«РОЛЬ ВИРУСА ГРИППА И ЕГО ПОВЕРХНОСТНЫХ БЕЛКОВ В РАЗВИТИИ ДИСФУНКЦИИ КЛЕТОК ЭНДОТЕЛИЯ ...»

ФГБУ Научно-исследовательский институт гриппа МЗ РФ

На правах рукописи

Азаренок Анастасия Александровна

РОЛЬ ВИРУСА ГРИППА И ЕГО ПОВЕРХНОСТНЫХ БЕЛКОВ В РАЗВИТИИ ДИСФУНКЦИИ КЛЕТОК ЭНДОТЕЛИЯ

03.02.02 – вирусология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель – доктор биологических наук Жилинская И.Н.

Санкт-Петербург 2014 2

СОДЕРЖАНИЕ

№ стр ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Глава 1. Структура вируса гриппа Гемагглютинин 1. Нейраминидаза 1. Мембранный белок М2 1. Мембранный белок М1 1. Нуклеопротеин 1. РНК-зависимая-РНК-полимераза 1. Белок РВ1 1.6. Белок РА 1.6. Белок РВ2 1.6. Неструктурные белки NS1 и NS2 (NEF) 1. Неструктурный белок NS1 1.7. Неструктурный белок NS2 (NEF) 1.7. Структурно-функциональные свойства эндотелия кровеГлава носных сосудов человека Анатомо-физиологическая характеристика 2. Роль эндотелия в раннем воспалительном ответе 2. Адгезионные молекулы 2.2. Вазодилататоры 2.2. Вазоконстрикторы 2.2. Сосудистый эндотелий и система фибринолиза 2.2. Глава 3. Дисфункция эндотелия Изменение секреторной активности эндотелия 3. Апоптоз эндотелиальных клеток 3. Взаимосвязь процессов апоптоза, гемостаза и воспаления 3. Вирусные инфекции и эндотелий 3. ДНК-содержащие вирусы 3.4. РНК-содержащие вирусы 3.4.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. 1. Культура эндотелиальных клеток человека линии 1. Определение инфекционной активности вируса гриппа Иммуногистохимический анализ аутопсийного материала 1. Выделение поверхностные белков исследуемых вирусов 1. Оценка метаболизма эндотелиальных клеток линии 1. Оценка жизнеспособности эндотелиальных клеток линии 1. Выявление раннеапоптотических эндотелиальных клеток 1. Определение активности тканевого активатора плазминогена Определение активности тканевого активатора плаз- миногена в эндотелиальных клетках линии EAhy Определение активности тканевого активатора плазминогена in vivo Компьютерный поиск сходных аминокислотных последовательностей в белках человека и вирусе гриппа 1.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Глава 1. Репродукция вируса гриппа типа А в эндотелиальных Инфекционная активность исследуемых штаммов вируса 1. Выявление РНК, исследуемых штаммов вируса, в культуре клеток EAhy926 с помощью ПЦР Выявление вирусных частиц исследуемых штаммов вируса, в культуре клеток EAhy926 электронно- Иммуногистоцитохимическое исследование аутопсийного материала от больных, умерших в эпидемию гриппа Иммуногистохимический анализ аутопсийного материала легких Иммуногистохимический анализ аутопсийного материала мозга Иммуногистохимический анализ аутопсийного материала сердца следуемых вирусов гриппа и их поверхностных белков Электронно-микроскопический анализ морфологии клеточной культуры эндотелия, инфицированной вирусом Изменение метаболизма эндотелиальных клеток линии 2. EAhy926 при воздействии исследуемых штаммов вируса Изменение метаболизма эндотелиальных клеток линии EAhy926 при воздействии исследуемых штаммов Изменение метаболизма клеток эндотелия при воздействии гемагглютинина исследуемых штаммов вируса Изменение метаболизма клеток эндотелия при воздействии нейраминидазы вируса гриппа А/Брисбейн/10/2007 (Н3N2) и А/курица/Курган/5/ Апоптоз клеток эндотелия под воздействием вируса 2. Активация каспазы-3 в клетках эндотелия под воздействием исследуемых штаммов вируса гриппа Активация каспазы-3 в клетках эндотелия под воздействием поверхностных белков исследуемых Оценка жизнеспособности эндотелиальных клеток линии EAhy926 под воздействием вируса гриппа типа А Выявление аннексин V положительных клеток в культуре клеток эндотелия EAhy926 под воздействием вируса гриппа типа А и его поверхностных белков Оценка активности тканевого активатора плазминогена 2. Оценка активности тканевого активатора плазминогена в эндотелиальных клетках линии EAhy926 под влиянием исследуемых штаммов вируса гриппа типа А EAhy926 под влиянием гемагглютинина исследуемых Оценка активности t-PA под влиянием гемагглютинина А/Брисбейн/10/2007 (Н3N2) и А/курица/Курган/5/ Сравнение последовательностей аминокислот тканевого 2. активатора плазминогена и поверхностных белков вирусов гриппа подтипов H5N1, H3N2 и H1N1pdm 09.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Грипп представляет собой инфекцию, занимающую доминирующее положение в структуре инфекционной заболеваемости, как по числу случаев заболевания, так и по наносимому экономическому ущербу. Однако, несмотря на интенсивное изучение возбудителя этой инфекции с момента его открытия и до наших дней, патогенез гриппа остается предметом интереса большого числа исследователей. Это связано в первую очередь с установленным фактом, что вирус гриппа вызывает не только нарушения дыхательной системы, но и поражает нервную систему, кишечник, а также вызывает изменения в системе гемостаза [3, 11]. Механизм этих множественных нарушений при гриппе до сих пор невыяснен. Взаимосвязь гриппозной инфекции и нарушений гемостаза клиницисты отмечали еще в 60-е года прошлого века [39]. Подтверждением этой взаимосвязи явилась эпидемия 2009-2011 гг., во время которой наблюдались тяжелые осложнения в виде энцефалопатий и тромбогеморрагических пневмоний, ключевым моментом в развитии которых явилось повреждение эндотелия кровеносных сосудов вирусом гриппа [7, 26]. Кроме того, эпидемиологические данные также указывают на то, что имеется корреляция между ежегодными эпидемиями гриппа и ростом числа больных, страдающих сердечно-сосудистыми заболеваниями [168;

3; 143; 162; 89; 310]. Так как среди причин развития сердечно-сосудистых заболеваний дисфункция эндотелия занимает одно из первых мест, то можно предполагать, что в случае подтверждения способности вируса гриппа поражать эндотелий кровеносных сосудов человека, гриппозная инфекция может представлять угрозу возникновения сердечно-сосудистой патологии. Поэтому, представляло интерес выяснить, влияет ли гриппозная инфекция на развитие дисфункции эндотелия.

Эндотелий кровеносных сосудов в настоящее время рассматривается не просто как барьер между кровью и окружающими тканями, но как диффузный эндокринный орган, пронизывающий все системы организма [6]. Основной функцией эндотелия является поддержание гемостаза, то есть непрерывного тока крови, но кроме этого клетки эндотелия участвуют в процессах воспаления, ангиогенеза и т.д [128; 6; 27]. В связи с этим эндотелий оказывается мишенью для большинства патогенов, как бактериальных, так и вирусных. Большое число исследований посвящено воздействию на эндотелиальные клетки таких вирусов, как вирус иммунодефицита, цитомегаловирус, вирусы-возбудители геморрагических лихорадок [212;154]. На этом фоне количество работ, посвященных влиянию вируса гриппа и его белков на клетки эндотелия, крайне незначительно и проведение подобных исследований при изучении патогенеза гриппозной инфекции представляется актуальным. Фундаментальные исследования по изучению механизмов взаимодействия вируса гриппа с клетками эндотелия в России не проводятся.

Имеется ряд сообщений о патоморфологических исследованиях клеток эндотелия при гриппозной инфекции [32, 7, 26], а также клинические исследования, касающиеся терапии ДВС-синдрома и геморрагических пневмоний при гриппе [Роганова, 2009]. Монографий на данную тему, а также защищенных кандидатских и докторских диссертаций не имеется. В основе работы лежат данные, полученные доктором биологических наук Жилинской И.Н. (сотрудником ФГБУ НИИ гриппа МЗ РФ) – докторская диссертация «Роль вирусных белков в патогенезе гриппозной инфекции», 2003 год.

Цель и задачи исследования. Целью работы было показать возможность репродукции вируса гриппа в клетках эндотелия сосудов человека и выявить роль вируса гриппа и его поверхностных белков – гемагглютинина и нейраминидазы – в развитии дисфункции эндотелиальных клеток.

Для достижения поставленной цели планировалось решить следующие задачи:

1). Выявить особенности репродукции эпидемически актуальных штаммов вируса гриппа человека и птиц в культуре клеток эндотелия человека EAhy926.

2). Оценить воздействие эпидемически актуальных штаммов вируса гриппа и его поверхностных белков на дыхательную активность митохондрий эндотелиальных клеток.

3) Выяснить воздействие эпидемически актуальных штаммов вируса гриппа и его поверхностных белков на апоптоз клеток эндотелия.

4) Изучить влияние эпидемически актуальных штаммов вируса гриппа и его поверхностных белков на выживаемость клеток эндотелия.

5) Оценить развитие дисфункции эндотелия под воздействием эпидемически актуальных штаммов вируса гриппа и его поверхностных белков по активности человеческого тканевого активатора плазминогена.

Научная новизна работы. Доказано, что вирус гриппа способен репродуцироваться в клетках эндотелия человека in vitro (на модели клеточной культуры EAhy926). На модели клеточной культуры репродукция вируса гриппа была зарегистрирована вирусологическим, молекулярно-биологическим и электронномикроскопическим методами, а также была подтверждена при изучении аутопсийного материала легких, мозга и сердца.

Впервые показано развитие дисфункции эндотелия под воздействием вируса гриппа и его поверхностных белков с использованием нескольких критериев:

по развитию апоптоза, по угнетению метаболизма клеток эндотелия, по активации тканевого активатора плазминогена.

Развитие апоптоза было подтверждено данными по активации каспазы-3 и регистрации аннексин V положительных апоптотических клеток. Впервые было показано, что вирус гриппа типа А вызывает активацию каспазы-3 в эндотелиальных клетках через 30 минут после их инфицирования. Аналогичные данные получены и для поверхностных белков исследуемых вирусов – гемагглютинина и нейраминидазы. Исследуемые штаммы вируса гриппа и их поверхностный белок нейраминидаза вызывали развитие апоптоза на ранних сроках воздействия (4часов), что регистрировалось по появлению аннексин V положительных клеток (6% от общего числа клеток). При изучении воздействия другого поверхностного белка – гемагглютинина – было показано, что, несмотря на активацию каспазы-3, гемагглютинин вируса гриппа вызывает гибель эндотелиальных клеток только по некротическому пути.

Показано угнетение метаболизма клеток эндотелия как цельным вирусом гриппа типа А, так и его поверхностными белками, что регистрировалось по изменению активности внутриклеточных дегидрогеназ.

Выявлена активация процесса фибринолиза (увеличение активности тканевого активатора плазминогена) под влиянием вируса гриппа и его поверхностных белков в клетках эндотелия человека in vitro (на модели клеточной культуры EAhy926) и in vivo (в эуглобулиновой фракции крови крыс). Можно предположить, что механизмом активации процесса фибринолиза может служить мимикрия аминокислотных последовательностей тканевого активатора плазминогена в структуре гемагглютинина и нейраминидазы.

Теоретическая и практическая значимость работы. Возможность репродукции вируса гриппа типа А в клетках эндотелия человека как in vitro, так и in vivo имеет большое значение для практической медицины, так как открывает новый аспект патогенеза гриппозной инфекции. Показано, что репродукция вируса гриппа приводит к изменению морфологии клеток эндотелия, к угнетению метаболизма, развитию апоптоза и активации тканевого активатора плазминогена.

