскрипционных факторов. Метилирование в этом случае имеет относительно локальный характер, препятствуя связыванию чувствительных к метилированию факторов транскрипции, и варьирует в широких пределах в разных тканях. В настоящий момент известно около метилчувствительных транскрипционных факторов. Например, такое сайтспецифическое метилирование и ассоциированная с ним инактивация транскрипции наблюдается в случае с промотором GK-интерферона (Melvin et al. 1995) и участком связывания CREB (cyclic AMP response elementbinding protein) промотора гена -глобина (Iguchi-Ariga et al. 1989). Подобная регуляция может наблюдаться как для генов, обладающих CpG-островками, так и для тканеспецифических генов, их не имеющих. Однако роль метилирования в этом случае ограничивается влиянием на доступность сайта связывания чувствительному к метилированию транскрипционному фактору и реализуется только при наличии в клетке соответствующего белкового фактора.

Наиболее общей функцией метилирования является участие в клеточном "иммунитете". Для бактерий оно характерно как элемент системы метилирования-распознавания "свой-чужой", что дает клетке возможность отличать свой генетический материал от инородных молекул, проникших в клетку. Это позволяет поддерживать генетическую стабильность вида.

Иногда один фермент выполняет и метилазную, и эндонуклазную функцию, но в большинстве случаев эти активности разделены между двумя ферментами, один из которых метилирует определенный сайт ДНК, а другой расщепляет. При этом метилазы «метят» специфические последовательности собственной ДНК, а чувствительные к метилированию рестрикционные эндонуклеазы узнают и расщепляют те из последовательностей, которые соответствующей метки не имеют, т.е чужеродную ДНК. Таким способом последовательность проникшего в бактериальную клетку фага расщепляется в определенных сайтах специфическими эндонуклеазами, в то время как те же последовательности в собственной ДНК клетки защищены от расщепления, так как метилированы (Noyer-Weidner and Trautner 1993).

Роль метилирования ДНК как компонента клеточного "иммунитета", предназначенного для избавления от "ненужной" ДНК (уничтожение или подавления ее функций), сохраняется и у эукариот, но конкретные механизмы реализации этой задачи могут отличаться. Так, в клетках грызунов и человека посредством метилирования происходит стабильное подавление транскрипции интегрированных вирусных последовательностей и транспозонов, что предотвращает их дальнейшие распространение по геному (Barlow 1993; Bestor and Tycko 1996), а у мышей часто происходит инактивация трансгенов (Sasaki et al. 1993). Однако роль метилирования у эукариот не ограничивается защитой клетки от потенциально опасной ДНК.

Предполагается, что при усложнении генома в ряду от низших эукариот к высшим происходила функциональная переориентация системы метилирования (Bird 1995). Если у беспозвоночных она в основном сводилась к подавлению активности потенциально опасных последовательностей ДНК (таких как вирусы и транспозоны), то у позвоночных ее назначение – еще и стабильная репрессия эндогенных генов (гены инактивированной Х хромосомы, импринтированные гены). В этом случае метилирование выступает как компенсаторный механизм для организации ДНК сложных геномов в транскрипционно-активные и неактивные области. В связи с этим, наличие метилирования является необходимым условием для процесса регуляции экспрессии генов во время развития и дифференцировки.

Во время нормального развития и клеточной дифференцировки у млекопитающих происходит комплекс изменений в метилировании ДНК хромосомы пространственно обособлены, и их деметилирование происходит метилирования ДНК в клетках млекопитающих во время развития (по Turker 1999). ППК – примордиальные половые клетки, ЭСК – эмбриональные стволовые клетки.

в разное время (Mayer et al. 2000). При этом отцовские хромосомы деметилируются в течение шести – восьми часов после оплодотворения независимым от репликации путем, тогда как деметилирование материнских хромосом охватывает стадии второго и третьего дробления и происходит в процессе репликации. У мышей в результате этого процесса уровень метилирования генома падает до 30% от наблюдаемого в соматических клетках (Kafri et al. 1992). После имплантации в клетках бластоцисты уровень метилирования восстанавливается, приобретая характерный для клеток взрослого организма паттерн (Turker 1999). Этот процесс начинается последовательности в геноме ("центры метилирования" – транспозоны и метилирования, происходит распространение метилирования из центра на окружающие неметилированные сайты. Во время дифференцировки в (Turker et al. 1991; Szyf et al. 1990), но сохраняется способность к распространению метилирования из "центров метилирования" (Toth et al.

1989). Однако характерной чертой клеток становится исключительно высокая способность поддерживать установленный статус метилирования в процессе репликации. Этот процесс называется поддерживающим метилированием.

метильной группы с молекулы донора на пятый атом углерода в молекуле цитозина ферментативным путем. В клетке наблюдаются два независимых процесса метилирования, осуществляемых, по-видимому, разными ДНКметилтрансферазами. В первом случае наблюдается приобретение метилированного статуса CpG динуклеотидом, который прежде не был метилирован (реакция метилирования de novo). Во втором, происходит восстановление метилированного состояния CpG динуклеотида из полуметилированного, возникающего в результате полуконсервативной репликации ДНК, т.е. осуществляется передача по наследству характерного статуса метилирования ДНК в ряду клеточных генераций (поддерживающее метилирование).

ДНК(цитозин-5)-метилтрансфераза 1 (Dnmt1), которая в соматических метилтрансферазную активность (Yoder et al. 1997). C-концевой домен Dnmt имеет такую же структуру, что и осуществляющие метилирование цитозина ферменты бактерий, которые содержат 10 консервативных мотивов, образующих каталитический центр (Bestor et al. 1988). N-концевой домен представляет собой регуляторную область. Он содержит сигнал ядерной локализации – последовательность, направляющую фермент в локус репликации ДНК (Liu et al. 1998), и район взаимодействия с белком цикла Rb (Pradhan and Kim 2002). Необходимость Dnmt1 для развития млекопитающих продемонстрирована на мышах. Их эмбриональные стволовые клетки с гомозиготной инактивацией Dnmt1 нормально размножаются, имея сильно деметилированный геном, но погибают при индукции дифференцировки in vitro. Мышиные эмбрионы, несущие дефектную Dnmt1, умирают при имплантации (Li et al. 1992). Показано, что Dnmt1 имеет in vitro высокое сродство к полуметилированной ДНК, как к субстрату для метилирования CpG динуклеотидов. Поэтому считается, что главная ее функция in vivo заключается в осуществлении поддерживающего метилирования, исполнение которого скоординировано в пространстве и времени с процессом репликации. В тоже время Dnmt1 проявляет небольшую способность к метилированию ДНК de novo, которая модулируется как изменениями в N-концевом домене фермента (Bestor 1992), так и вторичной структурой ДНК (Gacy et al. 1995). При этом, вероятно, именно она ответственна за распространение метилирования за пределы центров метилирования, как это показано в прямых тестах с очищенной ДНК (Carotti et al. 1998).

В настоящее время у млекопитающих известно еще три гена, кодирующие белки, аминокислотная последовательность которых также содержит метилтрансферазный домен. Они были обозначены как Dnmt (Yoder and Bestor 1998), Dnmt3a и Dnmt3b (Okano et al. 1998). Белок Dnmt содержит 6 из 10 консервативных метилтрансферазных мотивов, но лишен большого N-концевого домена. Его мРНК присутствует в малых количествах во всех типах клеток, но, несмотря на наличие метилтрансферазного домена, выявить у Dnmt2 какой-нибудь метилтрансферазной активности на настоящий момент не удалось (Yoder and Bestor 1998).

Dnmt3a и Dnmt3b экспрессируются в больших количествах в эмбриональных стволовых клетках, но в тканях взрослого организма их экспрессия подавлена. Их С-концевой домен аналогичен цитозинметилирующим ферментам, тогда как последовательность N-концевого отличается от аналогичного домена Dnmt1. Было показано, что обе эти метилтрансферазы обладают одинаковой способностью метилировать полуметилированную и неметилированную ДНК (Okano et al. 1998). Мутация в каталитических центрах Dnmt3a и Dnmt3b лишает эти ферменты способности к de novo метилированию in vivo (см. обзор Hsieh 1999).

Инактивация Dnmt3a и Dnmt3b в эмбриональных стволовых клетках показала продемонстрировано, что эти метилтрансферазы имеют как общие сайты метилирования, так и строго специфичные. Так, Dnmt3b участвует в метилировании минисателлитных повторов центромеры, тогда как Dnmt3a нет.

Исследование уровня мРНК трех человеческих метилтрансфераз координированный характер экспрессии, как в эмбриональных клетках, так и в тканях взрослого организма (Robertson et al. 1999). По всей видимости, в процессе метилирования ДНК de novo участвуют все три метилтрансферазы, специфически распределяя роли в установлении паттерна метилирования генома. Для установления импринтинга в женских половых клетках показана также необходимость присутствия белка DNMT3L, который не имеет метилтрансферазной активности и колокализуется вместе с DNMT3a и DNMT3b, в то время как за поддержание этого импринтинга ответственна ооцит-специфическая изоформа DNMT1o (Jaenisch and Bird 2003).

Метилирование как динамический процесс Статус метилирования ДНК в любой клетке устанавливается в деметилирования. В популяции клеток CpG динуклеотиды могут иметь один из трех профилей метилирования (Turker 1999): полностью метилированные (уровень метилирования почти 100%), неметилированные (около 0%) и усредненный показатель метилирования, определенный анализом большого числа аллелей. В случае импринтированных генов и генов инактивированной в женских клетках хромосомы Х промежуточный уровень метилирования (около 50%) отражает альтернативное состояние метилирования двух аллелей. Такая наследуемая совокупность всех неметилированных, частично метилированных и полностью метилированных CpG динуклеотидов для данной области ДНК получила название паттерна метилирования. В первых экспериментах, показавших существование воспроизведения статуса метилирования искусственно метилированной ДНК при делении клеток, также наблюдалось относительно низкая точность этого процесса (Wigler et al. 1981). После многих клеточных генераций, исследуемая ДНК сохранила метилирование, но на значительно меньшем уровне, чем это было в начале.

Количественные исследования эндогенных CpG динуклеотидов подтвердили относительную стабильность паттерна метилирования (Riggs et al. 1998).

Клеточные клоны, в которых изучаемые сайты первоначально были метилированными CpG динуклеотидами его теряли. Динамические изменения в деталях статуса метилирования исследовались в области промотора мышиного гена Aprt (Turker 1999). Этот ген обладает CpGостровком, который включает промотор, первый и второй экзоны и первый интрон. Было показано, что статус метилирования CpG динуклеотидов, расположенных в непосредственной близости от начала CpG-островка вне его границ, не однороден в клеточной популяции, тогда как CpG динуклеотиды в составе всех сайтов метилчувствительной рестриктазы HpaII внутри CpG-островка не метилированы. На основании многочисленных экспериментальных данных была предложена модель, объясняющая образование и поддержание паттерна метилирования 5' области гена Aprt (рис. 3). В раннем эмбриогенезе для 5' области гена Aprt характерно неметилированное состояние. Предполагают, что процесс метилирования называемом центре метилирования, активную часть которого составляют две копии B1 элементов, повторяющихся последовательностей грызунов, распространяется «ниже» по направлению к промотору гена.

