«РОЛЬ ВИРУСА ГРИППА И ЕГО ПОВЕРХНОСТНЫХ БЕЛКОВ В РАЗВИТИИ ДИСФУНКЦИИ КЛЕТОК ЭНДОТЕЛИЯ ...»

Диссеминированое внутрисосудистое свертывание – ДВС, спутник почти любого тяжелого заболевания. Под влиянием различных факторов происходит внутрисосудистое микротромбообразование (отложение тромбоцитарных, фибриновых, смешанных тромбов) в системе микроциркуляции. При этом состоянии происходит активация фибринообразования, агрегации тромбоцитов и фибринолиза [2; 42]. Поэтому на высоте диссеминированного внутрисосудистого свертывания отмечаются следующие основные признаки:

падение числа тромбоцитов как результат их агрегации и потребления;

истощение стимуляторов этих процессов;

гипофибриногенемия и накопление продуктов биотрансформации фибриногена.

В условиях внутрисосудистого свертывания активация фибринолиза вначале носит характер адекватной реакции, защищающей от закупорки капилляров.

Однако она может приобретать и чрезмерный характер, приводя не только к лизису нестабилизированного фибрина, но и к протеолитическому расщеплению плазменных факторов и кровяных пластинок. Активация фибринолиза еще больше повышает уровень свертывающих и лизирующих факторов крови, так как при растворении сгустков освобождаются адсорбированные на них тромбин, плазминоген и плазмин, образуется антиплазмин VI. Все эти вещества инактивируются только частично, поэтому происходит их накапливание, они становятся стимуляторами превращения оставшегося фибриногена в фибрин и его лизиса. Различают острый (шок), подострый (при тяжелой пневмонии, сепсисе) и хронический ДВСсиндромы [2; 42].

Таким образом, дисфункция эндотелия, являющаяся компонентом, а в некоторых случаях и первопричиной различных заболеваний, развивается под действием различных повреждающих факторов. Одним из таких повреждающих факторов является воздействие на эндотелий вирусов и бактерий.

Согласно современным данным большинство ДНК- и РНК-содержащих вирусов способны поражать клетки эндотелия кровеносных сосудов хозяина.

Вирусы герпеса и эндотелий. В семействе вирусов герпеса наиболее изучено воздействие человеческого цитомегаловируса (HCMV) на эндотелиальные клетки.

Показано, что эндотелиальные клетки поддерживают репродукцию HCMV, тем самым способствуя его распространению в организме [50, 244]. Согласно данным электронной просвечивающей микроскопии были обнаружены зрелые HCMV частицы в циркулирующих эндотелиальных клетках, а также в эндотелиальных клетках капилляров и венул, что дало основание предполагать, что цитомегаловирус вызывает десквамацию эндотелия [268, 269]. Стимулируя ангиогенез, цитомегаловирус обеспечивает собственную репродукцию [244]. Уникальность взаимодействия цитомегаловирус-эндотелий состоит еще и в том, что для проникновения вируса в эти клетки требуется совершенно особенный набор белков, кодируемый геном UL-131-128 [232; 256].

Цитомегаловирусная инфекция приводит к дисфункции эндотелия и активирует провоспалительные сигнальные пути: фосфатидил-инозитол-3-киназный и NFB [238]. Кроме того, цитомегаловирусная инфекция приводит к экспрессии рецептора тромбоцитарного фактора роста, а также к увеличению продукции фактора фон Виллебранда и тромбина, что несет в себе риск развития тромбоза и тромбинопосредованной клеточной активации [241; 238]. Так, показано, что экспериментальная HCMV инфекция у крыс приводила к повреждению эндотелиальных клеток аорты [120].

Имеются данные о том, что персистирующая инфекция HCMV – 4 в эндотелиальных клетках островков Лангерганса, приводит к повышению экспрессии адгезионных молекул ICAM и VCAM и увеличению продукции провоспалительных цитокинов IL - 1, IL – 6, хемокинов, IL – 8, а также IFN – [321].

Антитела, направленные против HCMV, модулируют экспрессию генов, кодирующих молекулы, участвующие в активации и апоптозе эндотелиальных клеток, в частности, молекулы белка теплового шока Hsp60 [194].

Данные о влиянии вируса простого герпеса (ВПГ-1) на эндотелиальные клетки и гемостаз противоречивы. С одной стороны, согласно данным Bok и сотр.,(1993), инфекция ВПГ-1 в культуре эндотелия вызывает уменьшение уровня PAI-1, что может стимулировать антикоагулянтный фенотип в естественных условиях. С другой стороны, инфекция ВПГ-1 in vitro вызывала экспрессию молекул адгезии (Р-селектина) и тканевого фактора. Уровни же тромбомодулина, простациклина и тканевого активатора плазминогена уменьшались, что говорит об изменении фенотипа с антикоагулянтного на прокоагулянтный [294; 176; 290].