Все перечисленные критерии указывают на то, что гриппозная инфекция приводит к прямому повреждению эндотелиальных клеток, которое выражается в развитии дисфункции. Все эти данные согласуются с клинической картиной при гриппозной инфекции.

Таким образом, впервые показана важная роль клеток эндотелия в патогенезе гриппозной инфекции. Полученные данные указывают на необходимость комплексной терапии при гриппе, а также открывают новые подходы в разработке противогриппозных препаратов. Кроме того, становится очевидным, что развитие дисфункции эндотелия при гриппозной инфекции может привести к развитию сердечно-сосудистой патологии в виду ежегодных эпидемий гриппа.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Вирус гриппа типа А способен репродуцироваться в клетках эндотелия кровеносной системы человека.

2. Вирус гриппа типа А и его поверхностные белки вызывают дисфункцию эндотелиальных клеток, которая выражается:

а) в развитии апоптоза.

б) в угнетении метаболизма эндотелиальных клеток;

в) в активации процесса фибринолиза путем увеличения активности тканевого активатора плазминогена.

3. Поверхностные белки вируса гриппа типа А – гемагглютинин и нейраминидаза – также вызывают развитие дисфункции эндотелия по тем же параметрам, что и цельный вирус гриппа.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы представлены на Международной конференции «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями» Санкт-Петербург 2010г.; Четвертой научнопрактической конференции «Актуальные вопросы инфекционной патологии»

Санкт-Петербург 2010г.; Всероссийской научно-практической конференции по медицинской микробиологии и клинической микологии(XV Кашкинские чтения) Санкт-Петербург 2012 г.; Юбилейной научно-практической конференции «Грипп:

эпидемиология, вирусология и лечение» Санкт-Петербург, 2012г.; Всероссийской научно-практической конференции по медицинской микробиологии и клинической микологии(XVI Кашкинские чтения) Санкт-Петербург 2013 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, из них - 6 статей в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации. Объем работы составляет 183 страницы машинописного текста, включая 6 таблиц и 31 рисунок. Список литературы из 328 наименований, из них 49 отечественных и 279 зарубежных.

Основные результаты, изложенные в диссертации, получены в соавторстве с Жилинской И.Н., Прочухановой А.Р., Ильинской Е.В., Сироткиным А.Н., Козловой Н.М., Еропкиной Е.М., Царевой Т.Р. и Сорокиным Е.В. - сотрудниками ФГБУ НИИ гриппа РАМН МЗ РФ; Ляпиной Л. А. и Оберган Т.Ю. – сотрудниками кафедры защитных систем крови МГУ, Москва; Харченко Е.П. - сотрудником Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М.Сеченова РАН; Люблинской О.Г. и Зениным – сотрудниками Института цитологии РАН.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Согласно современным данным, большинство вирусов способны поражать клетки эндотелия кровеносных сосудов хозяина. К ним относятся как ДНК-, так и РНК-содержащие вирусы, такие как герпесвирусы, вирусы гепатита В и С, вирус Денге, вирус Эбола, HIV, вирус кори и др. [212;154]. Эндотелиальный тропизм вирусов является чрезвычайно важным аспектом патогенеза вирусных инфекций, т.к. эндотелий играет ключевую роль в нормальном функционировании организма хозяина.

В настоящее время сформулированы основные функции эндотелия, такие как: 1) выполняет роль железы внутренней секреции, не имеющей себе равных ни по размеру, ни по функции; 2) секретирует в норме одни биологически активные вещества, а при дисфункции – другие; 3) способен преобразовывать биологически активные вещества, синтезируемые разными органами (печенью, почками) и находящиеся в крови; 4) регулирует гемостаз; 5) выполняет иммунные функции, представляя антигены иммунокомпетентным клеткам; 6) активно участвует в развитии воспалительной реакции[128; 6; 27]. Все это позволяет отнести эндотелий к органам внутренней секреции, участвующим в регуляции многочисленных биологических процессов. Нарушение функций эндотелия приводит к развитию целого ряда заболеваний, и, в первую очередь, повреждению сердечно-сосудистой системы. Именно поэтому изучению механизмов дисфункции эндотелия посвящены многочисленные исследования по патогенезу различного рода заболеваний, включая и вирусные инфекции.

Патогенез гриппа также связан с нарушениями в системе гемостаза [246; 11;

12; 180; 280; 148]. Однако до сих пор механизм подобных нарушений неясен. Исследования дисфункции эндотелия при гриппозной инфекции становятся особенно актуальными, т.к. этот возбудитель вызывает ежегодные эпидемии и имеется четкая взаимосвязь между эпидемиями гриппа и ростом числа больных, страдающих сердечно-сосудистыми заболеваниями [168; 3; 143; 162; 89; 310]. В первую очередь рассмотрим структуру и функцию белков вируса гриппа, так как именно вирусные белки играют основную роль в регуляции целого ряда биохимических процессов клетки хозяина.

Известно, что геном вируса гриппа кодирует 14 белков, которые можно классифицировать следующим образом:

1. Поверхностные белки – НА, NA, M 2. Внутренние белки – M1, NP, PB1, PA, PB2, NEF 3. Неструктурные белк – NS1, N40, PB1-F2.

Гемагглютинин – один из самых крупных белков в вирионе гриппа, на его долю приходится от 25-35% всех белков. Этот белок выполняет функции, крайне важные для развития инфекционного процесса: взаимодействует со специфическим для вируса гриппа клеточным рецептором - сиаловой кислотой [299], участвует в проникновении вируса в клетку, путем слияния вирусной мембраны с клеточной и слияния вирусной мембраны с эндосомальной в процессе «раздевания»

вируса [278]; наконец, именно против гемагглютинина направлены антитела, нейтрализующие инфекционность вируса гриппа [254, 315].

Структура гемагглютинина привлекала внимание многих исследователей, поэтому он был одним из первых наиболее изученных белков.

Поверхностный шип гемагглютинина представляет собой тример, состоящий из идентичных субъединиц, обозначаемых как НАО (молекулярная масса кДа). Каждая из субъединиц состоит из двух полипептидов – НА1 (тяжелая цепь гемагглютинина) с молекулярной массой 55 кДа и НА2 (легкая цепь гемагглютинина) – молекулярная масса – 20 кДа [12; 22]. Расщепление молекулы НАО на тяжелую и легкую цепи необходимо как для проникновения вируса в клетку [112], так и для формирования инфекционной частицы на последнем этапе репродукции вируса [78].

Согласно литературным данным, вся молекула НАО состоит из 567 аминокислотных остатков [308; 276]. N-конец НАО представлен высококонсервативной последовательностью, которая называется сигнальным пептидом, и состоит из 16аминокислотных остатков [169].Сигнальный пептид участвует в процессе переноса белка к месту сборки, а затем удаляется.

Тяжелая цепь гемагглютинина – НА1 – состоит из 328 аминокислотных остатков и содержит ряд функционально важных областей. Во-первых, это рецепторный «карман», который по разным источникам включает в себя аминокислотные остатки в 98, 153, 183, 190, 194 положениях (тирозин, триптофан, гистидин, глютамин и лейцин) [308], и аминокислотные последовательности 134-138 и 224По современным представлениям рецепторный «карман» – мишень для нейтрализующих антител, которые встраиваются в рецепторный «карман», мимикрируя сиаловые кислоты [276].

Во-вторых, в НА1 находятся основные антигенные детерминанты. Анализ изменений гемагглютинина выявил 5 антигенных сайтов. Они обозначаются как:

Sa (аминокислотные остатки в положении 128-129, 156-160, 162-167); Sb (аминокислотные остатки в положении 187-198); Са1 (аминокислотные остатки в положении169-173, 206-208, 238-240); Са2 (аминокислотные остатки в положении140и Cb (74-79). При этом буквой С обозначены общие для всех антигенные сайты, а буквой S – штаммоспецифические [276]. Некоторые авторы считают, что аминокислотные остатки с 116 по 261 можно считать рецепторсвязывающим сайтом в окружении антигенных сайтов [276].

Кроме упомянутых областей, в НА1 выделяют гистидин в положении 18 и 38. Эти сайты высококонсервативны, чувствительны к рН и важны для конформационной перестройки гемагглютинина [172; 276].

Вслед за молекулой НА1 идет молекула НА2, отделенная от НА1 областью аминокислот, называемых сайтом расщепления. От состава и последовательности аминокислотных остатков в пептиде слияния зависит активность взаимодействия НА с клеточными мембранами. Расщепление НА клеточными протеазами по аргинину или лизину является необходимым условием инфекционности вируса, распространения вируса в зараженном организме, тропизма к тканям и вирусной патогенности. Существуют различия в специфике эндопротеаз клетки-хозяина (сериновые или фуриновые), которые распознают различные мотивы последовательностей в сайте расщепления [255, 278].Так сериновые протеазы «узнают» в основном последовательности одноосновных аминокислот в сайтах расщепления НА вирусов гриппа млекопитающих и непатогенных вирусов птичьего гриппа.

Считается, что ограниченное определенными типами клеток, распространение этих протеаз приводит к локализованным инфекциям [255, 278 ]. Фуриновые протеазы, распространенные повсеместно, «узнают» сайт расщепления, состоящий из многоосновных аминокислот. Такой сайт расщепления характерен для высокопатогенных вирусов гриппа птиц, вызывающих генерализованные инфекции [255, 279].

За сайтом расщепления располагается высококонсервативная область НА2 – так называемый пептид слияния. Структура пептида слияния детально охарактеризована [112]. Последовательность из 23 аминокислот состоит из нескольких остатков гидрофобных аминокислот и остатков глицина, перемежающихся по всей последовательности. Гидрофобность и спиральная структура пептида слияния считаются важным условием при взаимодействии НА с мембраной эндосомы [112].

Далее за петидом слияния идет последовательность аминокислот, которая называется heptad repeat region и состоит из повторения семи аминокислот следующим образом: гидрофобная, полярная, полярная, гидрофобная, изменяемая, полярная, изменяемая. Такая структура этих областей (55-77 ак и 100-112 ак) обеспечивает конформационные изменения молекулы гемагглютинина в эндосоме [92].

У С-конца молекулы НА2 находится трансмембранный домен – последовательность из 28 аминокислот, который заякоривает гемагглютинин в липидной мембране вируса, за трансмембранным доменом следует последовательность из 10 аминокислот так называемого цитоплазматического «хвоста» [276], который играет существенную роль при сборке вирусных частиц и упаковке вирусного генома [323, 324].

Оставшиеся после расщепления субъединицы НА1 и НА2 соединены между собой дисульфидными связями, которые играют большую роль в стабилизации конформации НА [161]. Расположение этих связей показано на рисунке1.

Рисунок1. Положение дисульфидных связей в субъединицах молекулы НА (НА1 и НА2).

Как видно из рисунка 1 дисульфидные связи, соединяют аминокислотные остатки 14, 97 и 139 молекулы НА1 с 137, 144 и 148 аминокислотными остатками НА2.

Кроме того, есть три дисульфидные связи внутри молекулы НА1 и четыре дисульфидные связи внутри молекулы НА2 [161]. Сравнение гемагглютининов различных подтипов вируса гриппа показало сходство в положении дисульфидных связей. Различия наблюдались только в порядке связывания аминокислотных остатков между собой.

В молекуле НА обнаружены углеводы, так что фактически он представляет собой гликопротеин [261; 65; 178]. Гликозилирование гемагглютинина влияет на связывание с рецепторами и антигенные свойства вируса [261]. Кроме того, углеводы участвуют во внутриклеточном транспорте НА к месту сборки вирусных частиц и вносят значительный вклад в стабилизацию его структуры [65; 178]. В молекуле НА может обнаруживаться от 3 до 9 углеводных цепей, которые в основном сосредоточены в НА1 [261]. Положение мест прикрепления углеводов может меняться у разных подтипов и штаммов, за исключением 154 аминокислотного остатка в НА2. Эта связь оказалось консервативной для всех исследованных штаммов [169]. Локализация углеводных цепей определяет выбор ферментов для «упаковки» вновь синтезированного НА в эндоплазматическом ретикулюме [78].

