МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

СИБИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

Пронина

Наталия Александровна

ИММУНО-МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ФОРМИРОВАНИЯ

И ТЕЧЕНИЯ АТОПИЧЕСКОГО ДЕРМАТИТА

14.00.16 – патологическая физиология 14.00.36 – аллергология и иммунология диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научные руководители:

Доктор медицинских наук, Профессор Климов В.В.

Доктор медицинских наук, Профессор Суходоло И.В.

Томск - Оглавление Список сокращений

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Этиология атопического дерматита

1.2. Патогенез атопического дерматита

1.3. Роль костимулирующих молекул в патогенезе атопических заболеваний

1.4.Строение кожи в норме и при атопическом дерматите

1.4.1. Строение кожи здоровых лиц

1.4.2. Особенности иммуноморфологии кожи при атопическом дерматите

1.5. Классификация атопического дерматита

1.6. Специфическая иммунотерапия больных атопическим дерматитом.... 1.6.1. Принципы и механизмы специфической иммунотерапии............... 1.6.2. Определение содержания цитокинов ИЛ-2 и ИФН-, как метод оценки эффективности СИТ

Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1. Характеристика объекта клинико-иммунологических исследований.. 2.2. Методы исследования

2.2.1. Гистологическое исследование кожи

2.2.2. Определение сывороточных показателей, параметров лимфоцитарной системы и реактивности нейтрофилов

2.2.3. Постановка реакции бласттрансформации лимфоцитов................. 2.2.4. Определение содержания ИЛ-2 и ИФН-

Глава 3. Гистологическая оценка состояния кожи у пациентов с атопическим дерматитом

Глава 4. Клинико-иммунологическая характеристика больных атопическим дерматитом

4.1. Клиническая характеристика обследованных больных

4.2 Изменение иммунного статуса при атопическом дерматите.................. Глава 5. Специфическая иммунотерапия атопического дерматита:

иммунологическая эффективность и оценка экспрессии CD28................ 5.1. Влияние специфической иммунотерапии на степень тяжести у пациентов с атопическим дерматитом

5.2. Изменение иммунологических показателей I уровня у пациентов с атопическим дерматитом под влиянием специфической иммунотерапии.. 5.3. Влияние специфической иммунотерапии на показатели реакции бласттрансформации у больных атопическим дерматитом

5.4. Динамика ИЛ-2 и ИФН- у пациентов с атопическим дерматитом при проведении специфической иммунотерапии

5.5. Количество CD28+-лимфоцитов в крови у пациентов с атопическим дерматитом под влиянием специфической иммунотерапии

Приложение

Заключение

Выводы

Список литературы

Список сокращений АГ – антиген АД – атопический дерматит АПК – антигенпредставляющая клетка ИКК – иммунокомпетентная клетка ИЛ – интерлейкины (1-18) ИРК – иммунорегуляторный коэффициент ИФН- - интерферон КЛ – клетки Лангерганса НСТ-тест – тест восстановления нитросинего тетразолия ПЗА – причинно-значимый аллерген РБТЛ – реакция бласттрансформации лимфоцитов СИТ – специфическая иммунотерапия ТХ1, ТХ2 – Т-хелперы типов 1 и ФГА – фитогемагглютинин ЦИК – циркулирующие иммунные комплексы CD – cluster definition – антигены кластеров дифференцировки клеток FСЕRI – высокоспецифичный, FСЕRII – низкоспецифичный рецептор IgE на тучных клетках HLA-I, II – главный комплекс гистосовместимости I (первого класса), II (второго класса) ICAM-1, 2, 3 – inter cellular adhesion molecules – молекула межклеточной адгезии 1, 2, 3 типов Ig – иммуноглобулины (M, G, E, A, D) NK – натуральные киллеры PNU – единица белкового азота TNF – tumor necrosis factor – фактор некроза опухолей Актуальность. Актуальность проблемы атопического дерматита (АД) связана с тем, что в последние десятилетия XX столетия ученые всех стран мира отмечают постоянное увеличение числа людей, страдающих АД, и заметное утяжеление клинических проявлений дерматита в различных возрастных группах [127, 205]. Согласно данным официальной статистики, в России АД диагностируется впервые у 240-250 человек на 100000 обследованных [129,130,131]. Уровень инвалидизации при АД составляет 8% [5].

Между тем до настоящего времени нет достаточно полных данных о патогенезе формирования иммунопатологии кожи и механизмах, лежащих в основе зуда при атопическом дерматите.

Кроме того отсутствуют унифицированные методы, дающие стойкий терапевтический эффект при АД.

АД – проблема для больного человека и членов его семьи, так как почти у 50% больных АД появляется в возрасте 1 года, у 30% – между 1 и 5 годами жизни. Почти у 80 % больных позже развивается аллергический ринит или бронхиальная астма [205].

Кожа является высокоорганизованным периферическим органом иммунной системы и обладает необходимым составом иммунокомпетентных клеток (ИКК), кооперирующихся между собой как с помощью комплементарных структур на их поверхности, так и при участии иммунорегуляторных цитокинов [64,66,75,83].

С развитием новых концепций формирования иммунного ответа в иммунологии, большое значение придается роли костимулирующих молекул.

Костимулирующие молекулы участвуют в межклеточных взаимодействиях, которые играют ключевую роль на разных этапах становления и функционирования иммунной системы. Однако наибольшим своеобразием и специфичностью обладают межклеточные взаимодействия, реализуемые в процессе развития иммунного ответа [151,152]. При взаимодействии антигенпредставляющей клетки (АПК) и Т-хелперов ключевую роль играет взаимное связывание молекул CD28 Т-лимфоцита и вариантов молекул В7 (СD80 или СD86) АПК, а также – реакция молекул СD40 В-клетки и СD40L (СD 154) Тхелпера, которая приобретает особенно важную роль при Т-В-кооперации [139,151,152]. В рамках этой проблемы проведение работы по исследованию содержания СD28 представляет интерес в плане расшифровки патогенеза АД. Специфическая иммунотерапия (СИТ) является единственным этиопатогенетическим методом лечения атопических заболеваний, в том числе и АД [35,40,142].

Цель исследования: установить роль иммунологических и морфологических нарушений в патогенезе атопического дерматита до и после проведения специфической иммунотерапии.

С учетом поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Исследовать функциональную активность иммунорегуляторных клеток и роль костимулирующей молекулы CD28 в патогенезе атопического дерматита.

2. Оценить клиническую и иммунологическую эффективность специфической иммунотерапии у пациентов с атопическим дерматитом.

3. Определить морфологические особенности эпидермиса кожи у пациентов с атопическим дерматитом.

4. Исследовать взаимозависимость между клиническими и иммунологическими параметрами при атопическом дерматите.

Положения, выносимые на защиту:

1. В патогенезе атопического дерматита большую роль играет дисбаланс иммунорегуляторных субпопуляций Т-лимфоцитов, который смещается в сторону повышения активности ТХ2-типа, что проявляется снижением уровней ИЛ-2, ИФН-, и повышением количества CD28+лимфоцитов в крови. После проведения специфической иммунотерапии происходит частичное восстановление баланса ТХ1/ТХ2.

2. Патоморфологические изменения кожи при атопическом дерматите коррелируют со степенью тяжести патологического процесса и уровнем дисбаланса иммунорегуляторных клеток.

Научная новизна. Впервые проведено исследование состояния эпидермиса поврежденной и неповрежденной воспалительным процессом кожи у пациентов с атопическим дерматитом. Показано, что у пациентов с атопическим дерматитом наблюдается гиперкератоз даже в неповрежденных воспалительным процессом участках кожи. Получены новые данные о характере сдвига функциональной активности ТХ1- и ТХ2-типов. Исследовали роль костимулирующей молекулы CD28 при атопическом дерматите при проведении специфической иммунотерапии. После проведения СИТ имеет место частичное восстановление баланса ТХ1/ТХ2, что проявляется повышением уровня продукции ИЛ-2, количества CD28+-лимфоцитов, однако, сохраняется низкий уровень продукции ИФН-.

Практическая значимость. Комплексное изучение клиникоиммунологического и цитокинового статуса, гистологических особенностей строения эпидермиса кожи у больных АД позволяет оценить тяжесть и прогноз течения заболевания и дифференцированно, с учетом выявленных особенностей, подходить к вопросам лечения и осуществлять контроль за эффективностью иммунотерапии атопического дерматита.

