«Борискина Ольга Андреевна ОБНАРУЖЕНИЕ ПРОГНОСТИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫХ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ ДЛЯ РАННЕЙ ВЫСОКОТОЧНОЙ ДИАГНОСТИКИ РАЗВИТИЯ АГРЕССИВНОГО ПАРОДОНТИТА 14.01.14 – стоматология Диссертация на соискание ...»

1) опорная и амортизирующая – удерживание зуба в альвеоле и распределение нагрузки;

механических агентов в периодонтальное пространство;

3) трофическая – питание цемента;

4) рефлекторная – осуществляется через элементы нервной системы.

Гистологическое строение пародонта на сегодняшний день достаточно детально изучено.

Цемент располагается на всем протяжении корня от шейки до верхушки зуба, имеет разную толщину покрова и представляет собой твердую обезызвествленную ткань. Функции цемента следующие:

1) входит в состав поддерживающего аппарата зуба, являясь основным местом прикрепления коллагеновых волокон (шарпеевских волокон) связочного аппарата;

2) защищает дентин корня от повреждающих воздействий;

3) выполняет репаративные функции при образовании так называемых резорбционных лакун и при переломе корня зуба;

регенерирующей периодонтальной связки после ее повреждения, способствует восстановлению ее прикрепления к корню зуба;

5) откладываясь в области верхушки корня, обеспечивает сохранение общей длинны зуба, компенсирующее стирание эмали в результате ее изнашивания (пассивное прорезывание) [123, 124].

Цемент состоит из органической части, представленной в основном коллагеновыми волокнами, и неорганической части – различные кристаллогидратные формы фосфата кальция (гидроксиапатиты). По данным различных источников в процентном соотношении химический состав цемента выглядит следующим образом: неорганическая часть занимает около 50%; в органической на долю воды приходится 15-20%, остальные 25-30% составляют молекулы коллагена, протеогликанов, гликопротеинов. По своей структуре цемент аналогичен костной ткани, однако кровоснабжение цемента осуществляется за счет притока веществ из сосудов периодонта, так как собственных сосудов не имеет. К особенностям цемента относят его способность к постоянному синтезу в течение всего срока службы зуба [40].

Аморфное (основное) вещество и коллагеновые волокна входят в состав межклеточного вещества цемента. Коллагеновые волокна расположены определенным образом: часть из них расположена параллельно поверхности цемента, а другие идут радиально переходят в периодонт, после чего вплетаются в альвеолярную кость.

Коллаген межклеточного вещества цемента представлен I, II, III, V, XII, XIV типом. Основную часть составляет коллаген I типа, его содержание приближается к 90% общего белка ткани. На долю коллагена III типа приходится ~ 5%, причем он расположен на поверхности фибрилл коллагена I типа [123]. По данным Bosshardt D.D., коллаген III типа обычно интенсивно накапливается в минерализованной соединительной ткани в момент ее роста предполагается, что здесь они не выполняют специфической функции, а случайно захватываются в процессе роста из периодонтальной связки, соединяющей матрикс цемента с костной альвеолой [39]. Коллагены II, XII и XIV характерны для хрящевой ткани, однако в следовых количествах они также могут быть обнаружены в составе цемента.

Коллагены составляют основу соединительной ткани организма и обеспечивают ее прочность и эластичность. Гены коллагенов человека достаточно полиморфны. Прежде всего, это касается их промоторных областей, обусловливающих уровень и регуляцию синтеза белка. Имеются данные, указывающие на существование взаимосвязи полиморфизма генов коллагенов с развитием заболеваний соединительной ткани, таких как остеопороз, остеоартрит, фиброз подслизистой и т.п. [44, 47, 116].

В своей работе Kuivaniemi H. с соавторами проанализировали полиморфных позиций, обнаруженных в генах коллагенов I, II, III, IX, X и XI типов у 317 пациентов [83]. В результате было сделано заключение, что отдельные варианты коллагена способствуют развитию заболеваний костей, хрящей и кровеносных сосудов. Di Lullo с соавторами, изучая сайты связывания коллагена I типа, описали свыше 300 полиморфных позиций, ассоциированных с нарушениями соединительной ткани [52]. А в работе Suzuki A. с соавторами для пациентов из Японии была установлена взаимосвязь между аллельным состоянием ряда генов коллагенов с развитием пародонтита [134].

расположена в щелевидном пространстве между цементом зуба и альвеолой.

Удерживание зуба в костной альвеоле, наряду с амортизирующей и сенсорной, питание цемента корня – это основные функции, которые выполняет данное образование. Основу периодонтальной связки составляют клетки, плотная волокнистая соединительная ткань с включениями рыхлой соединительной ткани, кровеносные и лимфатические сосуды [106].

Гемонов В.В. и соавт. (2002), описывая гистологическое строение периодонта, отмечают разнообразный клеточный состав: фибробласты, остеобласты, цементобласты, остеокласты, одонтокласты (цементокласты), макрофаги, тучные клетки, лейкоциты, эпителиальные островки Малассе [5].

Последние несколько десятилетий знания о строении соединительной ткани стали более точными. Межклеточное вещество последней образовано коллагеновыми волокнами и основным аморфным веществом [145]. Коллаген является основным органическим составляющим матрицы соединительной ткани периодонтальной связки, а протеогликаны и гиалуроновая кислота составляют основу межклеточного вещества эпителия. В промежутках между соединительной ткани, где в небольшом количестве расположены эластические волокна, проходят кровеносные и лимфатические сосуды, а также элементы нервной ткани. Эластин входит в состав соединительной ткани, образующей различные органы, где требуется большая растяжимость.

Сосуды периодонта имеют большое количество анастомозов с сосудами костной альвеолы из-за большого количества отверстий в стенке последней.

Между эпителием и соединительной тканью располагается базальная мембрана. Основной ее функцией является барьерная – регуляция диффузии веществ между двумя граничащими тканями. Также базальная мембрана дифференцировке и регенерации тканей [85]. Она состоит из сложной и тканеспецифичной смеси гликопротеинов и протеогликанов [151]. Основное амортизирующую функцию.

Что касается коллагеновых волокон, то согласно Nanci A., Bosshard D.

D. в периодонте они представлены коллагеном I, III и XII типа, пучки, которых ориентированы в различных направлениях на всем протяжении периодонтальной щели [106]. В зависимости от расположения и хода пучки коллагеновых волокон делят на 5 групп: 1) надальвеолярные, 2) горизонтальные, 3) косые, 4) радиальные, 5) апикальные. За счет особенностей прикрепления в области края альвеолы и шейки зуба пучки коллагена образуют так называемую циркулярную связку. Один конец волокон вплетается в вершину альвеолы и соединительную ткань десны, другой - к цементу эмалево-цементной границы и они носят название Шарпеевские волокна. В первичном бесклеточном цементе Шарпеевские волокна полностью минерализованы, в то время как их концы, вплетенные в цемент, минерализованы лишь частично. К циркулярной связке также относят транссептальную группу волокон, которая располагается в межзубном сосочке и таким образом соединяет соседние зубы.

Эластические волокна также входят в состав периодонтальной связки, но только один эластин из 3 типов входит в состав периодонта.

Окситалиновые волокна формируют трехмерную сетчатую структуру, которая окружает корень и заканчивается в апикальной зоне артериями, венами, лимфатическими сосудами и нервными элементами. До конца функции этого сплетения не известны, но, вероятно, они играют роль в регуляции кровотока [107].

В течение жизни волокна периодонта постоянно обновляются и ремоделируются за счёт работы фибробластов. Благодаря этому возможно ортодонтическое перемещение зубов. При повреждении периодонта происходит резорбция цемента, а затем и костной ткани альвеолы.

В результате нескольких исследований было установлено, что клеткипредшественники цементобластов могут происходить из периодонтальной связки.

Костная альвеола – ячейка в альвеолярном отростке верхней челюсти и альвеолярной части нижней челюсти, где располагается зуб. Альвеолярный отросток и альвеолярная часть состоят из наружной и внутренней кортикальных пластинок, между которыми расположена губчатая кость.

Пространства между трабекулами губчатой кости заполнены у детей красным костным мозгом, а у взрослых – желтым. Губчатая кость образует межкорневые и межзубные перегородки, пронизанные вертикальными каналами, через которые проходят нервы, кровеносные и лимфатические сосуды. Костная ткань относится к соединительной ткани и состоит из клеток, межклеточного органического матрикса кости (органического скелета кости) и основного минерализованного межклеточного вещества.

Как и любая кость, альвеолярный отросток или часть на нижней челюсти покрыта надкостницей или периостом. Последняя представляет собой пленку из соединительной ткани, в которой выделяют два слоя:

наружный или адвентициальный (волокнистый, фиброзный) и внутренний костеобразующий (остеогенный, содержит остоебласты). За счет внутреннего слоя надкостницы осуществляется не только рост кости, но и, благодаря наличию большого количества сосудов, проходящих в наружную компактную пластинку кости, осуществляется ее питание.

