«Влияние салициловой кислоты и цитокинина на экспрессию генов митохондриальных белков ( ...»

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

Ордена Трудового Красного Знамени

Учреждение Российской академии наук

Институт физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН

На правах рукописи

БЕЛОЗЕРОВА

Наталья Сергеевна

Влияние салициловой кислоты и цитокинина на

экспрессию генов митохондриальных белков

(03.01.05 – физиология и биохимия растений) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель – кандидат биологических наук Пожидаева Елена Станиславовна Москва –

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Глава 1. ВВЕДЕНИЕ ……………………………………………………………... Глава 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ……………………………………………...... 2.1. Организация и функционирование митохондрий растений ………………... 2.1.1. Общие представления о структуре и функциях митохондрий растений… 2.1.2. Пути переноса электронов в дыхательной цепи митохондрии ………….. 2.2. Организация митохондриального генома …………………………………… 2.2.1. Особенности организации генома митохондрий растений ………………. 2.2.2. Основные пути регуляции экспрессии митохондриальных генов растений …………………………………………………………………………….. 2.3. Альтернативная оксидаза …………………………………………………….. 2.3.1. Структура и функция белка ………………………………………………… 2.3.2.. Роль АО при воздействии на растение биотических и абиотических факторов ……………………………………………………………………………. 2.4. Роль фитогормонов в регуляции интенсивности дыхания растений ……… 2.5. Характеристика люпина жёлтого (Lupinus luteus L.) как модельного объекта исследования ……………………………………………………………… Глава 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ………………….. 3.1. Материалы и объекты, используемые в работе …………………………….. 3.2. Определение скорости дыхания в семядолях Lupinus luteus ……………….. 3.2.1. Анализ и обработка данных полярограммы ……………………………….. 3.3. Выделение митохондрий методом дифференциального центрифугирования ………………………………………………………………...

3.3.1. Очистка митохондрий в сахарозном градиенте ………………………........ 3.3.2. Фракционирование митохондрий ………………………………………….. 3.4. Бактериальные штаммы и векторы …………………………………………... 3.5. Клонирование фрагментов ДНК в вектор pTZ57R/T ……………………….. 3.5.1. Подбор праймеров к гену исследования …………………………………... 3.5.2. Биоинформационный анализ подобранных зондов для генов …………… 3.6. Выделение тотальной растительной ДНК …………………………………… 3.7. Выделение митохондриальной ДНК …………………………………………. 3.8. Выделение плазмидной ДНК E. coli …………………………………………. 3.8.1. Микровыделение плазмидной ДНК ………………………………………... 3.8.2. Макровыделение плазмидной ДНК ………………………………………... 3.9. Определение количества и оценка качества препаратов нуклеиновых кислот ………………………………………………………………………………..

3.10. Полимеразная цепная реакция ………………………………………………. 3.11. Электрофорез ДНК в агарозном геле ……………………………………….. 3.12. Очистка фрагментов ДНК из геля …………………………………………... 3.12.1. Очистка фрагментов ДНК из геля с помощью набора «Silica Bead DNA Gel Extraction Kit» фирмы Fermentаs ……………………………………………...

3.12.2. Элюция фрагментов ДНК электрофоретическим методом ……………... 3.13. Лигирование ДНК ……………………………………………………………. 3.14. Приготовление компетентных клеток ……………………………………… 3.14.1. Приготовление компетентных клеток согласно рекомендации фирмы Fermentas …………………………………………………………………………….

3.14.2. Приготовление компетентных клеток с использованием CaCl2 ………... 3.15. Трансформация бактериальных клеток …………………………………….. 3.16. Рестрикция ДНК ……………………………………………………………... 3.17. Секвенирование ДНК ………………………………………………………... 3.18. Метод run on транскрипции …………………………………………………. 3.18.1. Иммобилизация фрагментов ДНК на нейлоновую мембрану ………….. 3.18.2. Определение количества белка в препарате митохондрий ……………… 3.18.3. Синтез меченых транскриптов в лизате митохондрий ………………….. 3.18.4. ДНК-РНК гибридизация …………………………………………………... 3.18.5. Оценка результатов гибридизации ………………………………………... 3.19. ПЦР после обратной транскрипции ………………………………………… 3.19.1. Выделение суммарной растительной РНК с помощью тризола ………... 3.19.2. Электрофорез РНК в агарозном геле ……………………………………... 3.19.4. ПЦР после обратной транскрипции ………………………………………. 3.19.5. Анализ результатов ………………………………………………………… 3.20. Вестерн-блоттинг …………………………………………………………….. 3.20.1. Выделение суммарного белка из митохондрий растений ………………. 3.20.2. Определение количества белка …………………………………………… 3.20.2.1. Определение белка по Бредфорд ……………..………………………… 3.20.2.2. Определение белка бицинхонином...…………………………………… 3.20.3. Разделение белков с помощью гель-электрофореза в денатурирующих условиях ………………………………………..…………………………………… 3.20.4. Окраска белковых гелей …………………………………………………… 3.20.5. Перенос белков на мембрану ……………………………………………… 3.20.6. Иммунохимический анализ ……………………………………………….. Глава 4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ ……………………………… 4.1. Влияние СК и 6-БАП на интенсивность дыхания в тканях семядолей 4.1.1. Оптимизация постановки эксперимента …………………………………... 4.1.2. Влияние СК на физиологические показатели дыхания в тканях этиолированных семядолях Lupinus luteus ……………………………………….. 4.1.3. Влияние 6-бензиламинопурина на показатели дыхания в тканях этиолированных семядолей Lupinus luteus ……………….………………………. 4.2. Изучение влияние 6-БАП и СК на интенсивность транскрипции митохондриальных генов …………………………………………………………..

4.2.1. Клонирование фрагментов митохондриальных генов ……………………. 4.2.2. Оптимизация выделения митохондрий для метода run-on транскрипции. 4.2.3. Оптимизация метода run-on транскрипции ………………………………... 4.2.4. Влияние СК на интенсивность транскрипции митохондриальных генов.. 4.2.5. Влияние 6-БАП на интенсивность транскрипции митохондриальных генов ………………………………………………………………………………… 4.3. Влияние 6-БАП и СК на альтернативный путь переноса электронов у Lupinus luteus ……………………………………………………………………….. 4.3.1. Идентификация генов АО у Lupinus luteus ………………………………... 4.3.2. Изменение содержания мРНК генов АО у Lupinus luteus под действием 4.3.3. Характеристика белка АО у Lupinus luteus ………………………………... 4.3.4. Характеристика предсказанных продуктов экспрессии LlAox2 и LlAox1.. 4.3.5. Влияние 1 мМ СК и 22 мкМ 6-БАП на содержания белка АО у Lupinus luteus …………………………………………………………………………………

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ:

СК – салициловая кислота; 6-БАП – 6-беннзиламинопурин, синтетический цитокинин; АО – альтернативная оксидаза; Vt - общей скорости дыхания; VKCN скорости цианид-резистентного дыхания; Vres, О - скорость остаточного дыхания;

Valt, А - максимальную активность альтернативного дыхания; Vcyt, Ц - скорость цитохромного дыхания; ЦРД - доля цианид-резистентного дыхания; СГК салицилгидроксамовой кислотой; дНТФ – дезоксирибонуклеозидфосфаты, используемые в ПЦР; НК – нуклеиновые кислоты; ОТ-ПЦР – ПЦР с продуктами обратной транскрипции; АТФ - аденозинтрифосфорной кислоты; ЦТК - цикл трикарбоновых кислот, ЭТЦ - электрон-транспортной цепи митохондрий; НАДН – никотинамидадениндинуклеотид; НАДФН – никотинамидадениндинуклеотидфосфат; ФАДН - флавинопротеин; FeS - железосерные белки; СДГ - сукцинатубихинон оксидоредуктаза, мтДНК – митохондриальная ДНК; АФК – активные формы кислорода; ОП, D – оптическая плотность; s – прямой праймер; asобратный праймер; РНК-аза – рибонуклеаза; Тр1 –система № 1 для run-on транскрипции; Тр2 – система № 2 для; ТСхл – система для run-on транскрипции хлоропластов; МХ – суспензия митохондрий; K IV и K I –четвертый и первый комплексы ЭТЦ соответственно; БСС – гены белок-синтезирующей системы митохондрий; hlp – обозначены хлоропластные гены; ПКС – программируемая клеточная смерть; а.о. - аминокислотные остатки; п.н. - пар нуклеотидов; БСА – бычий сывороточный альбумин; УФ – ультрафиолет; ЦТФ, ГТФ, УТФ – нуклеотидтрифосфаты.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Организация и функционирование митохондрий растений.

2.1.1. Общие представления о структуре и функциях митохондрий растений.

Митохондрии осуществляют синтез аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ), основной энергетической валюты живой клетки. Для осуществления своих функций митохондриям необходимо так называемое «топливо» в виде углеводов (пируват, малат), жирных кислот или аминокислот, а также, для фосфорилирующего дыхания требуется наличие в клетке АДФ и неорганического фосфата (Ленинджер, 1966). Митохондрии присутствуют практически во всех эукариотических клетках, как автотрофных (растения), так и гетеротрофных (животные, грибы) организмов. Здесь следует оговориться, что митохондрии растений существенно отличаются от митохондрий животных и грибов, как по своей внутренней организации, так и по функционированию. Однако их основная функция, окисление органических соединений и использование освобождающейся при распаде этих соединений энергии в синтезе молекул АТФ, остаётся неизменной (Ченцов, 2004T). На этих особенностях будет акцентировано внимание при описании общих принципов структурной организации митохондрий растений и их функционирования.

Рис. 1. Схематическое изображение строения митохондрии растений.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

На рис. 1 представлено схематическое изображение структуры митохондрии растений. Митохондрии растений имеют широкий диапазон изменений размера, который не превышает 1 мкм, формы, численности и локализации в клетках различного типа. Исследователи давно пришли к выводу, что митохондрии устроены единственно возможным способом, позволяющим им выполнять свои основные функции. По морфологии митохондрия является органеллой, окруженной двойной мембраной и наполненной митохондриальным матриксом (рис. 1). Наружная мембрана митохондрии гладкая, толщиной около 7 нм, она отделяет органеллу от цитоплазмы клетки и обладает низкой избирательностью для проникновения различных молекул. Внутренняя мембрана так же имеет толщину около 7 нм, однако она обладает высокой избирательностью для проникновения белков и молекул внутрь митохондриального матрикса. Для увеличения своей внутренней поверхности митохондрии развили сеть выростов, обращенных в матрикс органеллы, в виде пластин или трубок, называемых кристами. Наружную мембрану от внутренней мембраны отделяет межмембранное пространство шириной около 10-20 нм. В некоторых местах мембраны соприкасаются и образуют поры для проникновения белков и молекул ядерного кодирования, которые синтезируются в цитоплазме, а затем транспортируются в митохондрии к месту их функционирования. Митохондриальный матрикс представляет собой однородное прозрачное вещество, в котором содержится наибольшая часть ферментов, участвующих в цикле Кребса, в окислении жирных кислот, а также здесь располагаются митохондриальные ДНК, РНК и рибосомы (Полесская 2005;

Ченцов, 2004T).