Показана роль костимулирующей молекулы CD28+ в патогенезе атопического дерматита. Оценка динамики цитокинов (ИЛ-2, ИФН-) в культуральной жидкости различных модификаций РБТЛ и CD28+-лимфоцитов является чувствительным и достоверным критерием успешности проводимого лечения, что позволяет прогнозировать результаты СИТ.

Внедрение. Полученные результаты используются в работе иммуноаллергологического отделения, городского аллергологического кабинета г.Томска. Положения и выводы диссертации внедрены в процесс преподавания клинической иммунологии и аллергологии студентам Сибирского государственного медицинского университета.

Апробация. Основные положения работы докладывались и обсуждались:

1. Конференция РААКИ, С.-Петербург 2002г.

2. Научно-практическая конференция «Актуальные вопросы аллергологии», Томск, март 2003г.

3. Научно-практическая конференция «Атопический дерматит: новое в лечении и диагностике», Томск, май 2003г.

4. 3-я конференция FOCIS, Париж, май 2003г.

5. Заседание проблемной комиссии кафедры иммунологии и аллергологии СибГМУ, Томск, июнь 2003г.

6. Заседание экспертной комиссии по патологической физиологии при СибГМУ, Томск, октябрь 2003г.

Список работ, опубликованных по теме диссертации. По теме диссертации опубликовано 5 работ: 1 – в центральной, 1– в зарубежной, 3 – в местной печати.

Объем и структура диссертации.

Работа изложена на 117 страницах машинописного текста и состоит из введения, 5 глав, приложения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 240 источников, из которых 154 отечественных и 86 иностранных. Диссертация иллюстрирована рисунками, 3 фотографиями и 18 таблицами.

АД – генетически детерминированное хроническое аллергическое воспаление кожи с характерной клинической картиной, сопровождающееся зудом. Основополагающим фактором формирования АД является генетически обусловленная предрасположенность к IgЕ – ответу, причем передается по наследству не болезнь как таковая, а совокупность генетических факторов, способствующих формированию аллергической патологии [118,129,131]. В последние годы обнаружена связь атопических заболеваний с определенными антигенами гистосовместимости, в частности, установлена положительная ассоциация АД с антигенами HLA-A24, HLA-В5, HLA-В9, HLA-В12, HLA-В27 [131].

Для реализации IgЕ – зависимого иммунного ответа и появления клинических симптомов необходимо воздействие различных неблагоприятных внешних и внутренних факторов, называемых факторами риска, к которым относятся:

- климато-географические условия;

- экологическая ситуация (чаще страдают жители города, чем сельской местности);

- патология беременности;

- несоблюдение диеты в период беременности и лактации;

- дефекты вскармливания ребенка (ранний ввод прикормов, искусственное или смешанное вскармливание) [10,11,19,129,142].

Большое значение в формировании АД имеют функциональные нарушения ЖКТ в виде дисбактериоза, рефлюксов, дискинезии желчевыводящих путей; хронические болезни органов пищеварения, которые способствуют легкому проникновению антигенов (АГ) из пищевой кашицы через слизистую оболочку во внутреннюю среду организма и формированию сенсибилизации, прежде всего к пищевым продуктам [5,42,58,105,129]. Нарушенная кишечная флора обладает негативным воздействием на организм: усиливает кишечное брожение, выработку токсинов, фенолов, аминов (гистамина, тирамина и др.). Высокий уровень эндогенного амина способствует аллергическим заболеваниям [145].

Большую роль в развитии и поддержании АД играет паразитарная инвазия. В частности, продукты жизнедеятельности гельминтов и их токсины вызывают активацию иммунокомпетентных клеток (ИКК), гиперпродукцию иммуноглобулинов, особенно IgЕ, а также образование иммунных комплексов и повреждение Т-клеточного звена иммунитета. У пациентов с АД заражение лямблиями превышает в 7,6 раз по сравнению с здоровыми донорами [105].

Одной из существенных причин рецидивирующего течения АД является также значительная колонизация патогенной флоры на поверхности кожи, обусловленная наличием активных адгезинов в составе клеточной стенки микроорганизмов, что поддерживает бактериальную сенсибилизацию и гиперпродукцию IgЕ. Наибольшее внимание в развитии АД, особенно тяжелых форм, уделяется St.aureus. Известно, что у 80 - 95% больных АД St.aureus является доминирующим микроорганизмом, определяемым на пораженных участках кожи. Последние исследования свидетельствуют о том, что St.aureus способен усиливать или поддерживать воспалительный процесс на коже больных АД, являясь продуцентом энтеротоксинов, обладающих свойствами суперантигенов, стимулирующих активацию макрофагов и Т-клеток, несущих кожный хоуминговый рецептор, лимфоидный антиген кожи [44,129,205,206]. Длительная экспозиция антигена, стимуляция ТХ2-клеток, продукция аллергенспецифических IgE-антител, дегрануляция тучных клеток, эозинофильная инфильтрация и воспаление, усиливаемые повреждением кератиноцитов вследствие расчесов – все вместе приводит к хроническому воспалению кожи при АД, которое играет важную роль в патогенезе кожной гиперреактивности.

Несмотря на многообразие проявлений аллергических заболеваний, в основе их патогенеза лежат опосредованные IgE-антителами реакции высвобождения медиаторов аллергического воспаления из базофилов крови и тканей.

В патогенезе АД также ключевая роль принадлежит IgEопосредованным реакциям, т.е. аллергическим реакциям I типа [10,11,37,63].

В случае поступления во внутреннюю среду организма аллергена последний фрагментируется в антигенпредставляющих клетках до упрощенных пептидов, которые затем представляются этими клетками Т-клеткам – помощникам, имеющим профиль ТХ2-клеток. Этот профиль характеризуется продукцией клетками таких цитокинов, как ИЛ-4, ИЛ-13, ИЛ-5, но не ИЛ- или ИФН-. ТХ2 – клеточный профиль имеет отношение к гуморальному иммунному ответу и, в частности, к IgE-ответу. ТХ1 – клеточный профиль характеризуется продукцией клетками ИФН- и ИЛ-2, но не ИЛ-4, ИЛ-13, ИЛ-5. Между ТХ1 и ТХ2-клетками существуют реципрокные отношения, и ИФН- тормозит активность ТХ2-клеток, необходимых для осуществления IgE-ответа [66,75,141,210,212].

Образовавшиеся IgE-антитела (рис. 1) фиксируются на имеющих к ним очень высокое сродство специализированных рецепторах (высокоаффинные рецепторы для Fс-фрагмента IgE-FCERI), расположенных на тучных клетках слизистых оболочек и соединительной ткани.

Таким образом, вооруженные IgE-антителами, тучные клетки оказываются готовы к распознаванию аллергена, если он повторно сможет поступить во внутреннюю среду организма. При повторном поступлении аллерген связывается с IgE-антителами, происходит активация тучных клеток, в результате чего из них секретируются медиаторы (гистамин, серотонин, простагландин D2, лейкотриены С4, D4, Е4 и др.), которые Связывание АГ поверхностным Ig на В-клетке Интернализация образованного комплекса в В-клетке Представление аллергенных пептидов на В-клетке Распознавание Т-клеточным рецептором комплекса пептидов с молекулами HLA II класса Активация транскрипции на специ- Запуск переключающей рекомбинафическом регионе Ig локуса ции на синтез IgE Рис 1. Схема индукции IgE-ответа (по И.С. Гущину, 2000г.).

вызывают повышение сосудистой проницаемости, отек ткани, сокращение гладкой мускулатуры, зуд, гиперсекрецию слизистых желез [38,40,101,129].

Эти изменения составляют основу быстрой (ранней) фазы аллергической реакции, развивающейся в течение первых минут после действия аллергена.

Помимо указанных действий, высвобождаемые медиаторы привлекают в зону аллергической реакции другие клетки-участники: базофилы, эозинофилы, моноциты, лимфоциты. Пришедшие в эту зону дополнительные клеткиучастники аллергической реакции активируются, в результате чего также секретируют проаллергические (провоспалительные) медиаторы. Действие этих клеток и их медиаторов формирует позднюю (или отсроченную) фазу аллергической реакции. Поздняя фаза обуславливает поддержание аллергического воспаления в ткани, хронизацию процесса, формирование и усиление аллерген-специфической гиперреактивности, выражающейся в повышении чувствительности уже не только к конкретному аллергену, но и к разнообразным неспецифическим раздражающим воздействиям (дым, резкие запахи и прочее) [38,40].