Рисунок 3. Модель возникновения и поддержания паттерна метилирования 5' области гена Aprt мыши. А. На ранних стадиях эмбриогенеза CpG динуклеотиды в составе сайтов рестрикции фермента HpaII (H1-H3) не метилированы. Б. После имплантации происходит de novo метилирование центра метилирования (МС), содержащего В повторы и сайт Н1, и распространение метилирования за пределы этой области. В. В некоторых случаях метилирование может распространяться вплоть до сайта Н2, расположенного в непосредственной близости от начала CpG-островка. Г. Наличие сайтов связывания транскрипционного фактора Sp1 препятствует распространению метилирования на область промотора. Такое блокирование метилирования может распространяться от области промотора в сторону центра метилирования и приводить к деметилированию сайта Н2, препятствуя поддерживающему метилированию (по Turker 1999).

предохраняют промотор от экспансии метилирования, блокируя процесс вблизи сайта метилчувствительной рестриктазы НpaII. Как показано, делеции или мутации в сайтах Sp1 приводят к метилированию CpG-островка гена (Macleod et al. 1994; Mummaneni et al. 1995). В силу конкуренции между импульсами деметилирования, исходящими из структур промотора, этот сайт находится в динамически изменяющемся состоянии (метилирован менее чем на 50%). Таким образом, в установлении статуса метилирования участвуют два взаимоисключающих друг друга процесса: деметилирование ранее метилированных CpG динуклеотидов и de novo метилирование неметилированных CpG динуклеотидов. И, хотя, по всей видимости, паттерн метилирования ДНК в клетке в процессе развития передается по наследству точно (см. обзор Bird 2002), на уровне одиночных CpG динуклеотидов статус метилирования может варьировать. Поэтому представляется возможным нарушение профиля метилирования при сдвиге равновесия, вызванного усилением или ослаблением одного из двух противоборствующих процессов и развивающегося на протяжении нескольких клеточных поколений. Именно это, по всей видимости, и происходит при старении и злокачественной трансформации клетки.

По отношению к нормальной регуляции метилирования ДНК выделяют Трансформированные и опухолевые клетки практически всех типов одновременно имеют широкораспространенную по геному потерю метилирования в нормально метилированных сайтах и локальное гиперметилирование CpG-островков, неметилированных в нормальных клетках (рис. 3). Каждое из этих нарушений может иметь глубокие последствия для функционирования генома, и взаимодействие между ними представляется особенно важным для опухолевой прогрессии. Наиболее явно это проявляется при стабильной эпигенетической инактивации экспрессии генов-супрессоров, которая оказывает такой же эффект, как и генетические нарушения. По аналогии с мутациями, этот феномен был назван эпимутацией, т.е. эпигенетический эквивалент генетической инактивирующей мутации.

Рисунок 4. Изменения системы метилирования в опухоли. Показана структура типичного гена, содержащего CpG-островок: экзоны представлены пронумерованными прямоугольниками, CpG динуклеотиды – кружками (белые – неметилированные, черные – метилированные); DMTase – ДНК-метилтрансфераза; ? – регуляторные факторы. А. В нормальных клетках редкие CpG динуклеотиды вне CpG-островка в большой степени метилированы, тогда как внутри CpG-островка CpG динуклеотиды остаются неметелированными. Такое положение позволяет осуществлять транскрипцию гена (показана стрелкой). Б. В опухолевых клетках происходит локальное гиперметилирование CpG динуклеотидов в области CpG-островка и деметилирование вне его границ. Первое изменение ведет к блокированию транскрипции. Также может происходить нарушение в функционировании ДНК-метилтрансферазы, что сопровождается увеличением активности фермента и возможными изменениями в регуляции белка путем повреждения регуляторных факторов (по Herman 1999).

В тоже время вклад метилирования ДНК в канцерогенез не ограничивается исключительно эпигенетическими нарушениями. Как было сказано ранее, 5-метилцитозин обладает значительной нестабильностью и способен выступать в качестве горячей точки мутагенеза. Также следует отметить, что метилирование подавляет процесс гомологичной рекомбинации и, таким образом, глобальное деметилирование генома может способствовать генетической нестабильности опухолевой клетки.

Мутации в опухолевых клетках. 5-метилцитозин подвергается спонтанному дезаминированию в результате тепловых флуктуаций даже в обычных условиях (Bird 1995). В результате этого процесса возникает остаток тимина, и в ДНК происходит образование неканонической пары оснований G:T, которая является мишенью для системы репарации. Хотя ферменты репарации предпочтительно удаляют тимин из этой пары и восстанавливают исходную последовательность (пара G:C), тем не менее с небольшой вероятностью мутации возникают, и происходит замена пары G:C на A:T. Именно нестабильностью 5-метилцитозина объясняется низкий уровень CpG динуклеотидов в геноме млекопитающих, в результате того, что на протяжении эволюции происходили многочисленные замены пар G:С на А:Т (Gardiner-Gardner and Frommer 1987). Так, в сутки в каждой клетке человека происходит ~100 реакций дезаминирования 5-метилцитозина, многие из которых приводят к заменам пар G:С на А:Т. Например, из ~ мутаций гена-супрессора ТР53 (главного хранителя целостности генома), зарегистрированных в опухолях человека разного происхождения, 25-30% относятся к мутациям данного типа (Pfeifer 2000). Таким образом, спонтанный мутагенез (в отсутствие каких-либо экзогенных и эндогенных агентов, повреждающих ДНК) идет в клетках человека весьма активно и повреждает многие гены, в том числе и гены-супрессоры опухоли.

Нестабильность генома. Одним из характерных признаков опухолевой клетки является тотальное деметилирование ДНК. Этот процесс, по-видимому, оказывает крупномасштабное дестабилизирующее воздействие на геном. Так, гипометилирование ДНК в эмбриональных мышиных клетках, лишенных гена Dnmt1, приводит к десятикратному возрастанию частоты образования делеций и инсерций в уникальных генах (Chen et al. 1998).

Искусственное метилирование участков ДНК, являющихся горячими точками рекомбинаций у грибов, ингибирует гомологичную рекомбинацию во время мейоза (Maloisel and Rossignol 1998). Хотя приведенные причинно-следственных отношений между гипометилированием ДНК и нестабильность генома, возникающая в результате такого рода нарушения системы метилирования, представляется при канцерогенезе весьма вероятной.

В тоже время локальное гиперметилирование промоторных областей ряда генов, содержащих CpG-островки, и сопровождаемая этим инактивация экспрессии, также может способствовать дестабилизации генома. Оказалось, что этот процесс предшествует и, по-видимому, является необходимым для некоторых генетических событий, облегчающих прогрессию опухоли.

Наиболее прямая на нынешний день связь между генетическим нарушением и предшествующей ему эпигенетической инактивацией описана для микросателлитных повторах в опухолях кишечника, отличающихся MIN+ ("microsatellite instability") фенотипом (Herman et al. 1998). При этом гиперметилирование hMLH1 происходит на ранних стадиях прогрессии, прежде чем появляются нарушения в микросателлитах (Esteller et al. 1999). В гиперметилированием промотора другого гена репарации ДНК MGMT и возникновением мутаций (G:C – A:T транзиция) в гене супрессоре TP (Zhang et al. 2003) и протоонкогене K-ras (Esteller et al. 2000). При этом, как и в случае hMLH1, эпимутация MGMT предшествует появлению мутаций в генах TP53 и K-ras.

Эпигенетическая роль метилирования ДНК в канцерогенезе Общее деметилирование генома. Одним из первых обнаруженных нарушений в опухолевых клетках оказалось снижение общего уровня метилирования геномной ДНК, которое происходит на ранних стадиях прогрессии опухоли (см. обзор Baylin et al. 1998). Возможная связь гипометилирования ДНК с трансформацией клеток показана в экспериментах последующему возникновению опухолей печени (Pogribny et al. 1995).

Однако, несмотря на столь ясную ассоциацию гипометилирования ДНК с канцерогенного эффекта остаются невыясненными. Предполагают существование двух типов последствий деметилирования генома: локальные нарушения, влияющие на активность отдельных генов, и общее изменение, затрагивающее структуру хроматина.

Имеются отдельные наблюдения, свидетельствующие о том, что этот процесс в клетках опухолей человека и животных может изменять характер экспрессии различных генов и специфически активировать отдельные онкогены, в частности K-RAS в карциномах легких и толстого кишечника (см. обзор Baylin et al. 1998). Как и в случае общего деметилирования, эти локальные ген-специфические изменения также происходят на ранних доброкачественных полипах, которые служат предшественниками опухоли.

В тоже время, такого рода изменения в опухолевой клетке не носят общего характера. Четкая взаимосвязь между характером метилирования ДНК и регуляцией экспрессии наблюдается для промоторов, содержащих CpG динуклеотиды, как одиночные, так и в составе CpG-островков. Так как подавляющее большинство CpG-островков в нормальных клетках не метилировано, то, следовательно, мишенью для гипометилирования в опухолевых клетках они быть не могут. Что касается генов с одиночными CpG динуклеотидами в промоторной области, то деметилирование определенных сайтов может способствовать активации гена, но только, если транскрипционный фактор. Именно этим, по всей видимости, объясняется ограниченное количество генов, активированных в опухолях в результате гипометилирования генома.

крупномасштабный может оказывать воздействие на экспрессию генов и функциональном отношении в угнетенное положение (блок транскрипции, поздняя репликация). Тотальное деметилирование может кардинально повлиять на структуру хроматина, степень его конденсации, время репликации, что может повлечь за собой изменения в статусе экспрессии различных генов. О возможности таких нарушений свидетельствует ряд наблюдений. Так, в частности, показано, что гипометилирование генома, обусловленное воздействием деметилирующего агента 5-азацитидина, ведет к трансформации некоторых клеточных культур (Rainier and Feinberg 1988), а также к нарушениям процесса расхождения хромосом во время митоза (см.

обзор Baylin et al. 1998).

динуклеотидов, которые образуют CpG-островки, располагаются, как правило, вблизи регуляторных областей генов и имеют в нормальных клетках неметилированный статус. Исследования последнего десятилетия показали, что инактивация генов супрессоров опухоли, ассоциированная с гиперметилирование промоторной области, является таким же характерным признаком опухолей человека, как и генетические нарушения, и служит альтернативным механизмом потери функции генов супрессоров (Baylin et al.

1998; Herman 1999; Лихтенштейн и Киселева 2001).

Ниже приведена краткая характеристика некоторых генов, инактивация которых в опухолевых клетках происходит во многих случаях путем гиперметилирования регуляторной области.

Ген кальцитонина. Первый ген, для которого было показано, что он имеет в промоторе CpG-островок, гиперметилированный у человека в продемонстрировали, что CpG-островок кальцитонина интенсивно метилирован во многих солидных опухолях человека, при лейкозах и в клеточных линиях, трансформированных различными вирусами (см. обзор Herman 1999). Хотя роль этого гена в процессе канцерогенеза до сих пор остается не выясненной, наблюдаемые в нем изменения характера метилирования инициировали поиски функционально более значимых мишеней аберрантного метилирования CpG-островков.

Ген Rb1. Ген ретинобластомы – первый классический ген-супрессор, у которого обнаружено гиперметилирование CpG-островка. Примерно у 10больных со спорадической формой ретинобластомы происходит гиперметилирование CpG-островка, расположенного в промоторе Rb1. Также показано, что метилирование CpG-островка Rb1 in vitro напрямую блокирует активацию промотора транс-активирующими транскрипционными факторами и значительно снижает уровень экспрессии (Ohtani-Fujita et al.

