«Влияние салициловой кислоты и цитокинина на экспрессию генов митохондриальных белков ( ...»

Для получения более чистого препарата митохондрий суспензию отмытых митохондрий дополнительно очищали с помощью центрифугирования в ступенчатом градиенте плотности сахарозы. Для этого использовали градиент, состоящий из 4-х слоев (20, 35, 47 и 60%) сахарозы в отмывочном буфере (0.3 M сахароза; 25 мМ MOPS (pH 7.8); 2 мМ ЭГТА-KOH; 10 мМ ДТТ). Митохондрии, полученные методом дифференциального центрифугирования, наслаивали на градиент и центрифугировали в течение 90 мин при 113000 g. При разделении в градиенте были получены 3 фракции, находящиеся на границах сахарозы разных концентраций, причём интактные митохондрии локализовались на границе раздела 35 и 47%-ой сахарозы. Данную фракцию собирали и дважды промывали отмывочным буфером. Далее митохондрии либо непосредственно использовали для дальнейших экспериментов, либо замораживали в жидком азоте и хранили при -70°C. Все операции по выделению митохондрий проводили при температуре 2 оС.

3.3.2. Фракционирование митохондрий.

Фракционирование митохондрий осуществляли по методу «сжатиянабухания» (Guillot-Salomon et al., 1997). Для этого митохондрии, очищенные на сахарозном градиенте, ресуспендировали в 2 М растворе глюкозы в соотношении 1:1 и инкубировали в течение часа при 0°C, для сжатия митохондрий. Затем, при помощи шприца в полученную суспензию быстро вводили буфер 1, содержащий 5 мМ КН2РО4, 2 мМ ЭДТА (рН 7.2) в соотношении 1:40 (о/о; митохондрии : буфер).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Инкубировали в течение 20 мин при 0°C при постоянном перешивании для набухания митохондрий. Для сжатия митопластов, представляющих собою матрикс, окруженный внутренней мембраной, в суспензию набухших митохондрий добавляли буфер 2, содержащий 2 М сахарозу и 5 мМ МgCl2 в соотношении 9: (о/о; митохондрии : буфер). Инкубировали в течение 20 мин при 0°C. Затем центрифугировали в течение 10 мин при 15000 g для осаждения митопластов.

Надосадочную жидкость отбирали в отдельную пробирку и центрифугировали при 100000 g в течение одного часа для осаждения наружных мембран.

Осадок митопластов однократно промывали буфером 1 и дважды разрушали ультразвуком (наверно есть характеристика интенсивности ультразвука) в течение 2 мин с интервалом по 20 сек при 0°C. После разрушения суспензию центрифугировали при 10000 g в течение 10 мин для осаждения неразрушенных митопластов. Надосадочную жидкость переносили в чистые пробирки и центрифугировали при 100000 g в течение 1 часа для осаждения фракции внутренних мембран митохондрий (осадок).

3.4. Бактериальные штаммы и векторы.

В работе были использованы штаммы E. coli: DH5 и JM109.

3.5. Клонирование фрагментов ДНК в вектор pTZ57R/T.

ПЦР-продукты целевых генов клонировали в вектор pTZ57R/T согласно методике, описанной в InsTAcloneTM PCR Cloning Kit #K1213, #K1214 фирмы Fermentas (рис. 8).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Рис. 8. Схема вектора для клонирования ДНК pTZ57 (http://fermentas.com).

Внизу приведена последовательность полилинкера.

Известно, что используемая при амплификации фрагментов ДНК Taqполимераза проявляет не только ДНК-полимеразную активность, но так же терминальную дезоксинуклеотидилтрансферазную активность, что приводит к добавлению дополнительного аденинового нуклеотида на 3' ОН-конце амплифицированного фрагмента ДНК. Наличие добавочного нуклеотида на 3'ОНконце ПЦР фрагмента затрудняет клонирование этих фрагментов в обычные плазмидные векторы, поскольку амплифицированные фрагменты ДНК необходимо дополнительно обрабатывать фрагментом Кленова, Т4 ДНК-полимеразой или экзонуклеазой III. Чтобы избежать дополнительных обработок ПЦР-фрагментов

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

перед клонированием, рядом фирм разработаны методы, позволяющие клонировать амплифицированные фрагменты ДНК без предварительной обработки. Для этой цели используются специальные векторные молекулы ДНК.

Такие векторные молекулы готовятся следующим способом: плазмидная ДНК линеаризуется с образованием тупых концов по сайту рестрикции, находящемуся в полилинкере, затем с помощью Т4 полинуклеотидилкиназы к 3'-концу присоединяется добавочный Т нуклеотид. Таким образом, амплифицированный ПЦР фрагмент ДНК, имеющий выступающие 3'А-концы, легко лигируется с линейной векторной ДНК, имеющей выступающие 3'Т-концы. Образованные в результате лигирования кольцевые молекулы, могут напрямую использоваться для трансформации клеток E. coli с высокой частотой. Дополнительное преимущество данной методики заключается в том, что Т-выступающие концы предотвращают рециркуляризацию вектора при лигировании, и это обеспечивает выход рекомбинантных молекул с эффективностью выше 90%.

Полученные в данной работе ПЦР фрагменты лигировали с вектором pTZ57R/T. Соответствующие лигазные смеси использовали для трансформации клеток E. coli штамма DH5 или JM109. Отбор осуществляли на чашках с LB агаром с использованием в качестве селективного маркера ампицилина (Ар). В случае инсерции ПЦР-фрагмента в векторную молекулу ДНК клонытрансформанты на селективных чашках (Ар, X-GAL в качестве субстрата лактомазы, IPTG-индуктора -галактозидазы) будут белого цвета, так как инсерция приводит к инактивации гена lac Z векторной молекулы, а клоны-трансформанты без инсерции будут иметь синюю окраску, за счет гидролиза X-GAL -лактомазой.

3.5.1. Подбор праймеров к гену исследования.

Для данной работы были выбраны 13 митохондриальных генов, пластидных гена, а так же два гена ядерного кодирования. В вектор pTZ57R/T были клонированы фрагменты кодирующих областей целевых генов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

последовательностей Американского Национального Центра Биотехнологической Информации (NCBI, www.ncbi.nlm.nih.gov) были найдены последовательности выбранных генов. Подбор праймеров к кодирующей части целевых генов люпина проводили с использованием программы Veсtor NTI. В случаях отсутствия использовали нуклеотидную последовательность гомологичных генов арабидопсиса. При подборе праймеров в большинстве случаев были введены следующие ограничения: 1) температура отжига праймеров варьирует в пределах амплифицируемого фрагмента от 150 до 1100 н. п., с оптимальной длиной 500 н. п., 3) длина праймера от 19 до 23 нуклеотидов.

3.5.2. Биоинформационный анализ подобранных зондов для генов.

митохондриального генома были проверены с помощью программы BLAST на сервере NCBI на возможную гомологию с четырьмя случайно выбранными полностью секвенированными пластомами представителей семейства бобовых (NC_007942, NC_003119, NC_002694, NC_009259). В свою очередь, используемые фрагменты пластидных генов были проверены на возможную гомологию с митохондриальными геномами растений (NC_001284, NC_006581, NC_002511, NC_011033). Это было сделано с целью исключения возможной перекрёстной гибридизации при применении run-on анализа и, как следствие, искажения полученных результатов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

10 rps 11 rrn 12 rrn 16 rrn 17 rrn

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Список праймеров, использованных для ПЦР (продолжение).

Aox (Р1) s - gargcnkanaaygarmgnatgcayyt 70- 23 LlAox Примечание: № 1-13 гены митохондриального кодирования; № 14-17 гены пластидного кодирования; Ubq и Aox гены ядерного кодирования; s – прямой праймер; as- обратный праймер.

3.6. Выделение тотальной растительной ДНК.

Навеску (200 мг) растительного материала измельчали, помещали в предварительно охлажденную пробирку и растирали в жидком азоте до порошкообразного состояния. В пробирку добавляли 500 мкл лизирующего буфера, содержащего 50 мМ Трис-HCl (pH 7.5), 159 мМ NaCl, 10 мМ ЭДТА, 2% ДДС, 2% Sarcosyl, перемешивали и инкубировали 5 мин при комнатной температуре. Затем добавляли равный объем смеси фенол-хлороформ (1:1), перемешивали и центрифугировали в течение 5 мин при 14000 g. Водную фракцию переносили в чистую пробирку, добавляли равный объем хлороформа,

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

перемешивали и центрифугировали при тех же условиях. Повторно отбирали водную фазу и переносили ее в чистую пробирку. В ту же пробирку вносили 1 мкл РНК-азы (10 мг/мл) и 1/10 объема 10-кратного буфера для РНК-азы, перемешивали и инкубировали 1 час при 37°C. Далее проводили депротеинизацию последовательным добавлением растворов фенол:хлороформ и хлороформ, как описано ранее. К полученной водной фазе добавляли 1/10 объема 3М ацетата натрия (pH 6.0) и 0.7-1.0 от общего объема изопропанола, оставляли на 1 час при C. Центрифугировали 4 минуты при 14000 g, изопропанол удаляли, осадок промывали 80%-ым этанолом, тщательно высушивали и растворяли в нужном объёме стерильной воды.

3.7. Выделение митохондриальной ДНК.

Перед выделением митоходриальной ДНК (митДНК) выделяли митохондрии как описано выше (см. главу 3.3.1.). После очистки на сахарозном градиенте и промывки отмывочным буфером осадок лизировали в лизирующем буфере, аналогично используемому для выделения тотальной растительной ДНК. Далее проводили операции аналогичные операциям, проводимым при выделении тотальной растительной ДНК (см. главу 3.6.1.).

3.8. Выделение плазмидной ДНК E. coli.

3.8.1. Микровыделение плазмидной ДНК.

Клетки E. сoli выращивали в 5 мл жидкой среды LB в течение ночи при 37оС.

Затем трехкратно осаждали клетки в 1.5 мл в пробирке типа «эппендорф» 5 мин при 14000 g при 4оС. Добавляли 200 мкл раствора 1 (50 мМ глюкоза, 25 мM Трис HCl, pH 8.0, 10 мM ЭДТА, pH 8.0) и ресуспендировали в нём осадок. Добавляли 300 мкл раствора 2 (0.2 Н NaOH, 1% ДДС). Перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин. Затем добавляли 300 мкл раствора (3.0 М ацетата калия (pH 4.8-5.2)), перемешивали и инкубировали на льду 5 мин.

Центрифугировали 15 мин при 13000 g при комнатной температуре. Надосадочную

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

жидкость переносили в чистую пробирку. Добавляли 10 мкл раствора РНКазыА в концентрации 10 мг/мл. Инкубировали 30 мин при 37оС. Добавляли 400 мкл хлороформа, перемешивали на вортексе, центрифугировали 1 мин при 13000 g.

Переносили водную фазу в новую пробирку типа «эппендорф». депротенизацияю хлороформом повторяли еще раз. ДНК переосаждали добавлением 1/10 объёма 3 М ацетата натрия (рН 6.0) и 0.7-1.0 объема 100%-го изопропанола, инкубировали 30мин при -20°С, центрифугировали 5 мин при 13000 g. Осадок промывали 300 мкл 80%-го этанола, высушивали и растворяли в 30 мкл стерильной воды.

Перед нанесением на электрофорез ДНК прогревали 5 мин при 65оС.

3.8.2. Макровыделение плазмидной ДНК.