Такова структура мономера гемагглютинина. Биологической активностью НА обладает только в виде тримера [276]. Пространственная структура тримера весьма сложна. Каждый мономер, содержащий сцепленные субъединицы НА1 и НА2, образует структуру, состоящую из стержня, на верхнем конце которого находится большая глобулярная часть, на нижнем – малая глобулярная часть. Тяжелая цепь НА1 идет по стержню и восемь раз меняет направление, а затем образует большую глобулу. Легкая цепь НА2 располагается в пределах стержня и далее образует маленькую глобулу [276]. Три углеводные цепи расположены в большой глобуле и до четырех - в области стержня. Рецептор-связывающий сайт и антигенные детерминанты локализованы в области большой глобулы [178].

Оказалось, что НА выполняет важные функции не только в процессе репродукции вируса, но и в регуляции ряда других биохимических процессов в клетке, необходимых для обеспечения успешной репродукции. Так, получены данные о том, что в структуре НА вируса гриппа А/Калифорния/обнаружена последовательность токсина скорпиона [22]. Эти же последовательности обнаружены в НA вирусов подтипов H3N2 и H5N1.

Кроме того, в структуре НА обнаружены последовательности аминокислотных остатков сходных с последовательностью ряда областей тканевого активатора плазминогена – крингл 1, крингл 2 и «пептидазаS1». Крингл1 отвечает за связь с фибрином; крингл 2 отвечает за связь с аннексином 2 (рецептором активатора плазминогена); «пептидазаS1» отвечает за расщепление плазминогена. Карта функционально важных областей гемагглютинина вируса гриппа представлена на рисунке 2.

Рисунок 2. Карта функционально-значимых участков белка гемагглютинина (НА) вируса гриппа типа А (H3N2).

1 – Сигнальный пептид (1-18 ак).

2 – Рецептор-связывающий сайт в окружении антигенных сайтов(116-261ак.) 3 – Сайт расщепления (328-335 ак).

4 – Пептид слияния (328-346 ак) 5 – Heptad repeat region (55-77 ак, 100-112 ак) 6 – Трансмембранный домен (513-556 ак).

7 – Цитоплазматический «хвост» (556-567ак).

2а – Последовательность аминокислотных остатков, мимикрирующие Крингл1 (113-153 ак) (область t-PA, отвечающую за связь с фибрином).

7а, 8 – Последовательности аминокислотных остатков, мимикрирующие Крингл2 (274-310 ак и 554-562 ак.) (область t-PA, отвечающую за связь с аннексином II - рецептором активатора плазминогена).

6а – Последовательности аминокислотных остатков, мимикрирующие Пептидазу S1 (515- ак.).

Второй поверхностный белок вируса гриппа – нейраминидаза(NA).

Нейраминидаза принадлежит к семейству сиалидаз – гликогидролитических ферментов, которые отщепляют сиаловые кислоты от олигосахаридных цепей.

Все сиалидазы имеют высококонсервативные области аминокислотных остатков у N-конца и в каталитической области [135].

Нейраминидаза вируса гриппа состоит из 469 аминокислот [202]. Она ориентирована в вирусной мембране N-концом в отличие от НА [293].

N-конец нейраминидазы состоит из крошечного цитоплазматического «хвоста» (1-6 ак.) за которым следует трансмембранный домен (7-34 ак.) [211, 184, 293]. Оба эти домена представлены гидрофобными остатками аминокислот.

Трансмембранный домен считается ответственным за транслокацию NA [202], кроме того считается, что и трансмембранный, и цитоплазматический домены принимают участие в морфогенезе вирусных частиц [63].

Далее идет область, которую обозначают как неструктурный регион или «стебель»(stalk-motif) [202], который представлен аминокислотными остатками с 35 по 82 и «заякоривается» на вирусной мембране [326]. Эта область содержит остатки полярных аминокислот и участвует в посттрансляционных модификациях [184, 326]. Сравнение между разными штаммами вируса гриппа показало, что неструктурный регион нейраминидазы – крайне вариабельная область и даже существует предположение, что длина «стебля» нейраминидазы может коррелировать с вирулентностью [326].Кроме этого эта область содержит остатки цистеина, которые участвуют в образовании дисульфидных связей, стабилизирующих структуру нейраминидазы [302].

Активный центр нейраминидазы представлен областью аминокислотных остатков с 118 по 425 и отвечает за связь с сиаловыми кислотами [137]. Активный сайт нейраминидазы высококонсервативен и одинаков для гриппа типа А и В [137].

С-конец молекулы не содержит гидрофобных областей и играет важную роль в сборке вирусных частиц, упаковке вирусного генома и транспорте вновь синтезированных молекул к клеточной поверхности [62].

Доказано, что нейраминидаза имеет сайты связывания кальция, что важно для ферментативной активности NA в момент выхода вновь синтезированных вирионов [137].

Шип нейраминидазы на поверхности вириона представлен тетрамером с молекулярной массой 200-250 кДа, каждый мономер с молекулярной массой 50кДа. Нейраминидаза, также как и НА, – гликопротеин, содержащий 20 % углеводов в виде глюкозамина [201]. Трехмерная структура нейраминидазы может быть представлена в виде стебля с глобулярной головкой. Стебель формируют аминокислотные остатки с 35 по 82, головку образует остальная часть молекулы.

Внутри головки полипептидная цепь делает несколько витков. Каталитический центр NA расположен на поверхности головки каждой из субъединиц, поэтому тетрамер имеет четыре активных центра. В головке расположены также все сайты гликозилирования нейраминидазы [201]. Известно, что изменение или миграция сайтов гликозилирования может приводить к следующим последствиям: более эффективно маскировать антигенные сайты; эффективнее защищать сайты ферментативного расщепления нейраминидазы; стабилизировать полимерную структуру; регулировать связь с рецептором и каталитическую активность [286].

Некоторые авторы [282]считают, что нейраминидазы имеют вторичный сайт связывания сиаловых кислот, который не является консервативным, а зависит от происхождения вируса. У вируса птиц этот сайт представлен аминокислотными остатками с 366 по 373, у вируса человека N2 и N1 – с 399 по 403 и с 430 по 433 – соответственно [282].

На сегодняшний день известны следующие функции нейраминидазы:1) NA удаляет сиаловую кислоту от НА, так как без этого НА не сможет освободиться от поверхности клетки и участвовать в следующей стадии репродукции вируса [226;

135].

2) NA способствует освобождению вирусных частиц от поверхности клетки [288].

3). Нейраминидаза обладает плазминоген-связывающей активностью, которая приводит к превращению плазминогена в плазмин и затем к расщеплению НА плазмином. Считается, что данная функция нейраминидазы отвечает за увеличение вирулентности вируса гриппа [140, 185].

4). Появились данные о том, что нейраминидаза способствует выживанию клетки во время репродукции вируса путем активизации сигнального пути, связанного с молекулой адгезии С6. Взаимодействие NA/C6 приводит к фосфорилированию протеинкиназы (Act) и антиапоптического белка Bcl-2, что влияет на выживаемость клеток, пролиферацию, миграцию, дифференциацию и апоптоз [133].

5). Показано, что нейраминидаза вируса гриппа типа А тормозит суперинфекцию другими вирусами, например ретровирусами [159].

Относительно функциональных доменов NA, участвующих не только в проникновении и сборке вириона, но и в регуляции ряда других биохимических процессов в клетке известно очень мало. Так, в структуре нейраминидазы вируса гриппа А/Брисбейн/10/2007(H3N2) нами выявлено 5 областей аминокислотных последовательностей, сходных с активатором плазминогена: две области(116- ак и 198-215 ак) мимикрируют домен крингл 1, по одной области – домен фибронектина (217-235 ак), домен крингл 2 (185-192 ак) и домен пептидаза S1 (71-98 ак) [14]. Карта функционально- значимых областей представлена на рис.3.

Рисунок 3. Карта функционально-значимых участков белка нейраминидазы (NA) вируса гриппа А/Брисбейн/10/2007(Н3N2).

1 – Сигнальный пептид.

2 – N-концевой цитоплазматический хвост (1-6 ак.).

3 – Трансмембранный домен (7-34 ак.).

4 – Неструктурный регион (35-82 ак), который включает в себя трипсин-чувствительные сайты в положениях 57 и 63.

5 – Аминокислотная последовательность, отвечающая за связь с сиаловыми кислотами (118ак).

5a – Аминокислотные остатки (71-98ак), мимикрирующие пептидазу S 5b, 5d – Аминокислотные остатки (116-155 ак и 198-215 ак), мимикрирующие Крингл1.

5c – Аминокислотные остатки (185-192 ак), мимикрирующие Крингл 2.

5e – Аминокислотные остатки (217-235 ак), мимикрирующие домен фибронектина.

Третий поверхностный белок вируса гриппа – мембранный белок М2 представляет собой тетрамер [236; 237]. Основная функция белка М2 – формирование ионного канала, сквозь который осуществляется транспорт протонов, что необходимо для эффективной репродукции вируса [304; 284].

М2 белок состоит из 97 аминокислотных остатков, среди которых можно выделить следующие функциональные области: N-концевой домен или эктодомен (24 ак.), трансмембранный домен (19 ак.) и цитоплазматический домен (54 ак.) [165].

Основная функция эктодомена и трансмембранного домена – образование ионного канала, регулирующего рН среды в процессе раздевания вируса в эндосомах, а также в аппарате Гольджи – месте синтеза НА [287]. Канал сформирован четырьмя параллельными мономерами, которые связаны дисульфидными связями, стабилизирующими его структуру. Выявлены также два сайта – His 37 и Trp – которые определяют селективность канала и его однонаправленность [235].

На начальных стадиях инфекции транспорт протонов внутрь вириона приводит к образованию кислой среды, в результате чего происходит диссоциация М1 белка и РНП, конформационные изменения НА, слияние эндосомальной мембраны с вирусной и выход вирусного РНП в цитоплазму [237]. Предполагается, что на поздних стадиях инфекции ионный канал М2 поддерживает основной рН во время синтеза НА в аппарате Гольджи инфицированной клетки, предотвращая изменения конформации НА [284; 153].

Цитоплазматический домен белка М2 играет важную роль не только в создании ионного канала [165; 163], но и в процессе упаковки вирионной РНК, отпочковывании вириона, в определении морфологии вирусной частицы [90; 204].

Аминокислотные замены в цитоплазматическом «хвосте» могут приводить к неполному включению РНК в вирион и отпочковыванию дефектных вирусов. Данные дефекты могут приводить к прерыванию связи между М1 и М2 белками [204;

97].

В цитоплазматическом «хвосте» белка М2 находятся также сайты расщепления каспазами, которые обладают двойной чувствительностью как к цистеиновым протеазам (каспазам), так и к серингранзимам типа В (белкам участвующим в воспалительных процессах). Предполагается, что наличие этих сайтов влияет на вирулентность и патогенность вируса гриппа [324].

Данные, полученные о влиянии белка М2 на программируемую клеточную гибель неоднозначны. С одной стороны, М2 блокирует один из видов программируемой клеточной гибели – аутофагию, препятствуя слиянию аутофагосом с лизосомами клетки [130]. С другой стороны, трансмембранный домен белка М2 участвует в образовании пор в митохондриях, что приводит к развитию апоптоза по митохондриальному пути [160]. Кроме того, белок М2 способен к взаимодействию с белком теплового шока Hsp 40, который регулирует процесс апоптоза, связываясь с белком р58 – ингибитором протеинкиназы R. Комплекс белка М2, белка теплового шока 40 и белка р58 (M2/Hsp40/p58) приводит к фосфорилированию протеинкиназы R и в конечном итоге к гибели клетки [146]. На рисунке 4 приведена карта функционально-значимых областей белка М2.