1993). Также было показано, что метилирование CpG-островка в промоторной области Rb1 наблюдается в тех аденомах гипофиза, клетки которых не экспрессируют pRb (Simpson et al. 2000). Хотя мутации и делеции гена Rb1 отмечают при многих формах рака, гиперметилирование промоторного CpG-островка обнаружено только в ретинобластомах и аденомах гипофиза.

Ген VHL (von Hippel-Lindau). Ген-супрессор, повреждения которого часто регистрируют при светлоклеточной карциноме почек. Примерно в 20% гиперметилирование CpG-островка в промоторе одного аллеля этого гена сочетается с соматическими мутациями или потерей другого аллеля (Herman et al. 1994). Подобно гену Rb1, гиперметилирование CpG-островка VHL наблюдается только в двух типах опухолей, а именно в светлоклеточной карциноме почек и гемангиобластоме, и не обнаруживается в других типах опухолей, включая и другие типы опухоли почки.

блокирующий сигнальный путь cyclin D - Rb. Утрата этого белка или его инактивация ведут к тому, что клетка теряет контроль над клеточным циклом: циклинзависимая киназа фосфорилирует Rb, в результате чего из неактивного комплекса высвобождаются факторы транскрипции Е2F. В итоге активируются гены, обусловливающие вхождение клетки в фазу S клеточного цикла. При этом повреждение данного сигнального пути происходит практически во всех опухолях, путем нарушения функций либо гена р16, либо гена Rb1, но никогда сразу обоих названных генов. Случаи гиперметилирования CpG-островка в 5’-области гена р16 составляют от 20 до 67% солидных опухолей человека разной локализации (см. обзор Baylin et al.

1998).

Локус INK4A/ARF. Кодирует два различных белка (р16 и ARF), которые в качестве супрессоров играют существенную роль в регуляции клеточного цикла. Первый участвует в Rb-сигнальном пути, а второй ингибирует белок MDM2, индуцирующий деградацию р53, и, таким образом, повышает уровень функционального р53. Промотор ARF содержит CpG-островок, который гиперметилирован в клеточных линиях рака толстого кишечника (см. обзор Herman 1999). Кроме того, в промоторе гена ARF, присутствует p53-зависимый элемент, обеспечивающий подавление транскрипции этого гена в ответ на повышение уровня p53. Таким образом, метилирование промотора ARF способно нарушить регуляцию нормального уровня p53.

Ген р15 (INK4В). Расположен вблизи гена р16, обладает высокой гомологией с ним, также является ингибитором циклинзависимой киназы и экспрессируется в ответ на рост-ингибирующее действие TGF-. В отличие от гена р16 гиперметилирование промоторного CpG-островка гена р15 в солидных опухолях – событие редкое, тогда как в гематопоэтических новообразованиях оно становится доминирующим способом инактивации данного гена-супрессора (см. обзор Baylin et al. 1998).

генома» и нарушения в его функционировании идентифицированы не менее чем в половине случаев рака человека. Этот ген не содержит в своей промоторной части CpG-островка, поэтому, вклад метилирования в инактивацию p53 обусловлен не эпигенетическим, как для других генов, а генетическим механизмом. Одиночные метилированные CpG динуклеотиды в значительном числе присутствуют в кодирующей последовательности гена и, в силу гипермутабельности 5-метилцитозина, участвуют в замене пары зарегистрированных в гене p53, принадлежит к этому типу.

Для гена p73 (гомолога p53), содержащего в своей промоторной части свойственны. Гиперметилирование этого гена и ассоциированная с ним потеря экспрессии обнаружены при остром лимфобластном лейкозе и лимфомах (см. обзор Herman 1999).

расположенные на клеточной поверхности и принимающие участие в размножения и дифференцировки, воздействуя на активность ряда генов через сигнальный путь -катенин - транскрипционный фактор Lef/Tcf.

Асcоциация рядом расположенных эпителиальных клеток посредством мостика из молекул Е-кадхерина инициирует анти-ростовой сигнал, направленный внутрь клетки (см. обзор Ровенский 1998). E-cadherin – генсупрессор, инактивация которого способствует приобретению опухолевой клеткой свойств инвазивности и метастазирования. Инактивация транскрипции этого гена обнаружена во многих опухолях человека, при этом в ряде случае оно обусловлено гиперметилированием CpG-островка этого гена, в частности в опухолях молочной железы, желудка, предстательной железы, печени и щитовидной железы (Graff et al. 1995; Herman 1999).

модулирующим клеточный рост и дифференцировку. Функциональная инактивация ER считается главной причиной гормональной резистентности клеток рака молочной железы (Baylin et al. 1998). В промоторной области гена ER имеется CpG-островок, гиперметилирование которого характерно для опухолей молочной железы, не экспресирующих эстрогеновый рецептор (см. обзор Herman 1999). Отмечена четкая ассоциация гиперметилирования CpG-островка гена ER со многими видами опухолей человека, в частности с карциномой толстого кишечника и лейкемиями.

Ген HIC-1 (hypermethylated in cancer) кодирует белок, относящийся к семейству транскрипционных факторов с последовательностью «цинкового пальца». Предположительно является геном-супрессором. Гиперметилирование CpG-островка этого гена отмечено во многих опухолях человека и ассоциировано со снижением его экспрессии. В промоторной зоне HIC- содержится сайт связывания р53, что предполагает его участие в этом сигнальном пути (Baylin et al. 1998).

Ген GST-. Глутатион-S-трансфераза класса относится к группе изоферментов, играющих важную роль в защите клеток от цитотоксических и канцерогенных агентов. Гиперметилирование промоторной зоны гена присутствует в подавляющем числе случаев рака простаты, является причиной потери экспрессии GST- в этих опухолях и представляет собой характерный маркер этой формы опухоли (Lee et al. 1994). Метилирование гена GST- обнаружено также при раке печени (Zhong et al. 2002), молочной железы и почек (Esteller et al. 1998), но очень редко в других опухолях.

Ген BRCA1. Белок, кодируемый этим геном, участвует в репарации повреждений ДНК. Исследования гена-супрессора BRCA1, повреждение которого увеличивает вероятность возникновения рака молочной железы, показало, что при спорадических формах этого рака в данном гене отсутствуют мутации. Это заставило предположить участие метилирования в его инактивации. Действительно, гиперметилирование CpG-островка этого клеточных линиях рака молочной железы, а также в клетках рака яичников. В противоположность гену BRCA1, гиперметилирвание CpG-островка его функционального гомолога BRCA2 в тех же опухолях не обнаружено (см.

обзор Herman 1999).

Ген MLH1. Продукт этого гена участвует в репарации неспаренных оснований, возникающих в результате ошибок ДНК полимеразы.

Инактивация MLH1 ведет к накоплению мутаций в коротких повторяющихся (микросателлитных) последовательностях. Его мутации обнаруживают у больных наследственным неполипозным раком толстой и прямой кишки. В случае спорадической формы этого рака потеря функциональной активности гена MLH1 часто связана с метилированием его CpG-островка. Установлено, что микросателлитная нестабильность при спорадической форме рака толстого кишечника, эндометрия и желудка в большинстве случаев также обусловлена этой причиной (см. обзор Herman 1999).

Ген MGMT кодирует фермент О6-метилгуанин-метилтрансферазу, принимающую участие в репарации ДНК. Ранние работы не обнаруживали взаимосвязи между метилированием и потерей экспрессии данного гена в инактивацией его транскрипции и сопровождается перестройкой структуры хроматина в неактивное состояние (см. обзор Herman 1999). Метилирование регуляторной области MGMT характерно для рака толстого кишечника, легкого, некоторых типов лимфом и опухолей мозга (Esteller et al. 1999), а также для карцином печени (Zhang et al. 2003). У человека показана корреляция между гиперметилированием промотора MGMT и последующим за этим возникновением мутаций (замена G на A) в гене супрессоре опухолевого роста TP53 в опухолях толстого кишечника (Esteller et al. 2001), при раке легкого (Wolf et al. 2001) и печени (Zhang et al. 2003), а также в протоонкогене K-ras в опухолях толстого кишечника (Esteller et al. 2000).

1999). Расположен на хромосоме 17 в зоне 17q21, где при различных формах злокачественных новообразований человека отмечен феномен потери гетерозиготности. Ген экспрессируется в нормальной слизистой толстого кишечника и в клетках костного мозга, но в опухолях толстой и прямой кишки, желудка и при остром миелоидном лейкозе его транскрипция подавлена из-за метилирования CpG-островка. Предполагают, что CACNA1G регулирует потоки кальция в клетке, что имеет непосредственное отношение к клеточной пролиферации и апоптозу.

ангиогенеза, экспрессируется во многих тканях и регулируется продуктами генов ТР53 и RB. Снижение экспрессии гена THBS1 отмечено во многих опухолях, а восстановление его экспрессии в клетках рака молочной железы замедляет рост опухоли, ангиогенез и метастазирование. До сих пор не обнаружено мутаций, делеций или транслокаций этого гена в опухолях человека. Гиперметилирование CpG-островка и сопряженная с ним инактивация THBS1 отмечены в глиомах (Li et al. 1999).

Модуляция активности ДНК-метилтрансфераз. Первоначально считалось, что характерным свойством трансформированных клеток является повышение активности Dnmt1 (см. обзор Baylin et al. 1998). Однако в метилтрансферазы возникает как результат более высокого уровня пролиферации опухолевых клеток. Кроме того, в некоторых типах опухолей метилированием CpG-островков и уровнем мРНК не только DNMT1, но и DNMT3a и DNMT3b (Saito et al. 2001; Oue et al. 2001; Ahluwalia et al. 2001).

Хотя гиперэкспрессия экзогенной DNMT1 может привести к клеточной трансформации (Vertino et al. 1996), в опухоли, по-видимому, происходит нарушение специфичности взаимодействия фермента с ДНК. Это приводит к ошибочному метилированию CpG-островков, неметилированных в изменениями во взаимодействии между Dnmt1 и ее регуляторами, в число которых входят как онкогены, так и гены-супрессоры опухолевого роста.

Так, в экспериментах на культурах клеток показана связь между метилированием ДНК и ras-опосредованными путями передачи митогенных сигналов. Введение в мышиные адренокортикальные опухолевые клетки Y экзогенного негативного регулятора Ras (Gap) приводило, с одной стороны, к снижению уровня мРНК и активности Dnmt1, а с другой - к восстановлению нормального фенотипа. Последующая трансфекция в полученные таким образом ревертанты экзогенного Н-ras повышало уровень экспрессии мРНК и активности фермента и восстанавливало трансформированный фенотип (MacLeod et al. 1995). В экспериментах с клетками, трансформированными коститутивно-экспрессируемым с-fos, продукт которого расположен в цепи передачи сигнала после Ras, установлено, что подавление экспрессии Dnmt или ее активности восстанавливает нормальный фенотип на фоне неизменной экспрессии экзогенного с-fos (Bakin and Curran 1999). Также было установлено, что супрессор опухолевого роста Rb (регулятор клеточного цикла) взаимодействует с DNMT1, модулируя ее активность (Pradhan and Kim 2002). Показано, что при связывании Rb с DNMT продемонстрировано, что ингибитор циклин-зависимых киназ p21WAF1 может конкурировать с DNMT1 за связывание с PCNA в нормальных клетках и принимать, таким образом, опосредованное участие в модуляции активности DNMT1 (Chuang et al. 1997).

