«Анисимова Марина Анатольевна ДЕТОКСИЦИРУЮЩАЯ СПОСОБНОСТЬ ПОЧВ И ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ НИХ ГУМИНОВЫХ КИСЛОТ ПО ОТНОШЕНИЮ К ГЕРБИЦИДАМ (Специальность 03.00.27-почвоведение) Диссертация на соискание ученой степени кандидата ...»

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

имени М. В. ЛОМОНОСОВА

ФАКУЛЬТЕТ ПОЧВОВЕДЕНИЯ

На правах рукописи

УДК 632. 954: 631.417

Анисимова Марина Анатольевна

ДЕТОКСИЦИРУЮЩАЯ СПОСОБНОСТЬ ПОЧВ И ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ НИХ

ГУМИНОВЫХ КИСЛОТ ПО ОТНОШЕНИЮ К ГЕРБИЦИДАМ

(Специальность 03.00.27-почвоведение) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

кандидат биологических наук, доцент Г.Ф. Лебедева кандидат химических наук, старший научный сотрудник И.В. Перминова МОСКВА –

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Влияние типовой принадлежности и вида хозяйственного 1.1.

использования почв на их устойчивость по отношению к гербицидному загрязнению

1.1.1. Поведение гербицидов в почве

1.1.2. Влияние типовой принадлежности почв на их устойчивость по отношению к гербицидному загрязнению

1.1.3. Влияние вида использования почв на их устойчивость по отношению к гербицидному загрязнению

1.2. Роль гуминовых кислот в процессах детоксикации и трансформации гербицидов различных классов

Свойства гуминовых кислот почв различной типовой 1.2.1.

принадлежности и вида использования

1.2.2. Механизмы взаимодействия “ГК-гербицид”

1.2.3. Влияние ГК на токсичность гербицидов

Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Почвы

2.1.1. Отбор образцов почв

2.1.2. Характеристика почвенных образцов

2.2. Препараты гуминовых кислот

2.2.1. Выделение препаратов ГК

2.2.2. Характеристика препаратов ГК

2.3. Определение детоксицирующей способности почв и препаратов ГК по отношению к гербицидам

2.3.1. Гербициды и их свойства.

Трифлуралин

Атразин

2.3.2. Определение детоксицирующей способности почв

Токсикологический эксперимент на почвах с трифлуралином......... Лабораторно-вегетационный опыт на почвах с атразином................ Определение в почвах остаточных количеств атразина и его метаболитов методом ВЭЖХ

Определение детоксицирующей способности препаратов 2.3.3.

гуминовых кислот

Токсикологический эксперимент на препаратах ГК с трифлуралином

Токсикологический эксперимент на препаратах ГК с атразином..... 2.3.4. Количественная оценка детоксицирующей способности почв и препаратов ГК

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Характеристика почв и выделенных препаратов ГК

3.1.1. Свойства почв

3.1.2. Свойства препаратов ГК

3.2. Детоксицирующая способность почв и препаратов ГК по отношению к различным гербицидам

3.2.1. Детоксицирующая способность почв и препаратов ГК по отношению к трифлуралину

Почвы

Препараты ГК

3.2.2. Детоксицирующая способность почв и препаратов ГК по отношению к атразину

Почвы

Препараты ГК

3.3. Сопоставление детоксицирующей способности почв и препаратов ГК по отношению к трифлуралину и атразину

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

Применение средств химической защиты растений, ставшее неотъемлемым элементом практики современного земледелия, привело к возникновению проблемы загрязнения почвенного покрова остаточными количествами гербицидов и их метаболитов. В связи с этим в последние годы ведутся интенсивные изыскания по поиску детоксицирующих агентов, внесение которых в почву способствовало бы связыванию и инактивации гербицидов. Однако до сих пор весьма ограничен круг исследований по выявлению факторов, определяющих устойчивость почв по отношению к гербицидам. Так, несмотря на многочисленные указания в литературе на важную роль органического вещества почв и, в частности, гуминовых кислот (ГК) в процессах детоксикации гербицидов различных классов (Hayes, 1970; Самгин, 1975; Maqueda et al., 1990; Liu et al., 1996), практически отсутствуют комплексные исследования, направленные на изучение и сопоставление детоксицирующих свойств различных почв и формирующихся в них ГК. Кроме того, подходы к количественной оценке детоксицирующей способности как почв, так и ГК в отношении различных классов гербицидов разработаны недостаточно.

В связи с изложенным, систематическое исследование детоксицирующих свойств почв и выделенных из них ГК при смене типовой принадлежности почв в соответствии с законом широтной зональности и при различном виде их хозяйственного использования является важной и актуальной задачей, решение которой позволит найти новые подходы к регулированию токсичности гербицидов в условиях почвенной среды, а также использовать гуминовые препараты в качестве детоксикантов.

Целью настоящей работы было изучение детоксицирующей способности почв различной типовой принадлежности и вида хозяйственного использования и выделенных из них гуминовых кислот по отношению к гербицидам различных классов, а также установление роли ГК в детоксикации этих гербицидов в почвенной среде.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• изучить детоксицирующую способность почв в зависимости от типовой принадлежности и вида хозяйственного использования по отношению к гербицидам- представителям двух классов (симтриазинов и динитроанилинов);

• выявить свойства почв, определяющие их детоксицирующую способность;

• изучить детоксицирующую способность препаратов ГК, выделенных из исследуемых почв, по отношению к тем же гербицидам;

• выявить свойства ГК, определяющие их детоксицирующую способность;

• на основании сопоставления детоксицирующей способности почв и выделенных из них ГК оценить роль ГК в формировании детоксицирующего потенциала почв по отношению к различным гербицидам.

1.1. Влияние типовой принадлежности и вида хозяйственного гербицидному загрязнению 1.1.1. Поведение гербицидов в почве При попадании в почву гербициды подвергаются процессам химического и микробиологического разложения, перемещаются по растительными и животными организмами, а также связываются с различными компонентами почвы - с органическим веществом, минеральной частью, негумифицированными растительными остатками.

По различным данным, на непосредственное подавление сорной растительности расходуется от 1-2 до 10-40% от вносимого количества гербицида, остальная часть вымывается в грунтовые воды или связывается с почвенным материалом, создавая значительные экологические проблемы ("Гербициды...", 1990).

При рассмотрении поведения гербицидов в почвe необходимо учитывать биоклиматические особенности региона, поскольку способность гербицидов перемещаться по профилю, их улетучивание, скорость фотохимического, химического и микробиологического биологической активностью почв (Harris, 1966; Спиридонов, Каменский, 1970; Bailey & White, 1970; Головкин, Воловник, 1976; Rahman, 1977;

Smith, 1982; Лунев, 1992; Zech et al., 1992; Nakagawa et al., 1996). В регионах с теплым и влажным климатом период полной инактивации стойких к разложению гербицидов может быть сужен до одного вегетационного периода. Так, проведенные в Индии исследования показали, что пестициды, период полураспада которых в странах с разлагались менее чем за 6 месяцев (Лунев, 1992).

Говоря о поведении гербицидов в почве, следует выделить два основных процесса - это их закрепление (связывание) почвенными компонентами и миграция по профилю. Миграция токсиканта по почвенному профилю зависит от его растворимости, вносимой дозы, количества осадков, а также от способности почвы удерживать токсикант (“Миграция и детоксикация...”, 1970). Последняя в основном определяется обогащенностью почвы органическим веществом и ее механическим составом (Самгин, 1975; Schiavon, 1988; Helling et al, 1988;

Gilchrist et al., 1993; Sigua et al, 1995). Большое значение имеет и химическая природа гербицида. Например, при изучении миграции гербицидов методом почвенных колонок (Соколов и Стрекозов, 1970) наиболее подвижными оказались производные ароматических карбоновых кислот, наименее подвижными - производные толуидина.

Сильно адсорбируемые почвой дипиридиловые гербициды практически не передвигались по почвенному профилю; даже в чистом песке паракват при норме внесения 18 кг/га передвигался лишь до глубины 1 см, а дикват - до 8 см. В то же время слабо адсорбируемые почвой и хорошо растворимые в воде производные фенилуксусной и бензойной кислоты (фенак, 2,3,6-ТБК) обнаруживали на глубине 0,6 - 3,0 м (Соколов и Стрекозов, 1970).

трифлуралин обладают очень низкой миграционной способностью (Майер-Боде, 1972; Tutarli et al., 1995; Tworkoski et al., 1996). Из-за малой растворимости в воде и адсорбции составными частями почвы гербициды этого класса только в небольших количествах вымываются в более глубокие слои.

Гербициды класса сим-триазинов характеризуются ограниченной миграцией по почвенному профилю. Основная масса сим-триазинов обычно содержится в верхнем слое 0-5 см. Опытами Лебедевой и Шустровой (1975), изучавших влияние свойств почв на перемещение симазина, было показано, что в торфе и глине гербицид не перемещался ниже 5 см, несмотря на создание условий интенсивного промывания. В дерново-подзолистой суглинистой хорошо окультуренной почве максимальная концентрация гербицида содержалась в слое 0 - 15 см, а в песке самым токсичным оказался слой 15 - 20 см. Таким образом, органического вещества способствовало адсорбционному закреплению токсиканта и ограничению его перемещения. Данный вывод можно отнести ко всем гербицидам группы сим-триазинов.

При изучении адсорбционной способности почв по отношению к гербицидам очень трудно оценить отдельный вклад органической и минеральной фракций, образующих единый глинисто-гумусовый комплекс. По мнению ряда исследователей (Hance, 1969; Menzer & Nelson, 1986), содержание в почве более нескольких процентов органического вещества способно полностью блокировать поверхности глинистых минералов и сделать их недоступными для молекул определения сорбционной способности минеральной составляющей являются лабораторные эксперименты с очищенными минералами. С применением данного метода было установлено, что глинистые минералы могут адсорбировать гербициды различных классов как пространства. При этом сорбционная емкость глинистых минералов определяется площадью поверхности, емкостью катионного обмена и видом насыщающего катиона (Weber, 1970; Carringer et al., 1975; Terse & Calvet, 1978; Gilchrist et al., 1993). Однако органическое вещество почв, содержащее большое количество компонентов, способных к различному химическому и физическому взаимодействию с гербицидами, в большинстве случаев играет преобладающую роль в связывании токсикантов. Так, обладая одинаковой удельной поверхностью в 500- м2/г, верховой торф сорбировал 91,8 мкг атразина на 1 кг торфа, а монтмориллонит - только 4,3 мкг (Соколов и Стрекозов, 1970).

Остатки гербицида, связанные почвой, могут представлять собой как исходное соединение, так и продукты его разложения. Их содержание в почве может варьировать от нескольких процентов до 90% от примененного вещества в зависимости от химического класса гербицида. Так, для триазиновых гербицидов было найдено, что связанные почвой остатки составляют 47 - 57% от внесенной дозы; для производных нитроанилинов - от 7 до 85% (табл. 1).

Таблица 1. Содержание “связанных” остатков гербицидов в почвах (Кэлдербенк, 1993).

Особая трудность заключается в дифференциации связанных остатков на исходное соединение и продукт (продукты) его разложения, что связано с применением жестких воздействий при экстрагировании соединения из почвы. При этом может происходить изменение химической природы остатка. Во многих случаях содержащее связанные остатки органическое вещество можно фракционировать на гуминовые кислоты, фульвокислоты и гумин, причем все фракции будут содержать в своем составе продукты разложения гербицидов (Hayes, 1970; Meikle et al., 1976; Nearpass, 1976; Nelson et al., 1983).