Процесс дыхания условно можно разделить на несколько стадий: 1) подготовительный распад сложных органических соединений до простых, например углеводов; 2) гликолиз; 3) аэробная стадия, включающая цикл Кребса (цикл трикарбоновых кислот, ЦТК) и окисление в электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) митохондрий.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Первые две стадии осуществляются вне митохондрий, а последняя стадия непосредственно в митохондриях. Причём, если в ЦТК участвуют в основном растворимые белки и осуществляется этот процесс в матриксе, то заключительный этап дыхания реализуется в цепи переноса электронов, находящейся во внутренней мембране митохондрий. Продуктами ЦТК являются восстановленные коферменты (НАДН, ФАДН) и промежуточные метаболиты. Далее НАДН и сукцинат (как промежуточный метаболит ЦТК) окисляются в ЭТЦ митохондрий, структурная организация которой будет подробно рассмотрена в главе 2.1.2.

функциональной организации митохондрий, для лучшего понимания роли этих органелл в растительной клетке важно обратить внимание на те процессы, которые могут изменяться в результате функционирования митохондрий. Как отмечалось выше, основной функцией митохондрий является окисление органических соединений и синтез АТФ. Однако помимо этого, для клетки важны также промежуточные продукты ЦТК и глиоксилатного цикла, являющиеся метаболитами в других биохимических процессах.

В последнее время общепринято считать, что митохондрии являются полифункциональными органеллами. При этом функции митохондрий в автотрофных клетках несколько отличаются от функций в гетеротрофных клетках.

В растениях митохондрии и пластиды участвуют в формировании окислительновосстановительного баланса клетки. Этот баланс зависит от онтогенетической стадии клетки и растения в целом, от условий внешней среды и имеет тканеспецифичные особенности. Кроме того, митохондрии опосредованно участвуют в фотосинтезе через фотодыхание (Nunes-Nesi, Fernie, 2007).

Долгое время считалось, что такая функция как генерация тепла характерна исключительно для митохондрий животных клеток. Однако сейчас известно, что термогенез ароидных растений является результатом функционирования митохондрий клеток цветка (Meeuse, 1975). В итоге температура цветка или

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

початка может достигнуть 30°С при температуре воздуха 5°С (Seymour, SchlultzeMotel, 1996). В последнее время высказывается предположение, что термогенная функция митохондрий характерна не только для ароидных, но и для других растений. Эта функция может служить для поддержания температуры всего растения при незначительных колебаниях температуры окружающей среды (Vojnikov et al., 1984; Grabelnych et al., 2003).

Известно, что рост и накопление растением биомассы в значительной степени определяются интенсивностью и эффективностью дыхания, а точнее соотношением дыхания роста к дыханию поддержания. Под дыханием роста понимают количественные затраты дыхательного субстрата на рост растения. Под дыханием поддержания подразумевают количественные затраты дыхательного субстрата на обновление и поддержания биомассы (Палесская, 2005).

Важно отметить, что при стрессах различной природы рост растений, как правило, тормозится, однако интенсивность дыхания может оставаться на прежнем уровне или даже усиливаться. Это связано с тем, что увеличивается доля дыхания поддержания, происходят изменения в функционировании пластид и, как следствие, интенсивность фотосинтеза может падать. Митохондрии являются одним из основных мест генерации активных форм кислорода (АФК) в клетке, которые являются сигнальными молекулами и играют важную роль при стрессе различной природы (Mller, 2001). В последние годы митохондриям отводят важную роль в процессе апоптоза или запрограммированной клеточной смерти (Ванюшин, 2001).

2.1.2. Пути переноса электронов в дыхательной цепи митохондрии.

Окисление коферментов с помощью кислорода воздуха представляет собою заключительный этап дыхания. Восстановленные коферменты и сукцинат, образующиеся в ЦТК, окисляются в ЭТЦ митохондрий, локализованной во внутренней мембране органеллы. Окисление сопровождается переносом электронов по цепи переносчиков на кислород, который восстанавливается до

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

воды. Переносчиками служат пиридиновые и флавиновые дегидрогеназы, а также железосерные белки (FeS), убихинон и цитохромы. Расположение переносчиков в цепи зависит от их окислительно-восстановительных потенциалов, и перенос электронов осуществляется от более отрицательного к более положительному редокс-потенциалу. Данные переносчики могут быть в восстановленном и окисленном состоянии, и попеременно играют роль доноров и акцепторов электрона. Конечным акцептором электрона является кислород (Палесская, 2005).

На рис. 2 приведена схема строения ЭТЦ митохондрий растений.

Рис. 2. Схема строения ЭТЦ митохондрий растений (пояснения в тексте).

I, II, III, IV – трансмембранные белковые комплексы; цх с – цитохром с; UQ – убихинон; АОХ – альтернативная оксидаза; НДвнш, НДвн – внешние и внутренние альтернативные НАД(Ф)Н-дегидрогеназы, соответственно.

В составе основной ЭТЦ, общей для животных, грибов и растений переносчики образуют четыре трансмембранных белковых комплекса. Пятым мембранным комплексом является АТФ-синтаза, которая не входит в состав ЭТЦ (Nicholls, Ferguson, 2002; Trumpower, Gennis, 1994).

Комплекс I включает в себя НАДН-убихинон оксидоредуктазу, которая имеет молекулярную массу около 1 МДа и состоит из двух продолговатых доменов, формирующих L-образную структуру. Один из домеонов выступает в матрикс и отвечает за окисление НАДН. Комплекс состоит из 40 субъединиц (Sunderhaus et al., 2006). Причём, у большинства растений, только 7 субъединиц

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

имеют митохондриальное кодирование (NAD1-6, NAD4L), а остальные кодируются ядерным геномом (Rasmusson et al., 1998). Все они обладают высокой гидрофобностью и входят в состав мембранных доменов. В состав комплекса входит ФМН в качестве кофермента, а также содержит FeS-белки. Данный комплекс имеет два сайта связывания убихинона в гидрофобной части и в одном из них находиться прочно связанный убихинон. Комплекс осуществляет перенос двух электронов и, к тому же, является протонной помпой. Ингибитором функции этого комплекса является ротенон. Ротенон блокирует перенос электронов от восстановленной формы НАДН к цитохрому b (Гривенникова, Виноградов, 2003).

Комплекс II, сукцинат-убихинон оксидоредуктаза (СДГ), состоит из двух основных субъединиц - большой и малой субъединицы. Большая субъединица с молекулярной массой около 70 кДа представляет собой растворимый полипептид, с которой коволентно связан ФАД и на которой расположен сайт связывания субстрата. Малая субъединица 25-30 кДа содержит три FeS-белка и цитохром bB560, B однако участие последнего в транспорте электронов не показано (Horsefield et al., 2004). Комплекс II растений содержит, по крайней мере, четыре дополнительных субъединицы функция которых не ясна (Eubel et al., 2003). Все субъединицы данного комплекса имеют ядерное кодирование. Ингибитором СДГ является, нпримеер, малонат (Побежимова и др., 2004).

Комплекс III, убихинол-цитохром с оксидоредуктаза, функционирует как димер с молекулярной массой около 500 кДа. Каждый мономер содержит 10- различных субъединиц (Braun, Schmitz, 1995; Berry et al., 2000; Hunte et al., 2000).

Структура данного комплекса сходна у митохондрий Arabidopsis thaliana, дрожжей и митохондрий сердца быка (Dudkina et al., 2005). Комплекс III содержит цитохром b в состав которого входят два гема b–типа с разными редокс-потенциалами (гем bBL B с низким и гемм bBH с высоким потенциалами), железосерные белки Риске, цитохром cB1 и центры связывания для убихинона. Около четверти этого комплекса располагается внутри мембраны, малая его часть расположена в межмембранном пространстве и большая часть - в митохондриальном матриксе (Berry et al., 2000).

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Апоцитохром b является единственной субъединицей этого комплекса, которая кодируется у Arabidopsis thaliana геномом митохондрии (Unseld et al., 1997).

Перенос электрона в этом комплексе сопряжен с транспортом протона.

Ингибитором этого комплекса является антибиотик антимицин А, который протонпроводящем Q-цикле (Побежимова и др., 2004).

Комплекс IV включает в себя цитохром с–кислород оксидоредуктазу. Около 12-13 субъединиц формируют мономер с молекулярной массой ~220 кДа (Richter, Ludwig, 2003). Этот комплекс может функционировать как мономер и как димер (Лузиков, 2009). Комплекс IV имеет четыре активных металлсодержащих центра:

CuA-центр, который включает в себя два атома меди; гем а и а3, и CuВ. У большинства растений три большие субъединицы этого комплекса синтезируются в митохондриях (СОХ1, СОХ2 и СОХ3) (Unseld et al., 1997). Субъединица СОХ связывает гем а и гем а3, а также реакционный центр CuВ, в то время как СОХ включает CuA и участвует в связывании цитохрома с. Субъединица СОХ участвует в протонной проводимости. Согласно современным представлениям, остальные субъединицы, кодируемые в ядре, служат для стабилизации специфических субъединиц митохондрии или способствуют формированию каталитического центра. Комплекс IV являются протонной помпой. Связывание кислорода и его 4-х электронное восстановление до воды осуществляется биядерным центром - гем а3-CuВ (Лузиков, 2009). Ингибиторами комплекса являются цианид, азид и СО, причем, во всех трех случаях ингибиторы взаимодействуют с цитохромом а3. Азид и цианид образуют координационный комплекс с FeP3+ а СО с FeP2+ (Побежимова и др., 2004).

Помимо основных комплексов в транспорте электронов также участвуют водорастворимый белок, локализованный в межмембранном пространстве.

Пятым комплексом является АТФ-синтаза, которая представляет собой двухкомпонентную структуру, состоящую из каталитического центра F1 или

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

«головки», локализованной в матриксе и гидрофобной части F0, поддерживающей F1 во внутренней мембране митохондрий. Комплекс имеет молекулярную массу около 600 кДа (Stock et al., 2000). Две части АТФ-синтазы соединены центральным стебельком, который поворачивается в ходе катализа, и периферическим стебельком, который предотвращает поворот. Во время прохождения протонов через часть F0 высвобождается энергия, за счет которой осуществляется поворот субъединиц. В процессе поворота в «головке» осуществляется фосфорилирование АДФ. Комплекс включает в себя около 15 различных субъединиц, некоторые из них представлены множественными копиями (Полесская, 2005). Одна субъединица каталитического центра (АТР1) и три субъединицы мембранной части (АТР6, АТР8, АТР9) закодированы в митохондриальном геноме растений. Ингибитором АТФ-синтазы является олигомицин, который блокирует транспорт протонов через часть F0 (Побежимова и др., 2004).

В состав всех пяти основных комплексов митохондрий растений входит сходное количество субъединиц, которые гомологичны компонентам ЭТЦ грибов и животных. Однако встречаются некоторые дополнительные белки или компоненты, специфичные только для растений. Например, комплекс III включает последовательность у митохондриальных белков ядерного кодирования, при их транспорте внутрь митохондрии (Braun et al., 1995). Кроме того, комплексы II и IV имеют ряд специфичных для растений субъединиц, которые вероятно осуществляют специфические функции в ЭТЦ митохондрий (Millar et al., 2004).

Помимо основного пути переноса электронов у растений также присутствует альтернативные пути переноса электронов.

