1

Государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

«Курский государственный медицинский университет»

Министерства здравоохранения Российской Федерации

На правах рукописи

Раджкумар Денсинг Самуэл Радж

ФАРМАКОТЕРАПИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ОСТЕОПОРОЗА

И НАРУШЕНИЙ КОНСОЛИДАЦИИ ПЕРЕЛОМОВ НА ЕГО ФОНЕ

L-АРГИНИНОМ И ЕГО КОМБИНАЦИЯМИ С ЭНАЛАПРИЛОМ

И ЛОЗАРТАНОМ

14.03.06 – фармакология, клиническая фармакология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научные руководители:

Покровский М.В., доктор медицинских наук, профессор Файтельсон А.В., доктор медицинских наук Курск –

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Роль остеопоротических нарушений в процессах регенерации и репарации костной ткани

1.2 Влияние микроциркуляции и сосудистого эндотелия на ремоделирование и репаративную регенерацию костной ткани

1.3 Фармакотерапия нарушений функционирования сосудистого эндотелия L-аргинином, эналаприлом и лозартаном

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Моделирование экспериментального остеопороза

2.2 Моделирование закрытых остеопоротических переломов бедренных костей и их остеосинтез

2.3 Измерение уровня микроциркуляции в кости, проведение функциональных сосудистых тестов

2.4 Гистоморфометрическая оценка развития экспериментального остеопороза и эффективности его коррекции

2.5 Обоснование доз препаратов и дизайн исследования

2.6 Статистическая обработка первичных данных исследования

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Изучение развития экспериментального остеопороза с использованием результатов измерения уровня костной микроциркуляции, функциональных сосудистых проб и гистоморфометрического исследования

3.2 Изучение остеопротективного действия препарата Кальций-Д3 Никомед при экспериментальном остеопорозе

3.3 Изучение остеопротективного действия L-аргинина при экспериментальном остеопорозе

3.4 Изучение остеопротективного действия L-аргинина в комбинации с эналаприлом при экспериментальном остеопорозе

3.5 Изучение остеопротективного действия L-аргинина в комбинации с лозартаном при экспериментальном остеопорозе

3.6 Изучение влияния препарата Кальций-Д3 Никомед на репаративную регенерацию при экспериментальных остеопоротических переломах ........... 3.7 Изучение влияния препарата L-аргинин на репаративную регенерацию при экспериментальных остеопоротических переломах

3.8 Изучение влияния L-аргинина в комбинации с эналаприлом на репаративную регенерацию при экспериментальных остеопоротических переломах

3.9 Изучение влияния L-аргинина в комбинации с лозартаном на репаративную регенерацию при экспериментальных остеопоротических переломах

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования: Всемирная организация здравоохранения определяет остеопороз как заболевание скелета, (ВОЗ) «системное характеризующееся низкой плотностью костной ткани и нарушением ее микроархитектуры», что приводит к увеличению хрупкости костей и риску возникновения переломов [1, 6, 64, 128, 143]. К модифицируемым факторам развития остеопоротических нарушений относят низкое содержание кальция и витамина D, сидячий образ жизни, курение, чрезмерное потребление алкоголя [22, 106, 142, 152], длительный прием глюкокортикоидов, ревматический артрит [3,54, 60, 64, 67], к немодифицируемым факторам можно отнести преклонный возраст, генетическую предрасположенность, снижение веса и менопаузу [39, 74, 80, 141].

По данным Национального фонда остеопороза (NOF), 10 миллионов человек в США страдают остеопорозом, 80% из них – женщины. Переломы являются одной из основных причин гиподинамии у пожилых женщин, что значительно снижает качество их жизни [40, 82, 85, 163]. В Соединенных Штатах около 40% женщин в возрасте старше 50 лет страдают от переломов бедер, позвонков или костей запястья, причиной этому является остеопороз. Годовая стоимость лечения переломов в США к 2015 году прогнозируется на уровне более 20 млрд. долларов [99].

Отечественные и зарубежные травматологи-ортопеды утверждают, что смертность при характерном для остеопороза осложнении – переломе шейки бедра – в течение первых 6 месяцев после перелома достигает 30% [40, 85, 90, 103, 163].

С каждым годом растет число проводимых оперативных вмешательств по поводу переломов костей с применением разнообразных имплантатов, включая использование эндопротезов крупных суставов. По имеющимся данным, на каждую пятую операцию первичного эндопротезирования приходится одно реэндопротезирование, что чаще всего связано с развитием асептической нестабильности на фоне остеопоротических нарушений [39, 47, 90, 107, 197].

Как известно, пусковой механизм для манифестации остеопороза – это нарушение равновесия между двумя главными процессами ремоделирования костной ткани: резорбцией и остеогенезом [22, 60, 64]. Существенным звеном в патогенезе развития остеопоротических нарушений, в частности связанных с длительной иммобилизацией, является нарушение трофики кости, приводящее к уменьшению активности и количества остеобластов, а также к активации остеокластов [97, 102, 129, 150, 178].

Кровоснабжение кости играет значительную роль в процессах как костного ремоделирования [20, 104], так и репарации повреждений костной ткани [22, 97, 102, 154, 178].

эндотелиоцитов и не имеют мышечного и соединительнотканого слоев, следовательно, именно эндотелий опосредует гуморальную регуляцию обмена между остеоцитами и кровью [10, 19, 150, 182]. Следовательно, причиной нарушения кровоснабжения костной ткани может быть дисфункция эндотелия сосудов [25, 43, 73], которая таким образом может приводить к нарушениям образования кости и репаративной регенерации, вызывая остеопороз.

В свою очередь, современная патогенетическая терапия остеопороза включает препараты, как замедляющие костную резорбцию (эстрогены, кальцитонин) [9, 13, 59, 60, 116] и стимулирующие костеобразование (фториды, анаболические стероиды), так и препараты многопланового действия (например, витамин D) [69, 77, 148, 149, 190]. Это разграничение является условным, так как все препараты, так или иначе, воздействуют на оба процесса ремоделирования.

Однако неуклонный рост частоты остеопороза и остеопоротических переломов демонстрирует, что надежных способов терапии и профилактики этого заболевания не существует.

В то же время современные фармакологические исследования показали положительное остеопротективное действие препаратов, корригирующих дисфункцию эндотелия. К ним, в первую очередь, относятся ингибитор ангиотензинпревращающего фермента эналаприл, блокатор ангиотензиновых рецепторов лозартан и фитоалексин резвератрол [13, 20, 69, 138].

Это указывает на актуальность дальнейшего поиска фармакологических агентов для воздействия на процессы костного ремоделирования, а также обосновывает избранное нами направление исследования.

Цель исследования: сравнительное изучение остеопротективного действия L-аргинина фармакологической коррекции экспериментального остеопороза и нарушений консолидации переломов на его фоне.

Задачи исследования:

1. Изучить антиостеопоротическое действие L-аргинина на модели экспериментального остеопороза с использованием результатов изучения морфометрического исследования в сравнении с препаратом Кальций-Д Никомед.

2. Изучить антиостеопоротическое действие комбинации L-аргинина с эналаприлом при экспериментальном остеопорозе с использованием результатов изучения кровоснабжения костной ткани, функциональных сосудистых тестов и L-аргинином и препаратом Кальций-Д3 Никомед.

3. Изучить антиостеопоротическое действие комбинации L-аргинина с лозартаном при экспериментальном остеопорозе с использованием результатов изучения кровоснабжения костной ткани, функциональных сосудистых тестов и L-аргинином и препаратом Кальций-Д3 Никомед.

4. Изучить влияние L-аргинина на репаративную регенерацию кости при экспериментальных остеопоротических переломах проксимального отдела бедра у крыс в сравнении с препаратом Кальций-Д3 Никомед.

репаративную регенерацию переломов проксимального отдела бедра на фоне остеопороза в сравнении с монотерапией L-аргинином и препаратом Кальций-Д Никомед.

6. Изучить влияние комбинации L-аргинина с лозартаном на репаративную регенерацию переломов проксимального отдела бедра на фоне остеопороза в сравнении с монотерапией L-аргинином и препаратом Кальций-Д3 Никомед.

Научная новизна исследования: впервые показано, что через 12 недель после операции овариэктомии развивается экспериментальный остеопороз, характеризующийся признаками дисфункции сосудистого эндотелия – повышением коэффициента эндотелиальной дисфункции, значительным снижением уровня микроциркуляции в проксимальном отделе бедра и отрицательной динамикой морфометрических показателей.