Связывание гербицидов органо-минеральными компонентами почвы имеет различные последствия. Во-первых, может возникнуть необходимость в использовании больших доз препарата для достижения желаемого эффекта, поскольку инкорпорирование гербицида в глинистогумусовую фракцию в большинстве случаев приводит к потере его биологической активности (Kaufman et al., 1976; Riley et al., 1976;

Сюняев, 1984; Тейт, 1991; Barriuso & Koskinen, 1996). Во-вторых, взаимодействие гербицидов с органическим веществом почвы может различным образом влиять на скорость их разложения. С одной стороны, долговечность гербицида может повышаться в результате ограничения биодеградации вследствие эффекта защиты вещества от микробного воздействия за счет физического блокирования доступа клеток микроорганизмов и ферментов к субстрату (Smith et al., 1988; Тейт, 1991). При этом скорость деградации соединения, по-видимому, будет определяться скоростью трансформации самого органического вещества.

С другой стороны, внесение в почву свежих растительных остатков, а также препаратов гуминовых веществ способствует увеличению деградацию гербицида, что может ускорить и процесс разложения токсиканта, связанного с органическим веществом (Кузьмич, 1990;

Berger et al., 1996).

Таким образом, при попадании в почву гербициды испытывают влияние различных почвенных факторов, что изменяет степень их токсичности. При этом следует отметить, что для обозначения способности почвы снижать токсический эффект гербицидов в литературе употребляются различные термины: инактивирующая способность, устойчивость почв по отношению к гербицидному загрязнению, способность почв к снижению токсического эффекта гербицида (“Гербициды...”, 1990). В настоящей работе использовался потенциал), под которым в отношении почв понималась их способность снижать токсичность гербицида при действии всех почвенных факторов, препятствуя таким образом угнетению растений. Данный термин рассматривался как эквивалент понятию “устойчивость почв по отношению к гербицидному загрязнению”. В отношении препаратов ГК понималась их способность инактивировать гербицид путем его “связывания” и (или) перевода в нетоксичную форму.

устойчивость по отношению к гербицидному загрязнению Детоксикация гербицидов в почве достигается при комплексном протекании трех процессов, а именно, адсорбции, разложения и перемещения токсикантов в почвенном профиле. При этом адсорбция является, по-видимому, ведущим фактором, поскольку, во-первых, значительный процент практически всех применяемых в настоящее ("Гербициды...", 1990), и во-вторых, адсорбированный токсикант может характеризоваться совершенно отличной от исходного соединения биологической активностью, способностью к разложению и перемещению (“Разложение гербицидов”, 1971; Saxena & Bartha, 1983).

Адсорбционная способность почв определяется комплексом почвенно-биоклиматических условий, т.е. типовой принадлежностью почв, а также в значительной степени зависит от вида их использования (Войтехова, 1969; Спиридонов, Каменский, 1970; Raman et al., 1988;

Barriuso & Calvet, 1992). Тип почвы определяет общее содержание, состав и свойства органического вещества, ведущую роль которого в процессах связывания и детоксикации гербицидов отмечают многие исследователи (Hayes, 1970; Березовский, Немова, 1973; Smith, 1982;

Beck & Jones, 1996). Например, для получения достаточного эффекта от гербицидов - производных триазина и фенилдиметилмочевины в опытах Войтеховой (1969) на черноземах потребовалось внести в 20-30 большие дозы препаратов, чем на сероземах, при содержании гумуса 6 и 1%, соответственно. По данным того же автора, количества гербицидов, вызывавшие 50%-ное снижение веса тест-растений на различных почвах, существенно варьировали в зависимости от их агрохимических характеристик (табл. 2). Минимальное значение ЕД50 наблюдалось на инертном наполнителе - песке, не содержащем органического вещества.

Таблица 2. Дозы гербицидов (мг/сосуд), вызывавшие снижение веса растений на 50% (ЕД50) на различных почвах (Войтехова, 1969).

выщелоченный подзолистый суглинок Сравнение действия сим-триазинов в торфяной и дерновоподзолистой почвах при дозах внесения, вызывающих 50%-ное торможение роста растения-индикатора, показало, что в торфяной почве это ингибирующее действие ниже, чем в дерново-подзолистой по атразину в 7,8, по симазину - в 9,0, по пропазину - в 9,3 и по прометрину - в 13,5 раз (Березовский, Немова, 1973).

Корреляционный анализ, проведенный Barriuso & Calvet (1992) по данным экспериментов с 58 образцами почв восьми типов также продемонстрировал наличие линейной зависимости количества адсорбированного атразина от содержания органического углерода (r=0.90).

Изучение фитотоксичности тербацила и трифлуралина на десяти типах почв Новой Зеландии при содержании органического вещества от 5 до 62% (Rahman, 1977) показало, что на почвах с низкой обеспеченностью органическим веществом наблюдалось значительное пролонгирование остаточной активности препаратов; внесение трифлуралина в максимальной дозе 4 кг/га приводило к полной гибели растений-индикаторов на всех почвах, за исключением торфяной. На почве с высоким содержанием ила, глины и органического вещества количество связанной радиоактивной метки трифлуралина было значительно выше, чем на почве со слабым поглощающим комплексом (Whiller et al., 1979).

Различная типовая принадлежность почв и связанные с нею почвенные свойства, в частности, содержание гумуса, определяют возделывание различных культур без ущерба для их урожая. Перечень таких значений для атразина и симазина в условиях Казахстана приведен в таблице 3. На основании этих данных можно ориентировочно оценить уровень безопасных для указанных культур концентраций гербицидов и для других типов почв.

Следует отметить, что количество поглощенного токсиканта может зависеть не только от общего содержания органического вещества, но и от доли ГК, ФК и гумина в составе гумуса (Hayes, 1970; Nelson et al., 1983). Соотношение этих основных групп определяется типовой принадлежностью почв (Орлов, 1992) и во многом формирует их детоксицирующий потенциал по отношению к гербицидам. Так, рядом исследований было показано, что количество токсиканта, связанного с ГК, ФК или гумином, может составлять от 7 до 50% и более (табл. 4).

Таблица 3. Содержание атразина и симазина в различных типах почв в предпосевной период, не оказывающее фитотоксического действия на сельскохозяйственные культуры (ячмень, пшеница, рожь, злаковые травы) (Лунев, 1992).

каштановая Таблица 4. Содержание “связанных” остатков гербицидов в группах гумуса, % от внесенного.

реакционноспособную часть органического вещества почв при взаимодействии с веществами органической природы. (Hayes, 1970;

Орлов, 1990; Maqueda et al., 1990; Piccolo et al., 1992). Поэтому можно ожидать, что нарастание гуматности органического вещества в зональногенетическом ряду от дерново-подзолистых почв к черноземам способствует повышению детоксицирующего потенциала почв.

Значительная обеспеченность гумусом (4-12% и более) черноземов и особенно черноземно-луговых почв наряду с очень высокой степенью гумификации (т.е. с содержанием углерода гуминовых кислот в общем углероде - более 40%) (Гришина, 1986) обуславливает, как уже было показано выше, исключительно высокую инактивирующую способность этих почв по отношению к гербицидам. В литературе имеются указания на то, что изменение некоторых структурных характеристик ГК в зависимости от условий формирования почв, т.е. от их типа, влияет на их реакционноспособность по отношению к различным токсикантам (Liu et al., 1996).

Роль типовой принадлежности почв в процессах детоксикации гербицидов определяется не только изменением содержания и состава органического вещества, но и различием таких показателей, как рН почвенного раствора, емкость катионного обмена, степень насыщенности почв основаниями и, в частности, кальцием, влажность, условия аэрации, а также температурный режим почвы (Sheets et al., 1962; Жирмунская, Стонов, 1968; Hayes, 1970; Лунев, 1992). Следует отметить, что вышеперечисленные почвенные характеристики тесно взаимосвязаны с адсорбционной способностью почв.

Для многих гербицидов доказана зависимость их адсорбции от рН и гидролитической кислотности почвы (Соколов, Стрекозов, 1970).

Например, для линурона и дифенамида установлено увеличение адсорбции с повышением рН; для 2,4-Д, 2М-4Х и 2,4,5-Т - с понижением рН. В опытах с симазином на 18 типах почв не удалось установить строгой зависимости между значением рН и емкостью адсорбции, гидролитической кислотностью и адсорбцией гербицида, что позволило авторам сделать предположение о важности механизма ионного обмена во взаимодействии триазиновых гербицидов с адсорбентами.

Изучение адсорбционной способности девяти типов почв, существенно различающихся по минералогическому составу, содержанию органического вещества и рН, по отношению к атразину, тербутрину и 2,4-Д было проведено Barriuso & Calvet (1992) с целью выявления роли формы существования гербицида для адсорбционных процессов в почве. Выбранные гербициды представляли собой нейтральную (атразин), катионную (тербутрин) и анионную (2,4-Д) формы. Результаты исследований показали, что для токсиканта, находящегося в почве в неионизованном состоянии, степень его адсорбции органической компонентой увеличивается с увеличением содержания органического вещества и не зависит от рН, в то время как количество связанных органическим веществом катионного и, в особенности, анионного гербицидов в значительной степени определяется значением рН и минералогическим составом почвы.

Upchurch & Mason (1962) обнаружили высокую отрицательную корреляцию между токсичностью 12 гербицидов, включая симтриазины, и такими почвенными характеристиками, как содержание органического вещества, емкость катионного обмена, сумма обменных оснований, содержание обменного кальция, влажность и свободный дренаж. В опытах Sheets с соавт. (1962) токсичность симазина возрастала с увеличением емкости катионного обмена и понижением рН почвенного раствора.

Влияние типовой принадлежности почв на их связующую способность по отношению к трифлуралину было исследовано Wheeler с соавт. (1979) на примере двух почв штата Флорида - Webster soil и Cecil soil. Через 60 дней после внесения гербицида в Webster soil (содержание ила 45,5%, Сорг 3,9% и степень насыщенности основаниями 91%) в связанном (неэкстрагируемом) состоянии находилось 72% примененного количества; в Cecil soil (19,5%, 0,90% и 31%) - не более 10%.

Помимо связывания с почвенными компонентами, детоксикация гербицидов в почве может достигаться за счет их разложения или потери вследствие улетучивания, при этом существенную роль играют температура и влажность почвы. Данные факторы влияют не только на химическое разложение токсикантов, но также на процессы микробиологической трансформации гербицидов. Например, в условиях влажных субтропиков производные сим-триазина и фенилмочевины даже в дозах 20-30 кг/га теряют фитотоксические свойства в почве за 3- месяцев, т.е. скорость их инактивации в данной зоне в десятки раз выше, чем в зоне распространения дерново-подзолистых, серых лесных, черноземных, каштановых и сероземных почв (Спиридонов, Каменский, 1970). Повышение температуры и влажности почвы (до определенных пределов при рассмотрении биологических факторов) усиливает микробиологическое разложение гербицидов, ускоряет их химическую деградацию, а также способствует их улетучиванию (Соколов, Стрекозов, 1975; Wheeler et al., 1979). Наибольшая детоксикация гербицидов обычно наблюдается при влажности, близкой к полной полевой влагоемкости (Лунев, 1992). Так, для трифлуралина значение Т50 в сухой почве составило 100 суток, во влажной - 7 суток.

