РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

ТОМСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ КАРДИОЛОГИИ

На правах рукописи

Нарыжная

Наталья Владимировна

РЕЦЕПТОР-ОПОСРЕДОВАННЫЕ МЕХАНИЗМЫ

ВЛИЯНИЯ ОПИОИДНОЙ СИСТЕМЫ НА УСТОЙЧИВОСТЬ СЕРДЦА

К СТРЕССОРНЫМ ПОВРЕЖДЕНИЯМ

14.00.16 - патологическая физиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научный руководитель:

член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Ю.Б. Лишманов

Научный консультант:

доктор медицинских наук Л.Н. Маслов ТОМСК -

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

% об. - объемные проценты 99m Тс-ПФ - 99mТс-пирофосфат АКТГ - адренокортикотропный гормон АТФ - аденозинтрифосфорная кислота ГАМК - гамма-аминомаслянная кислота ГОМК - гамма-окимаслянная кислота ГЭБ - гематоэнцефалический барьер ДК - диеновые коньюгаты ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота КА - катехоламины МДА - малоновый диальдегид ОИМ - острый инфаркт миокарда ОП - опиоидные пептиды ОР - опиатные рецепторы ПОЛ - перекисное окисление липидов ПФЖ - порог фибрилляции желудочков ПЦ - простациклин РИА - радиоиммунный анализ РНК - рибонуклеиновая кислота САС - симпато-адреналовая система СЛС - стресс-лимитируюшая система СПР - саркоплазматический ретикулум СПС - стрессорное повреждение сердца ТХУ - трихлоруксусная кислота ТХ - тромбоксан В усл. ед. - условные единицы цАМФ - циклический аденозин монофосфат цГМФ - циклический гуанозин монофосфат ЦНС - центральная нервная система i.с.v. - интрацеребровентрикулярное введение СРМ - count per minute - количество импульсов в минуту

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..............................

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Система опиоидных нейропептидов и регуляция устойчивости миокарда к стрессорным повреждениям............ Влияние лигандов опиатных рецепторов на звенья симпатической нервной системы и ее роль в развитии стресс-реакции и повреждении миокарда.......... Влияние опиоидов на уровень минерал- и глюкокортикоидов при стрессе..................... Вклад метаболитов арахидоновой кислоты в патогенез стрессорных повреждений миокарда и их взаимодействие с лигандами ОР........

............... Понятие об адаптационной защите сердца и стресс-лимитирующих системах..................... ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ......... 2.1. Препараты и животные................ 2.2. Экспериментальная модель стресса....... 2.3. Модель изадринового некроза.......... 2.4. Методы оценки повреждений сердца....... 2.4.1. Методика оценки повреждений сердца по аккумуляции 99m Тс-пирофосфата в ткани миокарда. 2.4.2. Методика определения порога желудочковой фибрилляции..................... 2.5. Метод интрацеребровентрикулярного введения препаратов..

2.6.1. Определение общей интенсивности биосинтеза белка....

2.8. Гистохимическое определение катехоламинов в ткани 2.9. Методы статистической обработки результатов.............

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

воздействию стресса........

3.1.1. Влияние лигандов опиатных рецепторов и блокаторов кардиомиоцитах при иммобилизационном стрессе............

3.1.2. Опиатергическая модуляция стресс-индуцированного снижения порога желудочковой фибрилляции...............

3.2. Опиатные рецепторы и адреналовый компенент стрессорного предварительного введения лигандов опиатных рецепторов....

3.2.2. Роль периферического звена симпатической нервной системы в опосредовании мю-опиатергических влияний на устойчивость сердца к стрессорному повреждению...........

3.3. Роль системы эйкозаноидов в реализации опиатергических влияний на устойчивость миокарда к стресс-индуцированным 3.3.1. Роль простаноидов в механизмах опиоидной защиты 3.3.1.1. Изменение уровня простагландинов в плазме крови и миокарде стрессированных крыс на фоне предварительного 3.3.2. Изменение содержания продуктов ПОЛ в плазме крови и миокарде стрессированных крыс при введении лигандов 3.4. Взаимосвязь кардиотропного действия опиоидов с процессами 3.4.2. Влияние блокатора биосинтеза белка циклогексимида на кардиопротекторные свойства агониста µ-опиатных рецепторов

ВВЕДЕНИЕ

индуцированных повреждений миокарда в экстремальных ситуациях приобретает особую актуальность для современного индустриального общества с его урбанизацией, усложнением профессиональной деятельности человека, ускорением темпов жизни и возросшими психоэмоциональными нагрузками.

Согласно концепции Г.Селье, получившей развитие в нашей стране благодаря работам Ф.З.Меерсона, стресс-реакция, которая сформировалась в ходе эволюции как необходимое звено индивидуальной адаптации организма, в случае черезмерно интенсивных или неадекватно длительных воздействий может сама по себе явиться источником тканевых и органных повреждений [76,100,241,242,245]. Кроме того, в литературе все чаще встречаются сообщения о фатальных нарушениях желудочкового ритма и случаях сердечной смерти у лиц, не имевших “коронарного” анамнеза, но переживших тяжелый стресс или длительное психо-эмоциональное напряжение [199]. Однако единого мнения по вопросу патогенетически обоснованной профилактики стрессорных нарушений электрической стабильности сердца и стресс-индуцированных повреждений его мембран до настоящего времени не существует.

В последнее время активно обсуждается положение, согласно которому одним из наиболее оптимальных и физиологичных путей повышения резистентности сердца к экстремальным воздействиям является, так называемая, адаптационная защита сердца [75,76,77,78,79]. Суть ее сводится к профилактике или ослаблению различных по этиопатогенезу повреждений сердечно-сосудистой системы с помощью стимуляции механизмов естественной неспецифической резистентности организма или фармакологической имитации приспособительных процессов.

Профессор Ф.З.Меерсон предположил, что в основе данного феномена может лежать активация эндогенных стресс-лимитирующих систем (СЛС), к которым он относит серотонинергическую, ГАМК-ергическую системы, простаноиды, антиоксиданты и опиоидные пептиды [74,75,77,79,82,84,85, 86,96,98].

Активные исследования опиоидов, предпринятые в 80-90-х годах, показали их высокую стресс-лимитирующую [40,52,53], кардиопротекторную [35,36,50,69,198] и антиаритмическую [44,46,47,49,56,64,66,67,68] активность. В ряде работ показано, что энкефалины и эндорфины могут модулировать синтез и секрецию ряда гормонов, традиционно считающихся "стрессовыми" [7,36,40,146,155,159,184,225]. Публикации последних лет позволяют говорить о тесном взаимодействии опиоидных пептидов с вегетативной нервной системой [12,13,142,143,158,233,261], роль которой в стрессорном повреждении сердца общеизвестна.

Таким образом, в настоящее время не вызывает сомнения, что опиоидные пептиды играют важную роль в регуляции устойчивости сердца к повреждающему действию стресса.

Вместе с тем, остается открытым вопрос о типах и локализации рецепторов, отвечающих за кардиопротекторные эффекты опиоидов.

Единство взглядов отсутствует и в отношении физиологических механизмов, опосредующих эффект активации тех или иных субпопуляций опиатных рецепторов. Данные литературы позволяют рассматривать в качестве таких механизмов реакцию других известных стресс-лимитирующих систем организма, в частности - простаноидов [51,54,240], антиоксидантов [82,88], ГАМКергической системы [223,234] и др., а также опиатергическое ингибирование стресс-реализующих систем (в частности - супрессия неадекватного выброса катехоламинов) [12,13,15,142,143,158,233,261].

Изучению вышеизложенных проблем и посвящена данная работа.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ:

влияния опиоидной системы на устойчивость миокарда к стрессорным повреждениям.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Изучить роль различных типов опиатных рецепторов в регуляции естественной устойчивости сердца к стресс-индуцированным повреждениям.

2. Оценить роль вегетативной нервной системы в реализации опиатергических влияний на устойчивость миокарда к повреждениям сердца при стрессе.

3. Исследовать вклад продуктов метаболизма арахидоновой кислоты (простаноидов и продуктов перекисного окисления липидов) в реализацию кардиопротекторного или “кардиопато-генного” влияния лигандов ОР при стрессе.

