На правах рукописи
ВАРКЕНТИН Андрей Владимирович
ПОСТВАКЦИНАЛЬНЫЙ ИММУНИТЕТ К ГРИППУ У РАЗНЫХ ВИДОВ
ДОМАШНИХ ПТИЦ
06.02.02 «Ветеринарная микробиология, вирусология,
эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология»
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук
Владимир – 2011 2
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных»
(ФГБУ «ВНИИЗЖ»), г. Владимир
Научный руководитель – доктор ветеринарных наук Ирза Виктор Николаевич
Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор Мищенко Владимир Александрович ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», ФГБУ «ВНИИЗЖ»
г. Владимир доктор ветеринарных наук, профессор Кушнир Анатолий Тимофеевич Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии), г. Покров ФГБУ «Всероссийский государственный
Ведущая организация – Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» ФГБУ «ВГНКИ», г. Москва
Защита диссертации состоится «04» октября 2011 г. в 1000 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 220.015.01 при ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» по адресу: 600901, г. Владимир, мкр. Юрьевец, ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».
С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке и на сайте диссертационного совета Д 220.015.01 при ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»: http//www.arriah.ru.
Автореферат разослан «»20 г.
Ученый секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций, доцент А.П. Пономарёв
1.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Грипп птиц (ГП) – высококонтагиозная особо опасная зооантропонозная болезнь. Заболевание наносит большой экономический ущерб, связанный с гибелью и уничтожением птицы, затратами на проведение ветеринарносанитарных мероприятий, а также представляет опасность для человека В.А.
Бакулин, 2006.
В Российской Федерации высокопатогенный грипп птиц (ВПГП) не регистрировали с 1968г. по 2005г., и страна считалась благополучной по этому заболеванию.
Низкопатогенные вирусы неоднократно выявляли в разные годы среди дикой перелётной птицы на территории страны. В 2005г. в РФ впервые зарегистрирован грипп птиц, вызванный вирусом гриппа птиц (ВГП) H5N1Н.А. Власов, 2006.
Вакцинацию в составе комплекса мер борьбы с ВПГП применяют в некоторых странах I.Capua, 2004; Н. Chen, 2008-2009; I.H. Brown, 2007; L.D. Sims, 2007.
Обычно для этих целей используют инактивированные и/или векторные вакцины, экспрессирующие ген гемагглютинина Yu. Kangzhen, 2007; E. Spackman, 2008.
В РФ для предотвращения распространения и проникновения вируса H5N1 в птицеводческие предприятия с 2006г. применяется стратегия вакцинации домашних птиц разных видов в зонах повышенного риска, примыкающих к местам массовых скоплений диких перелетных водоплавающих птиц Н. А. Власов, 2006.
В 2005г. в ФГУ «ВНИИЗЖ» по заданию Россельхознадзора была разработана вакцина против гриппа птиц инактивированная эмульгированная из штамма ВГП H5N1.
Серийное производство препарата было организовано в ОАО «ПЗБ», и в 2006г. создан его необходимый резерв Д.С. Сурнев, 2007. Однако до выпуска первой серии вакцины грипп распространился в 8 субъектах РФ. Особенно тревожная ситуация сложилась в Южном Федеральном округе из-за проникновения вируса в промышленные предприятия, где погибло и было уничтожено более 1,5 млн. кур А.М. Смирнов, 2007.
В ФГУ «ВНИИЗЖ» были проведены испытания антигенной и иммуногенной активности вакцины на курах, и была показана высокая эффективность биопрепарата.
Однако изучение продолжительности поствакцинального иммунитета у разных видов домашних птиц на момент осуществления стратегии вакцинации не было проведено.
В ходе анализа информации о напряженности иммунитета у домашних птиц в разных регионах РФ были получены противоречивые данные, что, видимо, было связано со сложностью обеспечения качественного и статистически достоверного контроля напряженности иммунитета у привитого поголовья в личных хозяйствах граждан.
Поэтому изучение поствакцинального иммунитета к гриппу у разных видов птиц в экспериментальных условиях приобрело актуальность. Кроме того, занос в 2008г. в РФ штамма H5N1 ВГП новой генетической линии (клад 2.3.2) обусловил необходимость изучения протективных свойств вакцин в отношении этого штамма.