способность почвы, поскольку насыщение почвенных коллоидов молекулами воды препятствует сорбции токсиканта. Наряду с этим обводнение почв приводит к созданию анаэробных (восстановительных) условий, при которых скорость инактивации многих гербицидов, а также сама схема их разложения могут принципиально отличаться от таковых при доступе кислорода (Спиридонов, Каменский, 1970; “Разложение гербицидов”, 1971; Golab et al., 1979). В связи с этим детоксикация гербицидов на типах почв, формирующихся в условиях гидроморфизма, может иметь свои особенности. Так, Спиридоновым и Каменским (1970) было показано, что скорость инактивации гербицида в глеевом горизонте лугово-болотной почвы значительно выше, чем в гумусовом горизонте, что позволило авторам сделать предположение о преобладающей роли восстановительных процессов в инактивации атразина. Golab с соавт. (1979), изучавшие различные аспекты поведения трифлуралина в анаэробных и аэробных условиях, пришли к выводу, что при восстановительных условиях количество продуктов разложения токсиканта значительно выше, чем в аэробных условиях; при этом их фитотоксичность существенно ниже, чем фитотоксичность исходного соединения.

Сравнивать детоксицирующую способность почв, относящихся к устанавливаемых при проведении модельных опытов. В этом случае можно также более или менее точно определить ведущий фактор в процессах инактивации токсиканта. В опытах Березовского и Немовой (1973), изучавших адсорбционную способность двух различных почв по отношению к атразину, был рассчитан коэффициент распределения атразина между адсорбированной и растворенной формами. При температуре 20ОС и рН 5,6 коэффициент распределения был равен для торфяной почвы 24,1-26,1, а для дерново-подзолистой - 1,1-1,4, что свидетельствует о значительно более высокой поглотительной способности органогенной почвы.

Таким образом, характеризуя устойчивость различных почв по отношению к гербицидному загрязнению, необходимо учитывать свойства почв, обусловленные их типовой принадлежностью, и в особенности, показатели гумусного состояния, имеющие наибольшее значение в поведении большинства гербицидов в почвенной среде.

1.1.3. Влияние вида использования почв на их устойчивость по отношению к гербицидному загрязнению Изучение поведения гербицидов в почвах, не нарушенных сельскохозяйственной деятельностью, дает возможность выделить те особенности детоксикации, которые обусловлены действием только природных факторов, а именно, типовой принадлежностью почв. Это важно для понимания основного механизма детоксикации гербицида в зоне распространения конкретного типа почв. Однако свойства почв, характеризующихся различной степенью окультуренности, существенным образом меняются. Использование разнообразных агротехнических приемов приводит к нарушению естественной структуры и сложения почвенных горизонтов, изменению условий аэрации, влажности и температурного режима, что в комплексе с применением органических и минеральных удобрений, а также средств микробиологической активности почв и показателях их гумусного состояния (Титова, Когут, 1991; Гамалей с соавт., 1994; Когут, 1996;

Орлов с соавт., 1996). Поэтому детоксицирующая способность целинных почв может существенно отличаться от детоксицирующей способности их вариантов, используемых в сельском хозяйстве.

Следует отметить, что нам не удалось найти литературных естественном состоянии, на которой данный конкретный гербицид применялся бы впервые, и ее пахотным вариантом.

Изучение длительности токсического действия клопиралида на целинном и культивируемом вариантах почв было предпринято Schutz с соавт. (1996). Результаты показали, что период полураспада данного гербицида был значительно длиннее в целинном варианте с более высоким содержанием гуминовых кислот; в культивируемом варианте разложение шло быстрее.

Влияние различной обработки почвы на продолжительность токсического действия триазинов было изучено Г.Ф. Лебедевой (1970).

Для этой цели на одной части делянки, предварительно обработанной гербицидом, была произведена культивация на глубину 10-12 см, а на другой - вспашка плугом с оборотом пласта на глубину 20 см. В результате через год после внесения гербицидов количество сорняков и их масса были значительно большими, а видовой состав сорняков богаче на варианте “пашня” по сравнению с вариантом “культивация”.

Согласно мнению автора, различия в достигнутой степени детоксикации триазинов были обусловлены тем, что при вспашке гербициды перемешивались с большим объемом почвы, что послужило снижению их концентрации и уменьшению токсического эффекта. Этим же автором было показано влияние различной степени окультуренности почвы на длительность токсического действия триазинов (табл. 5). Так, симазин в дозе 3 кг/га на хорошо окультуренной дерново-подзолистой почве через 12 месяцев после внесения оказывал лишь небольшое токсическое действие, тогда как на слабо окультуренной дерновоподзолистой почве растения тест-культуры полностью погибали, и только через 24 месяца токсическое действие гербицида на этой почве практически прекратилось. Автором также было показано, что на дерново-подзолистой суглинистой почве при внесении 3 кг/га симазина токсическое действие прекращалось через год, а на огородном варианте спустя 6 месяцев. Аналогичные данные были получены в опыте с атразином.

В опытах Stearman с соавт. (1989) изучалась токсичность метрибузина и оксифлуорфена на почвах, находящихся под пашней и токсичность примененных гербицидов была в 1,5 раза ниже на пахотных вариантах почв, хотя содержание углерода в них было несколько меньше. Авторы объяснили данный факт повышенной реакционной способностью гумусовых веществ пашни, представленных в большей степени ГК и ФК, и в меньшей степени -гумином, по сравнению с почвой под многолетними травами.

Таблица 5. Длительность токсического действия триазинов на дерновоподзолистой почве разной степени окультуренности (Лебедева, 1970).

Для понимания процессов ускоренной трансформации гербицида в происходящие в почве при вовлечении ее в сельскохозяйственное использование. Результаты комплексного исследования гумусного состояния целинной и окультуренной дерново-подзолистых почв приведены в работе Овчинниковой с соавт. (1978). В качестве естественного биоценоза авторами был выбран типичный участок леса;

почва дерново-среднеподзолистая, легкосуглинистая с содержанием гумуса в слое 5-10 см 2,5%, рН 5,3. Окультуренная почва представляла собой вырубленный участок елово-березового леса, находившийся под посевом подсолнечника. До закладки опыта поле произвестковали и засеяли многолетними травами. Характерные различия между двумя почвами были установлены по интенсивности дыхания, являющейся одним из наиболее объективных показателей биологической активности почв. Результаты наблюдений показали, что в отдельные периоды с 1м окультуренной почвы за час выделялось в 1,5-4 раза больше диоксида углерода, чем из целинной почвы. Интенсивная система обработки пахотной почвы (вспашка, рыхление, ежегодное внесение удобрений, известкование) способствовала улучшению всех почвенных режимов, включая снижение кислотности, что положительно повлияло на почвенную биоту и биохимическую активность почвы в целом.

Изменение гумусного состояния выразилось в возрастании фракции известковании), увеличении отношения СГК/СФК (в основном за счет снижения содержания фульвокислот), увеличении количества нерастворимого остатка (гумина).

Следует отметить, что при повышении окультуренности почв степень выраженности указанных изменений возрастает, происходит усиление процессов гумусонакопления, что связано с ежегодным внесением больших доз органических удобрений, увеличением количества пожнивных и корневых остатков, улучшением условий гумификации. В общем, при переходе от лесных почв к пахотным наблюдается увеличение рН, емкости катионного обмена, степени насыщенности основаниями, содержания обменного кальция, снижение всех видов почвенной кислотности. Таким образом, создаются условия для повышения биологической активности почв, что может способствовать ускорению деградации гербицида, находящегося как в свободном, так и в связанном с различными компонентами гумуса состоянии.

Изменение различных показателей состояния почв при вовлечении их в сельскохозяйственное использование не следует рассматривать в отрыве от их типовой принадлежности (Александрова, 1980). Во-первых, смена климатических условий требует применения соответствующих агротехнических приемов, а во-вторых, при использовании одного и того же способа обработки на почвах, относящихся к разным климатическим зонам, могут происходить разнонаправленные изменения почвенных свойств. Так, детальное исследование режима органического вещества в автоморфных дерново-подзолистых, серых лесных и черноземных почвах, используемых под пашню, было проведено Б.А. Никитиным (1982). Сравнивались целинные и в разной степени окультуренные почвы, находящиеся в аналогичных ландшафтных условиях. В результате были сделаны следующие выводы: 1) в дерново-подзолистых почвах даже при слабой степени окультуренности возрастает содержание гумуса в расчете на 20-сантиметровый слой; 2) в серых лесных слабо- и среднеокультуренных почвах содержание гумуса уменьшается; то же самое наблюдается и в черноземах. Автор полагает, что в дерново-подзолистых пахотных почвах даже без внесения органических удобрений улучшение условий увлажнения и аэрации приводит к усилению процессов гумификации и гумусонакопления, а в серых лесных и черноземах - к их ослаблению. Рядом исследователей отмечается, что обогащенность органическим веществом, оптимальные температура, влажность и аэрация, создаваемые в почвах с высокой степенью окультуренности, благоприятствуют детоксикации гербицидов в условиях повышенной микробиологической активности (Лебедева, “Прогнозирование...”, 1992).

Взаимодействие гербицидов с компонентами почвы носит двоякий характер: с одной стороны, происходит его инактивация под действием различных почвенных факторов, а с другой стороны - возможно изменение свойств почв под действием токсикантов (Miele, 1986;

"Гербициды...", 1990; Гамалей с соавт., 1994). Так, интенсивная химическая обработка в целом малогумусированных, с низкой биологической активностью дерново-подзолистых почв может привести к общему ухудшению их гумусного состояния. При нарушении экологических условий гумусообразования - сокращении количества поступающих в почву органических остатков, изменении состава фито- и микробоценозов снижается общее содержание гумуса, уменьшается энергетического баланса почвы биологической массы сорных растений приводит к активизации устойчивых форм микроорганизмов, которые при дефиците легкодоступного материала могут разлагать гумусовые вещества. В результате создаются условия для перевода в подвижную форму части запасов общего гумуса (Гамалей с соавт., 1994). Регулярное внесение органических удобрений способствует нормализации общего состояния почв и, в частности, баланса органического вещества, нарушенных в результате применения химических средств защиты растений (“Использование почв...”, 1991).

Таким образом, вовлечение почв в сельскохозяйственное использование может оказывать существенное влияние на их детоксицирующие свойства по отношению к гербицидам, поскольку изменяются свойства почв по сравнению с их целинными аналогами.

1.2. Роль гуминовых кислот в процессах детоксикации и трансформации гербицидов различных классов 1.2.1. Свойства гуминовых кислот почв различной типовой принадлежности и вида использования Гуминовые кислоты - важнейший компонент почвенного гумуса представляют собой группу высокомолекулярных азотсодержащих органических кислот, молекула которых содержит ароматические группировки (Кононова, 1963; Александрова, 1980). Наличие сложного ароматического ядра, в состав которого входят бензолполикарбоновые кислоты, фенолы, хиноны и другие циклические соединения, и периферической части, представленной в основном фрагментами углеводов и аминокислот, обуславливает химическую гетерогенность и высокую реакционную способность ГК по отношению к веществам различных химических классов (Wershaw et al., 1977; Schnitzer, 1986;

Орлов, 1992).

Элементный состав ГК, содержание и природа функциональных групп, соотношение фрагментов, составляющих структуру молекулы, различны в разных типах почв (Орлов, 1990; Crespo et al., 1990) (табл. 6), хотя пространственная и временная изменчивость почв является причиной существенных колебаний состава и свойств ГК даже в пределах одной почвенной группы.

