«ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ НИМЕСУЛИДА И БЛИЗКИХ ПО СТРУКТУРЕ СОЕДИНЕНИЙ ...»

2.6.2 Электронная УФ- и видимая спектрофотометрия Нимесулид и близкие по структуре соединения содержат в молекулах сопряженные системы химических связей, способные поглощать излучение в ультрафиолетовой и видимой областях спектра. Благодаря этому, возможна идентификация рассматриваемых веществ электронной спектрофотометрией.

Изучены основные оптические характеристики исследуемых веществ в органических средах различной полярности, в воде и водных растворах различной реакции. Оптическую плотность бесцветных растворов измеряли в интервале длин волн 200-400 нм, окрашенных 200-1000 нм. Регистрацию спектров поглощения проводили на приборе СФ-2000 в прямоугольных кварцевых кюветах с длиной оптического пути 10 мм на фоне соответствующих растворяющих сред. На полученных кривых поглощения определяли положения минимумов и максимумов, и рассчитывали удельный и молярный коэффициенты светопоглощения. Результаты представлены в таблицах 10- (приложение).

В электронных спектрах 4-нитроанилина, 4-Н-2-ФА и нимесулида выявлено по несколько полос поглощения. Для 4-нитроанилина в интервалах длин волн 203,7-205,8 нм; 226,5-252,8 нм; 346,7-381,8 нм. Для 4-Н-2-ФА – 204,1нм; 253,4-271,0 нм; 333,3-390,3 нм. Для нимесулида – 199,99-226,3 нм;

244,9-300, растворяющей среды наблюдается явление батохромного сдвига полос поглощения анализируемых соединений. В качестве оптимальной растворяющей среды для 4-нитроанилина, 4-Н-2-ФА и нимесулида выбран ДМФА, вследствие максимального сдвига длинноволновой полосы к видимой области спектра. Сам растворитель обладает низкой летучестью.

В электронных спектрах 4-А-2-ФФМСА, 4-МСА-3-ФФА и 4-Г-2-ФФМСА наблюдается присутствие трех полос поглощения. Растворы 4-А-2-ФФМСА наиболее интенсивно поглощают УФ-излучение в интервалах 207,1-225,7 нм;

245,4-281,4 нм; 292,2-305,4 нм. Растворы 4-МСА-3-ФФА – в интервалах 206,7нм; 251,2-272,1 нм, 281,2-294,2 нм. Растворы 4-Г-2-ФФМСА – в интервалах 207,7-225,7 нм; 247,0-281,4 нм и 287,2-291,1 нм. Для 4-А-2-ФФМСА, 4-МСА-3-ФФА и 4-Г-2-ФФМСА можно ремендовать этанол, как оптимальную растворяющую среду. При этом возможно получение спектра в широком диапазоне длин волн.

Для шести вышеперечисленных соединений возможно применение ацетонитрила в качестве альтернативной растворяющей среды при их идентификации.

2.7 Идентификация хроматографическими методами Изучение хроматографической подвижности нимесулида и близких по структуре соединений проводили по схеме описанной в п. 2.5.3.

На основании полученных данных рассчитывали значения абсолютной (Rf) и относительной (Rs) подвижности относительно 4-нитроанилина.

Внутренним стандартом был выбран 4-нитроанилин.

Хроматографическая подвижность нимесулида и близких по структуре соединений основана на нескольких типах взаимодействий. Наиболее значимым, по нашему мнению, явилось образование водородных связей между фрагментами молекул анализируемых веществ, компонентами элюента и поверхностью сорбента. Хроматографическое поведение исследуемых соединений зависит от характера взаимодействия их с молекулярной поверхностью сорбента, с компонентами элюента, а также от взаимодействий молекул подвижной фазы между собой и с силанольными группами силикагеля.

На начальном этапе изучалась подвижность объектов исследования в монокомпонентных подвижных фазах (индивидуальных растворителях).

диэлектрической проницаемости: гексан, гептан, бензол, толуол, о-ксилол, дихлорметан, трихлорметан, тетрахлорметан, 1,2-дихлорэтан, диэтиловый эфир, 1,4-диоксан, метанол, этанол, пропанол-1, пропанол-2, бутанол-1, изобутанол, пентанол-1, изопентанол, деканол-1, муравьиная кислота, уксусная кислота, уксусный ангидрид, метилацетат, этилацетат, пропилацетат, бутилацетат, ацетонитрил, ацетон, ацетилацетон, формамид, диметилформамид, хроматографирования представлены в таблице 16 (приложение).

использовании элюентов малой полярности, обладающими низкими значениями диэлектрической проницаемости. С ростом диэлектрической проницаемости элюента, вцелом увеличивалась подвижность сорбата. Наибольшая подвижность отмечена при использовании элюентов с высокими значениями диэлектрических проницаемостей, которые принадлежат к группам спиртов, эфиров кислот, их ангидридов, нитрилов, кетонов и т.д. Элюенты обладающие высокой диэлектрической проницаемостью конкурируют с последними за образование водородных связей с активными силанольными группами силикагеля. В результате процесс сорбции анализируемых веществ на неподвижной фазе ослабляется, и они достаточно легко перемещаются вместе с элюентом к линии фронта.

диэлектрической проницаемости) исследуемые соединения имеют способность сильнее удерживаться активными центрами сорбента. Это объясняется отсутствием в структуре малополярного растворителя гидроксильных групп, третичных атомов азота и других фрагментов молекулы, способных образовывать водородные связи с поверхностью сорбента. Например, в гексане и гептане пятна исследуемых веществ располагались на старте пластины.

На следующем этапе исследования составляли двухкомпонентные подвижные фазы, содержащие один растворитель с низким значением диэлектрической проницаемости (малополярный), а другой – с высоким значением (сильнополярный). Результаты исследования представлены в таблице 17 (приложение).

Затем в оптимальных системах подбирали наиболее оптимальные соотношения компонентов. Полученные данные оформляли в виде наглядных диаграмм в соответствии с рисунками 13-18 (приложение). Дополнительно в некоторые системы вводили третий, четвертый, а иногда и пятый компонент, предполагая лучшее разделение исследуемых соединений. Данные представлены в таблице 18 (приложение).

Ряд отдельных хроматографических систем, близких к оптимальным исследовали на пластинах Silufol UV-254 (фирма «Kavalier», Чехия). Данные представлены в таблице 19 (приложение).

Анализ полученных данных позволил выявить на пластинах «Сорбфил»

оптимальную систему толуол-ацетонитрил (7:3). В ней разделяются все исследуемые соединения.

Основываясь на результатах хроматографирования, следует отметить общую закономерность увеличения хроматографической подвижности на пластинах «Сорбфил» в ряду: 4-МСА-3-ФФА нитразепам 4-А-2-ФФМСА нимесулид 4-нитроанилин 4-Г-2-ФФМСА 4-Н-2-ФА. Характер подвижности анализируемых соединений вцелом зависит от размеров молекулы, типа присутствующих в ней заместителей, а также от молекулярной массы сорбата. Чем больше молекулярная масса исследуемых соединений, тем меньше их хроматографическая подвижность.

Например, высокие значения подвижности 4-нитроанилина и 4-Н-2-ФА объясняются малой молекулярной массой молекул и наличием в них свободной ароматической аминогруппы, образующей водородные связи с активными центрами силикагеля. У 4-Г-2-ФФМСА высокие значения хроматографической подвижности объясняются сродством фенольного гидроксила в структуре молекулы к силанольным группам сорбента.

Однако, несмотря на меньшую молекулярную массу 4-А-2-ФФМСА обладает меньшей подвижностью, чем нимесулид из-за большего сродства к силанольным группам силикигеля и образованию водородных связей.

Введение в структуру 4-А-2-ФФМСА ацетильного фрагмента (структура 4-МСА-3-ФФА) увеличивает молекулярную массу сорбата и усиливает способность замещенного атома к образованию водородных связей с силанольными группами силикагеля.

В данном варианте хроматографирования в качестве неподвижной фазы использовали модель сорбента с искусственно привитой алкильной фазой С 14С15 на силикагеле марки СТХ-1ВЭ.

Для получения модели обращеннофазового слоя поверхность сорбента СТХ-1ВЭ пластин марки «Сорбфил» с УФ-индикатором обрабатывали 10% раствором вазелинового масла в гексане. Пластины немедленно высушивали и удаляли избыток масла с обеих сторон фильтровальной бумагой.

Используя методику описанную в п. 2.5.3 настоящей диссертации на линию старта подготовленных обращеннофазовых пластин наносили растворы объектов исследования.

В качестве подвижных фаз были выбраны вода очищенная, буферные растворы кислой и щелочной реакции с различными значениями рН (1,98; 2,87;

7,00; 8,95), а также их различные комбинации с метанолом, этанолом, пропанолом-2, ацетоном, ацетонитрилом и 1,4-диоксаном. Результаты хроматографирования анализируемых соединений в тонком слое модели обращеннофазого силикагеля приведены в таблице 20 (приложение).

По результатам хроматографирования в качестве оптимальной подвижной фазы выбрана смесь метанола и буферного раствора с рН 8,95 в соотношении 4:7. При выборе оптимального элюента руководствовались такими условиями анализа, как время хроматографирования, форма и характер расположения пятен на хроматограммах.

Использование высокоэффективной жидкостной хроматографии позволяет не только разделять компоненты в смеси, но и идентифицировать каждый из них на хроматограмме.

Хроматографирование нимесулида и близких по структуре соединений проводили на приборе «Милихром 5-03» с УФ-детектором в колонке 1002 мм, заполненной сорбентом «Силасорб-600». Скорость подачи элюента – мкл/мин. Температура термостата колонки 35 С. Значения оптической плотности регистрировали при 330 нм (нимесулид), 360 нм (4-нитроанилин и 4Н-2-ФА) и 250 нм (нимесулид, 4-А-2-ФФМСА, 4-МСА-3-ФФА и 4-Г-2ФФМСА). Вещества вводили в виде растворов в элюенте, объем вводимой пробы – 10 мкл.

Для смеси 4-нитроанилина, 4-Н-2-ФА и нимесулида использовался ряд элюентов состава гексан-ацетон-тетрахлорметан с различным объемным соотношением компонентов (7:3:3), (7:3:4), (7:3:5) и (7:3:7). Наилучшие результаты хроматографирования достигаются в подвижной фазе – гексанацетон-тетрахлорметан (7:3:7). Для смесей нимесулида, 4-А-2-ФФМСА, 4-МСАФФА, а также 4-А-2-ФФМСА, 4-МСА-3-ФФА и 4-Г-2-ФФМСА применяли элюент гексан-диоксан-тетрахлорметан (1:1:1). Концентрации 4-нитроанилина, 4-Н-2-ФА и нимесулида в элюенте гексан-ацетон-тетрахлорметан (7:3:7) – мкг/мл; нимесулида, 4-А-2-ФФМСА и 4-МСА-3-ФФА в элюенте гександиоксан-тетрахлорметан (1:1:1) – 100 мкг/мл; 4-А-2-ФФМСА, 4-МСА-3-ФФА и 4-Г-2-ФФМСА в элюенте гексан-диоксан-тетрахлорметан (1:1:1) – 160 мкг/мл.

Хроматограммы смесей представлены в соответствии с рисунками 7-10.

Рисунок 7 – Хроматограмма смеси трех соединений: 4-нитроанилина (справа), нимесулида (центр), 4-нитро-2-феноксианилина (слева), хроматограф «Милихром», подвижная фаза – гексан-ацетон-тетрахлорметан (7:3:7), длина волны 330 нм Рисунок 8 – Хроматограмма смеси трех соединений: 4-нитроанилина (справа), нимесулида (центр), и внутреннего стандарта (4-нитро-2-феноксианилина – слева), хроматограф «Милихром», подвижная фаза – гексан-ацетон-тетрахлорметан (7:3:7), длина волны 360 нм Рисунок 9 – Хроматограмма смеси трех соединений: 4-А-2-ФФМСА (второй пик справа), 4МСА-3-ФФА (первый пик справа), нимесулида (третий пик справа), выход элюента (четвертый пик справа), хроматограф «Милихром», подвижная фаза – гексан-диоксантетрахлорметан (1:1:1), длина волны 250 нм Рисунок 10 – Хроматограмма смеси трех соединений: 4-А-2-ФФМСА (второй пик справа), 4МСА-3-ФФА (первый пик справа), 4-А-2-ФФМСА (третий пик справа), хроматограф «Милихром», подвижная фаза – гексан-диоксан-тетрахлорметан (1:1:1), длина волны 250 нм Параметры хроматографирования отдельных пиков, а также смежных пиков в смесях при использовании указанных элюентов представлены в таблицах 21, 23 и 24 (приложение) [47, 67, 74].

При идентификации в системе гексан-ацетон-тетрахлорметан (7:3:7) время удерживания 4-нитроанилина составило 11,418 мин, нимесулида – 7,848 мин, 4Н-2-ФА – 7,065 мин. В системе гексан-диоксан-тетрахлорметан (1:1:1) время удерживания нимесулида составило 6,102 мин, 4-Г-2-ФФМСА – 8,385 мин, 4-АФФМСА – 10,242 мин и 4-МСА-3-ФФА – 21,906 мин.

В обращеннофазовом варианте хроматографирования ввиду сложности подбора условий разделения семи компонентов вместо изократического режима элюирования был применен градиентный режим, где достигаются наиболее оптимальные результаты.