Метод применяли для выделения препаративных количеств плазмидной ДНК. Растворы 1, 2 и 3 аналогичные применяемым для микровыделения плазмидной ДНК (см. главу 3.8.1.).

Клетки выращивали в 100-200 мл LB в течение ночи при 37оС. Ночную культуру E. coli осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 4000 g с охлаждением. Надосадочную жидкость удаляли и осадок ресуспендировали в 10 мл раствора 1, инкубировали 5 мин на льду. Добавляли 10 мл раствора 2, осторожно перемешивали, инкубировали 5 мин при комнатной температуре. Добавляли 10 мл раствора 3, осторожно перемешивали, инкубировали 10 мин на льду.

Центрифугировали 10 мин при 4000 g 4°C, отбирали надосадочную жидкость и переносили его в новую пробирку. Добавляли равный объем 100%-го изопропанола, перемешивали, инкубировали 1 час при -20 °C. Затем центрифугировали 10 мин при 4000 g 4°C, удаляли надосадочную жидкость.

Промывали осадок 80%-ым этанолом, центрифугировали 3 мин при 4000 g. Осадок высушивали и растворяли в 8 мл стерильной воды. Затем добавляли 6 мл 6 М LiCI, инкубировали 30-60 мин во льду, центрифугировали 10 мин 4000 g. Надосадочную жидкость переносили в новую пробирку для центрифугирования, добавляли равный объем 100%-го изопропанола, инкубировали 1 час (или ночь) при -20°C.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

ДНК осаждали центрифугированием в течение 15 мин при 4000 g и 4°C, удаляли надосадочную жидкость, промывали осадок 80%-ым этанолом и повторно центрифугировали в течение 3 мин при 4000 g и 4°C. После удаления этанола, осадок высушивали и растворяли в 4.5 мл стерильной воды. Добавляли 1/10 объема 10-кратного РНК-азного буфера и 15 мкл РНКазы (10 мг/мл), инкубировали 60 мин при 37°C. Для удобства переносили раствор в пробирки на 30 мл, добавляли равный объем фенол-хлороформа для депротеинезации. Смесь центрифугировали в течение 5 мин при 4000 g и 4°C. Отбирали водную фазу, ещё раз последовательно повторяли депротеинезацию смесью фенол-хлороформ и хлороформом. После обработки хлороформом отбирали водную фазу, добавляли 1/10 объема 3 М ацетата натрия (рН 6.0) и равный объем 100%-го изопропанола, инкубировали 1 час (или ночь) при -20°C. Центрифугировали 15 мин при 4000 g и 4°C, удаляли надосадочную жидкость, промывали осадок 80%-ым этанолом и повторно центрифугировали в течение 3 мин при 4000 g и 4°C. После удаления этанола, осадок высушивали и растворяли в 200 мкл стерильной воды.

3.9. Определение количества и оценка качества препаратов нуклеиновых кислот.

Оценку чистоты и определение количества нуклеиновых кислот в образцах проводили спектрофотометрическим методом с использованием спектрофотометра Pharmacia Biotech Ultrospec UV/Visible или прибора Nanodrop ND-1000 (Thermo Scientific).

Оптическую плотность (ОП) измеряли при трех различных длинах волн: 230, 260 и 280 нм. Численное значение ОП260/ОП230 характеризует наличие примеси полисахаридов, а ОП260/ОП280 показывает примесь белка в препарате нуклеиновых кислот. При хорошем качестве выделенной ДНК эти показатели должны быть не менее 1.7. Количество нуклеиновых кислот определяли пересчетом показателя ОП при длине волны 260 нм на соответствующий коэффициент (для ДНК –

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1 оптическая единица соответствует концентрации ДНК - 50 мкг/мл, РНК мкг/мл, а для смеси НК - 45 мкг/мл).

Качество выделенных нуклеиновых кислот оценивали также с помощью электрофореза в агарозном геле (см. главы 3.11. и 3.19.2.).

3.10. Полимеразная цепная реакция.

Для полимеразной цепной реакции (ПЦР) в качестве матрицы использовали плазмидную, митохондриальную и ядерную ДНК, выделенную методами, описанными ранее, или кДНК, в случае применения метода ОТ-ПЦР.

Реакцию проводили в 20 мкл или 50 мкл реакционной смеси. Реакционная смесь состояла из 1 мкл раствора дНТФ (20 мкМ), по 0.5 мкл праймеров (10 пкМ/мкл), 1 мкл ДНК (конечная концентрация ДНК варьирует 0.5 – 1 мкг в пробе), 0.1 мкл Taq-полимеразы (5 е.а./мкл.) и 10 буфер для этой полимеразы фирм СибЭнзим или Fermentas.

Список используемых праймеров представлен в таблице 2. Реакцию осуществляли в амплификаторе Mastercycler Personal фирмы Eppendorf.

На первой стадии образцы ДНК подвергали тепловой денатурации при 94С в течение 3 минут. На второй стадии, включающей три цикла, проводили денатурацию ДНК при 94С в течение 40 секунд, отжиг в течение 20 секунд (температура отжига зависит от нуклеотидного состава праймера и рассчитывается с помощью формулы t=(2(A+T))+(4(G+C)), синтез в течение 1 минуты/1000 пн.

при 72С. Указанные циклы второй стадии повторяли 30 раз. На третьей стадии проходил досинтез в течение 2 минут при 72C.

3.11. Электрофорез ДНК в агарозном геле.

Электрофоретическое разделение ДНК проводили в агарозном геле в ТАЕбуфере (0.04 М Трис-ацетат, 0.002 М ЭДТА, рН 8.0). Для оптимального разделения фрагментов в геле использовали соответствующую концентрацию агарозы от 1% до 2%. Для визуализации фрагментов ДНК в гель добавляли бромистый этидий до

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

конечной концентрации 0.5 мкг/мл. Для приготовления образцов, наносимых в гель, использовали 1ммкл 6-кратного буфера для нанесения ДНК (Fermentas).

Напряжение тока составляло 6 В/1 см геля.

Для определения молекулярной массы ДНК в образце использовали маркеры для электрофореза ДНК фирмы СибЭнзим, исходя из размеров последовательности исследуемой ДНК 1 т.п.н. (от 0.25 до 10 т.п.н.) и 100 п.н. (от 100 до 1000 п.н.).

Данные оцифровывали и сохраняли путем сканирования на приборе Phosphoimager Typoon Trio+ (GE Healthcare, США) или гели фотографировали с помощью цифровой камеры Olympus C-760 в ультрафиолетовой области при длине волны 254 нм. В качестве источника ультрафиолета (УФ) использовали трансэлюминатор фирмы Dosaga.

3.12. Очистка фрагментов ДНК из геля.

3.12.1. Очистка фрагментов ДНК из геля с помощью набора «Silica Bead DNA Gel Extraction Kit» фирмы Fermentаs.

Элюцию ДНК из геля осуществляли с использованием набора «Silica Bead DNA Gel Extraction Kit» фирмы Fermentаs. Для этого, фрагменты ДНК разделяли в агаразном геле, а затем фрагменты соответствующих размеров вырезали скальпелем, переносили в эппендорф и взвешивали. К вырезанным кусочкам геля добавляли 3 объема раствора для связывания ДНК (из расчёта на 100 мг образца 100 мкл буфера) и инкубировали 5 мин при 55оС до полного растворения геля.

Затем добавляли суспензию с силиконовыми шариками из расчета 2 мкл суспензии на 1 мкг ДНК, но не менее 5 мкл, после чего инкубировали 15 мин при 55оС, перемешивая через каждые 2 мин. Центрифугировали на максимальной скорости в течение 30 сек и удаляли надосадочную жидкость. Осадок трижды промывали 0.5 мл ледяным отмывочным буфером (отмывочный буфер предварительно разводили этанолом по методике: 15 мл концентрированного отмывочного буфера, 285 мл дистиллированной воды, 300 мл 100 % этанола), полностью ресуспендируя осадок. Осадок тщательно высушивали и ДНК элюировали 15 мкл ТЕ буфера

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

(10 мM трис-HCl, pH 8.0, 1 мM ЭДТА) при 55оС в течение 15 мин. Затем удаляли силиконовые шарики центрифугированием, надосадочную жидкость переносили в новый эппендорф. При необходимости проводили повторную элюцию ДНК.

3.12.2. Элюция фрагментов ДНК электрофоретическим методом.

Фрагменты ДНК разделяли в агарозном геле, после достаточной разгонки ТАЕ-буфер удаляли (оставляя в буфере только электроды), а затем, перед нужным фрагментом ДНК вырезали лунку, заполняли её стерильным буфером ТЕ и элюировали ДНК из геля при максимальном токе (200 мА/см2). Буфер, содержащий растворенную ДНК, отбирали в стерильную пробирку. После этого, ДНК переосаждали добавлением 1/10 объёма 3М ацетата аммония рН 6.0 и 2.5 объема 100%-го этанола. Инкубировали 2 час при - 20°С, затем центрифугировали 20 мин при 14000 g и 4°C, надосадочную жидкость удаляли и осадок промывали 75%-ым этанолом. После удаления этанола, осадок высушивали и растворяли в 20 мкл стерильной воды.

3.13. Лигирование ДНК.

Все компоненты лигационной смеси сливали на льду. Реакцию проводили в 1-кратном лигазном буфере (10х): 20 мМ трис-HCl (pH 7.6), 10 мМ MgCl2, 0.6 мМ ATP, 10 мМ дитиотрейтол. На 1мкг ДНК вносили 3-4 ед. лигазы фага Т4 фирмы Fermentas. Смесь инкубировали в течение 16-18 часов при 4оС.

3.14. Приготовление компетентных клеток.

Для трансформации использовали компетентные клетки E. coli, штаммы DH5 или JM109.

3.14.1. Приготовление компетентных клеток согласно рекомендации фирмы Fermentas.

Компетентные клетки готовили согласно протоколу набора «InsTAclonTM PCR Cloning Kit» фирмы Fermentas.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.14.2. Приготовление компетентных клеток с использованием CaCl2.

В основе приготовления компетентных клеток и трансформации лежит методика Humphreys et al (1978). Ночную культуру E.coli штамма XL-100 или JM 109 выращивали в течение 12 - 16 часов в 1.5ммл среды LB при 37oC без качания. Затем, 150 мкл ночной культуры E. coli разводили стерильной средой LB в 10 раз до конечного объёма 1.5 мл и подращивали с аэрацией 90-100 мин при 37оС до оптической плотности 0.6м–м0.8. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре (Pharmacia Biotech Ultrospec UV/Visible) по отношению к среде LB при длине волны 600 нм. Клетки собирали центрифугированием при 4000 g в течение 10 мин при 4C. В стерильных условиях удаляли надосадочную жидкость, а осадок бактерий осторожно ресуспендировали в 375 мкл ледяного стерильного 100 мМ СаСl2, инкубировали 5 мин на льду, а затем клетки собирали осаждением при 4000 g в течение 10 мин при 4C. На льду удаляли надосадочную жидкость, осадок осторожно ресуспендировали в 75 мкл СаСl2, а затем добавляли еще 300 мкл CaCl2. Клетки сохраняли свою компетентность в течение недели при хранении в ледяной бане (0oC) в холодильнике. Полученные компетентные клетки использовали для трансформации.

3.15. Трансформация бактериальных клеток.