В работе впервые продемонстрировано, что L-аргинин в дозе 200 мг/кг в качестве монотерапии и его комбинации с эналаприлом в дозе 0,5 мг/кг и лозартаном в дозе 6 мг/кг, обладая эндотелиопротективной активностью, предотвращали локальное ухудшение микроциркуляции в кости проксимального отдела бедра. Таким образом, L-аргинин и его комбинации с эналаприлом и лозартаном способствовали замедлению истончения трабекул в губчатой кости и предотвращению возникновения микроповреждений трабекул, то есть обладали остеопротективным действием.

Настоящее исследование впервые показало, что в группах животных, получавших Кальций-Д3 Никомед в дозе 85,7 мг/кг в течение четырех недель по прошествии восьми недель после произведенной билатеральной овариэктомии, не наблюдалось достоверного влияния препарата на функционирование эндотелия сосудов костной ткани и состояние регионарной микроциркуляции в кости проксимального отдела бедра экспериментальных животных. Кроме того, Кальций-Д3 Никомед не оказывал остеопротективного воздействия при экспериментальном остеопорозе, что выражалось в отсутствии статистически значимого влияния препарата на среднюю ширину костных трабекул в проксимальном отделе бедренной кости.

В работе впервые показано, что L-аргинин и его комбинации с эналаприлом и лозартаном, вводимые в течение четырех недель после воспроизведения и остеосинтеза экспериментальных переломов на фоне остеопороза, повышали показатели микроциркуляции в формирующейся костной мозоли проксимального отдела бедра у крыс не только по сравнению с животными с остеопоротическими переломами бедра, а также животными, получавшими Кальций-Д3 Никомед, но также и по сравнению с контрольными животными. Тем самым L-аргинин и его комбинации с эналаприлом и лозартаном статистически значимо улучшали частоту консолидации экспериментальных переломов проксимального отдела бедра на фоне гипоэстрогенного остеопороза.

Научная новизна исследования подтверждается подачей двух заявлений на № 2013143107).

исследовании обоснована эффективность L-аргинина и его комбинаций с эналаприлом и лозартаном для коррекции остеопоротических изменений костей скелета и фармакотерапии остеопоротических переломов.

комбинаций с эналаприлом и лозартаном позволяет нормализовать изменения соотношений сосудистых реакций эндотелийзависимой и эндотелийнезависимой вазодилатации.

L-аргинин в качестве монотерапии и в сочетании с эналаприлом и лозартаном способствует увеличению кровоснабжения костной ткани при экспериментальном остеопорозе, замедлению отрицательной динамики консолидации переломов на фоне экспериментального остеопороза.

Результаты работы позволяют рекомендовать проведение клинических испытаний L-аргинина и его комбинаций с эналаприлом и лозартаном при распространенном остеопорозе и переломах на его фоне.

Внедрение результатов исследования:

диссертационной работы запланировано проведение целенаправленных клинических исследований L-аргинина и его комбинаций с эналаприлом и лозартаном в фармакологической коррекции остеопоротических нарушений при переломах костей.

Федерального государственного автономного образовательного учреждения национальный исследовательский университет».

Связь диссертационного исследования с темами научноисследовательских работ организации: работа выполнена по инициативному плану, включена в программу «Разработка и совершенствование методов лечения и профилактики остеопоротических нарушений с целью улучшения качества и увеличения продолжительности жизни пациентов» на 2010-2014 гг., номер государственной регистрации темы – 01201153218.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. L-аргинин в дозе 200 мг/кг при экспериментальном остеопорозе оказывает эндотелиопротективное действие, предотвращая повышение коэффициента эндотелиальной дисфункции; позволяет избежать снижения локального кровоснабжения бедренной кости; обладает статистически значимым остеопротективным действием, проявляющимся замедлением уменьшения микроповреждений.

2. Комбинированное применение L-аргинина в дозе 200 мг/кг с эналаприлом в дозе 0,5 мг/кг и лозартаном в дозе 6 мг/кг при экспериментальном остеопорозе L-аргинином кровоснабжения костной ткани бедренной кости; обладает статистически значимым остеопротективным действием, проявляющимся замедлением уменьшения ширины костных трабекул и предотвращением возникновения их микроповреждений.

3. L-аргинин в дозе 200 мг/кг статистически значимо повышает уровень микроциркуляции в зоне экспериментального остеопоротического перелома проксимального отдела бедра по сравнению с крысами с экспериментальными остеопоротическими переломами, что положительно сказывается на процессах репарации костных повреждений. L-аргинин увеличивает число позитивных результатов консолидации переломов на фоне экспериментального остеопороза у крыс.

4. Комбинированная терапия L-аргинином в дозе 200 мг/кг с эналаприлом в дозе 0,5 мг/кг и лозартаном в дозе 6 мг/кг позволяет предотвратить снижение уровня микроциркуляции в межотломковой области перелома проксимального отдела бедра у крыс, что положительно сказывается на результатах регенерации костни. Исследуемые комбинации препаратов увеличивают число позитивных результатов сращения экспериментальных переломов на фоне остеопороза у животных.

Степень достоверности и апробация результатов:

полученных в ходе проведения исследования результатов обеспечивается выбором современных лабораторных и инструментальных методов получения экспериментальной информации, адекватных методов статистической обработки первичных научных данных.

Материалы диссертации были доложены на 76-й Всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Молодежная наука и современность» (г. Курск, 2011); на IV съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (Республика Татарстан, г. Казань, 2012); на X научно-практической конференции студентов, интернов, ординаторов, аспирантов, молодых ученых, посвященной 10-летию Института последипломного медицинского образования, «Актуальные вопросы современной клинической и экспериментальной медицины» (г. Белгород, 2012);

на IV Всероссийском научно-практическом семинаре молодых ученых с Направленный поиск новых лекарственных средств» (г. Волгоград, 2012); на VII Международной научной конференции молодых ученых-медиков (г. Курск, 2013);

на заседаниях Курского отделения ассоциации травматологов-ортопедов Российской Федерации (Курск, 2011, 2012, 2013).

Апробация диссертации проведена на совместном заседании кафедр фармакологии; клинической фармакологии; травматологии, ортопедии и военнополевой хирургии; гистологии, эмбриологии, цитологии; оперативной хирургии и топографической анатомии им. профессора А.Д. Мясникова; хирургических болезней №2; НИИ Экологической медицины Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Курский здравоохранения Российской Федерации.

Публикации:

опубликовано 16 работ, в том числе три из них – в изданиях, рекомендованных ВАК для опубликования результатов диссертационных исследований на соискание ученой степени кандидата медицинских наук, две – в иностранных изданиях. Поданы два заявления на выдачу патентов РФ на изобретения.

Личный вклад автора: автору принадлежит ведущая роль в составлении плана и дизайна исследования, в постановке цели и поиске путей ее достижения.

Им проведен подробный анализ отечественных и зарубежных источников литературы по теме диссертации, выполнялись экспериментальные исследования на 240 самках белых крыс линии Вистар с разделением их на группы: основных, сравнения и контрольных; выбраны критерии рандомизации. Диссертантом самостоятельно производился анализ и обобщение полученных результатов, составление графиков, таблиц и диаграмм, написание диссертации, сопоставление с литературными данными. В работах, выполненных в соавторстве, использованы результаты исследования с долей личного участия 70-90%.

Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования.

Объем и структура диссертации: работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования развития и фармакологической коррекции экспериментального остеопороза и экспериментальных остеопоротических переломов и их обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Диссертационная работа изложена на 115 страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы и рисунков. Библиографический список включает 199 источников, в том числе – на иностранном языке.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Роль остеопоротических нарушений в процессах регенерации У людей существуют три наиболее распространенные локализации возникновения остеопоротических переломов – это позвонки, кости запястья и проксимальный отдела бедра [128]. По данным некоторых исследований, остеопоротические переломы позвоночника являются наиболее распространенными – до 27% случаев, переломы дистального метаэпифиза лучевой кости – до 22% и повреждения проксимального метафиза бедра – до 15% случаев, оставшиеся 36% приходятся на другие локализации [64, 99].

Переломы проксимального отдела бедренной кости чаще приводят к инвалидизации, потере качества жизни и ранней смерти, чем в любой другой локализации перелома на фоне остеопоротических нарушений [40, 82, 85, 163].

Сращение перелома – физиологический процесс, необходимый для выживания организма. Несращение перелома приводит к тяжелому нарушению функции опорно-двигательного аппарата. Возникающие после переломов деформации сегментов конечностей из-за неправильной адаптации костных фрагментов чаще всего сопровождаются выраженным ограничением функции конечности. Консолидация перелома призвана полностью восстановить в сломанной кости прежнюю прочность, как до перелома, и является достаточно продолжительным по времени биологическим процессом. Короткая фаза эндохондрального образования наружной костной мозоли сменяется длительной фазой перестройки – ремоделирования костной ткани. Во время фазы образования эндохондральной мозоли существует опасность несращения костных отломков и возникновения повторного перелома. Остеопоротические нарушения оказывают отрицательное действие на физиологический процесс консолидации перелома [87, 88, 89, 126, 127].

