На правах рукописи

НГУЕН ВИНЬ ТИЕН

КИНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПЕРЕНОСА ЭЛЕКТРОНОВ В

СИСТЕМЕ «СУБСТРАТ – БИОКАТАЛИЗАТОР – МЕДИАТОР –

ЭЛЕКТРОД» В БИОТОПЛИВНОМ ЭЛЕМЕНТЕ НА ОСНОВЕ

GLUCONOBACTER OXYDANS

03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва – 2013

Работа выполнена кафедре химии естественно-научного факультета Тульского государственного университета.

Научный руководитель: кандидат химических наук, доцент, декан естественно-научного факультета Тульского государственного университета, заведующий кафедрой химии Алферов Валерий Анатольевич

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор, декан факультета химикофармацевтических технологий и биомедицинских препаратов Российского химико-технологического университета им.

Д.И. Менделеева, профессор кафедры химии и технологий биомедицинских препаратов Офицеров Евгений Николаевич кандидат химических наук, старший преподаватель кафедры биотехнологии и бионанотехнологии Московского государственного университета тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова.

Еремин Сергей Владимирович

Ведущая организация: Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева

Защита состоится «21» октября 2013 г. в 15 часов на заседании Диссертационного Совета Д 212.120.01 при Московском государственном университете тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова (МИТХТ им М.В. Ломоносова) по адресу 119571 Москва, пр. Вернадского, 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М. В.

Ломоносова по адресу: 119571 Москва, пр. Вернадского, 86.

Автореферат разослан «19» сентября 2013 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук, А.И.Лютик старший научный сотрудник

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования В последнее время темп использования ископаемых топлив, особенно нефти и газа, ускоряется, что влечет за собой угрозу энергетического кризиса и глобального загрязнения окружающей среды. Возобновляемые формы энергии являются одним из путей решения этих проблем, значительные усилия направляются на исследование альтернативных источников электроэнергии. В последние годы интенсивно исследуются биотехнологические аспекты генерирования энергии, в том числе технологии биотопливных элементов (БТЭ) как способ генерации электричества или водорода из возобновляемых источников без эмиссии углекислого газа в экосистему. БТЭ также могут быть использованы для очистки сточных вод за счет способности применяемых биокатализаторов окислять широкий спектр органических веществ. В качестве биокатализаторов для окисления субстратов могут выступать ферменты или микроорганизмы.

Использование последних более предпочтительно, т.к. не требуются сложные и дорогостоящие процессы выделения, очистки и хранения ферментов. Одними из перспективных микроорганизмов, на основе которых возможно создание БТЭ, являются уксуснокислые бактерии Gluconobacter oxydans. Эти микроорганизмы обладают уникальной организацией метаболической системы, характеризующейся мембранной локализацией основных ферментов – дегидрогеназ, что делает возможным перенос электронов из активных центров фермента на внешнее пространство. В связи с этим мембранная фракция, относительно просто выделенная из бактериальных клеток, также может явиться перспективным биокатализатором в БТЭ. Для облегчения процесса передачи электронов от мембранно-локализованных ферментов бактерий на анод БТЭ применяются медиаторы электронного транспорта – низкомолекулярные соединения, которые могут проникать через внешнюю мембрану бактерий, получать электроны у мембранно-локализованных ферментов и окисляться на аноде. В качестве медиаторов электронного транспорта для Gluconobacter oxydans в БТЭ использовались различные органические и неорганические соединения, среди них 2,6дихлорфенолиндофенол (ДХФИФ) оказался наиболее подходящим. При разработке проточных систем БТЭ важной проблемой является потеря биокатализатора, одним из возможных решений является применение иммобилизованных микроорганизмов. Сополимер поливинилового спирта (ПВС) и Nвинилпирролидона представляется перспективной матрицей для иммобилизации бактериальных клеток за счет способности удерживать клетки, нетоксичности для них, механической и химической устойчивости. Анализ литературы показывает, что большинство исследований по БТЭ до сих пор посвящено в основном прикладным аспектам технологии, т.е. подбору оптимальных условий и разработке конструкций для достижения максимальных энергетических характеристик БТЭ. При этом фундаментальные вопросы по механизмам работы БТЭ, в том числе кинетические аспекты процессов переноса зарядов в системе «субстрат – биокатализатор – медиатор - электрод» не были систематически исследованы. Понимание таких механизмов позволит создавать эффективные БТЭ с высокими электрическими характеристиками. Таким образом, исследование кинетических аспектов передачи электронов в анодном отделении БТЭ на основе Gluconobacter oxydans представляется актуальной задачей в области биотехнологии альтернативных источников энергии.

