WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

Pages:     || 2 |

«Молекулярные механизмы действия белков FtsZ, виллина и системы рестрикции-модификации Esp1396I, исследованные флуоресцентными методами. ...»

-- [ Страница 1 ] --

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский

государственный политехнический университет»

На правах рукописи

Сабанцев Антон Владимирович

Молекулярные механизмы действия белков FtsZ, виллина и системы

рестрикции-модификации Esp1396I, исследованные

флуоресцентными методами.

03.01.02 – биофизика Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Научный руководитель:

к.ф.-м.н. Ходорковский Михаил Алексеевич Санкт-Петербург - Оглавление Введение

1.

Обзор литературы

2.

Стохастичность экспрессии генов и системы рестрикциимодификации.

Локализационная микроскопия

2.2.

Методы преодоления дрейфа образца для ЛМ

2.3.

FtsZ – один из ключевых белков цитокинеза бактерий............... 2.4.

Механизм переключения активности актин-связывающего белка 2.5.

виллина Материалы и методы

3.

Исследование стохастичности экспрессии МТ и ЭР СРМ 3.1.

Esp1396I. Стабилизация положения объекта для локализационной 3.2.

микроскопии.

Локализационная микроскопия FtsZ в клетках E. coli................. 3.3.

Исследование взаимодействия домена 6 виллина с кальцием.... 3.4.

Результаты и обсуждение

4.

Распределения клеток E. coli по концентрации ЭР и МТ СРМ 4.1.

Esp1396I. Анализ внутриклеточного распределения МТ и ЭР

4.2.

Разработка протокола наблюдения «пробоя» СРМ на уровне 4.3.

одиночных клеток.

Разработка системы стабилизации положения объекта для ЛМ. 4.4.

Структуры, формируемые белком FtsZ в клетках E. coli............ 4.5.

Связывание домена 6 виллина с кальцием.

4.6.

Выводы

Список сокращений

Список публикаций по теме диссертации

Список литературы

Актуальность проблемы. Стохастичность процесса экспрессии генов, а также случайные флуктуации концентраций различных веществ в клетке, микроорганизмов наблюдаются существенные фенотипические различия, обусловленные различиями в количествах различных белков в отдельных клетках [1]. Важность этого факта была в полной мере осознана лишь недавно, когда было показано, что стохастичность экспрессии генов играет существенную роль в эволюции микроорганизмов, преодолении стрессов, выборе литического или лизогенного пути развития бактериофагом и других процессах [2, 3].

Важную роль в биологии бактерий играют системы рестрикциимодификации (СРМ), которые представляют собой набор ферментов, обычно кодируемых мобильным генетическим элементом, обеспечивающих защиту клетки от чужеродной ДНК, в том числе бактериофагов [4]. Действие СРМ основано на активности двух ферментов: метилтрансферазы (МТ) и эндонуклеазы рестрикции (ЭР). Ферментативная активность ЭР заключается во внесении двунитевого разрыва по определенному сайту в ДНК. МТ в свою очередь осуществляет метилирование оснований ДНК по этому же сайту, тем самым предотвращая разрезание ДНК по этому сайту ЭР. Несмотря на высокую эффективность, СРМ не обеспечивает абсолютной защиты от бактериофага и небольшая доля бактериофагов метилируется и дает начало устойчивому к СРМ потомству. В работе [5] проведен подробный теоретический анализ возможных механизмов преодоления бактериофагом СРМ, который показал, что преодооение СРМ бактериофагом может быть связано со стохастичностью процесса рестрикции/метилирования ДНК бактериофага и со стохастическими вариациями концентраций ЭР и МТ от клетки к клетке. Для проверки этих гипотез было решено проанализировать стохастичность экспрессии геном ЭР и МТ СРМ II типа Esp1396I [6] и разработать протокол эксперимента, который позволил бы исследовать корреляцию между концентрациями ЭР и МТ в клетке и вероятностью успешного заражения е бактериофагом.

Флуоресцентная микроскопия является одним из важных методов исследования биологических объектов. Привлекательность этого метода обусловлена в первую очередь чрезвычайно широкими возможностями селективного контрастирования различных структур в клетках и тканях. Кроме того, к важным преимуществам флуоресцентной микроскопии надо отнести возможность визуализации структур в живых клетках и многоклеточных организмах.

Несмотря на широкие возможности, флуоресцентная микрсокопия обладает одним существенным недостатком: е пространственное разрешение ограничено дифракционным пределом (для видимого света его величина составляет порядка 200 нм в фокальной плоскости и 500 нм вдоль аксиального направления [7]). В связи с ограниченным разрешением флуоресцентная микрсокопия долгое время считалась непригодной для исследования биологических структур с характерными размерами порядка сотен нанометров и меньше. В конце 20-го – начале 21-го века была постепенно осознана возможность обхода диффракционного ограничения разрешения субдифракционной микроскопии, среди которых наиболее важными являются структурированного освещения [9], STED-микроскопия [10] и локализационная флуоресцентной микроскопии от двух до десяти и более раз во всех трех измерениях.

Метод локализационной микроскопии основывается на раздельной регистрации флуоресценции одиночных молекул и определении их положения по флуоресцентным изображениям с точностью до нескольких десятков нанометров. Различные методы локализационной микроскопии (ЛМ) в первую очередь отличаются способом разделения флуоресценции молекул, которое чаще всего достигается за счет контроллируемой активации/переключения фотоактивируемых или фотопереключаемых красителей, как белковой [14], так и небелковой природы [15], а также за счет обратимого перехода молекул красителя в долгоживущее нефлуоресцентное состояние под действием возбуждающего излучения [16]. Для определения аксиального положения молекул используются интерференционные методы детекции [17], либо модификации оптической схемы, связывающие форму изображения молекулы с е аксиальным положением [18, 19].



Для получение одного ЛМ-изображения требуется от нескольких сотен до десятков тысяч кадров образца, содержащих изображения одиночных молекул, получение которых занимает от секунд до часов. Улучшенное разрешение локализационной микроскопии в сочетании с длительным временем сбора данных предъявляет особенно высокие требования к стабильности положения образца, в связи с чем осуществление ЛМ требует специальных методов борьбы с дрейфом образца. Существуют два основных подхода к решению этой проблемы: коррекция дрейфа на этапе обработки изображений и активная стабилизация положения образца в ходе эксперимента. Из этих двух подходов второй представляется более надежным, особенно в случае трехмерной локализационной микроскопии, так как за время наблюдения при отсутствии компенсации дрейф может привести к выходу образца за пределы области регистрации, что наиболее вероятно для аксиальной оси.

субдифаркционной микроскопии в целом и локализационной микроскопии в частности представляется микробиология, так как типичные размеры прокариотических клеток лишь в разы превышают дифракционный предел, в связи с чем возможности исследования их организации методом традиционной флуоресцентной микроскопии очень ограничены [20].

Белок FtsZ, бактериальный гомолог тубулина, играет одну из ключевых ролей в цитокинезе [21]. Этот белок обладает ГТФазной активностью и спопобен формировать различные полимерные структуры как in vitro, так и in vivo [22]. FtsZ формирует сократительное кольцо между делящимися клетками (Z-кольцо), а также динамические спиральные структуры, локализованные на цитоплазматической стороне внутренней мембраны бактерии, также есть предположение, что FtsZ выполняет в цитокинезе активную роль, являясь источником силы, вызывающей сокращение септы [23]. Несмотря на активные исследования, механизмы контроля полимеризации и положения филаментов FtsZ в клетке, обеспечивающие правильное формирование Z-кольца, до сих пор не до конца ясны [24]. Также FtsZ является мишенью для регуляции клеточного деления в SOS-ответе [25]. Методами субдифракционной микроскопии было показано, что FtsZ формирует различные спиральные структуры, а также кольцо в середине делящейся клетки (SIM [26], STED [27], PALM [28-32]).

Помимо роли в клеточном делении, некоторые авторы предполагают, что FtsZ также участвует в поддержании формы клетки [33]. В связи с этим особый интерес представляют данные о структурах, формируемых этим белком в клетках микоплазм, так как представители класса Mollicutes лишены клеточной стенки.

Правильное функционирование белков цитоскелета обеспечивается действием большого количества регуляторных белков.Так, в регулировании функций актиновых филаментов принимают участие белки суперсемейства гельзолина, куда ходят, помимо прочих, виллин [34], северин [35], гельзолин [34], супервиллин [36] и архвиллин [37]. Виллин участвует в поддержании микроворсинок в клетках эпителия кишечника и почек [38], и способен, подобно гельзолину переключать свою активность в зависимости от концентрации ионов кальция, а именно, в ответ на повышение концентрации ионов кальция переходить от сборки филаментов актина в пучки («bundling») в режим разрыва филаментов актина («severing») [39, 40]. Виллин требует для переключения на порядок более высоких концентраций кальция (100-200 мкМ по сравнению с 10 мкМ для гельзолина). Механизм активации кальцием гельзолина изучен достаточно хорошо [39]. При низких концентрациях кальция домен G6 гельзолина формирует контакт с доменом G2, содержащим сайт связывания актина, что предотвращает связывание белка с F-актином. При связывании кальция с доменом G6 в последнем происходит конформационная перестройка, приводящая к потере контакта с доменом G2 и открытием сайта связывания F-актина. Белок при этом переходит из неактивной закрытой в активную раскрытую конформацию [39, 41]. Одним из ключевых при изучении виллина является вопрос о том, имеет ли этот белок сходный с гельзолином механизм активации открытой конформации кальцием.

Цели и задачи исследования. Таким образом, целью настоящей работы являлось исследование механизмов функционирования белков FtsZ, виллина, МТ и ЭР СРМ Esp1396I флуоресцентными методами. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

Изучение стохастичности экспрессии генов ЭР и МТ СРМ Esp1396I Анализ внутриклеточных распределений ЭР и МТ Esp1396I Разработка протокола наблюдения преодоления бактериофагом системы рестрикции-модификации Esp1396I в клетках E. coli при заражении их бактериофагом на уровне одиночных клеток Создание и тестирование системы стабилизации положения объекта для осуществления локализационной микроскопии Получение субдифракционных изображений структур FtsZ в E. coli Изучение кальций-связывающих свойств домена V6 виллина при помощи спектроскопии собственной флуоресценции белка В ходе решения поставленных задач получены следующие результаты, которые выносятся на защиту:

Данные о стохастичности экспрессии рестриктазы и метилазы системы рестрикции-модификации Esp1396I свидетельствуют о том, что случайные вариации концентраций этих ферментов в клетке могут оказывать существенное влияние на процесс преодоления бактериофагом системы рестрикции-модификации.

Данные флуоресцентной микроскопии свидетельствуют о том, что метилаза, в отличие от рестриктазы Esp1396I, находится в клетках E.

иммунофлуоресцентным окрашиванием позволяет обнаружить особенности структур, формируемых белком FtsZ в клетках E. coli, недоступные для дифракционно-ограниченной флуоресцентной микроскопии, и существенно дополнить данные, получаемые с использованием флуоресцентных химерных белков.

При SOS-ответе в клетках E. coli продолжают действовать механизмы, обеспечивающие преимущественную локализацию FtsZ у мембраны и в областях клетки, свободных от ДНК.

Данные о связывании домена 6 виллина с ионами кальция, полученные при помощи метода спектроскопии собственной флуоресценции белка, свидетельствуют в пользу того, что виллин имеет сходный с гельзолином механизм переключения активности в ответ на изменение концентрации ионов кальция.

Научная новизна и практическая ценность работы. Результаты, изложенные в данной работе, получены впервые и носят фундаментальный характер, расширяя знания о молекулярных механизмах функционирования белков FtsZ, виллина, ЭР и МТ СРМ Esp1396I, способствуя тем самым более полному пониманию фундаментальных основ клеточного деления и его регуляции в стрессовых ситуациях, формирования и регуляции клеточных структур на основе актина, а также механизмов работы систем рестрикциимодификации и, в частности, влияния случайных процессов на их эффектинвность. Практическая ценность данной работы основывается на том, что механизм SOS-ответа способствует выживаемости и приобретению патогенными микроорганизмами устойчивости в ходе антибактериальной терапии. Расширение знаний о механизмах SOS-ответа будут способствовать созданию новых классов препаратов, блокирующих SOS-ответ, которые могли бы использоваться совместно с антибиотиками для увеличения эффективности терапии и предотвращения формирования устойчивости микроорганизмов к антибиотикам.