Меньшие коэффициенты варьирования характерны для ГК черноземов, где условия гумификации более однородны, чем, например, в дерново-подзолистых почвах. Так, ГК дерново-подзолистых почв можно отнести к группе относительно молодых гуминовых кислот, находящихся в промежуточной стадии гумификации.

Таблица 6. Характеристики гуминовых кислот основных типов почв (Орлов, 1990).

Тип почвы подзолистые лесные Они наименее обуглерожены (содержание углерода составляет в среднем 53,5±7,6, масс.%) (Орлов, 1992), в них хорошо развита периферическая легкогидролизуемая часть молекулы; содержание ароматических фрагментов понижено. ГК дерново-подзолистых почв характеризуются наиболее высокими молекулярными массами. При существенным изменениям структуры ГК в серых лесных почвах и особенно черноземах: возрастает обуглероженность и степень ароматичности ГК, повышается их “зрелость”. Гуминовые кислоты черноземов представляют собой наиболее сформированные и химически стабильные продукты гумификации. В них высоко содержание углерода (в среднем 57,9±5,1%), вклад негидролизуемой (ароматической) части в структуру молекулы составляет около 44% (в дерново-подзолистых около 20%), молекулярно-массовое распределение компактное, а средние значения ММ значительно меньше, чем в дерново-подзолистых почвах (Орлов, 1992).

Свойства гуминовых кислот и скорость их трансформации принадлежности почвы, но и от вида экосистемы, в результате функционирования которой они (ГК) формируются: например, лес или луг, а также от типа растительного сообщества (Тейт, 1991).

гумусообразователей, стадийность самого процесса гумификации и варьирование условий, в которых протекает этот процесс, а также реакции взаимодействия образующихся гуминовых кислот с компонентами минеральной части почвы являются, по мнению Александровой (1980), основными причинами полидисперсности и гетерогенности химического состава гуминовых кислот. Так, под покровом хвойных лесов формируются почвы подзолистого типа, исходное органическое вещество которых составляют воска, смолы, дубильные вещества, лигнин; в результате продукты гумификации обогащены бензолполикарбоновыми кислотами, хинонами, фенолами (Гришина, 1986).

активности, достаточная для глубокой трансформации органических веществ, должна бы приводить к образованию высокоароматичных гуминовых кислот, чего на самом деле не происходит. Высокая активность разложения мощной надземной биомассы приводит к освобождению продуктов кислой природы в силу низкой зольности хвойных остатков. В результате в почве создается кислая реакция, неблагоприятная для конденсации продуктов полураспада. К тому же промывной режим способствует процессу активного выноса продуктов распада органического вещества. Совокупность этих условий приводит к формированию относительно “молодых” ГК с хорошо развитой периферической частью и слабовыраженным ароматическим ядром.

В зоне распространения серых лесных почв в широколиственных лесах, по сравнению с хвойными, интенсивность трансформации растительных остатков существенно возрастает. Это связано со смягчением климатических условий, изменением химического состава опада, в котором уменьшается содержание липидов, дубильных веществ, увеличивается количество белковых соединений, минеральных компонентов (Гришина с соавт., 1990). Гуминовые кислоты здесь обогащены карбоксильными и фенолгидроксильными группами, что связано с высоким содержанием таннинов в листьях дуба. Степень их ароматичности несколько выше.

Смену лесной формации на луговую в естественных условиях широколиственных лесов в зону луговых степей, где распространены черноземные почвы. Биомасса корневых систем в луговых сообществах в 3-4 раза превышает надземную массу. В составе травянистой растительности повышено содержание соединений азота и углеводов, а также минеральных компонентов. Продолжительность активного времени гумусообразования на фоне оптимального увлажнения и близкой к нейтральной реакции среды создает условия для полимеризации образующихся продуктов распада органического вещества (Багаутдинов, 1994). Высокая биологическая активность почв луговых сообществ способствует использованию в качестве энергетических и пищевых ресурсов легко гидролизуемых органических компонентов как в растительных остатках, так и в гумусовых кислотах.

Поэтому формирующиеся в черноземных почвах гуминовые кислоты имеют отчетливо выраженное ароматическое ядро и слаборазвитую периферию. Стабилизации ГК способствуют карбонаты кальция и магния, а также контакт с обогащенной вторичными менералами минеральной частью почвы. В работе Гришиной (1986) отмечается также, что миграция водорастворимых компонентов по почвенному профилю происходит кратковременно лишь в периоды таяния снега или дождей и не имеет такого принципиального значения, как в лесных почвах подзолистого типа.

В целом, для почв, находящихся под разной растительностью, выявлены следующие закономерности изменения элементного состава ГК: для подзолистых почв содержание углерода возрастает в ряду “лес поле - луг”, а для черноземных - от степи к лесу.

Структура и свойства ГК претерпевают значительные изменения при вовлечении почв в сельскохозяйственное использование. На начальных стадиях обработки почв лесных экосистем и в последующие несколько лет происходит общее существенное снижение содержания органического вещества, что характерно для всех минеральных почв, обрабатываемых в сельском хозяйстве (Тейт, 1991). При распашке луговых почв на фоне первоначально прогрессирующих потерь гумуса наблюдается обогащение органическим веществом почвенных частиц гумифицированных продуктов возрастает, что указывает на снижение способности почвы обеспечивать растения питательными веществами.

Дальнейшему восстановлению и стабилизации уровня органического вещества способствует регулярное внесение органических удобрений и в целом проведение мероприятий, направленных на повышение степени окультуренности почв.

содержание ГК в составе гумуса, причем эта тенденция проявляется практически независимо от типовой принадлежности почвы. Так, по гуминовых кислот в пахотных вариантах дерново-сильноподзолистых почв Нечерноземной зоны России на 3%, серых лесных - на 8 и оподзоленных и выщелоченных черноземов - на 17% выше, чем в их целинных аналогах. Существенным образом меняется и состав ГК.

Согласно исследованиям Митусовой (1986), Багаутдинова и Хазиева (1992), выявлена общая тенденция увеличения содержания углерода в ГК почв, в которые регулярно вносили органические удобрения. В табл.

7 приведены состав и свойства бурых (БГК) и черных (ЧГК) гуминовых кислот, формирующихся в условиях целины и пашни в серой лесной почве и черноземе типичном. Как видно из представленных данных, сельскохозяйственное использование этих почв способствовало росту обуглероженности ГК, уменьшению гидролизуемой части молекулы, возрастанию степени бензоидности ГК.

Таблица 2. Состав и свойства гуминовых кислот целинного и пахотного вариантов серой лесной почвы и чернозема типичного (Багаутдинов и Хазиев, 1992).

Длительное применение высоких доз органических удобрений на песчаных Al-Fe-гумусовых подзолах ведет к укрупнению ароматической части молекулы ГК, обогащению их азотом (Аммосова и Балаганская, 1991). При длительном паровании дерново-подзолистых почв в ГК наблюдается отщепление боковых структур и относительное накопление ароматических фрагментов; систематическое унавоживание этих почв (при периодическом известковании) способствует их обогащению менее сложными, менее “зрелыми” гуминовыми соединениями, в молекулах которых преобладают малоконденсированные структуры с выраженными алифатическими цепями, вызывает гидратацию молекул ГК (Гришина, 1989). В то же время при длительном внесении навоза в мощные слабовыщелоченные черноземы наблюдается некоторое обогащение ГК углеродом при одновременном уменьшении содержания в них кислорода.

Гришиной с соавт. (1989) был применен метод графикостатистического анализа по Кревелену для характеристики изменений в составе ГК при окультуривании дерново-подзолистых почв различных элементов ландшафта. Результаты показали, что ГК окультуренных почв транзитных элементов рельефа характеризуются обогащенностью алифатическими цепочками, для них свойствен процесс гидрогенизации и декарбоксилирования; в то же время в верхнем горизонте почв элювиальных ландшафтов условия для гумификации растительных остатков и возрастания степени бензоидности и усложнения структуры ГК более благоприятны.

сказывается проведение оросительных мероприятий, характерных для зоны распространения черноземов. Режим периодического увлажнения высушивания способствует увеличению относительного содержания ГК, что связано, по-видимому, со вспышкой минерализации органических остатков вслед за высушиванием - увлажнением (Самойлова с соавт., 1990).

Изучение элементного состава ГК орошаемых и неорошаемых черноземных почв Поволжья показало, что под влиянием длительного орошения практически во всех ГК возросло содержание углерода, понизилось содержание водорода и кислорода, содержание азота практически не изменилось (Орлов, 1990). Значительно повысилась степень бензоидности ГК: повышение микробиологической активности почв способствовало усиленному отщеплению боковых алифатических цепочек в молекулах ГК.

Свойства гуминовых кислот могут существенно варьировать на участках площадью в несколько квадратных метров. Например, обуглероженность ГК, выделенных из почв при возделывании цитрусовых культур и виноградников, возрастала в ряду “контрольный участок - гряда - междурядье”; количество кислых функциональных групп было минимально в ГК гряд и максимально на ненарушенных участках (Miano et al., 1996). В почвах, на которых в течение продолжительного времени возделывались кукуруза и соя, содержание углерода гуминовых кислот было ниже на 6-10%, соответственно, по сравнению с их аналогами, где эти культуры не выращивались на протяжении 7 лет. При этом уменьшение отношения Н/С в ГК непрерывно культивируемых почв свидетельствовало об увеличении степени их ароматичности (Stearman et al., 1989).

Таким образом, свойства ГК находятся в тесной зависимости от типовой принадлежности и вида сельскохозяйственного использования почв. В зонально-генетическом ряду “дерново-подзолистые - серые лесные - черноземы” нарастает обуглероженность ГК и степень их ароматичности. Аналогичная тенденция наблюдается с увеличением степени окультуренности используемых в сельском хозяйстве почв.

1.2.2. Механизмы взаимодействия “ГК-гербицид” Взаимодействия в системе “ГК-гербицид” могут осуществляться посредством различных механизмов с преобладанием одного или нескольких в зависимости от химического класса гербицида, а также от особенностей строения самих ГК. Химическая гетерогенность молекул ГК, выраженная в наличии ароматического “каркаса” и алифатической периферии, обогащенность различными функциональными группами, способность к образованию свободных радикалов, а также присутствие гидрофильных и гидрофобных фрагментов в структуре молекулы определяет ведущую роль этих веществ в связывании токсикантов (Khan, 1978; Senesi & Testini, 1982).

Взаимодействия в системе “ГК-гербицид” включают комплекс процессов, в результате которых токсикант связывается гуминовыми веществами посредством образования физической или химической связи различной прочности от очень слабого Ван-дер-Ваальсова включением молекулы гербицида в структуру ГК, т. е. до потери его химической индивидуальности (Khan, 1978, Dec & Bollag, 1997). Более подробное описание основных механизмов взаимодействия гербицид-ГК приведено ниже.

Ионный обмен. Адсорбция по механизму ионного обмена характерна для относительно небольшого числа гербицидов, которые в растворе существуют как катионы или становятся ими в процессе протонирования. В образовании ионной связи принимают участие легкоионизирующиеся карбоксильные и фенольные гидроксильные группы ГК. Методами ИК-спектроскопии и потенциометрического титрования была показана ведущая роль данного механизма в адсорбции диквата и параквата (Burns et al., 1973). Существующие в растворе в виде двухвалентных катионов бипиридилиевые гербициды реагируют с отрицательно заряженными группами ГК: либо с двумя СОО, либо с одной СОО и фенолят-ионом.