Цель и задачи исследований. Цель работы – изучение поствакцинального гуморального иммунитета к гриппу у разных видов домашних птиц.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
- изучить динамику поствакцинального иммунитета к гриппу птиц у кур, уток, мускусных уток и гусей в зависимости от дозы, способа инъекции и кратности вакцинации;
- определить возможность использования эритроцитов селезня в реакции торможения гемагглютинации (РТГА);
- изучить трансовариальную передачу поствакцинальных антител к ВГП;
- оценить протективные свойства инактивированных вакцин в отношении разных штаммов Н5N1 ВГП и установить сроки выделения вируса во внешнюю среду при проведении контрольного заражения;
- сравнить протективный потенциал вакцин из гомологичного эпизоотическому (Н5N1) и гетерологичного (Н5N3) штаммов ВГП;
- оценить местные тканевые реакции на вакцину у разных видов домашних птиц.
Научная новизна. Впервые изучена динамика поствакцинального иммунитета к гриппу птиц после иммунизации инактивированной эмульгированной вакциной из штамма Н5N1 в зависимости от дозы, способа инъекции и кратности вакцинации у кур, уток, мускусных уток и гусей.
Определены протективные свойства инактивированных вакцин против ВГП подтипа Н5 в отношении штаммов ВГП Н5N1, принадлежащих кладам 2.2. и 2.3.2.
Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований разработаны «Рекомендации по вакцинации птиц против гриппа птиц», которые были одобрены Россельхознадзором и разосланы руководителям органов управления ветеринарией субъектов РФ и руководителям территориальных управлений Россельхознадзора в виде циркулярного письма № ФС-АС-2/8881.
Внесены изменения в инструкцию по применению вакцины против гриппа птиц инактивированной эмульгированной.
Одобрены ученым советом и утверждены зам. директора ФГУ «ВНИИЗЖ»
«Методические рекомендации по анализу динамики поствакцинального гуморального иммунного ответа у птиц (на примере гриппа, ИЛТ и ИБК)».
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Динамика поствакцинального иммунитета к гриппу птиц после иммунизации инактивированной эмульгированной вакциной из штамма Н5N1 в зависимости от дозы, способа инъекции и кратности вакцинации у кур, уток, мускусных уток и гусей.
2. Протективные свойства инактивированных эмульгированных вакцин против ГП подтипа Н5 в отношении штаммов ВГП Н5N1, изолированных на территории РФ.
Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Отдельные этапы выполнены совместно с сотрудниками ФГУ «ВНИИЗЖ» Кулаковым В.Ю., Фроловым С.В., Чвалой И.А., Бабиным Ю.Ю., Андриясовым А.В., Циванюк М.А., Волковым М.С., Пичуевым А.Е., а так же с сотрудниками ГНУ «ВНИИСХ» Фроловой Л.В., Гришиной Д.С., за что автор выражает им искреннюю благодарность.
Апробация результатов работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на III Международном ветеринарном конгрессе по птицеводству (г.
Москва, 2007г.), отчетном собрании ассоциации гусеводов в ГНУ «ВНИИСХ»
Россельхозакадемии (г. Суздаль, 2007г.), на заседаниях ученого совета ФГУ «ВНИИЗЖ» в 2007-2010 гг.
Публикация научных исследований. По теме диссертации опубликовано работ, в том числе 7 статей в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста, включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения, список использованной литературы и приложения. Диссертация иллюстрирована 38 таблицами и 23 рисунками. Список литературы включает 200 источников, из них 106 отечественных и 94 зарубежных. В приложениях представлены копии титульных листов документов, подтверждающих достоверность результатов работы, ее научную и практическую значимость.
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Вакцины:- вакцина против гриппа птиц инактивированная эмульгированная производства Покровского завода биопрепаратов трех серий: серия 16, контроль 16, дата изготовления 07.2006г.; серия 17, контроль 17, дата изготовления 08.2006г. и серия 21, контроль 21, дата изготовления 08.2007г;
- экспериментальные инактивированные эмульсионные вакцины из штамма ВГП H5N3, моно- и биштаммовая вакцины из штаммов ВГП H5N1, разработанные в ФГУ «ВНИИЗЖ».
Все вакцины, использованные в экспериментах, представляли собой эмульсии обратного типа («вода-масло») на основе адъюванта Монтанид ISA 70 (СЕППИК, Франция) с весовым соотношением водной и масляной фаз 30:70.