4. Сопоставить кардиопротекторные эффекты лигандов опиатных рецепторов с их влиянием на процессы биосинтеза белка в миокарде.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Основным опиатергическим механизмом повышения устойчивости сердца к стресс-индуцированному повреждению является активация периферических морфиноподобных рецепторов (µ-ОР).

2. Возбуждение центральных потенцирует стрессорное повреждение мембран кардиомиоцитов и наблюдаемое при этом снижение электрической стабильности миокарда.

3. Рецептор-опосредованное влияние опиоидной системы на резистентность сердца к повреждающему действию стресса реализуется через модуляцию симпатической активности, воздействие на метаболизм арахидоновой кислоты и ускорение биосинтеза белка в кардиомиоцитах.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.

рецептор-опосредованных механизмах влияния опиоидной системы на устойчивость сердца к стрессорным повреждениям.

Абсолютно новыми можно считать данные о неоднозначной роли различных типов опиатных рецепторов и их эндогенных агонистов в предупреждении или, наоборот, потенцировании альтерации мембран кардиомиоцитов. Так, активация периферических µ-опиатных рецепторов приводит к повышению устойчивости сердца к стрессорным повреждениям, а фармакологическое “выключение” этого типа рецепторов на периферии, соответственно, потенцирует повреждение миокарда в аналогичных условиях. Стимуляция центральных µ-ОР, наоборот, способствует усилению "стрессорной кардиомиопатии", а их блокада предупреждает повреждение сердца крыс при последующем стрессировании. Рецепторы, - и -типов, согласно полученным результатам, не имеют существенного значения в регуляции изучаемых процессов.

Оригинальным является и сам комплексный подход к экспериментальному изучению рецепторных звеньев опиоидной системы, включающий в себя системное и интрацеребровентрикулярное введение синтетических агонистов, селективную блокаду различных типов ОР и увеличение содержания эндогенных ОП с помощью ингибиторов энкефалиназ.

Прямые доказательства ведущей роли симпато-адреналовой системы в патогенезе стресс-индуцированных повреждений сердца, также как и участие эндогенных катехоламинов в реализации опиатергических воздействий на миокард, не имеют литературных аналогов.

Новизну представляют результаты, прямо показывающие участие простагландинов в формировании стрессорного повреждения кардиомиоцитов и доказательство их роли в кардиопротекторном эффекте активации периферических µ-ОР. Впервые получены аргументы в пользу способности лигандов µ-ОР модулировать интенсивность биосинтеза миокардиального белка при иммобилизационном стрессе, что существенно отражается на резистентности мембран кардиомиоцитов к повреждению при экстремальных воздействиях.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

диссертационного исследования факты развивают и обогащают существующие представления о механизмах повреждения миокарда в стрессовых ситуациях и роли опиоидной системы в регуляции неспецифической устойчивости сердца к действию чрезвычайных факторов. Результаты работы могут быть использованы при создании перспективных кардиопротекторов опиатергического типа действия.

Результаты исследования используются при чтении лекций и проведении семинарских занятий на кафедре биохимии МБФ СибирскогоГосударственного Медицинского Университета и кафедре физиологии Томского Государственного Университета.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

обсуждались на отчетной научной сессии "Актуальные проблемы кардиологии" (Томск, 4-6 октября 1994 г.); научной конференции, посвященной 15-летию НИИ кардиологии "Современные проблемы кардиологии" (Томск, 15 июня 1995); II Съезде физиологов Сибири и Дальнего Востока (г. Новосибирск, 14-17 июня г.), II Конгрессе кардиологов Центральной Азии (г. Алматы, сентябрь 1995 г.); I Росийском Конгрессе по патофизиологии “Патофизиология органов и систем.

Типовые патологические процессы (Экспериментальные и клинические аспекты)” (Москва, 17-19 октября 1996 г.); VII Всероссийскм симпозиуме “Коррекция гомеостаза” (17-22 марта 1996 г.); научной конференции памяти В.А.Пегеля (г.

Томск, декабрь 1996 г.); конференции “Актуальные проблемы кардиологии”, (г.

Томск, сентябрь 1997 г.).

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ, из них 5 - статьи в центральных журналах, 9 - тезисы в материалах отечественных и 2 зарубежных конференций.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ.

машинописного текста и состоит из введения, трех глав, заключения, выводов и Библиографический указатель включает 279 источников, из них 123 отечественных и 156 иностранных.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

СИСТЕМА ОПИОИДНЫХ НЕЙРОПЕПТИДОВ И РЕГУЛЯЦИЯ

УСТОЙЧИВОСТИ МИОКАРДА К СТРЕССОРНЫМ ПОВРЕЖДЕНИЯМ

Точка зрения о важной роли стресса в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний далеко не нова. Еще 150 лет назад Corvisart считал, что все сердечные заболевания возникают в результате двух основных причин: “от работы органа и от сформировавшаяся в ходе эволюционного процесса как необходимое звено индивидуальной адаптации организма, при черезмерно интенсивных или неадекватно длительных воздействиях сама может явиться источником органных и системных нарушений [76] от язвенной болезни желудка до стрессорных и ишемических поражений миокарда. Так, в 1958 г. Russek K. и соавт. показали, что длительный стресс предшествовал развитию сердечного приступа у больных ишемией в 91% случаев [цитировано по 33]. Исследования Kruhn и его коллег (1970) подтверждали предполагаемую зависимость между эмоциональным статусом, физиологическим состоянием и возникновением ишемической болезни сердца. В последующем появился ряд работ, связывающих эмоциональное и умственное [33,106,109,113,116].

Понятие о стрессорном повреждении сердца как нозологическом феномене было впервые предложено в конце 50-х годов Г.Селье, который наблюдал у крыс, перенесших иммобилизационный стресс, транзиторные гистологические изменения, проявляющиеся “появлением очагов фуксинофилии” [241]. В экспериментах на обезьянах Ю.М. Репин и В.Г. Старцева обнаружили в нескольких случаях появление отрицательного зубца Т на ЭКГ и повышение активности трансаминаз в крови при реализации пассивно-оборонительной реакции [цитировано по 74]. Bernard Lown в своих работах развил теорию Селье и неопровержимо доказал, что эпизоды острого эмоционального напряжения часто приводят к значительным изменениям электрической стабильности сердца, снижению порога желудочковой фибрилляции и могут спровоцировать внезапную остановку сердца [199]. Эти данные были подтверждены рядом исследователей [144,181,202,265] Однако, несмотря на большой интерес исследователей к проблеме стрессорного повреждения, исчерпывающего ответа на вопрос о патогенезе СПС не было дано.

Еще в 1969 г. Селье высказал предположение о мультифакториальном характере формирования СПС [245]. В работе В.В.Малышева и соавт. [62] было установлено, что многие вещества - модуляторы различных функциональных систем организма - (пропранолол, ионол, гамма-оксимаслянная кислота) способны в значительной мере предупреждать стрессорное повреждение сердца. Однако ни одно из этих веществ не устраняло СПС полностью, поэтому следует согласиться с мнением H.Selye о "плюрикаузальной" (многофакторной) природе стрессорной кардимиопатии [245].

Первые исследователи использовали морфологические методы выявления повреждений, которые являются довольно наглядными, но не позволяют количественно оценить степень СПС [229,242]. В 1977 году была опубликована работа Miller & Malov, в которой авторы предложили радиоизотопный метод количественной оценки диффузных повреждений миокарда, использующийся по сей день в экспериментальных исследованиях [210]. Данный метод позволяет не только выявить повреждения кардиомиоцитов при стрессе, но и успешно тестировать препараты на предмет их кардиопротекторной активности.

В настоящий момент наиболее аргументированной нам представляется концепция о том, что патогенез стрессорного повреждения складывается из нескольких звеньев:

1. Гиперактивация стресс-реализующих систем и прежде всего симпатикоадреналовой системы [76,229,244].

2. Подавление или несостоятельность стресс-лимитирующих систем, в том числе - эндогенной опиоидной системы [18,41,43,75,77].