На внутренней и наружной стороне внутренней митохондриальной мембраны локализованы субстрат-связывающие центры ряда НАД(Ф)Ндегидрогеназ (внутренних и внешних). Одни из них окисляют НАДН, другие НАДФН, восстанавливая при этом пул убихинонов (Melo et al., 1996).. В качестве кофермента НАД(Ф)Н-дегидрогеназы содержат ФАД. Их активность не

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

подавляется ротеноном и не сопряжена с переносом протонов в ЭТЦ. НАД(Ф)Ндегидрогеназы представляют собой мономерные белки с молекулярной массой 26кДа (Kerscher, 2000). Внутренние дегидрогеназы окисляют эндогенный НАД(Ф)Н и контактируют с комплексом I имеют более по низкое сравнениюс ним сродство к субстрату. Не осуществляя перенос протонов в ходе окисления кофакторов, их функционирование приводит к снижению эффективности дыхания, поскольку при этом обходиться один (первый) из трех пунктов сопряжения.

Присутствие дегидрогеназ на внешней стороне мембраны объясняет способность растительных митохондрий окислять цитозольный НАД(Ф)Н, поступающий через поры наружной мембраны. А также делает излишним наличие некоторых челночных механизмов транспорта восстановленных пиридиновых нуклеотидов в матрикс, присутствующих в митохондриях животных (Rasmusson et al., 2004).

Между собой альтернативные НАД(Ф)Н-дегидрогеназы различаются по кинетике 2001), предполагают что некоторые из них светорегулируемые (Elhafez et al., 2006).

В настоящее время считается что физиологическая роль этих ферментов связана с контролем редокс-состояния пулов НАД(Ф)Н в матриксе и цитозоле (Elhafez et al., 2006; Escobar et al., 2004).

ЭТЦ митохондрий растений содержит альтернативную терминальную оксидазу (АО). Активность этого фермента не подавляется цианидом и другими ингибиторами IV комплекса, поэтому дыхание, осуществляемое с участием АО, получило название цианид-резистентное (Bendall, Bonner, 1971). Данный фермент специфически подавляется салицилгидроксамовой кислотой (СГК) (Schonbaum et al., 1971). АО представляет собой убихинол-кислород-оксидоредуктазу и переносит электроны с пула убихинонов непосредственно на кислород с образованием воды (Siedow et al., 1995). Данный фермент осуществляет транспорт, минуя два пункта сопряжения (II и III), тем самым существенно снижает эффективность дыхания (Шугаев, 1999). Ряд исследований позволил предположить, что основной функцией АО является предотвращение

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

перевостанновленности переносчиков и, как следствие, образования АФК, а так же генерация тепла (Juszczuk, Rychter, 2003; Шугаев, 1999). Подробнее функционирование и возможная физиологическая роль данного фермента будут рассмотрены в главе 2.4.

В последние годы появляется все больше сообщений о наличии на внутренней мембране митохондрий растений разобщающих белков, что делает их более сходными с митохондриями животных. В растительных митохондриях обнаружены аналоги UCP-белков митохондрий животных (Vercesi, 2001). Данные белки играют роль разобщителей окислительного фосфорилирования и способствуют генерации тепла (Grabelnych et al., 2003). По мнению ряда авторов, растительные клетки не способны значительно повышать свою температуру и функция разобщающих белков может не ограничиваться генерацией тепла. Так, они могут снижать показания мембранного потенциала, что позволяет увеличить скорость транспорта электрона в ЭТЦ даже при высоком фосфатном потенциале (АТФ/АДФ). Это, в свою очередь, позволяет поддерживать работу ЦТК, а также избежать насыщение активных центров комплексов дыхательной цепи электронами и тем самым предотвращать генерацию АФК (Грабельных, 2005).

Белки всех альтернативных переносчиков, а также разобщающие белки кодируются ядерным геномом. Несмотря на то, что в ЭТЦ митохондрий растений присутствуют ряд альтернативных путей переноса электрона, большинство авторов подразумевают под альтернативным только перенос, осуществляемый посредством АО (Шугаев, 1999; Грабельных, 2005). Следует также отметить, что наличие нескольких ферментов, выполняющих одну и ту же функцию, указывает на пластичность функционирования растительных митохондрий.

В настоящее время в литературе широко обсуждается идея жесткой супермолекулярной организации ЭТЦ (Лузиков, 2009; Dudkia et al., 2006).

Согласно этим представлениям, комплексы и отдельные ферменты формируют суперкомплексы. Например, показано существование суперкомплексов I+IIIB2, B IIIB2+IVB1-2, I+IIIB2+IVB1-4 и VB2 (Dudkia et al., 2006). Для представителей семейства

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

бобовых - фасоли и гороха в настоящее время показано существование только суперкомплекса I+IIIB2 (Taylor et al., 2005). Для этого комплекса показана его высокая степень накопления (до 50%), по сравнению с содержанием отдельных комплексов I и III, и его высокая стабильность. Предполагают, что суперкомплексы могут формироваться и распадаться при различных внешних условиях, также показана тканеспецифичность распространения суперкомплексов (Лузиков, 2009;

Dudkia et al., 2006). Их физиологическая роль до конца не ясна, но считается, что динамика существования отдельных комплексов и формирование суперкомплексов могут быть вовлечены в ответную реакцию митохондрий при действии различных внешних факторов. Кроме того, предполагают, что формирование суперкомплекса I+IIIB2 может регулировать альтернативное дыхание в растениях, т.к. происходит ограничение доступа альтернативной оксидазы к субстрату – убихинолу, который является восстановленной формой убихинона (Лузиков, 2009; Dudkia et al., 2006).

2.2. Организация митохондриального генома.

2.2.1. Особенности организации генома митохондрий растений.

В начале 60-х годов было обнаружено, что митохондрии содержат собственную ДНК (мтДНК) (Nass, Nass 1963). Начиная с этого момента, ведется постоянное изучение организации митохондриального генома (митохондриона) различных систематических групп организмов, среди которых наряду с общими свойствами в строении генома, были выявлены значительные различия.

Изначально предполагали, что подобно мтДНК животных, растительная мтДНК представляет собой кольцевую молекулу, включающую весь набор генов.

Однако, более поздние исследования показали что, митохондрион не всегда представлен кольцевой молекулой. Геном митохондрий может быть представлен кольцевыми и линейными молекулами в различных соотношениях, а также он может находиться в виде нескольких взаимозамкнутых колец (так называемых котенированных форм). Помимо кольцевых молекул, содержащих полную последовательность мтДНК, существуют дискретные молекулы, состоящие из отдельных неполных последовательностей. Они характерны для каждого вида и

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

содержат меньшее количество генов (Backert et al., 1997). Предполагают, что молекулы мтДНК в определенных местах связываются с внутренней мембраной митохондрий, организуя структуры подобные бактериальным нуклеоидам (Даниленко, Давыденко, 2003).

Помимо геномной ДНК, для митохондрий многих видов растений, включая представителей семейства Fabacea, показано наличие генетического материала в форме плазмид (Kemble, Bedbrook, 1980; Palmer et al., 1983; Schardl et al., 1984).

Это линейные или кольцевые ДНК и/или РНК плазмиды, не гомологичные геномной мтДНК. Их подразделяют на кольцевые ДНК-плазмиды, линейные ДНКплазмиды и РНК-плазмиды. Плазмиды имеют размер от 1 до 30 т.н.п. и их отличительной способностью является способность к автономной репликации.

Значение плазмид в митохондриях широко обсуждается (Даниленко, Давыденко, 2003). Кольцевые ДНК-плазмиды не несут открытых рамок считывания и не имеют определенной вторичной структуры. Скорее всего, они выполняют регуляторную функцию. Показано, что их утрата не оказывает каких-либо разрушительных последствий на растение (Halden et al., 1989). Секвенирование нуклеотидной последовательности ряда линейных ДНК-плазмид выявило их гомологию с вирусными РНК-полимеразами. Эти плазмиды способны интегрироваться в митохондриальный геном (Даниленко, Давыденко, 2003). РНК-плазмиды менее всего изучены. Предполагается, что в их репликации и транскрипции участвует РНК-зависимая РНК-полимераза вирусного типа (Reisner, Gross, 1985). Возможно, они являются реликтами прошлых инфекций - РНК-вирусы которые встроились в геном в процессе эволюции (Dodds et al., 1984).

Геном митохондрий растений имеет большие размеры, чем у животных и грибов, и может составлять от 180 до 2500 т.п.н. Набор митохондриальных генов растений принципиально не отличается от других эукариот, но их геном менее компактен, так как кодирующие последовательности разделены довольно протяжёнными не кодирующими участками (Даниленко, Давыденко, 2003).

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Рис. 3. Структура митохондриального генома Arabidopsis thaliana.

На рис. 3 схематически изображена структура и состав митохондриального генома A. thaliana. Увеличение размера генома можно объяснить: 1) увеличенным количеством интронов (преимущественно группы 2) (Schuster, Brennicke, 1994); 2) большим число повторов, которые могут включать, как кодирующие, так и некодирующие участки; 3) наличием ДНК, имеющих ядерное, пластидное и вирусное происхождение (Marienfeld et al., 1999). Некодирующие участки часто уникальны для определенного вида и могут достигать составлять до 50% от всей мтДНК (Хворостовский и др., 2002).

Повторы участков ДНК митохондриальных геномов растений разделяют на большие и малые. В мтДНК растений разных видов их количество различается (Даниленко, Давыденко, 2003). Большие повторы имеют размер 1-10 т.п.н., однако встречаются повторы меньшего размера (Hanson, Folkerts, 1992). Наиболее протяженные повторы идентифицированы у линий с цитоплазматической мужской стерильностью. В результате гомологичной рекомбинации по этим повторам возникают субгеномные молекулы меньших размеров (Даниленко, Давыденко, 2003). Такая реорганизация мтДНК происходит при старении растительной ткани.

Субгеномные молекулы могут возникать при различных стрессовых воздействиях, что приводит к увеличению числа копий генов или к генетическим перестройкам, в

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

результате которых ген может попадать под более сильный промотор. Однако не все повторяющиеся последовательности способны к рекомбинации и их функция до сих пор остается не изученной (Даниленко, Давыденко, 2003; Хворостовский и др., 2002).

Малые повторы имеют размер от 6 до нескольких сот п.н. (Andre et al., 1992).

Предполагают, что они играют роль регуляторов генной экспрессии, т.к.

расположены рядом с активно функционирующими генами (Spenser et al., 1992).

Кроме того, они участвуют в редких рекомбинациях, приводящих к дивергенции митохондриальных геномов близкородственных видов, в частности, к мутациям внутри одного гена или к образованию химерных генов (Folkerts, Hanson, 1992;

Backert et al., 1997). Высказывают предположение, что посредством рекомбинаций по малым повторам создается ряд субмолекул, которые могут служить эволюционным резервом для преобразования мтДНК при изменении внешних условий (Small et al., 1989; Даниленко, Давыденко, 2003).

В полностью секвенированном митохондриальном геноме A. thaliana идентифицировано 57 генов и обнаружено 85 открытых рамок считывания с неизвестной функцией, часть из которых, возможно, кодирует специфические для растений белки (табл. 1) (Useld et al., 1997). Интересен тот факт, что мтДНК всех эукариот не содержит полный набор тРНК, необходимых для трансляции.

Отсутствующие тРНК кодируются ядром или пластидами, и импортируются из цитоплазмы в митохондрию (Колеснеченко и др., 2004). Следует также отметить, что митохондрии высших растений используют универсальный, а не модифицированный генетический код, характерный для животных и грибов (Jukes, Osawa, 1990).

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Гены, кодируемые мтДНК Arabidopsis thaliana (по Unseld et al., 1997).