Вирус. Для контрольного заражения птиц использовали штаммы ВГП из коллекции ФГУ «ВНИИЗЖ»: А/утка/Новосибирск/02/05 Н5N1 и А/курица/Приморск/85/08 Н5N1 («Новосибирск» и «Приморск») в дозах 106 ЭИД/ 0,5 см3 внутримышечно.
Подопытные животные. В производственных условиях (ГНУ «ВНИИСХ», г.
Суздаль Владимирской обл.) было привито более 5000 гол гусей в возрасте 1-3 года следующих пород: владимирская глинистая, итальянская, китайская серая.
В лабораторных экспериментах в ФГУ «ВНИИЗЖ» было вакцинировано более 450 гол птиц разного возраста (5 сут-5 мес): утят кросса «Благоварский»; мускусных уток; кур кроссов «Хайсекс коричневый» и «Хайсекс-белый». Утки были доставлены из ГППЗ «Благоварский», Республика Башкортостан, куры – из ЗАО п/ф «Кинешемская» Ивановской обл. и ОАО п/ф «Ковровская» Владимирской обл.
Условия кормления и содержания птиц соответствовали зоотехническим нормам.
Растворы и реактивы: спирт этиловый 70%, фосфатно-буферный раствор (ФБР, рН 7,2-7,4), физиологический раствор (0,15 М), дихлорэтилен, цитрат натрия 3%.
Оборудование: термостат лабораторный «MIM» (СНГ), высокоскоростная центрифуга «Eppendorf» (Германия), холодильник бытовой «Бирюса» (Россия), морозильная камера (- 20°С) «Sanyo» (Корея), ламинарные шкафы «Импеданс»
(Россия), «Esco» (Сингапур) с вертикальным рециркуляционным потоком, компьютер, изолирующие боксы для содержания птиц «Изоп» (Россия), иглы инъекционные 0,8х38 и 0,6х25, шприцы однократного применения различного объема «Луер» (Россия) и «Ситек Сервис» (КНР), автоматические шприцы многоразового использования «Socorex» (EU), пипетки автоматические со сменными наконечниками различного объема «Gilson» (Франция), планшеты полимерные для иммунологических реакций, пробирки Флоринского (Россия).
Вакцинация птиц. Иммунизацию проводили внутримышечно в область груди (в/м) или подкожно в среднюю треть шеи (п/к), предварительно обработав место инъекции 70% раствором этилового спирта. В производственных условиях птиц вакцинировали с помощью автоматического шприца многоразового использования.
Отбор крови и подготовка сывороток. Пробы крови у птиц отбирали из подкрыльцовой вены, у утят – из вены голени до вакцинации и в разные сроки после нее. Подготовку проб и получение сывороток проводили по общепринятой методике Р.Н. Коровин, 1989. До исследований сыворотки сохраняли при температуре минус 20С. Всего отобрано 4500 проб крови, из них 1800 проб в производственном опыте и 2700 проб в лабораторных экспериментах.
Получение 1% суспензии эритроцитов петуха и селезня. Кровь у петуха и селезня отбирали из подкрыльцовой вены, добавляли 3% раствор цитрата натрия ( часть на 4 части крови), центрифугировали в течение 10 мин при 1000 об/мин с последующим 3-кратным ресуспендированием осадка эритроцитов в физрастворе до первоначального объема. Для приготовления 1% взвеси эритроцитов из пробирки отбирали 1,0 см3 осажденных эритроцитов и добавляли 99,0 см3 физраствора, после чего использовали в РТГА Р.Н. Коровин, 1989; C. Terregino, 2009; OIE Manual, 2010.
Серологические исследования. Уровень антител к ВГП в сыворотках крови птиц определяли в РТГА с использованием антигенов (АГ) производства ФГУ «ВНИИЗЖ», ОАО «ПЗБ», Института Зоопрофилактики (Италия) в соответствии с инструкциями производителей диагностических наборов. Уровень антител выражали в средних геометрических титрах (СГТ) в логарифмах с основанием 2 (log2).
Определение трансовариальной передачи антител. От вакцинированных птиц проводили отбор яиц. Для приготовления желточного экстракта 1,5 см3 желтка смешивали с 6,0 см3 физиологического раствора. Затем в пробирки вносили 2,0 см дихлорэтилена, смесь интенсивно перемешивали встряхиванием, прогревали в течение 1 ч при температуре 37С и центрифугировали 15 мин при 2000 об/мин.