Десна – слизистая оболочка, покрывающая альвеолярный отросток и альвеолярную часть и обхватывающая шейку зуба. В оральной области и в области десневой борозды десна покрыта ороговевающим эпителием, неороговевающий эпителией находится в области прикрепления десны к зубу и называется соединительным эпителием. Последний состоит из нескольких слоев клеток – от 2 до 20 свободно расположенных клеток - и обладает высокой проницаемостью, что позволяет проникать лейкоцитам, а также веществам из плазмы через эпителий полости рта [125, 134].

Состояние клеток, такое как рост, дифференциация, прикрепление, миграция и секреторная активность, регулируется организмом на уровне систем: 1) за счет циркулирующих молекул – гормонов, факторов роста, цитокинов, прямых сигналов через клеточные рецепторы; 2) молекул межклеточного вещества.

Десневая борозда (желобок) – пространство между зубом и десной, дном которого является эпителиальное (зубо-десневое) прикрепление. Одну из стенок образует зуб, а точнее цемент корня или эмаль, другая представлена эпителием десны, а дном является свободная поверхность циркулярной связки. Эпителиальная выстилка на верхушке десневого сосочка переходит в эпителий десны, а в сторону зуба - в эпителий прикрепления. По данным Грудянова А.И. (2009) глубина десневой бороздки может составлять от 0,5 до 1,5 мм. Зубо-десневое прикрепление представлено многослойным плоским неорговевающим эпителием.

Считается, что эпителий прикрепления возникает из остатков клеток эмалевого органа, который после образования эмали редуцируется.

В норме это образование заполнено незначительным количеством жидкости, которое возрастает при воспалительном ответе. Последняя – транссудат плазмы крови, но, несмотря на это, ее химический состав несколько отличается. В десневой жидкости представлено множество веществ и элементов, так как поступление происходит из различных тканевых структур. Лейкоциты, слущенные эпителиальные клетки, белки, межклеточная жидкость тканей десны и периодонта, микроорганизмы – это лишь основная составная часть. Белковый состав десневой жидкости и плазмы крови одинаковый, он составляет порядка 61-68 г/мл. Интересно, что эта величина остается неизменной при возникновении воспалительных заболеваний пародонта. Тем не менее, изменение показателей других компонентов, как правило, носит выраженный характер, что позволяет судить о степени воспалительного процесса в тканях. Повышение показателей содержания иммуноглобулинов и компонентов системы комплемента, поступающих из плазмы крови и, как известно, отвечающих за фагоцитоз, позволяет с уверенностью говорить о локальном ответе организма человека на внедрение патогенных микроорганизмов. Ряд авторов считает, что помимо защитной функции десневая жидкость, а вернее ее компонент фибрин, образуя пленку, соединяет эпителий десневой борозды с поверхностью зуба. Разумеется, процесс образования пленки регулируется системой фибринолиза.

Различные исследования десневой жидкости позволили установить ее роль в разрушении тканей пародонтального комплекса при развитии воспалительно-деструктивного процесса.

1.3. Матриксные металлопротеиназы и их роль в развитии заболеваний пародонта Знания о строении и синтезе соединительной ткани и ее компонентов значительно пополнились за последние несколько десятилетий. Процессы ремоделирования и разрушения являются важной составляющей физиологических процессов, протекающих в межклеточном веществе. Они вносят решающий вклад в запуск и течение воспаления пародонта, влияя одновременно на множество факторов: синтез и распад межклеточного вещества, активацию и деградацию антимикробных пептидов дефензинов, активацию и деградацию хемокинов и цитокинов, рецепторов и других типов белков [84]. Деструкция тканей поддерживающего аппарата зуба вследствие деградации компонентов экстрацеллюлярного матрикса в первую очередь вызывается активностью матриксных металлопротеиназ (MMP). При агрессивном пародонтите она в течение нескольких месяцев приводит к необратимой потере соединительной ткани пародонта и альвеолярной кости [94, 137,138, 143].

MMP – это семейство Zn2+ и Са2+-зависимых эндопептидаз, которые секретируются клетками различных типов: фибробластами, макрофагами, гладкомышечными клетками эндотелия сосудов, нейтрофилами, хондроцитами, остеобластми и др. В совокупности аппарат MMP способен гидролизовать любые компоненты экстрацеллюлярного матрикса (ЕМС ЭЦМ): коллаген и проколлаген, протеогликан, эластин, фибронектин, ламинин, а также адгезин, интегрин и другие массовые поверхностные белки клеток соединительной ткани [9, 104].

гидролизовать основные белки межклеточного матрикса [104]. Количество вновь синтезируемых MMP поддается регуляции на уровне транскрипции их структурных генов, но фактическая протеолитическая активность определяется преимущественно на уровне активации проферментов. Она также находится в зависимости от ингибирования активных форм ферментов ингибиторами металлопротеиназ (TIMP). Экспрессия этих ингибиторов компонентами межклеточного вещества [49, 105]. Нарушение структуры межклеточного матрикса может оказывать существенное влияние, так как клетки взаимодействуют с внешней средой через него. Изменение или нарушение межклеточного матрикса вызывает различные клеточные реакции. Например, деградация базальной мембраны альвеол может изменять взаимодействие клеток альвеолярного эпителия с компонентами межклеточного вещества, что приводит к апоптозу [60].

MMP секретируются клетками в виде неактивных ферментов – проMMP или зимогенов. В качестве первичных индукторов активации MMP могут выступать протеаза плазмы крови плазмин и активаторы плазминогена - урокиназа (в плазме крови) или тканевый активатор плазминогена (в тканях). Далее каскад реакций отщепления пропептида от предшественников ММР может поддерживаться за счет самих активированных матриксинов.

Например, MMP1 способна активировать pro-MMP7, а MMP7, в свою очередь, активирует pro-MMP9 [21, 77].

У некоторых MMP имеется также трансмембранный домен или гликофосфатидилинозитольный якорь, прикрепляющий их к поверхности клетки.

Структура всех MMP представлена: 1) сигнальным пептидом, необходимым для секреции из клетки; 2) пропептидным участком, состоящим из примерно 80 аминокислотных остатков, при отщеплении которого MMP активируется (продомен, содержащий консервативную последовательность PRCGXPD, необходим для сохранения MMP в неактивной форме и отщепляется в процессе активации профермента); 3) каталитическим металлопротеиназным доменом, состоящим из примерно аминокислотных остатков, имеющим координационные связи с катионом Zn2+ каталитического центра, и 4) шарнирным регионом. Каталитический домен включает два иона Zn2+ и три иона Са2+. Все ферменты, кроме MMP7, имеют концевой гемопексиноподобный домен, содержащий центр связывания субстрата. В MMP2 и MMP9 выявлен дополнительный участок включения в каталитическом домене, схожий с фибронектином 2 типа, который, по-видимому, обеспечивает высокое сродство желатиназ к последовательность PRCGV/NPD, получившую название «цистеиновый выключатель», поскольку он содержит SH-группу, которая, связываясь с атомом Zn2+ в активном центре, поддерживает молекулу MMP в форме зимогена неактивного предшественника. После протеолитического происходит активация MMP [147].

В настоящее время известно как минимум 24 фермента, входящих в состав семейства MMP. На сегодняшний день существует несколько классификаций различных авторов. Так, Соловьева Н.И. (2000) представляет следующую классификацию ММP [21]:

растворимые):

коллагеназы (ММP1, ММP8, ММP13);

стромелизины (ММP3, ММP10, ММP11);

ММP, связанные с клеточными мембранами (мембранный тип МТ-ММP14, -15, -16, -17, -24, -25).

ММP неклассифицированные, не относящиеся к известным подсемействам.

высокоспецифичные протеиназы, обнаруженные во многих тканях, катализирующие начало распада коллагена. В этот класс входят: коллагенза (ММP1); колагеназа 2, также называемая нейтрофильнай коллагеназа (ММP8); коллагеназа 3 (МMP13). Они состоят из пропетида, каталитического и гемопексинового доменов. Этот класс MMP играет важную роль не только в разрушении фибриллярного коллагена I, II и III типов на различные фрагменты, но и обладает высокой активностью против других молекул и белков межклеточного вещества [48]. Изолированный каталитический домен коллагеназ может расщеплять неколлагеновые структуры, но не способен атаковать нативный фибриллярный коллаген без помощи гемопексинового домена. Наличие связи между двумя доменами является важным условием для проявления протеолитической активности в отношении нативного коллагена.

Высокая скорость расщепления нативного коллагена коллагеназами обусловлена узкой субстратной специфичностью: находясь в соединительнотканном матриксе, они распознают и гидролизуют строго определенные пептидные связи. Таким образом, неколлагеновые белки не являются для коллагеназ конкурентами коллагена. В биопсиях пораженных тканей пародонта обнаружены MMP1, -2, -3, -8, -9, в то время как здоровая десна содержит только pro-MMP2. Кроме того, ткани пародонта защищены тканевыми ингибиторами металлопротеиназ (TIMP) [73].

ММP1 – тканевый фермент, способный атаковать спиральную область полностью нативного коллагена I, II и III типа. MMP1 экспрессируется главным образом фибробластами и эндотелиальными клетками, но может продуцироваться также моноцитами, макрофагами, остеобластами, хондроцитами и некоторыми опухолевыми клетками.