Вся процедура осуществляется на ледяной бане. Для трансформации 1-2 мкг ДНК или 10 мкл лигационной смеси смешивали с 0.05-0.2 мл компетентных клеток E. coli и инкубировали в ледяной бане 20-40 мин. Затем клетки подвергали тепловому шоку, при 42C в течение 90 сек; к суспензии добавляли по 0.5 мл питательной среды и инкубировали при 37°С на качалке в течение одного-двух часов для экспрессии плазмидных генов. Затем клетки высевали по 100 мкл на чашки с селективной средой, содержащие IPTG, X-Gal, и ампициллин до конечной концентрации 50 мкг/мл. Колонии выращивали при 37С в течение ночи.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.16. Рестрикция ДНК.

Обработку ДНК рестриктазами проводили в 20-50 мкл смеси, содержащей 1 мкг ДНК, 1-2 ед. активности фермента и соответствующий буферный раствор.

Смесь инкубировали при 37°С 2 часа, затем для инактивации фермента прогревали 10 мин при 65°С и быстро охлаждали в воде со льдом. В реакции использовали ферменты рестрикции фирм «Fermentas» и «СибЭнзим», с соответствующими для данных ферментов буферами.

3.17. Секвенирование ДНК.

Плазмидную ДНК отдавали на секвенирование в биотехнологическую компанию Синтол. Секвенирование проводили в двух повторах с использованием праймеров М13, прямого и обратного, в концентрации 3.2 пкмоль/мл. Анализ результатов производили с помощью программ SeqScanner и VectorNTI.

3.18. Метод run on транскрипции.

3.18.1. Иммобилизация фрагментов ДНК на нейлоновую мембрану.

Для run-on метода очищенные фрагменты целевых генов в концентрации 1 мкг/в пробе наносили на нейлоновую мембрану (Hybond-N+, GE Healthcare) по два повтора на каждый вариант. Предварительно, образец, содержащий 2 мкг ДНК, денатурировали добавлением NaOH до конечной концентрации 0.5 М. Объём образца доводили стерильной водой до конечного объёма 200 мкл. Объем увеличивали для более качественного и равномерного нанесения ДНК на мембрану. Для окончательной денатурации пробирки с раствором ДНК инкубировали 10 мин при 95°C. По истечении 10 мин пробирки охлаждали в ледяной бане (0°C).

Для иммобилизации ДНК на мембрану по капиллярному типу использовали прибор «Bio-Dot TM» фирмы Bio-Rad. Перед нанесением образцов нейлоновую мембрану предварительно смачивали внесением в каждый капилляр по 100 мкл воды. Далее в капилляры вносили по 100 мкл приготовленного образца. После

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

этого в каждый капилляр вносили по 100 мкл 0.5 М NaOH для дополнительной денатурации ДНК. Мембрану высушивали, и для иммобилизации ДНК мембраны облучали ультрафиолетовым светом при длине волны 365 нм в течение 2 мин с расстояния 7 см. Для этого использовали переносной трансэлюминатор фирмы «Dosaga» (Германия).

3.18.2. Определение количества белка в препарате митохондрий.

После выделения митохондрий (см. главу 3.3.) производили выравнивание всех образцов по содержанию в них белка. Для этого 25 мкл митохондрий лизировали добавлением ДДС до конечной концентраии 1% и инкубировали на льду в течение 10 мин. Затем к лизату добавляли четыре объёма 100%-го ледяного ацетона и инкубировали в течение 30 мин при -20°С. Белки осаждали центрифугированием в течение 30 мин при 16000 g и 4°C. Надосадочную жидкость удаляли, а осадок ресуспендировали в растворе 0.1 N NaOH. Количество белка определяли по Бредфорд (см. главу 3.20.2.1.). Для дальнейшей работы во всех случаях использовали количество образца митохондрий, эквивалентное 100 мкг суммарного белка, за исключением случаев оговоренных отдельно.

3.18.3. Синтез меченых транскриптов в лизате митохондрий.

Для проведения реакции транскрипции in vitro отбирали необходимое количество митохондрий и центрифугировали в течение 3 мин при 16000 g.

Надосадочную жидкость удаляли, а к осадку митохондрий добавляли 100 мкл транскрипционной среды (таблица 3), мягко перемешивали и инкубировали в течение 10 мин при температуре 25°C. Пробы немедленно охлаждали в ледяной бане и реакцию останавливали добавлением 100 мкл «стоп»-буфера, содержащего 50 мМ трис-HCl (pH 8.0), 25 мМ ЭДТА и 5% саркозил натрия.

Затем из образцов выделяли нуклеиновые кислоты, в том числе и вновь синтезированную P-РНК. Для этого проводили депротеинизацию фенолхлороформом и хлороформом добавлением равного объема указанных растворов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Образцы пипетировали до однородного состояния, центрифугировали в течение мин при 16000 g и 4°C и водную фазу переносили в новую пробирку. После удаления белков к водной фазе добавляли 1/10 объема 3 М ацетата натрия (рН 6.0) и 2.5 объема 96%-го этанола. Раствор инкубировали при -20°C в течение 1 час и нуклеиновые кислоты осаждали центрифугированием в течение 30 мин при 16000 g и 4°C. Осадок высушивали и растворяли в стерильной воде.

Затем для удаления ДНК в образцах проводили обработку ферментом ДНКазой (0.01 ед/в пробе) в соответствующем 1-кратном буфере фирмы Fermentas с добавлением в реакционную смесь ингибитора РНКаз RNasin Inhib (Fermentas) в концентрации 0.01 ед. Обработку ДНКазой проводили в реакционной смеси объёмом 200 мкл в течение 30 мин при 37°С. Удаление фрагментов ДНК из образцов осуществляли последовательной обработкой равными объёмами растворов фенол-хлороформ и хлороформа, как описано выше. РНК переосаждали добавлением 1/10 объема 3 М ацетата натрия (рН 6.0) и 2.5 объема 96% этанола.

Раствор инкубировали при -20°C в течение 30 мин, центрифугировали 30 мин при 16000 g и 4°C. Осадок высушивали и растворяли в 50 мкл стерильной воды.

Образцы денатурировали при 94°C в течение 2 мин.

Используемые транскрипционные системы для проведения реакции Транскрипционная Транскрипционная система № 1 (по [5] с система № 2 (по [6] с модификациями): модификациями):

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.18.4. ДНК-РНК гибридизация.

Для проведения гибридизации молекул РНК, полученных в ходе реакции транскрипции in vitro с ПЦР фрагментами изучаемых генов, нанесенных на нейлоновую мембрану, использовали гибридизационный буфер (250 мМ Na2HPO (pH 7.2), 7% ДДС, 2.5 мM ЭДТА (pH 8.0)). Для снижения фона в ходе гибридизации перед предгибридизацией фрагмент чистой нейлоновой мембраны инкубировали в течение 1 час при 42°C (температура гибридизации) в гибридизационном буфере. После этого в том же буфере проводили предгибридизацию мембраны, несущей фрагменты ДНК целевых генов. Для этого мембраны помещали в пластиковые пробирки на 50 мл и добавляли 15 мл гибридизационного буфера. Пробирки инкубировали 1 час при 42°C в гибридизационной печи. Предгибридизация предназначена для промывки мембраны от веществ, которые остаются после нанесения фрагментов ДНК в денатурирующих условиях и промывки мембраны в 2-кратном SSC буфере (20кратный SSC: 0.3 М цитрат Na, 3 М NaCI (рН 7.0)). По истечении часа мембраны извлекали. Затем мембраны помещали в отдельные пробирки на 15 мл, добавляли по 2 мл гибридизационного буфера и прогревали до температуры гибридизации.

После этого добавляли раствор 32Р-РНК, выделенных из транскрипционной смеси.

Гибридизацию вели в течение 14 часов при температуре 42°C.

После гибридизации мембраны отмывали, чтобы удалить не специфично связавшиеся радиоактивные молекулы РНК. Для этого извлекали мембраны из пробирок, помещали в кювету, куда добавляли подогретый до температуры гибридизации отмывочный буфер. Производили две отмывки раствором 0.5кратного SSC и 0.1% ДДС. В процессе отмывки контролировали наличие радиоактивного фона, излучаемого мембранами.

3.18.5. Оценка результатов гибридизации.

Радиоактивный сигнал регистрировали на рентгеновской пленке или на пластинах Phosphoimaging прибора Typhoon Trio + («GE Healthcare»).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В случай экспонирования с рентгеновской пленкой, использовали пленку Hyperfilm MP («Amersham»), экспозицию проводили при -70°С. Мембраны после каждой гибридизации экспонировали попеременно с несколькими пленками для получения сигналов разной интенсивности. Таким образом, экспозиция длилась от одних суток до недели. Проявление рентгеновских плёнок проводили с использованием растворов проявителя (2.2 г метола, 72 г Na2SO3, 8.8 г гидрохинона, 48 г Na2СO3 и 4 г KBr на 1 литр воды) и закрепителя (фиксажа, 260 г Na2SO3 и 50 г (NH4)2SO4 на 1 литр воды ).

В случае же использования пластин прибора Typhoon Trio + («GE Healthcare») мембраны экспонировали в течение трех дней. Считывание результатов и обработку данных проводили с помощью программ 1DScan и Microsoft Excel.

3.19. ПЦР после обратной транскрипции.

3.19.1. Выделение суммарной растительной РНК с помощью тризола.

многоразового пользования предварительно обрабатывали 0.2 N NaOH и деионизованной воде. Все операции проводили в вытяжном шкафу и в стерильных перчатках. Ступку и пестик для растирания предварительно охлаждали жидким азотом.

Тотальную РНК изолировали из растительного образца весом 0.2 г с использованием реагента TRIZOL, согласно методике фирмы-производителя (GibcoBRL, Life technologies) с небольшими изменениями. Растительный материал для удаления инородных частиц предварительно промывали стерильным раствором 50 мМ Трис-HCl, 100 мМ ЭДТА (pH 7.5), замораживали в жидком азоте и хранили до использования при -70С. Затем, замороженные образцы гомогенизировали в жидком азоте до порошкообразного состояния и, не дожидаясь размораживания, добавляли 1 мл раствора TRIZOL, гомогенизировали повторно и

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

инкубировали при комнатной температуре в течение 2-5 мин до полной диссоциации белков от нуклеиновых кислот в процессе размораживания. К полученному лизату добавляли 100 мкл хлороформа, тщательно перемешивали на вортексе в течение 15 с, Центрифугировали 10 мин при 12000 g и 4С. Верхнюю водную фазу, содержащую РНК, отбирали в новую пробирку типа Эппендорф и смешивали с 250 мкл изопропанола. Инкубировали 10 мин при 4С, центрифугировали в течение 10 мин при 12000 g и 4С. Надосадочную жидкость удаляли и осадок промывали 500 мкл 75%-го этанолом, центрифугировали 5 мин при 7500 g и 4С. РНК высушивали и растворяли в 20-40 мкл стерильной воды.

Концентрацию РНК определяли спектрофотометрическим методом при длине волны 260 нм, согласно методу, описанному в главе 3.9.

3.19.2. Электрофорез РНК в агарозном геле.

РНК фракционировали с помощью электрофореза в 1.0%-ном агарозном геле, содержащем 2.5 М формальдегид в 1-кратном MEN -буфере (20 мМ МОРS, 5 мМ ацетат натрия, 1 мМ ЭДТА-Na2, рН 7.0). Напряжение тока составляло 2 В/см геля.