Открытые рамки считывания с неизвестной функцией 2.2.2. Основные пути регуляции экспрессии митохондриальных генов растений.

Специфика структурной организации митохондриального генома растений во многом определяет особенности его экспрессии. При транскрипции большинства индивидуальных генов образуется несколько стабильных РНК различного размера (Mackenzie, McIntoch, 1999; Даниленко, Давыденко, 2003). Это обусловлено наличием множественных сайтов инициации и терминации транскрипции, посттранскрипционным расщеплением молекул РНК, вариантами сплайсинга и модификацией 5’- и 3’- концевых участков, а так же существованием нескольких копий одного гена под промоторами, различными как по силе транскрипции, так и по специфичности (Mackenzie, McIntoch, 1999; Хворостовский и др., 2002). Обычно транскрипты имеют размер больше, чем кодирующая область гена, и включают длинные не транслируемые области на 5’- и 3’- концах молекулы

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

(Binder et al., 1996). Набор различных по длине матриц (так называемый транскрипционный профиль) специфичен для клеток, тканей и органов любого организма, он изменяется с возрастом и под влиянием условий внешней среды (Smart et al., 1994).

Регуляция экспрессии генов может осуществляться на различных уровнях, на уровне инициации транскрипции определяется структурой промоторной области, активностью РНК-полимеразы и транскрипционных факторов, а также реорганизацией митохондриального генома (Хворостовский и др., 2002).

Рис. 4. Организация промоторных зон митохондриальных генов однодольных и двудольных растений. Где W = A или T, R = A или G, x = любой нуклеотид; рамкой выделен коровый мотив промоторной зоны.

В 90-х годах впервые была определена последовательность промоторных участков некоторых митохондриальных генов растений. На рис. 4 представлены последовательности промоторных областей однодольных и двудольных растений.

Как оказалось, основным мотивом промоторных областей является последовательность CRTA (где, R = A или G) (Fay, Marechal-Drouard, 1999).

Однако у однодольных растений эта последовательность не является строго консервативной. Часто CR последовательность может быть заменена на последовательность TR, YY (Y = C или T) или AR. Кроме основного, митохондриальные гены однодольных растений имеют два консервативных участка RaaWW и axWaa (W = A или T, где х – любой нуклеотид) (рис. 4). Они расположены на расстоянии одного-двух нуклеотидов до и после основного мотива, соответственно(Fay, Marechal-Drouard, 1999). Для митохондриальных

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

генов двудольных характерна наибольшая консервативность в последовательности корового элемента. Кроме этого элемента в промоторной зоне выявлена типичная последовательность, включающая CNM-бокс (CRTAaGaGA) и расположенную непосредственно перед ним AT–богатую последовательность (AATaK, где K = G или T), строго консервативное основание W на расстоянии - 9 п.н. и два консервативных основания A и R на расстоянии + 4 п.н. от CNM-бокса (рис. 4) (Briner et al., 1995; Fay, Marechal-Drouard, 1999). Показано, что AT–бокс и CNMбокс функционируют вместе и участвуют во взаимодействии с РНК-полимеразой или транскрипционными факторами (Dombrowski et al., 1999).

Как для однодольных, так и для двудольных растений характерно наличие активно транскрибируемых генов, у которых район инициации транскрипции не имеет ничего общего с описанными типичными последовательностями. Это характерно, в частности, для гена рибосомной РНК 26S Solanum tuberosum и A.

thaliana (Даниленко, Давыденко, 200). Наблюдаемые различия в структуре промоторных зон могут обуславливать разницу в силе промоторов за счет изменённого сродства к РНК-полимеразе и транскрипционным факторам (Хворостовский и др., 2002). Для многих митохондриальных генов характерно наличие нескольких промоторов, которые отличаются по степени активности (Unseld et al., 1997; Notsu et al., 2002; Clifton et al., 2004). Например, ген atp кукурузы имеет 6 активных промоторов, отделённых несколькими сотнями пар нуклеотидов друг от друга (Mulliga et al., 1988).

У большинства растений транскрипция митохондриальных генов осуществляется РНК-полимеразой фагового типа, которая кодируется ядерным геномом (RpoT1) (Weihe, 2004). Для двудольных так же характерно наличие еще одной РНК-полимеразы фагового типа ядерного кодирования. Если РНКполимераза первого типа специфична исключительно для митохондрий, то другая выявлена не только в митохондриях, но и в пластидах RpoT2 (Hedtke et al., 2000;

Richter et al., 2002). Все РНК-полимеразы фагового типа, кодируемые ядром, высоко гомологичны между собой и имеют в структуре гена 18 интронов,

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

расположение которых совпадает у всех изученных генов РНК-полимераз цветковых растений (Даниленко, Давыденко, 2003). Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей РНК-полимераз различных организмов с митохондриальными РНК-полимеразами растений Triticum aestivum и A. thaliana показал, что у последних присутствует делеция в домене, отвечающем за распознавание области промотора (Даниленко, Давыденко, 2003). Вероятно, в этом случае функция узнавания промоторов РНК-полимеразой осуществляется с помощью транскрипционных факторов, которые наравне с ферментом способны распознавать сайты инициации транскрипции. В то же время показано, что для связывания РНК-полимеразы с промотором и инициации синтеза РНК in vitro дополнительные транскрипционные факторы не требуются (cм. обзор Хворостовский и др., 2002). Это указывает на то, что транскрипционные факторы в митохондриях растений, скорее всего, служат для активации специфической транскрипции.

Изучение факторов транскрипции митохондрий высших растений активно развивается. К настоящему времени показано наличие транскрипционного фактора, который кодируется геномом T. aestivum (Ikeda, Gray, 1999). Появляется все большее количество сообщений о новых потенциальных факторах транскрипции белковой природы. Среди генов таких факторов встречаются гены, обладающие высокой гомологией с соответствующими генами человека и дрожжей, и, в то же самое время, известны уникальные гены, не имеющие гомологии с генами известных факторов транскрипции митохондрий других организмов (cм. обзоры Хворостовский и др., 2002; Binder, Brennicke 2002;

Даниленко, Давыденко, 2003).

Регуляция экспрессии генов в митохондриях на уровне транскрипции может осуществляться так же за счет перестройки генетического аппарата. Здесь речь идёт о реорганизации промоторных зон в результате гомологичной рекомбинации между субгеномными молекулами, а так же возможно накопления отдельных субгеномных молекул, что приводит к изменению дозы конкретных генов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Экспериментальные данные указывают на ядерный контроль этого процесса. (cм обзоры Хворостовский и др., 2002; Binder, Brennicke 2002; Даниленко, Давыденко, 2003) На этапе посттранскрипционных изменений регуляция экспрессии осуществляется за счет различных вариантов сплайсинга, модификации 5’- и 3’концов транскриптов и редактирования предшественника мРНК (Giege, Brennicke, 2001). Многие гены митохондрий высших растений транскрибируются в виде моноцистронного продукта, хотя также наблюдается синтез и полицистронных РНК. Поэтому образование зрелого 5’-конца мРНК иногда определяется процессингом 3’-концевого участка предшествующего гена. Часто в состав полицистронных матриц входят тРНК. 5’-конец моноцистронных матриц может нести консервативные мотивы, которые служат сигналами для процессинга. На 3’концевых участках может происходить образование шпилек, которые стабилизируют структуру мРНК, скорее всего, за счёт взаимодействия с белками.

Кроме того, на 3’-концевом участке транскрипта может происходить нематричное присоединение нуклеотидов, в 80% такие РНК заканчиваются тринуклеотидом ССА. Это происходит наравне с полиаденилированием. Эти два процесса представляют собой альтернативный вариант процессинга по одной и той же позиции. Причем, если первый процесс обуславливает увеличение времени жизни молекулы мРНК, то полиаденилирование является сигналом для ее деградации (cм.

обзоры Хворостовский и др., 2002; Binder, Brennicke 2002).

РНК митохондриальных генов подвергается редактированию в большей степени в сравнении с редактированием РНК митохондрий других организмов. Его интенсивность может достигать нескольких десятков сайтов на тысячу нуклеотидов. В 80% случаев редактирование приводит к замене единичных нуклеотидов и, как следствие, аминокислот. Главным образом, осуществляется замена C на U, что приводит к повышению гидрофобности соответствующих белков (cм. обзоры Giege, Brennicke, 2001; Хворостовский и др., 2002). В результате редактирования могут появляться и исчезать старт- и стоп-кодоны для

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

открытых рамок считывания. Нетранскрибируемые последовательности на 5’- и 3’концевых участках, интроны и межгенные области полицистронных матриц также подвергаются редактированию (cм. обзор Хворостовский и др., 2002).

После транскрипции предшественники мРНК подвергаются сплайсингу (или вырезанию интронов) с образованием зрелой мРНК, с которой осуществляется трансляция. В митохондриях растений описан цис- и транс-сплайсинг. Процессинг и редактирование осуществляются продуктами ядерного генома. Изучение сплайсинга в митохондриях Nicotiana tabacum показало зависимость этого процесса, по крайней мере, от одного ядерного гена Мs1 (cм. обзоры Хворостовский и др., 2002; Binder, Brennicke 2002; Даниленко, Давыденко, 2003).

митохондриальной трансляции. Она обусловлена белками, кодируемыми ядерным геномом, а также наличием нескольких типов инициирующих кодонов и вовлечением 5’-нетранслируемой области в инициацию трансляции (cм. обзоры Binder, Brennicke 2002; Даниленко, Давыденко, 2003; Millar et al., 2005).

Несмотря на контроль созревания мРНК, возможен синтез белка с матриц, прошедших неполное редактирование или некорректный сплайсинг. Однако большая часть таких белков подвергается деградации, таким образом, осуществляется регуляция на посттрансляционном уровне (Millar et al., 2005).

В настоящее время считается, что ключевую роль в регуляции экспрессии посттранскрипционные модификации РНК (cм. обзоры Хворостовский и др., 2002;

Binder, Brennicke 2002; Даниленко, Давыденко, 2003). Соотношение интенсивности синтеза мРНК (определяется методом run-on транскрипции) отдельных субъединиц единого белкового комплекса могут значительно отличаться от соотношения содержания соответствующих мРНК и, тем более, белковых компонентов данного комплекса. Динамическое равновесие синтезируемых молекул (steady-state level) значительно ближе к соотношению белковых компонентов комплекса (Binder et al.,

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1996). Это указывает на то, что в митохондриях существуют процессы, уравновешивающие различия в транскрипционной активности.

Экспрессия митохондриального генома растений находится, главным образом, под контролем ядра. Как было отмечено раннее, сама мтДНК кодирует субъединицы комплексов дыхательной цепи и компоненты системы трансляции (cм. обзоры Одинцова, Юрина, 2002; Даниленко, Давыденко, 2003). Все трансляционного аппарата митохондрий кодируются ядерным геномом. Ядерный контроль может осуществляться на всех уровнях реализации генетической информации посредством контроля синтеза полипептидов, вовлеченных в тот или иной процесс. Ядро имеет множество точек контроля, куда входят РНКполимеразы и транскрипционные факторы, молекулы тРНК, белки, осуществляющие процессинг, редактирование и сплайсинг матричных молекул;

трансляционные и посттрансляционные регуляторные факторы. Кроме того, экспрессия митохондриальных генов растений связана с реорганизацией митохондриального генома на уровне транскрипции генов, а так же с функционированием третьего генома клетки – пластидного генома, так как ряд пластидных тРНК экспортируются в митохондрии (cм. обзоры Binder, Brennicke 2002; Даниленко, Давыденко, 2003; Millar et al., 2005).