Рисунок 4. Карта функциональных областей белка М2.

1 – Эктодомен (24 ак.).

2 – Трансмембранный домен (19 ак.).

3 – Цитоплазматический «хвост» (54 ак.).

Внутренняя поверхность липидного слоя мембраны вириона выстлана мембранным белком М1. На долю белка М1 приходится 40% всей массы вириона.

Молекулярная масса белка составляет 25 кДа.

Основные функции белка М1следующие:1). Сохранение целостности вириона в связи с его способностью связываться как с липидной мембраной и цитоплазматическими «хвостами» оболочечных гликопротеинов, так и с вирионной РНК [53], 2). Белок М1 определяет морфологию вириона; 3). Участвует в процессе репродукции вируса, его сборки и отпочковывания [245; 77].

М1 - белок состоит из 252 аминокислотных остатков [87]. В белке М1 выделяют следующие области: N-концевой домен (1-87 ак), средний домен (87-165ак) и С-концевой домен (165-252ак) [87].

В N- домене белка М1 аминокислотный остаток в положении 41 отвечает за формирование нитевидных частиц вируса гриппа [69].

В среднем домене находится сигнал ядерной локализации (NLS) (аминокислотные остатки 101-105), который отвечает за транспорт вновь синтезированного белка М1 из цитоплазмы в ядро [316; 306; 264].

На границе среднего домена и С-концевого находится последовательность аминокислотных остатков, получившая название Zn-фингер мотива [224]. Znфингер мотив ( последовательность аминокислот содержащая цистеин и гистидин, является Zn связывающей и имеется у всех белков, взаимодействующих с РНК или ДНК ) отвечает за связь только с одноцепочечной вирусной РНК [316;

66].

Белок М1 также играет важную роль в нуклеоцитоплазматическом транспорте вирусной РНК [199; 83]. Для осуществления этого транспорта формируется комплекс белка М1 с вирусной РНК и белком NS2 (NEP/NS2-vRNP-M1). NS2 связывается с вирусной РНК с помощью сигнала ядерного экспорта, содержащегося в его N- конце. М1 белок связывается с триптофаном в положении 78 белка NS2 с помощью сигнала ядерной локализации (101-105 ак) [228; 221; 51; 76].

Показано также, что сигнал ядерной локализации белка М1 содержит области взаимодействия и с NS1 белком вируса гриппа, а в средней части М1 белка находятся области аминокислотных остатков, которые ингибируют транскрипцию и сайт фосфорилирования Ser-161 [119; 66; 267].

На поздних стадиях инфекции белок М1 экспортируется из ядра. Связывание М1 и вРНК в цитоплазме блокирует возвращение вРНК в ядро, что важно для эффективной сборки вируса [83;58].

Аминокислотные остатки в положениях 41, 95, 102 отвечают за формирование нитевидных частиц вируса гриппа и, таким образом, оказываются определяющими для морфологии вириона [251; 118; 86; 69].

В С-концевом домене белка М1 также обнаружены аминокислотные остатки в положениях 204 и 218, которые влияют на морфологию вириона [Kristy et al., 2012].

Помимо выполнения функций, обеспечивающих успешную репродукцию вируса, белок М1 оказывает проапоптическое действие на клетку. Сам белок М не вызывает апоптоз, но может выступать в роли сигнальной молекулы. Так, М связывается с Hsp70 ( белком теплового шока), что приводит к уменьшению взаимодействия между Hsp70 и Apaf-1 (сигнальным белком апоптических путей) и, в конечном счете, к клеточной гибели. За это взаимодействие отвечает область аминокислотных остатков 128-165 белка М1, которая называется субстратсвязывающим доменом [149].

Также показано, что белок М1 вызывает депрессию в поведении крыс и воздействует на гемостаз, подавляя активность тканевого активатора плазминогена [13]. На рисунке 5 приведена карта функционально-значимых областей белка М1.

Рисунок 5. Карта функционально-значимых участков белка М1 вируса гриппа типа А.

1 – N-концевой домен(1-87 ак).

2 – Средний домен(middle domen)(87-165ак).

3 – С-концевой домен (165-252ак).

4 – Сигнала ядерной локализации(NLS) (101-105 ак).

5 – Субстрат связывающий домен(128-165 ак).

Нуклеопротеин (NP) –внутренний белок вириона, взаимодействующий с белком М1, РНК и белками-полимеразами. Он составляет 17-20% от всей массы белков вириона и имеет молекулярную массу 60 кДa. Каждый фрагмент вирусной РНК связан с многочисленными копиями белка NP и тремя полимеразными субъединицами (РА, РВ1 и РВ2) [239;223].

Контакт NP с РНК осуществляется, по-видимому, за счет электростатического взаимодействия, при этом каждый мономер белка NP взаимодействует с нуклеотидными остатками РНК. РНК-связывающая активность NP требуется для транскрипции вирусного генома [213]. РНК-связывающий домен представляет собой последовательность аминокислотных остатков с 130 по 155 ак [223; 76].

Кроме связывания с РНК, NР также связывается с полимеразами. В этом взаимодействии участвуют аминокислотные остатки в положениях 150, 204, 207, [222].

Оказалось также, что во взаимодействии NP-РНК участвуют клеточные белки, в частности белок 48кДа (обозначаемый как RAF-2p48). Этот клеточный белок взаимодействует только со свободным NP с образованием комплекса, который диссоциирует при добавлении свободной РНК, то есть способствует образованию комплекса NP-РНК [76].

Помимо этой функции, NР обеспечивает транспорт вирионной РНК как в ядро клетки, так и из ядра к месту сборки вириона [76]. Транспортные функции NP осуществляются благодаря наличию в структуре этого белка специфических аминокислотных последовательностей, получивших название последовательностей ядерной локализации [111; 312].

За импорт вирусной РНК в ядро клетки отвечают следующие аминокислотные последовательности в NP: монопартитный сигнал ядерной локализации (NLS1) – c 3 по 13 аминокислотный остаток на N-конце молекулы, бипартитный сигнал ядерной локализации (NLS2) (аминокислотные остатки с189 по 216) и, наконец, сигнал ядерной аккумуляции (NAS) (аминокислотные остатки с 327 по 345). N-конец NР высококонсервативен только у вируса гриппа типа А, а бипартитный сигнал ядерной локализации высококонсервативен у всех ортомиксовирусов [305; 111; 312].

На поздних стадиях инфекции вирусная РНК экспортируется из ядра в комплексе с белками М1 и NS2 [76; 319]. NР также принимает участие в транспорте с помощью последовательностей, получивших название сигнала ядерного экспорта – NЕS. Это короткие гидрофобные аминокислотные последовательности, которые направляют белок в цитоплазму через ядерные поры. Таких последовательностей три: NЕS1 – аминокислотные остатки с 24 по 49; NЕS2 – аминокислотные остатки с 183 по 197; NЕS3 – аминокислотные остатки с 248 по 274 [319].

NP, также как и белок М2, имеет последовательность аминокислотных остатков, расщепляемых каспазами (сайты 16 и 497) [324].

Помимо участия NP в репродукции вируса гриппа имеются данные о том, что NP выступает в качестве регуляторного белка в процессе апоптоза. Так, показано, что из-за образования комплекса белка NP и белка теплового шока Hsp40(NP/ Hsp40) происходит разрушение комплекса Hsp40/р58, что приводит к блокированию р 58 фосфорилирования протеинкиназы R, тем самым уменьшая продукцию IFN- и блокируя апоптоз [265].

С другой стороны, NP вызывает активацию клеточного белка р53, основная функция которого, - регуляция клеточного цикла и запуск процесса апоптоза. Это белок с коротким периодом полураспада, его протеолиз осуществляется с помощью другого клеточного белка - Mdm2. NP создает комплекс с р53, ухудшая Mdm2/р53 взаимодействие, увеличивает активацию р53 и его период полураспада, что в конечном итоге ведет к развитию апоптоза [301].

Интересно отметить, что кроме влияния на продукцию IFN-, NP вызывает увеличение экспрессии индуцибельной NO-синтазы [303]. На рис.6 приведена карта функционально-значимых областей белка NP.

Рисунок 6. Карта функционально-значимых участков белка М1 вируса гриппа типа А.

1 – Монопартитный сигнал ядерной локализации (3-13 ак) - NLS1 (nuclear localization signal) 2 – Сигнал ядерного экспорта (24-49 ак) - NES1 (nuclear export signal) 3 – РНК-связывающий домен (130-155 ак) 4 – Сигнал ядерного экспорта (183-197 ак) - NES 5 – Бипартитный сигнал ядерной локализации (198-216 ак) - NLS 6 – Сигнал ядерного экспорта (248-274 ак) - NES 7 – Сигнал ядерной аккумуляции (327-345 ак) – NAS (nuclear accumulation signal).

В тесном контакте с NP и РНК находится РНК-зависимая-РНК-полимераза, которая является мультифункциональным комплексом и состоит из пяти белков:

РВ1, РВ1-F2, N40, РВ2 и РА. Белки РВ, РВ2 и РА взаимодействуют с двумя концами каждого фрагмента вирусной РНК. Кроме этого, комплекс РВ1 и РВ2 взаимодействует с NP. Рассмотрим структуру и функцию каждого из этих белков.

Белок РВ1 имеет молекулярную массу 96 кДА и выполняет следующие функции:

1). Осуществляет катализ РНК-зависимого-РНК-синтеза [175].

2). Является основной субъединицей для сборки вирусных полимераз.

Именно РВ1 взаимодействует и с РА, и с РВ2, но контакта РВ2 с РА не обнаружено. После синтеза полимеразных белков в цитоплазме клетки РВ1 в комплексе с РА транспортируется в ядро отдельно от РВ2 и комплекс РВ1/РА/РВ2 собирается уже в зараженной клетке [189].

3).Проявляет эндонуклеазную активность, отщепляя кэп-фрагмент от клеточной пре мРНК [147].

Белок РВ1 представляет собой последовательность из 757 аминокислотных остатков в котором выделяют следующие функциональные области:

N-концевая область аминокислотных остатков (1-48ак) отвечает за взаимодействие с белком РА [76].

Что касается данных о расположении функциональных областей белка РВ1, отвечающих за связь с вирионной и клеточной РНК, то они различаются у разных исследователей. Так, Boulo и сотр. [2007] выделяют область аминокислотных остатков РВ1, отвечающую за взаимодействие с вирионной и клеточной РНК (1- ак), область отвечающую за взаимодействие с клеточной РНК (267-493ак) и область, отвечающую за взаимодействие только с вирионной РНК (496-757ак) [76].

По данным Jung и сотр.[2006] обнаружено две консервативные последовательности аминокислотных остатков (233-249 ак и 269-281 ак), отвечающие за связь с вирионной РНК [170].

Помимо этих функциональных областей, в структуре РВ1 имеется сигнал ядерной локализации, который представлен областью аминокислотных остатков с187 по 216 и отвечает за транспорт из цитоплазмы в ядро. Ближе к С-концу белка РВ1 находится домен, отвечающий за взаимодействие с белкомРВ2 (506-659 ак) [76].

Также получены данные о том, что несколько сайтов (669, 670 и 672 ак) ответствены за праймер-зависимый синтез вирионной мРНК. Мутации в этих положениях приводят к подавлению способности полимеразы катализировать синтез мРНК, вызывая уменьшение связывания промотора вирионной РНК и кэпирование мРНК [175]. Функционально-значимые области белка РВ1 представлены на рис 7.

В последние годы в структуре гена РВ1 были обнаружены две новые рамки считывания, которые кодируют два белка РВ1-F2 и N40.