РНК для нанесения на гель смешивали в пропорции 1:1.6 с “буфером для нанесения проб”, содержащим 80 мкл формальдегида, 81.25 мкл 10-кратного MEN буфера, 2.5 мкл 20% ДДС, 8 мкл EtBr (10мг/л) и 78.25 мкл бидистилированной воды. Перед нанесением на гель образцы прогревали при 70°С 5 мин.

3.19.3. Обратная транскрипция.

Анализ экспрессии генов проводили с использованием метода обратной транскрипции и последующей мультиплексной полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР).

Перед синтезом кДНК РНК обрабатывали ДНКазой I (не содержащей РНКазу) фирмы Fermentas в течение 30 мин при 37°C для удаления молекул ДНК.

Реакцию останавливали прогреванием в течение 10 мин при 65°C и проводили

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

удаление остатков дНТФ и фермента последующим добавлением равного объёма фенол-хлороформа и хлороформа. После центрифугирования в течение 5 мин при 13000 g и 4°C водную фазу отбирали в новую пробирку и РНК осаждали добавлением 1/10 объема 3М ацетата натрия (рН 6.0) и 2.5 объема 96% этанола.

Осадок высушивали и растворяли в 30 мкл стерильной воды. Перед синтезом кДНК РНК денатурировали в течение 3 минут при 70°С.

Синтез кДНК проводили с помощью фермента RevertAid M-MuLV Reverse Transcription (Fermentas) согласно инструкции фирмы-производителя. В качестве праймеров для синтеза кДНК использовали обратные ген-специфичные праймеры или так называемые «случайные праймеры» (random primers).

3.19.4. ПЦР после обратной транскрипции.

После завершения обратной транскрипции 2 мкл кДНК использовали в качестве матрицы для ПЦР с ген-специфичными праймерами, как описано в главе 3.10. с небольшими изменениями. При проведении мультиплексной ПЦР в реакционную смесь добавляют праймеры для синтеза фрагментов с нескольких участков ДНК (генов). В данном случае для двух, один из которых служил внутренним контролем на равное количество кДНК, взятой для реакции, другой являлся исследуемым геном и по интенсивности его сигнала на электрофорезе оценивалось содержание соответствующих мРНК. Отсутствие ДНК в препаратах РНК контролировали в ПЦР с аликвотами РНК из смесей, инкубированных без обратной транскриптазы. ПЦР реакцию проводили в объеме реакционной смеси 20 мкл, в пробирках типа Эппендорф на 200 мкл. В предварительных опытах было показано что 40 циклов позволяет детектировать разницу в накоплении матриц.

3.19.5. Анализ результатов.

Анализ количественного содержания матриц целевых генов в выше описанном методе осуществляли посредством определения количественного выхода продуктов ПЦР при заданном количестве кДНК. Для этого весь объем ПЦР

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

смеси наносили на агарозный гель и проводили контрольный электрофорез в присутствии бромистого этидия. После разделения полосы продуктов ПЦР сканировали на приборе Typhoon Trio + («GE Healthcare») для контроля общего содержания ДНК в пробах.

3.20. Вестерн-блоттинг.

3.10.1. Выделение суммарного белка из митохондрий растений.

Суммарный белок выделяли из митохондрий, полученных методом дифференциального центрифугирования или из митохондрий, очищенных в сахарозном градиенте (см. главу 3.3.).

концентрации 1% и тщательно перемешивали для разрушения митохондриальных мембран, а так же для высвобождения мембранных белков. Затем добавляли 4 объема ледяного 100% ацетона и белки осаждали в течение часа при -20°C.

Центрифугировали в течение 30 мин при 13000 g и 4°C. Надосадочную жидкость удаляли, осадок высушивали и белки растворяли в 0.1 N NaOH. Концентрацию белка определяли по Бредфорд (см. главу 3.20.2.1.) Для последующего анализа методом электрофореза в полиакриламидном геле белки переосаждали и ресуспендировали в 2% ДДС.

3.20.2. Определение количества белка.

Измерение количества суммарного белка проводили двумя различными методами: по Бредфорд (Bredford, 1976) и с использованием Бицинхонин (Stoscheck, 1990). Бицинхониновый метод использовали для определения низких концентраций белка в препарате мембран митохондрий и матриксе.

3.20.2.1. Определение белка по Бредфорд.

Определение белка по Бредфорд проводили с использованием реактива Бредфорд фирмы «Sigma» и согласно протоколу фирмы-производителя.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Разведения образцов контрольного белка и соответствующие концентрация белка, мг/мл Рис. 9. Калибровочная кривая реактива Бредфорд («Sigma») раствором БСА.

D 595 нм – оптическая плотность раствора разных концентраций белка при длине волны 595 нм.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для измерения 50 мкл образца смешивали с 1.5 мл реактива Бредфорд.

Измерения проводили в пластиковых кюветах с помощью спектрофотометра Pharmacia Biotech Ultrospec UV/Visible при длине волны 595 нм. Перед опытными измерениями была построена калибровочная кривая (рис. 7) по белку с известной концентрацией. В качестве контрольного белка использовали БСА (бычий сывороточный альбумин) в концентрации 2 мг/мл растворенный в 0.1 N NaOH.

Данные по разведению образцов контрольного белка для построения калибровочной кривой представлены в табл. 4. По результатам измерения был построен калибровочный график (рис. 9).

3.20.2.2. Определение белка бицинхонином.

При использовании бицинхониновой кислоты для определения белка применяли метод с некоторыми модификациями. Раствор, используемый для определения концентрации белка, представляет собою смесь трех растворов А (8 г Na2CO3, 1.6 г натрий-калий тартат на 100 мл дист. Н2О, рН доводили до 11.25 с помощью 10 М NaOH), В (4 г ВСА на 100 мл дист. Н2О) и С (0.4 г CuSO4 x 5 H2O на 10 мл дист. H2O) в соотношении 26:25:1, соответственно. Важно отметить, что реактивы смешивают в строгой последовательности, к раствору С добавляют раствор В, а затем добавляют раствор А. Все растворы готовят непосредственно перед использованием.

Для измерения смешивали 100 мкл образца и 100 мкл готового реактива.

Затем смесь инкубировали в течение 60 мин при 60°C. Измерения производили на приборе Multiscan MS при длине светового луча – 570 нм.

Поскольку конечный раствор (A+B+C) смешивают непосредственно перед измерением, то построение калибровочной кривой необходимо производить каждый раз перед анализом. Для построения калибровочной кривой использовали контрольный белок БСА с известной начальной концентрацией 5 мг/мл в 2% ДДС.

Затем, последовательным разведением в 2 раза получали растворы более низких концентраций от 6.25 до 0.39 мкг/мл. Данные по разведению образцов

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

контрольного белка для построения калибровочной кривой представлены в табл. 5.

По результатам измерения был построен калибровочный график (рис. 10).

Показатели оптической плотности калибровочных растворов.

оптическая плотность, D 570 нм Рис. 10. Калибровочная кривая конечного раствора (A+B+C) для определения белка бицинхонином раствором БСА. D 595 нм – оптическая плотность раствора разных концентраций белка при длине волны 595 ни.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

денатурирующих условиях.

Разделение белков клеточных экстрактов, а также белков митохондрии растений проводили с помощью электрофореза в денатурирующих условиях согласно Laemmli et al., (1970). Концентрации растворов и схема их приготовления приведены в табл. 6.

Растворы для денатурирующего гель–электрофореза Дистиллированная вода Довести до конечного объёма Довести до конечного объёма Образцы белков для нанесения на гель (конечный объем 10 мкл) содержали по 5 мкг белка в буфере для образцов (0.0625 М трис-HCl, 2% ДДС; 10% глицерин, 5% -меркаптоэтанол, 0.004% бромфеноловый синий, pH 6.8). Перед нанесением образцы денатурировали при 80оС в течение 10 минут. Электрофорез белков проводили в присутствии буфера 1х Laemmli (0.025 M трис-HCl; 0.125 М глицерин;

0.1% ДДС, pH8.5) при постоянном напряжении 300 V в течение часа. Для определения молекулярных весов белков в качестве стандартов использовали маркер Prestained marker фирмы «BioRad».

3.20.4. Окраска белковых гелей.

Окрашивание полиакриламидных гелей проводили двумя методами с использованием реактива Кумасси и с использованием имидозола.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для окраски реактивом Кумасси после электрофореза гель коротко промывали дистиллированной водой и помещали в раствор Кумасси (45 % метанола, 9 % уксусной кислоты, 0.2 % красителя Кумасси синий R-250). Окраску производили в течение часа на качалке при комнатной температуре. Затем, гель отмывали буфером для отмывки (225 мл 100 % этанола, 37.5 мл ледяной уксусной кислоты, 237.5 мл воды) до визуализации полос белков.

Окрашивание гелей имидазолом использовали для количественной оценки белковых полос в геле перед их переносом на мембрану. Гель помещали на 10 мин в раствор 0.2 М имидазола, промывали водой и инкубировали в растворе 0.3 М сульфата цинка до полной визуализации прозрачных белковых полос на молочнобелом фоне геля. Реакцию останавливали водой. До переноса гель хранили в небольшом количестве воды при 4°C. Перед переносом гель отмывали раствором для переноса белков, содержащим 0.02 М трис-HCl (pH 8.0) и 0.15 М глицин до полного исчезновения белковых полос.

3.20.5. Перенос белков на мембрану.

Перенос белков проводили на нитроцеллюлозные мембраны фирм Schleicher&Schuell (Германия) с помощью аппарата Semi-dry фирмы Bio-Rad, согласно методике фирмы-производителя. Перенос осуществляли в буфере для переноса, содержащем 0.02 М трис-HCl (рН 8.0), 0.15 М глицин, 20% метанола и 0.1 % ДДС. После электрофореза гель промывали водой, затем гель и нитроцеллюлозные мембраны инкубировали в буфере для переноса в течение 5 мин. После переноса мембраны просушивали. Перед последующим использованием мембраны предварительно прокрашивали 1%-ым раствором Ponceau S в 5 %-ой уксусной кислоте для оценки количества белка после переноса.

Перед имуннохимическим анализом мембраны отмывали дистиллированной водой до полного исчезновения полос. После окраски нельзя допускать высыхания мембраны.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.20.6. Иммунохимический анализ.

При стандартной постановке имуннохимического анализа мембраны с иммобилизованными белками инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре в блокирующем растворе, содержащем буфер 1хTBS-Т (20 мМ трисHCl (рН 7.5), 150 мМ NaCl, 0.1 % Твин 20), блокирующий реагент 5% (в/о) сухое обезжиренное молоко. Первичные антитела против белка альтернативной оксидазы арабидопсиса (АОХ; AS04054, «Agrisera») разводили в блокирующем растворе до необходимой концентрации 1:500 и инкубировали с мембранами в течение 2 часов при комнатной температуре или в течение ночи при 4°С. После этого для удаления первичных не связавшихся антител мембраны промывали блокирующим буфером (4 раза по 10 мин) при комнатной температуре. Затем мембраны инкубировали в течения часа в блокирующем буфере со вторичными кроличьими или мышиными IgG-антителами, конъюгированными с пероксидазой или флуоресцентным белком FITC, «Sigma». Не связавшиеся вторичные антитела удаляли повторным промыванием в блокирующем буфере без блокирующего реагента (4 раза по 10 мин). Затем, в зависимости от типа вторичных антител, проводили анализ взаимодействия антител с белками. В случае иммуноглобулинов, конъюгированных с пероксидазой, детекцию сигнала проводили с помощью реакции хемилюминесценции. С этой целью мембраны инкубировали в течение 1 мин в реакционной смеси, приготовленной из растворов 1 (0.5 мМ люминол, 0.4 мМ p-кумаровая кислота в ДМСО, 0.1 M трис-HCl, pH 8.5) и 2 (5.4 мМ Хемилюминесцентный сигнал регистрировали на пленке X-ray (Hyperfilm, «GE Healthcare»). Детекцию сигнала иммуноглобулинов, конъюгированных с красителем FITC (флуоресцеинизотиоцианат), обладающим собственной флуоресценцией проводили на приборе фосфоимиджер Typhoon Trio, «GE Healthcare» с настройками для лазера – 488 нм, фильтра - 526 нм.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Влияние СК и 6-БАП на интенсивность дыхания в тканях семядолей люпина желтого.