Для формирования функционально активных митохондрий требуется особый контроль над синтезом субъединиц митохондриальных белковых комплексов.

Основная масса растворимых митохондриальных белков матрикса и некоторая часть мембранных белков синтезируется в цитоплазме и транспортируется в стехиометрического соотношения этих субъединиц в белковых комплексах митохондриям необходимо поддерживать постоянный информационный контакт с ядром. Роль ядерно-митохондриальных взаимодействий еще более возрастает при действии различных факторов, приводящих к изменению процессов анаболизма и

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

катаболизма клетки (см. обзоры Giege, Brennicke, 2001; Лузиков, 2009). За счет большего вовлечения альтернативных путей, ферменты которых полностью кодируются ядром, происходят изменения в направлениях транспорта электронов по ЭТЦ (см. обзор Грабельных, 2005). Такая тонкая регуляция биогенеза и функционирования митохондрий осуществляется за счет взаимодействия трех важнейших клеточных компартментом: ядра, митохондрий и пластид (Millar et al., 2004).

2.3. Альтернативная оксидаза.

2.3.1. Структура и функция белка.

К настоящему времени альтернативная оксидаза обнаружена у всех высших растений, у многих эукариотических водорослей, а также у некоторых грибов и простейших. Недавние исследования показали наличие гомологов альтернативной оксидазы у -протеобактерий и некоторых видов животных. У цианобактерий были идентифицированы гомологи терминальной оксидазы пластид, которая отдаленно родственна АО (см. обзоры Juszczuk, Rychter, 2003; Moore, Albure 2008; Albury et al., 2009).

Как уже было отмечено (см. главу 2.1.2.) АО является альтернативной терминальной оксидазой ЭТЦ митохондрий, которая связана с основным цитохромным путем на уровне пула убихинона. Активация АО позволяет растению весьма эффективно переключать поток электронов с цитохромной электронтранспортной цепи на диссипирующий энергию альтернативный путь дыхания.

Среди различных видов растений молекулярный вес зрелого белка АО варьирует в диапазоне 32-3637 кДа (см. обзоры Шугаев, 1999; Грабельных, 2005;

Moore, Albure 2008), что составляет приблизительно 280 а.о. АО является гидрофильным белком с двумя гидрофобными районами протяженностью около 20 а.о. На основании данных гидропатии была предложена модель (рис. 5), согласно которой альтернативная оксидаза погружена во внутреннюю мембрану митохондрий двумя гидрофобными -спиральными участками, так называемыми трансмембранными доменами. Данная модель впоследствии была подтверждена

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

экспериментально в работах с использованием детергентов различной природы.

При этом N- и C-концевые участки белка выступают на поверхности органеллы со стороны матрикса, образуя 4 спирали (см. обзоры Грабельных, 2005; Moore, Albure 2008).

По структуре каталитического центра АО относят к семейству железосодержащих белков. В это семейство также входят метановые монооксигеназы (ММО), R2 субъединица рибонуклеиновой редуктазы, стирол ацильные десатуразы. Каталитический центр альтернативной оксидазы является двуядерным и миксвалентным, т.е. содержит Fe (II) и Fe (III) ионы. В связывании железа в активном центре АО участвует консервативная последовательность GluХХHis.

Большинство альтернативных оксидаз содержат два таких мотива в позициях 217а.о. и 319-322 а.о., а также консервативный глутамин в позиции Glu178 и Glu268. Каждый ион железа формирует 4 хелатные связи. Это взаимодействие необходимо для правильного сворачивания молекулы и формирования функционально активного каталитического центра (см. обзоры Moore, Albure 2008;

Albure et al., 2009).

Рис. 5. Модель строение мономерного белка альтернативной оксидазы (модифицированная модель Andersson, Nordlund, 1999 по Albure et al., 2009).

С помощью сайт-направленного мутагенеза было показано наличие дополнительных консервативных аминокислотных остатков Tyr253, Tyr266,

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Tyr275, Tyr299, Trp206 и Trh179, которые являются ключевыми в отношении активности АО. Предполагают, что Tyr275 и Trp206 являются донорами электронов при формировании хелатных связей, кроме того, Trp206 может участвовать в ассоциации белка с мембраной. Два других консервативных сайта Tyr266 и Tyr299 также, вероятно, задействованы в транспорте электрона. Однако нельзя исключить, что при замене этих аминокислот происходит ингибирование функции белка в результате нарушений в его нативной структуре. Расположенный рядом с хелатирующим глутаматом Trh179 влияет на активность каталитического центра и при точечной мутации в этой позиции снижается сродство АО к кислороду (т.е. константу Михаэлиса, Кm) почти в 4 раза с 18 до 5 мкМ. До сих пор не получена кристаллографическая структура АО, и поэтому невозможно идентифицировать ее кислород-связывающий сайт. Однако идентифицированы несколько аминокислотных остатков, которые, вероятно, вовлечены в функцию обеспечения доступа кислорода или входят в состав сайта его связывания. Такой аминокислотой является Cys127, которая помимо перечисленных функций, вероятно, может участвовать в регуляции активности АО пировиноградной кислотой (см. обзоры Moore, Albure 2008; Alburу et al., 2009). Ряд авторов выдвинули гипотезу о механизме такой регуляции. Согласно их предположению, механизм сходен с так называемым «карбоксилатным шифтом», регулирующим Всубъединицу ММО. Конформационные изменения, вызывающие изменения связывания атомов железа, могут вызывать движение спиралей, обеспечивая тем самым увеличение доступа кислорода к активному центру (Berthold et al., 2002;

Berthold, Stenmark, 2003).

Кроме каталитического центра, в котором происходит восстановление кислорода до воды, АО содержит сайт, связывающий убихинол. Структура гидрохинон-связывающего сайта белков до сих пор не изучена в достаточной мере, чтобы представить его универсальную модель. Однако были идентифицированы некоторые элементы для связывания убихинона. Формирование убихинолсвязывающего кармана осуществляется за счет взаимодействия двух

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

трансмембранных доменов, которые обеспечивают позицию убихинола на поверхности мембраны. Биоинформационный анализ показал наличие возможного сайта связывания убихинола АО, который локализован в гидрофобной части между 2 и 3 спиралями. В этой модели присутствуют консервативная пара His261 и Arg262. Показано, что эти аминокислотные остатки присутствуют в убихинолсвязывающих сайтах других молекул, например, у сукцинат-убихинол оксидоредуктазы. Этот участок наиболее консервативен у растительных АО, а также у АО других организмов. Предположительно, эта пара представляет собой убихинон-связывающий мотив. Консервативный Tyr253, расположенный в гидрофобном участке так же вовлечен в связывание убихинола. Кроме того, показана значимость Gln242, Asn247, Arg262 и Ser256 в связывании убихинона (см.

обзоры Moore, Albure 2008; Albure et al., 2009).

Активности альтернативной оксидазы регулируется на посттрансляционном уровне. В частности, у растений было установлено, что образование димеров за счет дисульфидной ковалентной связи приводит к резкому снижению активности фермента. Иными словами, АО проявляет свою максимальную активность в виде мономера. В тоже время известно, что в изолированных митохондриях активность альтернативной оксидазы заметно усиливается при добавлении -кетокислот, особенно пирувата. Ряд авторов предполагает наличие связи между этими двумя регуляторными механизмами, поскольку установлено, что альтернативная оксидаза не стимулируется -кетокислотами при образовании дисульфидных связей между субъединицами (см. обзоры Грабельных, 2005).

Альтернативная оксидаза не чувствительна к цианиду, азиду, антимицину А, миксотиазолу и углекислому газу. Перенос электронов по альтернативному пути ингибируется производными гидроксамовой кислоты и n-пропилгалатом (Day et al., 1994).

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

абиотических факторов.

АО играет важную роль при опылении растений семейства ароидных Araceae. Во время распространения пыльцы в клетках початка наблюдается высокая активность дыхания по альтернативному пути, в результате чего генерируется тепло, температура повышается на 10-15P0 ароматические вещества, распространяясь лучше, привлекают насекомых. Полагают, что эта реакция является частью механизма, контролирующего процессы репродукции, потому что высокая температура необходима для испарения аттрактантов, привлекающих насекомых-опылителей (Elyhon et al., 1989). Более поздние работы показали участи АО в гененрации тепла также в «нетермогенных» растениях при гипотермии (Vojnikov et al., 1984; Grabelnych et al., 2003). Хотя некоторые авторы считают, что это не может приводить к физиологически значимому увеличению температуры в тканях растений (Breidenbach et al., 1997).

Другой функцией АО является её антиоксидантная роль (Moller, 2001b).

Установлено, что в стрессовых условиях, а также в присутствии ингибиторов цитохромного пути наблюдается образование супероксида и перекиси водорода.

Была предложена гипотеза (Purvis, Shewfelt, 1993), согласно которой функция альтернативной оксидазы состоит в предотвращении образования АФК путем поддержания пула восстановленного убихинона на более низком уровне, при котором не образуются АФК (Moller, 2001b). В последние годы появляется много данных о распределении электронов между цитохромным и альтернативным путями, которые свидетельствуют, что АО функционирует в условиях неполного насыщения электронами цитохромного пути, и видимо, выполняет и другие функции (Mackenzie, McIntoch, 1999).

Изучение АО, как части антиоксидантной защиты, позволило определить ее роль в программируемой клеточной смерти (Ванюшин, 2001). Показано, что предварительно подверженные аноксии клетки Glycine max (G. max), во время которой происходила активация АО, устойчивы к программируемой клеточной

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

смерти, вызванной НB2О2, в то время как ингибиторы АО снижают эту устойчивость (Amor et al., 2000). По мнению некоторых авторов, активация АО может представлять важный механизм, предотвращающий запуск программированной клеточной смерти (Robson, Vanlerberghe, 2002; Vanlerberghe et al., 2002).

Кроме выше перечисленных функций, АО играет важную роль в поддержании ЦТК и гомеостаза растений. На последнее указывают работы, в которых показана индукция АО в мутантах, затрагивающих пластиды. Например, у митохондриальных транскриптов АО.

Известно также, что АО активируется в ответ на большое число различных типов неблагоприятных внешних воздействий: низкие и высокие температуры (Grabelnych et al., 2004), окислительный стресс (Polidoros et al., 2005), недостаток микроэлементов, в частности фосфата и азота (Sieger et al., 2005), различные инфекции (Lacomme,Roby, 1999), световой стресс, увеличение концентрации СОB2 и B воздействие гербицидами (Gaston et al., 2003). При этом постулируется, что АО играет важную роль в быстрой адаптации к стрессовым условиям. В настоящее время считается, что АО не только участвует в ответной реакции на стресс, но и играет важную роль в его идентификации. Однако, некоторые стрессы, например холод, не всегда индуцируют АО на каком-либо уровне.

Экспрессия генов АО изменяется при различных митохондриальных мутациях, в ответ на обработку ингибиторами ЭТЦ, в результате чего нарушаются митохондриальные функции, а также при воздействии гормонами.