Хроматографирование проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе фирмы Shimadzu LC-10 Avp (Япония) с дегазатором подвижной фазы, термостатом колонки (60 °С) и UV-Vis-детектированием. Неподвижная фаза колонка с силикагелем Luna 5мкм C18 марки Phenomenex® (Ирландия) размерами 2504.6 мм. Элюент – подвижная фаза состава В,% - С,%, где компонент В – 20 мМ фосфатный буфер KH2PO4 с рН 3,05, компонент С – ацетонитрил, в градиентном режиме по схеме в таблице 1.

Таблица 1 – Схема градиентного режима ОФ-ВЭЖХ хроматографирования Время, Компонент Компонент УФ-детектор – 230 и 370 нм; скорость потока элюента 1,0 мл/мин;

Температура – 60 °С; Объем вводимой пробы – 20 мкл.

Хроматограммы смесей исследуемых соединений представлены в соответствии с рисунками 11 и 12.

Рисунок 11 – Хроматограмма смеси семи соединений: 4-нитроанилин (первый пик слева), 4МСА-3-ФФА (второй пик слева), 4-А-2-ФФМСА (третий пик слева), 4-Г-2-ФФМСА (четвертый пик слева), нитразепам (пятый пик слева), нимесулид (шестой пик слева), 4-Н-2ФА (седьмой пик слева), хроматограф Shimadzu LC-10 ADVP, подвижная фаза – градиентный режим (Ацетонитрил - буфер с рН 3,05), длина волны 230 нм Рисунок 12 – Хроматограмма смеси семи соединений: 4-нитроанилин (первый пик слева), нитразепам (второй пик слева), нимесулид (третий пик слева), 4-Н-2-ФА (четвертый пик слева), хроматограф Shimadzu LC-10 ADVP, подвижная фаза – градиентный режим (Ацетонитрил - буфер с рН 3,05), длина волны 370 нм Параметры хроматографирования отдельных пиков, а также смежных пиков в смеси при использовании градиентного элюирования представлены в таблицах 22, 25 и 26 (приложение) [47, 67, 74].

Доказательство соответствия наложенным пикам 4-МСА-3-ФФА, 4-А-2ФФМСА и 4-Г-2-ФФМСА представлено в соответствии с рисунком 13. При этом используя программное обеспечение LC Solution смоделировано наложение пиков, вершины которых совпадают по временам удерживания с вершинами пиков, полученных в анализе смеси.

Рисунок 13 – Фрагмент наложения хроматограмм отдельных соединений (пики вверху) и их смеси (пики внизу). Слева направо 4-МСА-3-ФФА, 4-А-2-ФФМСА, 4-Г-2-ФФМСА.

Хроматограф Shimadzu LC-10 ADVP, подвижная фаза – градиентный режим (Ацетонитрил буфер с рН 3,05), длина волны 230 нм При идентификации в указанном градиентном режиме (элюент состава ацетонитрил – буферный раствор с рН 3,05) время удерживания 4-нитроанилина составило 6,28 мин, 4-МСА-3-ФФА – 7,52 мин, 4-А-2-ФФМСА – 7,75 мин, 4-ГФФМСА – 8,03 мин, нитразепама – 11,68 мин, нимесулида – 21,32 мин и 4-НФА – 22,51 мин. Выбор длин волн для детекции исследуемых соединений проводили спектрофотометрическим методом в соответствии с вышеуказанной схемой градиентного режима и временами удерживания исследуемых соединений в таблице 2.

Электронные спектры поглощения образцов приготовленных растворов были получены на сканирующем спектрофотометре UV-1800 (Shimadzu, Япония) в кварцевых кюветах с толщиной рабочего слоя 10 мм. Результаты представлены в соответствии с рисунком 14. Конечная концентрация всех растворов равна 8 мкг/мл.

Результаты спектрофотометрического исследования указанных образцов позволили выбрать длины волн для детекции 4-нитроанилина, 4-Н-2-ФА, нимесулида, нитразепама – 230 и 370 нм, а для 4-А-2-ФФМСА, 4-МСА-3-ФФА, 4-Г-2-ФФМСА – 230 нм при градиентном обращеннофазовом варианте хроматографирования.

Таблица 2 – Состав растворов для спектрофотометрического измерения 4-нитроанилин Абс.

Рисунок 14 – Электронные спектры исследуемых соединений в растворах подвижной фазы, соответствующей градиентному режиму хроматографирования: 1 – 4-Н-2-ФА, 2 – 4нитроанилин, 3 – 4-А-2-ФФМСА, 4 – 4-МСА-3-ФФА, 5 – нимесулид, 6 – нитразепам, 7 – 4-ГФФМСА.

2.7.5 Капиллярная газовая хроматография с масс-спектрометрическим Газохроматографический метод исследования с масс-спектрометрическим детектированием позволяет достаточно точно и селективно идентифицировать нимесулид и близкие по структуре соединения. Метод обладает высокой чувствительностью.

На аналитических весах брали навески веществ массой 1 мг и растворяли в 1,0 мл метанола, затем брали аликвоту 100 мкл и прибавляли 100 мкл метанола.

Навеску 1 мг 4-Н-2-ФА растворяли в 100 мкл метанола. Полученные растворы веществ подвергались анализу методом ГХ-МС.

Анализ проводили на газовом хроматографе Agilent модели 6850 Network GC System с масс-селективным детектором модели 5973 Network. Неподвижная фаза – капиллярная кварцевая колонка DB-5 MS EVIDEX длина – 25 м, внутренний диаметр – 0,2 мм, сорбент – 5%-фенил-95%-метилполисилоксан;

температура инжектора – 250°C, интерфейса детектора - 300°С; начальная температура термостата колонки - 70°С поддерживалась в течении 3,0 минут, затем осуществлялся нагрев до 290°С со скоростью 20°С в минуту, термостатирование колонки при конечной температуре 16 минут; газ-носитель – гелий, скорость газа-носителя – 0,6 мл/мин; объем вводимой пробы – 4 мкл.

Деление потока – 1:50 (при анализе нитразепама 1:2). Масс-селективный детектор работал в режиме электронного удара (70 эВ). Обнаружение проводили в режиме регистрации по полному ионному току, задержка на растворитель в 3, минуты. Диапазон сканирования – 40-500 m/z.

Полученные масс-спектры сравнивали с библиотечными масс-спектрами (библиотека Wiley-7nl). Кроме того, учитывали время удерживания выявленных компонентов. Полученные результаты представлены в соответствии с рисунками 19-32 и в таблице 27 (приложение). В вышеописанных условиях времена удерживания составляют для 4-нитроанилина, 4-Г-2-ФФМСА, 4-Н-2ФА, 4-А-2-ФФМСА, нимесулида, нитразепама, 4-МСА-3-ФФА соответственно 11,462; 13,407; 14,979; 17,119; 17,140; 20,165; 20,953 мин.

В масс-спектре 4-нитроанилина отмечены сигналы осколков в порядке уменьшения интенсивности 65, 138, 108, 92 и 80 m/Z. Осколок имеющий значение 138 m/Z соответствует молекулярной массе 4-нитроанилина.

В масс-спектре 4-Г-2-ФФМСА присутствуют сигналы осколков в порядке уменьшения интенсивности 201, 96, 124, 51 и 77 m/Z.

В масс-спектре 4-Н-2-ФА наблюдаются сигналы осколков в порядке уменьшения интенсивности 230, 77, 52, 51 и 200 m/Z. Осколок имеющий значение 230 m/Z соответствует молекулярной массе 4-Н-2-ФА.

В масс-спектре 4-А-2-ФФМСА обнаружены сигналы осколков в порядке уменьшения интенсивности 199, 171, 77, 51 и 278 m/Z. Осколок имеющий значение 278 m/Z соответствует молекулярной массе 4-А-2-ФФМСА.

В масс-спектре нимесулида выявлены сигналы осколков в порядке уменьшения интенсивности 154, 229, 77, 308 и 51 m/Z. Осколок имеющий значение 308 m/Z соответствует молекулярной массе нимесулида.

В масс-спектре 4-МСА-3-ФФА зарегистрированы сигналы осколков в порядке уменьшения интенсивности 199, 43, 171, 241 и 320 m/Z. Осколок имеющий значение 320 m/Z соответствует молекулярной массе 4-МСА-3-ФФА.

В масс-спектре нитразепама отмечены сигналы осколков в порядке уменьшения интенсивности 206, 253, 280, 77 и 205 m/Z.

Характерные значения m/Z осколков молекул в масс-спектре и значения времен удерживания на хроматограммах позволяют с высокой селективностью идентифицировать исследуемые соединения методом газовой хроматографии с масс-селективным детектированием.

ГЛАВА 3 КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ НИМЕСУЛИДА И БЛИЗКИХ

ПО СТРУКТУРЕ СОЕДИНЕНИЙ

3.1 Определение спектрофотометрическим методом 3.1.1 Анализ нимесулида, 4-нитроанилина, 4-Н-2-ФА в ДМФА Оптические плотности растворов 4-нитроанилина, 4-нитро-2феноксианилина и нимесулида в диметилформамиде измерили на спектрофотометре СФ-2000 на фоне ДМФА. Оптическая плотность растворов была стабильной, по крайней мере, в течение 24 часов с момента их приготовления.

Построение калибровочного графика для 4-нитроанилина. В мерные колбы на 100 мл внесли 0,2; 0,4; 0,8; 1,6; 3,2; 4,8; 6,4 и 8,0 мл раствора 4нитроанилина в ДМФА (100 мкг/мл) и довели до метки каждую из колб ДМФА.

Оптическую плотность серии стандартных растворов измерили на приборе СФна фоне ДМФА в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 10 мм при 384,9 нм. По полученным данным методом наименьших квадратов рассчитали уравнение калибровочной прямой линейного участка графика. Уравнение имеет вид: D=0,175483•С–0,003071, где D – оптическая плотность, С – концентрация 4нитроанилина в фотометрируемом растворе, мкг/мл. Определение возможно в интервале концентраций 0,2 – 8 мкг/мл. Коэффициент корреляции равен 0,99995.

Методика определения 4-нитроанилина. Около 25 мг (точная навеска) 4-нитроанилина растворили в 50-60 мл ДМФА в мерной колбе на 100 мл и довели раствор до метки ДМФА (раствор А). 1,6 мл раствора А довели до метки ДМФА в мерной колбе на 100 мл (раствор Б). Оптическую плотность раствора Б измерили при 384,9 нм на спектрофотометре СФ-2000 по алгоритму, описанному для построения калибровочного графика. Содержание 4нитроанилина определили по калибровочному графику и пересчитали на навеску. Результаты представлены в таблице 3.

Данная методика характеризуется хорошей воспроизводимостью и правильностью. Относительная ошибка среднего результата (n=6; Р=0,95) не более 1,04%. Продолжительность определения 4-нитроанилина в вышеуказанных условиях около 7-10 минут.

Таблица 3 – Результаты определения нимесулида и близких по структуре соединений методом спектрофотометрии (n=6, Р=0,95) Навеска, Найдено Метрологические Навеска, Найдено Метрологические 4-нитроанилин (ДМФА; 384,9 нм) 4-А-2-ФФМСА (этанол; 249,7 нм) 4-Н-2-ФА (ДМФА; 391,4 нм) 4-А-2-ФФМСА (этанол; 298,4 нм) Нимесулид (ДМФА; 439,4 нм) 4-МСА-3-ФФА (этанол; 254,3 нм) 4-Г-2-ФФМСА (этанол; 241,5 нм) 4-МСА-3-ФФА (этанол; 287,6 нм) 4-Г-2-ФФМСА (этанол; 280,6 нм) 0,02410 0,02433 100,94 х =100, 0,02700 0,02696 99,86 S =0, 0,02395 0,02386 99,61 S х =0, 0,02575 0,02599 100, 0,02445 0,02442 99, 0,02745 0,02712 99, Построение калибровочного графика для 4-нитро-2-феноксианилина.

В мерные колбы на 100 мл внесли 0,4; 0,8; 1,6; 4,8; 9,6; 12,0 и 14,4 мл раствора 4нитро-2-феноксианилина в ДМФА (100 мкг/мл) и довели до метки каждую из колб ДМФА. Оптическую плотность серии стандартных растворов измерили на приборе СФ-2000 на фоне ДМФА в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 10 мм при 390,3 нм. По полученным данным методом наименьших квадратов рассчитали уравнение калибровочной прямой линейного участка графика. Уравнение имеет вид: D=0,071267•С+0,002843, где D – оптическая плотность, С – концентрация 4-нитро-2-феноксианилина в фотометрируемом растворе, мкг/мл. Определение возможно в интервале концентраций 0,4 – 14, мкг/мл. Коэффициент корреляции равен 0,99977.

Методика определения 4-нитро-2-феноксианилина. Около 25 мг (точная навеска) 4-нитро-2-феноксианилина растворили в 12-15 мл ДМФА в мерной колбе на 25 мл и довели раствор до метки ДМФА (раствор А). 2,0 мл раствора А довели до метки ДМФА в мерной колбе на 250 мл (раствор Б).

Оптическую плотность раствора Б измерили при 384,9 нм на спектрофотометре СФ-2000 по алгоритму, описанному для построения калибровочного графика.

Содержание 4-нитро-2-феноксианилина определили по калибровочному графику и пересчитали на навеску. Результаты представлены в таблице 3.

Данная методика характеризуется хорошей воспроизводимостью и правильностью. Относительная ошибка среднего результата (n=6; Р=0,95) не более 0,82%. Продолжительность определения 4-нитро-2-феноксианилина в вышеуказанных условиях около 7-10 минут.