Вирус герпеса-8 является возбудителем саркомы Капоши. Как оказалось, он способен инфицировать клеточную культуру эндотелиальных клеток микрососудов человека, вызывая как литическую, так и латентную инфекции [84].

Вирусы папилломы человека 16 и 18 типов и эндотелий. Как известно, вирусы папилломы человека размножаются в кератиноцитах и вызывают их неконтролируемый рост, приводящий к развитию онкологических заболеваний. Но, кроме этого, они способны стимулировать пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток микрососудов человека, тем самым способствуя ангиогенезу, необходимому для образования опухоли [98]. Так, белки Е6 и Е7 вируса папилломы человека 16 типа усиливают экспрессию двух ангиогенных индукторов VEGF и IL-8 в культуре первичных кератиноцитов [192; 298]. То же самое относится к белку Е вируса папилломы человека 18 типа, который способствует опухолевому ангиогенезу путем индукции VEGF транскрипции р-53 независимым образом [106].

Вирус гепатита В и эндотелий. Показано, что в эндотелии сосудов больных гепатитом В были обнаружены HBcAg и HBsAg, а также промежуточные формы ДНК [200]. Согласно данным Rong и сотр. (2007) вирус гепатита В успешно репродуцируется в культуре эндотелиальных клеток.

Вирус иммунодефицита (HIV) и эндотелий. Большое количество исследований посвящено взаимодействию вируса HIV и эндотелиальных клеток, так как давно отмечено, что у ВИЧ-инфицированных пациентов отмечаются нарушения эндотелий-зависимой возодилатации, что приводит к дисфункции эндотелия и развитию сердечно-сосудистых заболеваний [261; 271]. Так, показано, что ВИЧинфекция связана с десятикратным увеличением риска венозного тромбоза по сравнению с неинфицированным населением того же возраста [70].

Экспериментальные исследования на трансгенных крысах подтверждают, что вирус HIV вызывает нарушения вазодилатации, связанные с уменьшением концентрации оксида азота, причем это уменьшение никак не связано с эндотелиальной NO-синтазой [181]. И экспериментальные, и клинические исследования отмечают взаимосвязь между вирусной нагрузкой и нарушениями эндотелийзависимой вазодилатации [271; 127]. Кроме того, при ВИЧ-инфекции обнаруживаются циркулирующие маркеры повреждения эндотелия, такие как растворимые молекулы адгезии (ICAM, Е-селектин) и прокоагулянтные белки (фактор фон Виллебранда и PAI-1) [158; 127].

Активация эндотелия при ВИЧ может происходить как прямо, так и опосредованно. Некоторые эндотелиальные клетки (клетки пупочной вены, стромы костного мозга и микрососудов) пермиссивны для вируса HIV [117]. Поступление вируса HIV в них может происходить через CD4 рецептор, либо через галактозил – церамидовый рецептор [279].

В случае опосредованного влияния на эндотелий воздействуют цитокины, вырабатывающиеся в ответ на заражение вирусом мононуклеаров и клеток адвентиции. Oтмечают также усиление пролиферации и апоптоза эндотелиальных клеток в ответ на воздействие вируса HIV [Chi et al., 2000].

Не только сам вирус HIV, но и его белки gp120, gp140 и Tat могут активировать эндотелий напрямую [279; 109; 207; 177; 110]. Показано, что белок Тат вируса HIV оказывает плейотропный эффект на сосудистый эндотелий [311]. При воздействии Тат белка на эндотелиальные клетки гемато - энцефалического барьера отмечалось увеличение продукции оксида азота, повышение уровня как eNOS, так и iNOS [61].Кроме того, Тат белок вызывал апоптоз эндотелиальных клеток и увеличение их проницаемости [184], а также экспрессию адгезивных молекул (ICAM, Е-селектин) и протромботических веществ (фактора фон Виллебранда, ингибитора активатора плазминогена) [158; 127]. Предполагают, что Тат белок может действовать в качестве активатора транскрипции ключевых воспалительных молекул, путем активации сигнального пути NFB или сигнального пути MAP-киназ [109; 311].

Оболочечный белок gp120,так же как и Тат белок, вызывает экспрессию адгезивных молекул (ICAM, Е-селектин) и протромботических веществ. Показано, что gp120 оказывает цитотоксическое действие на культуру эндотелиальных клеток микрососудов мозга [177]. Другой оболочечный белок вируса HIV – gp140 – взаимодействует с рецептором CXCR4 в культуре эндотелиальных клеток микрососудов мозга человека, активируя эти клетки [207].