Способность виллина переключаться между режимами сборки в пучки («bundling») и фрагментации филаментов актина («severing») используется возбудителем дизентерии (шигеллза), грамотрицательной бактерией Shigella flexneri для проникновения в клетки эпителия кишечника. Шигеллзом ежегодно заболевают более 100 миллионов людей, из которых около одного миллиона погибают от этого заболевания [42]. Новые данные о механизмах переключения виллина будут способствовать усовершенствованию методов терапии шигеллза. Более полное знание механизмов «пробоя» СРМ бактериофагом будет полезно для создания защищенных от бактериофагов и другой чужеродной ДНК биотехнологических штаммов микроорганизмов.

Публикации и апробация работы. Материалы работы докладывались на ряде международных и всероссийских конференций [43-47]. По результатам исследований опубликованы 3 статьи в рецензируемых научных журналах [48Структура и объем работы.

Работа изложена на 110 страницах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, описание методов исследования, изложение и обсуждение результатов исследования, выводы и список цитируемой литературы (136 источников). Работа содержит таблицу и 51 иллюстрацию.

Стохастичность экспрессии генов и системы рестрикциимодификации.

Стохастичность экспрессии генов. Долгое время изучение экспрессии генов осуществлялось на уровне крупных генетически однородных популяций клеток, что позволяло получить информацию только о средних уровнях экспрессии. С развитием проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии, а также с открытием флуоресцентных белков, стало возможным определять уровень экспрессии генов в одиночных клетках [1]. Было обнаружено, что уровни экспрессии многих генов существенно варьируются от клетки к клетке даже в генетически однородной популяции, и эти вариации играют важную роль в адаптации клеток к меняющимся условиям внешней среды [51] и эволюции популяций бактерий [52].

Процесс экспрессии генов имеет существенно стохастический характер, так как в подавляющем большинстве случаев ген белка представлен в клетке всего одной или несколькими копиями. Процессы транскрипции и трансляции подвержены влиянию множества случайных факторов, как связанных непосредственно со стохастичностью обеспечивающих их биохимических реакций («внутренние» флуктуации), так и со случайными вариациями в уровнях различных клеточных метаболитов («внешние» флуктуации). Эти два типа источников «генетического шума» различаются тем, что второй приводит к коррелированным флуктуациям уровней экспрессии различных генов, в то время, как первый вызывает некоррелированные флуктуации [3].

стохастичность экспрессии генов, была опубликована в 1957 году [53]. В этой работе исследовалась индукция экспресии фермента -галактозидазы в E. coli в ответ на наличие в среде негидролизуемого аналога галактозы (тиометил--Dгалактозида, сокр. TMG). Помимо индукции -галактозидазы, внутриклеточный TMG также вызывает экспрессию активного транспортера галактозид пермеазы, который обеспечивает при полной активации уровень TMG в клетке до 100 раз выше, чем во внеклеточной среде. Таким образом осуществляется положительная обратная связь между внутриклеточной концентрацией TMG и экспрессией галактозид пермеазы, за счет чего в определенных диапазонах концентраций активная экспрессия -галактозидазы сохраняется даже после поддерживающими), не вызывающих заметной активации экспрессии галактозидазы. Именно этот эффект сделал возможным анализ стохастичности экспресси -галактозидазы: растили клетки E. coli в присутствии различных концентраций TMG, обеспечивающих частичную индукцию экспрессии галактозидазы, после чего рассеивали бактерии по пробиркам, содержащим TMG в поддерживающей концентрации, таким образом, что в среднем на пробирок приходилась лишь 1 бактерия. Как и ожидалось, примерно в 10% пробирок наблюдался рост бактерий, и в большей части этих пробирок содержалось, таким образом потомство одной единственной клетки.

Когда выросшие в пробирках клоны были проанализированы на наличие галактозидазной активности, оказалось, что при различных концентрациях среди клонов присутствуют как активно экспрессирующие TMG галактозидазу, так и клетки с концентрацией этого фермента на 2 порядка ниже. Причем увеличение концентрации TMG приводит к росту доли активных клеток, но не к увеличению экспрессии в них -галактозидазы.

Успех этого исследования был во многом обусловлен наличием бистабильности в системе -галактозидазы, что обеспечило наличие условий (концентрации TMG), при которых одиночная бактерия может быть размножена с сохранением состояния экспрессии. Активное развитие этого направления исследований началось только после того, как появились эффективные и более универсальные методы определения уровней экспрессии на уровне одиночных клеток (проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии) [3].

В одной из основополагающих работ по стохастичности экспрессии генов [1] для разделения «внешних» и «внутренних» источников «шума» в геном E.

coli были введены гены флуоресцентных белков CFP и YFP под контролем коррелированные и некоррелированные флуктуации уровней экспрессии этих генов. Оказалось, что в зависимости от промотора и регуляторной системы как абсолютные значения, так и отношение стохастических флуктуаций уровней экспрессии генов, обусловленных «внутренними» и «внешними» источниками, варьируется в широких пределах. Наличие обратной связи в регуляторной цепи гена приводит к существенному снижению флуктуаций уровня его экспрессии [3].

В клетках бактерий трансляция, как и транскрипция, имеет прерывистый характер: периоды активной трансляции или транскрипции («burst») сменяются периодами относительно низкой активности [3, 54]. Прерывистый характер этих процессов приводит к отклонению распределения клеток в генетически однородной популяции по уровню экспрессии гена от статистики Пуасона [54].

Отношение между дисперсией и средним распределения клеток по концентрации белка позволяет оценить среднее количество молекул белка, производимых за период активной трансляции [54].

Возможность анализа экспрессии генов на уровне одиночных молекул в клетках E. coli была продемонстрирована в ряде работ [55, 56], а в работе [57] предложена модификация этих методов на случай более высоких уровней экспресии генов. В этой работе детекция одиночных молекул флуоресцентных белков используется для калибровки интенсивности флуоресценции одиночной молекулы, которая затем позволяет пересчитать интенсивность флуоресценции бактерии в количество молекул флуоресцентного белка в ней.

Система рестрикции-модификации Esp1396I. Важную роль в биологии бактерий играют системы рестрикции-модификации (СРМ), которые представляют собой набор ферментов, обычно кодируемых мобильным генетическим элементом, обеспечивающих защиту клетки от чужеродной ДНК, в том числе бактериофагов [4]. Действие СРМ второго типа основано на активности двух ферментов: метилтрансферазы (МТ) и эндонуклеазы рестрикции (ЭР). Ферментативная активность ЭР заключается во внесении двунитевого разрыва по определенному сайту в ДНК. МТ в свою очередь осуществляет метилирование оснований ДНК по этому же сайту. СРМ могут рассматриваться как разновидность системы токсин-антитоксин [58].

Действительно, эндонуклеаза рестрикции (токсин) более стабильна в клетке, чем метилтрансферраза (антитоксин), в связи с чем в случае потери плазмиды, кодирующей СРМ, потомство клетки гибнет от активности ЭР после деградации МТ. Сайты узнавания СРМ являются палиндромами и могут быть метилированы по двум основаниям на разных цепях ДНК. Метилирование хотя бы одного из этих оснований предотвращает узнавание этого сайта ЭР. При попадании СРМ в клетку ЭР синтезируется с задержкой относительно МТ, что дает последней достаточно времени, чтобы защитить клеточную ДНК от деградации [59]. Подробнее регуляция экспрессии генов СРМ описана в работе [60]. Таким образом, ДНК клетки, несущей СРМ, метилирована и тем самым защищена от воздействия ЭР, в то время как чужеродная неметилированная ДНК при попадании в клетку с большой вероятностью разрушается ферментом ЭР [4].

СРМ были впервые обнаружены в 1950-х годах в экспериментах по заражению бактерий бактериофагами [61]. Оказалось, что некоторые штаммы бактерий, названные рестрицирующими, заражаются бактериофагами, выращенными на других, нерестрицирующих штаммах, с очень низкой (порядка 10-3) вероятностью. Однако те бактериофаги, которые преодолели защиту и выросли на клетках рестрицирующего штамма, заражали их уже с вероятностью, близкой к 1. При этом способность бактериофагов с высокой эффективностью заражать клетки рестрицирующих штаммов терялась после размножения их на нерестрицирующих клетках [4]. Изучение этого эффекта показало впоследствии, что устойчивость бактериофагов к СРМ в этих опытах была связана с метилированием их ДНК и требовала для своего поддержания наличия в бактериях МТ [62].

Несмотря на высокую эффективность, СРМ не обеспечивает абсолютной защиты от бактериофага и небольшая доля бактериофагов метилируется и дает начало устойчивому к СРМ потомству. Есть основания полагать, что стохастичность экспресиии генов СРМ может играть важную роль в «пробое»

бактериофагом защиты бактерий.

В работе [63] проведено подробное математическое моделирование влияния стохастичности процессов рестрикции/метилирования ДНК бактериофага, инфекции и экспрессии генов МТ и ЭР. Дальнейший анализ влияния этих факторов требует экспериментальных данных, в частности, о стохастичности экспрессии генов СРМ.

Рис. 2.1.1. Схема регуляции экспрессии генов СРМ ESP1396I. Иллюстрация создана при помощи программы TinkerCell [64].

В качестве объекта для изучения влияния стохастичности экспресси генов на пробой СРМ была выбрана система рестрикции-модификации Esp1396I, ферменты которой узнают палиндромные последовательности 5’ – CCA(N)5TGG метилтрансферазу (МТ), эндонуклеазу рестрикции (ЭР) и регуляторный С белок [6]. В качестве модельного бактериофага был выбран бактериофаг. В геноме бактериофага содержится 14 сайтов узнавания для СРМ Esp1396I.

Регуляция экспрессии генов СРМ Esp1396I изучалась в работе [65]. Было показано, что транскрипция генов ЭР и МТ контролируется C-белком. В отсутствии C-белка, что соответствует ситуации попадания плазмиды, кодирующей СРМ, в клетку, ген МТ активно экспрессируется, в то время, как общий промотор генов ЭР и C-белка малоактивен. При этом, так как ЭР функционирует в виде димера, базальная экспрессия генов ЭР и C-белка не токсична для клетки [6]. C-белок также связывается с регуляторными последовательностями в виде димера. В СРМ Esp1396I есть три сайта связывания C-белка: наиболее сильный сайт расположен вблизи промотора гена МТ, более слабый – на некотором расстоянии от промотора генов C-белка и ЭР, а самый слабый – вблизи этого промотора. В ходе постепенного накопления Cбелка в клетке его димеры связываются в первую очередь с регуляторной последовательностью вблизи промотора гена МТ и репрессирую его экспрессию. В ходе дальнейшего роста концентрации C-белка он связывается с сайтом, расположенным на некотором расстоянии от промотора генов ЭР и Cбелка и активирует их экспрессию, однако вскоре кооперативное связывание со вторым сайтом, расположенным рядом с этим промотором, ингибирует экспрессию генов ЭР и C-белка. Таким образом устанавливаются равновесные концентрации белков СРМ в клетке. Схема регуляции экспрессии генов СРМ Esp1396I приведена на рис. 2.1.1. К сожалению, данных о СРМ Esp1396I недостаточно для того, чтобы создать достоверную математическую модель экспрессии генов СРМ. В частности, отсутствуют данные о скоростях деградации белков C, ЭР и МТ.

Локализационная микроскопия 2.2.

Флуоресцентная микрсокопия и дифракционный предел разрешения.

Флуоресцентная микроскопия – один из важнейших методов исследования пространственной организации биологических объетов [66]. Однако волновая природа света ограничивает разрешение этого метода величиной порядка /(2·NA), где - длина волны флуоресценции, а NA – численная апертура объектива [67]. Точное значение этой величины определяется выбором критерия для разрешения точек. Традиционный эмпирический критерий Релея, определяющий предел разрешения, как расстояние между двумя точечными объектами, при котором минимум интенсивности в изображении между ними составляет 0,8 от максимума, дает коэффициент 1,22 [67].

Рис. 2.1.2. Изображения точечных объектов в двумерном представлении (верхний ряд) и в виде поверхностных графиков (нижний ряд). А – аппаратная функция, Б – изображения двух объектов разрешены, В – изображения не разрешены. Красные точки обозначают положения точечных объектов.