АО кодируется у растений подсемействами двух ядерных генов, Аох1 и Аох2, подсемейства зависит от вида растения. Считается, что Аох1 гены экспрессируются в ответ на стресс и представлены у обоих классов. Представители Аох экспрессируются конститутивно. Например, у G. max выделен один ген Аох1 и два Аох2а и Аох2b. Гены АО обладают высокой изменчивостью последовательностей,

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

которая достигается за счет множественных единичных нуклеотидных замен, вставками и за счет гетерогенности 3’- нетранслируемой области. Экспрессия различных представителей обоих подсемейств может быть тканеспецифичной и зависеть от онтогенетической стадией развития. При исследовании АО G. max показана экспрессия Аох2b в корнях, а Аох1 и Аох2а в семядолях, которая совпадала с накоплением соответствующих белков в этих органах. При прорастании проростков G. max показано увеличение количество белка АО в семядолях, тогда как у каждой из изоформ уровень накопления мРНК отличался от уровня соответствующего белка. В данном случае в ходе развития происходило постепенное увеличение экспрессии Аох2b и снижение экспрессии Аох2a.

Ортологичные гены могут иметь сходное регулирование, как, например, ген Аох2а G. max и ген Aох2b Vigna unguiculata (V. unguiculata). Однако это характерно не для всех видов растений.

Общим результатом всех видов абиотических и биотических стрессов является увеличение скорости образование активных форм кислорода (АФК).

Основываясь на результатах ранних исследований, были выдвинуты предположения, что индукция экспрессии АО вызывается именно окислительным стрессом именно перекисью. В настоящее время показано, что существуют множественные сигнальные пути, ведущие к индукции Аох генов, которые могут быть зависимыми или независимыми от АФК. Например, в промоторной области гена Аох1а A. thaliana были идентифицированы последовательности, вовлеченные в активацию экспрессии этого гена антимицином А (ингибитором комплекса ЭТЦ) и монофлюорацетатом (ингибитором ЦТК). Нужно отметить, что если в первом случае образование АФК имеет место, то при ингибировании ЦТК их накопление не показано. Кроме того, в ответ на различные стрессовые, а также физиологические воздействия в клетках снижается потенциал плазматической мембраны и активация ионных каналов, а это сопровождается накоплением СаP2+ P.

Увеличение последнего запускает каскад реакций, в результате которых происходит активация защитных генов, включая АО (Меденцев и др., 1999).

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Экспрессия различных представителей подсемейств происходит независимо друг от друга, однако для A. thaliana показано (Clifton et al., 2007), что при инактивации гена Аох1а происходит усиление экспрессии Аох1d, но в меньшей степени, чем необходимо для полной компенсации отсутствующей формы белка специфической ролью каждого из них при различных стрессах. При этом различные сигнальные пути вызывают специфическую экспрессию генов АО.

Считается, что профиль экспрессии АО определяется иерархией регуляторных комбинацией транскрипционных факторов.

Показано так же, что экспрессия генов АО отличается у линий одного вида чувствительных или устойчивых к стрессу (см. обзор Polidoros et al., 2009). В исследованиях на линиях V. unguiculata, отличающихся по солеустойчивости, соответствующих белков и максимальная скорость альтернативного пути в корнях (Costa et al., 2010). При осмотическом стрессе и засолении уровень экспрессии Аох2b различался, тогда как уровень экспрессии Аох1 и Аох2а в этих линиях оставался неизменным. Также у чувствительных и устойчивых линий Medicago truncatula в условиях засоления наблюдали изменения в экспрессии Аох1а, при этом ответ зависел от длительности обработки. Таким образом, экспрессия различных генов АО имеет видо- и генотип-специфичность. В литературе активно последовательностей генов АО и возможность идентификации специфических маркерных участков для предсказания профиля экспрессии.

На уровне ткани и целого растения изменение активности альтернативной оксидазы проявляется в изменении уровня цианид-резистентного (альтернативного пути) дыхания. Однако следует помнить, что в этот показатель вносит свой вклад «остаточное» дыхание, которое обусловлено поглощением кислорода в реакциях, прямо не связанных с дыханием и протекающих в цитозоле и пероксисомах. Оно

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

может варьировать от 5 до 30 % от общего уровня дыхания. Хотя связь между накоплением белка АО и его активностью альтернативного пути описана в ряде работ, однако она не всегда имеет место. Показано, что активация альтернативного пути in vivo под воздействием света разной интенсивности на растения A. thaliana достигается за счет изменения активности фермента, в то время как количество белка не изменяется. Также следует отметить, что в этой работе показано, что ограничение доступа растворимых сахаров может быть фактором, понижающим интенсивность дыхания по цитохромному пути, наряду с тем, что в ряде других работ показана роль АО в расходовании излишних простых углеводов. Ключевую роль в активации экспрессии генов АО при повышенном углеводном статусе клетки отводят цитрату и предполагают, что данная регуляция осуществляется посредствам протеинкиназ.

Таким образом, активность альтернативного пути in vivo при различных условиях определяется совокупной активностью различных членов семейства АО, включая уровень экспрессии, количество белка, активность самого фермента.

Степень выраженности этого процесса зависит от вида растения и его генотипа.

В последнее время в литературе широко обсуждается возможность использования АО в качестве маркера устойчивости растений (Arnholdt-Schmitt et al., 2006), однако, авторы отмечают ограниченность доступных данных.

Необходимо проводить дальнейшие исследования, чтобы установить строгую корреляцию экспрессии генов АО с устойчивость растений.

2.4. Роль фитогормонов в регуляции интенсивности дыхания растений.

Митохондрии играют важную роль в функционировании, как единичной клетки, так и организма в целом, что является причиной стремительно возрастающего интереса к их изучению. На функционирование митохондрий растений существенное влияние оказывают многие регуляторные факторы, включая фитогормоны.

Вся жизнь растительных организмов, начиная от оплодотворения яйцеклетки и заканчивая гибелью организма, находится под контролем фитогормонов. Они

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

участвуют в ответе растений на внешние воздействия, в частности, на формирование устойчивости растений к экстремальным условиям окружающей среды (Кулаева, Кузнецов, 2002;). Существуют многочисленные экспериментальные данные, показывающие регуляцию функционирования митохондрий животных гормонами (Kulinsky, Kolesnichenco, 2007), в то время, как о гормональной регуляции растительных митохондрий практически ничего не известно.

При воздействии гормонов выделяют два типа ответа: кратковременную и долговременную ответные реакции. Кратковременная ответная реакция определяет время развития ответа от нескольких секунд до нескольких минут. Долговременная ответная реакция обуславливает время развития ответа от нескольких часов до нескольких дней. При развитии ответных реакций в клетке происходит изменение активности ключевых ферментов на уровне изменения сродства фермента к субстрату и скорости ферментативной реакции. Кроме того, наблюдается изменение рН клеточной среды, изменение объема матрикса органеллы и величины дыхательного контроля. Нередко кратковременный и долговременный ответы являются взаимоисключающими процессами. Однако, если в первом случае изменения происходят на уровне активности ферментов, то во втором случае эффект наблюдается на уровне транскрипции и стабильности РНК (Kulinsky, Kolesnichenco, 2007). Следует отметить, что изучение влияния какого-либо биотического или абиотического фактора на интенсивность дыхания растений на уровне клетки, ткани или целого организма осложняется вкладом в эту величину фотодыхания. Поэтому для того, чтобы исключить искажение получаемых результатов, многие исследования проводят на этиолированных тканях.

Как уже отмечалось, существуют лишь отрывочные данные о действии таких гормонов, как салициловая кислота (СК), цитокинины, жасмоновая кислота, абсцизовая кислота и этилена на функционирование митохондрий растений.

Абсцизовая кислота защищает митохондрии от окислительного стресса, вызванного переохлаждением и помогает восстановить уровень и активность

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

митохондриальных белков СОХ2 и и субъединиц АТФ-синтазы (Prasad et al., 1994). Жасмоновая кислота вызывает увеличение уровня транскриптов генов АО в Capsicum annuum (Zhang L., Xing D., 2008). 2.4-дихлорфеноксиуксусная, как синтетический аналог ауксина, защищают клетки от цитокинин-индуцируемой смерти (Carimi et al., 2004, 2005) Влиянию СК на дыхание растений уделено сравнительно большее внимание.

Это связано с тем, что исторически альтернативный путь дыхания был впервые обнаружен у ароидных. Было показано, что в его активации участвует сигнальная молекула, которой является СК (Elthon, Mcintosh,1987). С этого момента началось всестороннее изучение влияния данного гормона на интенсивность дыхания органов и культур клеток растений различных видов ().

СК является важной сигнальной молекулой. Показано, что она регулирует многие процессы, включая термогенез (Raskin et al., 1989), ответ на атаку патогенами (Alvarez, 2000), синтез этилена (TLeslie, Romani, 1988T) и созревание плодов (Zhang et al., 2003). Кроме того, СК регулирует ответные реакции растений на некоторые абиотические стрессы, такие как УФ радиация и озон. В настоящее время влияние СК на функции митохондрий описано наиболее полно, по сравнению с данными о действии других гормонов растений.

В 1987 году были опубликованы данные о регуляции СК термогенеза ароидных, осуществляемого посредствам разобщения ЭТЦ митохондрий и увеличения потока электронов через альтернативный путь. Эксперименты на трансгенных линиях A. thaliana, дефицитных по эндогенному уровню СК, иллюстрируют роль гормона в защите растений от окислительного стресса. Эти растения экспрессируют бактериальную салицилатгидроксилазу (NahG), которая превращает салициловую кислоту в катехол, препятствуя тем самым ее накоплению в ткани. Эти трансгенные растения накапливают большее количество АФК, и они менее устойчивы к свету высокой интенсивности и атакам патогенов по сравнению с нетрансгенными линиями (TBorsaniT et al.,T 2001T).

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Антиоксидантную роль СК подтверждают результаты исследований по анализу содержания мРНК и белка АО в клетках растений, демонстрирующие активацию АО салициловой кислотой. Механизм этой активации до конца не ясен.

Известно, что СК вызывает быструю генерацию АФК, в том числе через механизмы, в которые не вовлекаются митохондрии, например, за счёт процессов, происходящих в хлоропластах или за счет ингибирования каталазы. Это служит сигналом для усиления экспрессии ядерных генов АО и впоследствии приводит к увеличению емкости альтернативного дыхания (Maxwell et al.,T 2002).

Изменение проницаемости мембран митохондрий также может быть возможным механизмом регуляции фитогормонами активности АО. Показано что СК может изменять липидный состава мембран, что влечёт за собой изменение активности мембранных белков, а также проницаемость самой мембраны (TPanicker et al.,T 2005T).

В митохондриях животных СК способна, как напрямую нейтрализовать супероксид-радикал за счёт взаимодействия с ним, так и через образование комплекса с ионом Fe. Логично предположить, что в растительных клетках одним из путей антиоксидантного эффекта СК может являться подобная нейтрализация АФК гормоном (Norman et al.,T2004T).

При инфицировании растения патогеном часть ткани отмирает, что предотвращает распространение инфекции. Эта ответная реакция носит название «реакции гиперчувствительности» и в ее развитии участвует СК. При патогенной атаке гормон активирует экспрессию генов белков, повышающих устойчивость растения к патогену. Было показано, что эффект СК чувствителен к действию ингибитора цианид-резистентного пути дыхания СГК, что может служить основанием возможного действие гормона через АО. Подтверждением участия альтернативного пути в повышении устойчивости к патогенам служат данные, полученные в экспериментах на N. tabacum при действии актиномицина А и цианида (ингибиторы основного цитохромного пути) наблюдается повышение устойчивости растения к вирусу табачной мозаики (Alvarez, 2000).