Репарация костной ткани имеет важное биологическое значение, поскольку направлена на полное восстановление пластинчатых костных структур до исходного состояния с целью возвращения кости первоначальной прочности [125, 126, 127, 148]. Переломы костей обычно определяют как полное или частичное нарушение целостности костных структур в результате травмирующего воздействия. Однако часто в трабекулярной костной ткани у пациентов с остеопорозом могут спонтанно возникать микропереломы, которые самостоятельно восстанавливаются путем образования микромозолей [127].

Сращение поврежденной костной ткани является трехступенчатым процессом [148], состоящим из трех последовательных стадий. 1-я стадия – фаза воспаления – начинается сразу же после травмы. Она характеризуется активацией общих механизмов заживления раны, как обычно происходит после повреждения мягких тканей: кровотечение, появление гематомы с привлечением макрофагов и других воспалительных клеток и постепенное образование кровяного сгустка [129]. Некоторые цитокины и факторы роста, такие как трансформирующий фактор роста (ТФР-) и сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), активируют привлечение дополнительных воспалительных клеток и проникновение мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток из периоста и костного мозга. В течение этой стадии формируется простейшая первичная фиброзная спайка [81, 98, 118, 121, 123], которая несколько ограничивает подвижность костных отломков в зоне перелома [129, 130]. Данная фаза протекает достаточно быстро и завершается в течение недели после перелома [136, 183, 192, 195].

2-я стадия – фаза восстановления или репарации – начинается обычно после первой через 5-7 дней и продолжается несколько недель. Постепенно формируется твердая мозоль, которая обычно похожа на большое наружное кольцо вокруг места перелома. Микроподвижность костных фрагментов в зоне перелома активирует созревание межотломковой мозоли и ее трансформацию из хрящевой в более твердую костную ткань [125, 126, 127]. В этой фазе из поврежденной области удаляются нежизнеспособные ткани, и формируется новая кость на месте временного хряща при участии дифференцированных остеобластов, сформировавшихся непосредственно из клеток-предшественников.

В самой зоне перелома и на ее периферии в избытке образуется хрящевая ткань, примерно так же, как при эндохондральной оссификации во время роста кости [131, 137, 139]. Усиление выработки ряда факторов роста, таких как тромбоцитарный фактор роста 2 (ТФР-2), тромбоцитарный фактор роста (ТФР), морфогенетических белков, таких как КМБ-2, -4, -5 и -6, активирует пролиферацию и дифференцировку хондроцитов. В результате этого концы костных фрагментов соединяются с помощью репаративной наружной периостальной мозоли, состоящей из ретикулофиброзной костной ткани, и это обеспечивает некоторую механическую фиксацию в месте перелома [159, 177, 185, 186, 196]. Первые две стадии консолидации перелома позволяют после начала сращения перелома частично восстановить нормальное функционирование кости.

Стадия 3 – фаза перестройки или ремоделирования – является процессом непрерывной и постепенной адаптации сломанной кости к обычным нагрузкам в повседневной жизни. Полное восстановление биомеханической целостности достигается в течение длительного периода времени и связано с активацией хорошо известного механизма костного ремоделирования [87, 88, 89]. На этой стадии грубоволокнистая костная ткань в межотломковой мозоли постепенно заменяется на тонковолокнистую ткань или пластинчатую кость с перестройкой трабекулярного рисунка в зоне перелома [125, 126, 127, 148].

Переломы у больных с остеопоротическими изменениями чаще, чем в популяции в целом, сопровождаются осложнениями и нетрудоспособностью в периоде реабилитации [88, 89]. Экспериментальные исследования влияния остеопороза на консолидацию переломов, проведенные на крысах после овариэктомии, выявили замедленную консолидацию переломов и ухудшение механической прочности кости после завершения процесса консолидации, также в некоторых случаях наблюдалось несращение или неполное сращение экспериментальных переломов [13, 20, 158]. Имеются клинические наблюдения, констатирующие, что остеопороз может замедлить консолидацию перелома у человека [88, 89]. Это можно объяснить тем, что у пациентов с остеопорозом рост и дифференцировка остеобластов обычно подавлены. Поэтому у больных сращение костно-травматических повреждений занимает больше времени [163].

Данное обстоятельство подтверждается исследованиями на животной модели остеопороза, индуцированного кортикостероидами [198].

Восстановление костной ткани после перелома является результатом тесного клеточного взаимодействия остеобластов и остеокластов, которые берут начало от предшественников различных клеточных линий, а именно: остеобласты – из мезенхимальных стволовых клеток, остеокласты – из макрофагальномоноцитарных клеток крови. Образование кости превышает резорбцию в течение роста скелета, и наоборот, резорбция превалирует в течение последующего периода жизни человека. Усилению остеокластной активности способствуют нарушения в системе, образуемой остеопротегерином (OPG), поверхностными рецепторами остеокластов, получившими название RANK (Receptor Activator of NF-kB), и их лигандами (RANKL, синоним OPGL), представляющими собой поверхностные рецепторы остеобластов. Известно, что механические и биологические факторы, вовлеченные в процесс заживления кости, подвержены влиянию остеопоротической патологии, примером тому является нарушение костного метаболизма на фоне эстрогендефицитных состояний в организме [80, 88, 152].

OPG-остеопротегерин, гликопротеин, обладает сильной ингибиторной активностью остеокластогенеза, т.е. является мощным ингибитором костной резорбции. OPG действует для RANKL как ложный рецептор, блокирует взаимодействие с RANK и таким образом ингибирует формирование зрелых остеокластов, тем самым нарушая процесс остеокластогенеза и резорбцию костной ткани [99]. Баланс между RANKL и OPG фактически определяет количество резорбированной кости. Исследования показали, что отсутствие гена OPG у мышей приводило к развитию раннего остеопороза, переломам позвонков у взрослых особей. Мыши умирали от костных аномалий, кальцификации аорты и почечных артерий [6]. Также лиганды и рецепторы (RANKL-RANK-ОРG) участвуют в формировании, дифференцировке и активности ОК и могут быть межклеточное взаимодействие может быть представлено следующим образом:

RANKL – трансмембранный лиганд, экспрессированный на поверхности предшественниках остеокластов кроветворных клетках, индуцирует процесс дифференцировки и созревания остеокластов [80]. При потере активности лиганда RANKL возникает дефект в ранней дифференцировке Т- и В-клеток, которые принимают активное участие в регуляции костного метаболизма, это доказывает необходимость RANKL для развития остеокластов [115]. Следует отметить, что местные тканевые факторы тоже стимулируют остеокластную активность: это фактор некроза опухолей (TNF), фактор простагландинов Е2 (PGE2), эпидермальный фактор роста (EGF) и интерлейкины 1, 3, 6, 11 (IL-1, 3, 6, 11), колониестимулирующий фактор и гранулоцитарно-моноцитарный колониестимулирующий фактор (GMCSF). Также усиление резорбции костной ткани может отмечаться и при угнетении образования факторов, стимулирующих остеобласты, – инсулиноподобного фактора роста (IGF-1 и 2), фактора, ингибирующего лейкемию (LIF), кислотного и основного ростовых факторов фибробластов (FGGS), некоторых костномозговых протеинов (ВМР-2, 4, 7), трансформирующего ростового фактора (TGF), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) [101, 136, 172, 183, 192].

Все вышесказанное подтверждается экспериментальными исследованиями, которые продемонстрировали, что терапия крыс после овариэктомии остеопротегерином полностью предотвращала потерю костной ткани [6], из чего следует, что OPG играет важную роль в механизме антирезорбтивного действия эстрогенов на кость наряду с другими функциями эстрогенов. На модели адъювантного артрита было выявлено, что после введения OPG у крыс в начале болезни происходила блокировка RANKL, которая предотвращала потерю кости и хряща [6].

Ряд клинических наблюдений показал, что после костной травмы возникает остеопения, которая является результатом высокой активности костного метаболизма, сращение перелома сопровождается повышением уровней биохимических маркеров костного метаболизма, особенно маркеров костной резорбции. У женщин в постменопаузальном периоде после полученного перелома наблюдаются более высокие уровни костных маркеров, в частности сывороточной тартрат-резистентной кислой фосфатазы 5b (sTRAP-5b) и остеокальцина в моче. В течение двух лет после травмы сохраняются повышенные концентрации биохимических маркеров синтеза и резорбции кости (сывороточная костная щелочная фосфатаза и сывороточный С-телопептид коллагена – sCTX), выше, чем до перелома [167]. Этот факт может служить объяснением, почему наличие перенесенного перелома в анамнезе является индикатором высокого риска нового перелома [143].