Построение калибровочного графика для нимесулида. В мерные колбы на 25 мл внесли 0,05; 0,1; 0,2; 0,4; 0,8; 1,2 и 1,6 мл раствора нимесулида в ДМФА (250 мкг/мл) и довели до метки каждую из колб ДМФА. Оптическую плотность серии стандартных растворов измерили на приборе СФ-2000 на фоне ДМФА в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 10 мм при 439,4 нм. По полученным данным методом наименьших квадратов рассчитали уравнение калибровочной прямой линейного участка графика. Уравнение имеет вид:

D=0,074820•С–0,000311, где D – оптическая плотность, С – концентрация нимесулида в фотометрируемом растворе, мкг/мл. Определение возможно в интервале концентраций 0,5 – 16 мкг/мл. Коэффициент корреляции равен 0,99987.

Методика определения нимесулида. Около 25 мг (точная навеска) нимесулида растворили в 50-60 мл ДМФА в мерной колбе на 100 мл и довели раствор до метки ДМФА (раствор А). 5,0 мл раствора А довели до метки ДМФА в мерной колбе на 25 мл (раствор Б). Оптическую плотность раствора Б измерили при 439,4 нм на спектрофотометре СФ-2000 по алгоритму, описанному для построения калибровочного графика. Содержание нимесулида определили по калибровочному графику и пересчитали на навеску. Результаты представлены в таблице 3.

Данная методика характеризуется хорошей воспроизводимостью и правильностью. Относительная ошибка среднего результата (n=6; Р=0,95) не более 0,87%. Продолжительность определения нимесулида в вышеуказанных условиях около 7-10 минут.

3.1.2 Анализ 4-А-2-ФФМСА, 4-МСА-3-ФФА, 4-Г-2-ФФМСА в этаноле Оптические плотности растворов 4-А-2-ФФМСА, 4-МСА-3-ФФА и 4-Г-2ФФМСА в этаноле измеряли на спектрофотометре СФ-2000 на фоне этанола.

Оптическая плотность растворов была стабильной, по крайней мере, в течение 12 часов с момента их приготовления.

Построение калибровочного графика для 4-А-2-ФФМСА (вариант первый). В мерные колбы на 10 мл внесли 0,2; 0,4; 0,8; 1,0; 2,0 и 4,0 мл раствора 4-А-2-ФФМСА в этаноле (100 мкг/мл) и довели до метки каждую из колб этанолом. Оптическую плотность серии стандартных растворов измерили на приборе СФ-2000 на фоне этанола в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 10 мм при 249,7 нм. По полученным данным методом наименьших квадратов рассчитали уравнение калибровочной прямой линейного участка графика. Уравнение имеет вид: D=0,032067•С–0,003996, где D – оптическая плотность, С – концентрация 4-А-2-ФФМСА в фотометрируемом растворе, мкг/мл. Определение возможно в интервале концентраций 2 – 40 мкг/мл.

Коэффициент корреляции равен 0,99981.

Методика определения 4-А-2-ФФМСА (вариант первый). Около 25 мг (точная навеска) 4-А-2-ФФМСА растворили в 10-15 мл этанола в мерной колбе на 25 мл и довели раствор до метки этанолом (раствор А). 2,0 мл раствора А довели до метки этанолом в мерной колбе на 100 мл (раствор Б). Оптическую плотность раствора Б измерили при 249,7 нм на спектрофотометре СФ-2000 по алгоритму, описанному для построения калибровочного графика. Содержание 4А-2-ФФМСА определили по калибровочному графику и пересчитали на навеску. Результаты представлены в таблице 3.

Данная методика характеризуется хорошей воспроизводимостью и правильностью. Относительная ошибка среднего результата (n=6; Р=0,95) не более 1,03%. Продолжительность определения 4-А-2-ФФМСА в вышеуказанных условиях около 10-12 минут.

Построение калибровочного графика для 4-А-2-ФФМСА (вариант второй). В мерные колбы на 25 мл внесли 0,25; 0,5; 1,0; 2,0; 4,0; 6,0; 8,0; 10,0 и 12,0 мл раствора 4-А-2-ФФМСА в этаноле (250 мкг/мл) и довели до метки каждую из колб этанолом. Оптическую плотность серии стандартных растворов измерили на приборе СФ-2000 на фоне этанола в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 10 мм при 298,4 нм. По полученным данным методом наименьших квадратов рассчитали уравнение калибровочной прямой линейного участка графика. Уравнение имеет вид: D=0,009484•С+0,007401, где D – оптическая плотность, С – концентрация 4-А-2-ФФМСА в фотометрируемом растворе, мкг/мл. Определение возможно в интервале концентраций 2,5 – мкг/мл. Коэффициент корреляции равен 0,99988.

Методика определения 4-А-2-ФФМСА (вариант второй). Около 25 мг (точная навеска) 4-А-2-ФФМСА растворили в 10-15 мл этанола в мерной колбе на 25 мл и довели раствор до метки этанолом (раствор А). 6,0 мл раствора А довели до метки этанолом в мерной колбе на 100 мл (раствор Б). Оптическую плотность раствора Б измерили при 298,4 нм на спектрофотометре СФ-2000 по алгоритму, описанному для построения калибровочного графика. Содержание 4А-2-ФФМСА определили по калибровочному графику и пересчитали на навеску. Результаты представлены в таблице 3.

Данная методика характеризуется хорошей воспроизводимостью и правильностью. Относительная ошибка среднего результата (n=6; Р=0,95) не более 0,96%. Продолжительность определения 4-А-2-ФФМСА в вышеуказанных условиях около 10-12 минут.

Построение калибровочного графика для 4-МСА-3-ФФА (вариант первый). В мерные колбы на 10 мл внесли 0,1; 0,2; 0,4; 0,8; 1,2; 1,6; 2,0 и 2,4 мл раствора 4-МСА-3-ФФА в этаноле (100 мкг/мл) и довели до метки каждую из колб этанолом. Оптическую плотность серии стандартных растворов измерили на приборе СФ-2000 на фоне этанола в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 10 мм при 254,3 нм. По полученным данным методом наименьших квадратов рассчитали уравнение калибровочной прямой линейного участка графика. Уравнение имеет вид: D=0,056677•С+0,008211, где D – оптическая плотность, С – концентрация 4-МСА-3-ФФА в фотометрируемом растворе, мкг/мл. Определение возможно в интервале концентраций 1 – 24 мкг/мл.

Коэффициент корреляции равен 0,99987.

Методика определения 4-МСА-3-ФФА (вариант первый). Около 25 мг (точная навеска) 4-МСА-3-ФФА растворили в 10-15 мл этанола в мерной колбе на 25 мл и довели раствор до метки этанолом (раствор А). 1,0 мл раствора А довели до метки этанолом в мерной колбе на 100 мл (раствор Б). Оптическую плотность раствора Б измерили при 254,3 нм на спектрофотометре СФ-2000 по алгоритму, описанному для построения калибровочного графика. Содержание 4МСА-3-ФФА определили по калибровочному графику и пересчитали на навеску. Результаты представлены в таблице 3.

Данная методика характеризуется хорошей воспроизводимостью и правильностью. Относительная ошибка среднего результата (n=6; Р=0,95) не более 0,94%. Продолжительность определения 4-МСА-3-ФФА в вышеуказанных условиях около 10-12 минут.

Построение калибровочного графика для 4-МСА-3-ФФА (вариант второй). В мерные колбы на 25 мл внесли 0,8; 1,0; 2,0; 4,0; 8,0 и 10,0 мл раствора 4-МСА-3-ФФА в этаноле (250 мкг/мл) и довели до метки каждую из колб этанолом. Оптическую плотность серии стандартных растворов измерили на приборе СФ-2000 на фоне этанола в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 10 мм при 287,6 нм. По полученным данным методом наименьших квадратов рассчитали уравнение калибровочной прямой линейного участка графика. Уравнение имеет вид: D=0,010875•С+0,004202, где D – оптическая плотность, С – концентрация 4-МСА-3-ФФА в фотометрируемом растворе, мкг/мл. Определение возможно в интервале концентраций 8 – 100 мкг/мл.

Коэффициент корреляции равен 0,99958.

Методика определения 4-МСА-3-ФФА (вариант второй). Около 25 мг (точная навеска) 4-МСА-3-ФФА растворили в 10-15 мл этанола в мерной колбе на 25 мл и довели раствор до метки этанолом (раствор А). 6,0 мл раствора А довели до метки этанолом в мерной колбе на 100 мл (раствор Б). Оптическую плотность раствора Б измерили при 287,6 нм на спектрофотометре СФ-2000 по алгоритму, описанному для построения калибровочного графика. Содержание 4МСА-3-ФФА определили по калибровочному графику и пересчитали на навеску. Результаты представлены в таблице 3.

Данная методика характеризуется хорошей воспроизводимостью и правильностью. Относительная ошибка среднего результата (n=6; Р=0,95) не более 0,88%. Продолжительность определения 4-МСА-3-ФФА в вышеуказанных условиях около 10-12 минут.

Построение калибровочного графика для 4-Г-2-ФФМСА (вариант первый). В мерные колбы на 10 мл внесли 0,2; 0,4; 0,8; 1,0; 2,0 и 4,0 мл раствора 4-Г-2-ФФМСА в этаноле (100 мкг/мл) и довели до метки каждую из колб этанолом. Оптическую плотность серии стандартных растворов измерили на приборе СФ-2000 на фоне этанола в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 10 мм при 241,5 нм. По полученным данным методом наименьших квадратов рассчитали уравнение калибровочной прямой линейного участка графика. Уравнение имеет вид: D=0,038097•С+0,003948, где D – оптическая плотность, С – концентрация 4-Г-2-ФФМСА в фотометрируемом растворе, мкг/мл. Определение возможно в интервале концентраций 2 – 40 мкг/мл.

Коэффициент корреляции равен 0,99995.

Методика определения 4-Г-2-ФФМСА (вариант первый). Около 25 мг (точная навеска) 4-Г-2-ФФМСА растворили в 10-15 мл этанола в мерной колбе на 25 мл и довели раствор до метки этанолом (раствор А). 1,5 мл раствора А довели до метки этанолом в мерной колбе на 100 мл (раствор Б). Оптическую плотность раствора Б измерили при 241,5 нм на спектрофотометре СФ-2000 по алгоритму, описанному для построения калибровочного графика. Содержание 4Г-2-ФФМСА определили по калибровочному графику и пересчитали на навеску.

Результаты представлены в таблице 3.

Данная методика характеризуется хорошей воспроизводимостью и правильностью. Относительная ошибка среднего результата (n=6; Р=0,95) не более 0,80 %. Продолжительность определения 4-Г-2-ФФМСА в вышеуказанных условиях около 10-12 минут.

Построение калибровочного графика для 4-Г-2-ФФМСА (вариант второй). В мерные колбы на 25 мл внесли 0,5; 1,0; 2,0; 4,0; 8,0; 12,0 и 16,0 мл раствора 4-Г-2-ФФМСА в этаноле (250 мкг/мл) и довели до метки каждую из колб этанолом. Оптическую плотность серии стандартных растворов измерили на приборе СФ-2000 на фоне этанола в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 10 мм при 280,6 нм. По полученным данным методом наименьших квадратов рассчитали уравнение калибровочной прямой линейного участка графика. Уравнение имеет вид: D=0,008762•С+0,015371, где D – оптическая плотность, С – концентрация 4-Г-2-ФФМСА в фотометрируемом растворе, мкг/мл. Определение возможно в интервале концентраций 5 – 160 мкг/мл.

Коэффициент корреляции равен 0,99993.

Методика определения 4-Г-2-ФФМСА (вариант второй). Около 25 мг (точная навеска) 4-Г-2-ФФМСА растворили в 10-15 мл этанола в мерной колбе на 25 мл и довели раствор до метки этанолом (раствор А). 6,0 мл раствора А довели до метки этанолом в мерной колбе на 100 мл (раствор Б). Оптическую плотность раствора Б измерили при 280,6 нм на спектрофотометре СФ-2000 по алгоритму, описанному для построения калибровочного графика. Содержание 4Г-2-ФФМСА определили по калибровочному графику и пересчитали на навеску.

Результаты представлены в таблице 3.

Данная методика характеризуется хорошей воспроизводимостью и правильностью. Относительная ошибка среднего результата (n=6; Р=0,95) не более 0,85%. Продолжительность определения 4-Г-2-ФФМСА в вышеуказанных условиях около 10-12 минут.

3.2 Определение нормальнофазовой ВЭЖХ Количественный анализ 4-нитроанилина, 4-нитро-2-феноксианилина нимесулида, 4-А-2-ФФМСА, 4-МСА-3-ФФА и 4-Г-2-ФФМСА проводили методом нормальнофазовой ВЭЖХ на приборе «Милихром 5-03», используя колонку с размерами 1002 мм с сорбентом Silasorb-600. Скорость элюента – 100 мкл/мин. Температура термостата колонки 35 С. Значения оптической плотности регистрировали при следующих длинах волн: нимесулид – 250 и нм, 4-нитроанилин и 4-Н-2-ФА – 360 нм, 4-А-2-ФФМСА, 4-МСА-3-ФФА и 4-ГФФМСА – 250 нм. Общее время хроматографирования – 25 мин. Объем вводимых проб – 10 мкл.

По указанной схеме проводили определение каждого из исследуемых веществ. Условия определения отличались лишь типом элюента и величиной концентрации хроматографируемых растворов.

Нимесулид, 4-Н-2-ФА и 4-нитроанилин количественно определяли в оптимальном элюенте гексан-ацетон-тетрахлорметан (7:3:7).