4.1.1. Оптимизация постановки эксперимента.

Изменение показателей скорости дыхания является одной из главных характеристик, демонстрирующих изменения в функционировании митохондрий.

Была разработана схема эксперимента, опираясь на данные по действию гормонов на биогенез пластид (рис. 11) (Kusnetsov et al., 1994).

Рис. 11. Схематическое изображение условий эксперимента (А) и инкубационная камера (Б) для изучения влияния гормонов на интенсивность дыхания митохондрий в этиолированных семядолях люпина желтого.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

стратификации и кожуру каждого семени надрезали. Весь цикл проращивания семян и инкубации проводили в темноте, для того чтобы уменьшить вклад фотодыхания в измеряемые показатели скорости дыхания. Кроме того, примесь пластид может мешать последующему биохимическому и молекулярнобиологическому анализу. Замачивание, проращивание семян и инкубация семядолей для истощения по эндогенным гормонам проводили в инкубационной камере. Камера включает в себя кювету с водой или указанным раствором. Стекло, на котором инкубируют семена и семядоли, следует обернуть фильтровальной бумагой. При этом края бумаги погружают в воду или раствор, уровень которого не должен превышать уровень стекла (рис. 11Б). После прорастания семядоли переносили на растворы гормонов, приготовленные в 20 мМ Трис-HCl (рН 8.0) для лучшего проникновения гормона в ткань и инкубировали в течение 12 часов.

Инкубацию семядолей на воде и в растворе гормона вели в таких же в кюветах при тех же условиях. При изучении гормонального эффекта в качестве контроля использовали семядоли, инкубированные в течение 12 часов на растворе 20 мМ Трис-HCl (рН 8.0) без добавления гормонов.

В предварительных экспериментах было изучено влияние 20 мМ Трис-HCl (рН 8.0) на скорость дыхания этиолированных семядолей люпина желтого. Было показано, что 20 мМ Трис-HCl (рН 8.0) уменьшает долю цианид-резистентного дыхания (табл. 7, рис. 12А).

При вычислении значений скорости дыхания на грамм сухого веса семядолей (рис. 12Б) стало очевидно, что действие 20 мМ Трис-HCl (рН 8.0) вызывает увеличение скорости дыхания по цитохромному пути (Vcyt) более чем в 8 раз и не влияет на максимальную скорость дыхания по альтернативному пути (Valt).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

Примечание: представлены средние значения и их стандартные ошибки.

ЦРД, % Рис. 12 Влияние 20 мМ Трис-HCl (рН 8.0) на показатели скорости дыхания и соотношение дыхательных путей семядолей люпина желтого: изменение доли цианид-резистентного дыхания (А); изменение скорости цитохромного пути окисления, максимальной скорости альтернативного дыхания и остаточного дыхания при пересчете на сухой вес (Б). Контроль (К) - 20 мМ Трис-HCl (рН 8.0). Ц – Vcyt, скорость цитохромного пути окисления; А – Valt, максимальная активность альтернативного пути окисления; О – Vres, скорость остаточного дыхания. Бары отражают стандартные отклонения при трех независимых повторах эксперимента.

фитогормонов цитокинина и салициловой кислоты на экспрессию генов митохондриальных белков, то была поставлена задача определить действующие концентрации данных гормонов для этиолированных семядолей люпина желтого.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

4.1.2. Влияние СК на активность различных путей митохондриального окисления в тканях этиолированных семядолей L. luteus.

Следующим этапом работы стал подбор действующей концентрации СК для этиолированных семядолей люпина желтого.

В первую очередь, основываясь на данных, опубликованных в литературе, были выбраны следующие концентрации СК: 100 мкМ, 500 мкМ, 1 мМ. С помощью ингибиторного анализа исследовали влияние 12-ти часовой обработки СК этиолированных семядолей L. luteus на показатели интенсивности дыхания семядолей (табл. 8, рис. 13).

Показатели скорости дыхания семядолей L. luteus Примечание: представлены средние значения и их стандартные ошибки.

При воздействии 500 мкМ и 1 мМ СК наблюдается достоверное увеличение доли цианид-резистентного дыхания (рис. 13А). Это происходит за счет увеличения максимальной активности альтернативного окисления (Valt), рассчитанной на грамм сухого веса, на фоне уменьшения скорости окисления по цитохромному пути (Vcyt), однако лишь при действии 500 мкМ уменьшения Vcyt достоверно по сравнению с контролем (табл. 8, рис. 13Б). Кроме того, было показано, что действие 1 мМ помимо эффекта на альтернативный и цитохромный пути увеличивает остаточное окисление, однако данное изменение дыхание не

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

достоверно. Таким образом, увеличение доли ЦРД при действии 1 мМ СК отчасти может быть связано и с активацией остаточного окисления.

ЦРД, % Рис. 13. Влияние салициловой кислоты на показатели скорости дыхания и соотношение дыхательных путей семядолей люпина желтого: изменение доли цианид-резистентного дыхания (А); изменение скорости цитохромного пути окисления, максимальной скорости альтернативного дыхания и остаточного дыхания при пересчете на сухой вес (Б). Контроль (К) - 20 мМ Трис-HCl (рН 8.0).

Ц – Vcyt, скорость цитохромного пути окисления; А – Valt, максимальная активность альтернативного пути окисления; О – Vres, скорость остаточного дыхания. Бары отражают стандартные отклонения при трех независимых повторах эксперимента.

Основываясь на собственных экспериментальных результатах, и на литературных данных, для СК была выбрана концентрация 1 мМ для всех последующих экспериментов на этиолированных семядолях люпина желтого.

Представленные результаты демонстрируют активацию альтернативного пути данной концентрацией СК, при этом максимальная скорость альтернативного дыхания увеличивается на 131 % по сравнению с контролем (табл. 8, рис. 13).

Активация СК общей скорости дыхания на 43 %, главным образом, происходит за счет активации альтернативного пути, а также, возможно, за счет активации остаточного дыхания. Подтверждением правильности выбора концентрации гормона служило также то, что аналогичные данные с использованием 1 мМ СК получены Matos с соавт. (2008) на гипокотилях G. max. Выбор такой высокой концентрации СК может обуславливаться, в том числе, быстрым поглощением и интенсивной метаболизацией этого фитогормона в клетках растений. В частности,

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

в работе Chen et al., (2001) было показано, что более 85 % СК, поглощенной клетками табака, метаболизируется в течение 5 часов. Это свидетельствует, что выбор в качестве действующей концентрации СК 1 мМ, является вполне оправданным и именно такая концентрация позволила получить в данном исследовании отчетливый эффект этого фитогормона на определяемые параметры дыхания семядолей.

В данных экспериментах анализ изменения интенсивности дыхания под влиянием 100 мкМ СК выявил увеличение Vcyt, однако отличия не были достоверыми при сравнении с контролем. Отсутствие достоверного увеличения Valt при действии 100 мкМ может быть следствием недостаточной концентрации гормона или ограниченностью его проникновения в ткани семядолей (Norman et al., 2004).

Рис. 14. Влияние салициловой кислоты на показатели скорости дыхания семядолей люпина желтого при пересчете на сырой вес: изменение скорости цитохромного пути окисления, максимальной скорости альтернативного дыхания и остаточного дыхания при пересчете. Контроль (К) - 20 мМ Трис-HCl (рН 8.0). Ц – Vcyt, скорость цитохромного пути окисления; А – Valt, максимальная активность альтернативного пути окисления; О – Vres, скорость остаточного дыхания. Бары отражают стандартные отклонения при трех независимых повторах эксперимента.

Эффект 1 мМ СК сохраняется и при пересчете скоростей дыхания на сырой вес семядоли (рис. 14). Результаты ингибиторного анализа приведены на рис. Было выявлено, что при расчете показателей скорости дыхания на сырой вес СК увеличивает максимальную скорость альтернативного дыхания на 146 %, а общую

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

скорость митохондриального дыхания на 38 %. Однако физиологический эффект на общее митохондриальное дыхание не является достоверным, при пересчете скорости дыхания на сырой вес, и находиться в пределах ошибки, в отличии от эффекта выявленного при пересчете показателей на сухой вес.

Исходя из вышеизложенных результатов, можно сделать вывод об активации СК альтернативного пути дыхания в «нетермогенных» тканях семядолей люпина желтого, что согласуется с уже известными данными на других растениях (Clifton et al., 2006; Fung et al., 2006; Norman et al., 2004). Это происходит за счет увеличения максимальной скорости альтернативного пути дыхания. Увеличение остаточного тканевого дыхания позволяет предположить, что 1 мМ СК активирует какие-либо метаболические процессы. Таким образом, эксперименты с использование СК позволили удостовериться в правильном подборе концентраций данного фитогормона и продолжительности инкубации на нем семядолей люпина.

митохондриального окисления в тканях этиолированных семядолей L. luteus.

Литературные данные об эффекте различных концентраций цитокининов, в частности 6-БАП противоречивы и неоднозначны. В частности, существуют сведения о подавлении альтернативного пути митохондриального окисления (Miller, 1979, 1980; Musgrave, Siedow, 1985), либо о подавлении общего дыхания за счет ингибирования НАДН-дегидрогеназ (Miller, 1982; Sue et al., 1997) при действии цитокининов. В большинстве работ используемые концентрации гормона значительно превышали эндогенное содержание цитокининов в растительном соке, которое составляет десятки нМ (см. обзор Романов, 2009).

В данной работе для изучения влияния цитокининов на показатели скорости дыхания этиолированных семядолей люпина желтого был также выбран 6-БАП.

Это даёт возможность сравнивать полученные экспериментальные данные с уже опубликованными результатами. Поскольку диапазон используемых концентраций весьма широк, то в ходе этого исследования было использовано несколько

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

концентраций данного гормона: 1 мкМ, 10 мкМ, 22 мкМ, 50 мкМ, 100 мкМ и 200 мкМ. В табл. 9 и на рис. 15 представлены показатели скорости дыхания семядолей люпина желтого, обработанных различными концентрациями 6-БАП.

Показатели скорости дыхания семядолей L. luteus при действии Примечание: представлены средние значения и их стандартные ошибки.