В настоящее время коллагеназу I (ММP1), получившую свое название за способность расщеплять коллаген I типа, принято называть «интерстициальной» коллагеназой, чтобы подчеркнуть ее способность гидролизовать три интерстициальных коллагена – I, II и III, которые существенно отличаются друг от друга. Кроме того, этот фермент гидролизует минорные коллагены типов VII и X, а также белки соединительно-тканного матрикса: энтактин, аггрекан и, кроме того, казеин, 2-макроглобулин и синтетические субстраты, которые по своей последовательности соответствуют гидролизуемой области в коллагене и 2макроглобулине [17].

Повышенное содержание pro-MMP1 отмечается у пациентов с локализованным ювенильным пародонтитом [74]. Уровень активной ММP1 в десневой жидкости повышается при хроническом пародонтите [37].

ММP-8 (коллагеназа 2, нейтрофильная коллагеназа) является типичным маркером нейтрофилов и их предшественников, за что и получила название нейтрофильной коллагеназы. ММP8 синтезируется дифференцированными гранулоцитами в костном мозге и накапливается в специфических гранулах циркулирующих нейтрофилов.

Однако есть и другие источники ММP8, такие как клетки эпителия десневой борозды, фибробласты десны и пародонтальной связки, моноциты, макрофаги, плазматические клетки [79].

Субстратом экстрацеллюлярного матрикса для ММP8 являются коллагены I, II, III, VII, X, желатин, протеогликаны, брадикинин, ангиотензин 1, фибриноген, субстанция Р, аггрекан [61]. ММP8 играет важную роль в деструкции пародонтальной ткани и рассматривается в качестве основного фактора разрушения коллагена при хроническом пародонтите [79, 138].

ММP8 обнаруживается в зубном налете, а также в большом количестве присутствует в воспаленной ткани десны [72,79].

Экстракты десневой ткани пациентов с пародонтитом в отличие от десневой ткани здоровых лиц содержат повышенную концентрацию ММP8 в каталитически активной форме. Повышение уровня ММP8 в слюне пациентов с пародонтитом в сравнении со здоровыми пациентами установлено в ряде исследований и может рассматриваться в качестве диагностического признака. При хроническом пародонтите ММP обеспечивает 90-95 % коллагеназной активности десневой жидкости [73]. В течение прогрессирующей фазы пародонтита уровень ММP8 значительно увеличивается и фермент почти полностью переходит в активную форму [138].

Высокая активность коллагеназы 2 обнаруживается в десневой жидкости у пациентов с прогрессирующей убылью эпителиального прикрепления [114]. Высокая активность коллагеназы определяется в слюне пациентов с нелеченым хроническим пародонтитом и агрессивным клиническими показателями хронического пародонтита – глубиной пародонтального кармана и уровнем эпителиального прикрепления, поэтому концентрация ММP8 в слюне может быть индикатором не только тяжести, но и активности заболевания.

Установлено значительное снижение активности ММP-8 в десневой жидкости после успешно проведенной пародонтальной терапии [61].

Коллагеназа 3 – ММP13 экспрессируется эпителиальными клетками в ответ на действие различных экзогенных факторов. ММP13 в десять раз активнее других коллагеназ разрушает коллаген [23]. ММP экспрессируется эпителием пародонтальных карманов. У пациентов с пародонтитом ММP13 в десневой жидкости была обнаружена как в активной фрагментированной форме, так и в виде профермента [79,138].

Желатиназы. В отличие от коллагеназ, желатиназы не способны атаковать нативный коллаген. In vitro они интенсивно гидролизуют желатины, получаемые денатурацией коллагенов различных типов, в связи с чем и получили свое название. В тканях они, по-видимому, отвечают за окончательную деградацию фрагментов коллагенов, выведенных из состава фибрилл за счет атаки коллагеназ. В этот класс входят желатиназа А (MMP2) и желатиназа В (MMP9). Оба этих белка имеют три повтора фибронектина II типа, встроенного в каталитический домен. Они имеют схожий тип субстратной специфичности и кинетические характеристики: атакуют фрагменты коллагенов I, IV, V и XI типа, ламинин и аггрекан [22, 24]. По данным Aimes R.T., Quigley J.P. и Patterson M.L., Atkinson S.J., Knuper V., Murphy G. MMP2 все же способна разрушать нативный коллаген I, II и III типа, хотя существенно уступает в скорости этой реакции коллагеназам, тогда как MMP9 полностью лишена этой способности [29, 109].

Поскольку pro-MMP2 накапливается на поверхности синтезировавших ее клеток и активируется при помощи мебранносвязанной МТ-MMP, ее активность на уровне гистологии оказывается связанной с определенными типами клеток. Субстратная специфичность не позволяет рассматривать желатиназы в качестве первичного индуктора разрушения коллагена, но они могут вносить вклад в длительное поддержание гиперактивности системы MMP в ткани за счет деградации ингибиторов и первичных мессенджеров, участвующих в регуляции этого состояния [102]. При пародонтите главным источником желатиназы В (ММP9) являются нейтрофилы и, в меньшей степени, моноциты и макрофаги. РНК ММP9 была обнаружена в нейтрофилах и макрофагах, а также в фибробластах, хондроцитах и Тлимфоцитах после стимуляции их цитокинами, форболовым эфиром, онкогенами, а также в инфицированных клетках [73].

В десневой жидкости ММP9 была обнаружена в большинстве проб у пациентов с пародонтитом (97,8 %) и только в 11,4 % проб у пациентов с гингивитом Наиболее высокая активность желатиназы была зарегистрирована у пациентов с прогрессирующей убылью прикрепления или при пародонтальном абсцессе. Предполагается, что активность ММP- может быть использована в качестве маркера риска прогрессирования заболеваний пародонта [126]. Повышение уровня желатиназы А (ММP2) и желатиназы В (ММP9) в десневой жидкости, регистрируемое при пародонтите, снижается после проведения адекватной периодонтальной терапии [37, 73, 94].

Стромелизины. К классу стромелизинов относятся: стромелизин (ММP3), стромелизин 2 (ММP10) и стромелизин 3 (ММP11). Некоторые исследователи относят к этому классу также ММP-12 (макрофагальная металлоэластаза). К стромелизинам относят также транзины, протеогликаназу, активатор проколлагеназы. Стромелизины имеют сходный по устройству с коллагеназами домен, однако не расщепляют коллагены I, II и III типа, а действуют преимущественно в отношении неколлагеновых белков соединительнотканного матрикса и минорных коллагенов синергично с коллагеназами и желатиназами. MMP3 и ММP10 схожи по структуре и субстратной специфичности, но MMP11 (стромелизин 3) имеет отдаленное сходство.

В норме ММP3 продуцируется многими клетками соединительной ткани, но в незначительных количествах. Лишь воздействие на эти клетки таких внеклеточных факторов, как цитокины, факторы роста, форболовый эфир, или же внутриклеточная суперэкспрессия протоонкогенов приводят к резкой стимуляции синтеза как ММP3, так и ММP10 [17].

MMP3 и ММP10 способны переваривать молекулы ECM и участвуют в активации pro-MMP, а MMP11 имеет незначительную активность по отношению к молекулам межклеточного вещества [103]. Другим отличием является то, что и MMP3, и ММP10 выделяются из клеток в виде неактивных pro-MMP, а MMP11 активируется фурином внутриклеточно и секретируется из клетки уже в качестве активного фермента [110]. Интересно, что ген MMP11 находится в хромосоме 22, а гены MMP3 и MMP10 - в хромосоме 11, вблизи от генов MMP1, -7, -8, -12, -20, -26 и -27.

Стромелизины могут секретироваться клетками различных типов:

моноцитами, эндотелиалиоцитами, хондроцитами, десневыми фибробластами. Они могут оказывать влияние на запуск и скорость деградации различных белков внеклеточного матрикса: фрагментов коллагенов, протеогликанов, ламинина, фибронектина. Стромелизины способны непосредственно атаковать минорные коллагены IV и IX типа [22].

Активность ММP3 в десневой жидкости повышается как при агрессивном, так и при хроническом пародонтите и рассматривается в качестве одного из факторов деструкции соединительной ткани при этой патологии [37,139].

Матрилизины. В этот класс входят матрилизин 1 (ММP7) и MMP26.

Структурной особенностью этих MMP является отсутствие у них гемопексинового домена. MMP-7 синтезируется эпителиальными клетками и способна активировать несколько прo-MMP, в том числе про-ММP8.

Повышение активности ММP7 связывают с ускорением миграции предшественников эпителиоцитов и с антибактериальной защитой эпителия прикрепления [53, 143].

Матрилизин экспрессируется супрабазальными клетками эпителия прикрепления и эпителиальными островками Маляссе [141].

прикрепления пока неясна. Сам матрилизин не обладает антимикробной предшественников антибактериальных пептидов – дефензинов [22].

Дефензины – катионные пептиды, накапливающиеся в нейтрофилах и эпителиальных клетках, играющие важную роль в защите тканей от бактериальной инвазии. Дефензины 1 и 2 в существенных количествах обнаруживаются в десневом эпителии.

микроорганизмами полости рта. Матрилизин может также управлять поверхностные клеточные и матриксные белки или протеогликаны [142].