Вирусы – возбудители геморрагических лихорадок и эндотелий. Возбудители геморрагических лихорадок относятся к РНК-содержащим вирусам следующих семейств: тогавирусы (лихорадка Денге, къясанурская лесная болезнь, омская геморрагическая лихорадка), буньявирусы (лихорадки долины рифт и КрымКонго), аренавирусы (лихорадки Ласса, Аргентинская, Боливийская, Венесуэльская и Бразильская), филовирусы (лихорадки Марбург и Эбола) и флавивирусы (желтая лихорадка и омская геморрагическая лихорадка). Общим для этих вирусов является выраженный тропизм к эндотелиальным клеткам. Репродукция возбудителя в эндотелиальных клетках по данным электронной микроскопии сопровождается их набуханием и вакуолизацией, а затем отслаиванием от базальной мембраны и появлением в кровотоке десквамированных эндотелиоцитов.

Патогенез геморрагических состояний при геморрагических лихорадках отражает комплекс процессов:

Разрегулирование компонентов систем, обеспечивающих гемостаз Анатомо-физиологическое обнажение стенок кровеносных сосудов Повышение проницаемости сосуда из-за нарушения его целостности Отставание иммунологически важных защитных реакций Формирование ДВС-симптоматики различной степени выраженности Рассмотрим особенности патогенеза наиболее изученных вирусов - возбудителей геморрагических лихорадок.

Вирус Денге и эндотелий. Известно, что вирус Денге вызывает высокопродуктивную инфекцию в эндотелиальных клетках, что играет центральную роль в патогенезе этого возбудителя [59]. Гистологические повреждения эндотелиальных клеток обычно ограничиваются отеком и увеличением межклеточных расстояний [81]. Инфекция вируса Денге для эндотелиальных клеток сопровождается появлением циркулирующих эндотелиоцитов и эндотелиальных маркеров ICAM и VCAM в кровяном русле, а также увеличением фактора фон Виллебранда, тканевого фактора (TF) и ингибитора активатора плазминогена (PAI) во время первой лихорадочной фазы заболевания [273]. Во время токсической фазы увеличивалось количество растворимого тромбомодулина (sTM), активатора плазминогена тканевого типа(t-PA) и ингибитора активатора плазминогена (PAI-1).Таким образом, наблюдалось повреждение эндотелиальных клеток и выход прокоагулянтных компонентов, активация коагуляционного каскада, приводящая к генерации тромбина, усиление фибринолитических факторов и истощение природных коагулянтов [64].

Существует предположение, что нарушениние эндотелия опосредовано иммунопатологическими реакциями, а не только цитопатическим действием вируса, так как при заболевании происходит выброс провоспалительных цитокинов и химических медиаторов, которые повышают проницаемость эндотелия и, в конечном итоге, приводят к утечке плазмы [187].

Не только сам вирус Денге, но и его белки могут воздействовать на эндотелиоциты. Так, оболочечный белок вируса Денге может связываться с Fc - рецепторами, ICAM3, CD-14, HSP70/90, GRP78 [167; 138; 191; 114]. NS1 протеин вируса Денге преимущественно связывается с эндотелиальными клетками через специфические гликоаминогликаны (гепаран сульфат и хондроитин Е) [60]. Показано также, что белки вируса Денге (Е и NS1) имеют области аминокислотных остатков, гомологичные различным молекулярным факторам (факторам Х, ХI, VII).

Предполагают, что молекулярная мимикрия между белками вируса Денге и молекулами свертывания может вызывать перекрестную реактивность антител, которые препятствуют активации коагуляции [191]. Кроме того, антитела против NS1белка вируса Денге могут выступать в роли аутоантител и вызывать апоптоз эндотелиальных клеток [318].

Вирусы Марбург и Эбола и эндотелий. Эндотелиальные клетки считаются вторичными клетками-мишенями при заболеваниях вирусами Эбола и Марбург.

Первичная репродукция этих вирусов происходит в моноцитах/макрофагах и дендритных клетках. Цитокины, продуцируемые инфицированными вирусом моноцитами/макрофагами, – TNF- и IFN- – провоцируют активацию эндотелия, вызывают фосфорилирование молекулы адгезии PECAM-1и изменения кадгерин / катенинового комплекса сосудистого эндотелия, что приводит к увеличению сосудистой проницаемости и развитию шока [71; 52].

Кроме того, трансмембранный (VP40) и растворимый (sGP) гликопротеины вируса Эбола рассматриваются в качестве основных вирусных патогенных детерминант, способствующих повреждению сосудов [297; 309].

Эндотелиальные клетки восприимчивы к инфекциям большого числа вирусов, использующих в качестве рецепторов 1 и 3 интегрины, которые экспрессируются на поверхности эндотелиальных клеток. Так, вирус лихорадки Западного Нила использует v3 интегрин для входа вируса в клетку [104]. Хантавирус взаимодействует с этим же интегрином, увеличивая сосудистую проницаемость, путем воздействия на VEGF [134].

Парамиксовирусы и эндотелий. Получены данные о том, что вирус кори поражает эндотелиальные клетки кожи, мозга и других органов при острой и персистирующей инфекции, репродуцируется в них, используя для проникновения рецепторы СД 46 и СД150 [55; 193]. По другим данным, вирус кори может использовать для проникновения в эндотелиальные клетки рецептор v3 [151]. Заражение культуры эндотелиальных клеток вирусом кори показало повышение синтеза тканевого фактора и, следовательно, усиление прокоагулянтных свойств эндотелиоцитов. Данное изменение фенотипа может иметь отношение к тромботической васкулопатии, связанной с коревой инфекцией в естественных условиях [203].