гидроксильных функциональных групп в ГК обуславливает значительную роль водородного связывания в их взаимодействии с гербицидами, в составе которых присутствуют доноры или акцепторы протонов (Khan, 1978). Данный тип связывания наиболее характерен для сим-триазинов и производных мочевин.

механизм). Присутствие в молекулах ГК электрон-дефицитных (хинонов) и электрон-избыточных структур (например, дифенолов) предполагает возможность образования комплексов с переносом заряда, использованием метода ЭПР-спектроскопии, показавшей увеличение концентрации свободных радикалов в системе “сим-триазин - ГК” по отношению к чистым ГК (Senesi, 1992). По-видимому, электрондефицитные, хиноноподобные структуры ГК способны принимать электрон от гетероциклического азотного атома и/или амино-группы промежуточных продуктов реакции.

Ковалентное связывание. Образование ковалентных связей приводит к стабильному, практически необратимому включению гербицида или продукта его трансформации в структуру молекулы ГК, в результате токсикант теряет химическую индивидуальность. Протекание процесса может катализироваться химическими, фотохимическими биодеградации представителей многих классов гербицидов ациланилидов, фенилкарбаматов, фениламидов, производных мочевин и ковалентного связывания при участии карбонильных, карбоксильных и анилинохинонов) и негидролизуемых (например, гетероциклов или сложных эфиров) продуктов. Ковалентное связывание является самым прочным и практически исключает возможность высвобождения токсиканта и его дальнейшее существование в свободном виде (Dec & Bollag, 1997).

Ван-дер-Ваальсово взаимодействие. Образование данного типа связи является результатом слабого, короткодействующего дипольдипольного или индуцированно-дипольного притяжения. Наибольшее значение данный вид связи имеет для неионных и неполярных гербицидов. С увеличением размера реагирующих молекул вклад Вандер-Ваальсовых сил во взаимодействие “ГК-гербицид” возрастает (Senesi, 1992).

обуславливается химической структурой гербицида. Так, для представителей класса сим-триазинов рядом работ была показана важность двух типов взаимодействия - это образование комплекса с переносом заряда и водородное связывание (Khan, 1978; Ladislau et al., 1994; Senesi et al., 1995; Sposito et al., 1996). При этом отдельными исследователями указывается на особенности протекания того или иного реагирующих веществ. Применение методов ИК- и ЭПР-спектроскопии, элементного и калориметрического анализов продуктов взаимодействия триазинов с ГК продемонстрировало наличие нескольких различных функциональных групп в молекуле ГК и степени основности гербицида (Senesi & Testini, 1982; Sposito et al., 1996). Авторами отмечается, что способность ГК к образованию стабильного комплекса с переносом заряда понижается с возрастанием их способности образовывать ионные и водородные связи с молекулой триазина, что связано с уменьшением в этом случае количества свободных радикалов в системе.

взаимодействий ГК с динитроанилинами, нами не найдено. Однако существует ряд интересных работ, в которых рассматриваются различные аспекты поведения гербицидов данного класса в почве.

Так, комплексное исследование поведения трифлуралина в почве, проведенное Golab с соавт. (1979), позволило выделить 49 продуктов трансформации гербицида в анаэробных и аэробных условиях, при этом определение остатков, связанных с различными фракциями органического вещества, показало невозможность извлечения продукта, в котором кислород обеих NO2 -групп и оба пропиловых радикала азотного атома были заменены на водород. На этом основании авторами было сделано предположение о ведущей роли NH2 -групп в образовании прочной связи с компонентами органического вешества.

Серия физико-химических исследований связанных остатков гербицидов - производных нитроанилинов была проведена Helling & Krivonak (1978). На основании результатов термического разложения связанных остатков авторы пришли к выводу, что взаимодействие осуществляется в основном через карбоксильные и/или фенольные гидроксильные группы гумусовых веществ и амино-группы частичновосстановленного гербицида.

В целом можно сказать, что многообразие химической природы как гуминовых веществ, так и самих токсикантов обеспечивает возможность осуществления нескольких типов взаимодействия в системе “ГК - гербицид”. Однако специфичность условий реагирования и структурные особенности ГК, зависящие, в частности, от типовой принадлежности почвы, а также вида ее использования, могут обуславливать преобладание того или иного типа взаимодействий.

1.2.3. Влияние ГК на токсичность гербицидов Взаимодействие гербицидов с веществами гуминовой природы приводит к более или менее прочному закреплению токсикантов в почвенном слое и, кроме того, препятствует проявлению токсических свойств, поскольку связанные гербициды в большинстве случаев менее доступны и мобильны (Hsu & Bartha, 1974; Riley et al., 1976; Kearney, 1976; Berry & Boyd, 1985; Мотовилова с соавт., 1994; Dec & Bollag, 1997). Однако, как показано различными исследованиями, устойчивость образованного комплекса “ГК-гербицид”, его биодоступность для корневых систем растений, а также для почвенных микроорганизмов в значительной мере зависит от химического класса гербицида и свойств реагирующих с ним ГК (Sequi, 1986; Тейт, 1991; Genevini et al., 1994).

Гербициды или их метаболиты, не обладающие фитотоксическим действием в связанном состоянии и не поддающиеся экстракции, повидимому, могут впоследствии высвобождаться и оказывать токсический эффект. К такому выводу пришли Helling и Krivonak (1978), наблюдая дефекты в развитии растений на почве по прошествии 5- месяцев после внесения профлуралина, трифлуралина, хлорнидина и динитрамина.

Сюняев (1984), изучая трансформацию и миграцию симазина в почвах подзолистого и черноземного типов в полевых и лабораторных условиях, пришел к выводу о двоякой роли гумуса в процессах деградации симазина: в первые 20-30 суток после внесения гербицида гумус ускоряет его разложение, а затем способствует замедлению разложения вследствие прочного закрепления гербицида вплоть до включения симазина в структуру молекулы гумусовых веществ.

В работе Genevini с соавт. (1994) изучалась токсичность атразина, прометона, диурона, линурона и их комплексов с ГК, выделенной из угля, на водной среде по отношению к проросткам огурца. Результаты эксперимента показали, что комплексы атразина с ГК не обладали токсическим действием: тест-растения, выращенные в присутствии этих комплексов, не отличались от контрольных вариантов. По-видимому, это было обусловлено биологической недоступностью гербицида.

Токсичность прометона в присутствии ГК существенно снизилась. В то же время продукты взаимодействия производных мочевины с ГК оказывали ингибирующий эффект на прирост биомассы тест-растений.

Образование комплексов “ГК-гербицид” может способствовать снижению токсического эффекта, который оказывают представители триазинов, диазинов, производных мочевины, карбаминовых кислот и некоторых других химических классов на фотосинтетическую активность растений (Draber et al., 1991; Manthey et al., 1993). Молекула ГК в этом случае, по-видимому, “связывает” активный центр гербицида, препятствуя таким образом его вмешательству в процесс передачи электрона по электрон-транспортной цепи.

Взаимодействие гербицидов с ГК влияет не только на их трансформации. С одной стороны, может наблюдаться замедление деградации гербицида вследствие его ассоциации с ГК и блокирования органическими коллоидами (Smith et al., 1988; Кэлдербенк, 1993); с стимулирующее действие на активность некоторых ферментов, катализирующих разложение гербицида (Кузьмич, 1990). Ускорить растительных остатков (Smith et al., 1988; Lee et al., 1995; Berger et al., 1996), активизируя таким образом микробиологическую деградацию комплексов.

Гуминовые кислоты могут способствовать снижению токсичности не только исходных препаратов гербицидов, но и продуктов их трансформации. Так, Amador с соавт. (1991) изучали деградацию комплексов ГК с анилином, являющимся структурным компонентом многих органических соединений. Результатами эксперимента было показано, что комплексы “анилин-ГК” не оказывали токсического эффекта на численность бактерий; скорость деградации комплексов была значительно ниже, чем скорость деградации несвязанных ГК, и возрастала при световом облучении и увеличении численности микробных популяций. Повышенную устойчивость анилин-гуминовых формированием азотных гетероциклов в результате ковалентного связывания анилина с хинонными структурами в молекуле ГК.

Устойчивость комплексов “ГК-гербицид” существенно зависит от структурных особенностей ГК. Например, ГК, выделенные из почв, образовывали более стабильные комплексы с напропамидом, чем водные и торфяные ГК (Liu et al., 1996). Анализ элементного состава гуминовых кислот показал, что почвенные ГК характеризовались повышенным содержанием азота и фосфора и пониженным - кислорода;

содержание аминокислот в них в 2-5 раз превышало этот показатель для торфяных и водных ГК. По мнению авторов, такие различия в структуре ГК обусловили значительный вклад гидрофобного связывания в образование и устойчивость комплексов выделенных из почв препаратов.

Гуминовые кислоты почв могут влиять на токсичность гербицидов не только образуя недоступные для растений комплексы, но и вызывая химическую трансформацию токсикантов. Так, исследованиями Gamble & Khan (1988) было показано, что гуминовые кислоты способствуют гидролизу триазинов, ведущему к образованию нефитотоксичных оксипроизводных.

Таким образом, гуминовые кислоты, являясь высокоактивными веществами специфической химической природы, способствуют снижению токсического эффекта гербицидов различных классов посредством их связывания и трансформации.

В целом, говоря о детоксикации гербицидов в условиях почвы, следует учитывать весь комплекс почвенных свойств, определяемых типом почвы и видом ее использования, уделяя особое внимание органическому веществу как наиболее важному в процессах инактивации токсикантов компоненту почвенной системы. Большое значение имеет не только общее содержание, но и качественный состав органического вещества - в частности, содержание в нем гуминовых кислот. В свою очередь, реакционная способность ГК зависит от их химической структуры, определяемой типовой принадлежностью почв и видом их использования.

Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.1.1. Отбор образцов почв В соответствии с поставленными в настоящей работе целями, отбор почвенных образцов производился в зонах распространения трех типов почв, последовательно сменяющих друг друга с севера на юг:

дерново-подзолистых, серых лесных и черноземов. Каждый тип включал целинный и пахотный варианты. Следует отметить, что взятые образцы наиболее полно отражали типовые признаки выбранных почв, поскольку пробоотбор производился по маршруту летней зональной практики, ставящей своей целью ознакомление студентов с классическими представителями почв указанных типов.

Методика пробоотбора. Для проведения исследований было отобрано девять почвенных образцов, каждый из которых был составлен из семи индивидуальных проб. Индивидуальные пробы (каждая проба составляла около 2 кг) отбирали с почвенного участка площадью примерно 5 м2 из верхнего гумусированного горизонта на глубине 3см. Почву высушивали до воздушно-сухого состояния и пропускали через сито в 1 мм. Из подготовленной таким образом почвы составлялся смешанный образец, который использовали для биотестирования, химических анализов и выделения препаратов ГК.

Пункты пробоотбора и описание почвенных профилей.

Почвенные профили, краткое описание которых приведено ниже, были вскрыты непосредственно на участках пробоотбора.

Московская область. Территория учебно-научного почвенноэкологического центра МГУ “Чашниково”.

глубокоподзолистая среднесуглинистая на покровном суглинке;

смешанный лес с преобладанием ели: О(0-1см)Ад(1-6см)АЕ(6см)Е(28-41см)ЕВ(41-64см)В(64-70см)С(70-115см).