РВ1-F2 – одиннадцатый белок вируса гриппа – был открыт больше десяти лет назад. Различные исследования показали, что РВ1-F2 оказывает плейотропный эффект – может индуцировать апоптоз в инфицированных клетках, способствовать воспалению и регулировать патогенность вируса, путем взаимодействия с РВ1 [183]. РВ1-F2 имеет различную длину у разных штаммов (приблизительно 87ак), различную клеточную локализацию и функции, то есть отвечает за штаммспецифическую патогенность [96]. Показано, что РВ1-F2 вирусов H1N1 имеет сигнал митохондриальной локализации, расположенный в области С-конца (62- ак), и вызывает апоптоз по митохондриальному сигнальному пути. РВ1-F2 вирусов дикого типа H5N1 в митохондриях не локализуется и апоптоз не вызывает [96]. У пандемических вирусов H1N1-09 данный белок не синтезируется, так как рамка считывания трижды пересекается стоп-кодонами. Этот генетический признак считается основным отличием современного пандемического вируса H1N1pdm 09 от вируса H1N1-1918 года, вызвавшего эпидемию «испанки». Также имеются данные о том, что белок РВ1-F2 обладает высоким уровенем экспрессии в макрофагах, приводя к развитию апоптоза этих клеток, и тем самым способствуя утяжелению клинической картины при гриппе [108].

Белок N40 открыт в 2009 году [308]. Функции его неизвестны. Белок N является фрагментом белка РВ1, лишенным 39 аминокислотных остатков с Nконца. Известно, что удаление рамки считывания белка РВ1-F2 приводит к стимуляции синтеза N40 и что взаимное влияние трех рамок считывания важно для эффективной репродукции вируса. Оба белка и РВ1-F2, и N40 являются неструктурными белками вируса гриппа. На рисунке 7 приведена карта функциональнозначимых областей белков РВ1, РВ1-F2 и N40.

Рисунок 7. Карта функционально-значимых областей белков РВ1, РВ1-F2 и N40.

1 – N-концевой домен, отвечающий за взаимодействие с белком РА (1-48 ак).

2 – Сигнал ядерной локализации (187-216 ак).

3 – С-концевой домен, отвечающий за взаимодействие с белком РВ2 (506-659 ак).

4 – Домен, отвечающий за взаимодействие с вирионной и клеточной мРНК (1-139 ак).

5 – Домен, отвечающий за взаимодействие с клеточной мРНК (267-493 ак).

6 – Домен, отвечающий за взаимодействие с вирионной мРНК (496-757 ак).

7 – Домен белка РВ1-F2, отвечающий за митохондриальную локализацию (69-82 ак).

Белок РА имеет молекулярную массу 85 кДа и выполняет следующие функции:

1.Индуцирует протеолитические процессы, приводящие к снижению уровня накопления собственного белка и коэкспрессируемых белков [152, 147].

2. Возможно участвует в эндонуклеазном расщеплении клеточных пре мРНК – первом шаге вирусной транскрипции [115].

Белок РА представляет собой последовательность из 716 аминокислотных остатков в котором выделяют следующие функциональные области:

N-конец молекулы РА – последовательность с 1 по 256 аминокислотный остаток – отвечает за протеолитическую активность РА [147].Там же, в N-конце, имеются последовательности ядерной локализации – аминокислотные остатки с 124 по 139 и с 186 по 247 [76]. Как было сказано выше, РА может транспортироваться в ядро только в комплексе с РВ1. Интересно, что этот комплекс – РА/РВ1 – вызывает конформационные изменения в РА, которые могут быть необходимы для его ядерной транслокации [195]. Последовательность аминокислотных остатков с 1 по 209 отвечает за эндонуклеазную активность белка РА. Активный центр фермента содержит остатки гистидина и кластер из трех кислых аминокислот, консервативный для всех вирусов гриппа, который связывает два иона марганца, благодаря чему РА можно отнести к металлсвязывающим эндонуклеазам [115].

Кроме N-конца молекулы РА, отвечающего за протеолитическую активность фермента, выделяют еще сайт в положении 624, отвечающий за серин- протеазную активность [147]. Далее, у С-конца молекулы РА находится домен с по 716 аминокислотный остаток, отвечающий за связь с РВ1 [76]. Отмечают, что мутации в С-конце молекулы РА оказывают влияние на ядерную локализацию белка, синтез вирусной РНК и упаковку вирусного генома. Возможно, что за это отвечает последовательность аминокислотных остатков с 497 по 518 [190].

В настоящее время выявлены два новых белка, кодируемые тем же геном, что и белок РА. Эти белки представляют собой белок РА, усеченный по N-концу.

Их назвали РА-155 и РА-182 соответственно. Данные белки не обладают полимеразной активностью при совместной экспрессии с РВ1 и РВ2, но их отсутствие у мутантных вирусов приводит к более медленной репродукции в культуре клеток, что позволяет предположить, что данные белки обладают важными свойствами в процессе репродукции вируса [218].

Ниже приведена карта функционально значимых областей белка РА.

Рисунок 8. Карта функционально-значимых областей белков РА,РА-155,РА-182.

1 – Последовательность аминокислотных остатков с 1 по 257, отвечающая за протеолитическую активность белка.

2 – Последовательность аминокислотных остатков с 1 по 209, отвечающая за эндонуклеазную активность белка.

3,4 – Последовательности аминокислотных остатков с124 по 139 и с 186 по 247 соответственно, представляющие сигнал ядерной локализации.

5 – Последовательность аминокислотных остатков с 497 по 518, отвечающая за упаковку вирусного генома.

6 – Последовательность аминокислотных остатков с 668 по 716, отвечающая за взаимодействие с РВ1.

Белок РВ2 имеет молекулярную массу 87 кДа и выполняет следующие функции:

1. Отщепление кэп- фрагментов от хозяйских мРНК, которые используются в качестве праймеров для вирусной транскрипции [76; 141].

2. Взаимодействует с митохондриальными белками. Это взаимодействие блокирует экспрессию IFN-, тем самым подавляя противовирусный иммунный ответ клетки-хозяина [141].

Белок РВ2 представляет собой последовательность из 759 аминокислотных остатков в которой выделяют следующие функциональные области, которые расположены достаточно симметрично. У N- конца и у С-конца молекулы белка РВ находятся домены, отвечающие за связь с белком РВ1 – последовательность аминокислотных остатков с 1 по 124 и с 577 по 759, соответственно. Домены отвечающие за связь с белком NP, так же находятся у двух концов молекулы РВ2 – последовательности аминокислотных остатков с 1 по 269 и с 580 по 683 [76].

В структуре белка РВ2 имеются также две последовательности аминокислотных остатков, которые участвуют в связывании хозяйских кэп-фрагментов мРНК. Одна последовательность находится на N-конце молекулы РВ2 (242- ак), вторая – на С-конце (538-577 ак) [76; 141]. Показано, что эти последовательности содержат значительное количество триптофановых остатков, которые важны для взаимодействия с кэп-структурой. Для транспорта из цитоплазмы в ядро имеются сигналы ядерной локализации, которые представлены последовательностями аминокислотных остатков с 449 по 495 и с 736 по 739 [76; 195].

Хотя большее количество белка РВ2 в инфицированных клетках локализуется в ядре, где образует комплекс с РВ1 и РА, РВ2 белок был также обнаружен в митохондриях [88]. Предполагалось, что РВ2 может способствовать сохранению функций митохондрий во время гриппозной инфекции [88]. В настоящее время показано, что РВ2 с помощью сигнала митохондриальной локализации (1-120 ак) взаимодействует с митохондриальным противовирусным сигнальным белком MAVS (также называемый VISA) [263; 319] и подавляет опосредованную этим белком экспрессию IFN-. Белки РВ2 вируса гриппа различаются по способности взаимодействовать с митохондриями. Локализация РВ2 в митохондриях характерно только для вирусов гриппа человека. Показано, что разница в митохондриальной локализации белка РВ2 не влияет на репродукцию вирусов гриппа в культуре клеток, но «немитохондриальные» белки РВ2 индуцируют более высокий уровень IFN-, по сравнению с «митохондриальными» [141].

Также показано, что РВ2 играет важную роль в регулировании температурного оптимума для активности РНК-зависимой РНК-полимеразы, возможно из-за влияния на функциональную стабильность полимеразного комплекса [79].

Ниже представлена карта функционально-значимых областей белка РВ Рисунок 9. Карта функционально-значимых областей белка РВ2.

1, 5 – Последовательности аминокислотных остатков (1-124 ак и 577-759 ак), отвечающие за взаимодействие с РВ1.

2, 4 – Последовательности аминокислотных остатков (242-282 ак и 538-577 ак), отвечающие за кэп-связывание.

3, 6 – Последовательности аминокислотных остатков (449-495 ак и 736-739 ак), представляющие собой сигнал ядерной локализации.

7, 8 – Последовательности аминокислотных остатков (1-269ак и 580-683ак), отвечающие за взаимодействие с белком NP.

9 – Последовательность аминокислотных остатков (1-120 ак), представляющая собой сигнал митохондриальной локализации.

Необходимо отметить, что клеточные факторы, ассоциированные с вирусной полимеразой, играют важную роль в процессе транскрипции и репликации вирусного генома [75; 272]. Показано, что клеточный белок протеинкиназа С фосфорилирует РВ1 и NS1. Это взаимодействие определяет активность полимеразного комплекса и эффективность вирусной репликации [196]. Также, для обеспечения функций полимеразного комплекса, необходимо взаимодействие белка РВ2 с белком теплового шока Hsp60, митохондриальным белком р32 и с цитозольным шаперон-содержащим белком ССТ [125]. Показано также, что клеточный белок импортин положительно регулирует активность полимеразного комплекса вирусов гриппа человека, но не вируса гриппа птиц, участвуя в ядерном транспорте белков полимеразного комплекса [157].

Восьмой фрагмент вирионной РНК содержит информацию о структурном белке NS2 и неструктурном белке NS1. Предполагают, что восьмой фрагмент имеет еще одну рамку считывания, но белок не идентифицирован [Clifford et al., 2009]. Рассмотрим подробно структуру и функцию каждого из них.

Белок NS1состоит из 230-237 аминокислотных остатков (в зависимости от штамма вируса) с молекулярной массой 26 кДа [230]. В структуре этого белка содержится два крупных функциональных домена: N-концевой домен (важнейшей частью которого является РНК-связывающий домен), представленный последовательностью аминокислотных остатков с 1 по 73 [101] и С- концевой «эффекторный» домен, представленный последовательностью аминокислотных остатков c 74 по 230, который отвечает за взаимодействие с клеточными белками и стабилизацию РНК- связывающего домена [300]. Помимо этих доменов, идентифицированы следующие функционально-важные участки:

1) последовательность аминокислотных остатков с 5 по 49 называется РНКсвязывающим доменом, причем это связывание возможно только при димеризации белка NS1 [101; 317]. NS1 связывается со следующими типами РНК: вирусной геномной РНК, вирусной мРНК, малой ядерной клеточной РНК и двухцепочечной клеточной РНК [198]. Взаимодействие NS1 белка с малой ядерной РНК указывает на регуляторную роль этого белка в процессе сплайсинга мРНК М1 и мРНК NS1 [131].

2) NS1 в основном локализуется в ядре, но некоторые его количества могут находиться и в цитоплазме [206].Домены, представленные аминокислотными остатками 35, 38 и 41 (высококонсервативный монопартитный сигнал NLS1), а также с 219 по232 (бипартитный сигнал NLS2) необходимы для транспорта NS1 в ядро [144; 150]. В этом процессе участвует клеточный белок импортин [206]. В ядре NS1 взаимодействует с другим клеточным белком – нуклеолином – мультифункциональным ядерным белком [219]. За локализацию NS1 в ядре отвечает также сайт фосфорилирования, представленный остатком серина в положении [131; 73].

3)Домен, представленный аминокислотными остатками с 138 по 147, представляет собой сигнал ядерного экспорта (NES), который обуславливает цитоплазматическую локализацию NS1 [188; 150].