Построение калибровочных графиков 4-нитроанилина и нимесулида.

В мерные колбы на 10 мл внесли 0,01; 0,025; 0,05; 0,25; 0,5; 2,0 и 4,0 мл раствора 4-нитроанилина (200 мкг/мл); 0,025; 0,25; 0,5; 1,0; 2,0; 4,0; 6,0 мл раствора 4-Н-2ФА (200 мкг/мл) и 0,02; 0,04; 0,1; 0,4; 0,8; 2,0 и 4,0 мл раствора нимесулида ( мкг/мл) в смеси гексан-ацетон-тетрахлорметан (7:3:7) и довели до метки каждую из колб указанной смесью. Каждый из полученных растворов ввели в хроматографических пиков, соответствующих различным концентрациям анализируемых веществ в пробе.

По полученным данным методом наименьших квадратов рассчитали уравнения калибровочных прямых линейного участка графиков. Уравнения имеют вид: S=0,727783•С+0,013359 (4-нитроанилин), S=0,629709•С+0,005653 (4Н-2-ФА), (нимесулид), где – площадь хроматографического пика, усл.ед.; С – концентрация анализируемого вещества в хроматографируемой пробе, мкг. Определение 4-нитроанилина возможно в интервале концентраций 0,002-0,8 мкг, 4-Н-2-ФА – 0,005-1,2 мкг нимесулида – 0,01-2,0 мкг в 10 мкл пробы. Коэффициенты корреляции соответственно равны 0,99759; 0,99835 и 0,99932.

Методики определения 4-нитроанилина и 4-Н-2-ФА. Около 25 мг (точная навеска) одного из анализируемых соединений растворили в 10-15 мл смеси гексан-ацетон-тетрахлорметан (7:3:7) в мерной колбе на 25 мл и довели раствор до метки указанной смесью растворителей (раствор А). 1,0 мл раствора А довели до метки указанной смесью растворителей в мерной колбе на 50 мл (раствор Б). 10 мкл раствора Б ввели в хроматограф по алгоритму, описанному для построения калибровочного графика. Содержание анализируемого вещества определили по калибровочному графику и пересчитали на навеску. Результаты представлены в таблице 4.

Данные методики характеризуются хорошими воспроизводимостью и правильностью. Относительная ошибка среднего результата (n=6; Р=0,95) не Продолжительность определения в вышеуказанных условиях около 30 минут.

Методики достаточно селективны.

Методика определения нимесулида. Около 25 мг (точная навеска) нимесулида растворили в 10-15 мл смеси гексан-ацетон-тетрахлорметан (7:3:7) в мерной колбе на 25 мл и довели раствор до метки указанной смесью растворителей (раствор А). 2,5 мл раствора А довели до метки указанной смесью растворителей в мерной колбе на 50 мл (раствор Б). 10 мкл раствора Б ввели в хроматограф по алгоритму, описанному для построения калибровочного графика. Содержание нимесулида определили по калибровочному графику и пересчитали на навеску. Результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4 – Результаты определения нимесулида и близких по структуре соединений методом прямофазовой ВЭЖХ, элюент – гексан-ацетонтетрахлорметан (7:3:7), (n=6, Р=0,95) Навеска, Найдено Метрологические Навеска, Найдено Метрологические 0,02275 0,02292 100,76 х =100, 0,02595 0,02629 101,31 S =1, 0,02440 0,02486 101,88 S х =0, 0,02635 0,02620 99, 0,02265 0,02279 100, 0,02340 0,02317 99, Данная методика характеризуется хорошей воспроизводимостью и правильностью. Относительная ошибка среднего результата (n=6; Р=0,95) не более 1,20%. Продолжительность определения в вышеуказанных условиях около 30 минут. Методика достаточно селективна.

3.2.2 Анализ нимесулида, 4-А-2-ФФМСА, 4-МСА-3-ФФА, 4-Г-2-ФФМСА количественно определяли в элюенте гексан-диоксан-тетрахлорметан (1:1:1).

Построение калибровочных графиков нимесулида, 4-А-2-ФФМСА, 4МСА-3-ФФА и 4-Г-2-ФФМСА. В мерные колбы на 10 мл внесли 0,04; 0,08; 0,1;

0,2; 0,5; 1,0 и 4,0 мл раствора нимесулида (1000 мкг/мл); 0,04; 0,1; 0,2; 0,4; 0,8;

1,6 и 3,2 мл раствора 4-А-2-ФФМСА (500 мкг/мл); 0,04; 0,1; 0,2; 0,8; 1,6; 3,2 и 4, мл раствора 4-МСА-3-ФФА (500 мкг/мл) и 0,05; 0,1; 0,2; 0,4; 0,8; 1,6 и 3,2 мл раствора 4-Г-2-ФФМСА (2000 мкг/мл) в смеси гексан-диоксан-тетрахлорметан (1:1:1) и довели до метки каждую из колб указанной смесью. Каждый из полученных растворов ввели в хроматограф по вышеуказанной схеме.

Рассчитали площади хроматографических пиков, соответствующих различным концентрациям анализируемых веществ в пробе.

По полученным данным методом наименьших квадратов рассчитали уравнения калибровочных прямых линейного участка графиков. Уравнения имеют вид: S=0,226242•С+0,004484 (нимесулид), S=0,361616•С+0,003248 (4-АФФМСА), S=0,514343•С+0,005855 (4-МСА-3-ФФА), S=0,083164•С+0, (4-Г-2-ФФМСА), где S – площадь хроматографического пика, усл.ед.; С – концентрация анализируемого вещества в хроматографируемой пробе, мкг.

Определение нимесулида возможно в интервале концентраций 0,04-4,0 мкг, 4-АФФМСА – 0,02-1,6 мкг, 4-МСА-3-ФФА – 0,02-2,0 мкг, 4-Г-2-ФФМСА – 0,1Коэффициенты корреляции соответственно равны 0,99977; 0,99938; 0, и 0,99962.

Методика определения нимесулида. Около 25 мг (точная навеска) нимесулида растворили в 10-15 мл смеси гексан-диоксан-тетрахлорметан (1:1:1) в мерной колбе на 25 мл и довели раствор до метки указанной смесью растворителей (раствор А). 5,0 мл раствора А довели до метки указанной смесью растворителей в мерной колбе на 50 мл (раствор Б). 10 мкл раствора Б ввели в хроматограф по алгоритму, описанному для построения калибровочного графика. Содержание анализируемого вещества определили по калибровочному графику и пересчитали на навеску. Результаты представлены в таблице 5.

правильностью. Относительная ошибка среднего результата (n=6; Р=0,95) для нимесулида не более 1,22%. Продолжительность определения в вышеуказанных условиях около 30 минут. Разработанная методика достаточно селективна.

Таблица 5 – Результаты определения нимесулида и близких по структуре соединений методом прямофазовой ВЭЖХ, элюент – гексан-диоксантетрахлорметан (1:1:1), (n=6, Р=0,95) Навеска, Найдено Метрологические Навеска, Найдено Метрологические Методика определения 4-А-2-ФФМСА и 4-МСА-3-ФФА. Около 25 мг (точная навеска) одного из анализируемых соединений 4-А-2-ФФМСА или 4МСА-3-ФФА растворили в 10-15 мл смеси гексан-диоксан-тетрахлорметан (1:1:1) в мерной колбе на 25 мл и довели раствор до метки указанной смесью растворителей (раствор А). 2,5 мл раствора А довели до метки указанной смесью растворителей в мерной колбе на 50 мл (раствор Б). 10 мкл раствора Б ввели в хроматограф по алгоритму, описанному для построения калибровочного графика. Содержание анализируемого вещества определили по калибровочному графику и пересчитали на навеску. Результаты представлены в таблице 5.

правильностью. Относительная ошибка среднего результата (n=6; Р=0,95) для 4А-2-ФФМСА не более для 4-МСА-3-ФФА не более Продолжительность определения в вышеуказанных условиях около 30 минут.

Разработанные методики достаточно селективны.

Методика определения 4-Г-2-ФФМСА. Около 25 мг (точная навеска) 4Г-2-ФФМСА растворили в 10-15 мл смеси гексан-диоксан-тетрахлорметан (1:1:1) в мерной колбе на 25 мл и довели раствор до метки указанной смесью растворителей (раствор А). 5,0 мл раствора А довели до метки указанной смесью растворителей в мерной колбе на 25 мл (раствор Б). 10 мкл раствора Б ввели в хроматограф по алгоритму, описанному для построения калибровочного графика. Содержание 4-Г-2-ФФМСА определили по калибровочному графику и пересчитали на навеску. Результаты представлены в таблице 5.

правильностью. Относительная ошибка среднего результата (n=6; Р=0,95) для 4Г-2-ФФМСА не более 1,41%. Продолжительность определения в вышеуказанных условиях около 30 минут. Разработанная методика достаточно селективна.

3.3 Определение обращеннофазовой ВЭЖХ в градиентном режиме Количественный анализ 4-нитроанилина, 4-нитро-2-феноксианилина нимесулида, 4-А-2-ФФМСА, 4-МСА-3-ФФА и 4-Г-2-ФФМСА проводили методом обращеннофазовой ВЭЖХ на приборе Shimadzu LC-10Avp (Япония) с дегазатором подвижной фазы, термостатом колонки (60 °С) и UV-Visдетектированием. Колонка с силикагелем Luna 5мкм C18 марки Phenomenex® (Ирландия) размерами 2504.6 мм. Элюент – подвижная фаза состава В,% - С,%, где компонент В – 20 мМ фосфатный буфер KH2PO4 с рН 3,05, компонент С – ацетонитрил, в градиентном режиме (см. схему градиента в п. 2.7.4). Значения оптической плотности регистрировали при следующих длинах волн: нимесулид, 4-нитроанилин, 4-Н-2-ФА при 230 и 370 нм, 4-А-2-ФФМСА, 4-МСА-3-ФФА и 4Г-2-ФФМСА при 230 нм. Общее время хроматографирования – 25 мин. Объем вводимых проб – 20 мкл. Растворителем для всех проб анализируемых веществ явилась смесь 20 мМ фосфатного буфера KH2PO4 с рН 3,05 и ацетонитрила в соотношении (65:35), соответствующая составу начальной подвижной фазы в градиентном режиме элюирования. В дальнейшем – «начальный элюент».

Построение калибровочных графиков. В мерные колбы на 10 мл внесли 0,05; 0,1; 0,2; 0,8 и 4,0 мл раствора 4-нитроанилина (500 мкг/мл); 0,02; 0,05; 0,2;

0,8 и 4,0 мл раствора 4-Н-2-ФА (500 мкг/мл) и 0,02; 0,05; 0,2; 0,8; и 4,0 мл раствора нимесулида (250 мкг/мл); 0,016; 0,032; 0,16; 0,8 и 4,0 мл раствора 4-АФФМСА (500 мкг/мл); 0,016; 0,032; 0,16; 0,8 и 4,0 мл раствора 4-МСА-3-ФФА (500 мкг/мл) и 0,02; 0,05; 0,2; 2,0; и 4,0 мл раствора 4-Г-2-ФФМСА (1000 мкг/мл) в начальном элюенте и довели до метки каждую из колб указанной смесью.

Каждый из полученных растворов ввели в хроматограф по вышеуказанной схеме. Рассчитали площади хроматографических пиков, соответствующих различным концентрациям анализируемых веществ в пробе.

По полученным данным методом наименьших квадратов рассчитали уравнения калибровочных прямых линейного участка графиков. Уравнения имеют вид: S=2925839•С+71516 (4-нитроанилин 230 нм), S=1365606•С+5750 (4Н-2-ФА 230 нм), S=2548042•С+12081 (нимесулид 230 нм), S=6122286•С+ S=643338•С+3924 (нимесулид 370 нм), S=4104576•С–24916 (4-А-2-ФФМСА нм), S=3957090•С–4108 (4-МСА-3-ФФА 230 нм), S=162662•С+3511 (4-Г-2ФФМСА 230 нм), где S – площадь хроматографического пика, усл.ед.; С – концентрация анализируемого вещества в хроматографируемой пробе, мкг.

Коэффициенты корреляции соответственно равны 0,99987; 0,99975; 1,00000;

0,99982; 0,99996; 1,00000; 0,99943; 0,99961 и 0,99984. Определение 4нитроанилина возможно в интервале концентраций 0,005-4 мкг, 4-Н-2-ФА – 0,02-4 мкг, нимесулида – 0,01-2,0 мкг, 4-А-2-ФФМСА – 0,016-4 мкг, 4-МСА-3ФФА – 0,016-4 мкг, 4-Г-2-ФФМСА – 0,04-8 мкг в 20 мкл пробы.

Методики определения нимесулида (230 и 370 нм), 4-нитроанилина (230 и 370 нм), 4-Н-2-ФА (230 и 370 нм), 4-А-2-ФФМСА (230 нм), 4-МСА-3ФФА (230 нм) и 4-Г-2-ФФМСА (230 нм). Около 25 мг (точная навеска) 4-Г-2ФФМСА растворили в 10-15 мл начального элюента в мерной колбе на 25 мл и довели раствор до метки указанной смесью растворителей (раствор А). 5,0 мл раствора А довели до метки указанной смесью растворителей в мерной колбе на 25 мл (раствор Б). Около 25 мг (точная навеска) нимесулида растворили в 10- мл начального элюента в мерной колбе на 25 мл и довели раствор до метки указанной смесью растворителей (раствор А). 2,5 мл раствора А довели до метки указанной смесью растворителей в мерной колбе на 50 мл (раствор Б). Около мг (точная навеска) одного из анализируемых веществ (4-нитроанилина, 4-Н-2ФА, 4-А-2-ФФМСА или 4-МСА-3-ФФА) растворили в 10-15 мл начального элюента в мерной колбе на 25 мл и довели раствор до метки указанной смесью растворителей (раствор А). 5,0 мл раствора А довели до метки указанной смесью растворителей в мерной колбе на 50 мл (раствор Б). 20 мкл раствора Б ввели в хроматограф по алгоритму, описанному для построения калибровочного графика. Содержание анализируемого вещества определили по калибровочному графику и пересчитали на навеску. Результаты представлены в таблицах 6 и 7.