среднесуглинистая слабосмытая на покровном суглинке; ржаное поле, всходы: Апах(0-15см)А1(15-25см)ЕВ(25-50см)ВС(50-75см)С(75см).

среднесуглинистая на приусадебном участке: Апах(0-32см)А(32см)В(40-51см)ВС(51-...).

Тульская область. Территория государственного заказника “Тульские засеки”.

4. Целинная серая лесная глубоковскипающая среднемощная среднесуглинистая на покровном суглинке; смешанношироколиственный лес с преобладанием дуба и липы: О(0-2см)А(2см)АЕ(18-30см)ЕВ(30-45см)Вt1(45-60см)Вt2(60-90см)ВС(90- 142см)С(142-...).

5. Освоенная серая лесная среднесуглинистая слабосмытая на покровном суглинке; поле под кормовыми травами: Ад(0-4см)Апах(4см)АЕ(25-35см)ЕВ(35-47см)Вt(47-89cм)ВС(89-...).

среднесуглинистая на покровном суглинке; широколиственный лес (липняк с дубом и ясенем): О(0-3см)А(3-61см)АВ(61-79см)В1(79см)В2(98-115см)В3(115-145см)ВСg(145-...).

Воронежская область.

Территория НИИСХ им. В.В. Докучаева.

7. Чернозем типичный глубоковскипающий среднемощный целинный на лессовидном суглинке; злаковоразнотравный луг: Ад(0см)А(5-56см)АВ(56-75см)Вса(75-80см)ВСса(80-...).

Воронежская область, Бобровский район.

8. Чернозем обыкновенный глубоковскипающий среднемощный зоогенно-перерытый распаханный на лессовидном суглинке; свежая пахота: Апах(0-31см)АпахА(31-38см)АВ(38-56см)Вса(56см)ВСса(128-...).

9. Черноземно-луговая выщелоченная среднемощная целинная на лессовидном суглинке; злаковоразнотравный луг: Ад(0-6см)А(6см)АВg(38-56см)В1g(56-90см)В2g,са(90-...).

обозначения почв и выделенных из них препаратов ГК.

1. Целинная дерново-подзолистая...

2. Окультуренная дерново-подзолистая...

3. Культурная дерново-подзолистая...

2.1.2. Характеристика почвенных образцов Для всех 9 почвенных образцов были определены рНводн, рНсол, гидролитическая кислотность по Каппену, сумма обменных оснований и степень насыщенности почв основаниями по Каппену-Гильковицу, содержание подвижного алюминия по Соколову, содержание свободного кальция методом пламенной фотометрии (Аринушкина, 1970). Общее содержание органического углерода было определено по методу Тюрина, состав гумуса - с применением пирофосфатной вытяжки по Кононовой и Бельчиковой (Орлов, Гришина, 1981).

2.2. Препараты гуминовых кислот Препараты ГК были выделены из следующих семи почвенных образцов: ПДлес, ПДпах, ПДог, СЛлес, СЛпах , Чтип, Члуг. Почвенные источники были выбраны таким образом, чтобы наиболее полно представить влияние типа почв и вида их использования на структурные параметры формирующихся в них ГК.

2.2.1. Выделение препаратов ГК Выделение препаратов ГК из отобранных почвенных образцов проводили согласно Д.С. Орлову и Л.А. Гришиной (1981). Процесс выделения включал следующие стадии:

Подготовка почвы. Из почвенного образца отбирали корни, затем почву разминали и пропускали через сито с диаметром отверстий 1мм. Для извлечения препаратов использовали 500 г почвы.

Извлечение гуминовых кислот. Для декальцирования навеску почвы переносили в стакан и заливали 0.1 М раствором H2SO4 в соотношении почва:раствор 1:5. После отстаивания суспензии раствор сливали и операцию повторяли до отрицательной пробы на кальций. Карбонатные почвы (черноземы) предварительно обрабатывали 10%-ной HCl до полного разрушения карбонатов, а затем проводили декальцирование.

дистиллированой водой, затем к ней приливали 4 л 0.1 М NaOH. После перемешивания и отстаивания суспензии темноокрашенный раствор, содержащий гуматы и фульваты натрия, сливали в приемную бутыль.

Обработку почвы щелочью проводили до заметного осветления щелочного экстракта (3-4 раза). В полученный раствор добавляли NaCl (устанавливая концентрацию 0,8 М) для коагуляции минеральных примесей. После отстаивания раствор подвергали центрифугированию для отделения минеральных коллоидов. Отцентрифугированную жидкость собирали в приемную бутыль. Для осаждения гуминовых кислот к жидкости при осторожном перемешивании добавляли 10%-ную H2SO4 из расчета 20-25 мл на литр экстракта до появления первых признаков коагуляции (значение рН устанавливали в пределах 1-2).

После отстаивания осадка гуминовых кислот надосадочную жидкость осторожно сливали в бутыль, а аморфный рыхлый осадок подвергали центрифугированию промыванием дистиллированной водой в центрифужных стаканах) для полного отделения от надосадочной жидкости. В сырой препарат гуминовых кислот добавляли дистиллированную воду до получения жидкой суспензии, переносили в пакет из диализной пленки и помещали в сосуд с дистиллированной водой для очищения от примесей легкорастворимых солей. Диализ проводили до отрицательной реакции на Cl- и SO42- во внешнем растворе. Очищенную суспензию гуминовых кислот высушивали при 60ОС, сухой препарат гомогенизировали растиранием и использовали в дальнейшей работе.

2.2.2. Характеристика препаратов ГК Методика определения влажности твердых препаратов ГК.

Определение проводили по методу, описанному в работе Abbt-Braun et al., (1990). В оловянной лодочке взвешивали около 1,5-2 мг воздушносухого образца ГК с точностью до 1*10-3 мг и помещали вместе с лодочкой в прибор для вакуумирования. Вакуумирование проводили при температуре 45оС и давлении 10-4 мм. рт. ст. в течение 24 ч. По истечении этого времени лодочку с навеской помещали на тарелку микровесов и регистрировали набор массы образца каждые 15 секунд (первое измерение через 1 мин после прекращения вакуумирования).

Строили зависимость массы образца от времени и, экстраполируя ее начальный линейный участок на момент времени t=0, находили массу сухого вещества (рис. 1).

По разности между массой воздушно-сухого образца и абсолютно сухого находили его влажность. Большая величина навески не использовалась в связи с тем, что для навесок > 2 мг набор массы за счет поглощения атмосферной влаги оказывается настолько велик, что весы не успевали уравновеситься.

Рис. 1. Набор массы высушенной навески ГК при Исходя из полученных величин влажности, были рассчитаны поправки к содержанию элементов по следующим формулам:

где a –содержание элемента (С, N), масс. %;

x – влажность образца, масс. %;

h –содержание Н, масс. %;

q –содержание О, масс. %;

– соответствующие поправки на влажность.

Величины поправок составили для С – от +3 до +6%; для H от –0.4 до – 0.7%; для O от –3 до –6%.

Зольность выделенных препаратов ГК была определена в лаборатории микроанализа кафедры органической химии Химического факультета МГУ ручным сожжением в кварцевых трубках в атмосфере кислорода при температуре 750оС в течение 40 мин, а также с дожиганием с дополнительной порцией кислорода при той же температуре в течение еще 40 мин.

Элементный анализ препаратов ГК. C,H,N-анализ был выполнен на элементном анализаторе модели СHN–O–Rapid-Geraet фирмы Heraeus (ФРГ), для сравнения использовали данные, полученные в лаборатории микроанализа Химического факультета МГУ на приборе модели- фирмы Carlo Erba Strumentazione (Италия). Краткая характеристика условий определения для обоих приборов приведена в следующей таблице:

Температура сожжения Температура восстановления окислов азота на Сu-контакте *ГХ – газовая хроматография ацетанилиду. Использовали навески 1.5-2.0 мг.

Содержание кислорода определяли с помощью анализатора СHN– O–Rapid (Heraeus). Условия прямого определения кислорода на элементном анализаторе Heraeus: восстановительный пиролиз в среде формиер-газа (5% Н2 в N2) при 1120оС; конверсия продуктов пиролиза в селективное детектирование СО с помощью недисперсионного ИКспектрометра.

С-ЯМР-спектроскопия. Строение углеродного скелета молекул ГК изучали методом С-ЯМР-спектроскопии с использованием ЯМРспектрометра VXR-400 (Varian). Образцы готовили растворением навески (100 мг) в NaOD/D2O. Спектр регистрировали при рабочей частоте 100 МГц, время задержки -- 3 с. Количественную обработку спектра проводили интегрированием по следующим диапазонам химических сдвигов (в м.д. по отношению к тетраметилсилану): 0 - (углерод алкильных групп, СAlk), 50 - 108 (углерод карбогидратов, первичных спиртов, ацеталей, CAlk–O), 108 - 165 (ароматический углерод, CAr), 165 - 185 (углерод карбоксильных групп, CCOOH). Типичный СЯМР-спектр препарата ГК почв приведен на рис. 2.

Выбранные интервалы для интегрирования 13С-ЯМР-спектров гуминовых кислот, а также 13С-ЯМР-спектры всех препаратов ГК даны в Приложении 1.

Рис. 2. Типичный 13С-ЯМР-спектр препарата ГК (дерново-подзолистая Суммированием интегральных интенсивностей СAlk и CAlk–O определяли вклад алифатического углерода в скелет ГК. Рассчитывая ароматических фрагментов по сравнению с алифатическими в структуру исследуемых ГК.

Гель-хроматография. Молекулярные массы ГК определяли с помощью гель-хроматографии. Разделение ГК осуществляли на колонке, колонки: диаметр -- 20 мм, высота -- 25 см. Пробу ГК растворяли и элюировали 0.028 М фосфатным буфером (рН 6,8). Концентрация ГК во фракционируемой пробы - 2 мл. Скорость элюирования -- 1 мл/мин.

органического углерода в элюате (проточный DOC-детектор “Graentzel”, Германия). Типичная гель-хроматограмма препарата ГК приведена на рис. 3 (гель-хроматограммы всех препаратов ГК даны в Приложении 2).

Определение молекулярных масс проводили по калибровочному полидекстраны (молекулярная масса, г/моль: 830, 4400, 9900, 21400, 43500, 2000000), олигосахариды (342, 504), глюкозу (180), глицерин (92) и метанол (37). Калибровочный график приведен на рис. 4.

Рис. 3. Типичная гель-хроматограмма препарата ГК (Vo -- свободный объем колонки, Vp -- общий объем, Ve -- объем элюирования фракционируемой пробы).

Молекулярная масса, г/моль Рис. 4. Калибровочный график гель-хроматографической колонки Обратное титрование. Общую кислотность ГК характеризовали баритовым методом в модификации Перминовой с соавт. (1995). Для этой цели в пластмассовый сосуд вносили 15 мг гомогенизированного растиранием препарата ГК и приливали 20 мл 0.06 М раствора Ba(OH)2.

Полученную суспензию взбалтывали в течение двух дней. После отстаивания отбирали аликвотные части раствора и титровали 0.1 М HCl в присутствии индикатора фенолфталеина. Общую кислотность (мэкв/г ГК) рассчитывали по количеству пошедшей на титрование кислоты.