3. Запуск мембранных и внутриклеточных механизмов стресса - изменение соотношения циклических мононуклеотидов в клетках миокарда; нарушение работы ионных каналов клеток сердца и, как следствие, сдвиг мембранных потенциалов [89,120,121,269]; запуск “липидной триады” и активация перекисного окисления липидов (ПОЛ) в мембранах кардиомиоцитов [30,77,82,145];

изменение соотношения продуктов метаболизма арахидоновой кислоты [30,97,118]; сдвиг внутриклеточного метаболизма кардиомиоцитов в сторону преобладания процессов распада белков и нуклеиновых кислот над их ресинтезом [76,78,83,122].

Мы далеки от мысли, что вышеизложенный перечень патофизиологических факторов, участвующих в формировании СПС, является полным, так как этот список постоянно пополняется.

Поскольку страх и боль зачастую сами по себе являются стресс-факторами, обезболивающий и седативный эффект опиатов был причиной интереса к этим препаратам как к потенциально антистрессорным. Уже в ранних сообщениях по проблеме опиоидных нейропептидов отмечено увеличение уровня опиоидов в плазме крови, центральной нервной системе и спинно-мозговой жидкости при стрессе [10,11,102,193]. Позднее данные об активации опиоидной системы при стрессе были неоднократно подтверждены [28,41,105]. Однако, физиологическая роль такого изменения активности опиоидной системы при стрессе долгое время оставалась неясной.

В экспериментальных исследованиях удалось выяснить, что даларгин, смешанный агонист µ и -опиатных рецепторов, заметно подавлял гипертрофию надпочечников у стрессированных крыс [52]. Уменьшилось число образующихся язвенных поражений слизистой желудка, что указывало на наличие у даларгина стресс-лимитирующих свойств [36]. Наиболее интересными, на наш взгляд, явились эксперименты, в которых было показана способность даларгина снижать аккумуляцию Тс-пирофосфата в миокарде крыс при стрессе [35,69]. Этот эффект предупреждался налоксоном. Вышеизложенные факты внесли ясность в вопрос о физиологической роли опиоидов при стрессе и убедительно доказали несомненное участие данной системы в предупреждении стрессорной патологии миокарда. Однако, оставались невыясненными рецепторные и патофизиологические механизмы опиатергической защиты сердца.

На наш взгляд, влияние опиоидной системы на процессы стрессорного повреждения сердца может опосредоваться различными путями:

вегетативной нервной системы и снижение кардиотоксического влияния катехоламинов на миокард.

2. Изменение уровня стресс-гормонов.

3. Изменение соотношения продуктов метаболизма арахидоновой кислоты (простаноидов и липоперекисей).

(цАМФ/цГМФ) в миокарде.

5. Предупреждение стресс-индуцированного снижения биосинтеза белка и Ниже мы попытаемся подробнее изложить имеющиеся в литературе данные о патогенезе стрессорного повреждения миокарда и влиянии опиоидной ситсемы на различные патогенетические звенья этого процесса.

ВЛИЯНИЕ ЛИГАНДОВ ОПИАТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ НА ЗВЕНЬЯ

СИМПАТИЧЕСКОЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ И ЕЕ РОЛЬ В РАЗВИТИИ

СТРЕСС-РЕАКЦИИ И ПОВРЕЖДЕНИИ МИОКАРДА

катехоламинов в патогенезе стрессорных повреждений.

Работами [145,167,169,181] было показано, что при введении больших Waldenstrom и соавт. (1978)[цитировано по 76] установили, выражающееся в снижении уровня АТФ и появлении в перфузате снижение содержания катехоламинов в миокарде, надпочечниках и структурах головного мозга [28,31,59], обусловленное тем, что во время стресса выход катехоламинов из депо в кровоток подтверждается и тем фактом, что блокатор -адренорецепторов желудочков, сниженный в результате стрессорного воздействия существует множество данных, косвенно указывающих на то, что миокарда при действии экстремальных факторов [76].

[252]. Увеличение интенсивности и длительности этого эффекта стимулируют гликолиз, а также ингибируют ресинтез гликогена процессы обновления липидного бислоя мембран кардиомиоцитов, активности Са2+-АТФ-азы и увеличению проницаемости для Са2+ саркоплазме кардиомиоцитов при этом нарастает избыток Са2+, процессов, составляющих липидную триаду и, таким образом, замыкать порочный круг, усугубляющий повреждение миокарда.

Во-вторых, избыток Са2+ обладает самостоятельным повреждающим активации фосфолипаз и особенно протеаз, разрушающих диски ограничивается патологическими процессами в саркоплазме свободно-радикальные продукты ПОЛ могут вызывать повреждение ДНК клеточных ядер [83].

Клинически весь комплекс названных изменений проявляется сердечного выброса, снижением резистентности сердечной мышцы к гипоксии и нарушениями ритма сердца [76].

повреждений оказывается обратимым - система антиоксидантов активации репаративных процессов компенсируются последствия ДНК-повреждений [83]. Однако, морфологические исследования контрактурные изменения с последующим переходом в некробиоз и очаговый кардиосклероз [229].

Столь подробное описание процессов, происходящих в кардиомиоцитах при их стрессорном повреждении, мы позволили себе с целью продемонстрировать в дальнейшем, что лиганды опиатных рецепторов способны влиять на различные звенья механизма альтерации клеток сердца и, тем самым, ослаблять их патологическое значение.

В первую очередь необходимо указать на то, что опиоиды влияют на периферическое звено САС, подавляя секрецию норадреналина из периферических нервных окончаний [142,143,161]. Подтверждением данным исследованиям служат работы Лишманова Ю.Б. и соавт. [35,41] показавшие, что агонист µ- и -ОР даларгин способен снижать стресс-индуцированное выделение КА с мочой, что трактуется авторами как антиадренергическое действие пептида. Однако, в работах Van Loon [174,175,191,203,261,262]. показано, что при центральном введении агонисты ОР оказывают стимулирующее действие на САС: вызывают тахикардию, увеличение артериального давления и уровня катехоламинов в плазме крови. Аналогичные результаты были получены рядом других авторов [140,219,250]. С другой стороны, показано, что морфин способен рецепторопосредованно снижать спонтанную активность нейронов locus coeruleus - ядра, содержащего как тела большинства адренергических нейронов головного мозга, так и энкефалинергические нейроны [188], что предполагает тормозное влияние этого опиата на активность симпатической нервной системы. Как можно видеть, данные о влиянии опиоидов на САС зачастую противоречивы. Отчасти это происходит вследствии того, что авторами не исследуется рецепторная специфичность используемого лиганда и не учитывается локализация опиатных рецепторов.

Последнее обстоятельство является важным, поскольку эффекты активации ОР в Немаловажным является то, что до настоящего времени не получено прямого доказательства тому, что кардиопротекторные эффекты опиатов при стрессе опосредуются через изменение активности САС.

Не менее важной точкой приложения действия опиоидов при экстремальных воздействиях является их влияние на соотношение цАМФ/цГМФ в миокарде. Как известно, высокий уровень цАМФ является одним из факторов, способствующих развитию повреждений кардиомиоцитов и возникновению желудочковой 185,186,204], убедительно свидетельствуют о существовании тесных корреляций между эффектами опиоидных пептидов и уровнем циклических нуклеотидов в клетках миокарда. Так, например, показано, что внутривенная инъекция даларгина вызывала достоверное ослабление индуцированного острым инфарктом миокарда подъема уровня цАМФ в сердечной мышце, что косвенно указывает на снижение симпатического влияния на миокард при одновременном повышении тонуса парасимпатического отдела вегетативной нервной системы [260]. На содержание цГМФ даларгин действовал противоположным образом [65].