Полученную прозрачную, слегка опалесцирующую надосадочную жидкость использовали в РТГА В.А. Бакулин, 2006; J.R. Beck, 2002.
Оценка поствакцинального иммунитета. Вакцинацию считали эффективной, а поствакцинальный иммунитет напряженным, если у 80% вакцинированных птиц титр антител составлял 4,0 log2 Инструкция по применению вакцины, 2006; OIE Manual, 2010.
Оценка местных тканевых реакций на введение вакцины. Результаты наружного осмотра оценивали по появлению припухлости или образованию твердой опухоли в месте введения вакцины, послеубойную оценку степени поражения тканей проводили по критериям, предложенным H.D. Stone 1997.
Критерии учета состояния птиц после заражения вирусом ВГП.
За птицами наблюдали в течение 10 сут. Клинически здоровыми считали птиц, охотно потребляющих корм и воду, адекватно реагирующих на внешние раздражители, без каких-либо признаков заболевания. При любом отклонении от физиологической нормы (отказ от корма и воды, признаки угнетения, нарушения деятельности дыхательной, пищеварительной, нервной систем) считали птицу больной. Тяжелобольными признавали птиц с ярко выраженными признаками поражения различных систем, характерными для гриппа птиц OIE Manual, 2010.
Прогнозирование иммунного ответа с помощью математической модели.
Модель иммунной реакции представляли хронологической диаграммой в виде несимметричной трапеции, где более пологая боковая сторона соответствует фазе регрессии иммунитета (рис. 1).
Рис. 1. Модель поствакцинальной гуморальной иммунной реакции у птиц Примечание: log2 T – титры сывороточных антител соответственно времени после вакцинации (сут);
f1 – фаза развития, f2 – фаза стабилизации, f3 – фаза регрессии иммунного ответа;
L1 – допротективный период, L2 – протективный период иммунной реакции;
Пунктиром обозначен протективный титр антител – 4,0 log2.
Прогнозируемое значение титра антител (log2”T) на фазе f3 определяли с помощью уравнения по стандартному методу наименьших квадратов («Линейная регрессия» в Microsoft Excel): log2”T= [kt]+log2 T0, где log2T0 – математический оператор (параметр положения линии регрессии по оси Расчет продолжительности протективного периода в непрерывном отсчете от дня вакцинации (S)производили по формуле: S(L1+L2)= (log2T0 – log2 Tprot))/ |k|, где Статистическая обработка и графическое отображение данных. Для вычисления средней арифметической величины и ее статистической ошибки, существенности различий сопоставляемых величин использовали описанные в литературе методы Н.В. Садовский, 1975; Н.А. Плохинский, 1975; Л. Закс, 1976; Дж.
Поллард, 1982, а также пакет прикладных программ Microsoft Office Excel 2003.
2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Иммунитет при однократной вакцинации в различных вариантах.Исследовали периоды развития, стабилизации и регрессии поствакцинального гуморального иммунного ответа птиц, привитых вакциной производства ОАО «ПЗБ»
в следующих вариантах: в/м в дозе 0,5 см; п/к – 0,5 см; в/м – 1,0 см; п/к – 1,0 см.
Соответственно вариантам иммунизации были образованы 4 экспериментальные и одна контрольная группы молодняка кур 63-сут возраста кросса «Хайсекс коричневый» по 10 гол каждая. Сыворотки крови птиц отбирали во всех группах до эксперимента и через заданные интервалы времени после прививки в течение 180 сут.
Титры сывороточных антител к ВГП определяли в РТГА с набором ФГУ «ВНИИЗЖ».
Результаты серологических исследований представлены в табл. 1.
Динамика титров поствакцинальных антител к ВГП у кур в зависимости Срок после Средние титры в РТГА, log2 (числитель) и напряженность иммунитета по Результаты, представленные на рис. 2, демонстрируют, что данные серологических исследований (табл. 1) практически совпадают с расчетными сроками продолжительности иммунитета, полученными с помощью регрессионного анализа.