Однако, причиной выработки лейкотриенов, как и других метаболитов арахидоновой кислоты, могут быть вновь образующиеся IgG-антитела. Эти антитела запускают каскад реакций активации системы комплемента, ведущих в свою очередь к активации цикла распада арахидоновой кислоты и генерации лейкотриенов [79].

1.3. Роль костимулирующих молекул в патогенезе Связывание антигенспецифического рецептора с комплексом пептидмолекула II класса HLA и включение в комплексообразование корецептора СD4 обеспечивает лишь одно из условий развития наивных Т-клеток – формирование первичного сигнала к пролиферации и дифференцировке этих клеток. Чтобы специфически подготовленная клетка начала, наконец, процесс дальнейшего развития, необходим второй сигнал от клеточной поверхности к геному. Костимулятором в данном случае выступает молекула В7, экспрессирующаяся на мембране антиген – презентирующей клетки. Рецептором для В7 на поверхности наивной Т-клетки является белок СD [23,137,138,139,229]. Молекула СD28 присутствует на поверхности всех покоящихся СD4+-клеток и 50% СD8+-клеток [152]. Также в минимальных количествах СD28-костимулирующую молекулу обнаружили на поверхности эозинофилов [190].

СD28 – трансмембранный гликопротеин-гомодимер с молекулярной массой 44 кД, субъединицы которого соединены дисульфидной связью и образуют 1 внеклеточный домен, гомологичный V-домену иммуноглобулина, и спейсерный участок (структура, свойственная также молекуле СD8) [151,152,229].

При сочетании сигналов, поступающих в ТХ через антигенпредставляющий рецепторный комплекс Т-клеток с СD3 и костимулирующую молекулу СD28, формируется сигнал, приводящий к активации клеток, то есть к выходу ее из фазы покоя G0 в фазу клеточного цикла G1 [239]. Это подготавливает клетку к пролиферации, которая лежит в основе любых проявлений активности лимфоцитов. Но для развития пролиферации требуется участие ростовых факторов. В случае Т-клеток формирующиеся в процессе передачи сигнала транскрипционные факторы АР-1, NF-АТ, NFkB вызывают экспрессию генов ростового фактора ИЛ-2 и его рецептора, что создает условия для деления активированных Т-клеток. Смысл костимулирующего эффекта, возникающего при связывании СD28, состоит во взаимодействии сигналов, поступающих от этой молекулы и от рецепторов, что приводит к усилению конечного эффекта (экспрессии ИЛ-2 и его рецептора) [23, 137, 138, 151, 152, 207, 209, 229]. Показано также, что под влиянием костимулирующего сигнала В7-СD28 происходит стабилизация мРНК ИЛ-2. В результате такой стабилизации РНК усиливается синтез ИЛ-2 в 20-30 раз [23].

Для развития гуморального ответа, который приводит к образованию антител, способных специфически связывать антиген, необходимо как действие цитокинов, секретируемых ТХ2, так и контактные взаимодействия В- и Т-клеток. При этом происходит рассмотренное выше взаимодействие костимулирующих молекул СD28-В7 (1,2) и СD40-СD40L, причем для активации В-лимфоцитов важен сигнал, поступающий через молекулу СD40 [138].

Связывание СD28 на Т-клетке с В7 (СD80) на В-клетке может быть составной частью механизма, который усиливает клеточное взаимодействие между Т- и В-клетками, опосредуемое связыванием СD40 и СD40L. Связывание СD40 приводит к экспрессии В7 (СD80) на В-клетке. Связывание же СD28 повышает экспрессию СD40L на Т-клетке и, что особенно важно, усиливает секрецию ИЛ-4 и дифференцировку ТХ2-клеток. ИЛ-4 в свою очередь усиливает экспрессию В7 (СD80) на В-клетке (рис. 2) [38,39].

Из выше изложенного материала следует, что костимулирующая молекула СD28 имеет большое значение в патогенезе АД. Взаимодействие СD28 с мембранными молекулами СD80 и СD86 на АПК приводит к регуляции иммунного ответа в организме. Также СD28 совместно с другими костимулирующими молекулами (СD40L-СD40) опосредованно участвуют в повышенной продукции цитокинов: ИЛ-2, ИФН- в одних условиях; ИЛ-4, ИЛв других [38].

_ Рис. 2. Роль вспомогательных взаимодействий между Т- и В- лимфоцитами (по И.С. Гущину, 1999г.).

1.4.Строение кожи в норме и при атопическом дерматите Кожа – уникальный иммунный орган, заселенный клетками, способными инициировать системный ответ на АГ, поступающие через нее. Функционирование кожи как иммунного органа подтверждается присутствием резидентных и рециркулирующих клеток костномозгового происхождения и ее взаимосвязью с другими иммунными органами [43,115,140].

Кожа представляет собой трехкомпонентную тканевую систему, образованную эпидермисом, дермой и подкожной жировой клетчаткой, которые находятся в морфофункциональном единстве.

Эпидермис, или многослойный плоский ороговевающий эпителий является пограничной тканью. Особенности строения эпидермиса обеспечивают его эластичность, упругость и прочность, а высокие регенеративные свойства способствуют быстрому восстановлению при повреждениях. Эпидермис состоит из пяти слоев клеток, отличающихся количеством рядов и формой клеток, а также их цитологической характеристикой: рогового, блестящего, зернистого, шиповидного, базального (или зародышевого). Блестящий слой электронно-микроскопически в настоящее время как отдельный слой не выделяется.

Роговой слой построен из множества черепицеобразных чешуек, окрашивающихся оксифильно. У взрослых на большей части тела толщина рогового слоя равна 13-15 мкм. Структурной единицей рогового слоя является роговая чешуйка. Роговые чешуйки соединяются друг с другом с помощью взаимопроникающих выростов плазмолеммы и ороговевших десмосом.

Зернистый слой состоит из 1-2 рядов клеток. Ширина межклеточных промежутков 20-30 нм. Ядра полиморфны, одни округлой или овальной формы, другие сильно вытянуты с очень неровными контурами ядерной мембраны. Характерной особенностью зернистых клеток, обусловивших их название, является наличие в цитоплазме кератогиалиновых масс, ассоциированных с пучками тонофибрилл, часто окруженных скоплением нуклеопротеидных гранул и рибосом. Второй особенностью клеток этого слоя является присутствие в цитоплазме особых структурных образований – кератиносом, или гранул Орланда. Кератиносомы принимают активное участие в ороговении плазмолеммы [66,78,148].

Шиповидный слой состоит из шиповатых эпидермоцитов. Они окружены плазмолеммой толщиной 7-8 нм с очень неровными контурами за счет многочисленных глубоких и мелких выростов (шипов), проникающих в соответствующие углубления соседних клеток и образующих соединения типа застежки «молния». Ядра шиповатых клеток, округлой или слегка овальной формы, окружены хорошо очерченной ядерной мембраной с немногочисленными порами. Характерной особенностью ядер шиповатых клеток эпидермиса человека является высокое содержание в них нейтральных липидов, фосфатидилхолина и отсутствие гликофосфолипидов [78, 115, 148]. Отличительной особенностью клеток шиповидного слоя является наличие в цитоплазме хорошо развитого фибриллярного аппарата, представленного тонофибриллами и немногочисленными тонофиламентами.

Базальный слой состоит из базальных эпидермоцитов, располагающихся в один ряд. Клетки округлой формы. Ядра обычно содержат одно или два ядрышка. Для цитоплазмы базальных клеток характерно более высокое содержание рибосом и митохондрий. В функциональном отношении клетки базального слоя характеризуются двумя основными особенностями. В них протекают активные процессы синтеза волокнистого белка, полисахаридов и липидов. Они обладают максимальной митотической активностью, соответственно содержат наибольшее количество ДНК- и РНК-содержащих структур [114, 115, 148].

Область соединения эпидермиса и дермы является границей соприкосновения двух разнородных по эмбриогенезу тканей и зоной с выраженными барьерными функциями, через которую осуществляются обменные процессы между эпидермисом, не имеющим кровоснабжения, и подлежащей дермой.

Микроскопически область дермоэпидермального контакта имеет вид волнистой или зубчатой линии, образованной эпидермальными гребешками и отростками базальных клеток. Среди механических факторов, обеспечивающих прочное скрепление эпидермиса с дермой, можно выделить придатки кожи, эпидермальные выросты (гребешки) с соответствующими им сосочками дермы, обусловливающими шиповидный характер взаимосвязи [53, 78, 148].