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Помимо гибели клеток в реакции гиперчувствительности, показано участие СК в развитии некроза при старении ткани, сильном засолении и осмотическом стрессе (TBorsaniT et al.,T 2001T).

Таким образом, СК индуцирует две различные ответные реакции на окислительный стресс: 1) активирует защитные системы клетки, в том числе АО, что приводит к уменьшению повреждений, вызванных АФК и 2) вызывает резкое увеличение концентрации АФК и, как следствие, гибель клеток.

В различных растительных тканях эффект действия СК зависит от чувствительности растения к данному гормону и от его концентрации в клетке.

Кроме того, при исследовании действия экзогенного гормона следует учитывать длительность обработки экзогенным гормоном и время, прошедшее после данной обработки.

В экспериментах с использованием 0.02 мМ и 0.5 мМ растворов гормона показано, что СК подавляет синтез АТФ и общее дыхание культуры клеток N. tabacum Этот эффект не связан с активацией синтеза АО de novo, т.к.

развивается в течение нескольких минут, а для синтеза белка необходимо более длительный период времени. Возможной мишенью СК являются аконитаза ЦТК, для которой показана сравнительно высокая степень сродства к СК. Ещё одной возможной мишенью при воздействии салициловой кислоты является комплекс I ЭТЦ. Так как по своей структуре СК относится к классу фенольных соединений, то она может действовать в качестве аналога убихинона, предотвращая взаимодействие дегидрогеназы с пулом убихинона. В пользу данного предположения свидетельствуют данные, показывающие, что интенсивность дыхания митохондрий из клеток, обработанных СК, сохраняется на обычном уровне, если в качестве субстрата используется НАДН, и подавляется при окислении других субстратов, например, малата или пирувата.

В экспериментах, поставленных на культуре клеток N. sylvestris, СК в концентрациях 0.01 мМ и 0.1 мМ, добавленая непосредственно перед измерением дыхания, вызывала стимуляцию общего клеточного дыхания, в то время как

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

добавление гормона в концентрации 1 мМ, приводило к его ингибированию.

Обнаруженные различия могут быть связаны с использованием разных линий клеточной культуры, которые могут отличаться, как по их чувствительности к СК, так и по возрасту клеточной культуры. В данной работе было еще показано, что обработка клеток салициловой кислотой в концентрациях 0.01 мМ, 0.1 мМ и 1 мМ в течение часа ведет к накоплению внутриклеточного содержания гормона до 0. мМ, 0.72 мМ и 4 мМ, соответственно. По истечению 24 часов эндогенное содержание гормона составляет 0.03 мМ, 0.04 мМ и 0.96 мМ, соответственно (Norman et al., 2004T).

В ряде работ было показано влияние СК на альтернативные НАДНдегидрогеназы. Обработка листьев N. tabacum 0.5 мМ СК в течение 30 мин не влияла на функцию внешних НАДН-дегидрогеназ. В то время как обработка этиолированных проростков G. max 1 мМ СК вызывала уменьшение уровня окисления внешними НАДН-дегидрогеназами через 24 часов после обработки. Это изменение уровня окисления не было связано с изменением количества данного белка.

На протяжении более 50 лет ведутся активные исследования по изучению роли цитокининов в регуляции дыхания и функционировании митохондрий (Dedolph et al., 1962). Известно, что цитокинин, наряду с ауксином, контролирует рост и развитие растения, играет решающую роль в регуляции клеточного деления и контролирует метаболизм клетки. Кроме того, цитокинин отвечает за эффект отсроченного старения. В экспериментах со срезанными начинающими желтеть листьями Nicotiana rustica добавление синтетического аналога цитокинина синтетического цитокинина (6-БАП) вызывало вторичное позеленение (Кулаева, 1973). Известно, что некоторые цитокинины подавляют дыхание растений, и этот эффект достигается за счет ингибирования интенсивности альтернативного дыхания или за счёт нарушения функционирования цитохромного пути переноса электронов на уровне комплекса I (Miller, 1979, 1980, 1982). Однако сами авторы ставят под сомнение гормональную природу данного эффекта. Это вызвано тем,

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

что, во-первых, концентрации 6-БАП, используемого в указанных работах, часто намного выше физиологической концентрации и могут достигать 1.5 мМ, в то время как содержание эндогенных цитокининов в растительном соке находится на уровне наномолей или десятков наномолей. Во-вторых, в экспериментах показано, что 6-БАП оказывает большее влияние на интенсивность дыхания, чем физиологически более активный зеатин. Это так же свидетельствует в пользу негормонального эффекта 6-БАП.

В работах С.О. Miller показана зависимость эффекта цитокинина на митохондрии от его концентрации и химической структуры. Были изучено действие различных концентраций 6-БАП в диапазоне от 0.0005 мМ до 0.5 мМ, причём автор останавливается на концентрации 0.5 мМ в качестве физиологической. При обработке 0.5 мМ 6-БАП культуры клеток G. max в течение 10 мин наблюдали снижение интенсивности дыхания ткани. По мнению автора, это снижение происходило за счет подавления альтернативного пути дыхания на 71%.

Данный вывод автор делает на основании того, что в присутствии цианида калия, ингибитора цитохромного пути переноса электронов, дыхание подавлялось сильнее, по сравнению с эффектом, наблюдаемым при воздействии только 6-БАП.

При аналогичном эксперименте, но с использованием азида натрия в качестве ингибитора цитохромного пути, подавление дыхания при совместном действии 6БАП и азида натрия было меньше. При действии на митохондрии 0.5 мМ 6-БАП наблюдалось снижение альтернативного дыхания на 60%. Исходя из этого, С.О. Miller пришел к выводу, что цитокинины подавляют CN-резистентный путь (Miller, 1979; 1980).

В последующих работах С.О. Miller предположил, что 6-БАП влияет также на транспорт электронов от НАДН-дегидрогеназ к цитохрому b. Причём, эффект цитокининов зависел, как от способности гормона проникать в матрикс митохондрий и воздействовать на внутренние альтернативные ротеноннечувствительные НАДН-дегидрогеназы, так и от природы окисляемого субстрата.

В этом случае С.О. Miller использовал только две концентрации 6-БАП: 0.05 мМ и

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

0.5 мМ, и в обоих случаях было продемонстрировано снижение уровня дыхания под действием 6-БАП в митохондриях печени крысы. В от ичие от этого в работе японских ученых было обнаружено ингибирующие действие различных цитокининов на ротенон-чувствительную НАДН-дегидрогеназу (комплекс I).

В 1982 году Р. Dizengremel показал постепенное уменьшение цианидрезистентного дыхания митохондрий под действием 6-БАП в концентрациях в диапазоне от 0.2 мМ до 0.8 мМ (Dizengremel et al., 1982). Причем, при окислении сукцината максимальное снижение достигалось при действии 0.8 мМ 6-БАП, в то время как для подавления окисления малата в альтернативном пути достаточно 0.2 мМ гормона. Данные эксперименты подтвердили результаты исследований С.О. Miller (Miller, 1982), демонстрирующие зависимость гормонального эффекта от химической природы молекулы. Было показано, что степень подавления дыхательной функции митохондрий не зависит от физиологической активности гормона. В связи с этим было высказано предположение о воздействии 6-БАП как производного аденина, а не как цитокинина. В последующих экспериментах с использованием 0.04 мМ 6-БАП гормон либо подавлял альтернативный путь, либо активировал его (Dizengremel et al., 1982).

Во всех вышеупомянутых работах изучали лишь кратковременный эффект цитокининов. Изучение долговременного эффекта в культуре клеток A. thaliana показало, что 0.027 мМ 6-БАП блокирует пролиферацию клеток и вызывает программированную клеточную смерть уже через 24 часа воздействия (Carimi et al., 2005). Это происходит за счёт снижения активности циклин-зависимых киназ.

Авторы полагают, что данный эффект гормона играет определенную роль при сезонном опадении листвы. Кроме того, в ряде работ показано, что 6-БАП в концентрации 0.5-10 мкМ повышает синтез этилена в этиолированных проростках A. thaliana. Следует отметить, что этилен так же может вызывать программируемую клеточную смерть и индуцировать экспрессию АО на уровне транскрипции (Wang et al., 2010). Однако в данном случае, программированная клеточная смерть не является результатом увеличения концентрации этилена, так

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

как ингибирование синтеза этилена не блокирует данный эффект, вызванный 6БАП.

Таким образом, имеющиеся данные о влиянии цитокинина на функции митохондрии зачастую противоречат друг другу, вызывая ещё больший интерес к изучению данного гормона. В последние годы изучение гормональной дыхания сосредоточена на изучении регуляции экспрессии генов и обнаружении регуляторных областей, в том числе генов семейства АО.

2.5. Характеристика Lupinus luteus L. как модельного объекта исследования.

Объект, выбранный для изучения механизма действия гормонов на интенсивность дыхания растений, должен отвечать главному требованию – обладать чувствительностью к экзогенному фитогормону. Кроме того, объект должен иметь достаточную биомассу для получения количества митохондрий, необходимого для анализа. В лаборатории экспрессии генома растений ИФР им.

К.А. Тимирязева РАН было показано, что семядоли люпина желтого Lupinus luteus L. являются удобной экспериментальной моделью для изучения влияния экзогенных фитогормонов на хлоропластогенез. Эта модель характеризуется сравнительно быстрым ответом на воздействие экзогенных фитогормонов, хорошей воспроизводимостью гормонального эффекта, равномерностью ответа клеток семядолей на 6-БАП и абсцизовую кислоту. В экспериментах использовали изолированные семядоли, поэтому было важно определить, как гормональный эффект зависит от этапа, на котором отделяются семядоли от растения. При изучении влияния 6-БАП на биогенез хлоропластов было показано, что семядоли, отделенные от проростков через 72 часа после прорастания и подвергшиеся предварительной инкубации на воде в течение последующих 24 часов для истощения по экзогенным цитокининам, показывают наибольшую чувствительность к гормону, которая проявлялась в сокращении периода накопления хлорофилла, а также в изменении скорости метаболизма. В дальнейшем была показана гормональная регуляция экспрессии ряда ядерных и

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

пластидных генов, а так же накопление под влиянием 6-БАП и абсцизовой кислоты белков тилакоидных мембран хлоропластов.

Геном люпина желтого представлен 52 хромосомами. Нуклеотидная последовательность ядерного, пластидного и митохондриального геномов до сих пор полностью не определена. Однако в базе данных NСBI встречаются расшифрованные нуклеотидные последовательности единичных генов.

При работе чрезвычайно важны знания о биологии растения, что помогает создавать оптимальные условия для его выращивания и обработки фитогормонами.

Люпин желтый относится к семейству бобовых и является однолетним травянистым растением. Оптимальная температура развития и роста люпина составляет 20-25°С, причём он плохо переносит температуру выше 30°С.

Проростки люпина устойчивы к заморозкам до 4-5°С. Люпин требователен к увлажнению в период развития корневой системы, но, в то же время, является засухоустойчивым. Семена имеют округло-почковидную форму диаметром 5.5мм и содержат до 50% белка, 5-20% масла, до 1.7% горьких алкалоидов. При экспериментальной работе необходимо учитывать, что семена люпина подвержены заражению грибком или антракнозу и при необходимости требуется их стерилизация. Таким образом, зная условия оптимального проращивания и культивирования люпина желтого, его можно успешно использовать в качестве объекта для исследования механизмов гормональной регуляции физиологических процессов растительной клетки (Kurlovich, 2002).