Таким образом, необходимо отметить, что процесс репарации костных повреждений многогранен, регулируется многими системными гормонами, цитокинами, факторами роста; идентифицированы многие локальные факторы костного ремоделирования [77]. Васкуляризация костной мозоли играет важную роль в ее созревании, способствуя постепенному замещению хрящевой мозоли тромбоцитарный фактор роста b [96, 97, 100, 129] усиливают ангиогенез, что благоприятно сказывается на консолидации костно-травматических повреждений.

1.2 Влияние микроциркуляции и сосудистого эндотелия на ремоделирование В последнее время в научной литературе появляется все больше эпидемиологических, экспериментальных и клинических данных, свидетельствующих о взаимосвязи сосудистой патологии и остеопороза [12, 66].

Существует теория, что ухудшение васкуляризации костной ткани может приводить к развитию ряда остеологических заболеваний, таких как остеопороз [103, 176], на фоне которого замедляются процессы регенерации кости при травматических повреждениях [13, 20].

Кровоснабжение костей происходит за счет разветвленных питающих сосудов метафизарных, эпифизарных и периостальных артериальных сетей [105], включающих в себя артериолы, которые, в свою очередь, делятся на анастомозирующую капиллярную сеть и синусоидные сосуды [187]. В костном мозге синусоиды обладают тонкой высокопроницаемой стенкой, состоящей из монослоя эндотелиальных клеток. Эти клетки поддерживаются сосудистой мембраной, периоцитами и ретикулярными клетками [164]. Сами синусоидные сосуды в окружении ретикулярных клеток, продуцируют значительное количество хемокина (SDF-1), требуемого для поддержания сохранности стволовых клеток [154]. Эти микрососуды соединяются с отдельными венулами, следующими параллельно артериолам, возвращаются к перихондральному сплетению [131]. Через сосудистую сеть в костную ткань поступают питательные вещества, необходимые хондроцитам и мезенхимальным клеткам для адекватного течения хондрогенеза и остеогенеза [154, 185, 193].

Травмы костной ткани всегда сопровождаются повреждением сети сосудов, что ведет к прогрессированию гипоксии близлежащих тканей с последующей их гибелью [129]. При нарушении васкуляризации в зоне травматической патологии происходит активация тромботических факторов свертывания крови и формирования гематомы. Продукты распада тканей в области перелома и воспалительная реакция активируют такие факторы, как цитокины и факторы роста, вследствие чего к месту травмы подтягиваются мезенхимальные и остеопрогениторные клетки. Усиление эндостального кровообращения в зоне поврежденной кости дает возможность мезенхимальным клеткам, связанным с растущими капиллярными сосудами, проникать в область перелома со стороны эндоста и костного мозга [176, 193]. При этом в межотломковой области достаточно быстро развивается грануляционная ткань, которая впоследствии замещается фиброзно-хрящевой, тем самым формируется первичная спайка.

Впоследствии начинаются процессы интрамембранозного костеобразования в надкостнице, ведущие к образованию внешней костной мозоли [102], во внутренних слоях фиброзно-хрящевая ткань минерализуется и образуется рыхлая губчатая кость [185], которая стабилизирует костные фрагменты. В этот момент в зоне перелома активируются все процессы ремоделирования, при которых лизис некротизированной кости остеокластами сопровождается ангиогенезом с поэтапной заменой массивной костной мозоли на пластинчатую кость. Конечным результатом этих процессов является восстановление нормального кровоснабжения и уменьшение размера межотломковой костной мозоли [143].

В восстановлении костной ткани участвует большое количество медиаторов [187], которые связаны с эмбриональным и постнатальным развитием кости, играющих значительную роль в регенерации кости. К ним можно отнести BMP-2, BMP-4 [93, 136,196], VEGF [172, 179], bFGF, PDGF [96, 98, 101, 177].

Примером этому могут быть исследования, в которых выявлены признаки остеопрогениторных клетках и предшественниках клеток костного ряда в костной мозоли [191]. В свою очередь, остеокласты продуцируют гепариназу, которая способствует выделению активных форм VEGF из гепарина, что приводит не только к усилению ангиогенеза, но и к активизация остеокластов, тем самым стимулируя ремоделирование костной мозоли во время эндохондральной оссификации [133, 140].

Фактор роста эндотелия сосудов – VEGF – является ключевым протагонистом, участвующим в неоангиогенезе. Данное положение подтверждается исследовательскими работами, в которых была выявлена первостепенная роль ингибирования фактора роста эндотелия сосудов при переломах костей задней конечности у мышей в развитии значительного снижения кровоснабжения в зоне повреждений за счет уменьшения прорастания кровеносных сосудов, благодаря чему ухудшается минерализации межотломковой костной мозоли и нарушается перестройка костных трабекул [172, 192, 195, 196]. Также фактор VEGF и его рецепторы имеют функцию основных регуляторов молекулярных и клеточных взаимодействий, которые формируют зрелую сосудистую сеть в поврежденных тканях [123, 170, 179, 183, 192].

приводящий к усилению роста клеток эндотелия сосудов и их пролиферации.

Благодаря этим свойствам медиатор VEGF значительно влияет на рост [170, 178, 194] и репарацию повреждений костной ткани [115, 118, 191].

Морфологическое строение костных микрососудов имеет существенные отличительные особенности от структуры сосудов остальных тканей организма. У них отсутствуют мышечный и соединительнотканый слои, они имеют только эндотелиальный слой, из этого следует, что именно через сосудистый эндотелий происходит вся гуморальная регуляция обменных процессов. Таким образом, эндотелий, будучи неотъемлемой частью костной ткани, играет важную роль во взаимодействиях между клетками эндотелия и клетками костей, направленных на поддержание целостности костных структур [142].

Эндотелий сосудов состоит из эндотелиальных клеток и представляет собой непрерывную однослойную плоскую структуру мезенхимального происхождения, выстилающую всю кровеносную систему [5, 11, 25], а также и лимфатические сосуды [34, 35, 122, 132], является активной динамической структурой, контролирующей множество важных функций [29, 72, 76, 147]. Сосудистый эндотелий обладает функцией барьера между сосудистой стенкой и кровью, реагирует на воздействие тока крови и на напряжение сосудистой стенки, чувствительной к различным нейрогуморальным факторам, также продуцирует большое количество существенных биологически активных веществ: как вазодилататоров фактор гиперполяризующий эндотелиальный, простациклин), так и вазоконстрикторов (ангиотензин II, свободные радикалы недоокисленных жирных кислот, эндотелин, простагландин F2- и тромбоксан А2), то есть является гигантским паракринным органом человеческого организма [16, 38, 79]. Основная роль эндотелиальных клеток определяется поддержанием васкулярного гомеостаза посредством регуляции равновесия главенствующих прокоагулянтных медиаторов), пролиферации клеток в различных тканях, активацией или замедлением действий ростовых факторов, локального воспаления (производство противо- и провоспалительных факторов). Также через эндотелий сосудов окружающие ткани обеспечиваются гормонами, цитокинами, хемокинами и метаболитами. В случае необходимости сосудистый эндотелий является барьером, ограничивающим движение молекул, а также клеток, и обеспечивает взаимодействие с другими слоями сосудистой стенки. Многие факторы-аттрактанты, которые представлены на поверхности сосудистого эндотелия костей, привлекают из кровеносного русла гематопоэтические клетки в костный мозг, где последние, связываясь с различными агентами, принимают активное участие в процессах регенерации кости.

В ряде экспериментальных исследований было обнаружено влияние эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC) на пролиферацию стромальных клеток костного мозга человека (HBMSC), под воздействием которой происходит дифференциация HBMSC в остеобластах [157]. Из этого было сделано заключение, что эндотелиальные клетки контролируют деление стромальных клеток костного мозга в остеобластах и мобилизуют остеопрогениторные клетки к месту регенерации кости. Благодаря этому механизму предшественники остеобластов способны мигрировать к месту формирования кости из сосудистого русла, затем начинается дифференцирование их в зрелые остеобласты с образованием новой остеоидной ткани [18].

Также существует теория о том, что клетки эндотелия принимают участие в функционировании остеокластов. В область резорбции костной ткани клетки предшественники остеокластов проникают через эндотелий путем трансэндотелиальной миграции, как лейкоциты и моноциты, а эндотелиальные клетки являются регулировщиками данных процессов [170]. Поэтому любые изменения, в структуре капиллярных сосудов могут привести к нарушению тонко сбалансированных последовательных процессов резорбции и костеобразования, что ведет к нарушению восстановления кости и развитию заболеваний костной системы [104, 105, 130, 145, 178]. При альтерации кровоснабжения костной ткани происходит торможение активности остеобластов и усиление деятельности остеопоротических нарушений [60, 66, 178].