правильностью. Относительная ошибка среднего результата (n=6; Р=0,95) для 4нитроанилина (230 нм) составляет 1,36%, для 4-нитроанилина (370 нм) – 1,21%, для нимесулида (230 нм) – 1,15%, для нимесулида (370 нм) – 0,83%, для 4-Н-2ФА (230 нм) – 1,21%, для 4-Н-2-ФА (370 нм) – 1,02%, 4-А-2-ФФМСА (230 нм) – Таблица 6 – Результаты определения нимесулида и близких по структуре соединений методом обращеннофазовой ВЭЖХ; элюент – градиентный режим, ацетонитрил - буфер с рН 3,05; (n=6, Р=0,95) Навеска, Найдено Метрологические Навеска, Найдено Метрологические Таблица 7 – Результаты определения нимесулида и близких по структуре соединений методом обращеннофазовой ВЭЖХ; элюент – градиентный режим, ацетонитрил - буфер с рН 3,05; (n=6, Р=0,95) Навеска, Найдено Метрологические Навеска, Найдено Метрологические 0,02650 0,02652 100,09 х =100, 0,02550 0,02599 101, 0,02345 0,02330 99, 0,02520 0,02532 100, 1,25%, 4-МСА-3-ФФА (230 нм) – 1,05% и 4-Г-2-ФФМСА (230 нм) – 1,46%.

Продолжительность определения каждого из анализируемых соединений в вышеуказанных условиях около 30 минут. Разработанные методики достаточно селективны.

ГЛАВА 4 КОНЦЕНТРИРОВАНИЕ И ОЧИСТКА ОБЪЕКТОВ

ИССЛЕДОВАНИЯ

4.1 Экстракционные методы очистки и концентрирования Жидкость-жидкостную экстракцию применяли для очистки, разделения и концентрирования исследуемых веществ, находящихся в извлечениях из биологического материала.

Изучали особенности экстрагирования нимесулида и близких по структуре соединений из водных растворов, варьируя условия экстракции (тип экстрагента, наличие или отсутствие электролита, тип электролита, значения рН водной фазы).

4.1.1 Жидкость-жидкостная экстракция гидрофобными экстрагентами При изучении характера экстрагирования рассматриваемых соединений из водных растворов было выбрано по одному гидрофобному экстрагенту из различных химических групп. Из группы алифатических углеводородов выбран н-гексан, ароматических углеводородов – бензол, галогеналканов – хлороформ, алифатических спиртов – н-бутанол, простых эфиров – диэтиловый эфир, сложных эфиров – этилацетат. Дополнительно изучали экстракцию диэтиловым эфиром и этилацетатом насыщенными водой.

Для этого в ряд делительных воронок вносили по 25 мл 1 М раствора серной кислоты, по 0,1 М раствора кислоты хлороводородной, по 25 мл буферного раствора с различным значением рН (0,3-11,98) по 25 мл 5%, 15%, 25% раствора натрия гидроксида. В качестве буферного раствора использовали универсальную буферную смесь кислот (ортофосфорной – 3,92 г, борной – 2, г, уксусной – 2,4 г до 1 л) и 0,2 М раствор натрия гидроксида, взятых в различных соотношениях.

Затем вносили 25 мл водного раствора одного из исследуемых соединений (4-нитроанилин, 4-Н-2-ФА и нимесулид – 5 мкг/мл, 4-А-2-ФФМСА, 4-МСА-3ФФА и 4-Г-2-ФФМСА – 6 мкг/мл) и 10 мл экстрагента. После 100 равномерных аккуратных покачиваний воронок (в течение 3,5 мин) содержимое воронок отстаивали в течение пяти мин. Затем контактирующие фазы отделяли друг от друга. Экстракты органического слоя помещали в выпарительные чашки и удаляли растворитель в токе воздуха при комнатной температуре. Каждый из остатков 4-нитроанилина, 4-Н-2-ФА и нимесулида растворяли в 10 мл ДМФА, остатки 4-А-2-ФФМСА, 4-Г-2-ФФМСА и 4-МСА-3-ФФА в чашках растворяли в 10 мл этанола. Оптическую плотность каждого раствора измеряли на спектрофотометре СФ-2000 при соответствующих длинах волн (4-нитроанилин – 384,9 нм; 4-Н-2-ФА – 390,3 нм; нимесулид – 439,4 нм; 4-А-2-ФФМСА – 249, нм; 4-МСА-3-ФФА – 254,3 нм; 4-Г-2-ФФМСА – 241,5 нм) в кюветах 10 мм на фоне растворов контрольного эксперимента. Используя уравнения калибровочных графиков (см. 3.1.1 и 3.1.2) и значения полученных оптических плотностей определяли количество анализируемого вещества, перешедшего в слой экстрагента (R%, r=n). Используя полученные данные по известным формулам рассчитывали значения степени однократного экстрагирования в условиях соотношения водной и органической фаз 1:1 (R%, r=1) [50].

Результаты представлены в соответствии с рисунками 33-38.

Анализ полученных результатов позволил оценить влияние рН среды в условиях равенства контактирующих фаз на характер извлечения исследуемых соединений гидрофобными экстрагентами из водных растворов. Кривые экстракции 4-нитроанилина и 4-Н-2-ФА показали, что данные соединения достаточно хорошо экстрагируются в широком интервале рН практически всеми экстрагентами, кроме гексана. Лучшим экстрагентом для 4-нитроанилина явился этилацетат насыщенный водой (при r=1 степень экстрагирования составляет 77,89-87,41%). Худшим – гексан (1,21-6,47%). Лучшим экстрагентом для 4-Н-2ФА явился бензол (при r=1 степень экстрагирования составляет 95,96-99,51%).

Худшим – гексан (87,06-95,37%).

Кривые экстракции нимесулида, 4-МСА-3-ФФА и 4-Г-2-ФФМСА выявили их способность, как соединений кислого характера, экстрагироваться из кислых сред. Наилучшая экстрагируемость нимесулида большинством гидрофобных экстрагентов достигается в интервале рН 0,3-5,02. В качестве лучшего экстрагента был выбран этилацетат (при r=1 степень экстрагирования составляет 43,49-96,75%). Следует отметить, что при сдвиге рН от 5,02 до 0,3 в кислую сторону эстрагируемость нимесулида гексаном возрастает от 4,98 до 67,25%.

Интервалы экстрагируемости многими гидрофобными экстрагентами 4МСА-3-ФФА и 4-Г-2-ФФМСА по сравнению с нимесулидом еще больше уширены и находятся в диапазоне рН 0,3-10,88. 4-МСА-3-ФФА и 4-Г-2-ФФМСА лучше экстрагируются этилацетатом (при r=1 степень экстрагирования составляет соответственно 94,21-99,98 и 94,72-99,99%). Низкие значения экстрагируемости 4-МСА-3-ФФА и 4-Г-2-ФФМСА гексаном (0,23-3,41% и 0,01соответственно, r=1) по сравнению с нимесулидом, позволяют использовать данные условия для отделения 4-МСА-3-ФФА от нимесулида в водных средах при их совместном присутствии (например, биожидкости людей, принимавших нимесулид).

Наилучший характер экстрагируемости 4-А-2-ФФМСА гидрофобными экстрагентами наблюдается в интервале рН 2,87-8,95. Данный факт подтверждает слабую основность 4-А-2-ФФМСА. В интервалах рН 2,87-0,3;

8,95-11,98; а также в 5, 15 и 25% растворах гидроксида натрия наблюдается снижение величины экстрагируемости данного соединения. Лучшим экстрагентом явился этилацетат насыщенный водой (при r=1 степень экстрагирования составляет 63,91-99,06%). Худшие значения показал гексан (4,05-4,2%).

Комплексный анализ данных экстрагирования 4-нитроанилина, 4-Н-2-ФА, нимесулида, 4-А-2-ФФМСА, 4-МСА-3-ФФА и 4-Г-2-ФФМСА позволил выявить условия экстракции, при которых возможно селективно экстрагировать нимесулид, 4-А-2-ФФМСА, 4-МСА-3-ФФА из диэтилового эфира в водную фазу. Так, при извлечении нимесулида буферным раствором с рН 7-8 из эфирной фазы 4-А-2-ФФМСА и 4-МСА-3-ФФА практически полностью остаются в диэтиловом эфире. При экстрагировании 4-А-2-ФФМСА буферным раствором с рН 0,3-0,5 4-МСА-3-ФФА практически полностью остается в эфирном слое и не переходит в водную фазу. Дальнейшее экстрагирование 4-МСА-3-ФФА из эфирного слоя буферным раствором с рН 11-12 позволяет практически полностью извлечь 4-МСА-3-ФФА из эфирного слоя.

Для улучшения условий экстрагирования каждого из анализируемых соединений был проведен дальнейший подбор оптимального высаливающего электролита в сочетании с выбранным лучшим гидрофобным экстрагентом.

4.1.2 Жидкость-жидкостная экстракция гидрофобными экстрагентами в Подбор оптимального высаливающего агента проводили на следующих группах электролитов: хлориды, сульфаты, бромиды, фториды (натрия, калия и аммония). Дополнительно в качестве высаливающего агента был использован карбамид. Каждый из электролитов добавляли в водную фазу до состояния насыщения. Рассматриваемые соединения при этом экстрагировали и количественно определяли в экстрактах по схеме описанной в п. 4.1.1.

Используя полученные данные по известным формулам рассчитывали значения степени однократного экстрагирования в условиях соотношения водной и органической фаз 1:1 (R%, r=1) [50]. Результаты представлены в соответствии с рисунками 39-50 (приложение).

Анализ полученных данных показал, что для всех исследуемых соединений при применении практически любого высаливающего агента из разных групп (хлориды, сульфаты, бромиды, фториды и карбамид) наблюдается значительное уширение интервала экстрагируемости и повышение значений степени экстрагирования лучшим гидрофобным экстрагентом. Практически при всех значениях рН и при использовании 5, 15 и 25% растворов натрия гидроксида, а также при использовании практически любого электролита наблюдается степень экстрагирования около 75-89% для 4-нитроанилина, 39для 4-Н-2-ФА и 4-Г-2-ФФМСА, и около 90-99% для нимесулида, 4-А-2ФФМСА и 4-МСА-3-ФФА. В качестве оптимального высаливающего электролита для 4-нитроанилина и 4-Н-2-ФА был выбран аммония сульфат, для нимесулида, 4-А-2-ФФМСА и 4-МСА-3-ФФА – натрия бромид, а для 4-Г-2ФФМСА – аммония бромид.

По результатам однократного экстрагирования нимесулида и близких по структуре соединений был произведен расчет кратности экстрагирования (при r=1), требуемой для извлечения заданных количеств анализируемых веществ органическими экстрагентами без применения высаливающего электролита, а также оптимальными экстрагентами (бензол, этилацетат, этилацетат насыщенный водой) в присутствии электролитов при трех лучших значениях рН экстрагируемости, результаты исследования представлены в таблице 8.

Таким образом, использование комбинации лучшего гидрофобного экстрагента в сочетании с лучшим высаливающим электролитом позволяет экстрагировать нимесулид, 4-Н-2-ФА, 4-А-2-ФФМСА, 4-МСА-3-ФФА и 4-Г-2ФФМСА из водных растворов на 99,99% уже при двукратной экстракции, 4нитроанилин – при пятикратной экстракции.

4.2 Хроматографические методы очистки и концентрирования Более тонкая очистка объектов исследования возможна при использовании таких хроматографических методов, как хроматография в тонком слое сорбента и жидкостная макроколоночная хроматография низкого давления.

4.2.1 Хроматография в тонком слое нормальнофазового сорбента Характеристика хроматографической подвижности нимесулида и близких по структуре соединений приведена в п. 2.7.1 и 2.7.2 настоящей диссертации.

Таблица 8 – Результаты исследования кратности экстрагирования нимесулида и близких по структуре соединений в оптимальных условиях Экстрагент Электролит рН 90,0 95,0 96,0 97,0 98,0 99,0 99,5 99,9 99, Этилацетат насыщенный Этилацетат Этилацетат насыщенный Этилацетат Этилацетат Исходя из данных п. 2.7.1 в качестве оптимальной подвижной фазы при хроматографировании нимесулида и близких по структуре соединений в тонком слое сорбента с гидроксилированной поверхностью (пластины «Сорбфил» с УФиндикатором) была выбрана система толуол-ацетонитрил (7:3).