Область соединения эпидермиса и дермы имеет сложное строение и обозначена как пограничная зона. Она включает плазмолемму базальных клеток и прилегающих к ней части цитоплазмы, собственно базальную мембрану, разделяющий светлый бесструктурный промежуток, а также субэпидермальное сплетение аргирофильных (ретикулярных) волокон, являющихся частью дермы.

Дерма занимает основной объем кожи, отграничена от эпидермиса базальной мембраной и без резкой границы переходит в подкожную жировую клетчатку. Она построена преимущественно из коллагеновых, а также из эластичных и ретикулярных волокон и основного аморфного вещества. В ней содержатся нервы, кровеносные и лимфатические сосуды, потовые и сальные железы, волосяные фолликулы и различные типы клеток, располагающиеся, как правило, в ее верхних отделах. Среди клеток основную массу составляют фибробласты, а также тучные клетки, гистиоциты (макрофаги), меланоциты и лейкоциты. Общепринято подразделение дермы на сосочковый и сетчатый слои, которые не имеют между собой четкой границы.

Сосочковый слой располагается непосредственно под эпидермисом, состоит из рыхлой волокнистой неоформленной соединительной ткани, выполняющей трофическую функцию. Свое название этот слой получил от многочисленных сосочков, вдающихся в эпителий.

Сетчатый слой образован плотной неоформленной соединительной тканью с мощными пучками коллагеновых волокон и сетью эластических волокон. Пучки коллагеновых волокон проходят в основном в двух направлениях: одни из них лежат параллельно поверхности кожи, другие – косо. Вместе они образуют сеть, строение которой определяется функциональной нагрузкой на кожу. Эластические волокна в основном повторяют ход коллагеновых пучков. Ретикулярные волокна встречаются в небольшом количестве.

Они располагаются обычно вокруг кровеносных сосудов и потовых желез. В большинстве участков кожи человека в ее сетчатом слое располагаются кожные железы – потовые и сальные, а также корни волос.

Основное вещество представляет собой гель или золь, присутствует во всех слоях дермы, но преобладает в сосочковом. Оно является многокомпонентной системой, содержащей вещества, поступающие из крови (вода, неорганические ионы, сахара, белки крови), и продукты метаболизма эпидермальных и дермальных клеток (растворимые белки, протеогликаны и гликопротеины). Благодаря высокой вязкости это вещество участвует в скреплении, «цементировании», волокнистых компонентов дермы [148].

Подкожная клетчатка смягчает действие на кожу различных механических факторов. Кроме того, подкожный слой обеспечивает некоторую подвижность кожи по отношению к нижележащим частям, что в значительной мере предохраняет ее от разрывов и других механических повреждений. Наконец, подкожная клетчатка представляет собой наиболее обширное жировое депо организма, а также обеспечивает его терморегуляцию.

1.4.2. Особенности иммуноморфологии кожи Кожа больных АД претерпевает ряд значительных изменений и перестает выполнять присущие ей в норме функции. Нарушается барьерная функция кожи, функции потовых и сальных желез и прочее [143, 144].

Диапазон клинических проявлений атопического дерматита может варьировать от ограниченных отечных эритем до выраженных пузырных и даже некротических изменений, генерализованных эритематозных, папуловезикулезных и везикулезных сыпей, сопровождающихся зудом различной степени.

При АД наблюдаются несколько видов поражений кожи. Острые поражения характеризуются сильным зудом и папулами на гиперемированной коже. Они сопровождаются экскориациями, эрозиями и серозным экссудатом. При подостром дерматите наблюдается покраснение кожи, экскориации и шелушащиеся папулы. Хронический дерматит характеризуется утолщением кожи, лихенификацией и фиброзными папулами. При всех стадиях АД кожа больного сухая [143, 144, 205, 206]. Однако, основными морфологическими элементами на коже больного АД как обязательный признак выступает эритема и лихенификация. Обычно лихенифицированная кожа представляется утолщенной, грубой на ощупь, кожный рисунок резко выражен. Очаги лихенификации имеют застойную окраску, поверхность их сухая, умеренно шелушится. Вследствие зуда участки лихенификации обычно покрыты большим количеством расчесов, геморрагическими корочками. Очаги поражения располагаются симметрично, имеют нечеткие границы и неправильные очертания. Лихенификация развивается первично, вследствие длительного раздражения кожи при расчесах, либо вторично при слиянии папульных элементов [63, 114].

Гистологическая картина редко бывает специфичной, что затрудняет диагностику, однако преобладание того или иного компонента воспаления может служить отправным пунктом для дифференциальной диагностики атопического дерматита с другими заболеваниями кожи.

Морфологическое описание возможных изменений кожи при АД [114, 144, 145]. Кожа больных АД претерпевает некоторые гистологические изменения. При атопическом дерматите воспалительный процесс развивается в эпидермисе и дерме.

Спонгиоз (вид серозного воспаления) – это межклеточный отек в шиповидном слое. Спонгиоз является вторичным, развивающийся при выраженном процессе экссудации в дерме.

Акантоз – усиленное размножение клеток шиповидного слоя в виде тяжей, погруженных более или менее глубоко в дерму.

Гиперкератоз – утолщение рогового слоя без структурных изменений клеток.

Паракератоз – наличие в роговом слое эпидермиса клеток с палочковидными окрашенными ядрами.

Гистологическая картина зависит от остроты и распространенности поражения кожи.

При ограниченном дерматите обнаруживается различной степени акантоз, папилломатоз. Инфильтрация наблюдается лишь в верхней части дермы и состоит из лимфоцитов с примесью эозинофилов и фибробластов, отмечается фиброз. Участки спонгиоза и внутриклеточного отека встречаются редко.

При диффузном АД в свежих очагах поражения наблюдается акантоз, отек дермы и небольшие периваскулярные инфильтраты из лимфоидных клеток с наличием нейтрофильных гранулоцитов. В более старых очагах отмечается гиперкератоз и паракератоз, иногда спонгиоз, но везикуляций как правило нет. В дерме имеет место расширение капилляров с набуханием эндотелия, вокруг них скопления лимфоидных клеток, гистиоцитов и фибробластов [114, 144, 145].

При атопическом дерматите гистологические изменения регистрируются во всех составляющих кожи.

Клетки Лангерганса (КЛ) – субпопуляция дендритных клеток костномозгового происхождения, находящихся в базальном слое эпидермиса и составляющих, по мнению разных авторов, от 2-4% до 3-8% [43, 115]. Клетка имеет 2-5 отростков, проникающих до зернистого слоя и базальной мембраны. Для КЛ весьма характерно наличие особых гранул в форме теннисной ракетки. Из всех эпидермальных клеток они относятся к макрофагально – моноцитарно – гистоцитарной линии и играют центральную роль в инициации иммунного ответа. Это циркулирующие клетки с непродолжительным пребыванием в эпидермисе (примерно 3 недели). Клетки покидают кожу через лимфатические сосуды и мигрируют в лимфатические узлы, где превращаются в дендритные клетки. В эпидермисе человека это единственные клетки, экспрессирующие молекулы HLA-II класса. Основной функцией КЛ является восприятие антигенных сигналов и представление их ТХ2лимфоцитам, одновременно продуцируя ИЛ-1, который является необходимым для запуска иммунного ответа. ТХ2-лимфоциты продуцируют ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-10, ИЛ-13, которые обеспечивают размножение эозинофилов, тучных клеток, базофилов, В-лимфоцитов, продуцирующих в больших количествах IgE и IgG4. [13, 15, 43, 115, 128, 227]. Таким образом, КЛ кожи считаются основными клетками, ответственными за IgE-опосредованное накопление аллергенов в коже и их презентацию Т-клеткам.