Мембраносвязанные матриксные металлопротеиназы (МТ-MMP) в отличие от других металлопротеиназ проявляют свою активность, не покидая поверхности клетки, то есть они не секретируются в среду. Существует типа МТ-MMP, которые содержат четыре трансмембранных белка I типа (MMP14, -15, -16 и -24) и два глюкозилфосфотидилинозатол связанных белка (MMP17 и -25). Все они имеют фурин-чувствительный пропептид, на Сконце которого имеется консервативная последовательность RX[R/K]R.

идентифицированы на поверхность клетки по характерной ферментативной активности. Все MT-ММP, кроме MT4-MMP (MMP17), могут активировать про-MMP2 [56].

эндогенный тканевый ингибитор TIMP-2, тем самым способствуя активации про-MMP2, но не про-MMP9. MMP14 гидролизует ряд белков матрикса, что предполагает наличие у этого фермента важной сигнальной функции.

MT1-MMP (MMP14) может активировать прo-MMP13 непосредственно на поверхности клетки [81]. Однако МТ1-ММP сама по себе обладает коллагенолитической активностью в отношении типа I, II и III коллагена [107].

Культивируемые фибробласты десны от пациентов с пародонтитом способны экспрессировать и секретировать растворимую форму ММP14, которая поддается обнаружению в десневой жидкости при пародонтите [50, 138].

ММP-14 может активизировать другие MMP в том числе про-ММP8 и про-MMP13 [50, 51].

MMP14 может вызывать деградацию коллагенов I, II, III, что, в свою очередь, ускоряет активацию про-MMP2, -13, и -8. В десневой жидкости при поражении пародонта были также обнаружены лейколизин (МТ2-MMP или MMP25) и матрилизин-2 (MMP26) [73].

Другие матриксины.

В этот класс входит семь ММP, не относящихся к вышеуказанным.

Среди них ММP12, -20, -27 имеют схожую со стромелизинами структуру домена и локализацию в хромосоме, поэтому вероятно целесообразнее было бы их отнести в соответствующую группу.

Металлоэластаза (ММP12) первоначально была обнаружена в макрофагах, а затем и в гипертрофированных хондроцитах и остеокластах.

Она расщепляет эластин и ряд молекул внеклеточного матрикса и играет важную роль в миграции макрофагов [69, 78, 128].

базальные мембраны и расщепляющим другие молекулы межклеточного матрикса [133]. MMP19 широко распространена в тканях человека [111].

Предполагается, что этот фермент играет роль в ремоделировании тканей, заживлении ран и ускорении миграции эпителиоцитов путем расщепления цепи ламинина 5 [120, 121].

экспрессируется в новообразованной эмали и расщепляет амелогенин.

Несовершенный амелогенез – наследственное заболевание, обусловленное мутацией в гене MMP20 [90].

MMP21 экспрессируется в различных тканях, как эмбриональных, так и взрослых. Этот фермент обнаруживается в культурах клеток базалиом и плоскоклеточных форм рака, в макрофагах из очагов гранулематозного поражения кожи, в клетках дерматофибром [28, 130].

Данные о действии MMP21 на компоненты межклеточного вещества отсутствуют, но известно, что она обладает активностью в отношении желатина.

На посттрансляционном уровне в физиологических условиях известны два основных пути регуляции активности ферментов: 1) протеолитическая активация зимогенов и 2) взаимодействие с эндогенными ингибиторами [22].

Регуляция на посттрансляционном уровне включает в себя прежде всего активацию профермента, которая может протекать либо ступенчато (в особенности это характерно для мембранносвязанных проферментов), либо по cystein-switch механизму [26].

Тканевые ингибиторы (TIMP) – семейство белков, подавляющих активность MMP, которые синтезируются клетками соединительной ткани и лейкоцитами, за счет образования прочных нековалентных комплексов с MMP [73]. Первоначально они были обнаружены как ингибиторы коллагеназы в сыворотке крови и в очищенной от фибробластов среде [144].

У человека известны четыре типа ингибиторов MMP: TIMP1, TIMP2, TIMP3 и TIMP4 [36]. TIMP1 и TIMP3 являются гликопротеинами, а TIMP2 и TIMP4 не содержат в своем составе углеводов.

Белки TIMP гомологичны друг другу и состоят из 184- аминокислотных остатков, среди которых выделяются 12 консеравтивных Cys. При изучении расположения шести дисульфидных связей в TIMP- было установлено, что на N- и С-концевых доменах расположены по три ингибирования ее активности [100].

TIMP подавляют активность MMP в соотношении 1:1, непосредственно взаимодействуя с активным центром MMP [41]. Однако, помимо TIMP, существуют другие белки и механизмы, позволяющие ингибировать MMP.

Например, 2-макроглобулин вносит основной вклад в ингибирование MMP в синовиальной жидкости. RECK (индуцирующий реверсию обогащенный цистеином белок с мотивом Kazal) представляет собой чрезвычайно эффективный ингибитор MMP-9, иммобилизованный на поверхности плазматической мембраны фибробластов [36, 55].

TIMP1 известен как наиболее значимый ингибитор коллагеназы 1. В плазме TIMP1 существует в двух формах: свободной и связанной, образуя комплексы с металлопротеиназами: с ММP1 (коллагеназой 1), ММP (желатиназой А), латентной и активной формами ММP9 (желатиназой В), ММP3 (стромелизином-1) [146].

торможение способности клеток к преодолению эпителиальных барьеров, что особенно ярко проявляется при подавлении ими инвазий и метастазирования опухолевых клеток. TIMP1 и TIMP2 также замедляют процесс ангиогенеза. TIMP3 был обнаружен только в экстрацеллюлярном матриксе и может считаться маркером его конечной дифференцировки.

TIMP4 участвует в сохранении целостности экстрацеллюлярного матрикса [146].

Характеризуя роль экспрессии и активации MMP в проявлении их активности, нужно отметить, что в норме ткани не содержат активной MMP, а накопление их предшественников находится на минимальном уровне [127].

Таким образом, обе стадии регуляции являются необходимыми для накопления в ткани активной формы матриксинов.

1.4. Цитокины и их роль при воспалительных заболеваниях пародонта Воспаление – это возникший в ходе эволюции типовой патологический процесс, заключающийся в преимущественно защитной реакции организма на различные болезнетворные воздействия, выражением которой является поражение тканей (альтерация), нарушение микроциркуляции с повышением сосудистой проницаемости, экссудацией и эмиграцией лейкоцитов, а также образованием новых тканевых элементов (пролиферация), приводящее к заживлению дефекта [4].

иммунокомпетентных клеток. В течение нескольких часов после воздействия патогенов оседлые макрофаги в очаге воспаления запускают синтез экспрессируют их рецепторы, усиливают синтез эндотелиальными клетками и лейкоцитами молекул адгезии и синтез факторов роста [27]. При этом происходит выброс низкомолекулярных медиаторов воспаления, таких как гистамин, простагландины и др., ответственных за развитие воспалительной реакции в полном объеме [19].

универсальную сеть медиаторов, характерную как для иммунной системы, так и для клеток других органов и тканей. Под контролем этого класса регуляторных белков протекают все клеточные события: пролиферация, дифференцировка, апоптоз, специализированная функциональная активность клеток [18]. Термин «цитокины» был предложен Cohen N. в 1974 г., и в это время считалось, что они вырабатываются клетками иммунной системы, являясь одновременно и ее регуляторами. В последние годы появились данные, что продуцентами цитокинов могут быть и эндотелиальные клетки, причем вырабатываемые ими цитокины, также участвуют в регуляции процессов гемопоэза, хемотаксиса лейкоцитов, дифференцировке иммунокомпетентных клеток, синтезе острофазных белков [8].

зависимости от принципа, положенного в основу. Так, медиаторы можно биологическим свойствам; в) по типам рецепторов, посредством которых они осуществляют свои биологические функции; г) в зависимости от типа клеток иммунной системы, продуцирующих данные белки (интерлейкины, монокины и лимфокины) [20].

Большинство авторов придерживаются систематизации цитокинов на основании их биологического действия:

1. Интерлейкины (IL-1 – IL-18) - секреторные регуляторные белки, обеспечивающие медиаторные взаимодействия в иммунной системе и ее связь с другими системами организма.

2. Интерфероны (IFN-,, ) - противовирусные цитокины с выраженным иммунорегуляторным действием.

3. Факторы некроза опухоли (TNF, ) - цитокины с цитотоксическим и регуляторным действием.

регулирующие гемопоэз.

5. Хемокины (IL-8, IL-16) - хемоаттрактанты для лейкоцитов.

6. Факторы роста - регуляторы роста, дифференцировки и функциональной активности клеток различной тканевой принадлежности (фактор роста фибробластов, фактор роста эндотелиальных клеток, фактор роста эпидермиса) и трансформирующие факторы роста (TGF ).