Также известно, что в основе патогенеза высокопатогенного вируса Нипах (группа парамиксовирусов) лежит повреждение эндотелиальных клеток микрососудов. Этот вирус обычно вызывает васкулит, который характеризуется некрозом эндотелиоцитов и воспалительной инфильтрацией [197], но тропизм вируса Нипах к различным частям эндотелия различен. Вирус проникает в эндотелиальные клетки путем адсорбции на рецепторах ephrin (ЕВ2) и ephrin (ЕВ3), находящихся в основном в эндотелии сосудов головного мозга [121].

Вирус гепатита C и эндотелий. Вирус гепатита С (HCV) обнаруживали в аутопсийном материале эндотелия капилляров мозга. Клеточные линии (HBMEC, hCMEC/D3 – эндотелий сосудов мозга) поддерживали репродукцию вируса гепатита С. Рецепторами, с помощью которых HCV поступал в клетку, были СД81 и клаудин-1 [126].

Энтеровирусы и эндотелий. Многочисленные исследования показывают, что энтеровирусы, например вирус Коксаки В, могут модулировать сосудистый эндотелий в основном на уровне микрососудов. Инфекция Коксаки В в культуре эндотелиальных клеток приводила к экспрессии молекул адгезии ICAM-1 b VCAM-1 и увеличению количества провоспалительных цитокинов (IL-6, IL-8 и TNF-) [320].

Вирус гриппа и эндотелий. Известно, что геморрагические реакции характерны и для гриппа. Еще в 50-х годах клиницисты отмечали такие клинические реакции при гриппе,как кровотечения, ДВС-синдром, геморрагические пневмонии. Последние особенно часто регистрировались в эпидемию гриппа H1N – 2010гг.

Наблюдения клиницистов и экспериментальные данные о нарушениях процессов фибринолиза вирусами гриппа и их белками указывают на возможно важную роль эндотелия в патогенезе гриппа. Так, имеются данные о способности отдельных белков вируса гриппа модулировать гемостаз в условиях in vitro и in vivo, повышая активность активатора плазминогена [11, 12].

В эндотелиальных клетках артериол кур, зараженных высокопатогенным птичьим вирусом гриппа, были обнаружены сформированные фибриновые тромбы, в которых регистрировались вирусные антигены. Гематологический анализ переферической крови показал, что коагулопатии начинались на ранней стадии инфекции, когда вирусные антигены были обнаружены только в эндотелиальных клетках и в моноцитах/макрофагах [234; 216]. В более поздних исследованиях дисфункция эндотелия птиц, инфицированных вирусом H5N1, характеризовалась дессиминированным внутрисосудистым свертыванем крови (ДВС-синдром) [266].

В последние годы получены данные о детекции РНК и белков вируса гриппа в сердце и аорте мышей через 7 дней после инфицирования их гриппом [148].

Кроме этого, авторы отмечали нарушение морфологии эндотелия кровеносных сосудов, а в клетках эндотелия наблюдали изменение экспрессии ряда генов.

Важно отметить, что все эти изменения регистрировались в отсутствии виремии.

Получены важные данные о том, что энцефалопатия, наблюдаемая при гриппе, является следствием повреждения эндотелия сосудов мозга. Эти исследования были проведены с высокопатогенным птичьим вирусом H7N1 [94]. При этом оказалось, что эндотелиальные клетки сосудов мозга экспрессируют рецепторы Sial2,3Gal и Sial2,6Gal, то есть те рецепторы, которые необходимы для адсорбции вируса гриппа [94].

Исследования последних лет показали, что вирус гриппа (особенно H5N1) активирует преимущественно NFB сигнальный путь, отвечающий за экспрессию провоспалительных цитокинов в эндотелиальных клетках, приводя к извращению иммунного ответа – «цитокиновому шторму» [291]. С другой стороны, оказалось, что стимуляция рецепторов 1 типа сфингозин – 1 фосфата на эндотелиальных клетках уменьшает цитокиновый шторм, миграцию дендритных клеток, антиген специфическую пролиферацию Т-клеток, защищая легочную ткань, но при этом, не влияя на продукцию самого вируса и вирус нейтрализующих антител [286].