Эндотелиальные клетки микрососудов костной ткани обладают и другими метаболизма, таких как цитокины и эстрогены [95, 182]; вырабатывают значительное количество гормонального натрийуретического пептида типа В [134]; усиливают действие хемоаттрактанта – производного стромальных клеток поступление гемопоэтических клеток-предшественников в костную ткань [98].

Также клетки эндотелия стимулируют макрофагальные колониестимулирующие морфогенетические белки (BMP), факторы роста фибробластов, различные простагландины, фактор роста эндотелия сосудов, инсулиноподобный фактор роста-1 и оксид азота [10, 52, 165, 168, 169]. Экспериментально доказано, что остеогенные факторы, такие как BMP-2, стимулируя медиатор VEGF, ингибируют васкуляризацию. При этом вариации потенциала кислорода и его касательного напряжения могут усиливать выраженность экспрессии BMP-2 в эндотелиоцитах сосудов микроциркуляторного русла [34, 96]. В свою очередь, гипоксические явления вместе с VEGF воздействуют на регуляцию BMP-2 в эндотелиоцитах [136]. Этот стресс-кислород-чувствительный механизм является ответной реакцией клеток эндотелия на механическое повреждение кости, включающей множество факторов, которые впоследствии влияют на качество и скорость регенерации костной ткани.

консолидация костно-травматических повреждений и формирование ложных суставов. У этих последствий переломов может большое количество различных причин. В частности, длительный прием противовоспалительных и стероидных препаратов, глюкокортикодов [3], недостаточность витаминов С и D и кальция [9, 54, 74]. Нарушение васкуляризации в зоне перелома тоже является одним из основных факторов замедления сращения или несращения переломов. Это наглядно показано в некоторых исследованиях, где ангиогенные факторы благотворно влияют на восстановление кости [97], а их взаимодействие с остеогенными факторами значительно активирует регенерационную способность костной ткани [97, 144, 196].

Еще одним фактором роста, стимулирующим ангиогенез, является FGF- [81, 91, 93, 113, 139], экспериментально было выявлено, что на ранних стадиях сращения переломов он при введении в организм извне способен усиливать дифференциации остеобластов [113], что в целом позитивно воздействует на заживление костно-травматических повреждений.

Исходя из вышеизложенного, очевидна тесная взаимозависимость между сосудистой сетью, эндотелием сосудов и костной тканью. В условиях гипоксии, вызванной травматическими повреждениями тканей, активируются процессы роста сосудов. Основным событием для нормального течение процессов ангиогенеза является повышение проницаемости эндотелия сосудов. В связи с повышением проницаемости сосудов происходит необходимый выход фибриногена, приводящий к формированию фибринового базиса для дальнейшей миграции клеток эндотелия. Базисным регуляторным механизмом новообразования сосудистой сети является освобождение факторов ангиогенеза из эндотелиоцитов, тучных клеток, макрофагов и других. Эти факторы активизируют эндотелиоциты (главным образом в посткапиллярных венулах), при миграции которых через базальную мембрану формируются ответвления сосудов [75].

кровоснабжения является эндотелиальная дисфункция (ЭД), которая может приводить к спазму сосудов [5, 35, 73] и усиленному тромбообразованию [76, 111, 122, 132], что, в свою очередь, может вызывать нарушение процессов регенерации кости.

вазодилатирующих, антипролиферативных, ангиопротективных факторов с одной стороны и протромботических, вазоконстрикторных, пролиферативных факторов со второй стороны, приводящий к возникновению расстройств васкулярного гомеостаза. Также эндотелиальная дисфункция характеризуется патологией эндотелия в сторону уменьшения вазодилатации, провоспалительного состояния и протромботических свойств. Надо отметить участие эндотелия не только в возникновении и развитии различных патологических состояний, связанных с регуляцией тонуса сосудов, но и участие его в процессах тромбообразования, атерогенеза, обеспечения целостности стенки сосудов.

ориентированы на оптимальное регулирование органного кровотока. NO является основным гуморальным эндотелиальным модулятором вазодилатации, продуцируемым эндотелиоцитами. В нормальном состоянии эндотелий не только контролирует тонус сосудистой стенки посредством высвобождения ряда факторов, способствующих вазодилатации и вазоконстрикции [111, 122, 132], но и регулирует сократимость гладких миоцитов сосудистой стенки, а также модулирует функцию гемостаза и способствует выработке отдельных медиаторов роста сосудов [5, 11, 35, 73, 76].

NO синтезируется эндотелиоцитами из аминокислоты L-аргинина. Данный процесс представляется комплексной окислительной реакцией, катализируемой ферментом NO-синтазой (NOS) [35, 53, 199], который находится в мембранах аппарата Гольджи, состоящего из присоединенного молекулярного кислорода к L-аргинина [84, 117, 155, 180, 188]. Оксид азота вызывает релаксацию гладких миоцитов сосудистой стенки, оказывает влияние на гемокоагуляцию, снижает тромбоцитарную агрегацию и выраженность экспрессии молекул адгезии на поверхности моноцитов и нейтрофилов, предотвращает перестройку структуры эндотелиоцитов, замедляя рост и пролиферацию гладких миоцитов. Оксид азота также присутствует в клетках эндотелия не зависимо от их локализации, в латентном состоянии эндотелиоциты постоянно вырабатывают NO, нормализуя антидиуретический гормон, ацетилхолин, гистамин, брадикинин, тромбин, АТФ, АДФ, а также некоторые факторы и явления (например, движение крови по сосудам и прочие), способны стимулировать выработку NO.

Известно, что оксид азота регулирует активность большого количества разнообразных биологически активных веществ, вырабатываемых эндотелием, также он выполняет функции межнейронной передачи, принимает участие в мнемонических механизмах, обладает бактерицидными свойствами.

Соединение оксида азота является нестабильным химическим веществом, существующим лишь несколько секунд. Данное вещество проникает вовнутрь стенки сосудов и в тромбоциты, которые находятся в тесном контакте с эндотелиоцитами. В крови происходит быстрая инактивация NO растворенным кислородом, гемоглобином и супероксидными анионами. Оксид азота, окисляясь, превращается в пероксинитрат-радикал. Чаще всего пероксинитрат-радикал образуется при стрессах, тяжелых травмах и нарушениях липидного обмена. Этот радикал достаточно агрессивен, способствует оксидации липидов низкой плотности, обладает цитотоксическим и мутагенным действием, способен повреждать ДНК, разрушать мембраны клеток, нарушать деятельность энзимаотческих систем [168]. Увеличение негативных воздействий данного патогенного фактора, находящегося в системном и тканевом кровотоке, вызывает гибель эндотелиоцитов, что, в свою очередь, приводит к развитию эндотелиальной дисфункции [15, 162, 180]. Из всего вышесказанного следует вывод, что дисфункция эндотелия – это патологическое состояние эндотелия, при котором имеется недостаточная продукция оксида азота [31, 34, 73].

Одной из ведущих причин развития дисфункции эндотелия является хроническая гиперактивация ренин-ангиотензин-альдостероновой системы. Это положение доказывается рядом иммуногистохимических исследований, выявивших, что основная часть ангиотензинпревращающего фермента (АПФ) находится на мембранах эндотелиоцитов коронарных сосудов артериальной сети и незначительная часть данного фермента обнаруживается в половине артериальных капилляров, при этом полностью отсутствует в венозных сосудах.

Тонус сосудов регулируется синтезом ангиотензина-2 (АТ-2), который оказывает позитивный вазоконстрикторный эффект благодаря активации рецепторов гладкомышечных клеток. Брадикинин, продуцируемый из субстрата кининогена посредством калликреина, обладает сильным вазодилатирующим эффектом, а ангиотензинпревращающий фермент является катализатором распада брадикинина на неактивные фрагменты. Блокада B2-кининовых рецепторов эндотелиоцитов приводит к уменьшению синтеза оксида азота и повышению тонуса гладких миоцитов [7, 8, 41, 44, 76].

вазоконстрикторами ведет к регионарному повышению тонуса сосудов [21].

Внутриклеточное свободнорадикальное окисление тоже играет большую роль в нарушении эндотелийзависимой вазодилатации. Некоторые экспериментальные исследования обнаружили, что ангиотензин-2, являясь мощным медиатором свободнорадикального окисления, вызывает констрикцию артерий, усиливает продукцию цитокинов, активируя при этом воспаление в сосудистой стенке [21, 63, 65].