Как упоминалось выше, в основе АП лежит реакция воспаления, а цитокины являются одним из главных клеточных ответов организма на внедрение патогенной микрофлоры в ткани пародонта. Нейтрофилы и макрофаги являются наиболее значимыми источниками медиаторов воспаления при АП, однако весьма существенную роль отводят цитокинам и хемокинам, которые продуцируются активированными Т- и В-лимфоцитами, инфильтрированными в воспаленные ткани пародонта [25]. Деструкция соединительной и костной ткани является опосредованным процессом действия этих регуляторных белков. В литературе встречаются различные данные о роли цитокинов в течении АП. Самые первые работы были посвящены присутствию и оценке уровня цитокинов в тканях пародонта, а на сегодняшний день анализируются полиморфные позиции генов различных цитокинов.

Так, в работе Lee H.J. с соавт. была исследована взаимосвязь между уровнем цитокинов в десневой жидкости и активностью течения АП.

Авторами была установлена корреляция между потерей альвеолярной кости и повышенным уровнем IL-2 и IL-1, а в качестве возможных показателей активности заболевания предложено определение уровня IL-2, IL-1 и IL- [86].

Позднее коллектив авторов изучал изменение уровня IL-1, а также IL-1ra и IL-10, в десневой жидкости после проведения начального этапа лечения АП. В исследовании участвовало 15 пациентов с АП и 15 пациентов без патологии пародонта. Забор биоматериала в группе с АП проводили из ПК с различной глубиной – из наиболее глубокого, средней степени, минимальной глубины. В результате исследования было установлено, что уровень IL-1 является наиболее эффективным показателем для оценки воспаления тканей пародонта и может быть использован в качестве лабораторного инструмента для оценки активности заболеваний пародонта [140].

В сравнительно недавнем исследовании группа авторов изучала взаимосвязь между качественным составом поддесневой биопленки и уровнем цитокинов в десневой жидкости у 31 здорового пациента и пациентов с АП. В результате работы было обнаружено высокое соотношение IL-1/IL-10 у пациентов с АП, по сравнению с группой здоровых лиц [136].

В работе Ayazi G. и соавт. изучали взаимосвязь полиморфизма гена ILс +3954 развитием генерализованного АП у жителей Ирана. В исследовании принимали участие 26 пациентов с АП и 26 здоровых пациентов. Распределение генотипов было следующим: в группе здоровых пациентов СТ встречался в 56%, СС - в 28%, и ТТ в 16%, тогда как в группе пациентов с АП встречались только СТ и ТТ генотипы, 38,5% и 61,5% соответственно. В заключение своего сообщения авторы указывают, что при расчетах ими была выявлена ассоциация полиморфизма гена IL-1 с развитием АП [35].

Однако Ebadian A.R. и соав., проводившие в ирано-хорасанской популяции анализ взаимосвязи SNP цитокинов IL-1 +3954 С / Т и ФНО- G / A с развитием генерализованного АП, не выявили достоверных статистических различий в группе пациентов с АП (58 человек) и здоровых (60 человек). В качестве биологического материала использовали венозную кровь, а в качестве метода исследования выбрали полимеразную цепную реакцию полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ).

Распределения генотипов для IL-1 +3954 выглядели следующим образом:

у пациентов с АП генотип CT встречался в 39,6%, CC - в 60,4% и TT - в 0,0%; а в контрольной группе вт41,7%, 50% и 8,3%, соответственно. При расчете для TNF- -308 в группе пациентов c АП частота встречаемости генотипа GA была 44,8%, GG - 41,4% и AA -13,8%, а в контрольной группе и 3,3% соответственно [54]. Таким образом, это сообщение противоречит вышеупомянутому, но возможно, это связано с различиями в численности и выборке популяции.

В качестве SNP для своего исследования Ycel O.O. и соавт. также выбрали ген IL-1 +3954, однако включили в работу не только лиц с АП, но и ХГП. Таким образом, всего было обследовано 147 человек турецкого происхождения, из них 56 с диагнозом АП, 44 человека - с ХГП и клинически здоровых пациентов. Также в исследовании была поставлена задача выявить корреляцию между уровнем данного цитокина в десневой жидкости и тяжестью заболеваний и клинической картиной. В качестве метода исследования SNP была использована полимеразная цепная реакция полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ). При расчете данных не было выявлено ассоциации гена IL-1 +3954 с развитием АП, однако для аллеля Т выявили связь с повышенной кровоточивостью, и, в свою очередь, было выдвинуто предположение о роли данного SNP в развитии и течении ХГП [150].

В работе Jain N. с соавт. в качестве SNP для выявления возможной ассоциации с ВЗП выбрали IL-4 + 33С / Т и IL-17F 7383 A / G и 7488 A / G. В исследовании принимали участие 63 пациента с ХГП, 61 пациент с диагнозом АП, контрольная группа состояла из 101 здорового человека. Все пациенты относились к дравидийской этнической группе в Индии. IL-4, являясь мощным регулятором функции макрофагов, ингибирует секрецию провоспалительных цитокинов, таких как IL-1, IL-6 и фактора некроза опухоли (TNF). IL-17F является новым провоспалительным цитокином, который регулирует воспаление, активность остеокластов, усиливает провоспалительный ответ, а также способствует развитию аутоиммунных состояний. Роль IL-17F при заболеваниях пародонта мало изучена.

Имеющиеся данные позволяют предположить, что ген IL-17F является отличным кандидатом для хронических воспалительных заболеваний, таких как ревматоидный артрит [108]. Ревматоидный артирит и воспалительные заболевания пародонта объединяют общий иммунный путь, а ассоциация между ревматоидным артиритом и ХГП хорошо описана в литературе [59, 76]. При проведении расчетов Jain N. с соавт. обнаружили статистически значимые различия в распределении генотипов CC, CT, TT для IL-4 + 33C / T в выборке случаев (АП+ХГП) и в контрольной группе. Распределение генотипа CC (77%) было выше в группе случая (АП+ХГП) по сравнению с контрольной группой (64%). Авторы указывают на соответствие распределения генотипов в их исследовании с работой, проведенной на иранской популяции [68], где было выявлено преобладание генотипа СС в группе случая (АП+ХГП), однако они не достигали статистической значимости. Однако при разделении выборок по нозологии на агрессивный и хронический пародонтит авторы обнаружили статистически значимые различия в распределении аллелей SNP IL-4 + 33С / Т между АП (C = 89%, Т = 11%) и контрольной группой (С = 81%, Т = 19%), но не с генотипами. Не было выявлено статистически значимой связи между смешанными выборками случая (АП+ХГП) и контрольной группой для обоих генотипов и аллелей IL-17F на 7488 A / 7383A и G / G полиморфизма. Разделение на пациентов на группы с АП и ХГП также не позволило выявить каких-либо статистически значимых данных.

Опираясь на данные, полученные в результате анализа литературы, в качестве потенциальных генетических факторов риска развития пародонтита мы рассматривали гены четырех основных типов белков: металлопротеиназы и их ингибиторы, фибриллярные и аморфные белки матрикса пародонта, локальные сигнальные факторы и генерализованные сигнальные факторы, действующие на уровне кровотока.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В исследовании принимали участие 171 человек в возрасте от 18 до лет без тяжелых общесоматических патологий. Из них 48 человек с диагнозом агрессивный пародонтит, 123 практически здоровых лиц, не предъявляющих никаких жалоб и без видимых клинических проявлений воспалительных заболеваний пародонта. Необходимо отметить, что нашем пародонтитом не ассоциированным с какими-либо соматическими патологиями, что было подтверждено заключением врача-терапевта.

Всем без исключения пациентам была предоставлена для ознакомления информация о проводимом исследовании в письменной и устной форме, а также форма информированного согласия для подписи на участие в исследовании.

Критерии включения:

Лица обоего пола, принадлежащие к европеоидной расе, в возрасте от 18 до 45 лет, проживающие на территории г. Москвы и Московской области.

Критериями исключения являлись:

Системные заболевания соединительной ткани;

Злокачественные заболевания, курсы химиотерапии и лучевой терапии в анамнезе;

Острые инфекционные и вирусные заболевания;

Поливалентная аллергия;

Беременность и лактация;

Лица, не понимающие цели исследования и не подписавшие добровольного информированного согласия.

Перед проведением исследования была разработана анкета, отражающая основные необходимые для исследования параметры.

Анкета ФИО Прикус Возраст физиологический Возраст появления жалоб_ патологический Кровоточивость десен Количество зубов_ Периодическое воспаление Подвижность зубов I II III Ближайшие родственники Агрессивный пародонтит в Примечания Разработка тест–системы по 23 образца слюны металлопротеиназ Для определения пародонтологического статуса пациентов при обследовании использовали клинические и рентгенологические методы.

2.2. Клинические методы исследования Клиническое обследование пациентов начинали со сбора жалоб и анамнеза жизни. На этом этапе особое внимание уделяли возрасту возникновения первых жалоб и их характеру, а также наличию или отсутствию подобных жалоб по линии ближайших родственников.

Далее приступали к внешнему осмотру - визуально оценивали конфигурацию лица, состояние кожных покровов и красной каймы губ.

Затем переходили к пальпаторному исследованию регионарных лимфатических узлов.

Осмотр рта начинали со стороны преддверия, определяя состояние слизистой оболочки, фенотип десны, анатомо-топографические особенности, включая глубину преддверия и прикрепление уздечек и тяжей.