В тоже время нарушение регуляции метилтрансферазной активности в опухолевых клетках не ограничивается только DNMT1. Было показано, что одновременно с DNMT1 происходит изменение специфичности также и DNMT3a (Di Croce et al. 2002) или DNMT3b (Rhee et al. 2002). Исследование слитного белка PML-RAR, который является онкогенным транскрипционным фактором, образующимся при острой промиелоцитарной лейкемии (ОПЛ) в взаимодействует с метилтрансферазами DNMT1 и DNMT3a в клеточных линиях, полученных от больных с ОПЛ (Di Croce et al. 2002). С помощью хроматин-иммунопреципитации было продемонстрировано, что DNMT1 и DNMT3a в присутствии и вместе с PML-RAR предпочтительно локализуются в области промотора гена RAR2. Это приводит к метилированию CpGостровка гена RAR2 и инактивации его транскрипции. Таким образом, нарушение нормальной регуляции метилтрансфераз является важным этапом в прогрессии опухоли.

Сравнительный анализ современных методов определения статуса метилирования ДНК в канцерогенезе, различие паттернов метилирования нормальной и опухолевой клеток широко используются для оценки широты распространения аберрантного метилирования в опухолях, для выявления генов, утрата функций которых вносит вклад в развитие опухолей, и для поиска диагностических маркеров опухолей разных типов.

Методы анализа статуса метилирования CpG динуклеотидов.

Применение метилчувствительных эндонуклеаз рестрикции. Для анализа статуса метилирования CpG динуклеотидов, находящихся в сайте являющихся изошизомерами и различающихся по чувствительности к метилированию остатков цитозина (например, пары HpaII и MspI, TaqI и Sau3A, SmaI и ХmaI). В сочетании с гибридизацией методом Саузерна или ПЦР этот способ позволяет установить, метилирован или нет сайт узнавания соответствующих рестриктаз. Применение подхода ограничено тем, что набор соответствующих изошизомеров не затрагивает всех CpGдинуклеотидов, присутствующих в исследуемой последовательности. Тем не менее, этот метод долгое время был единственным, и именно с его помощью абберантно-метилированные гены-супрессоры Rb1 и p16.

Картирование метилированных цитозиновых остатков в известной последовательности ДНК (Clark et al. 1994). Метод основан на превращении всех неметилированных остатков цитозина в остатки урацила в результате обработки ДНК бисульфитом натрия. При этом цепочки ДНК оказываются в участках модификации некомплементарными друг другу. Амплификация исследуемой последовательности с помощью ПЦР и последующее стандартное секвенирование выявляют как цитозин только те цитозиновые остатки, которые в исходной цепочке были метилированы. Преимуществом данного метода является возможность установить статус метилирования каждого CpG динуклеотида в исследуемой последовательности ДНК.

Высокая чувствительность метода позволяет исследовать статус метилирования отдельных генов в раннем эмбриональном развитии (на стадии двух клеток), а также выявлять те динуклеотиды CpG в составе CpGостровков, метилирование которых необходимо и достаточно для подавления транскрипции соответствующего гена (Walsh and Bestor 1999; Warnecke et al.

1998; Cote et al. 1998).

MSP (methylation-specific PCR) – метод, позволяющий оценивать статус метилирования группы близкорасположенных CpG динуклеотидов в составе чувствительность, позволяющая анализировать метилированные аллели в присутствии большого избытка аллелей дикого типа (1 метилированный аллель на 1000 неметилированных; Herman et al. 1996), и возможность быстро проводить анализ большого числа образцов. Как и в предыдущем методе, процедура состоит в предварительной обработке исследуемых ДНК бисульфитом натрия. Для амплификации модифицированной ДНК неметилированные остатки цитозина. Данный метод позволяет проводить составе CpG-островка исследуемого гена в опухолях различной локализации.

цитозиновых остатков в известной последовательности ДНК позволяет инактивации транскрипции определенного гена, то метод MSP можно использовать для быстрого исследования статуса метилирования этих CpG динуклеотидов и, соответственно, функциональной активности соответствующего гена, в различных опухолях.

Методы идентификации CpG-островков, аберрантно-метилированных в MCA (methylated CpG island amplification) – метод, позволяющий избирательно амплифицировать CpG-островки, дифференциально метилированные в нормальных и опухолевых клетках, а затем клонировать и секвенировать их (Toyota et al. 1999). ДНК вначале обрабатывают рестриктазой SmaI (сайт узнавания СССGGG не расщепляется, если он содержит 5-метилцитозин), которая дает фрагменты с “тупыми” концами.

Метилированные сайты СССGGG затем расщепляют нечувствительной к метилированию рестриктазой ХmaI, которая формирует фрагменты с “липкими” концами. Именно последние могут взаимодействовать с адаптерами и быть в последующем амплифицированны. В сочетании с методом репрезентативного дифференциального анализа (RDA) (Lisitsyn et al. 1993) этот подход позволяет избирательно амплифицировать CpGостровки, аберрантно метилированные в опухолевых клетках. Таким способом в клетках рака толстого кишечника были идентифицированы и клонированы 33 последовательности, включая фрагменты известных генов (PAX6, Versican, -tubulin, CSX, OPT и др.).

RLGS (restriction landmark genomic scanning) позволяет одновременно анализировать статус метилирования в геноме нескольких тысяч CpGостровков (Eng et al. 2000; Costello et al. 2000). Суть метода заключается в полученных обработкой геномной ДНК несколькими рестриктазами. Вначале ДНК обрабатывают крупнощепящей рестриктазой NotI, сайты которой предпочтительно располагаются в CpG-островках и которая расщепляет только неметилированные сайты. Затем полученные фрагменты метят по концам радиоактивной меткой, рестрицируют вторым ферментом (например, EcoRV) для уменьшения их размеров и продукты гидролиза разделяют в первом направлении (в капиллярной трубке с агарозным гелем). Разделенные фрагменты NotI/EcoRV обрабатывают in situ (т.е. в геле) еще одной рестриктазой (например, HinfI) для большей фрагментации ДНК, после чего проводят электрофорез в полиакриламидном геле во втором направлении.

Пластину геля авторадиографируют и в результате выявляют множество пятен, положение которых строго определено. По их интенсивности судят о степени метилирования соответствующего CpG-островка. Интенсивность пятна, принятая за нормальную, свидетельствует о неметилированном статусе обоих аллелей, наполовину сниженная – о метилировании одного из аллелей, исчезновение пятна – о метилировании обеих аллелей (соответствующий сайт не расщепляется NotI). Именно этим методом было продемонстрировано широкое распространение аберрантного метилирования CpG-островков во многих типах опухолей.

СП-ПЦР (метилчувствительная ПЦР со статистическими GC-богатыми праймерами) используется для поиска CpG-островков, абберантнометилированных в опухолях (Gonzalgo et al. 1997; Liang et al. 1998).

Достоинством метода является возможность выявления ранее неизвестных CpG-островков. Метод основан на использовании статистических праймеров с GC-богатым 3' концом, амплифицирующих в неспецифических условиях GC-богатые участки генома, включая и CpG-островки. Различие в статусе метилирования фрагментов выявляют с помощью предшествующей амплификации обработки ДНК метилчувствительными рестриктазами. При использовании различных вариантов праймеров этот метод позволяет вести опухолевой тканях GC-богатых последовательностей (подробнее о принципе метода см. в разделе "Результаты").

метилирования ДНК и нарушений этого процесса при канцерогенезе открывают возможности для разработки новых подходов, как для изучения механизмов канцерогенеза, так и для диагностики, мониторинга, прогноза, а возможно и терапии опухолей. В отличие от мутаций, модификация ДНК путем метилирования цитозиновых остатков принципиально обратима, так как не приводит к изменению генетического кода. Метилирование может быть устранено, а функционирование генов восстановлено, хотя бы частично, при обработке опухолевых клеток деметилирующими агентами. В настоящее время ведется разработка подобных веществ. Также в настоящее время проводится поиск маркеров, метилирование которых специфично для опухолей определенного типа. Для некоторых опухолей уже показана возможность обнаружения аберрантно метилированных генов на микроколичествах ДНК, выделенных из слюны, сыворотки и форменных элементов крови, соскобов слизистой ткани высокочувствительными методами, основанными на ПЦР. В связи с этим выявление маркеров метилирования представляется перспективной и важной задачей.

Буфер TBE, 5Х: 0.445 М трис-борат Буфер ТАЕ, 50Х: 2 М трис-ацетат Буфер для ПЦР, 10Х: 0.16 М сульфат аммония Буфер для обратной 250 мМ трис-HCl рН 8. транскрипции, 5Х: 375 мМ KCl серебрения 1: 37% формальдегид 1.5 мл серебрения 2: 37% формальдегид 1.5 мл Раствор для выделения 50 мМ глюкоза Раствор для выделения 0.2 М NaOH (лизирующий):

плазмид 3 ледяная уксусная кислота 11.5 мл (нейтрализующий): Вода 28.5 мл Буфер для нанесения 98% деионизованый формамид ДНК на ПААГ: 0.025% бромфенол голубой Буфер для нанесения 50% глицерин ДНК на агарозный 1 мМ ЭДТА рН 8. "Кислый" силан: -метакрилоксипропилтриметоксисилан Буфер для гибридизации:

Буфер SSPE, 20Х: 3.6 М NaCl прилегающих тканей были получены в отделении радиохирургии РОНЦ им.

Н.Н. Блохина РАМН в результате оперативных вмешательств и любезно предоставлены д.м.н. Нечушкиным М.И. Клинический диагноз был патоморфологии РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН д.м.н. Смирновым А.В.

Морфологически нормальные ткани, прилегающие к опухолевым тканям, не содержали опухолевых клеток по данным гистологических исследований.

Сбор материала и создание банка биопсийного материала осуществляли гуанидинизотиоционатным методом и любезно предоставлена сотрудниками лаборатории молекулярной биологии вирусов Т. Грицко, М. Атталеб и В.

шейки матки, имеющих стадии опухолевой прогрессии Т1а-Т3 и классифицированных согласно критериям ВОЗ. Все исследуемые образцы опухолей шейки матки были позитивны по HPV-16 или HPV-18. Также в работе были использованы клеточные линии рака шейки матки HeLa и SiHa.

3. Выделение ДНК и РНК из клеточных культур.

гомогенизировали 4-5 ударами в гомогенизаторе Даунса. Гомогенат прогревали при 55°С в течение 5 мин, наслаивали на подушку 5.7 М CsCl и центрифугировали при 30 тыс. об/мин при 18°С в течение 18 ч с использованием ротора SW50 (Beckman). После центрифугирования фракцию, несущую клеточную ДНК и находящуюся на поверхности цезиевой "подушки", переносили в стеклянные пробирки, а оставшееся содержимое роторных пробирок сливали. Осадок РНК, находящийся на дне пробирок, растворяли в бидистиллированной воде и переосаждали ацетатом Nа рН 5.0 – этанолом (см. "Материалы и методы", п. 13).

К фракции ДНК добавляли 4 объема буфера 1Х STE – 1% SDS. Затем добавляли равный объем смеси хлороформ – изоамиловый спирт (24:1) и экстрагировали ДНК 5 мин. После разделения фаз центрифугированием отбирали верхнюю фазу и процедуру повторяли. Затем ДНК осаждали объемами этанола и центрифугировали при 20 тыс. об/мин при 4°С. Осадок ДНК промывали 75% этанолом на 1Х STE, высушивали и растворяли в бидистиллированной воде.