Таким образом, функция эндотелия представляется сложным механизмом тесного взаимодействия медиаторов-антагонистов. Строение сосудистого эндотелия гетерогенно, например, эндотелиоциты церебральных, коронарных и легочных сосудов существенно различаются между собой по активности генов и по белковой, ферментативной, медиаторной и рецепторной структуре. Поэтому патологические состояния в клетках эндотелия развиваются по-разному.

Некоторые из них более чувствительны к ишемическим воздействиям, а другие реагируют на наличие токсического компонента, на развитие отека в тканях и так далее. Эти свойства имеют существенное значение в патогенезе дисфункции эндотелия.

Таким образом, в вышеизложенном материале продемонстрирована первостепенная роль нормального кровоснабжения в процессах остеогенеза и остеорепарации. В свою очередь, из-за эндотелиальной дисфункции ухудшается кровоснабжение костной ткани посредством снижения микроциркуляции, что ведет к расстройству остеогенеза и остеорепарации, вызывая тем самым такие остеологические заболевания, как остеопороз, на фоне которого замедляется консолидация костно-травматических повреждений. Данное положение диктует необходимость разработки альтернативных подходов к проблеме нарушения консолидации переломов при остеопоротических изменениях костей скелета.

1.3 Фармакотерапия нарушений функционирования сосудистого эндотелия В последнее время стало очевидным, что эндотелий сосудов – это активная метаболическая система, которая функционирует как рецепторно-эффекторный орган, реагирующий на любые физические или химические раздражители секрецией веществ, с помощью которых он может поддерживать вазомоторный баланс и сосудисто-тканевый гомеостаз [30, 42, 71, 169]. Также сосудистый эндотелий представляется основным модулятором тонуса сосудистой стенки, вырабатывает различные вазоактивные соединения, наиболее важным из которых является оксид азота (NO). Оксид азота – это лабильная субстанция, высвобождаемая эндотелиоцитами во время катаболизма L-аргинина при активном участии NO-синтазы [26, 55]. Данное вещество является самым мощным из известных в настоящее время вазодилататором [61, 62, 110, 124].

Широкий диапазон биорегуляторных действий оксида азота в сосудах демонстрирует, что снижение его уровня в эндотелиальных клетках под влиянием разных патогенных факторов вызывает существенные изменения их функций и кровообращения. К ним относятся: снижение свойств эндотелийассоциированных вазодилататоров, увеличение вазоконстрикторных эффектов, рост артериального давления на этом фоне, нарушения системной и регионарной гемодинамики, увеличение активности молекул адгезии эндотелия, тромбоцитарной агрегации, адгезия тромбоцитов и лейкоцитов к стенке сосуда и другие [26, 27, 34, 122].

Отдельные исследовательские работы последних лет показали, что указанные нарушения, определяющие дисфункцию эндотелия [135, 146, 173], имеют место во многих случаях сосудистых заболеваний, таких, например, как артериальная гипертония [2,112], атеросклероз [5, 94, 171], ишемическая болезнь кровообращения, легочного кровообращения [109], кровообращения в головном мозге, кишечнике, конечностях, а также при остеопоротических нарушениях костей [13, 20].

Патогенетические механизмы постменопаузных состояний являются многофакторными и гораздо более сложными, чем просто влияние сниженного уровня эстрадиола в крови. Очевидно, что один из этих пусковых механизмов связан с нарушением эндотелийзависимой вазодилатации, вызванным снижением биодоступности оксида азота, то есть дисфункцией эндотелия [25, 66, 112]. Это объясняет повышение активности ренина плазмы, стимуляцию окислительного стресса, увеличение соль-чувствительности, ожирение, повышение симпатического тонуса [160, 161, 175]. Коррекция дисфункции эндотелия при гипоэстрогенных состояниях считается важной для восстановления баланса регуляций таких факторов, как: сосудистый тонус, гемостаз, иммунный ответ, миграция кровяных клеток в стенку сосуда, уменьшения выработки факторов воспаления, укрепления барьерных функций эндотелия [161, 162].

К одному из звеньев механизма, ведущего к формированию дефицита оксида азота и провоцируемой дисфункции эндотелия, можно отнести недостаток L-аргинина. В плазме крови уровень L-аргинина оказывается сниженным при многих заболеваниях сердечно-сосудистой системы [36, 84, 188, 199].

Обнаружено, что пероральное и парентеральное введение L-аргинина в организм больных при ряде заболеваний восстанавливает сниженный у них уровень Lаргинина, NO и функции эндотелия, давая соответствующий терапевтический эффект [56, 84, 155]. Это обстоятельство позволило предположить, что эндотелиальная дисфункция у таких больных может быть обусловлена недостатком L-аргинина в качестве субстрата для эндотелиальной синтазы оксида азота (eNOS).

В эндотелиальных клетках в результате биосинтеза из аминокислоты L-аргинина продуцируется оксид азота при участии фермента эндотелиальной NO-синтазы (eNOS), обладающей значительным влиянием на регуляцию сердечно-сосудистой системы. Образование оксида азота осуществляется с вырабатывается в результате поглощения молекулы кислорода и 2 электронов.

Далее NHA преобразовывается в L-цитруллин и оксид азота при участии молекулы кислорода и 1 электрона [56, 188, 199].

Исходя из вышеизложенного, очевидна существенная роль L-аргинина в предотвращении эндотелиальной дисфункции.

L-аргинин относится к группе полунезаменимых аминокислот и был впервые обнаружен в 1886 г. [180]. Данный препарат является предшественником оксида азота [169] и имеет широкий диапазон биорегуляторных свойств [36, 84, 188, 199]. Ежедневный прием этого вещества с пищей составляет около пяти грамм [199], при этом до 40% его разрушается аргиназой – ферментом, разрушающим аргинин, а также при абсорбции, его остальное количество попадает в воротную вену [132].

Концентрация L-аргинина в плазме крови у человека варьирует от 95 до мкмоль/л. Количество проходящего в эндотелиоциты аргинина, в первую очередь, зависит от таких факторов, как: активность мембраносвязанной системы транспорта – высокоактивного натрий-независимого транспорта аминокислот;

активность аргиназы, прочих факторов. Изолированные клетки эндотелия имеют концентрацию аргинина 1-2 ммоль/л. При недостаточности его в клетках L-аргинин–L-цитролиновый цикл может компенсировать дефицит аргинина.

Концентрация аргинина в эндотелиоцитах зависит от активности фермента, который превращает аргинин в мочевину и орнитин, при этом аргиназа-I – конститутивная, а аргиназа-II стимулируется в клетках эндотелия липополисахаридами и интерфероном [132, 199].

Помимо приведенного ранее прямого влияния аргинина на образование оксида азота, существуют и другие его свойств. Он косвенно воздействует на увеличение секреции инсулина [188] и высвобождение гистамина из тучных клеток [117], что, в свою очередь, ведет к дополнительному образованию оксида азота и эндотелийзависимой вазодилатации [155]. В последнее время появились публикации, где экспериментально доказано, что терапия L-аргинином в дозе 200 мг/кг предотвращает развитие гипоэстроген-индуцированного дефицита оксида азота [56].

осуществляться и другими лекарственными средствами, например нитратами, которые восстанавливают дефицит NO, ингибиторами АПФ, которые блокируют синтез ангиотензина-2 и предотвращают распад кининов, антагонистами кальция, тормозящими активность ангиотензина-2 и эндотелина в гладких миоцитах сосудов, потенцируя, тем самым, воздействие NO на дилатацию сосудов. Надо отметить, что в настоящее время препаратов для специфической фармакотерапии эндотелиальной дисфункции не существует [2, 29, 42, 71].

Коррекция гипоэстроген-индуцированного дефицита оксида азота может осуществляться ингибиторами АПФ, к ним, в частности, относится эналаприл.

Препараты этой группы восстанавливают обмен брадикинина, ингибируют тканевой пул ангиотензинпревращающего фермента, следствием чего является ингибирование синтеза ангиотензина-2 и деградации брадикинина. При этом в большей степени эффективны ингибиторы АПФ, которые обладают наибольшим воздействием на ренин-ангиотензин-альдостероновую систему. Также к предполагаемым механизмам влияния этих веществ можно отнести уменьшение инсулин-индуцированной и базальной выработки эндотелина-1 и рост выработки NO. Данное положение подтверждено исследованиями на крысах со спонтанной артериальной гипертензией (АГ) [25,70]. Например, каптоприл и цилазаприл восстанавливают функцию эндотелия, повышая продукцию оксида азота, в эндотелиального гиперполяризующего фактора, что позитивно влияет на функцию эндотелия в целом, а рамиприл предотвращает развитие дисфункции эндотелия, спровоцированной действиями недоокисленных липопротеидов низкой плотности [4, 31, 32, 174]. Также в эксперименте была выявлена положительная способность кандесартана и эналаприла к восстановлению функции эндотелия мезентериальных сосудов у крыс со спонтанной артериальной гипертензией [14, 57, 58, 108, 119]. Надо отметить, что помимо выраженных эндотелиотропных эффектов у эналаприла в дозе 0,5 мг/кг в ряде исследований были обнаружены остеопротективные свойства [13, 20].