препаратов ГК по отношению к гербицидам 2.3.1. Гербициды и их свойства Трифлуралин (2,6 - динитро - N,N - дипропил - 4 - трифторметил анилин) относится к группе замещенных 2,6-динитроанилинов ("Список...", 1994).

Предложен в 1960 году фирмой “Эли Лилли” (США) в качестве селективно действующего почвенного гербицида. Представляет собой кристаллы желтовато-оранжевого цвета. Обладает незначительной растворимостью в воде (1-24 мг/кг при 27ОС) и высокой - во многих органических растворителях (40 г в 100 мл ацетона при 27ОС).

Токсический эффект заключается в ингибировании роста корней, а именно, в нарушении процессов деления клеток. Химическая активность определяется строением ароматического ядра, имеющего дефицит электронов, вследствие чего молекулы гербицида образуют стабильные сигма-комплексы с нуклеофильными компонентами растительных тканей (Захаренко, 1990). Летуч, в тонком слое и в растворе на солнечном свету быстро разлагается с образованием продуктов, не обладающих гербицидным действием.

Торговый препарат трефлан представляет собой эмульсию, содержащую 500 г трифлуралина в 1 л раствора. Служит для уничтожения прорастающих сорных растений в посевах хлопчатника, сои, фасоли, гороха, моркови, капусты, томатов, сахарной свеклы, люцерны, а также в посадках фруктовых деревьев и других культурных растений. Трифлуралин применяется в количествах 0,5-2 кг д.в./га до, во время или после посева. Он заделывается в почву на глубину примерно 5-10 см с помощью соответствующих механизмов (фрез, культиваторов, дисковых и корпусных плугов и т. п.) Эффективное токсическое действие при правильной заделке сохраняется в течение одного вегетационного периода. Разложение осуществляется как химическим, так и микробиологическим путем. В аэробных условиях гербицид метаболизируется сначала с дезалкилированием дипропиламинной группы до монопропиламино- и аминогрупп, затем с восстановлением одной или обеих нитрогрупп. В анаэробных условиях, которые возникают в залитых водой почвах, эти реакции протекают в другом порядке: сначала проходит восстановление нитрогрупп, затем дезалкилирование (Майер-Боде, 1972).

В работе использовали х.ч. трифлуралин (99,7%), фирмы Dr.

Ehrenstorfer GmbH.

Рабочий раствор гербицида (с концентрацией 25 мг/л) готовили растворением навески в малом объеме этилового спирта с последующим доведением до метки дистиллированной водой.

Атразин (2-хлор-4-этиламино-6-изопропиламино-1,3,5-триазин) является представителем группы сим-триазинов, гербицидная активность которых была установлена в 1952 году в лаборатории фирмы “Гейги” (Швейцария) ("Список...", 1994).

C8H14ClN Применяется с 1958 года в качестве селективного гербицида для сельскохозяйственных культур, а также в качестве гербицида сплошного действия для невозделываемых площадей.

растворяющийся в воде и органических растворителях. Токсический эффект заключается в ингибировании процессов фотосинтеза. Гербицид препятствует процессу передачи электрона по электрон-транспортной цепи, блокируя белковую субъединицу Фотосистемы (Draber et al., 1991). Атразин используется при посевах кукурузы, спаржи, проса, сахарного тростника, цитрусовых, в виноградарстве, а также для борьбы с водной растительностью. Применяется в виде смачивающегося порошка путем опрыскивания почвы до посева, одновременно с посевом или после посева до появления всходов культуры. Обычная норма расхода составляет от 1 до 5 кг/га по д.в. В почве сохраняет фитотоксическое действие от нескольких месяцев до двух лет в зависимости от климатических условий и внесенного количества.

Разлагается в основном за счет химического гидролиза и в меньшей степени микробиологическим путем: первичным продуктом гидролиза дезалкилирование аминогрупп. Последней стадией гидролиза является расщепление триазинового цикла. Уменьшение фитотоксичности гербицида пропорционально уменьшению его фактической концентрации и указывает на отсутствие гербицидных свойств у продуктов разложения атразина (Майер-Боде, 1972; Керни и Кауфман, 1971).

содержанием д.в. 50%.

В работе с препаратами ГК использовали х.ч. атразин (98.0%), фирмы Dr. Ehrenstorfer GmbH.

Для проведения экспериментов использовали водный раствор гербицида.

2.3.2. Определение детоксицирующей способности почв Токсикологический эксперимент на почвах с трифлуралином.

Биотестирование проводилось в соответствии с “Методические указания...” (1988). В чашки Петри помещали по 50 г почвы и вносили водный раствор трифлуралина в дозах 1, 2, 4, 8, 12 мг/кг почвы с тщательным перемешиванием со всем объемом субстрата. По центру чашки Петри проводилась бороздка, в которую укладывали пророщенных семян пшеницы Triticum aestivum (сорт “Московская-35”) таким образом, чтобы корни всех проростков были ориентированы в одну грань бороздки, а ростки - в другую. Затем чашки помещали в термостат на 48 часов при температуре 25ОС. Чашки ставили на ребро так, чтобы бороздка находилась в горизонтальном положении. В качестве тест-отклика использовали длину среднего корня проростка в см. Для каждого опыта рассчитывали усредненную величину тестотклика по проросткам. Повторность опыта трехкратная.

Коэффициент вариации составил в среднем 4.6%.

Схема эксперимента для каждой из 9 почв (П - почва, Т - трифлуралин) Лабораторно-вегетационный опыт на почвах с атразином.

Опыт проводили в вегетационных сосудах. В сосуд помещали 500 г почвы, в которую при тщательном перемешивании вносили водный раствор гербицида в дозах из расчета 1, 2 и 4 кг/га. В сосуды высаживали пророщенные семена пшеницы Triticum aestivum (сорт “Московская-35”) (12 семян на сосуд). Опыт проводили в условиях дневного освещения. Продолжительность выращивания растений составляла 30 дней. В качестве тест-отклика использовали наземную воздушно-сухую биомассу всех растений в г. Повторность опыта трехкратная. Коэффициент вариации составил в среднем 5.2%.

Вариант 1. Контроль (П) Вариант 3. П + А (2 кг/га) Вариант 2. П + А (1 кг/га) Вариант 4. П + А (4 кг/га) Определение в почвах остаточных количеств атразина и его метаболитов методом ВЭЖХ. Извлечение остаточных количеств атразина из почв производилось согласно “Методические указания...” (1983). Для этой цели 20 г воздушно-сухой почвы помещали в колбу, увлажняли 6-8 мл дистиллированной воды и прибавляли 20 мл смеси гексан-этилацетат (1:1), плотно закрывали пробкой и встряхивали сначала вручную, переворачивая колбу, а затем на встряхивателе в течение 10 минут. Суспензии давали отстояться, экстракт осторожно сливали в чистую колбу (без частиц и слоя эмульсии), затем приливали еще 20 мл смеси и операцию повторяли. Экстракты объединяли и упаривали досуха на роторном испарителе (температура бани - до 37ОС).

Определение атразина в экстракте осуществляли методом ВЭЖХ с использованием хроматографа HP 1100 (Hewlett Packard, Waldbronn, Германия), снабженного ультрафиолетовым детектором на основе диодной матрицы. Разделение атразина и его метаболитов проводили на колонке Lichrocarb в режиме градиентного элюирования водой и ацетонитрилом. Регистрацию оптической плотности проводили при и 254 нм. Обработка данных производилась с помощью HP Chem Station, версия А.04.01. Типичная хроматограмма экстракта из почв приведена на рис. 5 (ВЖЭХ-хроматограммы всех почвенных образцов при различных дозах внесения гербицида даны в Приложении 3; времена удерживания составили: для дезизопропил-атразина tR= 12.67 мин, дезэтилатразина 16.38, 2-гидроксиатразина 23.99, атразина 26.31).

Рис. 5. Типичная хроматограмма экстракта из почвы, содержащей остаточные количества атразина.

2.3.3. Определение детоксицирующей способности препаратов гуминовых кислот трифлуралином. Для проведения биотестирования выделенные гуминовые кислоты использовали в виде нейтральных растворов, которые готовили из воздушно-сухих препаратов. Для этой цели необходимую для получения рабочего раствора навеску ГК (100 мг/л) растворяли в малом количестве 0.1 М КОН, нейтрализовывали серной кислотой до рН 7 и доводили до нужного объема дистиллированной водой.

Для выбора рабочей концентрации трифлуралина была исследована токсичность гербицида в диапазоне концентраций от 0, до 8 мг/кг субстрата. Для этой цели в чашки Петри помещали нейтральный субстрат - перлит (35 г на чашку), вносили растворы гербицида для достижения указанных концентраций, перлит увлажняли нейтральным раствором KOH+H2SO4, высаживали проростки пшеницы и далее поступали аналогично эксперименту на почвах. По результатам субстрата, вызывавшая 50%-ное снижение отклика биотеста (рис. 6).

Рис. 6. Шкала токсичности трифлуралина на перлите для проростков пшеницы (тест-отклик на контроле Ro = 38 см).

Далее проводили эксперимент с внесением препаратов ГК.

Растворы гуминовых кислот и гербицида вносили одновременно перемешиванием со всем объемом субстрата. ГК вносили в дозах 10, 25, 50, 100, 200 мг/кг субстрата. При закладке контрольных чашек перлит увлажняли нейтральным раствором KOH+H2SO4. В чашки высаживали по 10 проростков пшеницы и далее поступали аналогично эксперименту на почвах. Повторность четырехкратная. Коэффициент вариации составил в среднем 6.4%.

Схема эксперимента для каждого из 7 препаратов ГК 1. Контроль (перлит без ГК и трифлуралина) 2. Трифлуралин (Т) 0.5 мг/кг перлита атразином.

Для определения детоксицирующей способности препаратов ГК по биотестирования (Полынов, 1992). В качестве тест-объекта использовали культуру зеленой одноклеточной водоросли Chlorella vulgaris.

Культивирование тест-объекта. Культивирование интенсивной культуры хлореллы (термофильный штамм) осуществляли на 20%-ной среде Тамия в термостатируемых культиваторах емкостью 200 мл, при освещенности 30 Вт/кв.м (люминесцентные лампы типа ЛДЦ-40) и рН 6,6-6,8. Перед тестированием водоросли выращивали в течение суток.

Начальная плотность посадки - 500 тыс. кл./мл. К концу суток плотность клеток была не менее 10 млн. кл./мл.

водорослей использовали параметры быстрой флуоресценции. Выход импульсного флуориметра. Источником импульсного света служила лампа-вспышка ИФК-120, работающая в режиме генерации световых импульсов длительностью 40 мкс с частотой 0,5 Гц и вызывающая срабатывание не более 3% реакционных центров. Коротковолновую ( - 500 нм) область возбуждающего света вычленяли при помощи регистрировали в красной области спектра, помещая между образцом и осуществляли при помощи высоковольтного стабилизирующего выпрямителя ВС-22. Интенсивность флуоресценции регистрировалась на цифровом вольтметре и самописце.

Измерения проводили в момент начала эксперимента, через час и через 3 часа. Интенсивность постоянной флуоресценции (Fo), которая отражает излучательные потери энергии возбуждения при миграции ее к адаптированных к темноте образцов слабыми импульсами света.

Интенсивность максимальной флуоресценции (Fm) при восстановленном первичном хинонном акцепторе измеряли аналогичным образом, но при флуоресценции, характеризующий квантовую эффективность первичной фотосинтетической реакции, рассчитывали как Fv/Fm, где Fv=Fm-Fo. У лабораторной культуры хлореллы в оптимальных условиях Fv/Fm обычно составляет 0,75-0,78.