Лимфоциты. В коже имеются как В-, так и Т-лимфоциты. Установлено, что лимфоциты осуществляют свои функции в коже не как “фиксированные” клетки, а путем постоянной рециркуляции. В интактном эпидермисе обнаруживают лишь незначительное количество лимфоцитов, которое составляет 0,16% всех клеток эпидермиса. Иммуноморфологическими методами установлено, что Т-лимфоциты составляют 90% всех лимфоцитов кожи и располагаются преимущественно в эпидермисе и верхних слоях дермы, незначительная часть В-лимфоцитов встречается в средних и глубоких слоях дермы [114]. Соотношение СD4/СD8 равно 2:1 [66]. В норме только 1-3% лимфоцитов кожи синтезируют ИЛ-4, тогда как 20-40% образуют ИЛ-2 и ИФН-. При АД резко нарастает количество ТХ2-типа клеток, а соответственно и наработка ИЛ-4. Под влиянием ИЛ-4 тормозится образование ИЛ-2 и баланс ТХ1/ТХ2 смещается в сторону ТХ2 типа [15]. Тропизм лимфоцитов к коже, миграция в нее Т-клеток памяти и их избирательное накопление в местах присутствия антигена обеспечивается при АД особым Т-клеточным антигеном CLA (cutaneous lymphocyte-associated antigen), определяющий их хоуминг и позволяющий участвовать в формировании локальных кожных реакций [66, 82].

Тучные клетки. Располагаются, в основном, в верхних отделах дермы.

Отличительной особенностью этих клеток является наличие многочисленных крупных гранул, окруженных мембраной. Клетки обычно крупные, округлые или овальные, с небольшим плотным ядром и имеют длинные тонкие выросты цитоплазмы [148].

При АД отмечается увеличение количества тучных клеток в дерме, а также повышенная дегрануляция этих клеток. Индуктором дегрануляции тучных клеток в коже больных АД может служить субстанция Р, нейропептид, выделяемый кожными нервами, что объясняет тесную связь между психическим стрессом и кожным воспалением при АД. Кроме участия в механизмах воспаления и зуда, продукты тучных клеток участвуют в регуляции сдвига Т-клеточного ответа при АД в пользу ТХ2-клеток. Тучные клетки являются продуцентами ИЛ-4 и TNF-, которые подавляют наработку ИЛ-2 и ИФН- [82].

Таким образом, кожа является высокоорганизованным периферическим органом иммунной системы и обладает необходимым составом ИКК, кооперирующихся между собой как с помощью комплементарных структур на их поверхности, так и при участии регуляторных цитокинов. Это дает возможность коже осуществлять целый ряд важных для организма физиологических функций.

1.5. Классификация атопического дерматита В настоящее время существует несколько классификаций атопического дерматита. A. Wirter et al. [161] выделили три клинических стадии в зависимости от возраста, времени начала заболевания и течения АД. Если в вышеуказанной классификации представлена в общих чертах эволюция атопического дерматита с возрастом, то в классификации Б.Т. Глухенького и С.А.

Грандо [25], из общей эволюционной картины заболевания, выделены его отдельные варианты развития, имеющие клинически очерченные признаки, позволяющие дифференцировать формы АД. Эта классификация охватывает варианты, встречающиеся у детей и взрослых.

Существует еще и классификация АД по Н.П. Тороповой и О.А. Синявской [126]. Она более подробная и включает в себя варианты атопического дерматита, сочетающиеся с поражением других систем организма.

Также в 1980г. J.Hanitin и G.Rajka предложили диагностические критерии АД: разделив их на 2 группы – обязательные и дополнительные [29, 63, 121].

При характеристике проявлений АД и его тяжести большинство классификаций АД используют текстовое описание симптомов, что существенно затрудняет передачу информации от врача к врачу, объективную оценку эффективности тех или, иных методов лечения и динамический контроль АД.

В настоящее время разработана классификация SCORAD – объективный и стандартный метод оценки поражения кожи при АД [41, 49, 122, 123].

SCORAD включает комплексную оценку трех информационных блоков: распространенность кожных поражений (А), их выраженность, или интенсивность (В) и субъективные симптомы (С):

А. Распространенность оценивается по правилу “девятки”, где за единицу принята площадь ладонной поверхности кисти.

В. Интенсивность клинических проявлений АД оценивается по шести симптомам: эритема, отек/папула, корки/мокнутие, эскориации, лихенификация, сухость кожи. Степень выраженности каждого симптома оценивается по 4-бальной шкале.

С. К субъективным симптомам относят зуд и нарушение сна. Степень выраженности этих симптомов оценивается по 10-бальной шкале.

Расчет индекса SCORAD производится по формуле:

где А – сумма баллов распространенности поражения кожи;

В – сумма баллов интенсивности проявлений симптомов АД;

С – сумма баллов субъективных симптомов.

1.6. Специфическая иммунотерапия больных 1.6.1. Принципы и механизмы специфической иммунотерапии Специфическая гипосенсибилизирующая терапия (специфическая иммунотерапия – СИТ) составляет прерогативу практической аллергологии.

СИТ является единственным примером противоаллергического лечения, воздействующего на все патогенетически значимые звенья аллергического процесса и обладающего длительным профилактическим эффектом после завершения лечебных курсов.

Впервые этот метод был разработан в 1902-1911гг. для лечения поллинозов врачами госпиталя в Лондоне L.Noon и J.Freeman. А уже в 1911г. СИТ была использована в клинической практике для лечения больных аллергией [35].

СИТ является методом патогенетической терапии и его действие направлено на патогенетические звенья аллергического процесса.

СИТ, как известно, состоит во введении в организм больного возрастающих доз аллергена, к которому установлена повышенная чувствительность. Целью данного метода является уменьшение чувствительности к ПЗА, проявляющиеся в уменьшении или в полном отсутствии клинических симптомов при естественной экспозиции аллергена. [31, 35, 95, 101, 129, 130, 142]. Известно множество вариантов выполнения СИТ: классический метод предсезонной гипосенсибилизации; круглогодичная, непрерывная СИТ; ускоренный метод; метод сезонной гипосенсибилизации, молниеносный метод [35, 120, 142].

Целесообразно выделять методы СИТ по способу введения аллергена:

оральные, назальные, ингаляционные, подкожные, внутрикожные, аппликационные (кожа и слизистые), введение электрофорезом и комбинированные.

По применению СИТ может быть общей и местной (регионарной). Общей СИТ является тогда, когда она воздействует через общую систему иммунитета на все ткани и органы, включая шоковые. При местной СИТ аллерген непосредственно контактирует с шоковым органом, оказывая при этом меньшее воздействие на общую систему иммунитета и на организм в целом [101, 142].

Независимо от способа введения и вида аллергена, СИТ начинают с минимальной дозы, определяемой аллергометрическим титрованием. Распространено внутрикожное титрование, при котором определяют минимальное количество аллергена, способного при введении внутрикожно в определенном разведении еще давать аллергическую реакцию, а при последующем разведении – нет. С дозы аллергена, которая первая не вызывает аллергической реакции, обычно начинают специфическое лечение. [101, 142].

Показаниями для проведения СИТ являются:

- невозможность элиминации этиологически-значимого аллергена;

- наличие подтверждения IgE-зависимой гиперчувствительности больного к специфическому аллергену (аллергологический анамнез, кожные пробы, определение общего и специфического IgE).

Существуют противопоказания для проведения СИТ: декомпенсированные сердечно–сосудистые заболевания, заболевания печени, почек, крови;

беременность и период лактации; психические заболевания; острые интеркуррентные инфекции (ангина, грипп и т.д.); злокачественные и доброкачественные новообразования; аутоиммунные заболевания. Перед проведением СИТ осуществляют объективные исследования состояния больного, анализируются дневники и анкеты, проводится контроль окружающих аллергенов [10, 120, 142]. Терапевтический эффект СИТ обусловлен в первую очередь изменениями в иммунном ответе. В общем, основная задача СИТ состоит в переводе организма из категории высокореагирующего на данный аллерген в категорию низкореагирующего, т.е. в коррекции иммунного ответа на конкретный аллерген. Механизмы специфической иммунотерапии до конца не ясны, и, исходя из существующих сведений, можно предположить следующие патогенетические механизмы СИТ [40].

Впервые попытка изучить механизмы СИТ была предпринята в году. В течение длительного периода времени доминирующей теорией иммунологических механизмов СИТ оставалась теория «блокирующих» антител. Эта теория предполагает, что основной механизм СИТ состоит в перестройке иммунного ответа на действие аллергена, заключающейся в образовании так называемых «блокирующих» антител, принадлежащих к IgG и лишенных способности сенсибилизировать ткани, но обладающих аллергенсвязывающей активностью, за счет чего они уменьшают вероятность взаимодействия аллергена с IgE-антителами [34, 40, 81, 120, 142].