Понятие передаточной или аппаратной функции (АФ) позволяет наглядно представить разрешение микроскопа. АФ представляет собой изображение точечного объета ( -функция в плоскости образца), которое, вследствие дифракции света, уже не является точкой, а имеет конечную ширину порядка /(2·NA) (рис. 2.1.2 А). Решение задачи о дифракции на света от точечного источника на круглой апертуре позволяет определить аппаратную функцию микроскопа во флуоресцентном режиме. Получаемая при этом функция получила название диска Эйри:

где I(r) – интенсивность света как функция расстояния от центра изображения молекулы, I0 – интенсивность изображения в центре, J1 – функция Бесселя первого рода, NA – численная апертура объектива, – длина волны регистрируемого света. Первый минимум этой функции находится в точке r=1,22 /(2NA) [67].

Изображение объекта может быть получено как свертка плотности распределения флуоресцентных молекул в образце с АФ [67]. В частности, если в образце две молекулы флуорофора находятся на расстоянии меньше ширины АФ, их изображения наложатся одно на другое и не будут разрешены (см. рис.

2.1.2 Б и В).

Принцип локализационной микроскопии. В основе ЛМ лежит возможность определения положения объекта по его изображению с субдифракционной точностью при условии, что изображение не перекрывается с изображениями других объектов (то есть мы можем быть уверены, что наблюдаем именно изображение единичного объекта). Эта возможность была осознана уже давно и активно используется в целом ряде специальных методов микроскопии. Так, при использовании методики оптического захвата часто положение микросферы в ловушке определяется посредством анализа е изображения, что позволяет достичь точности до единиц нанометров [68, 69].

Аналогичный подход используется в методах Tethered Particle Motion и магнитной ловушки для исследования свойств ДНК на уровне одиночных молекул [70-74].

Рис. 2.1.3. Положение одиночного объекта можно определить по его изображению с точностью, существенно превышающей дифракционный предел.

В ЛМ используется метод определения положения объектов, размер которых пренебрежимо мал по сравнению с длиной волны регистрируемого света. В таком случае изображение объекта (молекулы флуорофора) представляет собой аппаратную функцию микроскопа, теоретически аппроксимируется функцией Гаусса [75, 76]. Зная, что в формировании изображения принимала участие только одна молекула, можно определить е положение с точностью, ограниченной только соотношением сигнал-шум и количеством зарегистрированных фотонов [75, 76] (рис. 2.1.3). Это легло в основу методики FIONA (Fluorescence Imaging with One Nanometer Accuracy), которая нашла применение, в частности, в исследовании моторных белков [77].

Методы регистрации траектории одиночных молекул активно используются для исследования диффузии и направленного перемещения биомолекул [78-81].

Из возможности локализации молекулы с субдифракционной точностью естественным образом вытекает идея о возможности получения субдифракционного изображения объекта посредством разделения флуоресценции различных молекул, независимой регистрации их изображений и последующей их локализации (рис. 2.1.4), которая была высказана задолго до первой экспериментальной реализации такого подхода [82, 83]. Идея ЛМ заключается в использовании дополнительной переменной для разделения флуоресценции одиночных молекул и независимого их наблюдения (чаще всего в качестве переменной разделения выступает время, но также использовалось, например, положение пика поглощения молекулы). При этом на первом этапе получается серия кадров образца, в каждом из которых присутствуют изображения лишь малой доли молекул (обычно, менее 1 на дифракционный объем). Далее при помощи компьютерного алгоритма осуществляется обнаружение изображений одиночных молекул и их локализация, которая может осуществляться различными методами, среди которых наибольшее распространение получили вычисление центра масс и нелинейная регрессия изображения двумерной функцией Гаусса. После этого положения всех локализованных молекул откладываются на одном изображении и тем самым субдифракционным разрешением.

Рис. 2.1.4. Принцип локализационной микроскопии. В первом ряду представлены идеальные изображения объекта (истинное распределение флуорофоров). Во втором ряду представлены изображения отдельных молекул объекта, получаемых при различных значениях переменной разделения, а также (справа) – суммарное изображение. В третьем ряду показан результат локализации отдельных молекул (три центральных изображения) и ЛМ-изображение (справа), полученное, как их сумма, а также обычное флуоресцентное изображение объекта (слева).

Впервые принцип ЛМ был реализован на практике в 1998 году [83, 84].

Идея использования спектральных параметров для разделения флуоресценции отдельных молекул и возможность использования е для субдифракционной микроскопии была сформулирована ещ в работе 1985 года [82]. Такой метод ЛМ получил название SSI (Spectrally Selective Imaging). Эффективно использовать эту идею для ЛМ позволил тот факт, что при температуре жидкого гелия (1.2 К) спектры поглощения и испускания флуорофоров становятся намного уже, чем при комнатной температуре (точнее, очень узкой становится нулевая фононная линия, ширина которой, в зависимости от степени неупорядоченности матрицы, может быть на 6 порядков меньше, чем сдвиги в е положении для отдельных молекул [85]). Спектр поглощения молекул пентацена в кристалле p-терпенила сильно зависит от локального окружения молекулы (напряжения и дефектов кристаллической структуры), в связи с чем различные молекулы возбуждаются светом различной длины волны и могут быть по этому признаку разделены. Ширина нулевой фононной линии для различных молекул пентацена составляет не более 20МГц, в то время, как вариации в положении этой линии вследствие различия в локальном окружении составляют более 3ГГц [84]. Таким образом, теоретически возможно разделение более 100 молекул на дифракционный объем.

Пренебрежимый уровень фотообесцвечивания и полный контроль над выбором молекулы позволил получать серии изображений одной молекулы при различных положениях фокуса с хорошим соотношением сигнал-шум, что дало возможность определить с высокой точностью не только латеральное, но и аксиальное положения молекулы. Стоит отметить, что в работе было исследовано всего 7 молекул. Несмотря на то, что в этих статьях была продемонстрирована принципиальная возможность ЛМ, предложенный метод сложен технически и имеет очень ограниченную область применения. В частности, так и не была продемонстрирована его применимость для биологических образцов, хотя такое развитие метода предполагалось [84].

ЛМ начала активно развиваться после того, как 2006 году в трех работах была продемонстрирована возможность реализации этого принципа с использованием фотоактивируемых или фотопереключаемых красителей (такие методы получили название PALM - PhotoActivation Localization Microscopy[11], FPALM - Fluorescence PhotoActivation Localization Microscopy[12] и STORM STochastic Optical Reconstruction Microscopy [13]).

В отличие от метода SSI, эти методы предполагают разделение флуоресценции молекул во времени при помощи явлений фотоактивации или фотопереключения, что значительно упрощает применение их в биологических экспериментах, так как такой подход совместим со стандартными методами пробоподготовки для флуоресцентной микроскопии. Получение изображения осуществляется в серии циклов, каждый из которых состоит из вспышки активирующего или переключающего света, интенсивность которой обеспечивает необходимую (менее одной на дифракционный объем) плотность наблюдаемых молекул, за которой следует получение их изображений и фотообесцвечивание интенсивным светом возбуждающей длины волны [11-13].

латеральным разрешением до 20 нм, однако для осуществления ЛМ этими методами требуются специальные красители, а именно фотопереключаемые белки, как, например PAGFP (для PALM и FPALM [11, 12]), либо фотопереключаемые конструкции из пар цианиновых красителей (Cy-3 и Cy-5), расположенных на определенном расстоянии на поверхности антитела для STORM [86, 13], что усложняет процесс пробоподготовки и затрудняет применение ЛМ для различных биологических задач. Стоит отметить механизм Регистрируемый краситель (в данном случае Cy-5) способен в особых условиях (ферментативная система поглощения растворенного кислорода – GOC-буфер, с добавлением 140 мМ -меркаптоэтанола) переходить под действием света нефлуоресцентное состояние (время жизни в отсутствие активации порядка часа и более), возврат из которого обеспечивается поглощением молекулой второго (активирующего) красителя (в данном случае – Cy3), находящейся в непосредственной близости (1 нм) от молекулы регистрируемого красителя, более коротковолнового света (532 нм, 1 Вт/см2). Эффект активации имеет более резкую, по сравнению с FRET, зависимость от расстояния между флуорофорами (увеличение расстояния с 1 до 3 нм приводит к ослаблению эффекта на порядок, в то время, как Фрстеровский радиус для пары Cy3-Cy составляет 5 нм) [86, 13]. Для осуществления ЛМ по методу STORM необходимо, помимо специального буфера, использовать вторичные антитела, окрашенные парами красителей Cy3 и Cy5 на определенном расстоянии и в определенной пропорции, что существенно усложняет процесс пробоподготовки [13].

Красители для локализационной микроскопии. Параллельно с развитием методики ЛМ с использованием редких фотопереключаемых и фотоактивируемых красителей, у многих широко распространенных красителей были обнаружены свойства, делающие их пригодными для ЛМ. Ещ в году была продемонстрирована способность цианинового красителя Cy5 к обратимому переходу в долгоживущее нефлуоресцентное состояние (далее – «мерцание») под действием интенсивного света возбуждающей длины волны (633 нм, 14 кВт/см2) в особых условиях (ферментативная система поглощения светом (488 нм, 14 кВт/см2) [87]. На основании этого наблюдения в 2008 году была продемонстрирована возможность ЛМ (с разрешением около 20 нм) с использованием в качестве флуоресцентных меток одиночных молекул красителей Cy5 или очень близкого к нему по химической структуре Alexa [88]. Этот метод очень близок к методу STORM, однако для его осуществления не требуется активирующего красителя, в связи с чем он был назван создателями dSTORM (direct STORM) [88].

Дальнейшее исследования механизма «мерцания» цианиновых красителей с использованием масс-спектрометрии показало [89], что природа этого процесса по всей видимости заключается в фотоиндуцированной реакции присоединения тиола по полиметиновому мостику красителя, что нарушает сопряженное -электронное облако (рис. 2.1.5).

Рис. 2.1.5. Предполагаемая схема образования долгоживущего «темного» состояния красителя Cy5 в условиях ЛМ [89].

В другой работе, вышедшей в 2008 году, была продемонстрирована ЛМ с разрешением 20 нм за счет «мерцания» красителей ATTO 655 и ATTO 680 в буфере, содержащим 10 мМ глутатиона или -меркаптоэтиламина, но не содержащим ферментативную систему поглощения кислорода [90].

Спектр пригодных для ЛМ флуорофоров был далее расширен в работе [91], где был продемонстрирован эффект аккумуляции большей части (>90%) молекул таких флуорофоров, как родамин-6G, 110 и 123, FITC, Oregon Green, Texas Red, Alexa 488, ATTO 532, ATTO 565, нефлюоресцирующем («темном») состоянии (время жизни от 0.5 до 1000 мс) под действием высокой освещенности светом возбуждающей длины волны (более 1 кВт/см2) в поливиниловом спирте (ПВС). В этой работе также был продемонстрирован аналогичный эффект для красителей родамин-6G и ATTO 532 в буфере PBS с добавлением ферментативной системы поглощения растворенного кислорода, а также для флуоресцентных белков EGFP, EYFP, Citrine и PhiYFP в PBS. Аналогичный эффект был продемонстрирован in vivo для белка слияния Citrine и Map2, экспрессированного в клетках PtK2, что позволило получить in vivo изображения тубулинового цитоскелета клеток с флуоресценции молекул во времени, этот метод ЛМ был назван авторами GSDIM (Ground-State Depletion followed by Individual Molecule return).

Механизм «мерцания» родамина-6G в ПВС исследовался в работе [92], где свидетельствующие о том, что долгоживущее «темное» состояние скорее всего представляет собой радикальный анион красителя.

Более поздняя работа акцентирует внимание на возможности использования таких распространенных флуоресцентных красителей (Alexa 488, Alexa 568 и FITC) в буфере без добавления ферментативной системы поглощения растворенного кислорода и тиолов, однако такая методика (как было показано ранее в [91]) требует существенно более высокой освещенности (100 кВт/см2 [93], что на два порядка больше типичной освещенности, необходимой для ЛМ в специальных условиях [91]). Это наблюдение позволило авторам получить изображения актиновых филаментов в фиксированных клетках HEK293, окрашенных Alexa 488-фалоидином, с разрешением 30 нм. Новая методика ЛМ получила название RPM (Reversible Photobleaching Microscopy), что подчеркивает тот факт, что она осуществляется при очень высоких освещенностях, которые ранее считались непригодными для флуоресцентной микроскопии вследствие фотообесцвечивания флуорофоров, которое, как показано в работе, является обратимым [93].

В работах [94, 95] также демонстрируется возможность ЛМ с разрешением до 30 нм с использованием эндогенно экспрессируемых флуоресцентных белков GFP, eGFP, EmGFP, YFP и eYFP, а также низкомолекулярных красителей Alexa 488 и Alexa 568, заключенных в коммерческую среду ProLong® Gold (Invitrogen).