Цель и задачи исследования. Цель данной работы - выявление закономерностей и определение кинетических параметров процессов передачи электронов в системе «субстрат – биокатализатор – медиатор 2,6дихлорфенолиндофенол – графитовый электрод» в БТЭ на основе уксуснокислых бактерий Gluconobacter oxydans и выделенной из них мембранной фракции в суспензионном и иммобилизованном состояниях.

Для достижения указанной цели в работе решались следующие задачи:

1. Определить кинетические параметры взаимодействия медиатора с биокатализаторами в суспензионном состоянии в присутствии субстрата.

2. Выявить влияние операционных условий (природа и концентрация субстрата, содержание биокатализатора, рН, ионная сила раствора, присутствие растворенного кислорода) на скорость восстановления медиатора при использовании биокатализатора в суспензионном состоянии.

3. Выявить лимитирующую стадию и определить кинетические параметры взаимодействия медиатора с иммобилизованным биокатализатором.

4. Определить кинетические характеристики процесса разряда медиатора на графитовом электроде.

5. Сравнить энергетические характеристики БТЭ на основе бактерий Gluconobacter oxydans и их мембранной фракции, применяемых в виде суспензии и в иммобилизованном состоянии.

Научная новизна Впервые определены эффективные константы скорости и начальные скорости восстановления ДХФИФ уксуснокислыми бактериями Gluconobacter oxydans и выделенной из них мембранной фракцией при различных условиях работы БТЭ (окислительная и инертная атмосфера, разомкнутая цепь и короткое замыкание, суспензионный и иммобилизованный биокатализатор), что позволяет оценить влияние этих условий на кинетику процесса восстановления ДХФИФ биокатализаторами.

Показано, что в условиях функционирования разработанного макета БТЭ растворенный кислород в анодном отделении не конкурирует с медиатором в процессе получения электронов от ферментных систем бактерий.

На основе модели ферментного электрода впервые выявлены области концентраций субстрата, при которых лимитирующей стадией является диффузия субстрата к частицам биокатализатора или ферментативная реакция окисления субстрата иммобилизованными в химически модифицированный поливиниловый спирт бактериями Gluconobacter oxydans на электроде.

Установлено, что процесс переноса электронов с восстановленной формы ДХФИФ на графитовый электрод протекает в смешанном режиме, т.е. конкурирующими являются стадии диффузии медиатора к электроду, адсорбции его на поверхности и перенос заряда на электрод, при этом окисление медиатора является реакцией первого порядка.

Практическая значимость Выявленное влияние рабочих условий БТЭ на скорость восстановления ДХФИФ может служить ориентиром при подборе оптимальных условий для работы БТЭ на основе уксуснокислых бактерий Gluconobacter oxydans и медиатора ДХФИФ.

Установлено, что при избытке бактериальных клеток Gluconobacter oxydans в качестве биокатализатора БТЭ может работать в аэробных условиях. При этом процесс передачи электронов от бактерий на молекулы медиатора не подвергается конкуренции со стороны растворенного кислорода, что позволяет конструировать более простые БТЭ без изолирования их анодного отделения от воздуха.