Лейкоцитарную массу суспендировали в буфере LST. Добавляли равный объем 4Х TNLB, осторожно перемешивали и центрифугировали при тыс. об/мин в течение 10 мин. Осадок дважды промывали буфером LST – сахароза. Затем к осадку добавляли буфер TNE – 1% SDS и протеиназу К в конечной концентрации 100 мкг/мл. Инкубировали в течение ночи при 50°С.

Затем добавляли равный объем смеси хлороформ – изоамиловый спирт (24:1) отбирали верхнюю фазу и процедуру повторяли. Затем ДНК осаждали объемами этанола и центрифугировали при 13 тыс. об/мин при 4°С. Осадок ДНК промывали 75% этанолом на 1Х STE, просушивали и растворяли в бидистиллированной воде.

Для рестрикции геномной ДНК мы использовали два типа эндонуклеаз рестрикции (далее рестриктазы – табл.1). На первом этапе определенное количество ДНК из нормальной и опухолевой тканей инкубировали с рестриктазой, не содержащей в составе своего сайта рестрикции CpG динуклеотиды. Затем отбирали половину или одну треть обработанной таким образом ДНК и добавляли к ней рестриктазу, чувствительную к статусу метилирования CpG динуклеотидов в составе своего сайта рестрикции. В дальнейшем аликвоту рестрицированной ДНК использовали в реакции амплификации. Все рестриктазы использовали с 5 кратным избытком (1 мкг ДНК – 5 ед. фермента) и инкубировали с ДНК в течение 14-16 ч. В случае метилчувствительных рестриктаз обработку проводили в два этапа, с добавлением на втором этапе половины первоначального количества фермента и инкубированием в течение 3-4 ч.

* - Россия. ** - Литва.

превращением последнего в урацил. В тоже время 5-метилцитозин при тех же условиях модификации не подвергается. В дальнейшем производится амплификация исследуемой последовательности ДНК с помощью ПЦР. При этом все остатки урацила и тимина амплифицируются как тимин и только 5метилцитозин воспроизводится как цитозин (Olek et al. 1996).

200 нг геномной ДНК выдерживали 5 мин в кипящей водяной бане, после чего охлаждали во льду. Добавляли раствор NaOH до конечной концентрации 0,3 М и инкубировали при 50оС 15 мин. Затем вносили объема 2% низкоплавкой агарозы (“Sigma”, США) и всю смесь переносили в пробирку с холодным минеральным маслом для формирования агарозной "бусины". После этого добавляли раствор Na2S2O3 и гидрохинона до конечной концентрации 3.1 М и 0.5 мМ соответственно и инкубировали при 50оС 16 ч. Дальше промывали раствором 1Х TAE 6 раз по 15 мин. Вслед за тем проводили десульфонацию раствором 0,2 М NaOH 2 раза по 15 мин и бидистиллированой водой 3 раза по 15 мин. Дальше «бусину» разводили нагреванием бидистиллированой водой в 10 раз и аликвоту использовали для ПЦР.

При выборе праймеров, для повышения специфичности ПЦР, необходимо следовать некоторым требованиям. Так, длина праймера должна быть от 18 до 40 нуклеотидов в зависимости от назначения. Следует избегать появления вторичных структур в праймере и более трех-четырех одинаковых нуклеотидов подряд. Используемые в одной реакции праймеры не должны иметь комплементарных участков. Для оценки структуры праймеров мы Состав праймеров, использованных в данной работе, приведен в таблице 2.

Температура отжига определяет жесткость условий гибридизации праймеров с мишенью и, следовательно, специфичность амплификации; она оценки температуры отжига мы использовали следующую формулу:

Точное значение температуры подбирали экспериментальным путем, используя температурный градиент.

7.2. Метилчувствительная ПЦР со статистическими GC-богатыми Обработанную метилчувствительными рестриктазами геномную ДНК (50-100 нг) амплифицировали методом ПЦР с использованием как одного статистического GC-богатого праймера, так и в случае СП-2 и СП-3 их комбинации. Использованные в нашей работе статистические GC-богатые праймеры приведены в табл. 2. Реакцию проводили в конечном объеме мкл в следующих условиях: 1X буфер для ПЦР, 1.5 мМ MgCl2, 200 мкМ каждого из четырех дезоксинуклеотид-трифосфатов, 25 пмоль праймера и ед. акт. Taq ДНК-полимеразы ("НИИ Биоорганической химии", Россия). В случае радиоактивного мечения продуктов ПЦР в реакцию добавляли 2 мкКи -33P-dATP. Первые 5 циклов реакции проходили в «мягком» режиме: 94oC 30 сек, 40оC 60 сек, 72оC 90 сек. В течение следующих 30 циклов амплификацию проводили в специфическом соответствующая для данного праймера tотж (см. табл. 2) 15 сек, 72оC 60 сек (Gonzalgo et al., 1997). Продукты ПЦР анализировали в высокоразрешающем 5% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях. ДНК выявляли методом серебрения, если не проводили мечения продукта ПЦР (см. п. 8.3.), или экспонированием геля с рентгеновской пленкой в течение 14 дней.

амплифицировали с использованием соответствующего праймера. Реакцию проводили в специфических условиях описанных выше. ПЦР осуществляли в течение 30 циклов в следующем режиме: 94оC 30 сек, соответствующая для праймера tотж (см. табл. 2) 30 сек, 72оC 60-180 сек. Время элонгации определялось размером амплифицируемого фрагмента ДНК. В ряде случаев Качественную и количественную оценку продукта ПЦР проводили методом электрофореза в агарозном геле, сравнивая с известным количеством ДНКмаркера PstI. Для клонирования использовали аликвоту продукта ПЦР без предварительной очистки.

7.3. Метилчувствительная ПЦР со специфическими праймерами.

Обработанную метилчувствительными рестриктазами геномную ДНК (50-100 нг) амплифицировали с использованием ген-специфических праймеров (табл. 2). Реакцию проводили в конечном объеме 25 мкл в следующих условиях: 1Х буфер для ПЦР, 2 мМ MgCl2, 200 мкМ каждого из четырех дезоксинуклеотид-трифосфатов, 10 пмоль каждого праймера и 1 ед.

акт. Taq ДНК-полимеразы ("НИИ Биоорганической химии", Россия).

соответствующая для пары праймеров tотж (см. табл. 2) 30 сек, 72оC 40-60 сек, - 30-35 циклов. В случае праймеров к гену 3A-адаптина реакцию проводили в присутствии 5% формамида. Выявление продуктов ПЦР проводили методом электрофореза в агарозном геле.

Метилспецифическую ПЦР проводили в два этапа по принципу модификации амплифицировали с использованием праймеров adpt-bis-1 и adpt-bis-3 в конечном объеме 50 мкл в следующих условиях: 1Х буфер для ПЦР, 2 мМ MgCl2, 200 мкМ каждого из четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, 10 пмоль каждого праймера и 1 ед. акт. Taq ДНК-полимеразы ("НИИ Биоорганической химии", Россия). Амплификация проходила в следующем режиме: 94оC 30 сек, 50оC 60 сек, 72оC 90 сек, - 35 циклов. На втором этапе использовали аликвоту амплификата из первой ПЦР, неразведенной или разведенной бидистилированной водой в соотношении 1:10. Также заменяли праймер adpt-bis-1 на праймер adp-bis-2. Реакцию проводили в конечном объеме 50 мкл в описанных выше условиях.

72оC 60 сек, - 30 циклов. Продукты ПЦР анализировали с помощью соответствующего размера, проводили его выделение из агарозы.

Количественную оценку очищенного продукта ПЦР осуществляли методом электрофореза в агарозном геле, сравнивая с известным количеством ДНКмаркера PstI. Определение нуклеотидной последовательности исследуемого продукта ПЦР проводилось на автоматическом сиквенаторе в институте Молекулярной биологии им. Энгельгардта, Россия.

8.1. Выделение продуктов ПЦР из полиакриламидного геля.

Отобранные для клонирования фрагменты ДНК вырезали из геля. К ним добавляли 25 мкл буфера для элюции ДНК из ПААГ и инкубировали мин при 37оС. Затем смесь несколько раз замораживали и оттаивали.

Инкубировали в течение ночи при 37оС, центрифугировали при 13 тыс.

об/мин 5 мин, отбирали супернатант и переосаждали с использованием 3М ацетата натрия – 96% этанола (см. "Материалы и методы", п. 13). Осадок специальной мембраны.

8.2. Выделение продуктов ПЦР из агарозного геля.

Выделение продуктов ПЦР после электрофореза проводили из 1% легкоплавкой агарозы ("Sigma", США) с помощью системы Wizard® PCR Preps DNA Purification System ("Promega", США) по методике, предложенной фирмой.

Для клонирования продуктов ПЦР мы использовали плазмиду pGEM®pGEM®-T Easy Vector System T Easy, входящую в состав системы (“Promega”, США). Так как некоторые термостабильные ДНК-полимеразы, в одиночный дезоксиаденозин, то вектор pGEM®-T Easy содержит в сайте клонирования на обоих 3' концах исскуствено добавленный одиночный концевой тимидин. Эта модификация позволяет значительно увеличить эффективность лигирования продукта ПЦР и плазмиды, поскольку обеспечивает комплементарность концов продукта ПЦР и плазмиды и снижает вероятность самолигирования вектора. Отбор трансформированных клонов вели по их резистентности к ампицилину, обеспечиваемой вектором pGEM®-T Easy, и с помощью биохимического теста, именуемого белоголубой селекцией. Несущие рекомбинантные плазмиды бактерии образуют колонии белого цвета, а бактериальные клоны, содержащие только плазмиду, – голубого. Полилинкер фланкируют промоторы T7 и SP6 РНК полимераз, что позволяет проводить определение нуклеотидной последовательности вставки, используя соответствующие праймеры.

Лигирование фрагмента ДНК, полученного в результате ПЦР, с вектором pGEM®-T Easy проводили по методике, предложенной фирмой.

Трансформацию компетентных клеток проводили всем количеством полученной рекомбинантной плазмиды.

9.2. Получение компетентных клеток Escherichia coli.

Для получения компетентных клеток мы использовали штамм XL1Blue Escherichia coli и стандартный метод с применением CaCl2 и RbCl (под ред. Гловера 1988).

В 500 мл колбу вносили 50 мл среды SOС и 1 мл ночной культуры бактерий. Наращивали клетки при 37оС с интенсивным перемешиванием до плотности ~5·107 клетка/мл, что для данного штамма соответствует оптической плотности D550 = 0.5. После достижения бактериальными клетками необходимой концентрации переносили культуру в полипропиленовые пробирки и охлаждали в ледяной бане в течение 15 мин.

Затем осаждали клетки центрифугированием при 3 тыс. об/мин в течение мин при 4оС и тщательно удаляли супернатант. Далее ресуспендировали инкубировали клетки в ледяной бане в течение 15 мин. Осаждали клетки как описано выше. Потом ресуспендировали клетки в буфере RF2 (1/12. исходного объема) и инкубировали в ледяной бане в течение 15 мин. После этого суспензию клеток разделяли на аликвоты по 100 мкл в охлажденные 1.5 мл микроцентрифужные пробирки и быстро замораживали в жидком азоте. Компетентные клетки хранили при температуре -70оС.

9.3. Трансформация клеток Escherichia coli.