циклонуклеотидов может быть прямым следствием модуляции активности симпатоадреналовой системы. Однако, ряд фактов указывают на то, что в механизм действия энкефалинов на характер адренергических процессов при стрессе включается и ограничение кардиотропного действия катехоламинов на уровне эффектора. Так, показано, что предварительная инъекция даларгина достоверно уменьшает аккумуляцию 99mTc-пирофосфата в миокарде крыс не только при стрессе, но и после введения изадрина [41]. Авторы предполагают, что кардиопротекторный эффект даларгина при изадриновом некрозе, по-видимому, был связан с ограничением синтеза цАМФ - основного внутриклеточного мессенджера действия изадрина на сердце, так как после введения изопротеренола уровень цАМФ в миокарде крыс, получавших даларгин, был в 2 раза ниже, чем в группе изадрин-контроль. В другой работе Xiao R.-P. и соавт. на модели изолированных кардиомиоцитов показали антагонизм катехоламинов и ОП на уровне аденилатциклазы in vitro, опосредуемый через G-белки [275,276].

Таким образом, можно с достаточной долей уверенности считать, что пептидергическое уменьшение уровня цАМФ, подъем концентрации цГМФ и снижение коэффициента цАМФ/цГМФ в миокарде способствуют своеобразной десенситизации миокардиоцитов к адренергическим воздействиям, повышая тем самым толерантность сердца к адреналовым, стрессорным и, вероятно, ишемическим повреждениям, имеющим тесные патогенетические взаимосвязи.

ВЛИЯНИЕ ОПИОИДОВ НА УРОВЕНЬ МИНЕРАЛ- И ГЛЮКОКОРТИКОИДОВ

ПРИ СТРЕССЕ

подтверждающих, что в основе повреждающего действия стресс-реакции лежит кардиотоксический эффект катехоламинов [76]. Между тем, нельзя полностью отрицать и другие механизмы возникновения стресс-индуцированных повреждений.

минералкортикоиды. Так, Г.Селье наблюдал у 80% животных, получавших сочетанный курс минерал- и глюкокортикоидов развитие кардиомиопатии и сердечной недостаточности [243]. Этим же автором показано, что диффузный тип кардиолизис”, с большой вероятностью может возникать при комбинации норадреналина и кортикоидов [244]. На основании этих данных можно предположить, что минерал- и глюкокортикоиды могут играть важную роль в формировании повреждения сердца при стрессе, так как их наибольший альтеративный эффект проявляется при наличии высокой концентрации катехоламинов, имеющей место в условиях стресса.

Поскольку активация системы эндогенных нейропептидов при стрессе является, по-видимому, частью общей реакции организм на чрезвычайные воздействия, не является неожиданность параллелизм реакции АКТГ и эндорфинов при стрессе [94,133,164,171,168,235,266], сопряженность изменений содержания опиоидных олигопептидов и катехоламинов в хромаффинной ткани эмоциогенных зонах [10,128], в отделах ЦНС, ответственных за регуляцию боли [192,251] и эндокринных функций [179,231], в железах внутренней секреции, то есть в структурах, имеющих приоритет в формировании стресс-реакции.

Однако, среди исследователей нет единства в оценке характера влияний опиоидов на функции гипофиз-адреналовой системы. Так, одни авторы отмечают опиатергическую стимуляцию синтеза кортикостероидов [140], другие - снижение секреции надпочечниковых гормонов [7,24,154,226,233,258] или отсутствие заметных изменений при повышении уровня лигандов опиатных рецепторов [91].

соматотропного гормона и пролактина [104,151,194], играющих важную роль в реакциях стресса и экстренной адаптации.

В экспериментальных исследованиях показано, что введение экзогенного иммунореактивного альдостерона в крови крыс [40,41,52,55]. Подобные изменения являлись, несомненно, проявлениями стресс-лимитирующего действия опиоидных пептидов. Небезынтересны клинические данные, полученные проф.

Ю.Б.Лишмановым. Этим исследователем, на примере инфаркта миокарда и психогенной депрессии, было показаны параллельные изменения у пациентов содержания -эндорфина и альдостерона [53].

Таким образом, вовлечение эндогенных опиоидов в реакцию экстренной адаптации несомненно. Однако вопрос о функциональной роли опиоидной системы при экстремальных состояниях в настоящее время является дискуссионным. Так, имеются сведения об улучшении состояния животных при шоке на фоне блокады опиатных рецепторов налоксоном [141,173], о снижении общей смертности после острой коронароокклюзии у крыс на фоне введения налоксона [200]; в других сообщениях, напротив, отмечено увеличение сроков выживания кроликов при инъекции в шоковом периоде аналога энкефалинов и уменьшение продолжительности жизни животных после введения налоксона [123].

Наиболее вероятным, по-видимому, является предположение о способности опиоидных пептидов уменьшать проявления “патологического” стресса [154]. В пользу этого свидетельствуют литературные данные, большая часть которых получена в последние годы. Так, показано, что опиаты ускоряют заживление экспериментального инфаркта миокарда [5], стимулируют репарацию повреждений других тканей [26] и обладают противоязвенным эффектом [240]. Имеются также работы о положительном влиянии энкефалинов на течение инфаркта миокарда у пациентов и экспериментальных животных, что выражается уменьшением степени метаболических нарушений [249].

ВКЛАД МЕТАБОЛИТОВ АРАХИДОНОВОЙ КИСЛОТЫ В ПАТОГЕНЕЗ

СТРЕССОРНЫХ ПОВРЕЖДЕНИЙ МИОКАРДА И ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С

ЛИГАНДАМИ ОР

Как было указано ранее, важнейшим следствием избытка внутриклеточного Са2+ и запуска так называемой липидной триады при стрессе является активация перекисного окисления липидов. Интенсификация ПОЛ при действии экстремальных факторов обусловлена, по большей части, повышенным выбросом катехоламинов, так как было показано усиление процессов пероксидации при введении экзогенного адреналина [30]. Катехоламины через цАМФ и кальмодулин активируют основные процессы обновления липидного бислоя мембран кардиомиоцитов, а именно липолиз, фосфолиполиз и перекисное окисление липидов [30,76], как это было описано выше. Активация ПОЛ при избытке катехоламинов может реализоваться и другими путями: во-первых, активные формы кислорода образуются на одном из этапов биосинтеза катехоламинов, во-вторых, при окислении адреналина в адренохром возникает семихинон адреналина, который может отдавать электрон кислороду, генерируя при этом супероксидный радикал важный индуктор ПОЛ.

На данный момент общепринятым является мнение о том, что происходящее при стрессе смещение баланса про- и антиоксидантых процессов в сторону образования продуктов ПОЛ [76,145,187,259] является неотъемлемой частью патогенеза повреждений миокарда. Так, например, показано, что активация перекисного окисления липидов, вызванная 24 часовой иммобилизацией у свиней сопровождалась повреждением ультраструктуры митохондрий и уменьшением митохондриальной АТФ [145]. По данным Ф.З. Меерсона, антиоксидант ионол оказывал кардиопротекторный эффект при стрессе, что не оставляет сомнений в том, что процессы ПОЛ являются важным звеном патогенеза СПС [76,81,82].

Вторым по значимости следствием липидной триады является усиленное образование эйкозаноидов, биосинтез которых лимитируется доступностью исходного субстрата - арахидоновой кислоты, а она, в свою очередь, активно освобождается под влиянием липаз и фосфолипаз. Метаболиты арахидоновой кислоты обратили на себя внимание тем, что их содержание в плазме изменяется при ишемической болезни сердца [3,206] и, прежде всего во время приступов стенокардии и при остром инфаркте миокарда [160,255,270]. Особый интерес вызвали тромбоксан А2 (с его метаболитом 6-кето-PgF2a) и простациклин (PgI2). При остром инфаркте миокарда увеличивается количество тромбоксана, обладающего вазоконстрикторными свойствами, активирующего агрегацию тромбоцитов и общепризнанного как медиатор повреждения кардиомиоцитов при ОИМ [160,255,270]. Простациклин, напротив, является вазодилататором и обладает кардиопротекторными свойствами [153]. Эти факты побудили исследователей к созданию антиишемических препаратов на основе энзиморезистентных аналогов простациклина и ингибиторов синтеза тромбоксана. Как оказалось, антагонисты тромбоксансинтетазы (CV-4151, дазмегрель) [178,150] способны защищать миокард от ишемических повреждений.