В последние годы накоплены сведения, указывающие на то, что СИТ, сопровождающаяся выраженным клиническим улучшением состояния пациентов, характеризуется угнетением вовлечения в аллергическую реакцию тех клеточных единиц, которые опосредуют эффекторную стадию аллергии. Так, в тканях после СИТ уменьшается содержание тучных клеток, угнетается накопление клеток воспаления (эозинофилов, нейтрофилов), тормозится высвобождаемость медиаторов из клеток-мишеней аллергических реакций I типа (тучных клеток, базофилов)[40, 142].

Действие СИТ охватывает также и лимфоидные клетки. Согласно данным современных исследований, терапевтический эффект СИТ обусловлен изменениями в иммунной системе, которые связаны с преимущественным блокированием ТХ2-ответа, а следовательно уменьшением наработки ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-10, ИЛ-13, ответственных за развитие АД. В то же время происходит активация ТХ1-ответа, в результате которой происходит увеличение наработки ИЛ-2 и ИФН-. Итогом подобных изменений в иммунной системе является смещение соотношения ТХ2/ТХ1 в сторону ТХ1-типа [40, 142].

1.6.2. Определение содержания цитокинов ИЛ-2 и ИФН-, ИЛ-2 и ИФН- - являются ключевыми цитокинами для ТХ1-типа.

Цитокины – биологически активные вещества пептидной природы, вырабатываемые клетками иммунной системы и являющиеся одновременно и продуктами жизнедеятельности этой системы, и ее основными регуляторами.

В настоящее время по своим функциональным свойствам цитокины подразделяются на следующие группы:

1. Цитокины – медиаторы естественного иммунитета. К ним относятся интерфероны I типа (ИФН-, ИФН-), фактор некроза опухолей (TNF), интерлейкин 1 (ИЛ-1) и интерлейкин 6 (ИЛ-6).

2. Цитокины, регулирующие рост, дифференцировку и активацию лимфоцитов: интерлейкин 2 (ИЛ-2), интерлейкин 4 (ИЛ-4), трансформирующий фактор роста (TGF-).

3. Цитокины, активирующие эффекторную фазу клеточноопосредованного иммунного ответа: интерферон- (ИФН-), лимфотоксин, интерлейкин-5 (ИЛ-5).

4. Цитокины – стимуляторы гемопоэза: колониестимулирующие факторы, интерлейкин 3 (ИЛ-3) и интерлейкин 7 (ИЛ-7) [91].

Рассмотрим подробно строение и функции ИЛ-2 и ИФН-.

Впервые в 1975г. был описан ИЛ-2. ИЛ-2 синтезируется в виде предшественника, состоящего из 153 аминокислотных остатков. Зрелая секретируемая молекула ИЛ-2 состоит из 133 аминокислотных остатков, с молекулярной массой 15000 Д. ИЛ-2 имеет глобулярное строение. Ген ИЛ-2 человека находится в составе хромосомы 4q [23, 83, 111, 139].

Клетками – продуцентами ИЛ-2 являются активированные Тлимфоциты. Большинство клеток-продуцентов ИЛ-2 у человека принадлежат к популяции СD4+, но СD8+ Т-клетки также способны его продуцировать [23, 111, 154]. 75% активированных СD4+ Т-клеток являются продуцентами ИЛ-2, а среди СD8+ – 15%. В присутствии митогенов обе субпопуляции ТХ экспрессируют рецепторы к ИЛ-2 и пролиферируют при добавлении экзогенного ИЛ-2. ИЛ-2 взаимодействует со специфическими мембранными рецепторами экспрессирующимися на Т0 и В-лимфоцитах, NK-клетках и моноцитах/макрофагах. Рецептор к ИЛ-2 (ИЛ-2R) не только экспрессируется на клеточной поверхности, но и секретируется во внешнюю среду, образуя растворимую форму, способную ингибировать ответ на ИЛ-2, конкурируя за него с мембранным ИЛ-2 R [23, 60].

В настоящее время считается, что рецепторный комплекс ИЛ-2 состоит из трех субъединиц, представляющих собой полипептиды разного размера и обозначаемых как -, -, - цепи. -цепь (СD25) с молекулярной массой 55кД связывает лиганд, а -цепь (СD125) с молекулярной массой 70-75кД и -цепь (СD132) с молекулярной массой 65кД обеспечивают проведение сигнала [23, 111, 139].

ИЛ-2 является основным ростовым фактором для Т-лимфоцитов [23, 83, 111, 139, 182, 200]. Однако, клетками-мишенями для ИЛ-2 могут быть и В-лимфоциты, NK-клетки, моноциты. В Т-лимфоцитах ИЛ-2 стимулирует продукцию самого ИЛ-2 и усиливает цитотоксические свойства, т.е. происходит развитие иммунного ответа в сторону ТХ1-типа, что необходимо для предотвращения гиперреактивности иммунной системы при АД. Активация же ТХ1-типа ведет к повышенной наработке ИЛ-2 и ИФН-, которые подавляют синтез ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-10, что приводит к уменьшению гиперпродукции IgE [36, 76, 111]. В NK-клетках ИЛ-2 стимулирует противоопухолевую активность, в моноцитах – продукцию провоспалительных цитокинов, фагоцитоз и бактерицидность.

ИФН- – это полипептид из 143 остатков аминокислот, мономер. Продуцируется ИФН- Т-лимфоцитами, NK-клетками. Индуктором его синтеза являются АГ и митогены. Рецептор для ИФН-, мембранная молекула СD 119, состоит из - и - цепей. ИФН- – это важнейший цитокин активации макрофагов, стимулирует фагоцитоз, активирует NK-клетки к осуществлению ими цитолиза клеток мишений. Также ИФН- осуществляет широкие иммунорегуляторные функции – повышает и понижает антителообразование, стимулирует реакции клеточного иммунитета, отторжение трансплантантов.

ИФН- способен тормозить эффект ИЛ-4 на В-лимфоциты, что в свою очередь приводит к торможению секреции IgE и экспрессии FCERII (рецептор к IgE низкого сродства) [51, 139, 141].

ИЛ-2 и ИФН- являются характерными цитокинами ТХ1-клеток. При атопическом дерматите наблюдается дефект ТХ1-клеток на количественном и функциональном уровнях, а также преобладание активности ТХ2-клеток [33, 34, 39].

Как известно, действие СИТ охватывает также и лимфоидные клетки.

Данные исследований последних лет подтверждают сведения о том, что СИТ сопровождается угнетением вызванного специфическим аллергеном пролиферативного ответа лимфоидных клеток периферической крови [35]. Торможение аллерген – специфической пролиферации Т-лимфоцитов выявляется на 15-90 день после проведения ускоренного курса СИТ. В эти же сроки уменьшается число клеток, экспрессирующих мРНК ИФН-, спонтанно и при стимуляции аллергеном in vitro, у больных до СИТ оказывается меньше, чем у контрольных лиц. После СИТ спонтанная экспрессия мРНК ИФН- возрастает только к 90 дню. В итоге к 90 дню наработка ИФН- оказывается сходной с таковой у практически здоровых лиц [158]. Все это свидетельствует о перестройке клеточного и цитокинового ответа на аллергенную нагрузку в ходе СИТ. Эти результаты принципиально совпадают с ранее полученными сведениями о переключении в ходе СИТ ТХ2-ответа на ТХ1-ответ. Не менее чем у 50% лиц с успешной СИТ возникало существенное увеличение экспрессии мРНК ИЛ-2, т.е. маркера, характерного для ТХ1-клеток, участвующих в запуске и поддержании продукции IgG-антител, которые относятся к блокирующим антителам [35].

Таким образом, определение уровня ИЛ-2 и ИФН- в сыворотке крови и культуральной жидкости можно использовать в качестве критерия оценки эффективности СИТ и активности аллергического процесса у пациентов с атопическим дерматитом.

2.1. Характеристика объекта клинико-иммунологических исследований Под наблюдением находились 81 человек (мужчины и женщины) в возрасте от 15 до 50 лет с атопическим дерматитом и 30 здоровых добровольцев в возрасте от 20 до 22 лет. Все пациенты находились на стационарном лечении и под диспансерным наблюдением в ООО «Центре иммунопатологии» г.Томска (2000-2002 гг.). Диагноз устанавливался согласно общепринятым критериям патологии (жалобы, анамнез данного заболевания, аллергологические пробы, отягощенный наследственный анамнез).

Контрольную группу составили 30 студентов медико-биологического факультета СибГМУ. Они не имели отягощенного семейного, аллергологического и иммунологического анамнеза. При проведении аллергологического тестирования у лиц, вошедших в контрольную группу, не выявлено сенсибилизации к бытовым, эпидермальным, пыльцевым и пищевым аллергенам.