100 мкл суспензии компетентных клеток размораживали в ледяной бане, вносили рекомбинантную ДНК, осторожно перемешивали и оставляли в ледяной бане в течение 30 мин. Затем клетки выдерживали в водяной бане при 42oС в течение 90 сек (фаза "теплового шока") и быстро охлаждали в ледяной бане в течение 10 мин. Затем к суспензии клеток добавляли 400 мкл среды SOC и инкубировали при 37оС в течение одного часа для развития устойчивости к селективному антибиотику. Затем клетки высаживали на чашки Петри с 3.5% триптоз-агаром ("Ferak", Германия), содержащим антибиотик ампицилин в концентрации 75 мкг/мл, IPTG (0.8 мг на поверхность 60 мм чашки) и X-gal (0.8 мг на поверхность 60 мм чашки).

После этого клетки инкубировали в течение ночи при 37оС. Бактериальные клоны, несущие рекомбинантные плазмиды, отбирали методом бело-голубой селекции. Отобранные клоны высевали в 4 мл среды LB, содержащей ампицилин в концентрации 50 мкг/мл, инкубировали при 37оС в течение ночи и выделяли из бактериальных клеток рекомбинантные плазмиды.

Аналитические количества плазмидной ДНК выделяли двумя способами:

Первый способ представляет собой метод щелочного лизиса ночной культуры бактерий (Маниатис с соавт., 1988). После осаждения бактерий из мл среды LB центрифугированием в течение 1 мин осадок ресуспендировали встряхиванием в 300 мкл охлажденного во льду раствора 1 для выделения добавляли 600 мкл свежеприготовленного раствора 2 (лизирующего) и осторожно перемешивали содержимое, переворачивая пробирку 4-5 раз без встряхивания. Выдерживали в ледяной бане в течение 5 мин. Далее добавляли 450 мкл охлажденного во льду раствора 3 (нейтрализующего) и осторожно перемешивали содержимое, переворачивая пробирку 4-5 раз без встряхивания. Инкубировали в ледяной бане в течение 5 мин. После этого центрифугировали при 13 тыс. об/мин в течение 5 мин при 4оС. Переносили надосадочную жидкость и добавляли к ней равный объем смеси фенолхлороформ. Перемешивали в течение 2 мин интенсивным встряхиванием и центрифугировали в течение 2 мин. Затем к супернатанту добавляли равный объем хлороформа и повторяли процедуру. Далее осаждали ДНК двумя объемами этанола, выдержав в течение 5 мин при комнатной температуре, и центрифугировали при 13 тыс. об/мин в течение 10 мин при 4оС. Осадок промывали 75% этанолом на 1X STE, высушивали в вакуумном эксикаторе, растворяли в 50 мкл буфера ТЕ и обрабатывали РНКазой 20 мкг/мл.

Второй способ представляет собой использование системы для выделения плазмид Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System ("Promega", США). Выделение проводили по протоколу, предложенному фирмой.

спектрофотометрически. Сиквенс клонированного продукта ПЦР в составе вектора проводился на автоматическом сиквенаторе в институте Молекулярной биологии им. Энгельгардта, Россия.

10.1. Электрофоретическое разделение ДНК в агарозном геле.

Разделение ДНК проводили в горизонтальном агарозном геле в 1X ТАЕ в присутствии бромистого этидия. Геномную ДНК после обработки метилчувствительными рестриктазами и плазмидную ДНК фракционировали в 0.8% агарозе; фрагменты ДНК, полученные в результате ПЦР, в зависимости ("Sigma", США; "Serva", США) и буфера ТАЕ нагревали в дистиллированной воде до полного расплавления агарозы. После этого раствор агарозы концентрации 0.5 мкг/мл, перемешивали и заливали в кювету для геля.

Образцы исследуемой и маркерной ДНК наносили в гель, предварительно смешав с буфером для нанесения (9:1, о/о). В качестве ДНК-маркера применяли Hind III, PstI и 100bp (табл. 3). Электрофорез геномной ДНК 3-4 В/см в течение ночи. В дальнейшем фракционированную геномную ДНК переносили на нейлоновую мембрану и использовали в блот-гибридизации.

напряженности электрического поля 10-15 В/см в течение 30-45 мин. ДНК в геле регистрировали по флуоресценции в проходящем ультрафиолете с длиной волн от 240 нм до 360 нм. Результаты протоколировали с помощью фотографирования геля или системы Gel Imagertm.

10.2. Электрофоретическое разделение РНК в агарозном геле.

Разделение РНК проводили в горизонтальном 0.8% агарозном геле в 2X BE в присутствии формальдегида и бромистого этидия. Для получения геля соответствующее количество агарозы ("Sigma", США) и буфера ВЕ нагревали в небольшом количестве дистиллированной воды до полного расплавления агарозы. Затем добавляли 1/6 конечного объема 37% раствора дистиллированную воду, перемешивали и заливали в кювету для геля. Перед нанесением образцы исследуемой РНК переосаждали с использованием 3М ацетата натрия – 96% этанола (см. п. 13) и растворяли в 20 мкл смеси, бидистиллированную воду. Затем пробы инкубировали при 55оС в течение мин, охлаждали в ледяной бане в течение 5 мин и наносили в гель, предварительно смешав с буфером для нанесения (9:1, о/о). Электрофорез проводили при напряженности электрического поля 3-4 В/см в течение 3-4 ч.

Результаты протоколировали с помощью фотографирования геля. В дальнейшем фракционированную РНК переносили на нитроцеллюлозную мембрану и использовали в блот-гибридизации.

10.3. Электрофорез ПЦР-амплифицированной ДНК в денатурирующем электрофоретический прибор Sequi-Gen ("Bio-Rad", США). В качестве электрофоретического буфера использовали 1Х ТВЕ.

Для связывания геля со стеклом, одно из стекол обрабатывали "кислым" силаном (acid activated silane). Другое стекло силиконизировали диметилхлорсиланом (repel silane). Для получения геля готовили 75 мл смеси, следующего состава: 9.375 мл 40% раствора акриламид-бисакриламид (соотношение акриламид-бисакриламид 19:1), 15 мл 5Х ТВЕ, 31.5 г мочевины и дистиллированная вода до необходимого объема. Затем добавляли 300 мкл ПСА и 60 мкл TEMED, тщательно перемешивали и заливали в прибор для полимеризации. Перед нанесением проб на гель проводили префорез при напряженности электрического поля 45 В/см в течение 1 ч.

Пробы для электрофореза в ПААГ готовили следующим образом: мкл исследуемого продукта ПЦР смешивали с 6 мкл буфера для нанесения в ПААГ. Далее пробы прогревали при 100оС в течение 5 мин, охлаждали в ледяной бане, брали аликвоту 4 мкл и наносили на гель. Электрофорез 40-50 В/см (в зависимости от температуры геля).

По окончании электрофореза гель оставался на стекле, обработанным "кислым" силаном и его фиксировали в 10% уксусной кислоте в течение мин. После фиксации гель отмывали 3 раза дистиллированной водой по мин каждый раз. Затем проводили окраску раствором 1 для серебрения в течение 30 мин, промывали 20 сек дистиллированной водой и проявляли раствором 2 для серебрения в течение 1-5 мин (до появления окраски ДНК).

Затем реакцию останавливали фиксацией в 10% уксусной кислоте в течение 5 мин и промывали водой. Результаты протоколировали с помощью сканера Mustek 1200SP.

После окончания электрофореза в случае геномной ДНК агарозный гель выдерживали в денатурирующем растворе 1.5 М NaCl – 0.5 M NaOH в течение 30 мин с периодическим покачиванием. Затем нейтрализовали в растворе 0.5 М Tris-HCl pH 8.0 – 1.5 M NaCl в течение 1 часа с постоянным покачиванием. В случае продуктов ПЦР предварительной обработки геля не проводили. После этого на ДНК-содержащую область геля накладывали нейлоновый фильтр Hybond N+ ("Amersham", UK), смоченный в 20X SSC.

Сверху помещали 5-6 см слой фильтровальной бумаги и груз до 200 г.

Перенос осуществляли в присутствии 20X SSC в течение ночи. ДНК фиксировали на нейлоновой мембране при 80оС в течение часа.

11.2. Перенос РНК на нитроцеллюлозную мембрану.

После окончания электрофореза на РНК-содержащую область геля накладывали нитроцеллюлозный фильтр Hybond C-extra ("Amersham", UK), смоченный в 20X SCC. Сверху помещали 5-6 см слой фильтровальной бумаги и груз до 200 г. Перенос осуществляли в присутствии 20X SSC в течение ночи. РНК фиксировали на нитроцеллюлозной мембране при 80оС в течение часа под вакуумом.

Детекцию исследуемых последовательностей проводили с помощью гибридизации с радиоактивно-меченным зондом. Для получения меченого зонда реакционная смесь (12 мкл) содержала 12 нг ДНК, 10 пмоль гексапраймера, 1.2 мкл 10X буфера, 0.5 М смесь нуклеотидов dTTP, dCTP и dGTP, 12.5 мкКи -32P-dATP (Обнинск, Россия), и 3 ед. акт. ДНК-полимеразы Кленова ("Fermentas", Литва). Смесь ДНК – гексапраймер предварительно выдерживали в кипящей водяной бане в течение 5 мин, затем быстро охлаждали на льду и добавляли остальные компоненты реакционной смеси.

Реакцию синтеза проводили в течение 1 час при 37оС. Очистку радиоактивно-меченного зонда от свободного -32P-dATP проводили на мини-колонке с Sephadex G50 fine, уравновешенной 1X буфером STE с использованием в качестве маркера молекулярного веса Dextran blue.

Активность зонда определяли с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика. Для гибридизации использовали зонд с удельной активностью 108 имп/(минмкг).

11.4. Гибридизация ДНК (РНК), иммобилизованной на мембране.

Предгибридизацию мембраны с перенесенной ДНК (РНК) проводили с использованием гибридизационного буфера при 42 оС в течение 1 час.

Гибридизацию проводили в свежем гибридизационном буфере, содержащим радиоактивномеченный зонд из расчета 2 млн. имп. на 1 мл, в течение ночи при 42 оС. Далее мембрану отмывали от непрореагировавшего зонда с помощью стандартного раствора (2X SSC, 0.1% SDS) 1 раз 10 мин при комнатной температуре и 3 раза по 20 мин при 60оС. При необходимости отмывку проводили раствором 1X SSC – 0.5% SDS, а затем раствором 0.1X SSC – 5% SDS. Степень отмывки тестировали с помощью счетчика -частиц "Эксперт", затем фильтр экспонировали с рентгеновской пленкой в кассете с усиливающими экранами при -70 С. Продолжительность экспозиции составляла от нескольких часов до суток для продуктов ПЦР и от 10 до дней в случае РНК и геномной ДНК.

Для обратной транскрипции использовали 1 мкг тотальной клеточной РНК. Реакцию проводили в конечном объеме 20 мкл в следующих условиях:

1Х буфер для обратной транскрипции, 0.01 М дитиотрейтол, 0.5 мМ каждого из четырех дезоксинуклеотид-трифосфатов, 10 пмоль гексапраймера и ед. акт. обратной транскриптазы Superscripttm II RnaseH– ("GibcoBRL", США).

Первоначально смесь РНК и гексапраймера в соответствующем объеме прогревали при 70оС в течение 10 мин. Затем охлаждали в ледяной бане и добавляли оставшиеся компоненты. Реакционную смесь выдерживали при 25оС в течение 10 мин для удлинения праймера и проводили основную реакцию обратной транскрипции при 42оС в течение 1 ч. Реакционную смесь прогревали при 70оС в течение 15 мин для инактивации фермента и разводили бидистилированной водой до конечного объема 100 мкл.