Обнаружено, что 6-БАП уменьшает долю ЦРД в общем дыхании изолированных этиолированных семядолей L. luteus при действии всех выбранных концентраций, за исключением концентрации 100 мкМ (табл. 9, рис. 15А). Однако, наблюдаемый эффект достигается за счет различных механизмов. В малых концентрациях гормон (1-22 мкМ) вызывает постепенную активацию общего тканевого дыхания (табл. 9, рис. 15Б). Это происходит из-за увеличения активности цитохромного пути окисления, снижение же максимальной скорости альтернативного дыхания незначительно и не является достоверным.. Повышение концентрации приводит к исчезновению эффекта 6-БАП на цитохромный путь дыхания. Цитокинин в концентрации 50 мкМ и 100 мкМ подавлял общее тканевое дыхание за счет значительного снижения по сравнению с контролем Valt на 73 % и 97 %, соответственно при инкубации семядолей на 100 мкМ БАП составляет 7 нг атом О2/мин г сухого веса. (табл. 9, рис. 15Б). Известно, что обработка ткани 6РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ БАП высокими концентрациями приводит к подавлению дыхания. Например, при обработке культуры клеток G. max 0.5 М раствором 6-БАП в течение 10 мин наблюдали снижение уровня дыхания ткани и, по мнению автора, это подавление происходит за счет подавления альтернативного пути на 71 %. В исследованиях по влиянию 6-БАП на митохондрии печени крысы наряду с 0.5 мМ концентрация 0. мМ также вызывала снижение уровня дыхания (Miller, 1982).

ЦРД, % Рис. 15. Влияние 6-БАП на показатели скорости дыхания и соотношение дыхательных путей семядолей люпина желтого: изменение доли цианидрезистентного дыхания (А); изменение скорости цитохромного пути окисления, максимальной скорости альтернативного дыхания и остаточного дыхания при пересчете на сухой вес (Б). Контроль (К) - 20 мМ Трис-HCl (рН 8.0). Ц – Vcyt, скорость цитохромного пути окисления; А – Valt, максимальная активность альтернативного пути окисления; О – Vres, скорость остаточного дыхания. Бары отражают стандартные отклонения при трех независимых повторах эксперимента.

Отсутствие эффекта 200 мкМ 6-БАП может быть следствием смены метаболических путей и, как результат, смены окисляемого субстрата. В работе Dizengremel et al. (1982) на препарате митохондрий показано, что при окислении сукцината и малата концентрации 6-БАП, подавляющие дыхание, различаются.

Если при окислении малата в альтернативном пути достаточна обработка 0.2 мМ гормона, то для подавления окисления сукцината максимальное снижение достигали при действии 0.8 мМ. Обработка 0.2 мМ 6-БАП вызывала подавление окисления сукцината лишь на 50 %.

Увеличение доли ЦРД (рис. 15А) на фоне уменьшения максимальной активности альтернативного окисления (рис. 15Б) происходит за счет увеличения

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

уровня остаточного дыхания (табл. 9). При действии 100 мкМ 6-БАП происходит активация Vres на 27 % (по сравнению с контролем) и Vres составляет 55 % от общего дыхания ткани. Известно, что 6-БАП активирует обменные процессы, включая окислительные процессы (Dezsi, Farkas, 1964; Kuper et al., 1991, 1992;

Кулаева, 1973), что, видимо, и является причиной активации остаточного дыхания ткани. Кроме того, длительная инкубация с высокими концентрациями 6-БАП вызывает синтез эндогенного этилена и оксида азота (Carimi et al., 2005; Vogel et al., 1998), которые являются важными сигнальными молекулами растений.

Вероятно, наблюдаемый эффект при действии различных концентраций 6-БАП является совместным эффектом различных регуляторных компонентов, таких как цитокинин, этилен и оксид азота.

опубликованными исследованиями по влиянию 6-БАП на интенсивность дыхания митохондрий, концентрация 22 мкМ 6-БАП была выбрана для дальнейшей работы на изолированных этиолированных семядолях L. luteus. В этой концентрации 6БАП не вызывает изменения Valt по сравнению с контролем (табл. 9, рис. 15Б), в то время как Vcyt увеличивается на 128 %, что может быть следствием активации метаболизма клетки.

Достоверность этих результатов сохраняется и при пересчете скоростей дыхания на сырой вес семядоли. Таким образом, в данной работе впервые показана активация митохондриального дыхания синтетическим аналогом природного цитокинина 6-БАП.

Опираясь на это, а так же проанализировав полученные данные и сопоставив их с ранее опубликованными исследованиями по влиянию 6-БАП на интенсивность дыхания митохондрий, концентрация 22 мкМ 6-БАП была выбрана для дальнейшей работы на изолированных этиолированных семядолях люпина желтого. Было показано, что в данной концентрации 6-БАП не вызывает изменения максимальной скорости альтернативного пути по сравнению с контролем (рис. 15Б), в то время как скорость цитохромного дыхания увеличивается на 128 %.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

Результаты ингибиторного анализа, пересчитанные на грамм сырого веса, приведены на рис. 16. Они подтверждают достоверность эффекта 22 мкМ 6-БАП.

Гормон в данной концентрации достоверно увеличивает скорость общего тканевого дыхания на 46 % по сравнению с контролем, тогда как изменение максимальной скорости альтернативного пути при пересчете на грамм сырого веса так же не достоверно, как и при расчете на сухой вес. Активация синтетическим аналогом цитокининов 6-БАП впервые показана в данной работе. Возможно, это связано со спецификой объекта.

Рис. 16 Влияние 6-БАП на показатели скорости дыхания семядолей люпина желтого при пересчете на сырой вес: изменение скорости цитохромного пути окисления, максимальной скорости альтернативного дыхания и остаточного дыхания при пересчете. Контроль (К) - 20 мМ Трис-HCl (рН 8.0). Ц – Vcyt, скорость цитохромного пути окисления; А – Valt, максимальная активность альтернативного пути окисления; О – Vres, скорость остаточного дыхания. Бары отражают стандартные отклонения при трех независимых повторах эксперимента.

Ранее эксперименты по изучению влияния фитогормонов на интенсивность дыхания не проводили на этиолированных семядолях люпина желтого. Важной отличительной особенностью семядолей является то, что они представляют не просто какую-либо растительную ткань или орган, а трансформируются в течение прорастания семени из запасающего органа в первый ассимилирующий орган, переводя тем самым проросток на автотрофное питание. Процессы, происходящие при такой перестройке, имеют тонкое регулирование, и если на первых этапах

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

прорастания семени имеет место активация дыхания в семядолях для иммобилизации запасных веществ, то при трансформации в ассимилирующий орган происходит формирование фотосинтезирующих пластид – хлоропластов.

Таким образом, постепенно в формировании окислительно-восстановительного потенциала клетки кроме митохондрий начинают участвовать и хлоропласты, и степень их участия в формировании данного потенциала изменяется во времени.

Следовательно, гормональный эффект в вышеописанных экспериментах получен на фоне постепенной дифференцировки митохондрий и хлоропласт.

Как уже отмечалось ранее, инкубация длительная инкубация на 6-БАП вызывает образование двух других важных сигнальных молекул – этилена и оксида азота. Кроме того, в ходе экспериментов не было произведено измерение эндогенного содержания СК и цитокининов после инкубации на растворах гормонов. Таким образом, термин «гормональный эффект» в данной работе имеет широкое значение и включает в себя возможную индукция сигнальных молекул и других гормонов.

Из полученных результатов данного исследования следует, что (1) СК достоверно увеличивает максимальную скорость альтернативного пути, что приводит к увеличению интенсивности общего митохондриального дыхания; (2) 6БАП увеличивает скорость общего тканевого дыхания, за счет увеличения максимальной скорости цитохромного пути.

4.2. Изучение влияние 6-БАП и СК на интенсивность транскрипции митохондриальных генов.

Первым этапом реализации генетической информации является синтез матричной РНК. Поскольку метод run-on транскрипции позволяет изучить интенсивность синтеза индивидуальных мРНК, то при помощи этого метода можно получить, хотя и не окончательный, но ответ на вопрос, как под влиянием фитогормона изменилось содержание мРНК.

Применение практически любого нового метода требует оптимизации отдельных его этапов. При использовании run-on транскрипции в зависимости от

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

объекта необходима оптимизация многих стадий метода – от выделения митохондрий до гибридизации и отмывки мембран. Очень важным этапом метода run-on транскрипции является подготовка мембран с фрагментами изучаемых генов. Такая мембрана является своеобразным макрочипом, который может содержать до 50-100 генов.

4.2.1. Клонирование фрагментов митохондриальных генов.

Поскольку цель работы заключалась в изучении влияние гормонов на функционирование митохондрий, для изучения регуляции на уровне транскрипции был отобран ряд генов митохондриального кодирования. Опираясь на данные по организации ЭТЦ митохондрий и с учетом того, что время действия гормонов достаточно для новообразования белков, были отобраны гены, кодирующие компоненты различных комплексов ЭТЦ, а так же гены, относящиеся к белоксинтезирующей системе митохондрий. Все отобранные для изучения гены были митохондриального кодирования. Однако, белковые комплексы ЭТЦ (за исключением комплекса II) включают в себя субъединицы ядерного и митохондриального кодирования, и новообразование комплексов требует точного стехиометрического соотношения субъединиц. Таким образом, изменение синтеза субъединиц ядерного кодирования повлечет за собой изменение синтеза субъединиц митохондриального кодирования. В экспериментах было длительное воздействия фитогормонов и возможно эффект опосредован ядерным сигналом, а не действием напрямую на митохондрии.

На основании этих критериев были выбраны 13 генов митохондриального кодирования, некоторые характеристики которых приведены в табл. 10.

Характеристика выбранных для изучения генов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

Характеристика выбранных для изучения генов (продолжение).

Примечание: № 1-13 гены митохондриального кодирования, № 14-17 гены пластидного кодирования.

Как видно из табл. 10, были выбраны представители практически всех компонентов ЭТЦ митохондрий, которые имеют митохондриальное кодирование.

Во-первых, это комплекс I - ndh; комплекс III - cob; комплекс IV – ccmB и cox гены;

АТФ-синтазный комплекс – atp9 и гены, продукты которых необходимы для синтеза белка, а именно: рибосомальные РНК – rrn26 и rrn18 гены, рибосомальные белки – rps12 и rps13 гены и ген транспортной РНК для изолейцина – trnI.

Для люпина не известна полная нуклеотидная последовательность митохондриального генома, как и для любого другого представителя семейства Fabaceae. Имеются лишь сведения о последовательности некоторых отдельных генов, в частности представителей рода Lupinus митохондриального кодирования.

Известно, что хондрион обладает высокой изменчивостью нуклеотидных последовательностей. Праймеры для синтеза фрагмента изучаемых генов подбирали к консервативным участкам последовательностей соответствующих генов представителей рода Lupinus, если последовательности таковых не доступны, то по консервативным участкам последовательностей соответствующих генов A. thaliana либо других видов. Подбор праймеров осуществляли на регионы генов,

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

не имеющих гомологии с пластомными последовательностями для исключения искажения результатов реакции run-on транскрипции в результате перекрестной гибридизации. Для этого отобранные последовательности сравнивали с последовательностями четырех пластомов (см. главу 3.5.2.).

С целью оценить возможный вклад пластдных транскриптов были отобраны четыре пластидных гена с высокой интенсивностью транскрипции (табл. 10). Эти гены относятся к комплексам, которые присутствуют и в пластидах и в митохондриях: АТФ-синтазный комплекс – atpE, НАДН-дегидрогеназный комплекс - nadF и гены рибосомальной РНК - rrn16 и rrn23. Отобранные последовательности пластидных генов сравнивали с последовательностями четырех митохондриальных геномов также для исключения искажения результатов реакции run-on транскрипции в результате перекрестной гибридизации (см. главу 3.5.2.). Праймеры на фрагменты генов atpE и nadF были ранее подобраны в лаборатории экспрессии генома на основе последовательностей однодольных (Зубо Я.О. и др., 2008; Зубо Я.О. (не опубл. данные)). Интересно отметить, что в результате ПЦР с использованием в качестве матрицы пластидной ДНК Lupinus luteus и праймерами, подобранными по последовательностям генов однодольных, амплифицируется продукт ожидаемого размера. Однако при использовании праймеров однодольных для митохондриальных генов с мтДНК люпина амплификация отсутствует в большинстве случаев. Это подтверждает высокую вариабельность митохондриального генома, которая отмечалась и другими исследователями (Даниленко, Давыденко, 2003).