Простациклин, являющийся физиологическим антагонистом тромбоксана, и его стабильные аналоги (илопрост, BMY-42) оказывают кардиопротекторный эффект при ишемии миокарда [153] и способны предупреждать постишемическую устойчивость миокардиальных мембран [183]. Следует особо отметить тот факт, что простациклин и его производное 7-оксо-PgI2 могут предупреждать изадриновые предположить, что простациклин играет важную роль в защите миокарда при стрессе, ведь при введении адреналина мы, в какой-то мере, модулируем ситуацию, сходную со стрессовой. Однако данное предположение остается до сих пор лишь гипотезой, так как отсутствуют прямые доказательства кардиопротекторного действия простациклина при стрессе. Несмотря на многочисленные косвенные свидетельства возможной роли простаноидов в механизмах повреждения сердца, при стрессе они изучены недостаточно. Так, в литературе отсутствуют работы, убедительно доказывающие протекторное либо "кардиотоксическое" действие простаноидов или блокаторов их синтеза в условиях стресса. Полностью устойчивости миокарда к стрессу смогут лишь данные об эффектах блокаторов тех или иных звеньев синтеза компонентов системы арахидоновой кислоты. Принимая во внимание вышеприведенные факты, можно лишь предположить, что система простаноидов может играть значительную роль в процессах стрессорного повреждения миокарда, однако вопрос об их участии в механизме формирования повреждений при стрессе и/или защите миокарда от действия экстремальных факторов остается открытым. В связи с этим, значительная часть представленной работы посвящена изучению роли метаболитов арахидоновой кислоты в патогенезе стрессорного повреждения кардиомиоцитов.

В ряде проведенный ранее исследований были предприняты попытки связать кардиопротекторный эффект опиоидов и их влияние на образование и баланс продуктов метаболизма арахидоновой кислоты. Так, после инъекции даларгина было обнаружено значительное изменение соотношения простациклин/тромбоксан при стрессе [54,57], сопровождающееся уменьшением степени повреждения миокарда. Другими исследователями [240] было показано, что гастропротекторный эффект опиоидов блокировался ингибитором циклооксигеназы индометацином.

Эти факты позволили авторам предположить, что кардиопротекторное действие лигандов опиатных рецепторов может быть опосредовано через систему простаноидов. Однако, с полным правом утверждать, что эйкозаноиды опосредуют кардиотропные эффекты опиоидной системы лишь после экспериментов с блокаторами синтеза эйкозаноидов на фоне действия лигандов опиатных рецепторов. К сожалению, таких работ мы в литературе не встретили.

Кроме того, в исследованиях, проведенных ранее было показано, что агонист µ -опиатных и рецепторов даларгин предупреждает стресс-индуцированное увеличение образования продуктов перекисного окисления липидов и угнетение биосинтетических процессов в кардиомиоцитах [41,43,46,51,54]. Мы склонны расценивать эти данные, как дополнительный аргумент в пользу того, что опиоиды непосредственно принимают участие в патологических процессах, происходящих в миокарде при стрессе. Однако, к сожалению, в указанных работах практически не исследовалась рецепторная специфичность действия использованных лигандов ОР.

ПОНЯТИЕ ОБ АДАПТАЦИОННОЙ ЗАЩИТЕ СЕРДЦА И СТРЕССЛИМИТИРУЮЩИХ СИСТЕМАХ

На наш взгляд, учитывая вышеизложенные факты, не остается сомнений в том, что стрессорное повреждение миокарда само по себе является серьезной патологией миокарда и может повлечь за собой фатальные осложнения таких распространенных сердечно-сосудистых заболеваний как ишемическая болезнь сердца и др. Вопрос защиты миокарда от повреждающего действия стресса был и остается на сегодняшний день достаточно актуальным. Многие исследователи склоняются к мысли о том, что одним из наиболее оптимальных и физиологичных путей повышения резистентности сердца к экстремальным воздействиям является так адаптационной защитой сердца понимается индуцированная адаптационным воздействием повышенная резистентность миокарда к повреждающему действию экстремальных факторов. Предполагается, что такая резистентность обусловлена активацией так называемых стресс-лимитируюших систем, ограничивающих стрессреакцию при последующем стрессорном воздействии [75-79].

В нашей стране учение об адаптационной защите сердца получило развитие, благодаря работам профессора Ф.З.Меерсона, который постулировал существование так называемых стресс-литирующих систем. Он подразделил на две группы:

центральные, к которым относится ГАМК-ергическая, опиоидергическая, серотонинергическая; и периферические, в число которых входят системы антиоксидантов, простагландинов, адениннуклеотидов [75]. Повышение активности центральных СЛС тормозит формирование инертно-возбужденных центров, индуцирующих аритмии [75,77,79]. Аналогичным образом стимуляция периферических СЛС ограничивает аритмогенные эффекты стресса, действуя главным образом на уровне сердца [82,84,85]. Отсутствие фибрилляции желудочков у больных с острым инфарктом миокарда, по мнению Ф.З.Меерсона, связано с адекватным функционированием СЛС, а функциональная неполноценность СЛС может предопределять возникновение желудочковых аритмий.

Серотонинергическая система - относится к центральным СЛС и ограничивает активность адренергических центров головного мозга [75,77]. Совместное введение в организм предшественника серотонина - триптофана, ингибитора окисления серотонина - фенелзина и блокатора синтеза этого нейротрансмиттера на периферии приводило к накоплению этого биологически активного амина в головном мозге. Такое фармакологически детерминированное накопление серотонина в нервной ткани обеспечивало достоверное повышение порога ЖФ. К аналогичному эффекту приводило введение в организм синтетического энзиморезистентного аналога серотонина.

ГАМК-ергическая система. В недавних исследованиях, выполненных в лаборатории Ф.З.Меерсона, было показано, что уменьшение частоты возникновения аритмий и ферментемии, вызванной повреждением кардиомиоцитов при стрессе, может быть достигнуто путем активации ГАМК-ергической системы. В этих работах установлено, что адаптация к коротким иммобилизационным воздействиям сопровождалась достоверным повышением содержания ГАМК в полушариях головного мозга, активацией ключевого фермента биосинтеза ГАМК глутаматдекарбоксилазы и при этом достоверно снижала частоту возникновения вентрикулярных аритмий и повышала порог ЖФ при ОИМ [86,96]. Введение же метаболита ГАМК-ергической системы - ГОМК предупреждало стрессорные повреждения органов. Таким образом, от состояния центральных СЛС во многом зависит возникновение или предупреждение поражений миокарда при стрессе.

К сожалению, концепция Ф.З. Меерсона в некоторых своих разделах носит компилятивный или гипотетический характер, не имея прямых экспериментальных доказательств. В частности, при выдвижении на роль стресс-лимитирующей какойлибо эндогенной функциональной системы (например, ГАМК-ергической) системы не проводятся эксперименты с ее блокаторами, что не позволяет достоверно судить о ее роли в формировании повышенной устойчивости миокарда к повреждению.

Кроме того, имеющиеся данные пока не позволяют определенно сказать, какая из выше охарактеризованных систем играет ключевую роль и согласует работу всех СЛС. По нашему мнению, на роль такого координатора, может претендовать эндогенная опиоидергическая система. В подтверждение данного предположения можно привести следующие аргументы: во-первых, известно что уровень опиоидных пептидов увеличивается при стрессе и повышен у адаптированных животных [36,37,48,50,254]; во-вторых, некоторые опиоиды обладают антистрессорной и кардиопротекторной активностью [35,40,52,53,84,88,93];

в-третьих, лиганды опиатных рецепторов проявляют высокую кардиоваскулярную активность [136,157,165] и в-четвертых, ОП являются нейромодуляторами и регулируют секрецию практически всех нейротрансмиттеров и гормонов [4,31,39,114,258,261,262]. Поэтому, на наш взгляд, эндогенная опиоидная система является одним из наиболее вероятных претендентов на роль ведущей стресс-лимитирующей системы. Помимо уже изложенных данных, при выдвижении опиоидной системы на роль стресс-лимитирующей важно учитывать и результаты экспериментов с блокаторами ОР, показывающие, что предварительная блокада опиатных рецепторов различных типов в той или иной степени способна устранять антифибрилляторный и кардиопротекторный [37,41,42,49,50,67]. На наш взгляд, эти факты являются неоспоримым доказательством ведущей роли опиоидной системы в формировании адаптационной устойчивости миокарда к действию экстремальных факторов.