Таким образом, экспериментальные данные подтверждают эпидемиологические и клинические наблюдения о способности вируса гриппа вызывать поражения кровеносных сосудов. Однако механизм подобных нарушений до сих пор неясен, поэтому эндотелиальные клетки должны стать объектом интенсивного исследования патогенеза гриппозной инфекции.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1) Эпидемический штамм вируса гриппа человека А/Брисбейн/10/ (Н3N2);

2) реассортантный штамм вируса гриппа птиц А/курица/Курган/5/05 NS1Н5N1). Этот штамм получен методом обратной генетики в лаборатории молекулярной вирусологии и генной инженерии НИИ гриппа; геном включает следующие гены: а) полимеразы РВ2 и РА, нуклеопротеин (NP), неструктурные белки (NS) – от вируса А/PR/8/34(H1N1); полимераза РВ1 – от вируса А/Техас/1/77 (Н3N2); б) гемагглютинин (НА) от дикого штамма А/курица/Курган/5/05 (Н5N1), модифицированный по сайту расщепления; в) нейраминидаза (NA) и мембранные белки (М) – от дикого вируса птиц А/курица/Курган/02/05 (Н5N1);

3)Пандемический штамм А/Санкт-Петербург/2/2009(H1N1)pdm.

Все вирусы получены из лаборатории эволюционной изменчивости вирусов гриппа ФГБУ НИИ гриппа РАМН МЗ РФ. Наличие вируса в исследуемом материале оценивали по реакции гемагглютинирующей активности (РГА) и инфекционной активности по общепринятому методу.

1.2.1 Культура эндотелиальных клеток человека линии EAhy Изучение репродукции вируса гриппа типа А в клетках эндотелия и оценка последствий этой репродукции на функцию клеток проводилось в культуре клеток эндотелия человека EAhy926 любезно предоставленной д-ром Корой Джин Эйджел (Отдел патологии университета Северной Каролины, США). Культура была получена путем гибридизации первичной линии эндотелиальных клеток HUVEC с линией клеток аденокарциномы легкого человека А-549.Клетки линии EAhy926 воспроизводят основные морфологические, фенотипические и функциональные характеристики, присущие эндотелиальным клеткам макрососудов. Клеточная линия обладает развитым механизмом контактного торможения и не требует добавки ростовых факторов при культивировании. Клетки спонтанно экспрессируют фактор фон Виллебранда, t-PA, PAI-1, тканевой фактор.

Клеточную линию EAhy926 поддерживали в среде DMEM/F-12 с Хепесом и L-глутамином, содержащей 10% сыворотки эмбрионов коров («Биолот», СанктПетербург), 100Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина («Биолот», СанктПетербург) и добавку НАТ («Вектон», СПб). Культивировали клетки при 370С во влажной атмосфере с 5% содержанием СО2. Линия EAhy926 является адгезионной культурой, требующей пересева 1 раз в 3-4 дня. Пересев осуществляли по общепринятой методике, вызывая дезинтеграцию монослоя 5-10-минутной экспозицией в растворе Версена («Биолот», Санкт-Петербург). В работе использовали пластиковые флаконы (Sarstedt, Австрия) и плоскодонные планшеты для культивирования клеток (Nunc,Дания). Отсутствие контаминаций (в том числе микоплазмой) контролировали.

Культура клеток МDСК была получена из коллекции клеточных культур НИИ гриппа. Среда для культивирования клеток (среда роста):ДМЕМ(«Биолот», СанктПетербург), содержащая 7% сыворотки крупного рогатого скота («Биолот», Санкт-Петербург) пенициллин/стрептомицин 100Ед/мл, гентамицин 10мг/мл («Биолот», Санкт-Петербург). Среда для выделения вируса: ДМЕМ («Биолот», Санкт-Петербург), содержащая Трипсин – ТРСК («Биолот», Санкт-Петербург) в конечной концентрации 2 мкг/мл. Раствор для дезинтеграции монослоя: 4% раствор Версена («Биолот», Санкт-Петербург).

1.3 Методы оценки репродукции вируса гриппа типа А 1.3.1 Определение инфекционной активности вируса гриппа Заражение клеточного монослоя проводили путем адсорбции вируса при 37о С в атмосфере 5% СО2 (инкубатор фирмы SANYO, Япония) в поддерживающей среде DMEM, содержащей 2 мкг/мл трипсина ТРСК («Биолот», СанктПетербург). Через час после адсорбции клетки отмывали поддерживающей средой DMEM, содержащей 2 мкг/мл трипсина ТРСК и инкубировали в той же среде в течение 72 часов.

Инфекционную активность вирусов гриппа определяли титрованием вируссодержащего материала в суточной культуре EAhy926 с коэффициентом разведения 10 и рассчитывали по общепринятому методу Reed & Muench(1934). Инфекционную активность вирусов оценивали по ТЦД50 (тканевая цитопатическая доза, вызывающая 50% гибель клеток при инфицировании их вирусом) и в реакции гемагглютинации с куриными эритроцитами через 72 часа после заражения.

Репродукцию вирусов гриппа человека и птиц оценивали по наличию вирусной и матричной РНК вируса гриппа А в разрушенных клетках клеточной культуры EAhy926 c помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени и электронно-микроскопического анализа.