При иммунизации птиц в/м или п/к в дозе 0,5 см3 допротективный период составлял не менее 14 сут. Период стабилизации иммунной реакции продолжался с 21 по 60 сут, СГТ антител к ВГП имел величину при в/м прививке log2Tstab = 4,97±0,16 и при п/к – log2 Tstab=4,62±0,16. Период регрессии иммунного ответа при обоих вариантах начинался с 60 сут. Уравнение регрессии титров антител имело вид log2“T = (-0,026)t + 6,430 для в/м и log2“T = (-0,023)t+5,874 для п/к вакцинации, на основании чего была определена прогнозируемая продолжительность протективного периода при непрерывном отсчете со дня вакцинации: 934,20 и 826,62 сут для в/м и п/к вариантов, соответственно. Иммунизация в дозе 1,0 см3 обусловила сокращение допротективного периода (L1 14 сут) и достоверное возрастание СГТ антител на фазе стабилизации: log2 Tstab =6,54±0,20 и log2 Tstab=7,46±0,37 для в/м и п/к вариантов, соответственно. Продолжительность протективного периода составила 1284,00 сут для варианта в/м и 1363,96 сут для варианта п/к вакцинации.
log2 T Рис. 2. Развитие, стабилизация и регрессия поствакцинального гуморального иммунного ответа у кур Значения титров сывороточных антител (log2 T) представлены в виде первичных оценок (заштрихованные фигуры) и средних величин (незаштрихованные фигуры) соответственно времени после прививки (сут), дозы и способа введения вакцины, где: а) и – 0,5 см3, в/м; b) и – 0,5 см3, п/к; с) и – 1,0 см3, в/м;
d) и – 1,0 см3, п/к. Ось абсцисс пересекает ось ординат в значении 4,0 log2, что соответствует величине протективного титра антител. Представлены уравнения и линии регрессии титров антител.
Иммунитет у кур после двукратной вакцинации в дозе 0,5 см3 в/м и п/к.
Повторную прививку птиц проводили через 90 сут, при снижении титров антител до значения 4,0 log2, с использованием вариантов 0,5 см3 в/м и 0,5 см3 п/к. Результаты серологических исследований показаны в табл. 2.
Динамика титров антител к ВГП у кур после ревакцинации в зависимости Ревакцинация птиц в обоих вариантах обусловила значительное возрастание напряженности гуморального иммунитета через 30 сут со схожей динамикой иммуногенеза. Уравнение регрессии титров антител имело вид для варианта вакцинации в/м log2“T = (-0,016)t + 9,03, а для варианта п/к – log2“T = (-0,015)t + 8,92. Используя приведенные уравнения, установили, что при непрерывном отсчете со дня вакцинации прогнозируемая продолжительность иммунного ответа птиц на протективном уровне после в/м ревакцинации составила 31418,09 сут, а после иммунизации п/к – 32820,24 сут.
2.2.2. Поствакцинальный иммунитет у мускусных уток В эксперименте мускусных уток 91-сут возраста, серонегативных к ВГП, иммунизировали вакциной производства ОАО «ПЗБ» следующими способами: в/м – 0,5 см; в/м – 1,0 см; п/к – 1,0 см.
Через 1 мес титры антител не достигли уровня 4,0 log2 и составили соответственно указанным вариантам вакцинации, 3,20±0,37 log2; 3,60±0,54 log2 и 3,60±0,65 log2. Птиц, привитых 0,5 см3 в/м, ревакцинировали 0,5 см3 в/м и 1,0 см3 в/м.
Птиц остальных групп ревакцинировали через 3 мес, убедившись, что уровень антител в ответ на 1-ю вакцинацию не возрос. При сравнении результатов установили, что продолжительность иммунитета после инъекции вакцины в объеме 1,0 см3 в/м или п/к существенных различий не имела (p0,05). Через 60 сут (или через 150 сут после начала эксперимента) отметили снижение напряженности гуморального иммунитета во всех группах (табл. 3).
Поствакцинальный иммунитет к гриппу птиц у мускусных уток в зависимости № Схема Средние титры антител в РТГА, log2 (числит.) и напряженность иммунитета по гр вакцинации группам, % (знаменат.) после ревакцинации, через мес Через 30 сут после ревакцинации наступала фаза регрессии, и для нее были определены уравнения регрессии титров антител: log2“T = (-0,033)t+7,12 для группы № 1 log2 “T = (-0,0091)t+6,18 для группы № 2, log2“T= (-0,011)t+7,29 для группы № и log2“T = (-0,012)t+7,39 для группы № 4. По приведенным уравнениям рассчитали прогнозируемую продолжительность протективных периодов, которые при непрерывном отсчете со дня вакцинации составили: 957,94, 2409,59; 29312,12 и 2839,91 сут для групп №№ 1, 2, 3, 4 соответственно.
«