констатировать, что лиганды опиатных рецепторов:

1. обладают антистрессорной и кардиопротекторной активностью;

2. способны влиять на различные звенья стресс-реакции и патогенеза стрессорного повреждения миокарда;

Однако, во-первых практически неизучена рецепторная специфичность данных эффектов; во-вторых - в литературе нам не встретилось работ, в которых авторы исследовали бы кардиотропные эффекты опиатов после предварительной фармакологической блокады вышеописанных стресс-лимитирующих либо стрессреализующих систем. Поэтому, изучению рецепторной специфичности и механизмов кардиопротекторного влияния лигандов опиатных рецепторов посвящена настоящая работа.

Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Препараты и животные.

Работа выполнена на 1023 крысах-самцах линии Вистар (Томск, питомник “Рассвет”). Животные содержались в стандартных условиях вивария, в условиях естественного светового режима, они получали стандартную лабораторную диету и воду ad libitum. При проведении экспериментов мы руководствовались рекомендациями, изложенными в Приказе N 755 МЗ СССР от 12 августа 1977 г.

Умерщвление животных проводили декапитацией под легким эфирным наркозом. В таблице 1 приводится распределение животных по сериям экспериментов.

В таблице 2 указаны использованные в работе препараты. Все препараты, за исключением DuP734 перед введением растворяли в изотноическом растворе NaCl.

Навеску DuP734 предварительно суспендировали в 0,5 мл Tween 80, затем добавляли 5 мл 0,9% NaCl. Все растворы готовили ex tempore в день эксперимента.

Использованные в работе дозы препаратов указаны в тексте соответствующих разделов главы 3. При выборе доз лигандов опиатных рецепторов мы руководствовались ранее опубликованными данными о ранее обнаруженной антиаритмической, либо антиноцицептивной активности ниже перечисленных соединений [41,44,46,47,64,66,68,129,139,198,208,209,217, 237,246,248,257,268].

Распределение животных по сериям экспериментов

№№ СЕРИИ ЭКСПЕРИМЕНТОВ

3 Изучение роли центральных и периферических б) по порогу фибрилляции желудочков 4 Изучение роли вегетативной нервной системы индуцированным повреждениям 5 Исследование роли простаноидов в механизмах при стрессе препарата 1. Лиганды опиатных рецепторов Тетрапептид- (Tyr-D-Ala-Phe-Phe-NH2) предоставлен enkephalin) селективный Peptide Systems” (Sanагонист µ-ОР [190,248] Diego, США), PL017 (H-Tyr-Pro-Phe(N-Me)-D-Pro- ”Chiron Mimotopes NH2) селективный агонист µ- Peptide Systems” (SanDiego, США), СТАР (H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Arg- ”Chiron Mimotopes Налоксон неселективный блокатор «Sigma», St.Louis США (N,N-dial-Аlyl-Tyr-Aib-AibDiego, США), Phe-LeuOH), где Aib alpha-aminoisobutyric (+)SKF- N-allylnormetazocine, предоставлен доктором DUP734 (1-(cyclo-propylmethyl) -4- DuP734 был предоставлен (2`- (4``-fluorophenyl-2`- Dr.P.Gilligan (DuPont селективный блокатор опиатных рецепторов [257] ({trans-3,4-dichloro-NUpjohn Company, США), methyl-N-[2-(1-pyrolidinyl) cyclohexyl]benzeneacetamide}) dichloro-N-methyl-N-(7-(1The Upjohn Company, (4,5)dec-8-yl)benzeneacetamide ((-)-5,9-diethyl-2-(3Boehringer Ingelheim KG Норбиналторфим селективный блокатор -ОР Предоставлен Research 2. Адреномодуляторы Гуанетидин (1-[2-Guanidinoethyl] «Sigma», St.Louis США Бретилиум [o-Bromobenzyl] «Sigma», St.Louis США ethyldimetylammonium -ptoluenesulphonate] Тирамин препарат, усиливающий Reanal Клоргилин ингибитор моноаминоксидазы «Sigma», St.Louis США 3. Блокаторы циклооксигеназы и биосинтеза белка Индометацин 1-[p-Clorobenzoyl]-5- «Sigma», St.Louis, США methoxy-2-methylindole-3acetic acid [73,118] Циклогексимид ингибитор биосинтеза белка ”Sigma”, St.Louis, США 4. Ингибиторы нейтральной эндопептидазы (энкефалиназы) Ацеторфан, [(RS)CH3-COS-CH2-CH(CH2)э Предоставлен проф. J.CONH-CH2-CO2CH2э] ингибитор C. Schwarz (Centre Paul 2.2. Моделирование стрессорного повреждения сердца Методом стрессорного воздействия в нашем исследовании явилась длительная иммобилизация. Лишение животного возможности свободно передвигаться является для него сильным стрессируюшим фактором [22]. В наших исследованиях животных находящихся под легким эфирным наркозом фиксировали липкой лентой за конечности в положении на спине. Продолжительность воздействия составляла 24 часа с момента окончания действия эфирного наркоза.

2.3. Методика воспроизведения изадринового повреждения миокарда Одним из основных факторов, повреждающих миокард при стрессе, является выброс избыточных количеств катехоламинов и их токсическое действие на кардиомиоциты. Мы моделировали данный компонент стресс-синдрома подкожным введением субтоксических доз (80 мг/кг) изопротеренола (изадрин), как наиболее активного синтетического катехоламина длительного действия [73].

2.4. Методы оценки повреждений сердца Для оценки степени повреждения сердца использовали метод включения 99mТспирофосфата в такнь сердца и определение порога фибрилляции желудочков.

2.4.1. Оценка повреждений сердца по аккумуляции Тс-пирофосфата в ткани Для количественной оценки повреждения сердца мы использовали определение степени интенсивности включения в миокард меченого радиоактивным технецием пирофосфата. Накопление Тс-ПФ в поврежденных кардиомиоцитах широко используется для диагностики диффузного повреждения кардиомиоцитов [210] поскольку в здоровую ткань миокарда Тс-ПФ включается лишь в следовых количествах. Данным методом мы количественно исследовали как степень повреждения кардиомиоцитов, так и эффективность антистрессорного влияния препаратов в отношении защиты сердца [62].

лиофилизированный пирофосфат (“Пирфотех”, компания “Изотоп”, Россия).

Приготовление метки осуществляли в соответствии с инструкцией фирмыизготовителя.

Непосредственно после окончания стрессорного воздействия в бедренную вену животных вводили 25 мкКи препарата Тс-ПФ на 100 г тела. По истечении мин у крыс под эфирным наркозом извлекали миокард, который немедленно промывали через аорту 10 мл холодного физиологического раствора, осушали, взвешивали и радиометрировали. Радиометрию извлеченных образцов миокарда проводили на гамма-счетчике "Гамма-I" (Россия). Параллельно измеряли радиоактивность вводимой дозы для коррекции результатов на величину физического распада радионуклида. Расчет поглощенной дозы (ПДС) проводили по формуле:

где СРМ - показатель счетчика (радиоактивность образца) за 1 минуту;

mсердца - масса миокарда;

mтела - масса тела животного до эвтаназии;

доза - радиоактивность вводимой одному животному дозы радиофармпрепарата.

2.4.2. Способ определения порога желудочковой фибрилляции Для определения порога фибрилляции желудочков сердце раздражали прямоугольными электрическими импульсами анодального тока длительностью кардиостимулятора ЭС-50-1. За величину ПФЖ принимали минимальную силу тока при которой возникает фибрилляция желудочков. Порог желудочковой фибрилляции является косвенным показателем повреждения кардиомиоцитов и дает полуколичественную оценку кардиопротекторных свойств исследуемых препаратов [82,107].

