ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ

УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

КУРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

На правах рукописи

СОРОКИН АЛЕКСАНДР ВЛАДИМИРОВИЧ

ВЛИЯНИЕ ОМЕГА-3 ПОЛИНЕНАСЫЩЕННЫХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ

И АЦЕТИЛСАЛИЦИЛОВОЙ КИСЛОТЫ НА ПОКАЗАТЕЛИ

ВОСПАЛЕНИЯ И АТЕРОГЕНЕЗ

(ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-КЛИНИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

14.01.05 – кардиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научные руководители доктор медицинских наук, профессор С.А. Прибылов доктор медицинских наук, профессор В.А. Лазаренко Курск

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ ………………………………………………………………… Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ………………………………………….

1.1. Омега-3 жирные кислоты в системе сердечно-лёгочной патологии… 1.2. Механизмы действия омега-3 жирных кислот………………………. Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ………………. Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ...

3.1. Экспериментальные диеты и их влияние на вес тела………………… 3.2. Влияние экспериментальных диет на липиды плазмы и липопротеины… 3.3. Эффекты экспериментальных диет на развитие атеросклероза……… 3.4. Воздействие экспериментальных диет на васкулогенез………………. 3.5. Эффекты экспериментальных диет на воспаление……………………. 3.6. Эффекты экспериментальных диет на тканевую экспрессию генов…. 3.7. Изменение уровней циркулирующего PCSK9 на фоне экспериментального лечения……………………………………………………………. 3.8. Влияние экспериментальных диет на липидные медиаторы………… Глава 4. РЕЗУЛЬТАТЫ КЛИНИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ………… 4.1. Клиническая оценка эффектов омега-3 ПНЖК в комбинации аспирина и статина……………………………………………………………….. 4.2. Особенности проведения ЧКВ у больных ИБС в сочетании с ХОБЛ Глава 5. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ……………… ВЫВОДЫ…………………………………………………………………….. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ……………………………………. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ…………………………………………………. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ……………………………………………………

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы:

Атеросклероз является ключевым патофизиологическим процессом, приводящим к развитию сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ), которые остаются лидирующими причинами смерти, инвалидности и основными статьями расхода здравоохранения РФ [1] и США [191]. Доказанным фактом является то, что повышенный уровень триглицеридов (ТГ) и провоспалительных цитокинов имеет прочную взаимосвязь с развитием ССЗ [138]. Основываясь на множестве, как животных, так и клинических моделей длинноцепочечные n-3 полиненасыщенные жирные кислоты (n-3 ПНЖК/PUFA или -3 жирные кислоты), содержащиеся в рыбе, такие как эйкозапентаеновая (ЭПК) и докозагексаеновая кислоты (ДГК), также известные как омега-3 жирные кислоты, считаются атеропротективными молекулами за счёт мощного триглицеридснижающего и противовоспалительного эффектов [158, 125]. Ацетилсалициловая кислота (АСК), лучше известная как аспирин, является мощным ингибитором циклооксигеназы (ЦОГ)-1, 2 и положительно влияет на предотвращение сердечно-сосудистых событий. Данный эффект главным образом приписывается её антитромбоцитарным свойствам [16], но возможно объясняется и общими противовоспалительными качествами АСК [187].

Недавние клинические трайалы показали благоприятное воздействие комбинированной терапии омега-3 ЖК и АСК в снижении уровня воспалительных цитокинов и возможность синергичного эффекта по уменьшению риска ССЗ [177].

Хотя имеется общепризнанное экспертное согласие о положительном воздействии омега-3 ЖК вместе с АСК на липиды и противовоспалительные агенты, детальное объяснение механизмов, лежащих в основе комбинации описываемых веществ, до сих пор остаётся не известным и имеет противоречивые результаты [79, 39]. Ряд учёных полагает, что терапевтическое воздействие омега-3 ЖК на ССЗ отличается от снижения ТГ плазмы и возможно связано с их участием в воспалительном ответе за счёт липидных медиаторов [41]. Одним из предполагаемых механизмов, описывающих синергизм лечения АСК с омега-3 ЖК, является способность изменять генерирование специализированных проразрешающих медиаторов (SPM), таких как резолвины, протектины и их аспиринтриггерные формы [156], образующиеся из омега-3 ПНЖК. SPM являются ключевыми молекулами в стадии разрешения воспалительного процесса и возможно также обладают антиатеросклеротическими качествами [110]. Ацетилирование ЦОГ-2 АСК приводит к ингибированию формирования простагландинов, однако продукция 15R-HETE из арахидоновой кислоты (AA) не прекращается [38]. Дальнейшая конверсия 15RHETE в лейкоцитах может привести к образованию аспиринтриггерных липоксинов (ATL), обладающих мощными противовоспалительными эффектами [38]. Таким образом, эндогенный биосинтез и метаболизм SPM из омега-3 ЖК может меняться в присутствии АСК, что в дальнейшем способно значимо повлиять на атерогенез модифицируя воспалительный ответ.