1. Выделение вирусной РНК проводили с использованием наборов для выделения нуклеиновых кислот РИБО-сорб ЦНИИ эпидемиологии, Москва, РФ (модификация метода Boom R. et al. (1990), согласно инструкции производителя).

2. Синтез кДНК проводился с использованием двух праймеров: универсального для всех сегментов вируса гриппа А - 12-членного праймера, комплементарного 5’-концу вирионной РНК(IAUPF), и универсального для всех сегментов вируса гриппа А - 13-членного праймера комплементарного 5’-концу матричной РНК(IAUPR). Обратную транскрипцию проводили в реакционной смеси следующего состава: по 1mM каждого из дезоксинуклеозидтрифосфатов, 3 mМ MgCl2 (“Sigma”), 50 mM Трис-HCl (рН 8,3 при +25°С), 50 mМ KCl, 10 mM дитиотрейтола DTT (“Serva”) и 2,5M синтетической затравки (олиго d(N)6) либо для вирусов гриппа типа А - по 0,05M универсальных олигонуклеотидных праймеров (5’AGCAAAAGCAGG3’, 5’AGTAGAAACAAGG3’), 1U/l ингибитора РНКаз (“Promega”) при +37°С 1 час с M-MulV обратной транскриптазой (“Promega”), конечная концентрация 2,5 U/l.

3. ПЦР проводили в присутствии 0,2 mM каждого из дезоксинуклеозидтрифосфатов, 2,5 mМ MgCl2, 30 mM Трис-HCl (рН 8,5 при +25С), 16 mМ (NH4)2SO4, 0,1% Nonidet P40 (“Sigma”), по 0,40 M олигонуклеотидных праймеров и 2,5 Ед.

Taq ДНК-полимеразы (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребсоюза, Россия) на амплификаторе Rotor Gene 6000. Термальный профиль ПЦР: 4 мин 95°C; 1 мин 95°C, 1 мин 45°C, 3 мин 72°C - 40 циклов; 5 мин 72°C. Анализ данных проводили прямым сравнением значений C(t).

Электронно-микроскопический анализ клеточной культуры EAhy926, интактной и инфицированной вирусами гриппа А (доза заражения вирусом 0, ТЦД50 /кл; время репродукции вируса 24 часа), был выполнен на микроскопе JEMКлетки фиксировали в 2% глутаральальдегиде на 0,1М какодилатном буфере (рН 7,4) в течение часа при комнатной температуре, постфиксировали в 1% растворе четырехокиси осмия на том же буфере в аналогичных температурных условиях. Материал обезвоживали в этаноле восходящей концентрации и заключали в смесь эпона и аралдита. Ультратонкие срезы изготавливали на ультратоме LKBИммуногистохимический анализ аутопсийного материала Аутопсийный материал от пациентов, умерших в эпидемию 2009-2010гг., был предоставлен Ленинградским областным патологоанатомическим бюро г.

Санкт-Петербурга. Анализировали ткани методом иммуногистохимии с моноклональными антителами (МКА) к гемагглютинину (НА) и нуклеопротеину (NP) вируса гриппа и выявляли белки вируса гриппа с помощью системы визуализации фирмы Novolink (Novocastra), включающей в себя реакцию с ДАБ-хромогеном, согласно инструкции производителя.

МКА к HA вируса гриппа H1N1pdm 09 и к NP белку вируса гриппа A были получены в лаборатории биотехнологии диагностических препаратов НИИ гриппа. В качестве отрицательного контроля был использован аутопсийный материал от пациентов, умерших с признаками прогрессирующей легочной дисфункции и явлениями острого респираторного дистресс-синдрома, не имевших диагноза «грипп».

1.5 Выделение поверхностные белков исследуемых штаммов вируса Получение поверхностных белков вируса гриппа типа А H1N1pdm 09 осуществляли следующим образом. На первом этапе производили очистку и концентрацию вируссодержащей аллантоисной жидкости проводили по следующей схеме:

1. Осветление вируссодержащей аллантоисной жидкости (g 1320,+40С, центрифуга К-70, ГДР).

2. Дифференциальное центрифугирование (34000 об/мин, 45 мин, +40С, центрифуга L8, ротор 45 ti, Beckman, США) с последующим ресуспендированием в Na-ацетатном буфере (50 mM ацетат Nа, 2 mM NaCl, 0,2 mM EDTA; pH 7,0).

3. Обработка материала фреоном-113 с последующим центрифугированием (2400 g, 15 мин, +40С, центрифуга К-23, ГДР).

Сконцентрированный и очищенный вирус разрушали 7% октилглюкозидом в течение 2 ч при +40С. Материал центрифугировали при 15000 об/мин в течение 1 ч (ротор Beckman SW50.1). К супернатанту, содержащему HA и NA, добавляли 2 %-ный водный раствор бромида цетримония (CTAB, Sigma) до конечной концентрации 0,1%. Образец наносили на анионообменную колонку (1x3 см; сорбент DEAE-Sephadex A-50; Pharmacia Fine Chemicals), предварительно уравновешенную стартовым буфером (50 mM Tris-HCl, 0,1% октилглюкозид; pH 7 для штамма A/курица/Курган/05/2005 и тот же буфер рН 7,5 для штамма A/Брисбейн/10/2007).