Систематическое исследование пригодности флуорофоров Alexa и ATTO для ЛМ было проведено в работе [96], где была продемонстрирована ЛМ фиксированных клеток с использованием Alexa 488, 532 и 568, а также ATTO 520, 565, 590, 655 и 700 в PBS с добавлением 10-200 мМ меркаптоэтиламина при освещенности от 1 до 4 кВт/см2, а также in vivo ЛМ с использованием ATTO 655.

субдифракционных изображений с использованием красителя Alexa647 в заключающей среде VectaShield [97]. Такая комбинация заключающей среды и красителя представляется удачной в связи с тем, что фон биологических существенно меньше, чем в видимом диапазоне, а заключающая среда VectaShield позволяет хранить образцы в течение длительного времени с сохранением возможности получения субдифракционных изображений.

Таким образом, развитие методов ЛМ привело к существенному распространенных флуорофоров (хороший обзор по «мерцанию» флуорофоров можно найти в [98]), что существенно упростило методику пробоподготовки, позволив использовать отработанные десятилетиями протоколы окраски с минимальными модификациями, а также уже существующие генетические необходимость в использовании нескольких источников света различной длины волны (лазеров) и синхронизации детектирования и активации.

В целом стоит отметить, что «мерцание» распространенных флуорофоров является существенно нелинейным эффектом по освещенности. Несмотря на то, что этот эффект очень активно используется на практике, в частности для осуществления ЛМ, механизм его во многом остается неясным, хотя он активно и небезуспешно исследуется [89, 92].

Параллельно с поиском у существующих красителей свойств, делающих их пригодными для локализационной микроскопии, также ведется разработка новых флуоресцетных красителей, обладающих свойством фотоактивации.

заключается в том, что их свойство фотоактивации проявляется независимо от окружающей среды, что дает более гибкие возможности для их применения. В частности, был описан новый класс фотоактивирумых красителей – «запертые»

производные родаминов, в которых тушащая группа отщепляется при поглощении кванта света с длиной волны в ближнем УФ-диапазоне [99].

Методы преодоления дрейфа образца для ЛМ 2.3.

Сочетание высокого разрешения и длительного времени накопления данных делает локализационную микроскопию чрезвычайно чувствительной к дрейфу. Смещение образца на десятки или сотни нанометров за время наблюдения, которое составляет от десятков секунд до часов, оказывает губительное воздействие на разрешение. В связи с этим в области локализационной микроскопии чрезвычайно остро встает проблема коррекции и/или предотвращения дрейфа образца.

Был предложен ряд методов преодоления проблемы дрейфа для локализационной микроскопии, которые можно разделить на методы активной стабилизации положения объекта на этапе сбора данных и методы коррекции дрейфа на этапе обработки данных. В обеих группах можно выделить методы, требующие использования маркерных объектов и основанные на анализе особенностей образца без использования маркерных объектов. Пожалуй, наиболее простым в применении является метод коррекции дрейфа, основанный на вычислении кросс-корреляции ЛМ-изображений, реконструированных на основе части кадров образца [100, 101]. Однако такой подход позволяет компенсировать только низкочастотные смещения образца с частотами на 1 или 2 порядка ниже частоты получения кадров образца. Кроме того, дрейф образца может привести к выходу его за пределы оптимального диапазона детекции, что особенно важно при регистрации аксиального положения молекул и приведет к ухудшению аксиального разрешения.

Методы коррекции дрейфа с использованием маркерных объектов (флуоресцентных микросфер, квантовых точек или металлических наночастиц) позволяет учесть движения объекта, частоты которых сопоставимы с частотой получения кадров образца, однако также не могут обеспечить нахождение объекта в диапазоне оптимального разрешения по оси z [102-104].

В работе [105] продемонстрирована возможность активной стабилизации положения объекта в ходе сбора данных для реконструкции субдифракционного изображения без использования маркерных объектов за счет вычисления кросс-корреляции изображений образца в проходящем свете с эталонными изображениями, полученными при различных положениях фокуса.

Такой метод позволяет стабилизировать положения объекта на уровне 10 нм в плоскости xy и 20 нм по оси z с частотой в несколько герц. Однако для реализации такого метода необходимо создание дополнительной схемы визаулизации образца в проходящем свете лазера с длиной волны в ближнем ИК-диапазоне и регистрацией изображения при помощи дополнительной камеры, что представляет большие трудности в рамках существующей экспериментальной установки. Кроме того, частота данного метода достаточно низкая. Аналогичный метод с использованием маркерных объектов описан в работе [106], где достигается стабильность лучше 2 нм в плоскости xy и 17 нм по оси z при частоте 10 Гц. В сочетании с особой конструкцией оптической установки, обеспечивающей пассивную минимизацию дрейфа, схожий метод, основанный на определении положения маркерных объектов по изображениям в проходящем свете и компенсации их перемещения за счет перемещения пьезостолика позволил достигнуть стабильности лучше 1 нм в трех измерениях при частоте в 25 Гц и применялся для экспериментов с использованием оптического захвата [107]. Также в этой работе предлагается использовать метод определения положения маркерного объекта в трех измерениях с использованием квадрантного детектора для увеличения частоты стабилизации, аналогично работе [108], в которой комплекс мер, направленных на повышение стабильности экспериментальной установки, включающий в себя заполнение оптического пути гелием, активную стабилизацию интенсивности следящего лазера, а также активную стабилизацию положения образца с использованием маркерных объектов, представляющих собой микроциллиндры, выращенные на стекле, положение которых в трех измерениях определялось при помощи квадрантного детектора, позволил достичь беспрецедентного уровня стабильности в 0,1 нм при частоте в 100 Гц. Однако такая высокая точность является избыточной для ЛМ, разрешение которой составляет десятки нанометров в трех измерениях. В таблице 1 представлены основные статьи, описывающие методы активной стабилизации положения объекта.

Таблица 1. Статьи, описывающие методы стабилизации полжоения объекта под микроскопом Ryan McGorty, Active microscope 2013 Optical Daichi Kamiyama stabilization in three Sang Hak Lee, …, Using fixed fiduciary 2012 OPTICS Определение положения 10 Гц, 1,25 нм и 1,47 нм M. Capitanio, R. Position control and 2005 Eur. Phys. Определиени положения 25 Гц, лучше 1 нм по Cicchi, and F.S. optical manipulation J. B Ashley R. Carter, Stabilization of an 2007 APPLIED FtsZ – один из ключевых белков цитокинеза бактерий.

2.4.

Долгое время считалось, что бактерии не имеют цитоскелета, однако в последние годы в бактериях были обнаружены гомологи всех основных белков цитоскелета эукариот [110].

Белок FtsZ – бактериальный гомолог тубулина. Именно этот белок стал первым ключом к пониманию того факта, что бактерии также имеют цитоскелет [111]. Впервые (в 1991 году) методом иммуноэлектронной (позже и иммунофлуоресцентной) микроскопии было установлено [112, 113], что FtsZ сконцентрирован в основном в районе перетяжки во время деления. Было показано, что этот белок формирует Z-кольцо, а мутация, выражающаяся в его недостатке, приводит к образованию длинных неразделившихся клеток. FtsZ присутствует практически во всех видах прокариотических организмов, за редкими исключениями, являясь, таким образом, одним из наиболее консервативных белков прокариот. Более того, FtsZ участвует в делении хлоропластов растительных клеток [114], что указывает на еще большую распространнность данного белка.

Олигомеры FtsZ напоминают микротрубочки, в частности, проявляют ГТФазную активность, но образуют менее стабильные структуры. In vitro FtsZ формирует лишь относительно короткие филаменты (порядка 100 нм в длину) Предполагается, что короткие филаменты в клетке соединяются друг с другом и образуют более сложные структуры, в частности, Z-кольцо.

Полимеризация FtsZ контролируется целым рядом регуляторных белков.

Белок MinC ингибирует полимеризацию FtsZ вблизи полюсов клетки, в то время как FtsA и ZipA стабилизируют Z-кольцо (в E. coli). Отсутствие 2-х последних белков приводит к нарушению образования Z-кольца. Белок sulA в E. coli экспрессируется при повреждении ДНК (в состоянии SOS-ответа) и ингибирует образование Z-кольца, пока повреждение не будет репарировано [115]. В работе [116] при помощи флуоресцентной микроскопии клеток, экспрессирующих белок слияния FtsZ с GFP, кодируемый плазмидой, было показано, что FtsZ формирует спиралевидные структуры с шагом около 200 нм (изображения получены методом деконволюции) в некоторых клетках E. coli, как в присутствие (рис. 2.4.1, E), так и в отсутствие Z-кольца (рис. 2.4.2, C-D).

Рис. 2.4.1. Локализация FtsZ-GFP в клетках E.coli [116].

Кроме того, в филаментных клетках, присутствующих в нормальной культуре, были обнаружены спиралевидные структуры с периодом около нм (рис. 2.4.2, E) и регулярно расположенные на расстоянии около 300 нм фокусы (рис. 2.4.2, F). Однако экспрессия флуоресцентно-меченого FtsZ в дополнение к нативному белку могла исказить формируемые этими белками структуры.

Рис. 2.4.2. Локализация FtsZ-GFP в клетках E.coli без Z-кольца [116].

цитоскелета. ЛМ активно применяется для исследования белковых структур в бактериальных клетках.. К примеру, работа [117] посвящена организации мембранных белков, образующих кластеры хемотаксиса в бактериях E. coli.

Хемотаксис позволяет клетке активно реагировать на изменение внешних условий: мембранные рецепторы запускают механизм, заставляющий бактерию перемещаться (за счет движения жгутиков). В хемотаксис вовлечены белки Tar, CheA, CheW, CheY. Эти белки способны образовывать комплексы, состоящие из тысяч отдельных молекул (кластеры) – вместе они образуют сложную сеть, и для понимания механизмов их формирования авторы использовали метод PALM. В работе показана справедливость теории спонтанной нуклеации и образования кластеров.

В работе [118] на примере C. crescentus изучалась внутриклеточная организация MreB, бактериального гомолога актина. Для визуализации структур, формируемых клетки трансформировались плазмидой, кодирующей белок слияния MreB-YFP (Yellow Fluorescent Protein). Изучалась динамика отдельных молекул данного химерного белка. Для этого записывались траектории молекул, а затем полученные изображения обрабатывались с помощью локализационного алгоритма в среде MATLAB.

Для возможности локализации отдельных молекул отбирались только клетки с малой концентрацией MreB-YFP (3-4 шт./клетку). Компенсация дрейфа образца в латеральном направлении осуществлялась за счет одновременной регистрации изображений отдельных квантовых точек, закрепленных в образце неподвижно (в дальнейшем траектории квантовых точек вычитались из траекторий молекул белка). В итоге оказалось возможным локализовать отдельные молекулы MreB-YFP с точностью около 15 нм, что позволило определить параметры движения (в частности, коэффициент диффузии) для каждой молекулы.

Как и ожидалось, часть молекул демонстрировала произвольную траекторию, характерную для свободной частицы, на основании чего можно сделать вывод, что это молекулы глобулярного g-MreB (по аналогии с gактином). Другая часть молекул практически не перемещалась – молекулы fMreB (по аналогии с f-актином). Неожиданным результатом данной работы явилось то, что для «свободных» молекул g-MreB коэффициент диффузии оказался значительно ниже теоретически рассчитанного, что авторы связывают с возможным взаимодействием MreB с мембраной и/или с комплексом других белков. Кроме того, рассчитанная скорость деполимеризации MreB in vivo позволила предположить наличие дополнительного фактора деполимеризации в данных бактериях.

В работе [119] также исследовался MreB, в частности, получены изображения, отражающие организацию MreB в C. crescentus. В клетках, готовых к делению, белок локализуется в виде кольца примерно посередине бактерии, а в неделящихся клеток – в виде спирали.

В другой работе [120] исследуется пространственная организация белка кресцентина методом трехмерной (3D) ЛМ. Использовались методики SPRAI (Super-resolution by PoweR-dependent Active Intermittency) и PAINT (Points Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography). Обе методики являются модификациями стандартных методик ЛМ. Первая методика использовалась для детектирования молекул внутри клетки, вторая – на ее поверхности.

Для реализации 3D ЛМ использовалась аппаратная функция (АФ) в виде двойной спирали (АФДС). Особенностью такого метода 3D ЛМ является то, что изображением каждой точки являются два максимума, взаимная ориентация (поворот) которых зависит от аксиального положения молекулы, что позволяет по изображению молекулы определить е аксиальное положение.