Цель исследования: изучить атеропротективные и противовоспалительные эффекты терапевтического приёма омега-3 ПНЖК как самостоятельно, так и в комбинации с ацетилсалициловой кислотой в экспериментально-клиническом исследовании.

Задачи исследования:

1. Определить влияние омега-3 ПНЖК, а именно ЭПК и ДГК, а также ацетилсалициловой кислоты, на систему воспаления в период 13 недель лечения apoE-KO мышей специально сформулированными экспериментальными диетами путём диагностики уровней циркулирующих цитокинов плазмы, активности ЦОГ-1,2, тканевой экспрессии генов в печени; а также анализа метабололипидома лёгких, селезёнки и аорты с помощью жидкостной хроматографии-тандем масс спектрометрии.

2. Провести анализ степени атеросклеротического поражения исследуемых групп apoE-KO мышей по данным изменения липидного спектра плазмы, морфометрического и иммуногистохимического анализа аорты и её ветвей, клеточных эссе неоваскулогенеза и миграционной активности, а также методами поточной цитофлюорометрии и тканевой экспрессии генов в аорте.

3. Оценить эффективность комбинирования омега-3 ПНЖК (Омакор, Abbott) со стандартной медикаментозной терапией по результатам лабораторноклинического анализа у больных с сочетанием ИБС и ХОБЛ.

4. Проанализировать влияние сочетанного течения ИБС и ХОБЛ на коронарное русло в клиническом исследовании в рамках экспериментально изучаемой концепции воспаления и атерогенеза.

Новизна исследования:

Впервые в проведённом эксперименте для моделирования атеросклероза у apoE-KO мышей использовались специально сформулированные диеты, имеющие низкое содержание холестерина и нормализованные по отношению n-3/n-6, что является важным аспектом в дальнейшем изучении как омега-3 ПНЖК, так и продуктов их метаболизма. Впервые была оценена тканевая вариабельность маркёров АК, ЭПК и ДГК и предположена их ассоциация с экспрессией соответствующих таргетных генов. Найденные вариации сопровождались интересными новыми данными по механизмам регуляции PCSK9, что является важным аспектом в планировании последующих как экспериментальных, так и клинических исследований. Кроме того, наши результаты показали как независимые, так и комбинированные с аспирином противовоспалительные свойства ЭПК и ДГК в клинических условиях у пациентов с сочетанным течением ИБС и ХОБЛ. Полученные экспериментально-клинические результаты объясняют возможность комбинации омега-3 ПНЖК со стандартной медикаментозной терапией у пациентов, перенесших хирургическую эндоваскулярную коррекцию.

Личный вклад автора:

Автору принадлежит ведущая роль в моделировании и реализации исследования. Им проанализированы зарубежные и отечественные источники по теме диссертации, получены и оценены результаты исследования. В работах, выполненных в соавторстве, использованы результаты исследований с долей личного участия автора 90% с планированием и проведением in vivo и in vitro частей эксперимента, а именно: самостоятельное препарирование и реализация хирургических этапов применённой apoE-KO модели, проведение и статистическая обработка всех частей эксперимента, за исключением масс-спектрометрического анализа, выполненного лабораторией партнёров. Автором самостоятельно проведен набора больных, разделение их на рандомизированные группы, разработка дизайна исследования, осуществление клинических наблюдений и статистическая обработка клинических результатов.

Практическая значимость:

Выявленный эффект потенцирования антиатерогенного влияния ЭПК+ДГК в комбинации с аспирином, в частности снижение циркулирующего уровня PCSK9, должен применяться в клинической практике для лечения атеросклерозассоциированных состояний. Более того, показанное положительное воздействие эквивалентных терапевтическим концентраций омега-3 ПНЖК на выработку продуктов метаболизма АК, ЭПК и ДГК необходимо учитывать при лечении состояний, имеющих хронический воспалительный компонент. Противовоспалительный эффект комбинации омега-3 ПНЖК со стандартной медикаментозной терапией у пациентов с ИБС и ХОБЛ следует шире применять в клинической практике, в частности у пациентов, перенесших хирургическую эндоваскулярную коррекцию.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Впервые было показано, что диетическое добавление омега-3 жирных кислот существенно изменяет липидный профиль плазмы (снижение ОХ в 1.6 раза, верхней границы нормы; хроническая почечная недостаточность (креатинин плазмы>177 мкмоль/л); миопатия, гиперчувствительность к ингибиторам ГМГКоА-редуктазы; известная чувствительность или аллергия к рыбным продуктам.