NA элюировали 20 мл стартового буфера, HA - 20 мл элюирующего буфера ( mM Tris-HCl, 0,5M NaCl, 0,1% Triton X-100, pH 7,5). Каждую фракцию диализовали против буфера STE в течение 72 ч для удаления остатков октилглюкозида и Triton X-100. Контроль чистоты выделенного материала осуществлялся при помощи электрофореза в полиакриламидном геле по методу Лэммли с последующим анализом гелей на денситометре GS-800 (Bio-Rad Laboratories).

Поверхностные белки(гемагглютинин и нейраминидаза) вирусов гриппа типа А/Брисбейн/10/2007 (Н3N2) и А/курица/Курган/5/05 NS1-81/5:3 (H5N1) были получены и любезно предоставлены д.б.н. И.Н.Жилинской.

1.6 Оценка метаболизма эндотелиальных клеток линии EAhy926 с помощью МТТ-теста Метаболизм клеток эндотелия оценивали с помощью МТТ-теста на общую активность внутриклеточных дегидрогеназ, который широко используется для биохимической оценки выживаемости клеток в культуре. Метод основан на восстановлении диметилтиазолил - дифенилбромид тетразолия митохондриальными и цитоплазматическими дегидрогеназами метаболически активных клеток.

Клетки EAhy926 вносили в 96-луночные планшеты в концентрации кл/лунку в 100 мкл культуральной среды. На следующий день клетки либо заражали вирусами по общепринятой методике, либо обрабатывали поверхностными белками исследуемых штаммов вируса в разной концентрации и с разным временем экспозиции. После экспозиции клеток или с вирусом, или с белком культуральную среду удаляли, к клеткам добавляли раствор МТТ-реактива (3-[4,5dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide,ICN,США) в бессывороточной культуральной среде в концентрации 5мг/мл и инкубировали 3 часа в СО2 инкубаторе. Затем раствор красителя удаляли и заменяли на 960 спирт на 30 минут. Далее планшет помешали в cпектрофотометр Thermofisher VarioScan и снимали показания при длине волны 540 нм.

1.7 Определение активности каспазы-3 иммуноцитохимическим методом Для иммуноцитохимического определения активности каспазы-3 суточный монослой клеток EAhy926 выращивали на предметных стеклах, предварительно покрытых полилизином. Затем клетки либо заражали вирусами по общепринятой методике [Жилинская и др., 2012], либо обрабатывали поверхностными белками исследуемых вирусов в разной концентрации и с разным временем экспозиции.

Зараженные клетки и клетки без заражения и обработки белками фиксировали смесью ацетон:этанол (1:1) в течение 0,5 часа, после чего их обрабатывали с помощью набора моноклональных антител для выявления каспазы-3 (фирма Novocastra, Англия). Визуализацию первичных антител проводили вторичными антителами, конъюгированными с полимером, сцепленным с пероксидазой (фирма Novolink, Англия). Далее следовала окраска диаминобензидином (ДАБ хромогеном), который полимеризуется с образованием коричневого окрашивания и хорошо контрастирует с клеточным ядром, докрашенным гематоксилином Майера (голубое окрашивание).

1.8 Оценка жизнеспособности эндотелиальных клеток линии EAhy Определенное количество эндотелиальных клеток (2 500 000 ) вносили в лунки 6-ти луночного планшета (Sarstedt, Австрия). Суточный монослой клеток либо заражали вирусами по общепринятой методике, либо обрабатывали поверхностными белками исследуемых вирусов в разной концентрации и с разным временем экспозиции, после чего производили дезинтеграцию монослоя в 0,02% растворе ЭДТА (Биолот, РФ) и переносили клеточную суспензию в микропробирки.

Жизнеспособность клеток оценивали методом проточной цитометрии на приборе Epics XL (Becman Coulter, США), снабженный аргоновым лазером с длиной волны 488 нм, с использованием пропидия иодида (PI), в концентрации, окрашивающего ДНК погибших клеток и не проникающего в живые клетки. Оценку количества погибших и живых клеток в образцах проводили, используя двухпараметрическую гистограмму, отображающую PI-окраску клеток в зависимости от прямого светорассеяния.

1.9 Выявление ранне-апоптотических эндотелиальных клеток линии Для оценки процесса апоптоза 2 500 000 эндотелиальных клеток вносили в лунки 6-ти луночного планшета (Sarstedt, Австрия). Суточный монослой клеток либо заражали вирусами по общепринятой методике, либо обрабатывали поверхностными белками исследуемых вирусов в разной концентрации и с разным временем экспозиции, после чего производили дезинтеграцию монослоя в 0,02% растворе ЭДТА (Биолот, РФ) и переносили клеточную суспензию в микропробирки.