Для визуализации использовались 2 красителя: eYFP (enhanced YFP) для SPRAI и Nile Red для PAINT. Т.к. красители имеют схожий спектр возбуждения, использовался единственный лазер, и изображения с каждым из красителей получали последовательно. Вначале получали около изображений с eYFP, затем около 25000 c Nile Red.

В согласии с предшествующими исследованиями, было установлено образование кресцентином продолговатого филамента вдоль внутренней стенки бактерии. Также было получено трехмерное изображение клетки (см. рис.

2.4.3).

Рис. 2.4.3. 3D изображения клеток C. crescentus с использованием ЛМ. Красным и желтым обозначен кресцентин, серым – мембрана. Слева направо: дифракционно-ограниченное изображение во флуоресцентном режиме; кресцентин (ЛМ); мембрана (ЛМ); совмещенный вид. В правом верхнем углу – изображение клеток на просвет. Шаг сетки – 1 мкм. [120] В работе [121] на примере C. crescentus исследуется система разделения хромосом в ходе клеточного деления. Эта система образована парой белков – ParA и ParB, которые конкурируют между собой за связывание с ДНК. Первый белок является АТФазой и образует протяженные филаменты, способствующие расхождению хромосом, второй – ингибирует активность первого, таким образом регулируя процесс расхождения. Наличие мутаций в генах parA и parB приводит к ошибкам в разделении хромосом. Для визуализации использовали мутантные бактерии, экспрессирующие флуоресцентные химерные белки ParAeYFP и ParB-mCherry.

В работе, в частности, было установлено, что ParA образует линейную структуру вдоль клетки толщиной около 40 нм, причем до разделения хромосом, во время и после не структура заметно различается.

Рис. 2.4.4. 2D проекции 3D–ЛМ изображений FtsZ в живых бактериях C. crescentus. A – в аксиальном направлении, B –в латеральном направлении. Вверху – стационарная клетка, внизу – непосредственно перед делением. [28] Работа [28] также посвящена исследованию бактерий C. crescentus. В данном исследовании методом ЛМ визуализировалась пространственная организация FtsZ в различные фазы клеточного цикла (см. рис. 2.4.4). Для реализации 3D ЛМ использовался искусственный астигматизм: помещенная между объектом и камерой цилиндрическая линза деформирует изображение таким образом, что по форме изображения молекулы можно определить аксиальное положение молекулы. Разрешение в аксиальном направлении составляло менее 100 нм. Для визуализации использовался FtsZ, эндогенномеченый при помощи фотопереключаемого флуорецентного белка Dendra2.

Исследовались как живые, так и фиксированные клетки.

Наблюдение производилось следующим образом: вначале возбуждающим лазером с длиной волны 561 нм «выжигались» молекулы, спонтанно переключившиеся из зеленого в красный канал флуоресценции. Затем лазерный импульс на длине волны 407 нм (0,5 с при плотности мощности 2 кВт/см2) переключал небольшую часть молекул красителя в красное флуоресцентное состояние, после чего вновь включался возбуждающий лазер, и записывались серии изображений отдельных молекул. Затем цикл (с периодом около 15 с) повторялся. Латеральное разрешение составило 30 нм, аксиальное – менее нм. Изображения, полученные в субдифракционном режиме, позволили оценить форму и размеры z-кольца: оно представляет собой тор с внешним диаметром, соответствующим толщине клетки (650 нм), и размером отверстия около 150 нм.

В одной из последних работ по изучению белка FtsZ в бактериях C.

crescentus [32] изучалось в частности образование этим белком структур в состоянии SOS-ответа. Интересно, что в SOS-ответе в бактериях данного вида в отличие, например, от E.coli, образуется z-кольцо, однако оно обладает иной морфологией (в частности, увеличенным размером). Эта особенность объясняется, по-видимому, иными механизмами остановки клеточного деления, чем ингибирование полимеризации FtsZ (как в E.coli) или образования z-кольца (B.subtilis).

Рис. 2.4.5. ЛМ-изображения белка слияния FtsZ-mEos2 в клетках E. coli [31].

В работе [31] с использованием белка слияния FtsZ с фотоактивируемым белком mEos2, кодируемого плазмидой, были получены ЛМ-изображения Zкольца (рис. 2.4.5, C-F). Полученные изображения не содержат спиральных структур вдали от центра клетки, что находится в очевидном противоречии с данными, полученными в работе [116]. Это может быть вызвано в частности артефактами, связанными с использованием белков слияния наряду с немеченным геномным FtsZ. Это противоречие подчеркивает важность сравнения данных, получаемых с использованием белков слияния и иммунофлуоресцентного окрашивания, для того, чтобы сделать достоверные выводы о структурах, формируемых белками цитоскелета бактерий.

Механизм переключения активности актин-связывающего 2.5.

Виллин – модульный белок, состоящий из 826 аминокислотных остатков и относящийся к суперсемейству гельзолин-подобных актинсвязывающих белков [34], куда также входят, помимо прочих, северин [35], гельзолин [34], супервиллин [36] и архвиллин [37]. Виллин участвует в поддержании микроворсинок в клетках эпителия кишечника и почек [38]. Аминокислотную последовательность этого белка можно разделить на две части: гельзолинподобное ядро на N-конце и небольшой домен («headpiece», HP) на C-конце, который соединен с ядром неструктурированым линкером длиной аминокислотных остатков [34, 122] (рис. 2.5.1, в). Ядро виллина примерно на 50% идентично гельзолину по аминокислотной последовательности и состоит из 6 гомологичных повторов V1-V6 (рис. 2.5.1, в), последний из которых V соединен линкером с HP доменом [34].

В регуляции активности виллина участвует ряд факторов, включая уровень кальция [34], фосфорилирование [38] и другие. При физиологическом уровне кальция виллин способен пучковать (bundle) актиновые филламенты (F-актин), а в ответ на повышение уровня кальция [34] или фосфорилирование [123] – нуклеировать, разрезать или блокировать их рост. Гельзолин также обладает способностью фрагментировать актиновые филаменты в ответ на повышение уровня кальция, для чего требуется около 10 мкМ [Ca2+] [39]. Способность виллина фрагментировать F-актин в свою очередь активируется при 100 - мкМ [Ca2+] [40], такие высокие концентрации кальция достигаются в клетке только при клеточном стрессе и апоптозе. Фосфорилирование ядра виллина, в том числе, домена V6, делает возможным фрагментирование актиновых филаментов этим белком уже при наномолярных концентрациях кальция [38, 123].

Механизм активации кальцием гельзолина изучен достаточно хорошо [39].

При низких концентрациях кальция домен G6 гельзолина формирует контакт с доменом G2, содержащим сайт связывания актина, что предотвращает связывание белка с F-актином. При связывании кальция с доменом G6 в последнем происходит конформационная перестройка, приводящая к потере контакта с доменом G2 и открытием сайта связывания F-актина. Белок при этом переходит из неактивной закрытой в активную раскрытую конформацию [39, 41].

Одним из ключевых при изучении виллина является вопрос о том, имеет ли этот белок сходный с гельзолином механизм активации открытой конформации кальцием. Гидродинамические данные свидетельствуют о том, что этот белок претерпевает масштабное конформационное изменение в зависимости от концентрации кальция с порогом около 20 мкМ, связанное с увеличением симметричности молекулы, а также максимальной длины с 84 до 123 ангстрем [124]. Исследования участка V6-HP виллина курицы, содержащий домен V6 и HP, соединенные гибким линкером, показали, что этот участок находится в состоянии мономера и способен пучковать актиновые филаменты при высоких концентрациях кальция, но при отсустствии кальция теряет эту способность и аггрегирует [122]. В то же время, домен HP виллина нечувствителен к кальцию и способен при любых его концентрациях связываться с актиновыми филаментами [125-127]. В связи с этим, было выдвинуто предположение о наличие в домене V6 сайта связывания кальция.

Пространственная структура домена V6, определенная методом ядерного магнитного резонанса, представлена на рис. 2.5.1, а.

Рис. 2.5.1. Структура виллина и его домена 6 (V6). Пространственная структура домена виллина определенная методом ядерного магнитного резонанса (Protein Data Bank, запись 2LLF) (а), первичная и вторичная структура домена 6 виллина (б) а также доменная структуры виллина (в). V1-V6 – гельзолин-подобное ядро виллина, состоящее из гомологичных доменов; HP – «headpiece» домен виллина; гибкий линкер между HP и V обозначен волнистой линией.

Исследование стохастичности экспрессии МТ и ЭР СРМ 3.1.

Для визуализации ЭР и МТ в клетках бактерий при помощи флуоресцентной микроскопии СРМ Esp1396I была клонирована в плазмиду, реплицируемую в клетках Esherichia coli. С генами ЭР и МТ были слиты последовательности, кодирующие флуоресцентные белки, таким образом, чтобы плазмида обеспечивала синтез химерных белков ЭР::mCherry и МТ::Venus.

Рис. 3.1.1. Схема расположения генов в плазмидах pEsp1396IRM5.6 (A) и pEsp1396IRM.Dual (B).

В основе использованных в работе генетических конструкций лежит плазмида pEsp1396IRM5.6 (рис. 3.1.1., А), которая была получена соединением разрезанной по сайту Bgl II природной плазмиды pEsp1396, несущей изучаемую систему рестрикции-модификации, и разрезанной по сайту BamHI многокопийной векторной плазмиды рUC19. Плазмида pEsp1396IRM5.6 несет систему реcтрикции-модификации Esp1396I, а также ген устойчивости к ампицилину и имеет длину около 8000 пар оснований. С помощью методов генной инженерии участки ДНК, кодирующие флуоресцентные белки были вставлены в конце каждого или обоих структурных генов Esp1396I, так что слитые белки представлют собой C-концевые слияния ферментов системы рестрикции модификации с флуоресцентными белками. На рис. 3.1.1, B, приведена схема расположения генов в плазмиде pEsp1396IRM.Dual, в которой ген ЭР слит с последовательностью, кодирующей флуоресцентный белок mCherry [128], флуоресцентный белок Venus [129]. При этом все варианты модифицированных СРМ сохраняли свою активность, обеспечивая тот же уровень защиты клеток E.

coli от инфекции бактериофагом, как и немодифицированный вариант системы Esp1396I.

Калибровка интенсивности флуоресценции одиночных молекул флуоресцентных белков. Образец для осуществления калибровки представлял собой бактерии E. coli, несущие плазмиды МТ::Venus и ЭР::mCherry, закрепленные на поверхности покрытых поли-L-лизином покровных стекол и фиксированные формальдегидом (5 %, 1 час при +4оС).

Для осуществления абсолютной калибровки измеряемых количеств ЭР и МТ область образца, содержащая бактерии, освещалась интенсивным лазерным илучением с длинами волн 473 нм для Venus и 532 нм для mCherry. Под действием лазеров через некторое время интенсивность флуоресценции образца начинала изменяться ступенчато, что соответствовало выгоранию одиночных молекул флуоресцентных белков. При этом на разностных изображениях для последовательных кадров образца наблюдались точечные объекты, представляющие собой флуоресцентный сигнал от одиночных молекул флуоресцентных белков, которые находились во флуоресцентном состоянии в первом кадре, но во втором переставали флуоресцировать вследствие фотообесцвечивания. Анализ таких изображений позволил оценить суммарную интенсивность флуоресцентного сигнала одиночной молекулы и определить абсолютные количества ЭР и МТ в клетках.

Построение распределений клеток E. coli по количествам ЭР и МТ.

Для анализа распределения клеток по концентрации ЭР и МТ использовались образцы из культур клеток, несущих плазмиду Dual. Клетки, выращенные до оптической плотности OD6000,3 в среде LB с добавлением 100 мкг/мл ампициллина при 37оС, промывались PBS и закреплялись на поверхности блока агарозы, расположенного на поверхности предметного стекла. Для этого 2 мкл суспензии клеток наносились на поверхность агарозы, после чего, спустя 5 мин, накрывались покровным стеклом.

Флуоресценция белка Venus регистрировались при помощи набора фильтров FilterSet10 (Zeiss), флуоресценция белка mCherry – при помощи набора фильтров mCherry-B (Semrock) при возбуждении ксеноновой лампой.

Также для определения положения клеток регистрировались изображения в проходящем свете.

Для упрощения автоматизированной обработки данных изображения в проходящем свете регистрировались при небольшой расфокусировке, благодаря чему изображения бактерий представляют собой яркие области на темном фоне, которые хорошо поддаются автоматической сегментации.