Определение нимесулида и близких по структуре соединений в тонком слое гидроксилированного силикагеля проводили по следующей схеме. 0,025 г (точная навеска) анализируемого соединения растворяли в 10-15 мл ацетона в мерной колбе на 25 мл и доводили до метки содержимое колбы ацетоном. 0,3 мл данного раствора наносили полосой на линию старта пластины «Сорбфил» с УФ-индикатором. На линию старта также наносили 5-10 мкл 0,02% раствора соответствующего вещества-свидетеля в этаноле. Хроматографирование осуществляли в камерах внутренним объемом 600 см 3, элюент – толуолацетонитрил (7:3). Анализируемые соединения детектировали на элюировали с пластин ДМФА, 4-А-2-ФФМСА, 4-МСА-3-ФФА и 4-Г-2-ФФМСА – этанолом. Измеряли оптические плотности элюатов и количественно определяли исследуемые вещества по схемам, описанным в п. 3.2.1 (для 4нитроанилина, 4-Н-2-ФА и нимесулида) и 3.2.2 (4-А-2-ФФМСА, 4-МСА-3-ФФА и 4-Г-2-ФФМСА) настоящей диссертации, пересчитывая на навеску взятую для анализа. Результаты определения представлены в таблице 31 (приложение).

4.2.2 Хроматография в тонком слое обращеннофазового сорбента Исходя из данных п. 2.7.2 при хроматографировании нимесулида и близких по структуре соединений в тонком слое обращеннофазового сорбента (пластины «Сорбфил», модель алкильной привитой фазы С 14-15) рекомендован оптимальный элюент состава метанол-буферный раствор с рН 8,95 (4:7).

Определение нимесулида и близких по структуре соединений в тонком слое обращеннофазового сорбента (модель алкильной привитой фазы С 14-15) проводили по следующей схеме. 0,025 г (точная навеска) анализируемого соединения растворяли в 10-15 мл ацетона в мерной колбе на 25 мл и доводили до метки содержимое колбы ацетоном. 0,3 мл данного раствора наносили полосой на линию старта пластины «Сорбфил» с УФ-индикатором, предварительно обработанной 10% раствором вазелинового масла в гексане. На линию старта также наносили 5-10 мкл 0,02% раствора соответствующего вещества-свидетеля в этаноле. Хроматографирование осуществляли в камерах внутренним объемом 600 см3, элюент – метанол-буферный раствор с рН 8, (7:4). Дальнейший анализ проводили согласно п. 4.2.1 настоящей диссертации.

Результаты определения представлены в таблице 31 (приложение).

Анализ полученных результатов показал, что потери исследуемых веществ после очистки хроматографией в тонких слоях нормальнофазового и обращеннофазового сорбента (модель искусственно привитой алкильной фазы С14-15) незначительны и составляют немногим менее 0,31%.

4.2.3 Макроколоночная нормальнофазовая хроматография При исследовании нимесулида и близких по структуре соединений методом нормальнофазовой макроколоночной хроматографии низкого давления 0,005 г (точная навеска) анализируемого соединения растворяли в 2-3 мл ацетона и присыпали к полученному раствору 1,5 г силикагеля L 40/100 мкм.

Сорбент перемешивали до сухого состояния, распределяли тонким слоем по поверхности выпарительной чашки и оставляли на 25-30 мин при комнатной температуре для полного удаления ацетона. В колонку внутренним диаметром 12 мм содержащую 8,5 г силикагеля L 40/100 мкм присыпали 1,5 г подготовленного сорбента с веществом, уплотняли сорбент и добавляли элюент.

Высоту столба элюента в колонке при хроматографировании поддерживали на уровне 28-29 см от верней части сорбента. Собирали фракции элюата по 2 мл в отдельные пробирки. 5-10 мкл из каждой фракции наносили на линию старта пластины «Сорбфил» с УФ-индикатором и хроматографировали с веществомсвидетелем в подвижной фазе толуол-ацетонитрил (7:3).

При наличии пятен на хроматограммах и совпадению их Rf со значениями Rf стандарта, фракции содержащие анализируемое вещество переносили в выпарительные чашки, элюент отгоняли в токе воздуха при комнатной температуре. Остаток, содержащий 4-нитроанилин, 4-Н-2-ФА или нимесулид растворяли в 5 мл ДМФА, содержащий 4-А-2-ФФМСА, 4-МСА-3-ФФА или 4-ГФФМСА – растворяли в 5 мл этанола и измеряли оптические плотности полученных растворов. Количественное определение исследуемых веществ определяли по схемам, описанным в п. 3.1.1 (для 4-нитроанилина, 4-Н-2-ФА и нимесулида) и 3.1.2 (для 4-А-2-ФФМСА, 4-МСА-3-ФФА и 4-А-2-ФФМСА) настоящей диссертации. По полученным данным рассчитывали ряд хроматографических параметров. Определяли объемы удерживания рассматриваемых веществ (VR), объем удерживания неудерживаемого вещества (V0), время удерживания (tR) и время удерживания неудерживаемого компонента (t0), ширину пика у основания (), скорость истечения элюента (), коэффициент асимметрии пика (AS), число теоретических тарелок (N), высоту эквивалентную одной теоретической тарелке (Н), приведенную высоту эквивалентную одной теоретической тарелке (H'), абсолютный и относительный коэффициенты емкости (k') и (k'st ), относительный фактор емкости (Fk'), относительное изменение свободной энергии при адсорбции ((G)). Относительный коэффициент емкости для 4-Н-2-ФА и нимесулида рассчитывали относительно 4-нитроанилина, для 4-А-2-ФФМСА и 4-МСА-3-ФФА – относительно 4-Г-2ФФМСА [47, 67].

Элюирование нимесулида и близких по структуре соединений методом нормальнофазовой макроколоночной хроматографии низкого давления проводили в системах гексан-ацетон и толуол-ацетонитрил с различным соотношением компонентов в каждой из них.

Оптимальный элюент при этом выбирали таким образом, чтобы анализируемое соединение выходило не ранее 5-6 фракций и, по возможности, не позже 50-60. В качестве оптимального элюента для 4-нитроанилина (15- фракции), 4-Н-2-ФА (13-28 фракции) и нимесулида (9-19 фракции) выбрана смесь гексан-ацетон (8:2), для 4-А-2-ФФМСА (7-14 фракции), 4-МСА-3-ФФА (10-23 фракции) и 4-Г-2-ФФМСА (5-16 фракции) – гексан-ацетон (6:4).

Результаты представлены в таблице 28 (приложение).

Зависимости объемов удерживания нимесулида и близких по структуре соединений от различных соотношений компонентов в системах гексан-ацетон и толуол-ацетонитрил представлены в соответствии с рисунками 51- (приложение).

Результаты количественного определения нимесулида и близких по структуре соединений в оптимальных подвижных фазах представлены в таблице 43 (приложение). Анализ полученных результатов показал, что потери исследуемых веществ после очистки методом жидкостной колоночной хроматографии низкого давления незначительны и составляют немногим менее 0,27%.

4.2.4 Макроколоночная обращеннофазовая хроматография При исследовании нимесулида и близких по структуре соединений методом обращеннофазовой макроколоночной хроматографии низкого давления 0,005 г (точная навеска) анализируемого соединения растворяли в 2-3 мл ацетона и присыпали к полученному раствору 1,0 г сорбента Silasorb C18 30 мкм.

Сорбент перемешивали до сухого состояния, распределяли тонким слоем по поверхности выпарительной чашки и оставляли на 25-30 мин при комнатной температуре для полного удаления ацетона. В колонку внутренним диаметром 12 мм содержащую 6,5 г сорбента Silasorb C18 30 мкм присыпали 1,0 г подготовленного сорбента с веществом, уплотняли сорбент и добавляли элюент.

Дальнейший анализ и расчет параметров хроматографирования проводили согласно п. 4.2.3, настоящей диссертации.

Оптимальный элюент при этом выбирали таким образом, чтобы анализируемое соединение выходило не ранее 4-5 фракции и, по возможности, не позже 60-70. В качестве оптимального элюента для 4-нитроанилина (4- фракции) использовали смесь вода-ацетон (9,5:0,5), для 4-Г-2-ФФМСА (7- фракции) и 4-МСА-3-ФФА (4-31 фракции) – вода-ацетон (8,5:1,5), для 4-А-2ФФМСА (6-28 фракции) – вода-ацетон (8:2), для 4-Н-2-ФА (8-21 фракции) – вода-ацетон (5:5), для нимесулида (5-60 фракции) – вода-ацетон (6,5:3,5).

Элюирование нимесулида и близких по структуре соединений методом обращеннофазовой макроколоночной хроматографии низкого давления проводили в системах вода-ацетон и вода-ацетонитрил с различным соотношением компонентов в каждой из них. Результаты представлены в таблицах 29-30 (приложение).

Зависимости объемов удерживания нимесулида и близких по структуре соединений от различных соотношений компонентов в системах водаацетонитрил и вода-ацетон представлены в соответствии с рисунками 51- (приложение).

Результаты количественного определения нимесулида и близких по структуре соединений в оптимальных подвижных фазах представлены в таблице 31 (приложение). Анализ полученных результатов показал, что потери исследуемых веществ после очистки методом обращеннофазовой жидкостной макроколоночной хроматографии низкого давления незначительны и составляют немногим менее 0,27%.

4.3 Моделирование очистки извлечений из биоматериала в контрольных В качестве модельного объекта для изучения степени очистки ацетоновых извлечений из биоматериала была использована трупная печень. Получение извлечений для моделирования очистки проводили по следующей схеме.

По 25 г мелкоизмельченной трупной печени настаивали с 50 г ацетона в течение 45 минут при периодическом перемешивании. Ацетоновые извлечения переносили с твердого остатка в химический стакан. Процесс настаивания повторяли по вышеописанной схеме. Затем первое и второе извлечения в каждом случае объединяли, фильтровали в выпарительную чашку, промывали 20-25 мл ацетона и упаривали до сухого остатка в токе воздуха. Остаток растворяли в 10-15 мл ацетона, фильтровали, промывали фильтр ацетоном, и снова упаривали до сухого остатка. Остатки в чашках исследовали, применяя различные виды очистки.

4.3.1 Модель очистки в тонком слое нормальнофазового сорбента Полученный по схеме в п. 4.3 остаток в чашке растворяли в 6-7 мл ацетона, количественно переносили в мерную колбу на 10 мл и доводили объем до метки ацетоном. 1,0 мл полученного раствора полосой наносили на пластину «Сорбфил» с УФ-индикатором. Хроматографирование проводили в присутствии веществ-свидетелей по схеме описанной в п. 4.2.1. Хроматограммы проявляли в УФ-свете. Участок, соответствующий по площади и положению анализируемому веществу, вырезали и элюировали 5 мл ацетонитрила.

Оптическую плотность полученных растворов измеряли при длинах волн 366, нм (4-нитроанилин), 375,1 нм (4-Н-2-ФА), 298,8 нм (нимесулид), 302,9 нм (4-АФФМСА), 290,5 нм (4-МСА-3-ФФА), 287,2 нм (4-Г-2-ФФМСА). Раствор сравнения – ацетонитрил.

Параллельно вырезанные участки хроматограмм помещали в 5 мл ДМФА (при анализе 4-нитроанилина, 4-Н-2-ФА, нимесулида) или 5 мл этанола (при анализе 4-А-2-ФФМСА, 4-МСА-3-ФФА, 4-Г-2-ФФМСА). Оптическую плотность растворов в ДМФА измеряли при 384,9; 391,4 и 439,4 нм, а растворов в этаноле при 249,7; 298,4; 254,3; 287,6; 241,5 и 280,6 нм. Измерения проводили на спектрофотометре СФ-2000 в кюветах с толщиной рабочего слоя 10 мм.

Растворы сравнения – ДМФА и этанол соответственно. Результаты измерений представлены в таблице 32 (приложение).

Полученные значения оптических плотностей незначительны, что характеризует относительную эффективность данного способа очистки.

4.3.2 Модель очистки в тонком слое обращеннофазового сорбента Полученный по схеме в п. 4.3 остаток в чашке растворяли в 6-7 мл ацетона, количественно переносили в мерную колбу на 10 мл и доводили объем до метки ацетоном. 1,0 мл полученного раствора полосой наносили на пластину «Сорбфил» с УФ-индикатором (модель алкильной привитой фазы С 14-15).

Хроматографирование проводили в присутствии веществ-свидетелей по схеме описанной в п. 4.2.2. Хроматограммы проявляли в УФ-свете. Участок, соответствующий по площади и положению анализируемому веществу, вырезали и элюировали 5 мл смеси 20 мМ буферного раствора KH2PO4 с рН 3, и ацетонитрила (65:35) (4-нитроанилин, 4-А-2-ФФМСА, 4-МСА-3-ФФА и 4-Г-2ФФМСА) или 5 мл смеси 20 мМ буферного раствора KH2PO4 с рН 3,05 и ацетонитрила (60:40) (4-Н-2-ФА) или 5 мл смеси 20 мМ буферного раствора KH2PO4 с рН 3,05 и ацетонитрила (55:45) (нимесулид). Оптическую плотность полученных растворов измеряли при длинах волн 230 нм (4-нитроанилин, 4-Н-2ФА, нимесулид, 4-А-2-ФФМСА, 4-МСА-3-ФФА и 4-Г-2-ФФМСА) и 370 нм (4нитроанилин, 4-Н-2-ФА, нимесулид).

Параллельно вырезанные участки хроматограмм помещали в 5 мл ДМФА (при анализе 4-нитроанилина, 4-Н-2-ФА, нимесулида) или 5 мл этанола (при анализе 4-А-2-ФФМСА, 4-МСА-3-ФФА, 4-Г-2-ФФМСА). Дальнейший анализ растворов проводили согласно п. 4.3.1.

Результаты измерений представлены в таблице 32 (приложение).

Полученные значения оптических плотностей незначительны, что характеризует относительную эффективность данного способа очистки.