эндотелиопротективным действием, механизм влияния этих препаратов, скорее всего, опосредован блокадой АТ1-рецепторов, приводящей к ингибированию синтеза и накопления супероксид-радикалов и уменьшению связывания оксида азота. Известно, что стимуляция ангиотензин-1-рецепторов провоцирует выработку супероксидов, инактивирующих оксид азота, тогда как стимуляция ангиотензин-2-рецепторов вызывает вазодилатацию и усиление натрийуреза, обусловленное активированием системы брадикинина, оксида азота и циклоГМФ. Влияние ангиотензина-2 (активация образования или ингибирование оксида азота) обусловлено типом рецепторов, с которыми он в основном взаимодействует. Вот почему при блокаде АТ1-рецепторов формируются позитивные условия для усиления деятельности не блокированных ангиотензинрецепторов, приводящие к накоплению оксида азота. Данное положение подтверждается рядом исследователей, которые обнаружили увеличение уровня цГМФ в аорте при приеме лозартана у крыс со спонтанной артериальной гипертензией, что свидетельствует об интенсификации последним синтеза оксида азота. В некоторых экспериментальных работах продемонстрировано, что при моделировании артериальной гипертензии профилактическое использование лозартана позволяет блокировать воздействие ангиотензина-2 на формирование супероксид-радикалов, при этом у крыс с нарушением синтеза оксида азота в надпочечниках способствует возникновению и поддержанию повышенного артериального давления, лозартан же увеличивает концентрацию нейрональной синтазы оксида азота в надпочечниках, тем самым нормализуя синтез оксида азота. При обследовании пациентов с эссенциальной гипертензией было обнаружено улучшение эндотелиальной функции резистивных артерий при лечении лозартаном, что может объясняться стимуляцией синтеза оксида азота [28, 45, 46, 51, 52]. При этом у больных повышается активность синтазы оксида азота как в плазме, так и в эритроцитах, увеличивается концентрация стабильных метаболитов оксида азота, то есть улучшает функция эндотелия, нормализуется активность почечной ксантиноксидазы и увеличивается брадикининопосредованная продукция NO в почках [53, 68, 78, 108, 166]. К имеющимся эффектам лозартана в некоторых исследованиях было обнаружено положительное воздействие данного препарата на регенерацию костной ткани [13, 20].

Исследования, выполненные в НИИ экологической медицины КГМУ, доказали, что через 6 недель после двусторонней овариэктомии у самок крыс формируется и в последующем прогрессирует гипоэстрогенная дисфункция сосудистого эндотелия [30], на фоне которой по прошествии восьми недель после удаления яичников у половозрелых самок крыс формируется гипоэстрогенный генерализованный остеопороз [20, 138]. Комплекс патологических изменений после овариэктомии у самок крыс подтверждает концепцию, в которой основным звеном в развитии остеопоротических нарушений является эндотелиальная дисфункция микроциркуляторного русла кости, негативно влияющая посредством ухудшения кровоснабжения кости на процессы костного ремоделирования.

Лозартан и эналаприл, оказывая позитивное влияние на регионарную микроциркуляцию, обладают остеопротективными эффектами, что положительно сказывается на сращении переломов [13, 20].

L-аргинин обладает выраженными эндотелиопротективными эффектами, поэтому можно предположить, что данный фармакологический агент имеет остеопротективные свойства. Поэтому не подлежит сомнению актуальность исследования перспектив использования L-аргинина в качестве монотерапии и в комбинациях с другими эндотелиотропными препаратами для коррекции остеопоротических нарушений костей скелета и переломов на фоне остеопороза.

РЕЗЮМЕ

Васкуляризация играет важную роль в формировании костной ткани и восстановлении ее после травматических повреждений. Появление новых методов исследования постепенно объясняет функции разных остеогенных и ангиогенных факторов, участвующих в развитии костной ткани. Благодаря этим факторам можно объяснить взаимосвязь костной ткани и эндотелиоцитов, а также главенствующую роль локального кровоснабжения в посредничестве между ними.

Одной из причин развития остеопоротической патологии на фоне замедления сращения или несращения переломов является ухудшение регионарного кровоснабжения, основой которого является дисфункция эндотелия.

Понимание этих процессов создает теоретическую предпосылку для исследования влияния препаратов с доказанными эндотелиопротективными свойствами на костное ремоделирование и остеорепарацию. Все вышеизложенное указывает на актуальность изучения остеопротективных эффектов L-аргинина и его комбинаций с эналаприлом и лозартаном.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Моделирование экспериментального остеопороза Исследование проводили на 120 белых крысах-самках Вистар с массой тела 200- предварительно подвергали наркотизации посредством внутрибрюшинной инъекции водного раствора хлоралгидрата в дозе 300 мг/кг, после чего осуществляли операцию двусторонней овариэктомии [138]. По прошествии восьми недель у данных животных развивается системный остеопороз [20].

Исследуемые препараты и комбинации препаратов для коррекции остеопоротических изменений костей применяли с девятой по двенадцатую неделю эксперимента включительно (рис. 2.1).

Рисунок 2.1 – Схематическое изображение хода эксперимента на модели В качестве контроля использовали животных, которым была проведена ложная операция овариэктомии (вскрытие под наркозом брюшной полости без удаления яичников, послойное зашивание раны).

Степень выраженности остеопоротических изменений анализировали спустя 12 недель после проведения овариэктомии посредством проведения гистоморфометрии (рис. 2.1).

2.2 Моделирование закрытых остеопоротических переломов Исследование было проведено на 120 белых крысах-самках Вистар с массой тела 200-300 г. У всех крыс (за исключением контрольной группы) моделировали экспериментальный остеопороз путем удаления обоих яичников (в соответствии с методикой, описанной в п. 2.1 настоящей диссертации).

Далее, по прошествии восьми недель после овариэктомии, на фоне развившегося остеопороза [13, 20] моделировали переломы бедренных костей подопытных животных (остеопоротические переломы) (рис. 2.2).

Рисунок 2.2 – Схематическое изображение хода эксперимента на модели Для этого крыс предварительно наркотизировали (водный раствор хлоралгидрата внутрибрюшинно в дозе 300 мг/кг). После наркотизации животных без разреза мягких тканей, при помощи крампонов с надетыми на режущие поверхности силиконовыми трубками, производилось внешнее воздействие на проксимальный отдел бедренной кости (между большим и третьим вертелами бедренной кости). Нагрузка осуществлялась перпендикулярно оси кости до появления в ней перелома.

В дальнейшем для фиксации и стабилизации переломов производили закрытый миниинвазивный интрамедуллярный остеосинтез следующим способом.

Со стороны дистального эпифиза бедренной кости при согнутой в коленном суставе задней конечности животного, вдоль оси кости в асептических условиях через прокол кожи и кортикальный слой, а далее интрамедуллярно, проводили спицу Киршнера, имеющую диаметр, соответствующий ширине внутреннего диаметра костномозгового канала бедра, с помощью струбцины. Во время остеосинтеза спица проходила сквозь ткань дистального метафиза, диафиз, зону перелома и прочно фиксировалась в костномозговом канале и проксимальном метафизе бедренной кости (рис. 2.3).

Рисунок 2.3 – Схема интрамедуллярного остеосинтеза бедра. Красным цветом обозначено место перелома, синим – спица Киршнера, введенная в костномозговой канал бедренной кости крысы Контроль прочности фиксации определяли по отсутствию патологической подвижности в области перелома. Фрагмент спицы, выстоящий за пределы эпифиза кости, коротко скусывали и полностью погружали в ткань кости. На прокол кожи в месте введения спицы накладывали один шов капроновой нитью, рану обрабатывали кожным антисептиком.

Исследуемые препараты в качестве монотерапии и комбинации препаратов применяли с первой по четвертую неделю после воспроизведения и остеосинтеза переломов включительно (рис. 2.2).

Таким образом, результаты консолидации переломов оценивали визуально и рентгенографически по прошествии четырех недель после остеосинтеза переломов или через 12 недель после начала эксперимента.

2.3 Измерение уровня микроциркуляции в кости, проведение Уровень микроциркуляции на модели экспериментального остеопороза оценивали в ткани проксимального отдела бедра, на модели остеопоротических переломов – в ткани формирующейся костной мозоли через 12 недель после начала эксперимента (проведения операции удаления яичников).