Изображения бактерий E. сoli, экспрессирующих флуоресцентно-меченые ЭР и МТ, обрабатывались при помощи специально созданного для этой цели макроса в программе ImageJ (пакет Fiji [130]). Для пересчета средней интенсивности флуоресценции во внутриклеточную концентрацию ферментов диаметр клетки полагался равным 1 мкм.

Анализ колокализации ЭР и МТ с ДНК в клетках E. coli. Для сравнения внутриклеточного распределения ЭР и МТ с распределением ДНК клетки E.

coli, несущие плазмиду Dual, растились в среде LB до оптической плотности OD6000,5 и окрашивались ДНК-связывающим красителем Hoecht (Invitrogen) в течение 15 минут при комнатной температуре, после чего клетки иммобилизовались на поверхности агарозы (1,5%). В каждом канале флуоресценции (Venus, mCherry и Hoecht 3334) регистрировались по изображений, которые обрабатывались фильтром высоких частот для снижения фонового сигнала (функция Subtract Background пакета ImageJ с параметром Rolling ball radius 50 пикселей) и усреднялись.

Разработка камеры для длительного наблюдения за ростом клеток E.

coli при помощи оптической микроскопии. В ходе работы был опробован ряд различных конструкций камеры для длительного наблюдения за клетками E.

coli иммобилизованы у поверхности покровного стекла, для чего было решено использовать агарозный гель (1,5%). Эксперименты с иммобилизацией бактерий на поврехности покрытого полилизином покровного стелка в промываемой камере продемонстриовали непригодность этой конфигурации для наблюдения за ростом бактерий в связи с тем, что большая часть бактерий закреплялась за поверхность одной точкой и их положение не было фиксировнным в ходе съемки. Для поддержания роста бактерий к агарозе добавлялась питательная среда LB либо M9 с добавлением 0,5% глицерина.

Кроме этого для нормального роста бактерий необходим доступ кислорода.

Рис. 3.1.2. Схема (A) и фотография (B) камеры для длительного наблюдения за ростом бактерий под микроскопом с фиксацией положения верхнего покровного стекла.

изображенная на рис. 3.1.2. Такая камера формируется при помощи рамки GeneFrame (22*22*0,25 мм), создающей герметичный карман между двумя покровными стеклами (нижним 24*24 мм и верхним 24*60 мм). Вначале рамка GeneFrame наклеивается на нижнее покровное стекло и заполняется 100 мкл агарозы (1,5%) с добавлением питательной среды, слой которой выравнивается при помощи второго покровного стекла. После затвердевания агарозы из не вырезаются полоски по краям камеры для обеспечения доступа кислорода в ходе эксперимента. Добавление около 2 мкл дистиллированной воды сбоку от агарозного геля позволяет предотвратить высыхание геля в ходе эксперимента.

Далее на поверхость агарозы наносятся 2 мкл суспензии клеток. После впитывания жидкости камера накрывается верхним покровным стеклом и устанавливается в держатель, обеспечивающий фиксацию в ходе эксперимента положения верхнего покровного стекла относительно столика микроскопа, что позволяет существенно повысить стабильность положения объекта наблюдения относительно объектива по сравнению со стандартной схемой, при которой фиксируется положение предметного стекла относительно столика микроскопа.

Рис. 3.1.3. Изображения бактерий E.coli в среде LB. В первой строке предоставлены изображения на просвет, во второй,в канале Venus, на третьей в канале mCherry, в начале эксперимента, через 60 и 120 мин.

Рис.3.1.4. Изображения бактерий E.coli в среде М9. В первой строке предоставлены изображения на просвет, во второй,в канале Venus, на третьей в канале mCherry, в начале эксперимента, через 60 и 120 мин.

В ходе работы сравнивались питательные среды LB и M9 с добавлением 0,5% глицерина для наблюдения роста бактерий под микроскопом. На богатой среде LB (рис. 3.1.3) бактерии быстрее делятся, однако высокий фоновый сигнал не позволяет зарегистрировать флуоресценцию белков Venus и mCherry в бактериях уже спустя 60 минут после начала. Минимальная среда M9 с добавлением 0,5% глицерина приводит к более медленному делению бактерий, однако даже спустя 120 минут после начала эксперимента (рис. 3.1.4) удается уверенно зарегистрировать флуоресценцию в бактериях. В связи с этим, среда M9 с добавлением 0,5% глицерина лучше подходит для изучения динамики уровней ЭР и МТ в клетках бактерий, в то время, как LB предпочтительна при изучении «пробоя» СРМ, так как обеспечивает более быстрый рост бактерий и, соответсвенно, более короткий цикл заражения бактериофага.

бактериофагом на уровне одиночных клеток. Для наблюдения за ростом одиночных клеток E. coli был создан скрипт в программном пакете MicroManager, осуществляющий автоматическую фокусировку и параллельную многоканальную съемку набора полей обзора в образце. Для осуществления фокусировки определяется минимум стандартного отклонения пикселей центральной области изображения образца на просвет. Это позволяет точно и воспроизводимо определить положение фокуса объекта во флуоресцентном режиме и минимизирует фотообесцвечивание.

бактериофагом и сопостовления вероятности «пробоя» с количествами ЭР и МТ в клетке необходимо:

1. Регистрировать концентрации ЭР и МТ в одиночных клетках 2. Наблюдать лизис клеток бактериофагом 3. Убедиться в том, что вышедшие после лизиса из клетки близлежащие бактерии («вторичная инфекция») В связи с этим в экспериментах по заражению бактериофагом использовались бактерии, содержащие плазмиду Dual с флуоресцентномечеными ЭР и МТ. Для контрольных экспериментов также использовались клетки E. coli без СРМ и бактериофаг, выращенный на клетках, содержащих СРМ, и, соответственно, метилированный по сайтам узнавания СРМ Esp1396I.

В ходе экспериментов было показано, что лизис бактерий происходит с низкой вероятностью и в отсутствии бактериофага. В то же время, «пробой» СРМ – также достаточно редкое событие (вероятность порядка 0,1%), в связи с чем, для однозначной идентификации событий «пробоя» СРМ необходимо убедиться в том, что после лизиса клетки спустя время, соответствующее циклу размножения бактериофага, окружающие клетки также начинают лизироваться.

Это свидетельствует о том, что в ходе лизиса клетки высвободились бактериофаги, способные эффективно заражать близлежащие клетки и, следовательно, метилированные. Для эффективного наблюдения «вторичной инфекции» необходимо максимизировать эффективность заражения клеток бактериофагом, для чего в среду для роста клеток, а также в гель для закрепления клеток во время эксперимента, добавляются 20 мМ MgSO4 и 0,2% мальтозы.

Для эксперимента по заражению клеток E. coli бактериофагом лямбда ночная культура клеток разводилась в 50 раз в свежей среде LB с добавлением 100 мкг/мл ампициллина, 20 мМ MgSO4 и 0,2% мальтозы и клетки растились до оптической плотности OD6000,5 при 37оС, после чего 10 мкл суспензии клеток смешивались в пропорции 1 к 1 с суспензией бактериофага с титром около 5*109 и инкубиролись 10 мин при +4оС и 5 мин при +37оС. Далее суспензия зараженных клеток наносилась на поверхность агарозы в камере для наблюдения за ростом бактерий под микроскопом и регистрировались изображения набора полей обзора в образце в проходящем свете, а также во флуоресцентном режиме в каналах Venus и mCherry каждые 15 мин при помощи разработанного скрипта для программы MicroManager.

Стабилизация положения объекта для локализационной 3.2.

Эксперименты проводились на установке «Лазерный пинцет», основанной на исследовательском моторизованном микроскопе AxioImager.Z1 (Carl Zeiss).

Данная установка включает в себя возможности традиционной оптической (в т.ч. флуоресцентной) микроскопии, локализационной микроскопии и оптической ловушки. Оптическая схема смонтирована на оптическом столе с пневматической системой виброизоляции «Newport Smart Table» и расположена на независимом от здания фундаменте. Кроме того, вспомогательное оборудование (контроллеры, блоки питания и др.) смонтированы отдельно от оптического стола. Оптическая схема установки приведена на рис. 3.2.1 (для наглядности в схеме не отмечены оптические элементы, не задействованные в описываемых экспериментах).

Рис. 3.2.1. Схема экспериментальной установки, относящаяся к локализационной микроскопии. CD – конденсор, CL – цилиндрическая линза, CS – покровное стекло, DM – дихроическое зеркало, EM-CCD – ПЗС камера с электронным усилением, FC –набор фильтров для регистрации флуоресценции, IL – осветитель проходящего света, IRF 1 – полосовой фильтр, пропускающий свет с длиной волны близкой к 830 нм, IRF 2 – фильтр, отсекающий излучение в ближнем ИК-диапазоне, в том числе с длиной волны 830 нм, Lлинза, M – зеркало, ML – ртутная лампа для возбуждения флуоресценции, O – объектив, PC – поляризационный кубик, PS – пьезостолик, QD – квадрантный фотодетектор, S – образец, Sh – оптический затвор, TL – тубусная линза.

В основе системы стабилизации положения объекта для ЛМ лежит метод определения положения микросферы при помощи квадрантного детектора.

Изображение микросферы на детекторе формируется при помощи лазера (Qioptiq iFLEX-2000, 830 нм, 50 мВт, TEM00, DPSS), фокусируемого чуть выше положения микросферы. Это позволяет по сигналам с квадрантного фотодетектора определять положение микросферы в трех измерениях (рис.

3.2.2).

Рис. 3.2.2. Калибровочные кривые системы квадрантного детектирования положения микросферы. A – зависимость сигнала Uy от положения микросферы в плоскости xy, B зависимость сигнала Ux от положения микросферы в плоскости xy, C – зависимость сигнала Uz от положения микросферы вдоль оси z. Оптимальная для работы системы стабилизации положения объекта область по оси z выделена пунктирным прямоугольником.

Для стабилизации положения образца на этапе пробоподготовки на поверхности покровного стекла закрепляются микросферы из ПММА диаметром 2,35 мкм (Bangs Laboratories). Перед активацией алгоритма стабилизации луч лазера автоматически центрируется на одной из микросфер посредством нахождения локального максимума суммарной интенсивности попадающего на детектор света. Данее осуществляется калибровка зависимостей сигналов с детектора от положения микросферы, перемещаемой при помощи пьезостолика Ux(x), Ux(y), Uy(x), Uy(y) и Uz(z). Эти зависимости аппроксимируются линейными функциями и далее используются в ходе работы алгоритма для пересчета сигналов с детектора в положение микросферы.

Положение фокуса следящего лазера при необходимости подстраивается для обеспечения максимальной чувствительности определения аксиального последовательно осуществляются измерение сигналов с квадрантного детектора, вычисление положения микросферы и сдвиг пьезостолика для компенсации отклонения микросферы от начального положения (для предотвращения самовозбуждения вектор сдвига пьезостолика домножается на коэффициент обратной связи, находящийся в пределах от 0,1 до 0,8). Вблизи максимума Uz мало зависит от x и y, однако, если микросфера смещается на значительное расстояние от начального положения в плоскости xy, зависимость Uz(x,y) становится существенной. Поэтому, в случае, если сдвиг микросферы от начального положения превышает пороговое значение Rmax, обычно принимаемое равным 100 нм, алгоритм смещает пьезостолик только в плоскости xy до тех пор, пока микросфера не окажется снова достаточно близко к исходному положению в плоскости xy для надежного вычисления е аксиального положения. Схема работы алгоритма стабилизации приведена на рис. 3.2.3.

Рис. 3.2.3. Схема алгоритма стабилизации положения объекта для ЛМ.

микросферы сами могут быть подвержены флуктуациям, одним из основных источников которых могут являться флуктуации интенсивности излучения следящего лазера. Поэтому сигналы с квадрантного детектора сами по себе не могут служить адекватной оценкой достигаемого уровня стабильности образца.

Для определения эффективности стабилизации объекта использовалась возможность точного определения положения флуоресцентных микросфер по их изображениям в трех измерениях (с использованием искусственного астигматизма за счет введения в оптический путь регистрации флуоресценции циллиндрической линзы для увеличения точности определения аксиального положения микросферы).

Рис. 3.2.4. Изображения флуоресцентной микросферы при различных положениях е по оси z. Изображения решистрировались при наличии в оптическом пути циллиндрической линзы. Шкала 1 мкм.