В данной экспериментальной работе были использованы два гормона – цитокинин и салициловая кислота. Выбор ЦК обусловлен малой изученностью его действия на дыхание, а также наличием в нашей лаборатории разработанной системы чувствительной к действию этого гормона (Kusnetsov et al, 1994).

Использование в исследованиях салициловой кислоты дает возможность проследить ее эффект в «нетермогенных» тканях. Кроме того, действие СК на митохондрии наиболее подробно изучено (Norman et al., 2004) и поэтому используется в качестве контроля в нашей постановке эксперимента.

ВВЕДЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

Известно, что фитогормоны оказывают влияние на все стороны развития растений: рост, дифференцировку, морфогенез. Их функция проявляется на всех этапах онтогенеза растений, начиная от оплодотворенной яйцеклетки и заканчивая процессами старения и гибели организма (Кулаева, 1973, 1982). При этом неизбежно возникают существенные изменения в интенсивности и характере основных процессов клеточного метаболизма, включая дыхание. Поскольку митохондрии занимают центральное место в метаболизме клетки, в первую очередь, как основные поставщики энергии и промежуточных метаболитов, маловероятно, чтобы регуляция их активности оказалась вне сферы действия фитогормонов.

В настоящее время установлено, что митохондрии растений обладают рядом уникальных особенностей, в частности, наличием альтернативных нефосфорилирующих путей электронного транспорта, шунтирующих все пункты энергетического сопряжения в дыхательной цепи. Постулируется, что наличие разветвленной ЭТЦ обеспечивает большую лабильность энергетического метаболизма, увеличивает способность растений к адаптации при изменении эндогенных и экзогенных факторов (см. обзор Грабельных, 2005). В этой связи возрастает интерес к изучению механизмов регуляции энергетики дыхания, включая изучение роли фитогормонов в этом процессе. Значение этой проблемы возрастает также в связи с успехами, достигнутыми в последнее время в выяснении молекулярных механизмов действия фитогормонов на клетки растений и путей передачи гормонального сигнала (Dodd, 2003; Кулаева, Прокопцева, 2004;), особенностей строения и функционирования митохондриального генома растений (Giege, Brennicke, 2001; Хворостовский и др., 2002; Даниленко, Давыденко, 2003), а также ядерно-митохондриальных взаимодействий (Rhoads, Subbaiah, 2007; Юрина, Yang et al., 2008; Одинцова, 2010). Однако следует отметить, что, несмотря на очевидные успехи, достигнутые в последнее время, например, в изучении рецепторов фитогормонов, передачи гормонального сигнала, а также регуляции

ВВЕДЕНИЕ

фитогормонами экспрессии ядерных и хлоропластных генов, а также биогенеза хлоропластов (Кулаева, Кузнецов, 2002; Романов, 2009), аналогичные исследования механизмов действия фитогормонов на митохондрии, гормональной регуляции митохондриального генома, а также ядерных генов, кодирующих белки митохондрий, включая гены, кодирующие АО, практически отсутствуют (Miller et al., 2010).

С целью выяснения фундаментальных путей действия фитогормонов на функциональную активность митохондрий растений на примере этиолированных семядолей Lupinus luteus L. в данной работе были поставлены следующие основные задачи исследования:

1) Провести подбор оптимальных условий действия цитокинина на примере 6бензиламинопурина (6-БАП) и салициловой кислоты (СК) (концентрации гормона, способы обработки растительного материала) для семядолей L. luteus;

2) Изучить влияние экзогенных 6-БАП и СК на интенсивность дыхания в семядолях L. luteus и на активность различных путей митохондриального окисления в условиях in vivo;

транскрипции митохондриальных генов, кодирующих органельные белки комплексов основного цитохромного пути дыхания, тРНК и рРНК у L. luteus методом run-on транскрипции;

4) Идентифицировать гены альтернативной оксидазы цианид-резистентного пути окисления у L. luteus для дальнейшего анализа эффекта 6-БАП и СК на экспрессию АО.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Модельный объект исследования.

В работе использованы растения люпина желтого L. luteus L. сорт «Дружный». Семена люпина предварительно стерилизовали концентрированной серной кислотой в течение 40 мин и промывали до исчезновения характерного запаха дистиллированной водой. Обработка серной кислотой позволяет уменьшить заражение семян грибковыми инфекциями.

Клонирование фрагментов генов проводили в клетках Escherishia coli (E. coli) штаммов DH5 и JM109.

3.1.1. Питательные среды и условия культивирования растений и микроорганизмов. Растения выращивали в почве при режиме освещения 16 час день/8 час ночь в камере фитотрона при температуре 22°С. После посадки семена подвергались стратификации (48 час при 4°С в темноте).

Для исследования влияния экзогенных гормонов на функцию митохондрий использовали этиолированные семядоли люпина желтого. Для достижения одновременного прорастания кожуру семян повреждали и семена проращивали в кюветах на стекле, обернутом фильтровальной бумагой, причём края бумаги погружали в воду, таким образом, чтобы уровень раствора находился на уровне стекла. Прорастание проводили в камере фитотрона при 22°C в полной темноте.

После прорастания семян семядоли отделяли от корней и помещали наружной стороной вниз на увлажнённую фильтровальную бумагу. Такая инкубация в течение 24 часов вызывает снижение уровня эндогенных гормонов в семядолях (Kusnetsov et al. 1994). Далее семядоли переносили на среды, содержащие различные фитогормоны и инкубировали в течение 12 часов в темноте.

В исследовании использовали растворы следующих гормонов: салициловая кислота в концентрациях 100 мкМ, 500 мкМ, 1 мМ; БАП (6-бензиламинопурин) искусственный аналог природного цитокинина, в концентрации 1 мкМ, 10 мкМ, 22 мкМ, 50 мкМ, 100 мкМ, 200 мкМ. Семядоли экспонировали на воде или на

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

водных растворах, содержащих 20 мМ Трис-HCl (pH 8.0), СК + 20 мМ Трис-HCl (pH 8.0), 6-БАП + 20 мМ Трис-HCl (pH 8.0).

Для культивации бактерий E. coli использовали жидкую среду LB (10 г бактотриптона, 5 г дрожжевого экстракта, 10 г NaCl на 1 л дистиллированной воды). Для получения агаризованной питательной среды вносили агар до конечной концентрации 1.5% (15 г агара на литр раствора). Культуры E. coli выращивали в течение ночи при 37°С, жидкую культуру выращивали при постоянной аэрации.

При отборе колоний на устойчивость к антибиотикам, в среду добавляли ампициллин (50 мкг/мл). Раствор X-gal использовали в концентрации 20 мг/мл, раствор IPTG – 24 мг/мл.

3.2. Определение скорости дыхания в семядолях L. luteus.

Поглощение кислорода в семядолях люпина измеряли амперометрическим методом, используя полярограф LP 7 (Чехия) с электродом конструкции Шольца и Островского (Шольц, Островский, 1975). Семядоли или суспензию митохондрий вносили в полярографическую ячейку объемом 1.5 мл, термостатируемую при 25°С в воде или буфере выделения митохондрий, соответственно. Для определения общей скорости дыхания (Vt), скорости цианид-резистентного (VKCN) и остаточного (Vres) дыхания применяли ингибиторный анализ с использованием цианида калия и салицилгидроксамовой кислоты (СГК) в концентрациях для семядолей 4 мМ и 20 мМ, соответственно; для изолированных митохондрий - 1 мМ и 3 мМ, соответственно (Moller et al., 1988). Цианид калия позволяет оценить интенсивность цианид-резистентного дыхания, салицилгидроксамовая кислота позволяет измерить уровень остаточного окисления. При измерении дыхания семядолей скорость поглощения кислорода выражали в нг-атомах О2 в мин на г сухого/сырого веса. В случае измерения дыхания в суспензии митохондрий - в нгатомах О2 в мин на мг белка.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.2.1. Анализ и обработка данных полярограммы.

Определение скорости дыхания проводили по методу Чанса-Вильямса (Chance, Williams, 1955).

На рис. 6 приведена схема, демонстрирующая алгоритм подсчета указанных скоростей дыхания, исходя из результатов полярограммы.

Рис. 6. Схематическое изображение полярографической кривой. Т1, Т2 – время, мин; Т – разница между двумя временными точками, мин; [O2]1, [O2]2 – концентрация кислорода в ячейке в момент времени Т1 и Т2, соответственно, нг атом О2; [O2] – количество поглощенного кислорода за время Т, нг атом О2.

По данным полярограммы вычисляли (рис. 7):

1) общую скорость дыхания (Vt), т.е. количество поглощенного кислорода в единицу времени в тканях семядоли без добавления ингибиторов ЭТЦ;

2) скорость цианид-резистентного дыхания (VKCN) определяется измерением скорости дыхания семядоли в реакционной среде с добавлением СГК;

3) интенсивность остаточного дыхания (Vres) определяется скоростью дыхания семядоли в реакционной среде с добавлением цианида калия и СГК.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Рис. 7. Схематическое изображение полярограммы при ингибиторном анализе дыхания. Определение скорости цитохромного, альтернативного и остаточного дыхания. (1) - общая скорость тканевого дыхания ткани (Vt); (1-2) – скорость цитохромного дыхания, чувствительного к KCN (Vcyt); (2-3) – максимальная активность альтернативного окисления (Valt); (3) – скорость остаточного дыхания (Vres).

Затем, максимальную активность альтернативного дыхания (Valt), определяли по изменению скорости дыхания ткани после добавки CГК в присутствии KCN (Valt= VKCN - Vres) (рис. 7). Уровень цитохромного дыхания (Vcyt) определяли по изменению скорости поглощения кислорода после добавки цианида на фоне СГК (Vcyt= Vt - VKCN) (рис. 7). Вычисление уровня цианидрезистентного дыхания (ЦРД) проводили по формуле: ЦРД = (VKCN / Vt) * 100%.

3.3. Выделение митохондрий методом дифференциального центрифугирования.

Митохондрии выделяли из этиолированных семядолей люпина.

Гомогенизацию семядолей проводили в гомогенизаторе фирмы Moulinex при умеренных скоростях вращения, что связано с высокой жесткостью тканей семядолей. В качестве среды для выделения использовали буфер следующего состава: 0.6 M сахароза; 25 мМ MOPS (pH 7.8); 2 мМ ЭГТА-KOH; 10 мМ ДТТ;

1 мг/мл БСА; 6 мг/мл нерастворимого поливинилпирролидона. Соотношение образца ткани (семядоли) к буферу составляло 1:4 (вес/об.). Гомогенат фильтровали через 1 слой марли, мираклоса ("Calbiochem-Behring," США) и нейлона (размер пор 80 мкм), и центрифугировали 7 мин при 3500 g. Затем надосадочную жидкость переливали в новые пробирки и центрифугировали в

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

течение 7 мин при 7500 g. Для осаждения митохондрий надосадочную жидкость вновь переносили в новые пробирки и центрифугировали при 20000 g в течение 15 мин. Осадок, содержащий митохондрии, отмывали в отмывочном буфере, содержащем 0.3 M сахарозу; 25 мМ MOPS (pH 7.8); 2 мМ ЭГТА-KOH; 10 мМ ДТТ.

Все этапы выделения митохондрий проводили при температуре 2-4оС.

3.3.1. Очистка митохондрий в сахарозном градиенте.