4) NS1 имеет домен, представленный аминокислотной последовательностью 123-144, который связывает клеточный противовирусный белок hGBP1 [327], принадлежий к семейству гуанилатсвязывающих (GBP) интерферонзависимых белков. NS1 блокирует продукцию интерферонов и, а также провоспалительных цитокинов путем взаимодействия с клеточным белком RIG-1 (внутриклеточный рецептор опознавания паттерна, который распознает 5’ трифосфорилированные РНК). В частности, он препятствует убиквитинированию этого белка, что влечет за собой блокаду сигнальных путей, отвечающих за продукцию интерферонов и провоспалительных цитокинов [208; 242].

5) Домен 81-113 отвечает за взаимодействие c клеточным фактором – elF4GI, что приводит к преобладанию процесса трансляции вирусных белков [Aragon et al., 2000]. NS1 также блокирует функцию двух клеточных белков: 2’олигоаденилат синтетазы (OAS) и протеинкиназы R [209, 210]. Оба эти белка являются ингибиторами процессов транскрипции / трансляции вирусных РНК [132].

6) NS1 ингибирует процессинг клеточных мРНК, тем самым давая преимущество вирусным РНК. Домены белка, представленные аминокислотными остатками 103-106 и 144 -148, взаимодействуют с клеточными факторами полиаденилирования (CPSF, PAB2), что приводит к ингибированию полиаденилирования клеточных мРНК и прекращению их транспорта из ядра в цитоплазму [150].

7) Так называемые SH (Sarс homology)домены белка NS1 (последовательности аминокислотных остатков 89-93, 164-167, 212-216) взаимодействуют с регуляторной субъединицей р85 фосфатидил-3-инозитолкиназного пути (NS1), что необходимо для эффективной репродукции вируса и ингибиции апоптоза [166].

8) С-концевой PDZ-связывающего мотив (233-237 ак) может также осуществлять активацию и дизрегуляцию фосфатидил-3-инозитолкиназного пути, путем связывания с клеточными белками, содержащими PDZ-домены. PDZ -домены обычно находятся в клеточных цитоплазматических и мембранассоциированных белках, которые участвуют в различных клеточных процессах, имеющих значение и для вирусной инфекции. NS1 связывается с PDZ белками (Dlg 1, MAGL-1, 2, 3, Scribble) – членами семейства мембранассоциированных гуанилинкиназ, которые отвечают за поляризацию клетки и процессы межклеточного взаимодействия [136]. Взаимодействие NS1 с Dlg 1 приводит также к активации фосфатидил-3инозитолкиназного пути, а взаимодействие с другим белком – Scribble, изменяет клеточную локализацию этого белка, а также защищает инфицированные вирусом гриппа клетки от апоптоза [166; 136].

Белок NS2 – небольшой белок, состоящий из 112 аминокислотных остатков, выполняет следующие функции:

1. NS2 стимулирует синтез вирусной комплементарной РНК, что приводит к увеличению количества вирионной РНК [250; 231].

2. NS2 действует как белок-посредник в экспорте вирусного РНП из ядра, для упаковки в вирионы на переферии клетки. Ядерный экспорт РНП осуществляется путем взаимодействия NS2 с клеточным белком ядерного экспорта CRM (chromosom region maintenance) и вирусным М1 белком, который связан с вирусным рибонуклеопротеином. Характерной особенностью белка CRM1 является его лейцин - богатая аминокислотная последовательность на N-конце молекулы. Аналогичная последовательность (12-21 ак) находится и на N-конце молекулы NS [221; 164]. На сегодняшний день обнаружен еще один лейцин - богатый сигнал ядерного экспорта (NES2), который также отвечает за связь с клеточным белком CRM1 и является высококонсервативным для всех вирусов гриппа [160]. Как и в случае с белками М1 и NP, в выполнении транспортных функций существенную роль играет то, что NS2 фосфорилирован по высококонсервативному, серин- богатому мотиву, представленному аминокислотными остатками с 23 по25 [159].

3. NS2 также активирует клеточную АТФ-азу, которая обеспечивает процесс отпочковывания вируса [139].

Ниже представлена карта функционально- значимых участков белков NS1и NS2.

Рисунок 10. Карта функционально-значимых областей белков NS1и NS2.

1 – РНК-связывающий домен(5-49ао).

2,7 – Сигналы ядерной локализации 1 и 2 (35-41 и 219-232 ак соответственно).

3,4,6 – SH-домены 1, 2. и 3 (89-93,164-167 и 212-216 ак соответственно).

5 – Серин в положении 195.

8 – PDZ-связывающий мотив (233-237 ак).

1’ – Сигнал ядерного экспорта (12-21 ак).

2’ – Сайт фосфорилирования (23-25ак).

3’ – Триптофан в положении 78.

Из приведенных выше данных о функциях белков вируса гриппа становится очевидно, что они полифункциональны и, помимо своих основных функций, выполняют еще и дополнительные, которые помогают обеспечить успешную репродукцию вируса: стимулируют апоптоз, оказывают влияние на фибринолитическую систему и систему гемостаза, воздействуют на клеточный цикл и т.д.

Внедрение вируса в организм вызывает поток сигналов, активирующих целый ряд процессов, с помощью которых организм пытается освободиться от вируса. К таким процессам относиться ранний защитный воспалительный ответ, клеточный и гуморальный иммунные ответы.

Поскольку во всех процессах, которыми организм отвечает на внедрение вируса, эндотелиальные клетки играютважную роль, рассмотрим подробнее структуру и функцию сосудистого эндотелия.

Глава 2 СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ЭНДОТЕЛИЯ

КРОВЕНОСНЫХ СОСУДОВ ЧЕЛОВЕКА

2.1 Анатомо-физиологическая характеристика Эндотелий сосудов в течение продолжительного времени считался защитным слоем, мембраной между кровью и внутренними оболочками стенки сосуда.

В настоящее время эндотелий рассматривается не просто как внутренняя выстилка сосудов, а диффузный эндокринный орган, пронизывающий все системы организма [128; 6; 27].

Эндотелий сосудов – монослой тонких плоских клеток, обладающих очень высокой метаболической и секреторной активностью [34]. Эндотелиальные клетки покрыты мукополисахаридной пленкой, гликокаликсом, имеющей двоякую функцию: предохраняет клетки от повреждения и препятствует адгезии тромбоцитов. Структура и свойства эндотелиальных клеток специфичны для определенных тканей и соответствуют их функциям [205; 34].

Различают следующие виды эндотелия: непрерывный, фенестрированный и прерывистый. Непрерывный эндотелий, называемый еще соматическим, наиболее характерен для капилляров скелетных мышц и гематоэнцефалического барьера.

Фенестрированный эндотелий назван так потому, что включает в себя фенестры, истонченные участки, облегчающие транспорт между кровью и тканью. Данный вид эндотелия характерен для эндокринных желез, ворсинок кишечника и капилляров почечных клубочков. Прерывистый эндотелий, характеризующийся наличием щелей между клетками и прерывистой базальной мембраной, находится в костном мозге [205; 34; 27].

Сосудистые эндотелиальные клетки представляют собой уплощённые полигональные клетки длинной 25 – 50 мкм и шириной 10 – 15 мкм, которые образуют одноклеточный слой на внутренней стороне кровеносных сосудов, причём длинная ось клеток ориентирована в направлении кровотока. Эндотелиальные клетки содержат обычные цитоплазменные органеллы, включая толстые и тонкие филаменты, состоящие из актина и миозина [6; 34; 27].

Специфическими органеллами, характерными для эндотелиальных клеток являются тельца Вейбеля-Паладе – палочковидные структуры, основной функцией которых является аккумуляция фактора фон Виллебранда [1;296;30;].Некоторые исследователи считают, что в этих тельцах также находится тканевой активатор плазминогена [227] Мембрана эндотелиальных клеток богата рецепторами чувствительными ко многим биологическим веществам, синтезируемым местно и циркулирующим в крови (ацетилхолин, брадикинин, катехоламин, вазопрессин, гистамин) [258; 233].

Особенно важное место в функционировании клеток эндотелия занимают его механорецепторы, способные комплексно воспринимать основные гемодинамические характеристики: изменения объема крови, движущейся с определенной скоростью под определенным давлением. Эти изменения гемодинамических характеристик получили название – напряжение сдвига [45].

Эндотелий обладает рецепторами, воспринимающими колебания уровня различных гормонов, метаболитов, сдвиги рН и изменения внутренней среды организма [233]. Его общая масса в организме составляет от 1600 г до 1900 г (больше веса печени). Доказано, что эндотелий обладает сосудодвигательной, антитромбоцитарной, антикоагулянтной, тромболитической, противовоспалительной, антиоксидантной и антипролиферативной активностью [6, 27, 24, 21].

В процессе ангиогенеза эндотелий регулирует рост и пролиферацию субэндотелиальных клеточных и неклеточных структур. Эндотелий выполняет важную секреторную функцию путем высвобождения эндотелиальных релаксирующих и констрикторных факторов [6, 27, 24]. В физиологическом состоянии эндотелий способен поддерживать равновесие между этими двумя антагонистическими процессами, регулируя местный кровоток и состояние гемостаза, соответственно уровню обмена веществ данного органа [27; 24].

Согласно многочисленным исследованиям эндотелий оказывает большое влияние на состояние общего кровотока, что выражается в обеспечении и поддержании нормальных констант общей гемодинамики [5; 27] Секреторная активность эндотелия отличается тем, что он способен не только продуцировать большое количество биологически активных веществ (БАВ), но и преобразовывать некоторые БАВ, синтезированные другими органами (печенью, почками и др.), а также находящиеся в крови [34].

Кроме этого, эндотелий выполняет иммунные функции, представляя антигены иммунокомпетентным клеткам, секретируя интерлейкин-1 (стимулятор Тлимфоцитов) [229] и синтезируя биологически активные вещества, которые влияют на программированную гибель клетки (апоптоз) [18; 35].

Повреждение стенки сосуда и особенно его внутренней части, эндотелия, является важным этапом процесса гемостаза [17] и развития ранней воспалительной реакции [43].

2.2 Роль эндотелия в раннем воспалительном ответе Очевидно, что эндотелий кровеносных сосудов – мишень для большинства патогенов, как бактериальных, так и вирусных. Ранний защитный воспалительный ответ призван препятствовать внедрению и распространению возбудителя, по возможности быстро удаляя его из организма. Ранний воспалительный ответ начинается с привлечения лейкоцитов из кровяного русла в очаг инфекции с последующей их активацией для удаления возбудителя. Мобилизация лейкоцитов в очаг инфекции стимулируется провоспалительными цитокинами (фактор некроза опухоли, интерлейкин-1), а опосредуется адгезионными молекулами на поверхности лейкоцитов и эндотелиальных клеток, а также молекулами хемокинов и их рецепторами [43; 34].

Необходимо отметить, что в физиологических условиях эндотелиальные клетки не экспрессируют молекулы адгезии. Адгезия лейкоцитов происходит в две стадии:

1. Стадия роллинга ( прокатывания лейкоцитов вдоль эндотелия) 2. Стадия плотной адгезии (остановка лейкоцитов).

Эти стадии связаны с адгезивными молекулами, последовательность и время экспрессии которых на лейкоцитах и эндотелии различно. Начальную стадию обеспечивает Р-селектин, экспрессия которого происходит в течение очень короткого времени при воздействии на эндотелий тромбина, гистамина, компонентов системы комплемента и некоторых других стимулов. Р-селектин представляет собой гликопротеин, который хранится в тельцах Вейбеля-Паладе эндотелиальных клеток [43; 34].

Далее на поверхности эндотелиальных клеток, появляются молекулы Еселектина. Их экспрессия индуцируется провоспалительными цитокинами – TNF- и IL-1 через 4-6 часов. Е-селектин также представляет собой гликопротеин и является первой индуцибельной адгезионной молекулой, выявленной на эндотелиальных клетках. Под действием Р- и Е-селектинов происходит роллинг лейкоцитов, при этом Р-селектин обеспечивает начальную стадию – быстрый роллинг лейкоцитов, скорость которого начинает замедляться при экспрессии Еселектина.