Методика токсикологического эксперимента. Интенсивную культуру хлореллы после суточного выращивания освобождали от культуральной среды и концентрировали центрифугированием в течение 3-х минут при скорости 5000 об./мин. Полученную суспензию водорослей вносили в культиваторы с растворами ГК и гербицида.

Для выбора рабочей концентрации атразина была исследована токсичность гербицида в диапазоне концентраций от 1,12*10-7 до 1,12*10- биотестирования (10%-ная среда Тамия, не содержащая фосфатов, ЭДТА и микроэлементов) вносили растворы гербицида для достижения указанных концентраций, помещали водоросли и регистрировали изменение их фотосинтетической активности. По результатам эскперимента была выбрана концентрация гербицида 2,2*107 М, вызывавшая 50%-ное снижение отклика биотеста (рис. 5).

Далее проводили эксперимент с внесением препаратов ГК. В пять мерных колб объемом 50 мл приливали нейтральные растворы ГК для установления концентраций 1, 2, 3, 5, 10 мг/л, к ним добавляли водный раствор атразина и доводили общий объем до метки средой для биотестирования. Растворы в других пяти колбах готовили таким же образом, но без добавления гербицида. В качестве контроля использовали чистую среду для биотестирования; для установления действия самого гербицида готовили раствор атразина вышеуказанной концентрации в среде для биотестирования. Приготовленные таким помещенные в аквариум с терморегуляцией. Условия проведения опытов (освещенность, температура, рН, продувка увлажненным воздухом) были теми же, что и при выращивании хлореллы. В культиваторы помещали по 1 мл культуры водоросли и культивировали в течение 3 часов, контролируя изменение их фотосинтетической активности через определенные промежутки времени. Для этого из культиваторов отбирали аликвотные части растворов, помещали в кюветы и регистрировали параметры быстрой флуоресценции. Повторность трехкратная. Коэффициент вариации составил в среднем 1,3%.

Рис. 7. Шкала токсичности атразина для культуры хлореллы (тест-отклик Схема эксперимента 1. Контроль (среда для биотестирования) 2. Атразин (А) 2,2*107 М 2.3.4. Количественная оценка детоксицирующей способности почв и препаратов ГК Детоксицирующую способность (D) почв по отношению к используемым гербицидам рассчитывали по формуле:

где Rt - тест-отклик в присутствии гербицида, Ro - тест-отклик в контроле. В качестве тест-отклика использовали воздушно-сухую наземную биомассу или длину корней проростков (для соответствующих экспериментов).

Детоксицирующую способность (D) препаратов ГК по отношению к гербицидам рассчитывали по следующей формуле (Perminova et al., 1996):

где Ro - тест-отклик в контроле; Rt - тест-отклик в присутствии гербицида; Rd - тест-отклик в присутствии ГК; Rd+t - тест-отклик в присутствии ГК и гербицида. В качестве тест-отклика использовали длину корней проростков или фотосинтетическую активность (для соответствующих экспериментов).

Для характеристики детоксицирующей способности почв при всех дозах внесения гербцида или детоксицирующей способности ГК при всех дозах внесения ГК использовали показатель “суммарная детоксицирующая способность” (SD). SD рассчитывали как площадь под кривой зависимости D от дозы внесения гербицида (для почв) или дозы внесения ГК при постоянстве концентрации гербицида (для препаратов), отнесенную к площади, соответствующей стопроцентному детоксицирующему эффекту.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Характеристика исследуемых почв и выделенных из них препаратов ГК Принадлежность почвы к конкретному почвенному типу, вид ее использования в хозяйственной деятельности человека обуславливают специфичность ее свойств и влияют на устойчивость почвы по отношению к загрязнителям различной химической природы, в том числе, гербицидам. Как было показано в литературном обзоре, способность почвы противостоять неблагоприятному влиянию химических соединений может сильно варьировать в зависимости от содержания и качественного состава органического вещества, рН почвенного раствора и целого ряда других факторов. При этом выявление зависимости детоксицирующего потенциала почвы от ее свойств возможно только при работе с набором почв, охватывающим непрерывный зональный ряд. Кроме того, детоксицирующая способность почвы может существенно меняться при вовлечении почвы в сельскохозяйственное использование.

При выполнении настоящей работы выбор почвенных образцов производился с учетом влияния двух основных факторов на свойства почв и формирующихся в них ГК: это смена типовой принадлежности почв в соответствии с законом широтной зональности и различный вид их хозяйственного использования. В данном случае представлялось возможным выделить как общие для всего ряда почв и препаратов ГК, так и свойственные каждому конкретному типу почв и формирующихся в них ГК факторы детоксикации используемых гербицидов.

В связи с этим для проведения исследований было отобрано девять образцов трех типов почв различного вида использования (дерновоподзолистые, серые лесные, черноземы; целинный и распаханный варианты), из гумусового горизонта А с глубины 3-20 см. Препараты гуминовых кислот были выделены из семи почвенных образцов и представляли все исследуемые типы почв и их варианты в зависимости от вида использования.

3.1.1. Свойства исследуемых почв В соответствии с поставленными в настоящей работе целями в исследуемых почвах были определены те показатели химического состояния, от которых в наибольшей степени зависит поведение гербицидов в почве. Как указывалось в литобзоре, такими показателями являются кислотность почв и насыщенность катионами, содержание органического вещества и его групповой состав. Во всех отобранных образцах были определены рНводн, рНсол, гидролитическая кислотность по Каппену, сумма обменных оснований и степень насыщенности почв основаниями по Каппену-Гильковицу, содержание подвижного алюминия по Соколову, содержание свободного кальция методом пламенной фотометрии. Общее содержание органического углерода было определено по методу Тюрина, а состав гумуса - с применением пирофосфатной вытяжки по Кононовой и Бельчиковой. Полученные результаты приведены в таблицах 1 и 2.

Как видно из табл.1, при переходе от дерново-подзолистых почв к черноземам наблюдалось снижение кислотности почвенного раствора и увеличение содержания в почве обменных оснований. Так, значения рНводн исследованных почв находились в диапазоне от 4.9 (Пдлес) до 7. (Чтип), 9.9 мгэкв/100 г почвы в Пдлес и 0.8 - в Чтип и Чоб. Максимальное содержание обменных оснований наблюдалось в черноземе обыкновенном - 64.6 мгэкв/100 г почвы. Содержание кальция составляло 0.1 мгэкв/100 г почвы в Пдлес и 30.2 - в Чтип. Наибольшая степень Таблица 1. Показатели химического состояния исследуемых почв.

Почвы рНводн рНсол Гидролити- Сумма ности основа- мг/100 г Таблица 2. Показатели гумусного состояния исследуемых почв.

насыщенности почв основаниями - до 99% - была зафиксирована в черноземных почвах. В дерново-подзолистой почве под лесом наблюдалось высокое содержание подвижного алюминия: ~0.4 мг/100 г почвы; тогда как в черноземах его обнаружено не было.

Результаты исследования гумусного состояния почв приведены в таблице 2. Как свидетельствуют полученные данные, при переходе от дерново-подзолистых почв к черноземам наблюдалось увеличение содержания в почве органического вещества и гуминовых кислот в его составе. Так, содержание органического углерода в гумусовом горизонте дерново-подзолистой почвы под лесом составило 2.1%, серой лесной под лесом - 2.8%, черноземно-луговой - 6.4%; при этом наблюдалось увеличение доли гуминовых кислот в составе гумуса: 33, 52 и 79% для тех же почв, соответственно. Гуматно-фульватный тип гумуса в дерновоподзолистых почвах сменился на гуматный в черноземах. Таким образом, анализ свойств почв различной типовой принадлежности показал соответствие полученных величин характерным для этих почвенных типов показателям.

Существенное влияние на свойства почв оказало их вовлечение в сельскохозяйственное использование. Так, сельскохозяйственное использование дерново-подзолистых почв, характеризующихся неблагоприятной для выращивания многих культурных растений кислой реакцией среды и подверженных быстрой деградации в силу низкой обогащенности органическим веществом, предусматривает их окультуривание. Как показало сопоставление свойств целинных и окультуренных вариантов исследуемых в настоящей работе дерновоподзолистых почв, их окультуривание (“Почвенно-агрономическая характеристика АБС “Чашниково”, 1988) способствовало увеличению содержания в почвах обменных оснований, в особенности, кальция (табл.1); наблюдалось снижение величины гидролитической кислотности и повышение рН. Как видно из данных по гумусному состоянию исследуемых почв (табл. 2), содержание органического углерода в окультуренном варианте дерново-подзолистой почвы (Пдпах) оказалось ниже, чем в целинном, но при этом в нем наблюдалась более высокая доля гуминовых кислот. Содержание Сорг в дерново-подзолистой огородной почве оказалось на уровне черноземов (4.8%). Однако органическому веществу данной почвы была присуща наименьшая среди всех исследованных почв степень гумификации - содержание ГК составило 24%. Данный факт может быть следствием внесения органических удобрений, приводящего к возрастанию содержания неспецифических органических веществ в почве.

Уменьшение содержания Сорг наблюдалось в пахотном варианте серой лесной почвы (1,3%) по сравнению с целинным (2,8%). О некотором ухудшении гумусного состояния черноземов при распашке может свидетельствовать относительно невысокий для этих почв показатель СГК/СФК, составивший в черноземе обыкновенном 1,7 при общем содержании Сорг 5% (табл. 2).

Таким образом, в результате определения основных показателей химического и гумусного состояния исследуемых почв были выявлены основные тенденции изменения свойств почв в зависимости от их типа и вида хозяйственного использования. Особо следует отметить значительное изменение количественного и качественного состава органического вещества почв.

3.1.2. Свойства препаратов ГК Препараты ГК были выделены из следующих почв: ПДлес, ПДпах, ПДог, СЛлес, СЛпах, Чтип, Члуг. Все выделенные препараты были охарактеризованы методами элементного и функционального анализа, гель-хроматографии и С-ЯМР-спектроскопии. Полученные результаты приведены в табл. 3 и 4.

Как видно из представленных данных, структурные параметры ГК в существенной степени зависят как от типовой принадлежности почв, в которых они были сформированы, так и от вида использования почв.

Согласно результатам элементного анализа (табл. 3), в ГК черноземов наблюдались более низкие отношения Н/С (0.6-0.7) и О/С (0.4) по сравнению с дерново-подзолистыми и серыми лесными почвами (H/C—1.0-1.04; О/С—0.55-0.59). Уменьшение отношения Н/С является индикатором возрастания содержания ароматических фрагментов в структуре ГК, тогда как снижение О/С свидетельствует о падении степени их окисленности (Орлов, 1990).

Исследование, предпринятое методом С-ЯМР-спектроскопии, подтвердило указанные тенденции. Так, согласно табл. 4, в ГК черноземов наблюдалось максимальное содержание ароматического углерода (54-55%) по сравнению с ГК дерново-подзолистых и серых лесных почв (45-47%) и минимальное - углерода карбогидратных структур (11%). При этом значимых различий по относительному вкладу ароматических фрагментов в структуру ГК дерново-подзолистых и серых лесных почв обнаружено не было. Определение общей кислотности не выявило существенных различий между препаратами ГК, выделенных из почв различных типов (7.1 - 8.1 мэкв/г).