внутрибрюшинно в дозе 300 мг/кг) производили хирургический доступ к проксимальному отделу бедренной кости крысы. После формирования отверстия в кортикальном слое кости или на поверхности костной мозоли глубиной до 2 мм, вводили в него игольчатый датчик для исследования состояния регионарной микроциркуляции.

исследовали с помощью аппаратного комплекса Biopac systems, включающего блок полиграфа MP100, LDF100C – блок лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) и датчик TSD144, который после хирургического доступа вводился в ткань проксимального отдела бедра.

Метод лазерной допплеровской флоуметрии – это способ диагностики, при котором применяется зондирование тканей лазерным лучом. Обработка отраженного излучения от тканей основана на выделении из зарегистрированного пропорционального скорости движения эритроцитов. В ходе проводимых исследований обеспечивается регистрация изменения потока крови в микроциркуляторном русле (рис. 2.4, 2.5) [49].

Рисунок 2.4 – Пример ЛДФ-граммы: уровень микроциркуляции в мышечной Рисунок 2.5 – Пример ЛДФ-граммы: уровень микроциркуляции в костной ткани На модели экспериментального остеопороза после измерения уровня микроциркуляции в кости, проводили функциональные сосудистые тесты эндотелийзависимой (ЭЗВД) и эндотелийнезависимой (ЭНВД) вазодилатации в ответ на одномоментное внутривенное введение растворов ацетилхолина в дозе 40 мкг/кг и нитропруссида натрия в дозе 30 мкг/кг соответственно [30, 31] для оценки степени развития дисфункции сосудистого эндотелия [20].

Регистрацию и обработку результатов лазерной допплеровской флоуметрии при исследовании микроциркуляции и проведении функциональных сосудистых тестов осуществляли в программе AcqKnowledge версий 3.8.1-4.2.0, показатели локального кровоснабжения выражались в перфузионных единицах (ПЕ).

2.4 Гистоморфометрическая оценка развития экспериментального остеопороза и эффективности его коррекции экспериментального остеопороза и при его коррекции исследуемыми препаратами и комбинациями препаратов, проводили гистоморфометрические исследования костной ткани проксимальных отделов бедренных костей подопытных крыс.

После эвтаназирования животных производилось извлечение бедренных костей, которые затем фиксировались в 10% растворе формалина с последующей проводкой и заливкой в парафин. После этого изготавливались гистологические препараты, которые окрашивались гематоксилином и эозином (Г-Э).

Гистологические стекла с препаратами микроскопировали на микроскопе Leica CME (увеличение х100: объектив х10, окуляр х10) и фотографировали цифровым фотоаппаратом с фиксированным разрешением.

Для морфометрического изучения микроархитектоники костной ткани использовали предварительно откалиброванную программу ImageJ версий 1.39В качестве количественной меры оценки развития остеопороза и эффективности его фармакологической коррекции использовали ширину костных трабекул проксимального отдела бедра, которую измеряли и выражали в микрометрах (мкм) (рис. 2.6).

Гистоморфометрические исследования проводились при методической, консультативной и технической поддержке заведующего кафедрой гистологии, эмбриологии, цитологии КГМУ, д.м.н., профессора Иванова Александра Викторовича, за что выражаем ему глубокую благодарность.

Рисунок 2.6 – Пример измерения ширины трабекулы при гистоморфометрии костной ткани проксимального отдела бедра у крысы (окр. Г-Э, Х200) 2.5 Обоснование доз препаратов и дизайн исследования Для исследования антиостеопоротической активности нами были подобраны препараты и комбинации препаратов с эндотелиотропной активностью, продемонстрированой в ранее проведенных исследованиях в НИИ Экологической медицины КГМУ: L-аргинин, эналаприла малеат, лозартан калия [20, 56]. В качестве препарата сравнения использовали Кальций-Д3 Никомед в дозе 85,7 мг/кг.

L-аргинин, ингибитор ангиотензинпревращающего фермента эналаприл («Рениприл», «Фармстандарт-Лексредства»), рецепторов лозартан калия («Блоктран», «Фармстандарт-Лексредства») применяли в дозах 200 мг/кг, 0,5 мг/кг и 6 мг/кг соответственно, что отвечает данным доступных отечественных и иностранных источников и обнаруживает эффективную эндотелиотропную активность препаратов в ранее проведенных исследованиях. Препараты после тщательного измельчения вводили ежедневно однократно в сутки внутрижелудочно в виде суспензии в 1% крахмальной слизи.

Распределение животных по группам осуществляли рандомизацией, стратифицирующими признаками являлись масса тела, условия содержания, питания, проводимые манипуляции и операции.

Таблицы 2.1, 2.2 отражают дизайн эксперимента.

Во время проведения исследований условия содержания подопытных крыс были следующими: помещения временного содержания, биологически чистые, температура воздуха – 20-24 оС, относительная влажность – 30-70%, условия освещения – светлый/темный цикл (12 ч/12 ч), корм – гранулированный в соответствии с ГОСТ 50258-92, вода – водопроводная, фильтрованная.

2.6 Статистическая обработка первичных данных исследования Данная диссертационная работа является проспективным исследованием.

Она проводилась на отобранных случайным образом группах самок белых крыс линии Вистар с использованием рандомизированных контролируемых испытаний. Благодаря использованию рандомизации эта экспериментальная работа дает уверенность в том, что группы различаются только изучаемым признаком, тем самым преодолевается основной недостаток обсервационных исследований.

В проспективном исследовании, в отличие от ретроспективных испытаний, до завершения эксперимента нельзя с точностью сказать к чему оно приведет, следовательно, полученные результаты становятся более объективными и независимыми.

Поэтому результаты контролируемых исследований нередко могут привести к ложному выводу о неэффективности того или иного применяемого метода, тогда как обсервационное исследование, напротив, доказывает его эффективность.

Таблица 2. Дизайн исследований на модели экспериментального остеопороза Моделируемые Контроль внутрижелудочно ежедневно один раз в сутки в течение 12 недель (ложная операция измерение уровня микроциркуляции в проксимальном отделе бедра, овариэктомии) проведение функциональных сосудистых тестов, забор костного биологического материала для морфологических исследований Билатеральная овариэктомия 1% крахмальная слизь внутрижелудочно функциональных сосудистых тестов, забор костного биологического Остеопороз + L-аргинин 200 мг/кг Остеопороз Билатеральная овариэктомия 1% крахмальная слизь внутрижелудочно + L-аргинин 200 мг/кг ежедневно один раз в сутки в течение 8 недель введение препаратов или + эналаприл 0,5 мг/кг Остеопороз измерение уровня микроциркуляции в проксимальном отделе бедра, проведение функциональных сосудистых тестов, забор костного + лозартан 6 мг/кг биологического материала для морфологических исследований Остеопороз Таблица 2. Дизайн исследований на модели экспериментальных остеопоротических переломов Перелом бедра у контрольных перелом бедренной кости и его остеосинтез 1% крахмальная слизь Остеопоротический перелом бедренной кости и его остеосинтез 1% крахмальная слизь перелом бедра внутрижелудочно ежедневно один раз в сутки в течение 4 недель Остеопоротический перелом бедра + L-аргинин 200 мг/кг Остеопоротический перелом + эналаприл 0,5 мг/кг Остеопоротический перелом Остеопоротический перелом + Кальций-Д3 Никомед 85,7 мг/кг проанализированы с помощью описательной статистики (пакет анализа Micrоsоft Excel 2003). Для групповых значений определяли средние значения (M) показателей и ошибку среднего (m); если не указано другого, данные в тексте и таблицах представлены в виде M±m.

сравнениях (анализируемой группы с контрольной группой интактных животных гетероскедастическому t-тесту (двухвыборочный t-тест Стьюдента с различными дисперсиями). Критерий Стьюдента (t-критерий) является наиболее часто применяемым методом обнаружения различия между средними значениями из двух выборок и используется более чем в половине медицинских публикаций [50].

Критерий Стьюдента с поправкой Ньюмена-Кейлса применяется для сравнения нескольких групп с контрольной. Данная поправка дает возможность анализировать множественные сравнения с увеличением интервала сравнения в зависимости от количества групп и получением критического значения q.

Критерий Ньюмена-Кейлса дает более точную оценку вероятности ; его чувствительность выше, чем критерия Стьюдента.

Этот тест используется для больших выборок, как в случаях, приведенных в данной работе (n = 20). Значение критерия сравнивается с табличными показателями. Если значение критерия превышает критическое значение, то можно утверждать, что нулевая гипотеза была справедлива. То есть имеется вероятность, что показатель р – значение критерия, окажется не меньше критического значения при условии справедливости нулевой гипотезы об отсутствии различий между группами [50]. В работе это будет обозначено как