4.3.3 Модель очистки с применением жидкость-жидкостной экстракции Полученный по схеме в п. 4.3 остаток в чашке растворяли в 10 мл ацетонитрила (анализ 4-нитроанилина и 4-Н-2-ФА) или 10 мл диэтилового эфира (анализ нимесулида, 4-А-2-ФФМСА и 4-МСА-3-ФФА) или 10 мл хлороформа (анализ 4-Г-2-ФФМСА).

Каждый из ацетонитрильных растворов (анализ 4-нитроанилина и 4-Н-2ФА) разбавляли 40 мл буферного раствора с рН 8-9 и насыщали полученный раствор аммония сульфатом. Каждую из водных фаз экстрагировали по схеме указанной в п. 4.1.1. 50 мл этилацетата насыщенного водой (анализ 4нитроанилина) или 50 мл бензола (анализ 4-Н-2-ФА). Экстрагент отделяли, процесс экстракции повторяли. Первый и второй экстракты объединяли, упаривали в токе воздуха при комнатной температуре до сухого остатка [85, 92].

При анализе нимесулида, 4-А-2-ФФМСА и 4-МСА-3-ФФА эфирную фазу экстрагировали трехкратно равным объемом буферного раствора. Водные фазы в каждом случае объединяли. При экстрагировании нимесулида использовали буферный раствор с рН 8-9, 4-А-2-ФФМСА – рН 0,3-0,5 и 4-МСА-3-ФФА – рН 11-12. Затем каждый из водных экстрактов доводили до рН 6-7 (используя 2 М раствор кислоты хлороводородной для нимесулида, 4-МСА-3-ФФА и 2 М раствор гидроксида натрия для 4-А-2-ФФМСА), насыщали натрия бромидом и экстрагировали двукратно по 30 мл этилацетатом (анализ нимесулида и 4-МСАФФА) или этилацетатом насыщенным водой (анализ 4-А-2-ФФМСА).

Этилацетатные извлечения в каждом случае объединяли и упаривали в токе воздуха при комнатной температуре до сухого остатка.

При анализе 4-Г-2-ФФМСА хлороформную фазу экстрагировали трехкратно равным объемом буферного раствора с рН 11-12. Водные извлечения объединяли, доводили до рН 6-7 2 М раствором кислоты хлороводородной, насыщали аммония бромидом и экстрагировали двукратно по 30 мл этилацетатом. Этилацетатные извлечения объединяли, упаривали в токе воздуха при комнатной температуре до сухого остатка.

Каждый из остатков растворяли в 50 мл смеси 20 мМ буферного раствора KH2PO4 с рН 3,05 и ацетонитрила (65:35) (4-нитроанилин) или 50 мл смеси мМ буферного раствора KH2PO4 с рН 3,05 и ацетонитрила (60:40) (4-Н-2-ФА) или 50 мл смеси 20 мМ буферного раствора KH2PO4 с рН 3,05 и ацетонитрила (55:45) (нимесулид). Оптическую плотность полученных растворов измеряли при длинах волн 230 и 370 нм, остатки при анализе 4-А-2-ФФМСА, 4-МСА-3ФФА и 4-Г-2-ФФМСА растворяли в 50 мл смеси смеси 20 мМ буферного раствора KH2PO4 с рН 3,05 и ацетонитрила (65:35). Оптическую плотность полученных растворов измеряли при длине волны 230 нм. Оптические плотности полученных образцов измеряли на фоне соответствующих растворяющих смесей в кюветах с длиной оптического пути 10 мм.

Параллельно полученные остатки растворяли в 50 мл смеси растворителей гексан-ацетон-тетрахлорметан (7:3:7) (4-нитроанилин, 4-Н-2-ФА, нимесулид) или в 50 мл смеси растворителей гексан-диоксан-тетрахлорметан (1:1:1) (нимесулид, 4-А-2-ФФМСА, 4-МСА-3-ФФА и 4-Г-2-ФФМСА). Оптические плотности полученных образцов измеряли на фоне соответствующих растворяющих смесей в кюветах с длиной оптического пути 10 мм. Для смеси гексан-ацетон-тетрахлорметан (7:3:7) использовали длины волн 330 и 360 нм, для смеси растворителей гексан-диоксан-тетрахлорметан (1:1:1) – 250 нм.

Параллельно полученные остатки растворяли в 50 мл ДМФА (при анализе 4-нитроанилина, 4-Н-2-ФА, нимесулида) или 50 мл этанола (при анализе 4-А-2ФФМСА, 4-МСА-3-ФФА, 4-Г-2-ФФМСА). Оптическую плотность растворов в ДМФА измеряли при 384,9; 391,4 и 439,4 нм, а растворов в этаноле при 249,7;

298,4; 254,3; 287,6; 241,5 и 280,6 нм. Растворы сравнения – ДМФА и этанол соответственно. Вышеуказанные измерения проводили на спектрофотометре СФ-2000 в кюветах с толщиной рабочего слоя 10 мм. Результаты измерений представлены в таблице 32 (приложение).

Полученные значения оптических плотностей фотометрируемых растворов свидетельствуют о недостаточной очистке извлечений из трупной печени. Всвязи с чем, рекомендуется комбинация данного способа очистки с другими.

4.3.4 Модель очистки на макроколонке с нормальнофазовым сорбентом Полученный по схеме в п. 4.3 остаток в чашке растворяли в 2-3 мл ацетона, ацетоновый раствор смешивали с 1,5 г силикагеля L 40/100 мкм, подготовку пробы к хроматографированию проводили по схеме, указанной в п.

4.2.3. Моделирование очистки 4-нитроанилина, 4-Н-2-ФА и нимесулида проводили, используя элюент гексан-ацетон (8:2), для моделирования очистки 4А-2-ФФМСА, 4-МСА-3-ФФА и 4-Г-2-ФФМСА применяли элюент – гексанацетон (6:4). Собирали фракции элюата по 2 мл. Фракции, в которых могут содержаться анализируемые вещества объединяли в выпарительной чашке и испаряли элюент в токе воздуха при комнатной температуре. Остатки в которых могут содержаться анализируемые вещества после испарения растворяли в 50 мл ДМФА (анализ 4-нитроанилина, нимесулида, 4-Н-2-ФА) или 50 мл этанола (анализ 4-А-2-ФФМСА, 4-МСА-3-ФФА и 4-Г-2-ФФМСА). Оптическую плотность растворов в ДМФА измеряли при 384,9; 391,4 и 439,4 нм, а растворов в этаноле при 249,7; 298,4; 254,3; 287,6; 241,5 и 280,6 нм. Растворы сравнения – ДМФА и этанол соответственно. Вышеуказанные измерения проводили на спектрофотометре СФ-2000 в кюветах с толщиной рабочего слоя 10 мм.

Параллельно анализировали сухие остатки по схеме указанной в п. 4.3. (растворение в смеси 20 мМ буферного раствора KH2PO4 с рН 3,05 и ацетонитрила). Результаты измерений представлены в таблице 32 (приложение).

Полученные значения оптических плотностей фотометрируемых растворов незначительны, что характеризует достаточную эффективность данного способа очистки при использовании подвижных фаз гексан-ацетон в соотношении 8:2 и 6:4.

4.3.5 Модель очистки на макроколонке с обращеннофазовым силикагелем Полученный по схеме в п. 4.3 остаток в чашке растворяли в 2-3 мл ацетона, ацетоновый раствор смешивали с 1,5 г сорбента Silasorb C18 30 мкм, подготовку пробы к хроматографированию проводили по схеме, указанной в п.

4.2.4. Моделирование очистки 4-нитроанилина проводили, используя элюент вода-ацетон (9,5:0,5), для моделирования очистки 4-Г-2-ФФМСА и 4-МСА-3ФФА применяли элюент вода-ацетон (8,5:1,5), для 4-А-2-ФФМСА – вода-ацетон (8:2), для 4-Н-2-ФА – вода-ацетон (5:5), для нимесулида – вода-ацетон (6,5:3,5).

Собирали фракции элюата по 2 мл. Фракции, в которых могут содержаться анализируемые вещества объединяли в выпарительной чашке и испаряли элюент в токе воздуха при комнатной температуре. Остатки после испарения нимесулида растворяли в 50 мл смеси гексан-ацетон-тетрахлорметан (7:3:7) или в 50 мл смеси гексан-диоксан-тетрахлорметан (1:1:1) (анализ нимесулида, 4-А-2ФФМСА, 4-МСА-3-ФФА и 4-Г-2-ФФМСА). Оптические плотности полученных образцов измеряли на фоне соответствующих растворяющих смесей в кюветах с длиной оптического пути 10 мм. Для смеси гексан-ацетон-тетрахлорметан (7:3:7) использовали длины волн 330 нм (анализ нимесулида) и 360 нм (анализ 4нитроанилина и для смеси растворителей гексан-диоксанН-2-ФА), тетрахлорметан (1:1:1) – 250 нм.

Параллельно полученные фракции, в которых могут содержаться анализируемые вещества растворяли в 50 мл ДМФА (анализ 4-нитроанилина, нимесулида, 4-Н-2-ФА) или 50 мл этанола (анализ 4-А-2-ФФМСА, 4-МСА-3ФФА и 4-Г-2-ФФМСА). Оптическую плотность растворов в ДМФА измеряли при 384,9; 391,4 и 439,4 нм, а растворов в этаноле при 249,7; 298,4; 254,3; 287,6;

241,5 и 280,6 нм. Растворы сравнения – ДМФА и этанол соответственно.

Вышеуказанные измерения проводили на спектрофотометре СФ-2000 в кюветах с толщиной рабочего слоя 10 мм. Результаты измерений представлены в таблице 32 (приложение).

Полученные значения оптических плотностей фотометрируемых растворов незначительны, что характеризует достаточную эффективность данного способа очистки при использовании вышеуказанных элюентов.

4.3.6 Модель очистки комбинацией жидкость-жидкостной экстракции и макроколоночной нормальнофазовой хроматографии Полученный по схеме в п. 4.3 остаток в чашке экстрагировали согласно схеме, описанной в п. 4.3.3. Дальнейшие исследования остатков в чашках после экстрагирования и измерения проводили по схеме, описанной в п. 4.3.4.

Результаты представлены в таблице 32 (приложение).

Полученные значения оптических плотностей рассматриваемых соединений характеризуют данный способ очистки, как наиболее эффективный из указанных выше.

4.3.7 Модель очистки комбинацией жидкость-жидкостной экстракции и макроколоночной обращеннофазовой хроматографии Полученный по схеме в п. 4.3 остаток в чашке экстрагировали согласно схеме, описанной в п. 4.3.3. Дальнейшие исследования остатков в чашках после экстракции и измерения проводили по схеме, описанной в п. 4.3.5. Результаты представлены в таблице 32 (приложение).

Полученные значения оптических плотностей характеризуют данный способ очистки, как наиболее эффективный из указанных выше (за исключением способа очистки в п. 4.3.6). Рассмотренный способ очистки может быть использован взамен способу, описанному в п. 4.3.6.

ГЛАВА 5 ОПРЕДЕЛЕНИЕ НИМЕСУЛИДА И БЛИЗКИХ ПО СТРУКТУРЕ

СОЕДИНЕНИЙ В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ

5.1 Изолирование из биологической ткани настаиванием. Поиск Среди существующих способов изолирования отравляющих веществ из биоматериала при химико-токсикологических испытаниях, метод настаивания занимает лидирующее место. Он не требует сложной пробоподготовки и использования дорогостоящей аппаратуры. В то же время при правильном подборе условий можно достичь высоких значений извлечения токсиканта и минимизировать количество сопутствующих эндогенных веществ биоматериала.

На первом этапе поиска оптимальных условий изолирования нимесулида и близких по структуре соединений проводили выбор лучшего изолирующего агента. При этом учитывали способность потенциального изолирующего агента к лучшему растворению всех исследуемых соединений и проникновению через цитоплазматическими структурными элементами. Дополнительными факторами выбора оптимального изолирующего агента явились его лучшая летучесть и способность к ослаблению или разрушению лабильных связей исследуемых веществ с активными химическими центрами структурных элементов клеток.

Выбор лучшего изолирующего агента проводили на ряде гомологов или индивидуальных органических растворителей из различных химических групп, а также смесей отдельных растворителей. Использовали алканы (н-гексан), арены (бензол, толуол, о-ксилол), галогеналканы (дихлорметан, трихлорметан, тетрахлорметан, 1,2-дихлорэтан), алифатические спирты (метанол, этанол, пропанол-1, пропанол-2, бутанол-1, изобутанол), ациклические простые эфиры (диэтиловый эфир), циклические простые эфиры (1,4-диоксан), карбоновые кислоты (ледяная уксусная кислота), ангидриды карбоновых кислот (уксусный ангидрид), сложные эфиры карбоновых кислот (метилацетат, этилацетат, пропилацетат, бутилацетат), амиды карбоновых кислот (диметилформамид), нитрилы (ацетонитрил), кетоны (ацетон). Дополнительно рассматривалось изолирование водой и водными растворами кислот (8% раствор уксусной кислоты) и щелочей (0,1 М раствор гидроксида натрия), а также смесями органических растворителей диоксан-ацетон (1:1), ацетонитрил-ацетон (1:1), диоксан-ацетонитрил (1:1) и диоксан-ацетон-ацетонитрил (1:1:1).

Модельные смеси исследуемых веществ с мелкоизмельченной тканью трупной печени (0,05 г анализируемого вещества в 100 г биоматериала) выдерживали 1,5 часа при температуре 18-20 °С при периодическом (соотношение изолирующего агента и биоматериала составляло 2:1 по массе), используя различные изолирующие агенты. Процесс настаивания проводили при периодическом перемешивании. Извлечения для каждого изолирующего агента после первого и второго настаивания объединяли и перемешивали [87, 88].