Несколько позднее, через 8-9 часов после стимуляции, на поверхности эндотелиальных клеток появляются молекулы межклеточной адгезии, входящие в суперсемейство иммуноглобулинов, ICAM-1 и VCAM-1. Экспрессия этих молекул происходит под воздействием провоспалительных цитокинов (TNF- и IL-1) и приводит к прочному прилипанию циркулирующих лейкоцитов к эндотелиальным клеткам [43; 34].

Эндотелиальные клетки также экспрессируют VE-кадгерин, который играет важную роль в функционировании эндотелия, контролируя образование межклеточных адгезивных соединений.

Эндотелиальные клетки сами являются продуцентами цитокинов. В различных патологических процессах показано участие следующих цитокинов: IL-1, MCP-1, IL-6, IL-8. Продукция и секреция цитокинов наблюдается в ответ на активацию эндотелиальных клеток. Цитокины, продуцируемые эндотелиальными клетками представлены в таблице 1[43].

Цитокины, продуцируемые эндотелиальными клетками.

CXCL CCL

экспрессии адгезионных синтеза острофазных свертывания Индукторами активации эндотелиальных клеток могут выступать различные факторы, в том числе и вирусные инфекции, что подтверждается развитием такого явления как цитокиновый шторм при тяжелой инфекции вируса гриппа.

Активированные под влиянием провоспалительных цитокинов, эндотелиальные клетки продуцируют молекулы вазодилататоров, под действием которых усиливается местный кровоток, повышается проницаемость сосудов для молекул фибриногена, который, покидая сосуды, превращается в фибрин, что способствует ограничению очага инфекции.

Оксид азота. Одним из основных сосудорасширяющих веществ, вырабатываемых эндотелием, является оксид азота (NO) [28; 9]. На продукцию оксида азота влияют такие биологически активные вещества, как ацетилхолин, кинины, серотонин, тромбоксан и др., а также воздействие на механорецепторы эндотелиоцитов [34; 27]. Под влиянием NO происходит активация фермента гуанилатциклазы. Это приводит к увеличению образования цГМФ (циклический гуанозинмонофосфат) и удалению внутриклеточного кальция, так как гуанилатциклаза регулирует содержание калия и кальция в гладких мышцах сосудов и тромбоцитах, воздействуя на кальций-зависимые калиевые каналы [38]. Это приводит к нарушению сократительных функций белков, гиперполяризации клеточной мембраны и расслаблению мышц.

Кроме сосудорасширяющих, оксид азота выполняет целый ряд других важных функций: модулирует высвобождение вазоактивных медиаторов, ингибирует адгезию лейкоцитов, подавляет экспрессию провоспалительных генов, адгезию и агрегацию тромбоцитов, ингибирует миграцию и пролиферацию гладкомышечных клеток и таким образом участвует в ремоделировании сосудов [27; 24].

Основным источником оксида азота в организме является эндотелий сосудов, но образование NO происходит и во многих других клетках и органах, в частности, в мышцах сосудов, тромбоцитах, макрофагах, нейтрофилах, купфферовских клетках печени, многих нейронах, глиальных клетках [28; 9; 27].

Оксид азота образуется из L-аргинина под действием кальций/кальмодулин - зависимой изоформы фермента NO-синтазы при участии ряда кофакторов [27;

21;].

В настоящее время принято деление изомеров синтаз (NOS) на три группы:

нейрональная синтаза – NOS, или nNOS, первоначально обнаружена в нейронах центральной и периферической нервной системы, индуцибельная синтаза NOS-2, или iNOS, как считалось раньше, не экспрессируется постоянно, ее синтез может быть индуцирован во многих клетках организма; находится она в активированных макрофагах, в купферовских клетках печени;

эндотелиальная синтаза NOS-3, или eNOS, обнаружена в клетках сосудистого эндотелия.

Функции и локализация изомеров синтаз в организме относительно специфичны, что определяется как функцией органа, так и общим состоянием организма [34; 27].

Простациклин (простагландин Pgl2) – продукт метаболизма арахидоновой кислоты – обладает сосудорасширяющими, антиагрегантными и цитопротекторными свойствами. Синтезируется преимущественно в эндотелиоцитах и клетках стенок сосудов. Механизм клеточного действия простациклина связан с повышением уровня цАМФ в гладкомышечных клетках и тромбоцитах, путем активации аденилатциклазы, и выражается в релаксации сосудов и препятствии активации тромбоцитов [16]. Участие простациклина в вазодилатации в норме, повидимому, минимально, основной эффект связан с ингибированием агрегациии тромбоцитов.

При блокировании действия оксида азота и простациклина расширение сосудов вызывает эндотелиальный фактор гиперполяризации (ЭФГП) [24]. Химическая природа этого вещества не установлена. ЭФГП вызывает открытие калиевых каналов (вероятно кальцийзависимых) в гладких мышцах, что вызывает расслабление сосудов. Считается, что наибольшее значение ЭФГП имеет в поддержании сосудистого тонуса на уровне микроциркуляторного русла [24].

Описаны еще два фактора, вызывающие расширение сосудов, и продуцируемые эндотелием. Это адреномедулин – сосудорасширяющий пептид, впервые выделенный из клеток феохромоцитомы [16]. Эндотелиальные клетки секретируют этот пептид, который увеличивает продукцию цАМФ в результате активации аденилатциклазы, что приводит к расширению сосудов [20]. Натрийдиуретический пептид С типа (НПС), который образуется в основном в эндотелии сосудов, некоторых клетках крови и участвует в локальной регуляции сосудистого тонуса [16]. НПС вызывает релаксацию сосудов и угнетает пролиферацию гладкомышечных клеток. Его действие опосредовано активацией гуанилатциклазы и увеличением содержания цГМФ [34; 27].

Cистема протеина С (PrC), включающая в себя тромбомодулин, протеин С, протеин S, тромбин (как активатор PrC) и ингибито PrC, хорошо известна как естественный физиологический антикоагулянт. Тромбомодулин – эндотелиальный фактор, ключевое звено нормальной функции эндотелия, определяющее направление и скорость процессов гемостаза, синтезируется эндотелием в физиологических условиях, выполняя функцию рецептора тромбина [113; 20; 27].

Связывая тромбин, тромбомодулин резко меняет его свойства: тромбин теряет способность усиливать процессы коагуляции, превращать фибриноген в фибрин, но приобретает способность активировать плазменные факторы, т.е. из активного коагулянта тромбин превращается в антикоагулянт [27]. Вместе с протеином S активированный протеин С расщепляет факторы Va и VIIIa, итогом чего является угнетение свертывания крови. Кроме того, система протеина С инактивирует ингибитор тканевого активатора плазминогена [27]. По динамике уровня протеина С во время окклюзии можно определить степень антикоагулянтной защиты эндотелия [24].

2-макроглобулин – белок, входящий в систему естественных антикоагулянтов, который обладает способностью связывать активированные компоненты системы свертывания крови [1].

Сильные антикоагулянтные свойства проявляет комплекс гепарина и антитромбина III.

Антитромбин III – сериновая протеаза, постоянно циркулирующая в крови.

Синтезируется печенью и эндотелиальными клетками. Антитромбин III повышает активность калликреина, тем самым увеличивая синтез оксида азота, снижает концентрацию фибриногена и увеличивает растворимость кровяных сгустков (возрастает неферментативный фибринолиз), а также повышает литические свойства комплекса плазминоген-плазмин [25; 49].

Гепарин является кофактором антитромбина III. Комплекс гепарин – антитромбин III (называемый антитромбин II) фиксируется на поверхности эндотелиальных клеток, сильно повышая их тромборезистентность. Этот комплекс проявляет очень сильные антикоагулянтные свойства, ингибирует активность тромбоцитов и тромбина, блокирует активированные плазменные факторы (VIIIa, IXa, Va, VIIa), связывает фибринолитические ферменты [27]. Гепарин вырабатывается тучными клетками, расположенными вокруг капилляров и базофилами, циркулирующими в крови. Особенно много гепарина синтезируется в печени и в легких [34; 27].

Эндотелины. Считается, что наиболее сильными сосудосуживающими веществами, вазоконстрикторами, являются эндотелины [33], которые были обнаружены K.Hickey et al.[1987] при культивации эндотелиальных клеток в гипоксической среде. Cемейство эндотелинов состоит, по крайней мере, из трех сходных по структуре пептидов: эндотелина-1,эндотелина-2 и эндотелина-3, при этом только первый тип синтезируется эндотелиальными клетками. Эндотелины, как и остальные биологически активные вещества, секретируемые эндотелием, действуют паракринно на рецепторы гладких мышц сосудов и паракринно-аутокринно – на рецепторы эндотелия сосудов. Обнаружены А, В и С эндотелиальные рецепторы. Все они являются гликопротеидами, различаются по месту расположения, по характеру реакции с определенными изомерами эндотелинов [34; 27; 255].

В физиологических концентрациях эндотелин-1 действует на эндотелиальные рецепторы, вызывая высвобождение релаксирующих факторов, а в более высоких – активирует рецепторы на гладкомышечных клетках, стимулируя стойкое сужение сосудов [24]. При связывании эндотелина с рецепторами происходит высвобождение ионов кальция, который связывается с кальмодулином и активирует процессы клеточного сокращения [47]. Из других эффектов эндотелина следует отметить его способность вызывать экспрессию адгезивных молекул, тем самым способствуя тромбообразованию [247; 277].

Эндотелий также синтезирует ангиотензинпревращающий фермент (АПФ), под действием которого из малоактивного вещества ангиотензина-I образуется ангиотензин-II. Ангиотензин-II вызывает очень сильное (в 50 раз сильнее адреналина), генерализованное сужение сосудов. АПФ является цинкметаллопептидазой, принимает участие и в метаболизме других БАВ: разрушает брадикинин и другие кинины до неактивных пептидов. В плазме крови ангиотензинпревращающий фермент находится в небольшом количестве. Активность АПФ наиболее высокая в эндотелии крупных и мелких коронарных артериях и артериолах; в капиллярах АПФ значительно меньше. В венах АПФ почти отсутствует [10].

Ангиотензин-II (AT-1I) в физиологических условиях и в физиологических дозах участвует в создании сосудистого тонуса, необходимого для поддержания нормального артериального давления и достаточного кровотока в жизненно важных органах (головном мозге, сердце, почках, печени), оказывает влияние на свертывающую систему крови (применение ингибитора АПФ снижает активность тканевого активатора плазминогена, играя важную роль в регуляции эндогенного фибринолиза, а также участвует в регуляции водно-солевого равновесия, стимулируя выделение альдостерона [10].

Тромбоксан А2 (ТхА2 ) – очень активный вазоконстриктор, синтезируется эндотелием, гладкими мышцами сосудов, тромбоцитами. Образуется из арахидоновой кислоты под действием циклооксигеназы-1. Под действием циклооксигеназы арахидоновая кислота превращается в простагландин G2, а затем в простагландин Н2. В зависимости от состояния эндотелия будет синтезироваться либо простациклин, либо тромбоксан – биологически активные вещества с противоположным механизмом действия[17; 34; 27].

Фактор фон Виллебранда – крупный белок,представляющий собой гетерогеннаую популяцию гликопротеиновых мультимеров, синтезируется в мегакариоцитах и в эндотелии, выделяется в плазму крови, адсорбируется тромбоцитами, где и сосредоточен в гранулах. Фактор фон Виллебранда связывается, в основном, с рецепторами тромбоцитов (Ib, IIb-IIIa, являющихся гликопротеинами), способствуя адгезии тромбоцитов к поврежденному участку стенки сосуда [34; 27].