Показатели иммунитета соответствовали возрастной и региональной норме.

Иммунологическое обследование пациентов с АД проводили в период обострения, ремиссии до проведения специфической иммунотерапии ПЗА согласно спектру сенсибилизации, и на этапах проведения СИТ (на 30 сутки после введения максимальной дозы причинно-значимого аллергена). Данные распределения пациентов с АД по полу и длительности заболевания представлены в табл. 1.

Распределение пациентов с атопическим дерматитом по длительности заболевания и полу Как видно из табл. 1 АД был у 71,6% женщин и только у 28,4% мужчин.

В качестве основных биологических материалов для исследования служили венозная кровь, культуральная жидкость, полученная при культивировании лимфоцитов периферической крови в реакции бласттрансформации (РБТЛ) на третий день инкубации, биоптаты кожи.

Иммунологические исследования включали расширенный набор тестов I уровня, а также некоторые методы II уровня. Проводили оценку сывороточных показателей (IgM, IgG, IgA, IgE, ЦИК), содержания Т-лимфоцитов (СD3) и В-лимфоцитов (СD22). Определяли уровни некоторых субпопуляций Т-лимфоцитов (СD4, СD8), а также костимулирующей молекулы СD28. Проводили НСТ-тест с нейтрофилами в спонтанном и стимулированном вариантах.

Были исследованы показатели РБТЛ в двух модификациях (спонтанной, стимулированной ФГА) с определением содержания ИЛ-2 и ИФН- в культуральной жидкости.

Оценивали изменения в биоптатах кожи.

Достоверность различий полученных данных оценивали при помощи критериев Манна-Уитни и Х-критерия Вандер-Вардена для связанных групп.

Корреляцию признаков оценивали с помощью коэффициента корреляции рангов по Спирмену [68, 117].

2.2.1. Гистологическое исследование кожи Получение материала: Нами было исследовано 20 биоптатов от 20 пациентов с АД, из них 16 женщин и 4 мужчины, и 10 биоптатов от 10 здоровых добровольцев (5 женщин и 5 мужчин). Возраст пациентов и здоровых добровольцев колебался от 20 до 22 лет. Материал для исследования получали путем введения в верхнюю часть предплечья пациентам с АД и здоровым добровольцам подкожно 0,5мл 0,5% новокаина (до появления «лимонной корочки»), а затем через 10 минут проводили иссечение участка кожи 5х5 мм при помощи глазных ножниц.

Получение гистологических срезов.

Гистологическую обработку исследуемого материала проводили по стандартной методике, которая включала в себя фиксацию биоптатов в 10% растворе нейтрального формалина в течение 24 ч; промывание в проточной воде в течение 24 ч; дегидратацию биоптатов в этаноле восходящей концентрации по 24 ч; последовательное пропитывание материала в двух порциях хлороформа по 12 ч в каждой; пропитывание материала в насыщенном растворе парафина в хлороформе в течение 7 суток при 370С; пропитывание материала первой порцией парафина при 370С; заливку материала второй порцией парафина при 560С; вырезание парафиновых блоков и их наклеивание на деревянные заготовки. Затем приготавливали срезы толщиной 5-7мкм при помощи санного микротома МС-2. Для дальнейшего гистологического исследования полученные срезы депарафинизировали и «доводили до воды», а затем окрашивали.

Определение толщины слоев эпидермиса. Депарафинированные срезы окрашивали гематоксилином Эрлиха и 0,1% водным раствором эозина по стандартной методике [77, 109]. На окрашенных срезах проводили измерение толщины слоев эпидермиса при помощи объект-микрометра в 5 полях зрения каждого среза (увеличение х630) [1].

Исследование морфологии тучных клеток и эозинофилов в эпидермисе проводили с помощью сочетанной окраски гистологических препаратов основным коричневым и прочным зеленым по методу В.Ю. Голофеевского, С.Г. Щербака [26]. Депарафинированные срезы окрашивали 0,5-1% раствором основного коричневого на спиртово-солянокислом растворе (4:1) при 370С в течение 40-60 минут и обезвоживали в 70% этаноле. Далее окрашивали 0,1% спиртовым раствором прочного зеленого (рН 8,1-8,2) при 22-260С в течение 15-25 минут. Промывали дистиллированной водой и проводили дегидратацию 96% этиловым спиртом в течение 2-3 минут. Просветляли ксилолом в течение 10-15 минут и заключали в бальзам.

Тучные клетки представляли собой крупные клетки с коричневой зернистостью (гранулами) в цитоплазме. Эозинофилы окрашивались в зеленый цвет и имели характерную морфологию со специфической фиолетовой зернистостью в цитоплазме. Подсчитывали эозинофилы и тучные клетки в полях зрения (увеличение х630). Проводили перерасчет на площадь среза в мм2. В популяции тучных клеток определяли количество недегранулированных клеток, частично дегранулированных и клеток с единичными гранулами.

Подсчет митозов в базальном слое эпидермиса. Депарафинированные срезы окрашивали по А.Браше в модификации G.Kurnik [150]. Срезы окрашивали в смеси метилового зеленого и пиронина при 18-240С в течение минут. Смесь готовили предварительно: 12,5мл 2% пиронина GS, 7,5мл 2% метилового зеленого и 30мл дистиллированной воды. Затем подсушивали фильтровальной бумагой, с дальнейшей дифференцировкой срезов в двух порциях бутанола по 5 минут. После чего гистологические срезы помещали по очереди в три порции ксилола по 5 минут, затем заключали в бальзам.

Учет результатов проводили при помощи светового микроскопа (увеличение х630). Подсчет митозов осуществляли в базальном слое эпидермиса на клеток.

Исследование количества В-лимфоцитов и плазматических клеток в эпидермисе проводилось в гистологических срезах, окрашенных по А.Браше [150]. Подсчет проводили в 10 полях зрения (увеличение х630), с последующим перерасчетом на площадь среза в мм2.

В-лимфоциты имели розовую цитоплазму и сине-зеленое ядро.

2.2.2. Определение сывороточных показателей, параметров лимфоцитарной системы и реактивности нейтрофилов Определение иммуноглобулинов методом радиальной иммунодиффузии в геле по G.Mancini [49]. Содержание иммуноглобулинов классов M, G, A определяли методом радиальной иммунодиффузии в агаре “Difko” (Германия) с использованием моноспецифических антисывороток к Fс-фрагментам IgM, G, A.

Использовали реактивы НИИВС им. Мечникова (г. Москва) и НИИЭМ (г. Горький).

Определение содержания циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) [69,80]. Содержание общей фракции ЦИК определяли методом иммунопреципитации в 3,75% растворе полиэтиленгликоля 6000 (“Serva”) в баратном буфере pH 8,4.

Определение содержания общего IgE [92]. Содержание общего IgE определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием набора НИИВС (г. Ставрополь). Используемый твердофазный метод иммуноанализа основан на принципе “сэндвича”. Анализ проводили в две стадии. На первой калибровочные пробы с известной концентрацией IgE и исследуемые образцы инкубировали в лунках стрипированного планшета с иммобилизованными моноклональными антителами (МКАТ) к IgE. Затем планшет отмывали. На второй стадии связавшийся в лунках IgE обрабатывали коньюгатом МКАТ к IgE с пероксидазой (коньюгат МКАТ и иммобилизованные в лунках планшета МКАТ специфичны к разным участкам молекулы IgE). Затем отмывали избыток коньюгата. Образовавшиеся иммунные комплексы “иммобилизованные МКАТ – IgE-коньюгат” выявляли ферментативной реакцией пероксидазы с перекисью водорода в присутствии хромогена (ортофенилендиамина). Интенсивность окраски хромогена пропорциональна концентрации IgE в анализируемом образце.

После остановки пероксидазной реакции стоп-реагентом (2н. серной кислотой) результаты учитывали фотометрически.

НСТ-тест [57, 69, 80]. В основе НСТ-теста – бессубстратное восстановление нитросинего тетразолия (НСТ) активными формами кислорода (свободные радикалы и H2O2). Взаимодействуя с активированными метаболитами нейтрофилов, НСТ восстанавливается в диформазан, который в виде грубодисперсных темно-синих гранул откладывается внутри или на поверхности клеток. НСТ-тест проводили в двух вариантах: спонтанном и стимулированном.

В качестве стимулятора НСТ-теста использовали раствор пирогенала (25МПД/мл).