Полученную кДНК в количествах подобранных экспериментальным путем использовали в полуколичественной ПЦР со специфическими праймерами.

Условия проведения ПЦР описаны в п. 5.3.

Для переосаждения к раствору ДНК (РНК) добавляли 0.1 объема 3 М ацетата натрия рН 5.0 и 3 объема 96% этанола, тщательно перемешивали и –20оС в течение 20 мин. Затем центрифугировали при 13 тыс. об/мин в течение 5-15 мин при 4оС. Осадок ДНК (РНК) промывали 75% этанолом на 1Х STE, высушивали под вакуумом и использовали в дальнейшей работе.

14. Анализ нуклеотидных последовательностей.

Поиск нуклеотидных последовательностей, гомологичных выявленным фрагментам ДНК, проводили с помощью BLAST® (Basic Local Alignment Search Tool) – набора компьютерных программ поиска гомологий, разработанных для быстрого анализа всех доступных баз данных последовательностей, каковыми являются Genbank, EMBL, DDBJ и PDB.

При использовании программ оставляли предложенные их разработчиками параметры поиска.

При анализе CpG-островка используют три основных критерия:

распределение CpG динуклеотида по нуклеотидной последовательности, GC состав и длина последовательности. Для оценки распределения CpG динуклеотида вычисляется показатель Н/Т по следующей формуле:

где H – наблюдаемое число CpG динуклеотидов; T – теоретическое число CpG динуклеотидов; n – число CpG в последовательности; N – общее число нуклеотидов в последовательности; NC – число остатков цитозина; NG - число остатков гуанина. Для CpG островков этот показатель 0.6. Характерной особенностью CpG островков является так же повышенный GC состав, который определяется как доля цитозиновых и гуаниновых нуклеотидов в составе последовательности. Для CpG островков данный показатель превышает 0.5. Длина CpG-островка колеблется от 200 н.п. до нескольких тысяч, составляя в среднем 1 т.н.п.

При анализе нуклеотидной последовательности на наличие CpGостровка использовалась компьютерная программа предсказания CpGостровков – WWWCPG program (http://l25.itba.mi.cnr.it/cgi-bin/wwwcpg.pl). В данной программе использовались следующие критерии CpG-островков:

длина более 200 п.н., GC состав > 0.5, показатель Н/Т > 0.6 (Gardiner-Garden and Frommer 1987). Наличие повторов в последовательности ДНК определяли с помощью компьютерной программы обнаружения повторов REPEAT (http://l25.itba.mi.cnr.it/cgi-bin/wwwrepeat.pl).

1. Поиск CpG-островков, гиперметилированных в опухолях шейки матки 1.1. Принцип метода метилчувствительной ПЦР со статистическими GCбогатыми праймерами.

Задачей нашего исследования было обнаружение CpG-островков, метилированных в опухолях шейки матки. Для ее решения мы использовали праймерами (СП-ПЦР) (Gonsalgo et al. 1997). Принцип метода заключается в следующем. ДНК из двух сравниваемых образцов (в нашем случае из морфологически нормальной ткани, взятых от одного и того же пациента) обрабатывали мелкощепящей рестрикционной эндонуклеазой (рис. 5А), в

А. НОРМА ДНК ОПУХОЛЬ

5’- AACCCTCACCCTAACCCGCG-3’ Рисунок 5. Схематическое изображение метода метил-чувствительной ПЦР со статистическими GC-богатыми праймерами. Кружком обозначен сайт МЧР: - сайт не метилирован, - сайт метилирован. А. Схема эксперимента; – статистический GCбогатый праймер. Б. Присоединение статистического праймера к CpG-богатому району ДНК. Вертикальными черточками обозначены CpG динуклеотиды. Стрелки указывают направление синтеза ДНК.

использовали ферменты RsaI и MseI. Их применение позволяет получить CpG-островки в составе сравнительно небольших фрагментов геномной ДНК. Это повышает вероятность последующей амплификации CpGостровков, так как небольшие GC-богатые фрагменты ДНК амплифицируются лучше, чем крупные. В тоже время большинство CpGостровков остаются после обработки такими рестриктазами неповрежденными. Затем обработанную ДНК снова подвергали рестрикции, но уже с использованием так называемых метилчувствительных рестриктаз (МЧР), отличительной чертой которых является два свойства. Во-первых, такие ферменты имеют в составе своих сайтов рестрикции один и более CpG динуклеотидов, поэтому CpG-островки содержат повышенное количество сайтов этих рестриктаз по сравнению с остальной ДНК. Во-вторых, МЧР работают в зависимости от статуса метилирования определенного CpG динуклеотида в сайте рестрикции. Так, они не способны рестрицировать свой сайт, если цитозин в составе этого CpG динуклеотида метилирован. Именно это свойство МЧР позволяет проводить дифференциальный анализ статуса метилирования CpG-островка. Таким образом, использование МЧР с одной стороны повышает вероятность обнаружения именно CpG-островка, а с другой определить его статус метилирования.

Далее все варианты обработанных рестриктазами ДНК из опухолевой и нормальной ткани амплифицировали с использованием статистических GCбогатых праймеров. Эти праймеры представляют собой олигонуклеотиды, подобранные к среднестатистической последовательности ДНК, за исключением 3' конца, который состоит из 5-6 остатков цитозина и гуанина в различной комбинации (обычно расположенных случайным образом, но могут представлять собой и последовательность сайта какой-нибудь МЧР, например SacII в праймере СП-2). Наличие такого 3' конца приводит к тому, что в неспецифических условиях (при достаточно низких температурах отжига) происходит предпочтительная гибридизация праймера с GCбогатыми областями ДНК (рис. 5Б). Так достигают обогащения продуктов ПЦР фракцией GC-богатых последовательностей, включающей также и CpGостровки.

После амплификации ПЦР продукты разделяли в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях. Для детекции продуктов мы использовали два метода. Первый является стандартным и подразумевает применение меченого нуклеотида при проведении ПЦР. Мы использовали -33P-dATP. В дальнейшем, после разделения, продукты выявляли, экспонируя гель с рентгеновской пленкой. Альтернативным методом идентификации является серебрение фрагментов ДНК непосредственно в полиакриламидном геле (реакция серебряного зеркала). Несмотря на более низкую чувствительность по сравнению с первым методом, он позволяет эффективно выявлять относительно длинные продукты реакции (300-1000 п.н.). На рисунке

Л О Л О Л О Л О Л О

M HM H MH MH MHMH MH MH MH MH

Рисунок 6. Сравнение двух методов визуализации продуктов ПЦР в ПААГе. А.

Радиоавтограф ПААГ с радиоактивномеченными продуктами ПЦР. Б. Серебрение фрагментов ДНК непосредственно в ПААГе. Стрелкой указан фрагмент, взятый в дальнейшее исследование. Числа вверху рисунка обозначают номера образцов, где Л – ДНК из лейкоцитов, О – ДНК из опухоли шейки матки. Рестрикция образцов ДНК MseI (M); MseI/HpaII/HhaI (H).

представлены результаты типичного опыта по сравнению двух способов визуализации продуктов ПЦР в полиакриламидном геле. Стрелкой указан один и тот же фрагмент, выявленный как серебрением, так и при помощи радиоактивной метки. Таким образом, метод серебрения позволял нам что, согласно общепринятым критериям (Gardiner-Gardner and Frommer 1987), соответствует размерам CpG-островков. В случае продуктов короче 300 п.н. радиоизотопный метод более чувствителен, чем серебрение.

Основными преимуществами метода СП-ПЦР являются простота выполнения и относительная дешевизна. К главным недостаткам метода последовательности, не все из которых представляют собой CpG-островки.

Причиной этому служат праймеры, которые не могут дифференцировать CpG-островки и амплифицируют все GC-богатые последовательности.

Поэтому нами были внесены модификации, повышающие вероятность обнаружения CpG-островков. Известно, что скопление сайтов редкощепящих МЧР указывает на присутствие CpG-островка (Bird 1986). В связи с этим использование одновременно нескольких крупнощепящих ферментов метилчувствительной рестрикции повышает вероятность идентификации CpG-островка. Поэтому, наряду с обычно применяемыми мелкощепящими метилчувствительными эндонуклеазами (HpaII, HhaI) мы использовали крупнощепящие ферменты (SmaI, SacII, NarI). При этом недостатком использования МЧР является возможность неполного расщепления сайта рестрикции. Хотя для решения этой проблемы мы применяли двухэтапную обработку ДНК МЧР (см. раздел "Материалы и методы", п. 5), подтверждение статуса метилирования выявленных фрагментов требует дополнительных исследований.

Обычно при сравнительном анализе ДНК из опухолевых и нормальных клеток методом МЧ-ПЦР со статистическими GC-богатыми праймерами в геле присутствуют три типа продуктов ПЦР (рис. 7).

Первый тип продуктов присутствует в ДНК, как нормальных тканей, метилчувствительными ферментами или нет. В этом случае возможны два варианта. Либо амплифицируемые фрагменты ДНК не содержат сайтов метилированы во всех исследуемых ДНК. Такие продукты ПЦР встречаются наиболее часто. Второй тип продуктов присутствует в ДНК, необработанных метилчувствительными рестриктазами, и отсутствует в ДНК, обработанных ими, независимо от того из опухолей или нормальной ткани они выделены.

последовательностях есть неметилированные сайты узнавания, которые расщепляются рестриктазами, и, следовательно, предотвращается появление продуктов ПЦР. Эти последовательности наиболее вероятные кандидаты на роль CpG-островков. Они встречаются гораздо реже продуктов первого типа.

И, наконец, существует третий тип продуктов, отсутствующий в ДНК из нормальных клеток и присутствующий в ДНК из некоторых опухолей.

Причем данное различие существует только для ДНК, обработанных метилчувствительными рестриктазами. В этом случае сайты узнавания в амплифицируемых последовательностях есть, но они метилированы в некоторых опухолях в отличие от нормальных тканей. Такие продукты ПЦР метилирование только в опухоли, эти фрагменты, в сущности, и являются предметом поиска и дальнейших исследований.

ДНК-матрица продукт ПЦР Рисунок 7. Схема типов продуктов ПЦР со статистическими GC-богатыми праймерами, встречающиеся в ПААГе. МЧР – метилчувствительная рестриктаза; Н – прилегающая нормальная ткань, О – опухоль. Кружком обозначен сайт МЧР: - сайт не метилирован, - сайт метилирован.

Типичный результат сравнительного анализа ДНК из опухолевых и нормальных клеток методом МЧ-ПЦР со статистическими GC-богатыми праймерами представлен на рисунке 8. Здесь видно, что большинство четко являются продуктами первого и второго типа (отмечены стрелками). Также можно заметить, что продукты первого типа встречаются чаще, чем второго.

Примеры продуктов третьего типа представлены на рисунке 9.

Н О Н О Н О Н О Н О Н О

R N R NR N R N R N R N R NR NR N R N R N RN

Рисунок 8. Анализ продуктов амплификации ДНК из опухолевых и нормальных клеток с помощью СП-ПЦР со статистическими GC-богатыми праймерами СП-2 и СП-3.

Фотография геля с продуктами ПЦР, окрашенных серебрением. Числами вверху рисунка обозначены номера образцов, где Н – ДНК из нормального эпителия; О – ДНК из опухоли продукт ПЦР первого типа; – продукт ПЦР второго типа. Числами справа указаны размеры маркерных фрагментов.