шинирующих и ортопедических конструкций.

пародонтальных карманов при помощи специального градуированного зонда в области каждого зуба в 6 точках (рис.1).

Рис.1. Определение глубины пародонтальных карманов.

Для максимальной объективизации и цифрового выражения уровня гигиены полости рта и степени воспаления тканей пародонта применяли стандартные методики определения индексов Силнесса - Лоэ и Мюллеманна, а для определения степени подвижности зубов индекс Миллера в модификации Флезара.

Для определения налета в придесневой области использовали индекс Силнесса – Лоэ (Silness, Loe, 1962). В область исследования были включены «зубы Рамфьорда»: 16, 21, 24, 36, 41, 44 (щечные поверхности зубов верхней челюсти и язычные нижней челюсти). Зондом проводили вокруг шейки зуба, слегка погружая в десневую бороздку или пародонтальный карман (рис.2).

При оценке использовали следующую шкалу:

0 – на кончике зонда налёта нет;

1 –на зонде небольшое количество налёта;

2 – тонкий слой налета около шейки зуба, а его количество на зонде значительное;

3 – визуально определяли значительное количество налёта.

Для расчета значения индекса сумму показателей делили на количество обследованных зубов.

Индекс Мюллемана (Mhlemann, 1971) в модификации Коуэлл (Cowell I., 1975) использовали для оценки кровоточивости. Для этого кончиком пуговчатого зонда проводили вдоль стенки десневой бороздки или пародонтального кармана (рис.3).

Интенсивность кровоточивости оценивали по следующей шкале:

0 – после проведённой пробы кровоточивость отсутствовала;

1 – кровоточивость появлялась не ранее, чем через 30 секунд;

2 – кровоточивость возникала сразу или ранее 30 секунд;

3 – кровоточивость возникала при приёме пищи или чистке зубов (со слов пациента).

Значение индекса получали при делении суммы показателей на количество обследованных зубов.

Степень поражения фуркаций в вертикальном направлении определяли по индексу Тарноу – Флетчер (Tarnow О., Fletcher P., 1984) (рис.4):

I - убыль кости в фуркации от 1 до 3 мм;

III - убыль кости 7 мм и более.

2.3. Рентгенологические методы исследования С целью уточнения диагноза и для оценки состояния костного субстрата в качестве дополнительного метода использовали цифровую ортопантомограмму (рис5).

При анализе рентгенограмм внимание уделяли наличию костных карманов, степени деструктивных изменений, состоянию зоны межзубных перегородок, а также анатомическим особенностям строения корней моляров. Описанное в литературе явление дивергенции многокорневых зубов у пациентов с агрессивным пародонтитом является одним из отличительных признаков данного заболевания.

Съемку проводили на аппарате Orthophos XG 5 («Sirona», Германия) в отделении рентгенологии ФГБУ «ЦНИИС и ЧЛХ» Минздрава РФ (рис.6). По данным фирмы производителя цифровой рентгеновский аппарат предназначен для панорамной томографической съемки всей челюстной зоны, височно-нижнечелюстных суставов и околоносовых пазух, имеет режимов для цифровой панорамной съемки.

Все полученные в ходе обследования пациентов данные были отражены как в стандартной медицинской документации, так и в специально разработанной для этого исследования анкете.

2.4. Молекулярно–генетические методы исследования 2.4.1. Методика забора биоматериала Молекулярно-генетические исследования проводились на базе ФГБУН Института общей генетики имени Н. И. Вавилова РАН. В качестве биоматериала для проведения молекулярно–генетических исследований использовали слюну.

Все пациенты заранее были ознакомлены с условиями сдачи биоматериала. За 30 минут до процедуры сдачи слюны пациентам необходимо было воздержаться от чистки зубов, приема пищи и каких-либо жидкостей. Сбор биоматериала осуществлялся в стоматологическом кабинете непосредственно самими пациентами в специальные пробирки в количестве 1 мл (рис.7).

Каждой пробирке присваивали шифр, номер которого дублировался на индивудуальной анкете пациента. Таким образом, весь биоматериал (слюна) в дальнейшем поступал в лабораторию в обезличенном виде. По окончании процедуры пробирка помещалась для хранения в морозильную камеру с температурой минус 2С.

Транспортировка биоматериала в лабораторию осуществлялась в специальных термоконтейнерах при температуре 4°С.

2.4.2. Экстракция нуклеиновых кислот Экстракцию ДНК из биологического материала проводили с помощью комплектов «Проба–ГС» (ООО «НПО ДНК–Технология», Россия) согласно прилагаемой инструкции. Метод основан на сорбции ДНК на носителе, отмывке примесей и последующей элюции нуклеиновых кислот с сорбента.

За счет лизиса клеток сильными хаотропными агентами, «Проба–ГС»

примерно с равной эффективностью разрушает клетки с различным типом клеточной стенки (грамположительных, грамотрицательных бактерий, грибов). Также «Проба–ГС» подходит и для экстракции геномной ДНК эукариот (использованной в исследовании в качестве нормировочного показателя).

2.4.3. Генотипирование образцов геномной ДНК использовался принцип «примыкающих зондов» (kissing probes) (рис. 8).

Рис. 8. Принцип «примыкающих зондов» для идентификации момнонуклеотидных замен в заранее синтезированном продукте ПЦР (далее «матрица»). Комплементарно присоединившиеся к матрице зонды содержат гаситель (черный цвет зонда) и флуорофор (красный – зонд частично комплементарный матрице, и синий – зонд полностью комплементарный матрице). А. Состояние зондов при температуре отжига (исходный момент снятия кривой плавления): сигнал флуоресценции отсутствует, так как гаситель примыкает к флуорофорам обоих зондов. Б. Состояние зондов при плавлении дуплексов:

частично комплементраный геномной ДНК зонд (красный) отделяется от гасителя раньше, чем полностью комплементарный (синий). В результате флуоресценция «красного» зонда проявляется при более низкой температуре, чем «синего».

Принцип основан на анализе кривых зависимости интенсивности флуоресценции от температуры плавления при использовании аллель– специфичных зондов, меченных соответственно флуорофорами и гасителями. Для мечения флуорофором использовали два зонда, активный концевой нуклеотид каждого из которых соответствовал одному из двух возможных аллельных вариантов геномной ДНК человека. Зонд, меченный гасителем, соответствовал инвариантной последовательности, примыкающей к полиморфной позиции.

Для установления аллельного состояния полиморфных позиций в пределах отобранных для анализа генов были использованы 23 набора олигонуклеотидов. Из них 18 были использованы в практике стоматологии впервые, а 5 были с некоторыми модификациями заимствованы из докторской диссертации О.А. Зориной (2011).

2.4.4. Методика проведения ПЦР «в реальном времени»

Реакцию ПЦР и оценку результатов реакции осуществляли с помощью в амплификатора ДТ-96 (ООО «НПО ДНК–Технология», Россия), снабженного оптической системой (рис.9). Использовались следующие параметры программы для ПЦР: 94C – 10 c, 64C – 20 c, 72C – 10 c, реакция проводилась в 40 циклов. Измерение сигнала флуоресценции в зависимости от температуры проводилось в интервале от 25C до 80C. Для повышения достоверности результатов каждая реакция проводилась в двух повторностях [15].

Рис. 9. Вид амплификатора «ДТ–96» с оптической системой оценки результата.

Статистический анализ результатов осуществляли с помощью пакета WINРЕРI в. 10.7 (для некоммерческого использования распространяется без ограничений). Оценку статистической достоверности различий проводили согласно критерию Пирсона 2 с поправкой Йетса на непрерывность.

Величину корреляции между генотипом и фенотипом (риск развития агрессивного пародонтита) рассчитывали по величине относительного риска.

Параметр OR (отношение шансов) рассчитывался с доверительным интервалом 95%.

представлены в таблице 2.

Немеченные олигонуклеотиды (праймеры) 100 пМ/мкл по 0,14 мкл *Состав буфера для проведения ПЦР 2.5. Методы статистического анализа 2.5.1.

исследования Для статистической обработки данных исследования использовали методы вариационной статистики. Для построения таблиц и диаграмм использовали пакет компьютерных программ Statisticа 8.0 for Windows (Stat Soft, Inc., США) и пакет WinSTAT 2003.1, интегрированный в Excel (Microsoft, США).

При анализе результатов клинического исследования рассчитывали средний показатель доли () или средней величины (х), которые оценивали с помощью их средней ошибки (m). Различия между сравниваемыми показателями выявляли с помощью t-критерия Стьюдента. Сравнение между собой различных распределений проводили с помощью критерия Пирсона или F–критерия Фишера. Различие между двумя сравниваемыми величинами считали достоверным, если вероятность случайного совпадения распределений составляла не менее 95%.

2.5.2. Статистическая обработка результатов молекулярно– генетического исследования Для оценки соответствия распределений генотипов ожидаемым значениям при равновесии Харди-Вайнберга (РХВ) в выборке и сравнение с частотами аллелей и генотипов разных групп проводили с помощью критерия 2 Пирсона. Оценку статистической достоверности различий проводили согласно критерию Пирсона 2 с поправкой Йейтса на непрерывность [16].