Определение СD3,4,8,22,28 лимфоцитов с помощью моноклональных антител в лимфоцитотоксическом тесте [49]. Метод основан на способности мышиных моноклональных антител и комплемента оказывать цитотоксическое воздействие на соответствующие субпопуляции лимфоцитов, что выявляется с помощью красителя. Получение суспензии лимфоцитов: периферическую венозную кровь в количестве 5-6 мл смешивали с 1 мл гепарина ( ЕД/мл). В центрифужную пробирку наливали 2-3 мл смеси фиколлверографин: 12 частей фиколла + 5 частей 33,9% верографина (=1, г/см3). На раствор фиколл-верографин наслаивали 4 мл цельной крови пастеровской пипеткой в соотношении 1:2, 1:4. Центрифугировали 30-40 мин при 1500-1800 об/мин. Слой лимфоцитов в виде полосы белого цвета над сепарирующим раствором удаляли пастеровской пипеткой и трижды отмывали средой 199 или раствором Хенкса по 10 мин при 1000 об/мин. К осадку добавляли 1 мл среды и ресуспендировали. Устанавливали плотность суспензии, равную 2х106 кл/мл. Определение субпопуляции лимфоцитов: полученную лимфовзвесь в количестве 40 мкл смешивали с 10 мкл моноклональных антител (“Диагнотекс”, “Сорбент”, г.Москва) в разведении 1:200 и инкубировали 40 мин при комнатной температуре, центрифугировали при 2000 об/мин в течение 5 мин. Затем добавляли 50 мкл комплемента (источник комплемента – сыворотка не менее 4 кроликов) и инкубировали 1,5 часа при комнатной температуре. После окончания инкубации добавляли 20 мкл 2% эозина, делали препарат “раздавленная капля” и подсчитывали 100 клеток, при этом определяли процент окрашенных клеток (мёртвых).

2.2.3. Постановка реакции бласттрансформации лимфоцитов [17, 99, 113] Принцип метода: под влиянием неспецифических и специфических стимулов лимфоциты превращаются в бласты - большие пиронинофильные клетки, способные к пролиферации и дальнейшей дифференцировке, что приводит к увеличению в лимфоидной ткани количества реагирующих клеток. Это явление называют бласттрансформацией, которая постоянно наблюдается в лимфоидных тканях в результате антигенной стимуляции. ФГА вызывает трансформацию Т-лимфоцитов в бласты в культуре клеток.

В стерильную пробирку наливали 0,5 мл раствора гепарина, содержащего 50 ЕД/мл. Кровь брали из вены в количестве 2 мл. Подготовка питательной среды. Стерильно во флакон со средой 199 вводили растворы пенициллина и стрептомицина из расчета 100 Ед/мл каждого антибиотика. Флакон встряхивали и помещали в холодильник. Разведение ФГА. ФГА использовали фирмы “Difko” (Германия) в концентрации 0,1 мг/мл. Постановка реакции. В стерильные флаконы наливали по 2 мл среды 199 с антибиотиком.

Готовили 2-3 флакона спонтанной РБТЛ, 2-3 флакона с ФГА. Во все флаконы вносили по 0,2 мл крови. Флаконы помещали на 3 суток в термостат при 370С. Каждый день флаконы встряхивали. Затем содержимое флакона переливали в центрифужную пробирку и центрифугировали 5 мин. при об/мин. Супернатант замораживали для дальнейшего определения цитокинов, осадок ресуспензировали воздухом и готовили по 2 мазка на каждый флакон. Мазки фиксировали, окрашивали азур-эозином по методу Романовского. Учет реакции бласттрансформации лимфоцитов. Мазки микроскопировали под иммерсионным объективом 90. Подсчет процента бласттрансформации лимфоцитов производили следующим образом: на общее количество лимфоцитов (100 клеток) подсчитывали количество средних лимфоцитов и бластов. Результат РБТЛ выражали в процентах бласстрансформации.

Реакция была использована в следующих модификациях: РБТЛ спонтанная;

РБТЛ, стимулированная ФГА.

2.2.4. Определение содержания ИЛ-2 и ИФН- [49, 92] Принцип метода: Использовали наборы ProConIl-2, ProConINF- (г. С.Петербург) для измерения содержания ИФН- и ИЛ-2 человека в сыворотке и супернатантах. Метод основан на твердофазном иммуноферментном анализе с применением пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента. Один тип антител иммобилизировали на внутренних поверхностях ячеек планшетов для микротитрования. Другой тип моноклональных антител к независимому эпитопу молекулы ИЛ-2 (ИФН-) находился в наборе в виде конъюгата с биотином. Индикаторным компонентом являлся конъюгат пероксидазы хрена со стрептавидином, имеющим очень высокое сродство к биотину.

Порядок работы. Дважды промывали лунки буфером В для промывки по 300 мкл в каждую лунку. В ячейки планшета вносили по 100 мкл стандартов ИФН-, ИЛ-2. В оставшиеся ячейки микропланшета вносили по 50 мкл буфера В и исследуемые образцы в объеме 50 мкл. Инкубировали 1,5 часа при температуре +18-+200С. Удаляли жидкость из ячеек и трижды промывали их буфером В (300 мкл на 1 ячейку). Вносили в каждую лунку по 10 мкл раствора вторых антител. Инкубировали 1,5 часа при температуре +18-+200С.

Трижды промывали ячейки буфером В. Вносили по 100 мкл раствора коньюгата стрептавидина с пероксидазой хрена в каждую ячейку микропланшета.

Инкубировали 1 час при температуре +18-+200С. За 10-15 мин до окончания инкубации приготовили раствор субстрата с красителем. Трижды промывали ячейки буфером В. Дважды промывали ячейки планшета струей дистиллированной воды. Вносили во все лунки по 100 мкл раствора субстрата с красителем. Инкубировали стрипы 5-10 минут при комнатной температуре в защищенном от прямых солнечных лучей месте на шейкере. Наблюдали развитие голубой окраски. Остановили реакцию добавлением 50 мкл раствора серной кислоты в каждую лунку. Производили учет результатов с использованием ручного фотометра для микропланшетов при длине волны 450 нм, устанавливая нулевое поглощение по лунке со стандартом 0. Строили калибровочную кривую “оптическая плотность/концентрация”, пользуясь данными по концентрациям, указанным для растворов стандартов. Определяли графически концентрацию ИЛ-2 (ИФН-) в образцах.

Глава 3. Гистологическая оценка состояния кожи у пациентов Все пациенты с атопическим дерматитом находились в состоянии ремиссии и были разделены нами на 2 группы:

1. В первую группу вошли 11 пациентов с атопическим дерматитом (из них 9 женщин и 2 мужчин), у которых воспалительный процесс локализовался и визуализировался далеко от места взятия биоптата (лицо, шея, живот, спина), или вообще никак не проявлялся на коже на момент исследования.

2. Вторую группу составили пациенты, у которых иссечение кожи проводилось из участка, близко расположенного к очагу хронического воспалительного процесса. Эту группу составили 9 человек (из них 6 женщин и мужчин). У всех этих пациентов отмечались очаги лихенификации в локтевых сгибах и подколенных ямках. Лихенифицированная кожа была утолщенной, грубой на ощупь, кожный рисунок был резко выражен. Поверхность очагов лихенификации была сухая.

На срезах, окрашенных гематоксилином-эозином, мы проводили измерение толщины слоев эпидермиса при помощи объект-микрометра [1] в 5 полях зрения каждого среза (увеличение х630).

Исследование морфологии тучных клеток и эозинофилов в эпидермисе осуществляли с помощью сочетанной окраски гистологических препаратов основным коричневым и прочным зеленым по методу В.Ю. Голофеевского, С.Г. Щербака [26]. Подсчитывали эозинофилы и тучные клетки в 10 полях зрения (увеличение х 630). Проводили перерасчет на площадь среза в мм2. В популяции тучных клеток определяли количество недегранулированных клеток, частично дегранулированных и клеток с единичными гранулами (дегранулированных).

На срезах, окрашенных по А.Браше [150], производили подсчет Влимфоцитов и плазматических клеток в 10 полях зрения (увеличение х630), с последующим перерасчетом на площадь среза в мм2. Подсчет количества митозов в клетках базального слоя эпидермиса проводили на 1000 клеток слоя.

Результаты измерения толщины слоев эпидермиса представлены в табл. 2. Нами выявлены достоверное (р< 0,05) увеличение толщины рогового