Полученные продукты ПЦР очищали из агарозного геля, а затем клонировали в вектор pTZ57R/T («Fermentas»). С помощью программы VectorNTI последовательность каждого амплифицируемого фрагмента проверяли на наличие в нем сайтов рестрикции. После проведения ПЦР с плазмиды со встроенным фрагментом гена, ампликон или плазмиду рестриктировали подобранными рестриктазами, что служило доказательством корректности амплификации.

Информация о нуклеотидной последовательности праймеров, сайтах рестрикции

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

ампликонов и размерах получаемых после рестрикции фрагментов приведена в табл. 11.

Характеристика клонируемых фрагментов генов исследования rps rps rrn rrn Окончательным подтверждением того, что праймеры осуществляли синтез с последовательности интересующих нас генов, служило получение нуклеотидной последовательности проклонированных фрагментов. Сиквенирование позитивных клонов проводили в компании «Синтол» с использованием праймеров М13.

Полученные нуклеотидные последовательности привеены на рис. 17. Необходимо отметить, что предполагаемый фрагмент гена rrn26 по сиквенсу оказался на 83 % гомологичен хромосомному участку M. truncatula (FP700159), но мы его не исключили из дальнейшей работы, поскольку он окозался гомолигичен участку митохондриальной ДНК и если в результате исследований удостся показать гормональную регуляцию данного фрагмента, можно будет изучить функцию

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

программы BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) с нуклеотидными принадлежности к последовательности определенного гена. В результате последовательность 6 генов митохондриального кодирования, atp9, ccmB, cob, cox1, cox3 и rps13 у L. luteus.

транскрипции.

Сложность выделения нативных функционально активных митохондрий из растительных тканей служит одной из основных причин ограниченного количества работ по изучению функционирования этих органелл в растениях и, особенно, по изучению регуляции экспрессии их генов. Изучение роли фитогормонов в регуляции уровня дыхания в растительной клетке может быть связано с рядом трудностей. В первую очередь к ним относится наличие плотных и жестких клеточных оболочек, вызывающих механические повреждения органелл при растирании тканей. Отрицательную роль играет кислая реакция клеточного сока, выделяющегося в процессе гомогенизации ткани, а также фенольные соединения, содержащиеся в значительном количестве во многих растительных клетках. Они являются разобщающими агентами и ингибиторами в ЭТЦ (Douce et al., 1987;

Побежимова и др., 2004).

Другие особенности растительных тканей, такие как высокое содержание крахмала, фотосинтетических пигментов и масел, также оказывают негативное влияние на качество и чистоту изолированной митохондриальной фракции (Douce et al., 1987; Побежимова и др., 2004).

дифференциальным центрифугированием. Однако органеллы, выделенные таким образом, имели очень низкую транскрипционную активность in vitro. Это могло

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

быть связано со значительной примесью этиопластов и фрагментов клеток, что отмечается в литературе (Douce et al., 1987).

В результате самих митохондрий в транскрипционной среде оказывалось недостаточно. Поэтому, для получения более чистого препарата суспензия отмытых митохондрий была дополнительно очищена с помощью центрифугирования в ступенчатом градиенте плотности сахарозы. Чтобы исключить такую возможность, мы перешли к получению более чистой фракции митохондрий путем их очистки с помощью ступенчатого градиента сахарозы.

Рис. 18. Данные полярографических исследований различных фракций, полученных в результате очистки митохондрий люпина в градиенте плотности сахарозы. (А) - Разделение суспензии отмытых митохондрий после очистки в сахарозном градиенте: 1 – граница между 20%- и 35%-сахарозы; 2 – между 35%- и 47%-сахарозы; 3 – между 47%- и 60%-сахарозы. (Б) – полярограммы поглощения кислорода при окислении сукцината митохондриями соответствующих фракций.

Содержащие митохондрии фракции (МХ), инкубировали в реакционной среде, куда дополнительно вносили 200 мкМ АДФ и 10 мкМ сукцината (СК). Численные значения кривых показывают скорость поглощения кислорода митохондриями в нг-атомов О2/(мин мг белка).

При разделении в градиенте плотности сахарозы были получены три полосы (рис. 18А), предположительно содержащие митохондрии, находящиеся на границах сахарозы разной концентрации (1 – граница 20% и 35% сахарозы; 2 – граница 35% и 47% сахарозы; 3 – граница 47% и 60% сахарозы). По литературным данным

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

митохондрии при центрифугировании в градиенте сахарозы скапливаются на границе 60% и 47%, 47% и 35% сахарозы (Giege et al., 2000). Степень обогащенности каждой из фракций митохондриями оценивали по скорости дыхания с помощью полярографа. Интактные митохондрии были обнаружены на границе 35% и 47% сахарозы (рис. 18Б).

Следует также отметить, что согласно расчетам, количество белка очищенных митохондрий составляло примерно 10% от количества белка отмытых митохондрий, нанесенных на градиент. Такое низкое содержание белка митохондрий после очистки в градиенте, скорее всего, является спецификой семядолей люпина желтого, содержащих большое количество запасных белков.

Действительно, при использовании такого метода очистки в сахарозном градиенте для митохондрий, выделенных из корнеплодов Beta vulgaris, количество белка интактных митохондрий локализованных на границе раздела 35% и 47% сахарозы по отношению к белку во фракции отмытых митохондрий составляло около 50% (данные не приведены).

Основываясь на данных полярографических исследований, митохондрии, локализованные на границе раздела 35% и 47% сахарозы, были использованы для проведения run-on транскрипции. Количество митохондрий для транскрипции обычно оценивают по содержанию белка.

4.2.3. Оптимизация метода run-on транскрипции.

Метод run-on транскрипции был исходно разработан для изучения скорости транскрипции ядерных генов (Marzluff, 1978). Позднее эта техника стала применяться для изучения интенсивности синтеза индивидуальных мРНК пластидных генов (Deng et al., 1987; Зубо, Кузнецов, 2008), однако до настоящего времени практически отсутствуют работы по изучению интенсивности транскрипции митохондриальных генов растений. Использование этого метода необходимостью получения достаточно чистой фракции органелл, но и с оптимизацией условий проведения различных этапов run-on транскрипции.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

Рис. 19. Результаты экспериментов по оптимизации run-on транскрипции:

радиоавтограф транскрипции (А, В) Радиоавтографы экспериментов run-on транскрипции с митохондриями 2-й фракции в различных транскрипционных системах (А), и при различном временим транскрипции (Б), а также содержание транскриптов в относительных единицах в соответствующих экспериментах (Б, Г) Тр1 – транскрипционная система 1, Тр2 – транскрипционная система 2, ТСхл – транскрипционная система для хлоропластов, cob, nad9 atp9, cox3 – митохондриальные гены, rrn16.- пластидный ген. Бары отражают стандартные отклонения при трех независимых повторах эксперимента.

Известно, что РНК-полимеразы митохондрий большинства изученных видов, в том числе и эволюционно далеко отстоящих друг от друга, имеют значительное сходство с РНК-полимеразами бактериофагов Т3, Т7 и SP6. Анализ литературных данных показал, что состав компонентов реакционных сред для транскрипции митохондриальных генов довольно универсален. В наших опытах были использованы две различные, но достаточно близкие реакционные среды.

Первая из них «Транскрипционная система № 1» была ранее применена для транскрипции митохондриальных генов A. thaliana (Giege et al., 2000) (см. главу 3.18.3.). Вторая «Транскрипционная система № 2» хорошо апробирована для транскрипции митохондриальных генов различных организмов, в том числе

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

дрожжей (Binder et al., 1995) (см. главу 3.18.3.). Реакцию проводили в течение мин.

использовании для транскрипции in vitro среды №1, ранее оптимизированной для транскрипции митохондриальных генов растений, интенсивность сигналов гибридизации транскриптов митохондриальных генов с фрагментами этих генов была выше в 1.2 (atp9) – 1.8 (nad9) раз, чем при применении среды №2, что говорит о более активной транскрипции соответствующих генов.

транскрипции пластидных генов (Зубо, Кузнецов, 2008), которая, как видно из рис. 19А, Б, не подходит для транскрипции митохондриальных генов.

В ходе оптимизации метода было изучено накопление транскриптов в течение различного периода времени. Для этого транскрипцию in vitro проводили в трнскрипционной системе №1 в течение 10, 15 и 30 мин при 25С. Результаты, представленные на рис. 19В, Г, показывают, что через 10 и 15 мин реакции накапливается примерно равное количество транскриптов митохондриальных генов, а к 30 мин интенсивность транскрипции резко падает как минимум в 2 раза.

При run-on транскрипции всегда предпочтение отдают наиболее короткому времени реакции, для того чтобы минимизировать вклад процессов деградации мРНК. В данных экспериментов 10 мин было выбрано в качестве оптимального времени реакции.

Для того, чтобы убедиться, что именно интактные митохондрии с наиболее, высокими показателями, характеризующими дыхание, являются наиболее транскрипционно активными, была проведена реакция транскрипции in vitro в подобранных условиях (транскрипционная система №1 и время реакции 10 мин) со всеми тремя фракциями, разделенными в сахарозном градиенте (рис. 18, 20А-В).

Результаты показали, что наиболее активную транскрипцию наблюдали с функциональную активность. Это подтверждается наиболее интенсивными

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

сигналами радиоактивности, полученными при гибридизации синтезированной in vitro РНК с фрагментами индивидуальных митохондриальных генов (рис. 20Б).

Рис. 20. Результаты run-on транскрипции с различными фракциями после очистки митохондрий в градиенте сахарозы. Радиоавтографы экспериментов транскрипции с 1 (А), 2 (Б) и 3 (В) фракциями; (Г) – схема нанесения на мембрану фрагментов ДНК исследованных органельных генов (прямой шрифт – митохондриальные гены, курсив – хлоропластные гены).

Наиболее высокая интенсивность транскрипции для митохондриальных генов была показана для гена рРНК (rrn18). Более низкую интенсивность транскрипции в условиях эксперимента имели cox3, cob, nad9 гены, а также ген, кодирующий транспортную РНК митохондрий - trnl. Несмотря на очистку в сахарозном градиенте, в препарате митохондрий присутствует незначительная примесь пластид, что видно по наличию сигнала с пластидной рРНК (rrn16 и rrn гены). Однако на мембрану нанесены фрагменты генов митохондрий, не имеющих гомологий с какими-либо генами пластид, поэтому небольшая примесь пластид не будет влиять на количественные показатели транскрипции митохондриальных генов. Следует отметить, что интенсивность транскрипции большинства изученных митохондриальных генов была значительно более низкой, чем показанная ранее скорость транскрипции большинства пластидных генов (Зубо, Кузнецов, 2008).

Полученные результаты показали, что оптимизированный метод позволяет выделить из семядолей люпина интактные транскрипционно активные

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

митохондрии и использовать их для изучения регуляции интенсивности транскрипции фитогормонами.