Частоту вариантов нуклеотидных последовательностей и аллелей (f) вычисляли по формуле: f = n/2N где n – встречаемость варианта (аллеля), N – объем выборки.

Частоту генотипов (f) вычисляли по формуле: f = n/N где n – встречаемость генотипа, N – объем выборки.

Оценка ассоциации аллелей или генотипов с предрасположенностью к заболеванию проводили по величине отношения шансов (OR) – показателю, отражающему, во сколько раз вероятность оказаться в группе «случай»

(больные) отличается от вероятности оказаться в группе «контроль»

(здоровые) для носителя изучаемого генотипа. Параметр OR рассчитывали с доверительным интервалом 95%. Величина OR=1 означает полное отсутствие корреляции признака с риском развития заболевания; OR> означает наличие положительной ассоциации полиморфизма («фактор риска») и заболевания; OR3 мм), часть из которых (110 человек) имела, а другая (158 человек) не имела сопутствующего повреждения периапикальных тканей. Из крови больных выделяли ДНК, которую генотипировали по 16 полиморфным позициям в генах MMP2, MMP3, MMP9, MMP13, MMP14 и TIMP2 с помощью ПЦР «в реальном времени».

Результаты исследования показали достоверную ассоциацию наличия у пациентов редких аллелей MMP3 позиции rs639752 (р=0,03) и rs (р=0,004) с повышенным риском возникновения кариеса и его осложнений, выражающихся в повреждении периапикальных тканей. Был найден также редкий аллель гена MMP2 (р=0,000004), также вызывавший повышение риска развития осложнений кариозного процесса. Важным выводом из этого наблюдения является значимость генов MMP2 и MMP3 с точки зрения развития болезней ротовой полости. Кроме того, авторами была доказана возможность получения статистически достоверных результатов при использовании технологии ПЦР «в реальном времени», позволяющей анализировать лишь небольшие выборки (несколько более 100 пациентов), компенсируя это возможностью параллельного анализа достаточно большого числа маркерных SNP (16 штук) [95]. Таким образом, в случае кариеса в отличие от пародонтита ген MMP3 представляется более информативным маркером по сравнению с MMP9. Эти данные показывают также высокую степень полиморфности генов стромелизинов достаточную для того, чтобы оказывать влияние на риск развития социально значимых заболеваний.

Однако в нашем исследовании аллельное состояние этого маркера не коррелировало с риском развития агрессивного пародонтита. В совокупности эти наблюдения позволяют считать ген стромелизина MMP3 перспективным кандидатом на роль детерминанты риска развития агрессивного пародонтита, однако не позволяют выстроить в отношении него чёткой медикогенетической модели участия в этом процессе.

исследованиях индивидуальных генетических профилей собраны для онкологических и кардиологических больных. Это обусловлено наибольшей встречаемостью этих патологий. Именно на этих моделях в наибольшей мере практически отработаны методы применения систем для генотипирования.

Поэтому имеет смысл обратить внимание на поведение кандидатных маркеров развития агрессивного пародонтита с точки зрения развития рака. В работе Chaudhary A.K. с соавт. (2010) мононуклеотидный полиморфизм по генетическим риском возникновения рака шейки матки [46]. Авторы этой работы исследовали мутации, затрагивающие промоторные области генов MMP1 (-1607 1G/2G), MMP2 (-1306 C/T), MMP3 (-1171 5A/6A), MMP9 (- C/T) и TIMP2 (-418 G/C or C/C). Было показано, что относительно редкие полиморфизмы в промоторах генов MMP3 и MMP9 повышают риск возникновения этого типа опухолей. Эти полиморфизмы не исследовались в нашей работе, однако нет сомнений, что полиморфизм MMP9 (-1562 C/T) в будущем должна рассматриваться в качестве кандидатного маркера развития агрессивного пародонтита. Подобно позиции rs3918242 в промоторной области гена MMP9, исследованной в нашей работе, редкий аллель Т способен увеличивать уровень продукции MMP9, что непосредственно увеличивает риск запуска деградации пародонта.

полиморфных позиций в генах MMP9 (rs17576) и SIPA1 (rs746429 и rs931127) на риск развития рака шейки матки [42]. Полиморфная позиция MMP9 (rs17576) совпадала с мишенью, выбранной и в нашей работе. В исследовании участвовала 101 пациентка, оперированная на предмет удаления тазового лимфоузла, подвергшегося метастазированию клетками рака шейки матки, и 273 здоровых пациентки. В качестве средства для генотипирования служил ПЦР «в реальном времени». Минорный аллель в метастазирующей формы рака шейки матки - OR 1,5 (р=0,08). Таким образом, редкие полиморфизмы в позиции rs17576 можно считать неблагоприятными для здоровья пациентов в целом и лишенными видимого адаптивного значения для человека.

Анализируя литературные данные, иллюстрирующие биологическую роли точечных замен в генах MMP, прежде всего, желатиназы MMP9, целесообразно обратиться к данным, касающимся её роли в развитии глаукомы. Обращает на себя внимание наличие противоречивых результатов двух различных групп, касающихся наиболее важного маркера, выявленного в нашей работе: MMP9 Q279R (rs17576). В работе Mossbck G. с соавт.

(2010) исследовалась роль полиморфных позиций в генах MMP1, MMP2 и MMP9 с точки зрения развития открытоугольной формы глаукомы (POAG) и синдрома вторичного отслоения (XFG) [100]. Были изучены частоты встречаемости полиморфных позиций в генах MMP1 -1607 1G/2G (rs1799750), MMP2 -1306 C/T (rs243865), MMP2 -1575 G/A (rs243866) и MMP9 Q279R (rs17576), которые часто фигурировали среди факторов риска развития POAG. В исследовании участвовало 322 больных POAG, пациента с XFG и 248 условно здоровых индивида. Для генотипирования применялась ПЦР «в реальном времени». Авторы показали отсутствие значимой корреляции между наличием перечисленных аллелей (MMP1 - 1G/2G, MMP2 -1306 C/T, MMP2 -1575 G/A и MMP9 Q279R) и риском развития POAG и XFG (p>0.05). Напротив, в работе Awadalla M.S. с соавт.

(2011), ставившей цель изучить связь между генетическим полиморфизмом в гене MMP9 и закрытоугольной формой глаукомы (PACG), были получены аргументы в пользу значимости полиморфных позиций rs3918249 и rs [34]. В исследовании участвовало 107 пациентов из Австралии с PACG и целенаправленно анализировали наиболее часто встречающиеся в гене MMP9 полиморфные позиции rs3918249 и rs17576, показавшие значимость с точки зрения риска развития агрессивного пародонтита в нашем исследовании. Было установлено, что гаплотип TACGG намного чаще встречается у здоровых доноров (69%) по сравнению с группой больных PACG (59%) - достоверность соответствует p=0,006. Таким образом, обе полиморфные позиции в гене MMP9 - rs3918249 и rs17576 - оказались значимыми с точки зрения риска развития закрытой формы глаукомы PACG.

В работе Tanner R.M. с соавт. (2011) была исследована роль полиморфных позиций в генах MMP9 и MMP12 с точки зрения чувствительности к препаратам, используемым для профилактики и лечения сердечно-сосудистых патологий: хлорталидону, амлодипину, лизиноприлу и доксазосину [135]. Исследование интересно тем, что в нём участвовала очень крупная выборка больных с гипертонией и первичной коронарной недостаточностью, размером 42418 человека, каждый из которых находился под наблюдением в течение около 5 лет. В ходе исследования часть пациентов перенесли инфаркт, приобрели острую сердечную недостаточность или умерли. Гомозиготное состояние AA в позиции rs2274756 (R668Q) в гене MMP9 обеспечивала большую эффективность действия хлорталидона по сравнению с амплодипином. Мутация rs17576 в гене MMP9 (R279Q), по нашим данным оказавшаяся наиболее значимой с точки зрения риска развития агрессивного пародонтита, не имела выраженного эффекта на фармакокинетику препаратов для лечения сердечно-сосудистой недостаточности. Мутация rs652438 в гене MMP (N122S) обусловливала большую эффективность действия хлорталидона по сравнению с лизиноприлом. Для гомозиготного состояния АА в позиции rs2276109 гена MMP12 (-82A>G) наилучшее сочетание в отношении продолжительности и качества жизни было найдено с препаратом хлорталидон.

В работе Kim J.H. с соавт. (2011) исследовалась роль полиморфизмов в генах мателлопротеиназ MMP7, MMP8 и MMP9 с точки зрения развития агрессивных и метастазирующих форм рака [80]. Частоты встречаемости полиморфных позиций в генах MMP7 (rs11568818), MMP8 (rs11225395) и MMP9 (rs17576 и rs2250889) анализировались у больных, страдающих гастритом и раком желудка, а также метастазами рака желудка в лимфоузлах.

В исследовании участвовало 326 гастритом и 153 больных раком.

Генотипирование проводилось с использованием микрочипов по технологии GoldenGate®. Авторам не удалось выявить влияния перечисленных маркеров на риск развития гастрита и рака желудка. По нашему предположению, неудача исследования связана в первую очередь с объединением в одной выборке больных заболеваниями различной этиологии. Создав и проанализировав раздельные выборки для гистологически неоднородных форм рака и гастрита, эти исследователи имели больше шансов обнаружить корреляции с индивидуальным генетическим профилем по любым маркерам, включая MMP.