Тестовые образцы представляли собой промываемые камеры между покровным и предметным стеклами, в которых на поверхности покровного стелка были закреплены два типа микросфер: ПММА микросферы диаметром 2.35 мкм для работы алгоритма стабилизации и флуоресцентные микросферы из полистирола диаметром 1 мкм (Invitrogen, FluoSpheres Neutravidin red fluorescent 580/605) Флуоресценция микросфер регистрировалась при помощи набора фильтров mCherry (Semrock, BrightLine 40LP ZERO) с экспозицией 100 мс и частотой Гц. В ходе эксперимента в оптический путь микроскопа была добавлена циллиндрическая линза, в связи с чем положение фокуса по осям x и y различались и форма изображения микросферы менялась в зависимости от положения е по оси z.

Рис. 3.2.5. Зависимость параметра формы изображения от положения микросферы по оси z.

На рис. 3.2.4 приведены изображения микросферы при различных положениях е по оси z. В качестве параметра, характеризующего форму изображения микросферы, использовалась разность полной ширины изображения на полувысоте по осям x и y. Ось циллиндра линзы не совпадает с осями ПЗС-камеры, поэтому на этапе обработки изображения микросферы поворачивались на 40 градусов против часовой стрелки. Обработка изображений микросферы осуществлялась при помощи плагина QuickPALM [102] для пакета ImageJ [131, 132] (сборка Fiji [130]). Для построения калибровочной зависимости параметра формы изображения от положения микросферы по оси z использовалась функция Create 3D calibration плагина QuickPALM, полученнная калибровочная зависимость представлена на рис.

3.2.5. Далее изображения микросферы в ходе эксперимента анализировались при помощи функции Analyze Particles плагина QuickPALM.

Локализационная микроскопия FtsZ в клетках E. coli.

3.3.

В работе использовался штамм E. coli KD403, геном которого содержит CRISP-R систему (гены casA-E,1,2 под контролем арабинозного промотора и ген cas3 под контролем lac-промотора) с праймером к сайту в геноме бактерии.

В связи с этим, добавление индукторов (арабинозы и IPTG) приводит к появлению двунитевых разрывов в геноме бактерии и активации SOS-ответа.

Бактерии растились при 37оС до оптической плотности OD6000,5, после чего окрашивались при помощи первичных антител кролика к белку FtsZ (Acris) и вторичных антител козы, конъюгированных с флуорофорами ATTO-532 (Active Motif) или Cage 635 (Abberior).

Рис. 3.3.1. Western-blot клеточного лизата E. coli с первичными антителами к белку FtsZ E.coli.

Проверка специфичности первичных антител была проведена методом Western-blot. Электрофорез клеточных лизатов E.coli и M.Hominis проводили в 8% ДДС-ПААГ. В эксперименте использовали маркеры молекулярного веса PageRuller (ThermoScientific). Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану Hybond (Amersham) осуществляли полусухим способом в буфере трислициновом буфере с 20% метанола в течение 1,5 часа при напряжении 100 В.

Далее мембрану инкубировали на шейкере 10 мин в буфере PBS+0,1% Tween 20 (далее PBS-Tween), а затем инкубировали 1 час в 5% обезжиреном сухом молоке в буфере PBS-Tween. Инкубацию с первичными антителами осуществляли в течение 1 часа в буфере PBS-Tween, после чего мембрану в течение 30 мин отмывали в буфере PBS-Tween (6 смен буфера). В качестве вторичных антител использовали козьи анти-кроличьи антитела конъюгированные с пероксидазой хрена (Sigma) в разведении 1:6000 в буфере PBS-Tween. Детекция осуществлялась при помощи набора реагентов Pierce ECL. Антитела к FtsZ E.coli использовались в разведении – 1:500. Результаты эксперимента подтвердили специфичность первичных антител (рис. 3.3.1).

Рис. 3.3.2. Фотография модернизированной системы возбуждения флуоресценции. На фото обозначены лазеры с длинами волн излучения 405 нм, 473 нм, 532 нм и 635 нм, а также соответствующие оптически пути.

Для осуществления локализационной микроскопии была создана дополнительная оптическая схема возбуждения флуоресценции (рис. 3.3.2).

Излучение четырех лазеров с длинами волн 405 нм (диодный лазер с максимальной мощностью излучения 500 мВт), 473 нм (твердотельный лазер с диодной накачкой, 200 мВт), 532 нм (твердотельный лазер с диодной накачкой, 100 мВт) и 635 нм (диодный лазер, 500 мВт) сводится в единый луч при помощи дихроических зеркал (Semrock) и через резервный порт микроскопа и набор фильтров для регистрации флуоресценции попадает на объектив микроскопа, который фокусирует его в область диаметром около 40 мкм в фокальной плоскости. Набор оптических затворов, управляемых вручную и при помощи персонального компьютера, позволяет в зависимости от потребностей эксперимента независимо перекрывать или открывать оптические пути всех четырех лазеров. При использовании в ходе эксперимента нескольких лазеров (например, 635 нм для возбуждения флуоресценции и 405 для активации молекул красителя) входной фильтр набора для регистрации флуоресценции демонтировался из держателя и перемещался в оптический путь лазера с длиной волны 635 нм, что позволяет с одной стороны обеспечить доступ излучения с длиной волны 405 нм в образец, с другой – подавить длинноволновой «хвост» спектра излучения диодного лазера с длиной волны 635 нм, который в противном случае создает значительный фоновый сигнал при регистрации флуоресценции.

Окрашивание осуществлялось в промываемых камерах, образованных между покровным и предметным стеклами при помощи двухсторонней клейкой ленты толщиной 130 мкм (Scotch). Для закрепления бактерий и микросфер для стабилизации поверхности камеры покрывались поли-L-лизином (SigmaAldrich, 0,1%, 30 мин). Сначала на поверхности покровного стекла закреплялись микросферы из ПММА (Bangs Laboratories, 2,35 мкм, 1 к 500 в 10кратном PBS, 15 мин покровным стеклом вниз). Далее аналогичным образом на поверхности покровного стелка закреплялись бактерии (10 мин). Образцы дистиллированной воды в соотношении 3:1:4 (также были опробованы другие протоколы фиксации, однако именно этот обеспечивал наиболее качественные результаты). Затем осуществлялась обработка в течение 5 мин раствором лизоцима (Sigma-Aldrich, 5 мкг/мл) в буфере GTE (Tris 32.5 мМ, pH = 7, глюкоза 50 мМ, ЭДТА 10 мМ) для разрушения клеточной стенки.

Блокирование неспецифического связывания осуществлялось при помощи БСА (20 мг/мл, 30 мин). Инкубация с первичными антителами осуществлялась в течение ночи при +4оС, со вторичными – 1 час при комнатной температуре, после пятикратной промывки 0,05% Tween в PBS. В некоторые образцы также добавлялся на 10 мин краситель YOYO-1 в концентрации 100 нМ для визуализации ДНК.

Рис. 3.3.3. Исходные данные и реконструкция субдифракционного изображения FtsZ в клетках E. coli. а-д – кадры образца, содержащие изображения одиночных молекул Cage 635, и локализованные положения молекул (з-м). е-ж – усредненные по 5 и 1000 кадров соответсвенно изображения образца, н-о – реконструированные по 5 и 1000 кадров соответственно субдифракционные изображения образца.

Для получения данных ЛМ образец, окрашенный вторичными антителами с красителем Cage 635, одновременно освещался диодными лазерами с длинами волн 635 нм (10 кВт/см2 – возбуждение флуоресценции молекул красителя) и 405 нм (около 100 Вт/см2 – активация молекул красителя). При помощи EMCCD камеры регистрировалось от 1000 до 10000 кадров, содержащих одиночные флуоресцентные молекулы, с экспозицией 100 мс (рис. 3.3.3, а-д).

Для регистрации флуоресценции использовался набор фильтров Semrock LF635/LP-B, входной фильтр которого был перемещен в оптический путь лазера с длиной волны 635 нм. Сбор данных осуществлялся при активном алгоритме стабилизации положения объекта. Для реконструкции ЛМизображений использовался плагин ThunderSTORM [103] для ImageJ [131, 132], осуществляющий обнаружение изображений одиночных молекул и их локализацию с последующей реконструкцией субдифракционного изображения (см. рис. 3.3.4).

Исследование взаимодействия домена 6 виллина с кальцием.

3.4.

Подготовка образца V6 домена виллина. Процедура экспрессии и выделения домена 6 виллина была подробно описана ранее [41]. Домен V сверхэкспрессировался в клетках E.coli клеточной линии BL21(DE3) (Novagen), хроматографической очистки на колонках Sephadex G50 и GE Superdex 75 HPSEC. Лизирование и хромотография осуществлялись в буфере А (150 мМ NaCl, 5 мМ CaCl2, 5 мМ дитиотрейтол, 0,01% NaN3, 20 мМ PIPES; pH = 7,0).

Для перевода белка в буфер без кальция осуществлялся обмен буфера с использованием мембранных концентраторов Millipore (порог отсечения этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA), которая затем также удалялась посредством обмена буфера.

Флуориметрические исследования. Для регистрации собственной флуоресценции остатков триптофана в белке использовался флуориметр Cary Eclipse (Varian). Для исследования обратимости связывания домена V6 виллина с кальцием к образцу белка концентрации 10 мкМ в буфере А добавлялась EDTA до концентрации 5 мМ, что приводило к снижению концентрации кальция не менее, чем на два порядка. После этого концентрация кальция в растворе восстанавливалась до уровня 5 мМ добавлением раствора CaCl 2. В ходе эксперимента регистрировались спектры флуоресценции образца в диапазоне от 290 до 500 нм при возбуждении на длине волны 280 нм.

Регистрация динамики установления равновесия при добавлении кальция к домену V6 виллина осуществлялась в акриловой УФ-прозрачной кювете при непрерывном перемешивании при помощи магнитной мешалки. В образец объемом 2,25 мл и концентрацией V6 2,23 мкМ добавлялся раствор CaCl2 до концентрации 5,0 мМ. При этом регистрировалась динамика интенсивности флуоресценции образца на длине волны 350 нм при возбуждении на длине волны 280 нм.

Титрование домена V6 виллина кальцием осуществлялось посредством добавления к образцу в кювете (концентрация белка 2,23 мкМ, объем 1000 мкл) по 1 мкл раствора CaCl2 соответствующих концентраций (от 0,6 мМ до 0,6 М).

После каждого добавления кальция образец инкубировался 2 мин для установления равновесия, после чего осуществлялось 100-кратное измерение уровня флуоресценции на длине волны 350 нм при возбуждении на 280 нм с экспозицией 0,2 сек. Время инкубации было выбрано с учетом данных о кинетике установления равновесия при добавлении кальция к домену V виллина (рис. 9), демонстрирующих, что установление равновесия занимает менее 10 с.

Обработка кривой титрования осуществлялась двумя моделями, описывающими обратимое независимое связывание лиганда с одним или двумя сайтами в белке соответственно:

где I – регистрируемая интенсивность флуоресценции; I0 – интенсивность флуоресценции белка, свободного от кальция; I1– разность между интенсивностями флуоресценции белка, первый сайт которого связан с кальцием и свободного от него; I1– разность между интенсивностями флуоресценции белка, оба сайта которого связаны с кальцием, и белка, первый сайт которого связан с кальцием; [V6], [Ca2+] – концентрации белка и кальция;

Kd1, Kd2 – константы диссоциации для реакции связывания первого и второго сайта белка с кальцием соответственно.

Распределения клеток E. coli по концентрации ЭР и МТ СРМ 4.1.

Полученные флуоресцентные изображения (рис. 4.1.1) клеток E. coli, содержащих плазмиду, кодирующую СРМ Esp1396I, ЭР и МТ в которой слиты с флуоресцентными белками mCherry и Venus соответственно, позволили проанализировать внутриклеточное распределение этих ферментов, а также вариации их концентраций от клетки к клетке (рис. 4.1.2).

Рис.4.1.1. Флуоресцентные изображения бактерий E.coli, экспрессирующих флуоресцентные белки слияния компонентов СРМ Esp1396I А – МТ с белком Venus, Б – ЭР с белком mCherry, В - МТ с Venus и ЭР с mCherry одновременно.

Были определены параметры распределения клеток по количествам и концентрациям ЭР и МТ. Среднее количество (±стандартное отклонение) молекул ЭР на клетку составило 610±480, МТ - 230±100, концентрации: ЭР нМ, МТ - 140±40 нМ. Таким образом, среднее количество ЭР в 2,6 раза больше, чем МТ. Кроме того, коэффициент вариации (отношение стандартного отклонения к среднему значению) ЭР в 2,8 раза выше, чем МТ (0,64 против 0,27). Анализ корреляции концентраций ЭР и МТ (рис. 4.1.2, B) показывает, что распределение распадается на две части: основная часть бактерий (обозначена черной штриховой линией на графике) демонстрирует значительную корреляцию между уровнями ЭР и МТ (коэффициент корреляции 0,56), однако часть бактерий (около 5 %) содержат аномально высокое количество ЭР при незначительном превышении среднего уровня МТ. На рис. 4.1.2, C представлено распределение клеток по соотношению концентраций МТ и ЭР.