- 63 Таким образом, при отборе фрагментов ДНК, как вероятных CpGостровков, мы руководствовались следующими критериями. Во-первых, в составе фрагмента должны присутствовать сайты, по меньшей мере, одной метилчувствительной рестриктазы, что определяется по отсутствию продукта в рестрицированной ДНК из нормальной ткани. И, во-вторых, он должен быть метилированным в двух и более опухолях.

Н О Л О Л О

RN S RNS M HM H MHM H

Рисунок 9. Анализ фрагментов ДНК, метилированных в опухолях шейки матки.

Результаты ПААГ-электрофореза продуктов амплификации образцов ДНК из опухолевых, статистических GC-богатых праймеров. А – фрагмент 26; Б – фрагмент 36; В – фрагмент 22. Вертикальными стрелками указаны продукты ПЦР третьего типа. Числа вверху рисунка обозначают номера образцов, где Н – ДНК из нормальной ткани, Л – ДНК из лейкоцитов, О – ДНК из опухоли шейки матки. Рестрикция образцов ДНК RsaI (R);

RsaI/NarI (N); RsaI/SacII (Sc); RsaI/SmaI (S); MseI (M); MseI/HpaII (H). Числами справа указаны размеры маркерных фрагментов.



Pages:     || 2 |


Похожие работы:

«из ФОНДОВ РОССИЙСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННОЙ БИБЛИОТЕКИ Конев, Федор Федорович 1. Федерализм: теоретико-правовые аспекты и опыт России 1.1. Российская государственная Библиотека diss.rsl.ru 2003 Конев, Федор Федорович Федерализм: теоретико-правовые аспекты и опыт России [Электронный ресурс]: Дис.. канд. юрид. наук : 12.00.01.-М.: РГБ, 2003 (Из фондов Российской Государственной Библиотеки) Государство и право. Юридические науки — Государственное (конституционное) право — Российская Федерация —...»

«Воробьёв Анатолий Евгеньевич РАЗРАБОТКА И ИССЛЕДОВАНИЕ СИСТЕМ МОНИТОРИНГА РАСПРЕДЕЛЕННЫХ ОБЪЕКТОВ ТЕЛЕКОММУНИКАЦИЙ Специальность 05.12.13 - Системы, сети и устройства телекоммуникаций Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук Научный руководитель :...»

«НИКОЛИЧЕВ Дмитрий Евгеньевич ИССЛЕДОВАНИЕ СОСТАВА САМООРГАНИЗОВАННЫХ НАНОКЛАСТЕРОВ GexSi1-x/Si МЕТОДОМ СКАНИРУЮЩЕЙ ОЖЕ-МИКРОСКОПИИ Специальность 01.04.10 – физика полупроводников Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Научный руководитель д.ф-м.н., проф. Д.А. Павлов Нижний Новгород – ОГЛАВЛЕНИЕ...»

«ИЗ ФОНДОВ РОССИЙСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННОЙ БИБЛИОТЕКИ Горохова, Светлана Сергеевна Правовое обеспечение федерализма в современной России Москва Российская государственная библиотека diss.rsl.ru 2006 Горохова, Светлана Сергеевна.    Правовое обеспечение федерализма в современной России  [Электронный ресурс] : Дис. . канд. юрид. наук  : 12.00.02. ­ М.: РГБ, 2006. ­ (Из фондов Российской Государственной Библиотеки). Государство и право. Юридические науки ­­...»

«vy vy из ФОНДОВ РОССИЙСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННОЙ БИБЛИОТЕКИ Водопьянова, Лилия Николаевна 1. Управленческий учет валютных операций 1.1. Российская государственная библиотека diss.rsl.ru 2002 Водопьянова, Лилия Николаевна Управленческий учет валютных операций [Электронный ресурс]: Дис.. канд. зкон. наук : 08.00.12 М.: РГБ, 2002 (Из фондов Российской Государственной Библиотеки) Бухгалтерский учет, контроль и анализ хозяйственной деятельности Полный текст: http://diss.rsl.ru/diss/02/0000/020000262.pdf...»

«Куницына Ирина Валентиновна СПОР В ПРАВЕ И ПРОЦЕССУАЛЬНЫЕ СПОСОБЫ ЕГО РАЗРЕШЕНИЯ 12.00.01 – теория и история права и государства; история учений о праве и государстве диссертация на соискание ученой степени кандидата юридических наук Научный руководитель : доктор юридических наук, профессор Павлушина Алла Александровна...»

«ХУСАИНОВ Радмир Расимович ОБОСНОВАНИЕ КОМБИНИРОВАННОЙ ТЕХНОЛОГИИ ПОВЫШЕНИЯ НЕФТЕОТДАЧИ ПЛАСТОВ С ПРИМЕНЕНИЕМ ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ И ПЛАЗМЕННОИМПУЛЬСНОЙ ТЕХНОЛОГИИ Специальность 25.00.17 – Разработка и эксплуатация нефтяных и газовых месторождений ДИССЕРТАЦИЯ на...»

«УСТИЧ Дмитрий Петрович ФОРМИРОВАНИЕ СИСТЕМЫ МОНИТОРИНГА ИННОВАЦИОННОЙ АКТИВНОСТИ НА КРУПНЫХ РОССИЙСКИХ ПРЕДПРИЯТИЯХ Специальность: 08.00.05 – Экономика и управление народным хозяйством (управление инновациями) Диссертация на соискание ученой степени кандидата...»

«ИЗ ФОНДОВ РОССИЙСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННОЙ БИБЛИОТЕКИ Ларина, Елена Викторовна Признание доказательств недопустимыми в российском уголовном судопроизводстве Москва Российская государственная библиотека diss.rsl.ru 2006 Ларина, Елена Викторовна Признание доказательств недопустимыми в российском уголовном судопроизводстве : [Электронный ресурс] : В стадии предварительного расследования : Дис. . канд. юрид. наук  : 12.00.09. ­ М.: РГБ, 2005 (Из фондов Российской Государственной Библиотеки)...»

«из ФОНДОВ РОССИЙСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННОЙ БИБЛИОТЕКИ Бактина, Наталья Николаевна 1. Псикологические осоБенности профессиональной деятельности инспекторов рыБоокраны 1.1. Российская государственная Библиотека diss.rsl.ru 2003 Бактина, Наталья Николаевна Псикологические осоБенности профессиональной деятельности инспекторов рыБоокраны [Электронный ресурс]: Дис.. канд. псикол. наук : 19.00.03.-М.: РГБ, 2003 (Из фондов Российской Государственной Библиотеки) Псикология — Отраслевая (прикладная)...»

«Амирханова Евгения Александровна АДМИНИСТРАТИВНО-ПРАВОВОЕ РЕГУЛИРОВАНИЕ В СФЕРЕ ТУРИЗМА Специальность 12.00.14 – административное право; административный процесс ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата юридических наук Научный руководитель кандидат юридических наук,...»

«Раскин Михаил Александрович Сверхслова, меры на них и их полупрямые произведения 01.01.06 – математическая логика, алгебра и теория чисел диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Научный руководитель д. ф.-м. н., профессор Николай Константинович Верещагин Москва – 2014 2 Содержание Введение...........................»

«ШУЛЬГИНОВ Роман Николаевич КОМПЛЕКСНАЯ ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ГИДРОАККУМУЛИРУЮЩИХ ЭЛЕКТРОСТАНЦИЙ НА ЭНЕРГЕТИЧЕСКОМ РЫНКЕ Специальность 08.00.05 – Экономика и управление народным хозяйством (экономика, организация и управление предприятиями, отраслями, комплексами ) Диссертация на соискание ученой...»

«Григорьев Евгений Юрьевич РАЗРАБОТКА И ИССЛЕДОВАНИЕ СПОСОБОВ СНИЖЕНИЯ ВИБРАЦИИ КОЛЬЦЕВЫХ ДИФФУЗОРОВ ГАЗОВЫХ ТУРБИН (05.04.12 – Турбомашины и комбинированные турбоустановки) Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук Научный руководитель : д.т.н., профессор Зарянкин А.Е Москва – 2014 2 Содержание Введение.. Глава 1. Краткий обзор литературных данных по предмету проводимых исследований.. 1.1...»

«из ФОНДОВ Р О С С И Й С К О Й Г О С У Д А Р С Т В Е Н Н О Й Б И Б Л И О Т Е К И Михайлов, Андрей Валерьевич 1. Роль императивных норм в правовом регулировании отношений между лицами, осуществляющими предпринимательскую деятельность, или с их участием 1.1. Российская государственная библиотека diss.rsl.ru 2003 Михайлов, Андрей Валерьевич Роль императивных норм в правовом регулировании отношений между лицами, осуществляющими предпринимательскую деятельность, или с их участием [Электронный...»

«ИЗ ФОНДОВ РОССИЙСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННОЙ БИБЛИОТЕКИ Кожанов, Виктор Иванович Применение системы рейтингового контроля в управлении физическим воспитанием студентов Москва Российская государственная библиотека diss.rsl.ru 2006 Кожанов, Виктор Иванович.    Применение системы рейтингового контроля в управлении физическим воспитанием студентов [Электронный ресурс] : Дис. . канд. пед. наук  : 13.00.08, 13.00.04. ­ Чебоксары: РГБ, 2006. ­ (Из фондов Российской Государственной Библиотеки)....»

«УДК 519.21 Громов Александр Николаевич ОПТИМАЛЬНЫЕ СТРАТЕГИИ ПЕРЕСТРАХОВАНИЯ И ИНВЕСТИРОВАНИЯ В СТОХАСТИЧЕСКИХ МОДЕЛЯХ РИСКА 01.01.05 теория вероятностей и математическая статистика Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико–математических наук Научный руководитель профессор, доктор физ.–мат. наук Булинская Екатерина Вадимовна Москва 2013 г....»

«ТУРКИНА ОЛЬГА ВАЛЕНТИНОВНА МЕТОДЫ ОЦЕНКИ И МЕХАНИЗМЫ СГЛАЖИВАНИЯ ПРОСТРАНСТВЕННЫХ ДИСПРОПОРЦИЙ В СОЦИАЛЬНОЭКОНОМИЧЕСКОМ РАЗВИТИИ РЕГИОНОВ (НА ПРИМЕРЕ РЕГИОНОВ ЮГА РОССИИ) Специальность 08.00.05 - Экономика и управление народным хозяйством (региональная экономика) ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата экономических наук Научный...»

«БОГОПОЛЬСКИЙ Павел Майорович ИСТОРИЯ РЕКОНСТРУКТИВНОЙ ХИРУРГИИ ПИЩЕВОДА В РОССИИ Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук 07.00.10 – История науки и техники (медицинские науки) Научные консультанты: д.м.н. С.А. Кабанова д.м.н. проф. М.М. Абакумов Москва – 2014 г. ОГЛАВЛЕНИЕ Страницы Введение 5– Глава I. Исследования по истории развития...»

«ИЗ ФОНДОВ РОССИЙСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННОЙ БИБЛИОТЕКИ Патрушева, Тамара Николаевна Экстракционно­пиролитический метод получения функциональных оксидных материалов Москва Российская государственная библиотека diss.rsl.ru 2006 Патрушева, Тамара Николаевна Экстракционно­пиролитический метод получения функциональных оксидных материалов : [Электронный ресурс] : Дис. . д­ра техн. наук  : 05.17.02. ­ М.: РГБ, 2006 (Из фондов Российской Государственной Библиотеки)...»








 
2014 www.av.disus.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.