В работе Mishra A. с соавт. (2012) исследовалось влияние мутаций в генах MMP2, MMP7 и MMP9 на риск развития дисфункции левого желудочка сердца, приводящей к нарушению его заполнения артериальной кровью [99]. Заболевание вызвано, в первую очередь, нарушением структуры соединительной ткани. Мутации в гене MMP2 (rs2285053 - C-735T), MMP (rs11568818 - A-181G) и MMP9 (rs17576 R279Q; rs2250889 - P574R и rs - R668Q) рассматривались в качестве потенциального фактора риска развития патологии коронарной артерии. В исследовании участвовало пациентов с коронарной недостаточностью и 230 здоровых донора. Анализ полиморфизмов выполнялся методом ПЦР-ПДРФ. Результаты исследования показали существенное влияние относительно редкой мутации R668Q в гене MMP9 на риск развития коронарной недостаточности (OR=3,82, p=0,009).

Исследование было повторено на другой выборке из 200 пациентов, и результаты подтвердились: фактор риска составил OR=3,59 при р=0,033.

Гаплотипы, соответствующие заменам Arg на Pro или Gln в аминокислотной позиции MMP9, также существенно повышали риск возникновения коронарной недостаточности: OR=1,83 при р=0,008.

В работе Micheal S. с соавт. (2013) исследовалось влияние полиморфных позиций в генах MMP1 и MMP9 на риск развития открытоугольной (POAG) и закрытоугольной (PACG) форм глаукомы в Пакистане [98]. В исследовании участвовали 112 больных POAG, 82 больных PACG и 118 здоровых донора. Генотипирование проводилось методом ПЦРПДРФ. Авторы обнаружили существенный вклад позиции rs1799750 (- 1G/2G) в гене MMP1 в генетический риск развития POAG (p=0,001), причём этот риск оказался значимым только для женщин (p0,47). Генотип по гену MMP9 в позиции rs17576 (836A>G) сказывался на риске развития PACG (pC) и MMP9 (-1562C>T) не оказывало влияния на рис развития глаукомы.

В работе Корытина Г.Ф. с соавт. (2012) исследовалось влияние маркеров в генах металлопротеиназ MMP1 (-1607G > GG, rs1799750; -519A > G, rs494379), MMP2 (-735C > T, rs2285053), MMP3 (-1171 5A > 6A, rs35068180), MMP9 (-1562C > T, rs3918242; 2660A > G, rs17576), MMP12 (A > G, rs2276109), дезинтегрина ADAM33 (12418A > G, rs2280091; 13491C > G, rs2787094) и ингибиторов металлопротеиназ TIMP2 (-418G > C, rs8179090), TIMP3 (-1296T > C, rs9619311) на развитие хронической обструктивной болезни лёгких [10]. Авторы проводили генотипирование методом ПЦР-ПДРФ используя материалы выборки из 391 пациентов с ХОБЛ и 514 здоровых лиц. Гомозиготное состояние поли-А тракта 6A/6A в промоторе гена MMP3(-1171 5A > 6A), приводящее к снижению транскрипционной активности, является значимым фактором развития ХОБЛ: фактор риска составляет OR = 2,490 при Padj= 0,003979 и Pcor = 0, при условии выравнивания контрольной и опытной выборки по полу, возрасту и доле курильщиков. Эта мутация благоприятна с точки зрения риска развития опухолей. Можно предполагать, что она положительно скажется и на риске развития агрессивного пародонтита, так как способствует повышению устойчивости коллагена к деградации MMP3.

Гаплотип G/G в позициях 13491C > G и 12418A > G гена дезинтегрина ADAM33 является благоприятным фактором с точки зрения риска возникновения ХОБЛ: фактор риска OR = 0,39 при Padj = 0,0012 и Pcor = 0,006.

Аллельное состояние гена ADAM33 по позиции 12418A > G (Pint= 0,026) и TIMP3 -1296T > C (Pint = 0,044) существенно влияет на риск возникновения ХОБЛ только у активных курильщиков. Гаплотип GG в позиции 13491C > G гена ADAM33 and повышает риск возникновения эмфиземы лёгких: фактор риска OR = 1,74 при Padj = 0,013 и Pcor = 0,117. Аллельное состояние гена MMP9 в позиции (-1562C > T) существенно влияет на тяжесть течения ХОБЛ согласно аддитивной модели (OR=1,883, Padj = 0,028, Pcor = 0,252). Таким образом было показано, что полиморфизм по генам MMP-3, MMP-9, ADAM33 и TIMP3 является существенным генетическим фактором развития ХОБЛ.

Анализируя биологическое значение мутации С/Т в позиции rs в промоторной области гена MMP9, можно сделать вывод о ее однозначно отрицательном влиянии на здоровье человека. Об этом говорят данные работы Корытиной Г.Ф. с соавт. (2012) о том, что, согласно аддитивной модели, аллельное состояние локуса rs3918242 в MMP9 (1562C>T) серьезно влияет на тяжесть течения эмфиземы легких (OR = 1,883, Padj = 0,028, Pcor = 0,252). В работе Inoue H. с соавт. (2012) установлено, что редкий гаплотип T по этой же позиции серьезно повышает риск возникновения астмы у детей в результате сенсибилизации пыльцой хвойных и фруктовых дереьвев (Pcor=0.0012, Pcor=0,0059 and Pcor=0,0041) [75].

В работе Inoue H. с соавт. ( 2012) исследовалось влияние аллельного состояния гена MMP9 на возникновение аллергозов: аллергического ринита и астмы [75]. Исследованию подверглись 670 школьников в Японии, которые подвергались генотипированию по позиции (-1590C/T: rs3918242) в промоторе MMP9 и трём точечным полиморфизмам в кодирующей области гена R297Q - rs17576, P574R - rs2250889 и R668Q - rs17577. Одновременно в их крови определяли уровень IgE к белкам пыльцы. Статус болезни дополняли анкетными данными. Далее проверялась гипотеза о наличии корреляции между аллельным состоянием SNP в гене MMP9 и уровнем специфических IgE. Мутация в промоторной области -1590C/T показала существенную корреляцию с риском возникновения поллиноза в ответ на сенсибилизацию пыльцой хвойных (Pcor = 0,039). Мутация R668Q оказалась генетически сцеплена с -1590C/T, таким образом, она также оказывала существенное влияние на риск возникновения поллиноза (Pcor=0,023) и средний уровень антител класса IgE (Pcor = 0,022). Гаплотип по позициям T и 668Q в равной мере влиял на склонность детей к сенсибилизации пыльцой хвойных и плодовых деревьев (Pcor =0,0012 и Pcor =0,0041). Мутации R297Q и P574R также в определенной мере влияли на риск возникновения аллергозов. По сравнению с протеазой MMP9 дикого типа (279R-574P-668R) мутантная форма (279R-574P-668Q), обладающая сниженной активностью в отношении коллагена, несколько слабее индуцировала развитие поллиноза.

Однако другая мутантная разновидность MMP9 со сниженной основной активностью - 279Q-574R-668R - никак не сказывалась на риске возникновения поллиноза по сравнению с MMP дикого типа. Промоторная мутация -1590T в максимальной мере сказывалась на уровне IgE, превосходя по значимости мутацию в кодирующей области R668Q. Таким образом, ген MMP9, несомненно, является важной областью генома, определяющей склонность японских детей к аллергизации.

В работе Sakowicz A. с соавт. (2012 ) исследовалось влияние гена MMP9 на риск возникновения инфаркта миокарда. Как и в работе (Корытина Г.Ф. с соавт., 2012), внимание авторов привлек поли-А тракт 6A/6A в промоторе гена MMP3(-1171 5A > 6A), приводящий к снижению транскрипционной активности [122]. Исследовалось также 16 других SNP в 15 генах-кандидатах, потенциально влияющих на риск возникновения инфаркта у пациентов в возрасте свыше 45 лет. В исследовании участвовал 271 пациент, перенёсший инфаркт миокарда, и 141 условно здоровое лицо.

Генотипирование проводилось методом ПЦР-ПДРФ. Полиморфизм Leu125Val в гене PECAM1 и A1/A2 в факторе свёртывания крови VII существенно влияли на риск возникновения инфаркта, а ещё две замены C677T в гене MTHFR и 5A/6A в гене MMP3 вызывали рисок стеноза коронарных сосудов (> 75%).

В работе Hu C. с соавт. (2013) исследовалось влияние аллельного состоянии генов металлопротеиназ MMP1, MMP2, MMP3 и MMP9 на риск возникновения рака лёгких [70]. Ранее описывалась корреляция между аллельным состоянием позиций MMP1-1607 1G/2G, MMP2-735 C/T, MMP2 (C/T), MMP3 (-1171 5A/6A) и MMP9(-1562 C/T) и риском возникновения рака лёгких. Однако эти данные оставались сомнительными из-за их большой зависимости от методики подбора пациентов в контрольную группу.