4.2.4. Влияние СК на интенсивность транскрипции митохондриальных генов.

Для наиболее полного анализа механизмов действия фитогормонов на митохондрии, был исследован эффект их воздействия на цитохромный и альтернативный путь на молекулярно-биохимическом уровне.

Согласно экспериментальным данным, полученным в данном исследовании, воздействие СК не влечет за собой изменения интенсивности цитохромного пути дыхания. Однако отсутствие какого-либо эффекта на функциональном уровне не означает отсутствие изменений на уровне экспрессии генов белков ЭТЦ митохондрий. Действительно, в работе показано, что СК изменяет интенсивность транскрипции генов митохондриального кодирования, при этом, СК может, как ее увеличивать, так и уменьшать.

На рис. 21 приведены результаты нескольких экспериментов в виде десятичного логарифма величины изменения интенсивности транскрипции от контроля. Наибольшее влияние СК оказывала на интенсивность транскрипции митохондриальных генов nad6, nad9 и rps12. Интересно отметить, что изменение интенсивности транскрипции генов субъединиц комплекса I ЭТЦ (nad3, nad6, nad9) происходит прямо противоположно: если для nad3 и nad6 она подавляется, причем в случае nad6 практически в 2 раза, то интенсивность транскрипции nad усиливается в 2 раза. На культуре клеток A. thaliana также показана разнонаправленная регуляция генов, кодирующих субъединицы этого комплекса при обработке перекисью водорода и актиномицином А (ингибитором комплекса III) (Sweetlove et al., 2002). По-видимому, регуляция экспрессии генов данного комплекса носит сложный характер. Для выявления механизма и физиологического смысла такой регуляции необходимы дополнительные исследования.

Интенсивность транскрипции двух пластидных генов atpE и rrn16, уменьшалась более чем в 2 раза под воздействием СК.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

Рис. 21. Эффект 1 мМ СК на интенсивность транскрипции генов митохондриального кодирования. Значения приведены в виде десятичного логарифма изменения скорости транскрипции относительно контроля (lg X). K IV и K I – гены субъединиц четвертого и первого комплексов ЭТЦ соответственно. БСС – гены белок-синтезирующей системы митохондрий, hlp - хлоропластные гены.

Бары отражают стандартные отклонения при трех независимых повторах эксперимента.

При оценке интенсивности транскрипции пластидных генов достоверным считается изменение только в том случае, если интенсивность изменялась в два и более раз по сравнению с интенсивностью транскрипции в контроле. Десятичный логарифм от 2 (т.е. изменение в два раза) равен 0.3 (Зубо, Кузнецов, 2008).

Изменение интенсивности транскрипции может свидетельствовать об изменении экспрессии генов, что, в конечном итоге, приводит к изменениям в содержании соответствующих белков. Однако анализ литературы показал, что изменение интенсивности транскрипции митохондриальных генов в течение циркадного цикла не приводит к изменениям содержания мРНК соответствующих генов, а в случае необходимости может служить для обеспечения достаточного уровня мРНК. (Okada, Brennicke, 2006). Поэтому нельзя утверждать, что изменения интенсивности транскрипции в ответ на действие 1 мМ СК действительно влекут за собой изменения на уровне количества мРНК и соответствующих белков.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

Таким образом, исследования показали разнонаправленное изменение транскрипции генов митохондриального кодирования, в том числе компонентов цитохромного пути переноса электронов, под действием СК. Впервые эффект СК на транскрипцию показан с применением метода run-on транскрипции, исследованиях другими методами.

митохондриальных генов.

интенсивности транскрипции митохондриальных генов при действии 6-БАП, изучаемого в данной работе. Напомню, что согласно собственным данным по изменению скорости дыхания в системе in vivo – на изолированных семядолях, цитокинин активирует цитохромный путь дыхания, в то время как максимальная скорость альтернативного окисления остается практически неизменной. Можно предположить изменение транскрипции генов, кодирующих компоненты основного цитохромного ЭТП. И действительно такие изменения имели место, однако вопреки ожидаемому, 6-БАП уменьшал интенсивность транскрипции практически всех проанализированных генов, за исключением rps12, интенсивность транскрипции которого незначительно увеличивалась (рис. 22). По результатам нескольких экспериментов было показано, что 6-БАП оказывает наибольшее подавляющее действие на транскрипцию гена atp9, кодирующего субъединицу АТФ-синтазы. Кроме того, гормон уменьшает интенсивность транскрипции более чем в 2 раза генов cox1 и cox3 (комплекс IV); ccmB (связанный с биосинтезом цитохромом с); nad6 (комплекс I); rps13, rrn26 и trnI (белоксинтезирующая система митохондрий); atpE и rrn16 (пластидные гены).

транскрипции генов митохондриального кодирования растений не только под влиянием гормонов. Это не дает возможности сопоставить результаты, полученные в ходе данной исследовательской работы с ранее опубликованными данными.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

Рис. 22. Эффект 22 мкМ 6-БАП на интенсивность транскрипции генов митохондриального кодирования. Значения приведены в виде десятичного логарифма изменения скорости транскрипции относительно контроля (lg X). K IV и K I – гены субъединиц четвертого и первого комплексов ЭТЦ, соответственно.

БСС – гены белок-синтезирующей системы митохондрий, hlp - хлоропластные гены. Бары отражают стандартные отклонения при трех независимых повторах эксперимента.

Подавление интенсивности транскрипции при действии 6-БАП на фоне активации цитохромного пути дыхания можно объяснить увеличением времени полураспада мРНК соответствующих генов. Накопление матриц, вероятно, приводит к подавлению нового синтеза данных мРНК. Кроме того, увеличение скорости дыхания по цитохромному пути при воздействии цитокинина, возможно, является результатом увеличения ферментативной активности комплексов ЭТЦ, а также результатом формирования суперкомплексов, существование которых показано (Dudkina et al., 2006). Не исключена возможность, что при 12-часовом воздействии гормона удалось уловить кратковременный и долговременный эффекты, которые являются прямо противоположными. При этом кратковременным эффектом является активация гормоном цитохромного пути окисления, вероятно связанной с активацией метаболизма, в то время как в клетке начинают развиваться процессы (подавление транскрипции генов компонентов

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

цитохромного пути), предшествующие реализации долговременного эффекта, а именно гибели клеток. На культуре клеток A. thaliana (Carimi et al., 2004) и M. truncatula (Zottini et al., 2006) показано, что длительное культивирование (от часов и более) в среде, содержащей 27 мкМ 6-БАП, вызывает гибель клеток.

Известно, что при программируемой клеточной смерти, наряду со многими изменениями на молекулярном уровне, происходит высвобождение цитохрома с из митохондрий в цитоплазму и активация альтернативного дыхания (Sun et al., 1999), следствием чего является изменение интенсивности цитохромного дыхания.

Однако на сегодняшний день экспериментальных данных, имеющихся в литературе, недостаточно для объяснения результатов, представленных в данной работе.

4.3. Влияние 6-БАП и СК на альтернативный путь переноса электронов у Lupinus luteus.

Альтернативная оксидаза является основным компонентом альтернативного пути переноса электронов, которая катализирует поглощение кислорода, нечувствительное к цианиду. АО является главной характеристикой при изучении эффекта фитогормонов на функционирование митохондрий при анализе цианидрезистентного пути окисления.

4.3.1. Идентификация генов АО у Lupinus luteus.

В клетках растений АО кодируется небольшим, но весьма вариабельным семейством ядерных генов. На сегодняшний день установлена последовательность кДНК АО у A. thaliana (Considine et al., 2002) G. max (Finnegan et al., 1997), Mangifera indica (Cruz-Hernmdez et al., 1995) и др. Исследования ряда авторов, проведённые с использованием вестерн-блоттинга, демонстрируют тканеспецифическую дифференциальную экспрессию генов АО (Finnegan et al., 1997).

Геном люпина жёлтого не секвенирован, поэтому нет точных данных о нуклеотидной последовательности АО, и соответствующего белка у Lupinus luteus.

В задачи данного исследования входило выявить изоформы АО в клетках люпина

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

жёлтого и изучить возможное влияние фитогормонов СК и 6-БАП на экспрессию генов АО.

Для идентификации генов АО в геноме люпина жёлтого с помощью анализа методом ПЦР на первом этапе исследования были подобраны пары генспецифичных праймеров к уже идентифицированным растительным генам АО.

Подбор праймеров осуществляли, основываясь на последовательностях АО представителя семейства Fabaceae G. max, наиболее близкого к L. luteus, а также на последовательностях генов АО A. thaliana. У G. max идентифицированы кДНК, по крайней мере, для трех генов АО: GmАох1 (X68702), GmАох2а (U87906) и GmАох2b (U87907). У A. thaliana выявлено 5 генов АО (D89875, NM_113135, D89875, NM_113134, AB003175, AB003175, NM_113678, NM_102968, AB003176,NM_12581,AB003176, NM_125817). Праймеры подбирали для синтеза каждого отдельного гена АО: пара праймеров Аох1-s,-as амплифицирует ген(ы), принадлежащие к первому подсемейству – Аох1, а пары праймеров Аох2a-s,-as и Аох2b-s,-as амплифицируют гены, предположительно второго подсемейства, – Аох2а и Аох2b, соответственно. Информация о нуклеотидной последовательности праймеров и размерах фрагментов, полученных после амплификации, приведена в табл. 2 (см. главу 3.5.2.).

На рис. 23А-В дорожки 1 и 2 представлены результаты ПЦР-анализа, где в качестве матрицы использовали ДНК и кДНК L. luteus, демонстрирующие отсутствие синтеза ДНК или синтез фрагмента, размер которого не соответствует ожидаемому результату. Однако при использовании в качестве матрицы ДНК и кДНК G. max во всех случаях наблюдали синтез фрагмента ожидаемого размера 120 п.н. (рис. 23А-В, дорожки 3 и 4). Таким образом, полученные результаты еще раз подтверждают высокую вариабельность нуклеотидной последовательности генов АО, которая также отмечается в литературе.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

Рис. 23. Результаты электрофореза продуктов ПЦР с ген-специфичными праймерами к генам АО. А. – ПЦР с праймерами к Аох1; Б. – ПЦР с праймерами к Аох2а; В. – ПЦР с праймерами к Аох2b. М – маркер молекулярной массы; 1 - в качестве матрицы использовали ДНК L. luteus; 2 - в качестве матрицы использовали с кДНК L. luteus; 3 - в качестве матрицы использовали ДНК G. max; 4 - в качестве матрицы использовали кДНК G. max; К - отрицательный контроль.

Использование стандартной методики подбора праймеров для идентификации генов АО не является возможным в данном случае из-за возможной не специфической реакции подобранных праймеров. Поэтому следующим шагом в данном исследовании был подбор вырожденных праймеров, которые позволяют идентифицировать несколько генов, относящихся к одному семейству (рис. 24).

ПЦР-анализ осуществляли путем постепенного снижения температуры отжига праймеров от 68°С до 54°С с шагом в 2 градуса с последующим синтезом ДНК в течениив течение 30 циклов при температуре отжига 54°С. На рис. представлены результаты ПЦР-анализа. Был получен фрагмент ожидаемой длины около 180 п.н. (рис. 25, дорожка 1). Подтверждением того, что данный фрагмент вероятнее всего является частичной последовательностью генов АО, служило то, что проведении ПЦР с использованием в качестве матрицы кДНК G. max был также получен фрагмент ожидаемого размера (рис. 25, дорожка 4).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