2.5. Методика интрацеребровентрикулярного введения Для интрацеребровентрикулярного введения препаратов в боковой желудочек мозга крыс за 5-7 дней до эксперимента имплантировали полую канюлю из нержавеющей стали, которую фиксировали на поверхности черепа с помощью стоматологического цемент-фосфата. Операцию выполняли под барбамиловым наркозом (50 мг/кг внутрибрюшинно) с помощью стереотаксического аппарата СЭЖ-5 (НПО "Конструктор", Киев, Украина). При этом использовали следующие координаты: AP-1.5 мм, L+2.0 мм, V-3.5 мм относительно брегмы [215,216]. Перед декапитацией всем животным для уточнения локализации канюли производили интрацеребровентрикулярное введение 5 мкл метиленового синего. Препараты вводили в объеме 20 мкл со скоростью 5 мкл/мин.

2.6. Биохимические методы исследования 2.6.1. Определение общей интенсивности биосинтеза белка с применением радиоизотопной метки Меченый тритием лейцин-зН (Россия, “Изотоп”) в дозе 500 мкКи/100 г массы вводили животным внутрибюшинно за 1 ч до декапитации, как рекомендовано в литературе [119,238]. Миокард извлекали, отмывали от крови и быстро замораживали в жидком азоте. Навески тканей гомогенизировали в 10% ТХУ, центрифугировали и повторно промывали в 5% ТХУ. Для удаления нуклеиновых кислот образцы прогревали на водяной бане при +90oC в течение 20 мин. Липиды удаляли промыванием смесью спирт этиловый : эфир (соотношение 1:1), затем эфиром. Пробы в объеме 0,2 мл наносили на микропоровые фильтры с диаметром пор 0,1-0,2 мкм (Томск, НИИЯФ), промывали 5 мл 5% ТХУ. Фильтры с белковым осадком помещали во флаконы сцинтилляционного счетчика. Радиоактивность миокардиальных белков измеряли на сцинтиляционном -счетчике Mark-3 (США) c использованием стандартного диоксанового сцинтилляционного раствора ЖС-8.

Интенсивность биосинтеза белка определяли по формуле:

где СРМ - счет образца;

2.6.2. Определение продуктов перекисного окисления липидов Для оценки интенсивности процессов пероксидации в ткани миокарда определяли уровень малонового диальдегида и содержание диеновых коньюгатов в плазме крови и ткани миокарда.

Определение содержания малонового диальдигида в плазме крови проводили применением фосфорно-вольфрамовой кислоты. Принцип метода: при нагревании в кислой среде часть продуктов ПОЛ, относящихся к классу эндоперекисей, разлагается с образованием малонового диальдегида, взаимодействие которого с двумя молекулами тиобарбитуровой кислоты приводит к формированию комплекса, окрашенного в розовый цвет [277]. К 0,25 мл плазмы крови добавляли 2,5 мл 20% фосфорно-вольфрамовой кислоты, пробирки закрывали пробками, перемешивали и оставляли на холоде на 15 минут до образования крупных хлопьев, затем пробирки центрифугировали с охлаждением при 4°С 15 минут при 2500 об/мин.

Надосадочную жидкость сливали, к осадку приливали 1 мл дистилированной воды и 0,5 мл 0,8% тиобарбитуровой кислоты, приготовленной ex temporo (80 мг тиобарбитуровой кислоты растворяли в 5 мл дистилированной воды при нагревании, охлаждали и доводили объем до 10 мл ледяной уксусной кислотой), перемешивали, регистрировали рН, закрывали пробками и инкубировали 1 час на водяной бане при температуре 99 - 100°С. После окончания инкубации пробы охлаждалии центрифугировали 10 минут при 6000 об./мин. В центрифугате с помощью спектрофотометра СФ-26 регистрировали оптическую плотность при длинах волн 535 и 580 нм против контроля, содержащего 1 мл дистилированной воды и 0,5 мл тиобарбитуровой кислоты. Концентрацию малонового диальдегида рассчитывали по формуле:

С - концентрация малонового диальдегида (нмоль/мл) D - оптическая плотность центрифугата миокарда. Принцип метода тот же, что и для определения МДА в плазме крови. Навески ткани миокарда гомогенизировали в 1мл переносили в стеклянные пробирки, ступку ополаскивали 1 мл буфера, в пробирки добавляли по 2 мл 30% трихлоруксусной кислоты и 1 мл 0,75% тиобарбитуровой кислоты (приготовление аналогично предыдущему методу). Пробирки закрывали пробками и инкубировали 15 минут на водяной бане при температуре 99 С. После инкубации пробирки охлаждали и центрифугировали 15 минут при 3000 об./мин. В центрифугате регистрировали с Расчет концентрации МДА производили с учетом коэффициента молярной экстинкции, равным 1,56*105 ммоль-1 см-1 в нмоль /г ткани [32].

осуществляли по методу J.L.Bollard & H.P.Koch в модификации В.Б.Гаврилова и М.И.Мишкорудной [17]. Принцип метода основан на интенсивном поглощении конъюгированных диеновых структур стеклянные пробирки к 0,2 мл плазмы крови добавляли 4 мл смеси гексан : изопропанол в соотношении 3 : 2 (экстракция по методу Плацера [220,221]), пробирки закрывали пробками и добавляли по 1мл НСl (рН=2) и по 2 мл гексана, пробирки прошествии этого времени верхний гексановый слой отбирали и измеряли его оптическую плотность при длине волны 233 нм с помощью спектрофотометра СФ-26 против контроля, содержащего вместо плазмы 0,2 мл дистилированной воды и подвергнутого всем вышеперечисленным методам обработки.

относительных единицах по формуле:

D233 - измеренное значение оптической плотности, Ve=4 мл - конечный объем гексанового экстракта, Vp=0,2 мл - объем взятой плазмы крови.

миокарда. Принцип метода аналогичен предыдущему определению.

Навеску ткани гомогенизировали в 3 мл трис-буфера (рН=7,4).

В стеклянные пробирки к 0,5 мл гомогената добавляли 4,5 мл определение проводили так же, как и в плазме крови.

Расчет содержания диеновых конъюгатов в ткани миокарда производили в относительных единицах по формуле:

D233 - измеренное значение оптической плотности, Ve=4 мл - конечный объем гексанового экстракта, 2.7. Радиоимунные методы исследования Определение уровня простагландинов и гормонов плазмы крови и тканях проведено методами радиоиммунного анализа.

Общей основой радиоиммунных исследований in vitro является конкуренция немеченых (“холодных”) молекул определяемого вещества и молекул этого же вещества, соединенных с радиоактивной меткой (125I, 3Н и др.), за связывание со специфическими биндинг-системами. В качестве биндинг-систем могут выступать:

имунная сыворотка (РИА), специфические тканевые рецепторы (радиорецепторный анализ), белки различных тканей (метод конкурентно-белкового связывания) [112].

РИА-анализ подразумевает следующие основные этапы: 1) внесение в пробирку исследуемой пробы или раствора стандарта, меченного антигена, антисыворотки или другого специфически связывающего компонента в присутствии буфера; 2) инкубация проб в оптимальных для каждого набора условиях, что необходимо для установления динамического равновесия между процессами образования и распада иммунных комплексов; 3) сепарация связанной и свободной фракций меченного лиганда методами: фракционного осаждения полиэтиленгликолем, сульфатом аммония, этанолом, адсорбции на активированном угле, силикатах и др. с последующим центрифугированием и аспирацией или декантированием супернатанта; 4) радиометрия проб и математическая обработка результатов.

Методические детали проведения радиоконкурентного анализа описаны в инструкциях фирм-изготовителей для каждого РИА-комплекта. В своей работе мы использовали следующие наборы для проведения РИА-исследований:

фирмы “Amersham” (Англия) - для определения 6-кето-простагландина-Ф альфа (RPA 515) и тромбоксана В2 (RPA 516);

фирмы “Изотоп” (Россия) - для определения инсулина.