Группы контроля и сравнения были сопоставимы по основным стратификационным категориям: возраст, пол, длительность и тяжесть заболевания. В открытом проспективном исследовании пациенты рандомизировались на 2 группы:

группа контроля – 30 пациентов с ИБС, острый инфаркт миокарда и ХОБЛ средней степени тяжести в сочетании c АГ 1-2 степени, получавших ежедневно 20 мг розувастатина (Мертенил, Gedeon Richter) + 75 мг ацетилсалициловой кислоты (Кардиомагнил, Takeda) в дополнение к базисной терапии и группа сравнения – 30 пациентов с ИБС, острый инфаркт миокарда и ХОБЛ средней степени тяжести в сочетании c АГ 1-2 степени, получавших ежедневно 20 мг розувастатина (Мертенил, Gedeon Richter) + 2 г омега-3 ПНЖК (Омакор, Abbott) + 75 мг ацетилсалициловой кислоты (Кардиомагнил, Takeda) в дополнение к базисной терапии. Базисная терапия ИБС, острый инфаркт миокарда, перенесенная хирургическая эндоваскулярная коррекция осуществлялась согласно принятой формулярной системе и включала: двойную антиагрегантную поддержку (клопидогрель мг/сут.), -адреноблокаторы (бисопролол 5-10 мг/сут.), ингибитор ангиотензинпревращающего фермента (рамиприл 5-10 мг/сут.). Базисная терапия ХОБЛ проводилась согласно принятым стандартам и включала ингаляции 0.5 мл беродуала 2 раза/сут., амброксола 15 мг 2-3 раза/сут. через небулайзер, сопутствующей антибиотикотерапии проведено не было. Характеристика клинических групп представлена в Таблице 2. Результаты скрининга позволили включить в исследование 60 пациентов, получающих описанное лечение в течение 3 месяцев, исключая госпитальный этап. Диагноз ИБС, острый инфаркт миокарда устанавливался в соответствии с рекомендациями ВНОК (2009 г.) и МКБ-10 с учётом клиниколабораторных данных, а также результатов ЭКГ, Эхо-КГ сердца и коронароангиографии. Верификация диагноза ХОБЛ проводилась в соответствии с положениями “Глобальной стратегии диагностики, лечения и профилактики хронической обструктивной болезни лёгких” (Global Strategy For The Diagnosis, Management, And Prevention Of Chronic Obstructive Pulmonary Disease, updated 2010) [169] по результатам клинических, рентгенологических, функциональных и лабораторных методов исследования.

Клинические исследования проводились общепринятыми методами, включавшими физикальный и лабораторно-инструментальный анализ. Клинические характеристики были представлены данными анамнеза, жалоб, частоты сердечных сокращений (ЧСС), артериального давления (АД), частоты дыхания (ЧД), аускультативной картиной сердца и лёгких. Общеклиническое обследование включало: ЭКГ, Эхо-КГ, Тредмил-тест. После получения информированного согласия, всем пациентам было предложено заполнить специально разработанную анкету, включавшую опросники по симптомам, статусу курения и истории болезни.

Таблица 2. Сравнение исследуемых групп по демографическим показателям, сопутствующей патологии, клиническим симптомам, липидному профилю, терапии и спирометрии в начале исследования

ГРУППА ГРУППА

Текущее курение, n (%) ное вмешательство, n (%) Признаки/симптомы Липидный профиль Сокращения: ОФВ1 – объём форсированного выдоха за 1 секунду, ЛПНП – липопротеины низкой плотности, ЛПВП – липопротеины высокой плотности, ТГ – триглицериды, ± SEM – стандартное отклонение.

Далее проводилось физикальное обследование пациентов, с верификацией диагноза ХОБЛ по результатам портативной спирометрии (MicroLoop Spirometer, Care Fusion, United Kingdom) c оригинальным программным комплексом. Спирометрическое исследование проводилось согласно принятым стандартам, за 1 час до и в момент обследования пациентам не рекомендовалось пользоваться 2агонистами и курить. Результаты спирометрии интерпретировались в сравнении с должными величинами, рассчитанными по формулам Европейского Сообщества Стали и Угля (1993 г.) [108]. Оценка степени влияния ХОБЛ на пациента проводилась согласно опроснику больницы Святого Георгия, SGRQ (St. George’s University of London, UK). Подсчёт и интерпретация результатов осуществлялись согласно официальному Excel калькулятору SGRQ по ранее принятой методике [9, 66]. Анализ качества жизни пациентов проводился согласно опроснику SF-36, переведённому на русский язык и апробированному «Институтом клиникофармакологических исследований» (г. Санкт-Петербург). Подсчёт баллов и интерпретация получены из адаптированного Excel калькулятора SF-36.

Забор венозной крови осуществлялся после 12 ч голодания в начале исследования и через 3 месяца. Комплаенс лечения контролировался по средствам индивидуального телефонного опроса. Оценка липидного профиля, глюкозы, креатинина и аланинаминотрансферазы (АЛТ) проводилась согласно стандартным лабораторным методам в начале и конце исследования. Образцы крови в дальнейшем центрифугировались и направлялись на оценку маркёров воспаления, таких