Эти данные показывают, что относительные уровни рестриктазной и метилазной активности могут варьироваться в достаточно широких пределах.

Рис. 4.1.2. Распределения клеток E. coli по концентрациям ЭР и МТ Esp1396I. A – гистограммы распределений (МТ – черные сплошные столбцы, ЭР – красные штрихованные столбцы), B – корреляционный график для концентраций ЭР (ось ординат) и МТ (ось абсцисс), черной штрихованной линией обозначена основная часть распределения, красным штрих-пунктиром – клетки с аномально высокими концентрациями ЭР, C – гистограмма распределения клеток E. coli по соотношению концентраций МТ и ЭР.

Существенный уровень корреляции между концентрациями ЭР и МТ свидетельствует о том, что вариации концентраций в значительной мере обусловлены «внешними» источниками шума, общими для обоих генов.

Существенно более высокий уровень вариации концентрации ЭР является достаточно неожиданным результатом, так как ген ЭР находится под контролем положительной и отрицательной обратных связей, которые должны поддерживать постоянный уровень продукта, в то время, как ген МТ не имеет обратной связи и лишь репрессируется C-белком. Несмотря на то, что имеются достаточно подробные данные о регуляции экспрессии генов СРМ Esp1396I [65, 6], отсутствие ряда ключеных параметров не позволяет провести эффективное математическое моделирование работы этой системы. Так, например, отсутствуют данные о стабильностях белков ЭР, МТ и C в клетке.

Предположительно, С-белок и ЭР могут обладать существенно отличными временами жизни, что может приводить к повышению флуктуаций концентрации ЭР, так как именно C-белок осуществляет положительную и отрицательную обратную связь в гене Esp1396ICR. В связи с этим представляется целесообразным провести эксперименты по изучению стабильности белков СРМ Esp1396I клетке. В работе [133] теоретически предсказано и экспериментально подтверждено существование бистабильности и гистерезиса в СРМ II типа PvuII. В частности, показано, что количество копий генов СРМ может оказывать существенное воздействие на регуляцию экспрессии белков СРМ. Использование описанной в работе [133] плазмиды с регулируемой копийностью в сочетании с измерением конценцентраций ЭР и МТ при помощи флуоресцентной микроскопии должно позволить лучше понять механизмы регуляции СРМ II типа.

Анализ внутриклеточного распределения МТ и ЭР 4.2.

Анализ флуоресцентных изображений бактерий, несущих плазмиду «Dual»

показал, что внутриклеточное распределение ЭР и МТ существенно отличаются друг от друга (рис. 4.2.1 и 4.2.2). В то время, как ЭР распределена по объему клетки равномерно, МТ во многих клетках концентрируется в двух областях вблизи полюсов, а в середине клетки наблюдается локальный минимум флуоресцентного сигнала. Подобное пространственное распределение характерно для ДНК в клетках E. coli, в связи с чем неравномерное распределение МТ в клетках может объяняться тем, что этот фермент находится в комплексе с ДНК.



Pages:     || 2 |


Похожие работы:

«vy vy из ФОНДОВ РОССИЙСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННОЙ БИБЛИОТЕКИ Тенетко, Алексей Алексеевич 1. Юридическая техника правоприменительных актов 1.1. Российская государственная библиотека diss.rsl.ru 2003 Тенетко, Алексей Алексеевич Юридическая техника правоприменительных актов [Электронный ресурс]: Дис.. канд. юрид. наук : 12.00.01.-М.: РГБ, 2003 (Из фондов Российской Государственной библиотеки) Теория права и государства; история права и государства; история политических и правовых учений Полный текст:...»

«Бессуднов Иван Александрович СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИЙ РЕМОНТА ГАЗОТУРБИННЫХ АВИАЦИОННЫХ ДВИГАТЕЛЕЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РЕСУРСОСБЕРЕГАЮЩИХ ТЕХНОЛОГИЙ Специальность 05.02.08 – Технология машиностроения Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук Научный руководитель заслуженный деятель науки и техники РФ,...»

«ИЗ ФОНДОВ РОССИЙСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННОЙ БИБЛИОТЕКИ Юрченко, Оксана Феодосьевна Диагностика и коррекция проявлений личностной изменчивости у подростков из неблагополучных семей Москва Российская государственная библиотека diss.rsl.ru 2006 Юрченко, Оксана Феодосьевна.    Диагностика и коррекция проявлений личностной изменчивости у подростков из неблагополучных семей [Электронный ресурс] : Дис. . канд. психол. наук  : 19.00.01. ­ Ставрополь: РГБ, 2006. ­ (Из фондов Российской...»

«Шубочкин Андрей Евгеньевич Развитие методов и средств вихретокового и магнитного контроля металлопроката для оценки его остаточного ресурса Специальность 05.11.13. – Приборы и методы контроля природной среды, веществ, материалов и изделий. ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора технических наук Москва – -2Оглавление...»

«ИЗ ФОНДОВ РОССИЙСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННОЙ БИБЛИОТЕКИ Андреев, Юрий Александрович Влияние антропогенных и природных факторов на возникновение пожаров в лесах и населенных пунктах Москва Российская государственная библиотека diss.rsl.ru 2007 Андреев, Юрий Александрович.    Влияние антропогенных и природных факторов на возникновение пожаров в лесах и населенных пунктах [Электронный ресурс] : Дис. . д­ра техн. наук  : 05.26.03. ­ М.: РГБ, 2007. ­ (Из фондов Российской Государственной Библиотеки)....»

«из ФОНДОВ РОССИЙСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННОЙ БИБЛИОТЕКИ Корнилова, Ольга Алексеевна 1. Фактор значимый (внутрисемейнык) жизненный ситуаций в структуре и стратегии дезадаптивного поведения подростков 1.1. Российская государственная Библиотека diss.rsl.ru 2003 Корнилова, Ольга Алексеевна Фактор значимы к (в нутрисемейны к) жизненный ситуаций в структуре и стратегии дезадаптивного поведения подростков [Электронный ресурс]: Дис.. канд. псикол наук : 19.00.07.-М.: РГБ, 2003 (Из фондов Российской...»

«АРАНОВ Владислав Юрьевич МЕТОД ЗАЩИТЫ ИСПОЛНЯЕМОГО ПРОГРАММНОГО КОДА ОТ ДИНАМИЧЕСКОГО И СТАТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА Специальность 05.13.19 – Методы и системы защиты информации, информационная безопасность Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук Научный руководитель : д.т.н., проф. Заборовский...»

«Махлаев Александр Викторович Метаморфозы русского национального сознания в условиях острого политического кризиса Специальность 23.00.02 – Политические институты, этнополитическая конфликтология, национальные и политические процессы и технологии Диссертация на соискание ученой степени кандидата политических наук Научный руководитель – кандидат исторических наук, доцент М.Ф. Цветаева Москва 2006 -2Оглавление. стр. Введение.....»

«Амирханова Евгения Александровна АДМИНИСТРАТИВНО-ПРАВОВОЕ РЕГУЛИРОВАНИЕ В СФЕРЕ ТУРИЗМА Специальность 12.00.14 – административное право; административный процесс ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата юридических наук Научный руководитель кандидат юридических наук,...»

«по специальности...»

«Выстрчил Михаил Георгиевич ОБОСНОВАНИЕ СПОСОБОВ ВНЕШНЕГО ОРИЕНТИРОВАНИЯ ЦИФРОВЫХ МОДЕЛЕЙ ГОРНЫХ ВЫРАБОТОК, ПОЛУЧАЕМЫХ ПО РЕЗУЛЬТАТАМ СЪЕМОК ЛАЗЕРНО-СКАНИРУЮЩИМИ СИСТЕМАМИ Специальность 25.00.16 – Горнопромышленная и нефтегазопромысловая геология, геофизика,...»

«ИЗ ФОНДОВ РОССИЙСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННОЙ БИБЛИОТЕКИ Андерсон, Ольга Владимировна Лингвокультурологические и национально­ментальные особенности языка рекламы Москва Российская государственная библиотека diss.rsl.ru 2006 Андерсон, Ольга Владимировна Лингвокультурологические и национально­ментальные особенности языка рекламы : [Электронный ресурс] : Дис.. канд. филол. наук  : 10.02.19. ­ Краснодар: РГБ, 2006 (Из фондов Российской Государственной Библиотеки)...»

«УДК-616.31.000.93(920) ЧЕРКАСОВ ЮРИЙ АЛЕКСЕЕВИЧ АЛЕКСАНДР ИВАНОВИЧ ЕВДОКИМОВ ОСНОВОПОЛОЖНИК ОТЕЧЕСТВЕННОЙ СТОМАТОЛОГИИ 14.00.21 -Стоматология 07.00.10 - История наук и и техники' ДИССЕРТАЦИЯ На соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: Д.М.Н., профессор B.C. Агапов К.М.Н., профессор Г.Н. Троянский МОСКВА - 2003г. ОГЛАВЛЕНИЕ Стр. ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1....»

«Богачева Ольга Юрьевна Эмпатия как профессионально важное качество врача (на примере врачей терапевтов и врачей хирургов) Специальность 19.00.03 Психология труда, инженерная психология, эргономика по психологическим наук ам ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата психологических наук Научный...»

«МАЗУРЕНКО АННА ВЛАДИМИРОВНА ФОРМИРОВАНИЕ КЛЮЧЕВЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ БРЕНДИНГА ТЕРРИТОРИИ Специальность 08.00.05 – экономика и управление народным хозяйством (маркетинг) диссертация на соискание ученой степени кандидата экономических наук Научный...»

«ГАВРИЛОВ ИЛЬЯ ЮРЬЕВИЧ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВЛИЯНИЯ НАЧАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ПАРА НА ВОЛНОВУЮ СТРУКТУРУ И ПАРАМЕТРЫ ДВУХФАЗНОГО ПОТОКА В СОПЛОВОЙ ТУРБИННОЙ РЕШЕТКЕ Специальность 05.04.12 – Турбомашины и комбинированные турбоустановки Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук Научный руководитель : Доктор технических...»

«Зайцев Владислав Вячеславович РАЗРАБОТКА И ИССЛЕДОВАНИЕ МЕТОДИКИ ПРОЕКТИРОВАНИЯ БАЗЫ МЕТАДАННЫХ ХРАНИЛИЩА ГЕОДАННЫХ Специальность 25.00.35 – Геоинформатика ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата технических наук Научный руководитель д-р техн. наук, проф. А.А. Майоров Москва ОГЛАВЛЕНИЕ...»

«УДК 511.3 Горяшин Дмитрий Викторович Об аддитивных свойствах арифметических функций 01.01.06 математическая логика, алгебра и теория чисел диссертация на соискание учной степени е кандидата физико-математических наук Научный руководитель : доктор физико-математических наук, профессор В. Н. Чубариков Москва 2013 Содержание Обозначения Введение 1 Точные квадраты вида [n]...»

«из ФОНДОВ РОССИЙСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННОЙ БИБЛИОТЕКИ Крюкова, Ирина Васильевна 1. Рекламное имя: от изобретения до прецедентности 1.1. Российская государственная библиотека diss.rsl.ru 2005 Крюкова, Ирина Васильевна Рекламное имя: от изобретения до прецедентности [Электронный ресурс]: Дис.. д-ра филол. наук : 10.02.19.-И.: РГБ, 2005 (Из фондов Российской Государственной Библиотеки) Филологические науки. Художественная литература — Языкознание — Индоевропейские языки — Славянские языки —...»

«Омельченко Галина Георгиевна ГИПЕРГРАФОВЫЕ МОДЕЛИ И МЕТОДЫ РЕШЕНИЯ ДИСКРЕТНЫХ ЗАДАЧ УПРАВЛЕНИЯ В УСЛОВИЯХ НЕОПРЕДЕЛЕННОСТИ 05.13.18 - Математическое моделирование, численные методы и комплексы программ Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Научный руководитель доктор физ.-мат.наук, профессор В.А. Перепелица Черкесск - Содержание ВВЕДЕНИЕ...»








 
2014 www.av.disus.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.