Кроме того, содержит центры связывания с коллагеном базальной мембраны подэндотелия, образует комплекс с фVIII, предохраняя его от протеолиза. В физиологических условиях фактор фон Виллебранда укрепляет стенки сосудов, при уменьшении его содержания в крови наблюдается кровоточивость [17]. Уровень фактора фон Виллебранда может увеличиваться при повреждении эндотелия, адренергической стимуляции, активации воспалительных реакций и увеличении напряжения сдвига [24].

2.2.4 Сосудистый эндотелий и система фибринолиза Эндотелий сосудов обеспечивает не только функционирование противосвертывающей системы крови, но и является местом образования ряда компонентов, участвующих в активации системы фибринолиза по внешнему пути. Внешний путь активации фибринолиза осуществляется следующими компонентами:

Профермент плазминоген, который превращается в плазмин путем органического протеолиза;

Тканевой и урокиназный активаторы плазминогена (t-PA, u-PA);

Ингибиторы тканевого и урокиназного активаторов плазминогена (PAI-1, PAI-2), которые или быстро нейтрализуют плазмин, или препятствуют активации плазминогена [145; 124; 249].

Тканевой активатор плазминогена (t-PA) постоянно секретируется эндотелиоцитами. Он относится к семейству сериновых протеаз и представляет собой полипептид состоящий из 527 аминокислот. Домен, представленный остатками аминокислот 276 – 527, характерен для сериновых протеаз и включает в себя каталитический сайт (His 322, Asp 371, Ser 478). Данный сайт в активаторе плазминогена отвечает за его связь с фибрином, фибринспецифическую активацию плазминогена, быстрое расщепление in vivo и связь с клеточными рецепторами [17; 249]. На поверхности эндотелиальных клеток присутствуют рецепторы как к тканевому активатору плазминогена, так и к самому плазминогену [99].

Процесс лизиса фибринового сгустка происходит в две фазы. В первую очередь тканевой активатор плазминогена активирует плазминоген на интактной фибриновой поверхности. Затем фибрин частично разрушается плазмином и подвергается дополнительному связыванию плазминогеном и возможно t-PA [145;

124; 249].

Эндотелиальные клетки способны регулировать фибринолиз, путем регуляции экспрессии рецепторов плазминогена – увеличение количества рецепторов приводит к увеличению активации плазминогена тканевым активатором [31].

Урокиназный активатор плазминогена продуцируется главным образом почками и фибробластами [215; 17].

Эндотелиальные клетки также синтезируют ингибиторы активатора плазминогена первого и второго типов (второй обнаруживается только во время беременности). Ингибитор активатора плазминогена первого типа(PAI-1) регулирует процесс превращения плазминогена в плазмин под влиянием тканевого активатора плазминогена и урокиназы. PAI-1 – одноцепочечный гликопротеин, состоящий из 379 аминокислот и принадлежащий к семейству серпинов (ингибиторы сериновых протеаз). Активный PAI-1спонтанно превращается в неактивную «латентную» форму, но может быть стабилизирован связыванием с S-протеином или витронектином [91].В настоящее время изучению ингибитора активатора плазминогена уделяется большое внимание, так как он играет роль в регуляции клеточной смерти [68] и в сосудистом ремоделировании [122; 116].

При нормальном физиологическом состоянии организма эндотелию свойственно сохранять определенный уровень фибринолитической активности крови, обеспечиваемый t-PA. Депрессия фибринолитической системы – одно из важнейших условий образования тромбов в сосудистом русле [31; 17; 91].

Одна из причин возникновения сердечно-сосудистых заболеваний – дисфункция эндотелия кровеносных сосудов. По современным представлениям дисфункция эндотелия – это дисбаланс между системами локальной регуляции гомеостаза и сосудистого тонуса, а также между анти - и прокоагулянтными медиаторами, факторами роста и их ингибиторами [24].

Маркеры эндотелия, изменение концентрации которых в крови является признаком эндотелиальной дисфункции [из книги «Дисфункция эндотелия, причины, механизмы, фармакологическая коррекция»].

Десквамированные эндотелиальные Очень высокая клетки Тканевой активатор плазминогена t- Очень высокая.

Ингибитор тканевого фактора (TFPI) Высокая Существуют методики определения всех известных веществ, образующихся в эндотелии, но, как видно из таблицы, не все показатели имеют одинаковую диагностическую ценность, так как многие вещества образуются не только в эндотелии, но и в других клетках [34].

3.1 Изменение секреторной активности эндотелия Дисфункция эндотелия в результате действия разнообразных повреждающих факторов проявляется, прежде всего, в изменении секреторной активности эндотелиальных клеток. Происходит изменение синтеза активных веществ, уменьшающих кровоснабжение органов. Так происходит уменьшение синтеза простациклина и одновременно увеличение синтеза тромбоксана, являющегося его антагонистом; уменьшается концентрация протеина С, что приводит к повреждению эндотелия и, соответственно, еще большему уменьшению его концентрации; синтез оксида азота может меняться как в сторону уменьшения, так и в сторону его гиперсекреции; резко возрастает синтез и выделение эндотелинов, которые повреждают эндотелиальные клетки; происходит гиперактивация ренинангиотензин альдостероновой системы и увеличение синтеза ангиотензина II [24;

7; 27]. Эти изменения в совокупности приводят к изменению ионного состава клеток, ускорению адгезии и агрегации тромбоцитов, повышению тонуса гладких мышц сосудов и усилению их сокращения [27]. Многие исследователи полагают, что несогласованная стимуляция эндотелиальных клеток и их неконтролируемый ответ характерны для таких патологических процессов как атеросклероз, заболевания сосудов трансплантата, артериальная гипертензия, застойная сердечная недостаточность, сепсис и воспалительные синдромы. Все эти заболевания включают в себя повреждения эндотелия, которые могут привести к его активации, дисфункции и апоптозу [257; 293; 171].

Апоптоз эндотелиоцитов является одним из ключевых моментов в развитии дисфункции эндотелия. Апоптоз эндотелия можно рассматривать как форму повреждения, при которой увеличивается проницаемость сосудистой стенки для цитокинов, факторов роста, липидов, увеличивается адгезия лейкоцитов, а также активируется система коагуляции и снижается выработка оксида азота [67]. Клинические наблюдения, проводимые в этой области, свидетельствуют о том, что появление десквамированных (апоптотических) эндотелиоцитов является признаком развития инфаркта миокарда, стенокардии, ишемических нарушений мозгового кровообращения [35; 36]. Так, у больных, перенесших ишемический инсульт, количество десквамированных эндотелиоцитов превышало норму в два раза.

Апоптоз – программируемая клеточная гибель – процесс предназначенный для удаления из организма поврежденных клеток, клеток «ненужных» по программе морфогенеза и индивидуального развития организма [40; 48]. Интерес к апоптозу предопределен тем, что апоптоз – важнейший обязательный механизм онтогенеза, морфогенеза, антираковой защиты организма – в ряде случаев может усиливать тяжелые поражения организма [40; 23]. Согласно рекомендации номенклатурной комиссии по клеточной смерти этот вид клеточной смерти отличается от других (некроза, аутофагии, митотической катастрофы и др.) характерным набором морфологических признаков: изменением мембраны апоптотических клеток (переход фосфатидилсерина с внутреннено слоя мембраны в наружный), дегидратационное сжатие клетки, утрата межклеточных контактов, блеббинг, разрушение цитоскелета, конденсацию хроматина, фрагментацию ядра и деградацию ДНК [74; 48; 23]. Важной особенностью апоптоза, отличающей его от некроза является то, что деградирующая клетка сохраняет целостность мембраны до конечных стадий процесса и, в связи с этим, отсутствует воспалительная реакция соседних клеток [29; 48]. Апоптоз в норме заканчивается фагоцитозом макрофагами или окружающими паренхиматозными и стромальными клетками образовавшихся апоптозных телец без последствий для окружающих тканей в виде воспаления и иммунного ответа [40; 29].

Сигнальные пути при апоптозе. Апоптоз может быть вызван как внешними, так и внутренними сигналами, к важнейшим из которых относится повреждение ДНК [283; 103]. В этом многостадийном процессе существную роль играют каспазы – семейство эволюционно консервативных протеаз [41]. В нормальном состоянии каспазы присутствуют в клетке в неактивной форме, как проэнзимы. Различают два вида каспаз – «инициирующие» и «эффекторные» [173]. К первым относят каспазы-8, 9, 10 и 12, которые после активации действуют на «эффекторные» каспазы- 3, 6, 7 и 14 [41]. Мишени эффекторных каспаз многообразны: например для каспазы-3 это могут быть фрагментация ДНК, гельзолин, PARPполимераза или РАК-киназа [48]. Важно отметить, что после активации «эффекторных» каспаз апоптоз становится необратимым процессом.

Каспазный каскад может быть активирован по рецепторному или же по митохондриальному пути. Рецепторный путь запуска каспазного каскада начинается с активации одного из расположенных на клеточной мембране рецепторов, воспринимающих внешний сигнал: Fas/CD95, TNF, DR-4 и т. п. [174].

В случае митохондриального запуска каспазного каскада ключевым звеном является изменение состояния митохондрий, при котором снижается мембранный потенциал на внутренней мембране, в ней образуются гигантские поры, матрикс набухает, разрывается наружная мембрана, из митохондрий выходит ряд белков, в частности цитохром с [80; 23]. Последний в комбинации с фактором Apaf- (apaptotic protease-activating factor-1) и прокаспазой-9 образует апоптосомный комплекс, в котором прокаспаза превращается в каспазу-9 [80]. Далее каспаза- активирует каспазу-3 и таким образом рецепторный и митохондриальный пути сходятся на стадии активации эффекторной каспазы [48]. На наружной мембране митохондрий локализованы большая часть белков семейства Bcl-2, в состав которого входят промоторы (Bax, Bid, Bik) и ингибиторы (собственно Bcl-2 и Bcl-Х) апоптоза. От соотношения этих белков зависит, состоится апоптоз или нет [80; 48;

23].

Открытие каспазонезависимого пути апоптоза является важным этапом в развитии представлений о сигнальных апоптозных каскадах. AIF (apoptosis inducing factor) – митохондриальный флавопротеин, который перемещается от митохондрий к ядру, где вызывает конденсацию хроматина на переферии ядра и разрыв ДНК с образованием крупных фрагментов [283].

3.3 Взаимосвязь процессов апоптоза, гемостаза и воспаления Изменение плазматической мембраны клетки является одним из самых ранних событий апоптоза. Потеря сиаловой кислоты на гликопротеинах и гликолипидах, появление рецептора витронектина и переход фосфатидилсерина (PS) с внутреннего на наружный слой мембраны – наиболее ранние апоптотические изменения, которые делают клетку «привлекательной» для макрофагов [40]. Но эти изменения имеют и другое значение для организма. Так транслокация фосфатидилсерина свидетельствует не только о том, что в клетке начался процесс апоптоза и она готова к фагоцитозу другими клетками, но и о том, что она начала проявлять провоспалительные и прокоагулянтные свойства [285] В нормальных, жизнеспособных клетках фосфатидилсерин находится с внутренней стороны плазматической мембраны, исключение составляют активированные тромбоциты и лейкоциты [289]. Транслокация PS приводит к тому, что он связывается белком аннексином V, в присутствии ионов кальция. Аннексин V, как и другие аннексины не выделяется из нормальных клеток: источником внеклеточного аннексина являются клетки апоптотические и разрушенные [243]. Связывание аннексина V с фосфатидилсерином является, следовательно, защитным механизмом, который препятствует развитию воспаления и прокоагулянтной активности апоптотических клеток [35]. Если же связывание сразу не происходит, то данный участок мембраны с PS приобретает свойства устойчивого отдельного пузырька – микровезикулы [19].При этом в состав микровезикул включаются многие цитоплазматические и мембранные белки, в частности тканевой фактор [18]. Микровезикулы связываются с плазменными факторами свертывания, что приводит к активации этих факторов [186; 102] и далее возможно как развитие тромбоза [186], так и развитие ДВС-синдрома [18].