0,3 мл извлечения наносили полосой на пластину «Сорбфил» с УФиндикатором и хроматографировали в системе толуол-ацетонитрил (7:3) в присутствии вещества-свидетеля по алгоритму, описанному в п. 2.7.1. В УФсвете наблюдали пятна с определенными значениями абсолютной подвижности (Rf4-нитроанилин=0,72; Rfнимесулид=0,74; Rf4-А-2-ФФМ СА=0,55; Rf4-М СА-3-ФФА=0,38; Rf4-Н-2Rf4-Г-2-ФФМ СА=0,61). Пятна вырезали и элюировали 5 мл ДМФА (4ФА=0,77;

нитроанилин, 4-Н-2-ФА и нимесулид) или 5 мл этанола (4-А-2-ФФМСА, 4МСА-3-ФФА и 4-Г-2-ФФМСА). Оптическую плотность полученных растворов измеряли на фоне контрольных при длинах волн 384,9 нм (4-нитроанилин), 390,3 нм (4-Н-2-ФА), 439,4 нм (нимесулид), 298,4 нм (4-А-2-ФФМСА), 287,6 нм (4-МСА-3-ФФА) и 281,4 нм (4-Г-2-ФФМСА) на спектрофотометре СФ-2000 в кюветах с длиной оптического пути 10 мм. По результатам измерений определяли количество анализируемого вещества по калибровочному графику.

Затем определяли процент изолирования вещества из биологического материала, необходимости пробы концентрировали. Результаты определения (n=5; Р=0,95) представлены в таблицах 9-14.

соединений от природы изолирующего агента в гомологичных рядах аренов, галогеналканов, алифатических спиртов, сложных эфирах карбоновых кислот представлены в соответствии с рисунком 15. Среди аренов наилучшая степень изолирования наблюдается у бензола, галогеналканов – 1,2-дихлорэтана, алифатических спиртов – пропанола-2, сложных эфирах карбоновых кислот – метилацетата.

Рисунок 15 – Зависимость полноты изолирования нимесулида и близких по структуре соединений алифатическими спиртами (А), аренами (Б), сложными эфирами карбоновых кислот (В), галогеналканами (Г) Таблица 9 – Результаты изолирования 4-нитроанилина из биологического материала различными изолирующими агентами Галогеналканы Алифатические спирты Ациклические простые Циклические простые Ангидриды карбоновых Амиды карбоновых кислот N,N-диметилформамид 42,01 1,89 0,85 2,35 5, различной реакции агентов (соотношение по Таблица 10 – Результаты изолирования нимесулида из биологического материала различными изолирующими агентами Галогеналканы Алифатические спирты Ациклические простые Циклические простые Ангидриды карбоновых Амиды карбоновых кислот N,N-диметилформамид 93,49 1,64 0,74 2,04 2, различной реакции агентов (соотношение по Таблица 11 – Результаты изолирования 4-Н-2-ФА из биологического материала различными изолирующими агентами Галогеналканы Алифатические спирты Ациклические простые Циклические простые Ангидриды карбоновых Амиды карбоновых кислот N,N-диметилформамид 85,86 3,69 1,65 4,59 5, различной реакции агентов (соотношение по Таблица 12 – Результаты изолирования 4-А-2-ФФМСА из биологического материала различными изолирующими агентами Галогеналканы Алифатические спирты Ациклические простые Циклические простые Карбоновые кислоты Уксусная кислота 15,92 2,20 0,98 2,73 17, Ангидриды карбоновых Амиды карбоновых кислот N,N-диметилформамид 99,72 3,46 1,55 4,30 4, различной реакции агентов (соотношение по Таблица 13 – Результаты изолирования 4-МСА-3-ФФА из биологического материала различными изолирующими агентами Группы изолирующих Галогеналканы Алифатические спирты Ациклические простые Циклические простые Карбоновые кислоты Уксусная кислота 39,88 3,37 1,51 4,19 10, Ангидриды карбоновых Амиды карбоновых кислот N,N-диметилформамид 98,51 2,67 1,19 3,32 3, различной реакции агентов (соотношение по Таблица 14 – Результаты изолирования 4-Г-2-ФФМСА из биологического материала различными изолирующими агентами Галогеналканы Алифатические спирты Ациклические простые Циклические простые Карбоновые кислоты Уксусная кислота 2,67 0,31 0,14 0,38 14, Ангидриды карбоновых Амиды карбоновых кислот N,N-диметилформамид 14,08 1,08 0,48 1,34 9, различной реакции агентов (соотношение по Комплексный анализ полученных данных показал, что оптимальным изолирующим агентом для нимесулида и близких по структуре соединений явился ацетон. Процент изолирования ацетоном 4-нитроанилина составил 64,02%, 4-Н-2-ФА – 92,3%, нимесулида – 91,4%, 4-А-2-ФФМСА – 88,96%, 4МСА-3-ФФА – 99,61% и 4-Г-2-ФФМСА – 52,30%.

5.1.2 Выбор времени настаивания с оптимальным изолирующим агентом На втором этапе поиска оптимальных условий, использовали ацетон в качестве изолирующего агента. Приготовление модельных смесей проводили по схеме, указанной выше в 5.1.1. Смеси каждого из объектов исследования изолировали ацетоном, двукратно, при различных временных режимах настаивания (15, 30, 45, 60 и 75 минут) [87]. Извлечения полученные из каждого опыта анализировали как указано в п. 5.1.1. Результаты определений (n=5) представлены в таблице 15.

Анализ полученных данных показал, что оптимальное время для изолирования нимесулида и близких по структуре соединений составляет не менее 45 минут.

5.1.3 Выбор кратности настаивания и количества изолирующего агента при На третьем этапе поиска оптимальных условий проводили выбор количества изолирующего агента и кратности настаивания, используя лучший изолирующий агент – ацетон и лучшее время настаивания – 45 минут.

Модельные смеси исследуемых веществ с мелкоизмельченной тканью трупной печени (0,05 г анализируемого вещества в 100 г биоматериала) выдерживали 1,5 часа при температуре 18-20 °С при периодическом перемешивании. Параллельно готовили контрольные образцы без веществ.

Таблица 15 – Результаты изучения зависимости степени извлечения нимесулида продолжительности настаивания (n=3; Р=0,95) По 25 г каждой модельной смеси исследуемого вещества и контрольного образца настаивали с различными количествами ацетона (25; 50; 62,5; 75 и 100 г) при регулярном перемешивании в течение 45 минут. Процесс настаивания с различными количествами ацетона проводили на одних и тех же анализируемых образцах биоматериала четырехкратно. При этом каждый раз собирали извлечения по отдельности [87]. Извлечения полученные из каждого опыта анализировали как указано в п. 5.1.1. По результатам измерений определяли количество анализируемого вещества по калибровочному графику, учитывая аликвоту наносимую на пластину ТСХ и объем изолирующего агента. Затем определяли процент изолирования вещества из биологического материала, по отношению к количеству, внесенному в модельную смесь. Результаты определения (n=5) представлены в таблицах 16-21.

Анализ полученных данных показал, что масса изолирующего агента для изолирования нимесулида и близких по структуре соединений должна превышать массу биоматериала как минимум в два раза. Оптимальные количества анализируемых соединений извлекаются при этом в условиях как минимум двукратного настаивания.

5.2 Методики изолирования из трупных органов и биожидкостей Оптимальные условия изолирования (настаивание ацетоном двукратно по 45 минут) применяли для анализа ралзичных видов биологического материала (трупная печень, кровь, плазма крови и моча) [88, 89].

В химические стаканы вносили в интервале от 0,02 до 1,0 мл различные аликвоты ацетоновых растворов исследуемых веществ с определенными концентрациями, и отгоняли ацетон в потоке теплого воздуха с температурой 35-40 °С. Затем в стаканы, остывшие до температуры 18-20 °С вносили по 25 г биологического материала (ткани трупной печени, крови, плазмы крови или мочи) и тщательно перемешивали. Приготовленные таким образом различные количества каждого из анализируемых соединений в 25 г биоматерила перемешивании, данные представлены в таблицах 33-55 (приложение).

Параллельно готовили контрольные образцы биоматериала без веществ по вышеуказанной схеме.

Таблица 16 – Зависимость полноты изолирования 4-нитроанилина от соотношения биоматериала и ацетона, и от кратности настаивания (n=3; Р=0,95) Взято вещества, Масса ацетона, Кратность Таблица 17 – Зависимость полноты изолирования нимесулида от соотношения биоматериала и ацетона, и от кратности настаивания (n=3; Р=0,95) Взято вещества, Масса ацетона, Кратность Таблица 18 – Зависимость полноты изолирования 4-Н-2-ФА от соотношения биоматериала и ацетона, и от кратности настаивания (n=3; Р=0,95) Взято вещества, Масса ацетона, Кратность Таблица 19 – Зависимость полноты изолирования 4-А-2-ФФМСА от соотношения биоматериала и ацетона, и от кратности настаивания (n=3; Р=0,95) Таблица 20 – Зависимость полноты изолирования 4-МСА-3-ФФА от соотношения биоматериала и ацетона, и от кратности настаивания (n=3; Р=0,95) Взято вещества, Масса ацетона, Кратность соотношения биоматериала и ацетона, и от кратности настаивания (n=3; Р=0,95) Взято вещества, Масса ацетона, Кратность 5.2.1 Методика изолирования из ткани трупного органа (печени) 25 г искуственной смеси мелкоизмельченной трупной печени с анализируемым веществом и такое же количество контрольного образца настаивали с 50 г ацетона двукратно по 45 минут при регулярном перемешивании. Сухой бумажный фильтр промывали ацетоном. Объединенные извлечения, полученные после настаивания, фильтровали, и промывали фильтр 15-20 мл ацетона. Собранный фильтрат и промывной раствор объединяли в выпарительной чашке и упаривали до сухого остатка в токе воздуха при комнатной температуре. Остаток растворяли в 10-15 мл ацетона, фильтровали, промывали фильтр ацетоном, и снова упаривали до сухого остатка. Параллельно проводили вышеуказанные операции с образцом контрольного извлечения.

25 г искуственной смеси крови с анализируемым веществом и такое же количество контрольного образца настаивали с 50 г ацетона двукратно по минут при регулярном перемешивании. Сухой бумажный фильтр промывали ацетоном. Объединенные извлечения, полученные после настаивания, фильтровали, и промывали фильтр 15-20 мл ацетона. Собранный фильтрат и промывной раствор объединяли в выпарительной чашке и упаривали до сухого остатка в токе воздуха при комнатной температуре. Остаток растворяли в 10- мл ацетона, фильтровали, промывали фильтр ацетоном, и снова упаривали до сухого остатка. Параллельно проводили вышеуказанные операции с образцом контрольного извлечения.

5.2.3 Методика изолирования из плазмы крови 25 г искуственной смеси плазмы крови с анализируемым веществом и такое же количество контрольного образца настаивали с 50 г ацетона двукратно по 45 минут при регулярном перемешивании. Сухой бумажный фильтр промывали ацетоном. Объединенные извлечения, полученные после настаивания, фильтровали, и промывали фильтр 15-20 мл ацетона. Собранный фильтрат и промывной раствор объединяли в выпарительной чашке и упаривали до сухого остатка в токе воздуха при комнатной температуре. Остаток растворяли в 10-15 мл ацетона, фильтровали, промывали фильтр ацетоном, и снова упаривали до сухого остатка. Параллельно проводили вышеуказанные операции с образцом контрольного извлечения.

25 г искуственной смеси мочи с анализируемым веществом и такое же количество контрольного образца настаивали с 50 г ацетона. 45 минут при регулярном перемешивании. Затем в образцы добавляли еще 50 г ацетона и процесс настаивания повторяли. Сухой бумажный фильтр промывали ацетоном.

Извлечение, полученное после настаивания, фильтровали, и промывали фильтр 15-20 мл ацетона. Собранный фильтрат и промывной раствор объединяли в выпарительной чашке и упаривали до сухого остатка в токе воздуха при комнатной температуре. Остаток растворяли в 10-15 мл ацетона, фильтровали, промывали фильтр ацетоном, и снова упаривали до сухого остатка. Параллельно проводили вышеуказанные операции с образцом контрольного извлечения.

5.3 Определение на основе разработанных специальных схем очистки извлечений. Установление определяемого минимума в биоматериале Остатки в чашках, после испарения извлечений из ткани трупного органа или биожидкости исследовали, применяя различные схемы очистки.

Использовали очистку двумя способами: комбинацию экстракции и нормальнофазовой колоночной хроматографии низкого давления, а также комбинацию экстракции и обращеннофазовой колоночной хроматографии низкого давления.

5.3.1 Определение с использованием очистки комбинацией жидкостьжидкостной экстракции и макроколоночной нормальнофазовой Очистка извлечений методом жидкость-жидкостной экстракции.

Каждый из полученных остатков в п. 5.2.1-5.2.4 растворяли в 10 мл ацетонитрила (анализ 4-нитроанилина и 4-Н-2-ФА) или 10 мл диэтилового эфира (анализ нимесулида, 4-А-2-ФФМСА и 4-МСА-3-ФФА) или 10 мл хлороформа (анализ 4-Г-2-ФФМСА). Дальнейший процесс экстракции проводили согласно схемам в п. 4.3.3. При экстрагировании каждого из соединений первый и второй экстракты упаривали в токе воздуха при комнатной температуре до сухого остатка.