Радиоиммунному определению содержания простагландинов предшествовали процедуры экстракции анализируемого лиганда из опытного образца:

а) экстракция простагландинов из плазмы крови. В пробирки для забора крови с целью предотвращения энзиматического гидролиза простагландинов вносили натриевую соль этилендиамин-тетрауксусной кислоты (конечная концентрация мкМ), которая в указаной концентрации не влияет на образование комплекса антиген-антитело и в то же время достаточно эффективно ингибирует протеолиз пептидных гормонов. Для предотвращения синтеза простагландинов in vitro в пробирку вносили 10 мкл спиртового раствора индометацина (конечная концентрация 50 мкМ). После забора крови пробирки центрифугировали в рефрижераторной центрифуге К-70 при 2000g в течении 15 мин при температуре +4оС. Немедленно после центрифугирования плазму разливали на аликвоты и хранили в низкотемпературном холодильнике при -20оС.

модифицированным методом B.M.Jaffe и соавт [180]. Использованный нами метод отличался от оригинала тем, что петролейный эфир был заменен на пентан. К 0,5 мл плазмы добавляли 1,5 мл пентана для удаления нейтральных липидов. Тщательно перемешивали пробы. Верхнюю пентановую фазу отбрасывали, к образцам добавляли 1,5 мл смеси этилацетат : изопропанол : 0,2 М Hcl в соотношении 3:3: соответственно. Встряхивали пробирки в течении 30 сек., добавляли 1 мл этилацетата и 1,5 мл воды. После перемешивания производили разделение фаз путем центрифугирования при 2500g в течении 10 минут. Верхнюю органическую фазу, содержащую простагландины переносили в чистые пробирки и высушивали вакуумом при + 55оС.

простагландинов из ткани миокарда также проводили по методу Jaffe и соавт. [180].

Навески миокарда, замороженые в жидком азоте, гомогенизировали в смеси из 1 мл 0,01 М фосфатного буфера,приготовленного на 0,15 М NaCl (рН 7,4) и 3 мл экстрагирующего раствора (этилацетат:изопропанол:0,2 М HСl в соотношении 3:3: по объему). После гомогенизации к образцам добавляли 2 мл этилацетата, 3 мл воды, перемешивали. Дальнейшие процедуры проводили аналогично таковым для плазмы.

Содержание простациклина и тромбоксана определяли по уровню их стабильных метаболитов 6-кето-простагландина F1 и тромбоксана типа В2.

2.8. Гистохимическое определение катехоламинов Ранее показано, что уровень катехоламинов в нервных структурах является интегральным показателем процессов синтеза, высвобождения и обратного нейронального захвата медиатора адренергическими структурами [1]. Криостатные срезы левого желудочка сердца и надпочечников толщиной 15 или 25 мкм, изготавливали при температуре -15°С. Катехоламины, преимущественно норадреналин, выявляли модифицированным глиоксиловым методом [117]. После 10-минутной инкубации свежих срезов гистологических образцов в 2% растворе глиоксиловой кислоты (рН 7,2-7,4) их подсушивали в течении 15-30 мин под вентилятором. Для окончания гистохимической реакции срезы выдерживали минут при температуре 85°С. При этом, в результате конденсации КА ткани с глиоксиловой кислотой образовывались изохинолины, которые способны люминесцировать в видимой части спектра при облучении ультрафиолетовым светом с длиной волны 390-410 нм [1]. После термической обработки готовые препараты заключали в нефлюоресцирующее вазелиновое масло и исследовали в люминесцентном микроскопе. Для контроля специфичности реакции в части случаев глиоксиловую кислоту заменяли в инкубационной среде на KH2PO4.

Определение количественного содержания КА в адренергических клетках надпочечников выполняли на цитофотометре ЛЮМАМ-И3. Измерение уровня флуоресцинции катехоламинов проводили в падающем ультрафиолетовом свете, проходящем через возбуждающие фильтры СЗС-24-4, ФС-1-2, СС-15-2 и запирающие фильтры ЖС-18 и ЖС-19, при длине волны 521 нм. Считываемые показания интенсивности флюоресценции с цифрового регистрирующего прибора выражали в условных единицах [34]. Перед каждым измерением прибор калибровали по контрольному стеклу, входящему в комплект микроскопа.

Оптическую плотность и интенсивность определяли не менее чем при 30-ти наложениях фотометрического зонда в каждом гистологическом препарате, что определяло необходимую достоверность результата.

Содержание КА в адренергических волокнах миокарда оценивали полуколичественным косвенным способом, исходя из того, что при изменении концентрации КА в нервных волокнах изменяется и количество видимых флюоресцирующих адренергических волокон на гистологическом срезе. Поэтому, проводили измерение относительной объемной плотности адренергических волокон наложением на срез тестовой сетки, имеющей 100 тестовых ячеек [2]. Измерения в каждом препарате осуществляли не менее, чем при 20 случайных наложениях сетки, подсчитывая точки, приходящиеся на исследуемые структуры. Полученные величины объемной плотности адренергических волокон выражали в объемных процентах [2,108].

2.9. Методы статистической обработки результатов.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием методов биологической статистики. Для каждого измеряемого параметра вычисляли среднее (Х) и ошибку среднего (m). Проверку гипотезы о равенстве групповых средних (достоверность различия между сравниваемыми величинами) проводили с использованием t-критерия Стьюдента.

Все математические расчеты и вычисления статистических показателей проводили на ЭВМ IBM PC 486 с использованием пакета прикладных программ Statistica 5.0 for Windows.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Основные субтипы опиатных рецепторов, лиганды которых модулируют устойчивость миокарда к повреждающему воздействию стресса Уже в ранних сообщениях по проблеме опиоидных нейропептидов были отмечены факты увеличения уровня опиоидов в плазме крови, ЦНС и ликворе при стрессе [125,126,168,207] и при введении изадрина [27]. Впоследствии данные об активации опиоидной системы при стрессе были неоднократно подтверждены [10,11,14,111,184,262], но биологический смысл этого оставался неясным. Позднее было обнаружено, что в процессе адаптации к действию различных факторов, либо при применении адаптогенных препаратов увеличивается содержание опиоидов в плазме крови и центральной нервной системе, что сопровождается формированием повышенной устойчивости миокарда к повреждающему действию стресса [41], а неселективный агонист µ и ОР даларгин обладает антистрессорной активностью и предупреждает развитие стрессиндуцированного повреждения миокарда [35,36,38,40,41,44,50].

Сопоставление этих фактов позволяет нам предполагать, что опиоиды играют важную роль в повышении устойчивости миокарда к экстремальным воздействиям.

Однако, оставался открытым вопрос о рецепторной природе эффектов даларгина при стрессе. В экспериментах данного раздела работы мы попытались выяснить, через какие типы рецепторов реализуется кардиопротекторное действие опиоидов при стрессе.

3.1.1. Влияние лигандов опиатных рецепторов на уровень аккумуляции Тспирофосфата в кардиомиоцитах при иммобилизационном стрессе Как показано в таблице 3, иммобилизационный стресс приводил к увеличению аккумуляции Тс-ПФ в миокарде экспериментальных животных в 1,5 раза, что указывает на наличие повреждений миокарда [62,210], в данном случае, несомненно, стрессорной этиологии, так как другие повреждающие факторы были исключены. Это убедило нас в адекватности избранной модели стресса, поскольку повышенное накопление указанного радиофармпрепарата в сердце при стрессорном повреждении обнаруживали и другие авторы [62,210].

Как следует из таблицы 3, ни селективные агонисты -ОР (U-50,488H), -ОР (DSLET) или -рецепторов ((+)SKF 10,047 (N-allylnormetazocine)), ни антагонисты этих рецепторов MR2266 и норбиналторфимин (-ОР), DUP734 (-ОР) и ICI-174, (-ОР), не влияли на степень СПС в наших экспериментах, поскольку их системное введение не сопровождалось достоверными изменениями аккумуляции Тс-ПФ в миокарде при иммобилизационном стрессе. Следовательно, есть все основания предполагать, что -,-, -рецепторы, а также их эндогенные агонисты не играют существенной роли в механизме развития СПС.

То, что изменения функциональной активности -, - или k-ОР не отражались на устойчивости сердца подопытных крыс к стрессорным повреждениям явилось для нас неожиданным (табл.3). Так, имеются литературные данные [263] об идентификации - и -ОР непосредственно на мембранах кардиомиоцитов.

Влияние лигандов -, - и -опиатных рецепторов на степень повреждения сердца крыс при иммобилизационном стрессе (Х ± 1 Интактные животные