Для определения количества клеток в состоянии апоптоза использовали аннексин V, конъюгированный с FITC (Annexin V kit 1, BD Biosciences, США). Эндотелиальные клетки окрашивали аннексином V согласно инструкции производителя.

Анализ образцов производили с помощью проточной цитометрии на приборе Epics XL (Becman Coulter, США), снабженном аргоновым лазером с длиной волны 488 нм. Опыт производили в трех повторностях, количество клеток в состоянии апоптоза выражали в процентах от общего количества анализируемых клеток.

1.10 Определение активности тканевого активатора плазминогена 1.10.1 Определение активности тканевого активатора плазминогена в Активность тканевого активатора плазминогена (t-PA) in vitro определяли по методу Кудряшова и сотр.(1974). Суточный монослой клеток EAhy926 выращивали в культуральных пробирках. Затем клетки либо заражали вирусами по общепринятой методике, либо обрабатывали поверхностными белками исследуемых вирусов в разной концентрации и с разным временем экспозиции. Зараженные и контрольные клетки замораживали при - 200С. После оттаивания суспензию наносили на стандартные фибриновые пластины (прогретые и непрогретые при 86о С в течение 30 мин). Далее пластины инкубировали при 37о С в течение 20- ч и регистрировали результаты по разнице площадей зон лизиса на непрогретых и прогретых пластинах. Разница площадей зон лизиса характеризует величину активности тканевого активатора плазминогена.

1.10.2 Определение активности тканевого активатора плазминогена in vivo Активность активатора плазминогена (t-PA) in vivo определяли по общепринятому методу в эуглобулиновой фракции плазмы крови крыс. Гемагглютинин и нейраминидазу в дозе 50 мкг/кг тела вводили белым беспородным лабораторным крысам весом 200г (10 мкг белка в объеме 0,3мл) и через 10 мин брали кровь из яремной вены (vena jugularis) с консервантом 3,8% NaCl. Получали бедную тромбоцитами плазму крови центрифугированием крови при 3000 об/мин в течение 10 мин. Активность тканевого активатора плазминогена определяли на стандартных (стабилизированных) фибриновых пластинах (по разнице зон лизиса на прогретых при 860С в течении 30 мин и непрогретых пластинах).

1.11 Компьютерный поиск сходных аминокислотных последовательностей в Поиск сходных последовательностей между белками и регуляторными пептидами человека и белками вируса гриппа проводили с помощью компьютерного анализа. Компьютерный поиск подобий в первичной структуре белков опирается на « систему весов», характеризующую допустимость замены одной аминокислоты на другую (в том числе и на саму себя), ибо подобие фрагментов последовательностей означает соответствие аминокислот одного фрагмента аминокислотам другого в порядке их следования; подобие тем выше, чем больше сумма весов замен. Содержательно высокий вес замены означает сохранение в каком-то смысле свойств заменяемой аминокислоты.

Существует несколько подходов к построению матрицы весов: 1)единичная матрица; 2)матрица, основанная на генетическом коде; 3)структурно-генетическая матрица;4) матрица Дэйхоффа. В настоящей работе использовали матрицу Дэйхоффа, видоизмененную Стаденом, пользующуюся наибольшей популярностью.

При последовательном продвижении пептида вдоль белка выделяли такие участки, для которых минимальна вероятность случайно получить соответствующее этим участкам подобие (сумму весов на замены), то есть протяженность соответствующих участков сходства не обусловлена случайными причинами. Реализовав этот алгоритм, можно точно указать границы участков сходства, а также вероятность получения такого сходства по случайным причинам (вероятность указывается в единицах среднеквадратичного отклонения стандартного нормального распределения). Программы, основанные на этом алгоритме доступны в Интернете на сайте http://www.ncbi.nlm.nih.gov. В точном указании границ участков наибольшего сходства состоит основное преимущество этого алгоритма в сравнении с традиционным алгоритмом поиска локальных сходств просмотром окна с фиксированной длиной.

В алгоритме поиска локальных сходств белков для просмотра использовано окно размером (длина сравниваемых фрагментов белков) в 13 аминокислот и применен более строгий критерий родства [44]. Длина окна просмотра была предопределена иммунологическим контекстом: 13 аминокислот - наименьшая длина иммуноэпитопов для главного комплекса гистосовместимости типа II. Сравниваемые фрагменты считались родственными, если в их последовательностях содержалось не менее 7 идентичных позиций аминокислот, что позволяло изначально исключить фрагменты с низким родством и тем самым селектировать наиболее близко родственные последовательности. В последних дополнительно отмечались также позиции неидентичных изофункциональных аминокислот. Источником белков служили доступные по Интернету базы данных белков (http://www.ncbi.nlm.nih.gov и http://platform.gisaid.org).

1.12 Статистическая обработка данных Статистическую обработку данных проводили с применением программного

class='zagtext'> РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