Впервые показана возможность использования поливинилового спирта, модифицированного N-винилпирролидоном, для иммобилизации бактериальных клеток Gluconobacter oxydans на аноде БТЭ. Такая композиция анода повышает долговременную стабильность БТЭ, улучшает его энергетические характеристики и позволяет применять биокатализатор в проточных системах.

Результаты работы внедрены в учебный процесс – поставлена новая лабораторная работа по курсам «Биосенсоры» и «Биотехнология защиты окружающей среды» для студентов специальностей 020100 Химия и 240901 Биотехнология.

Апробация работы и публикации Результаты работы представлены во всероссийских конференциях с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология», (г. Тула, 2010, 2011, 2012 гг.), Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития», (2011г. г. Москва, диплом и медаль конкурса), Всероссийской школе-конференции "Химия биологически активных веществ" с международным участием "ХимБиоАктив-2012" (г. Саратов 2012г.), Международной интернет-конференции «Биотехнология. Взгляд в будущее», (2012г.), Международной научной конференции «Достижения и перспективы развития биотехнологии» (г. Саранск, 2012г).

По теме диссертации опубликовано 3 статьи в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых журналов и изданий ВАК и 7 сообщений в тезисной форме и в виде материалов конференций, получен патент на полезную модель (2012г.).

Место проведения работы Экспериментальная часть работы выполнялась на кафедре Химии ЕНФ Тульского государственного университета, в рамках проектов ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России», Соглашение № 14.В37.21.0561 и Государственного задания Минобрнауки 4412 ГЗ.

Благодарности. Автор благодарен коллективам кафедры химии Тульского государственного университета за неоценимую помощь в проведении исследований и обсуждении результатов. Особую признательность автор выражает своим научным руководителям – к.х.н., проф. Алферову В.А., к.х.н., доц. Понаморевой О.Н.

Структура и объем работы.

Работа состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Экспериментальная часть», «Обсуждение результатов», «Выводы» и «Список литературы». Диссертационная работа изложена на 111 страницах машинописного текста, содержит 42 рисунка и 12 таблиц. Список литературы включает 97 источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении дана общая характеристика диссертационной работы, изложены актуальность темы, научная новизна и практическая значимость работы, сформулированы цель и задачи исследования.

Глава 1. В первой главе дан анализ научно-технической литературы, посвященной исследованиям в области технологии БТЭ. Приведено описание физиолого-биохимических особенностей уксуснокислых бактерий Gluconobacter oxydans, а также кинетического аспекта процессов передачи электронов в анодном отделении БТЭ.

Глава 2. Во второй главе дано описание материалов и методов исследования.

В работе использован бактериальный штамм: Gluconobacter oxydans subsp. industrius (ВКМB-1280). (Всероссийская коллекция микроорганизмов, УРАН ИБФМ им. Г.К. Скрябина). Мембранную фракцию из бактерий Gluconobacter oxydans sbsp. industrius ВКМB-1280 (далее G. oxydans) получали путем разрушения биомассы бактерий на ультразвуковом диспергаторе УЗД11-0,1/22 и последующим центрифугированием на центрифугаторе Centrifuge 5417R (Eppendorf).

Электрохимические измерения проводили с помощью гальванопотенциостатов IPC2000 и IPC Micro («Кронас», Москва) с программным управлением.

Измерения концентрации глюкозы и этанола в анодном отделении БТЭ проводили при помощи биосенсора на основе кислородного электрода и ферментов глюкозооксидазы и алкогольоксидазы соответственно.

Определение концентрации кислорода в растворе проводили на анализаторе жидкости «ЭКСПЕРТ-001» с программным управлением.

Определение скорости восстановления медиатора ДХФИФ проводили с использованием спектрофотометра СФ-103 при длине волны 600 нм. Обработку экспериментальных данных проводили с помощью компьютерных программ «Microsoft Excel» и «Sigma Plot 11.0»

Глава 3. В третьей главе приведены основные результаты работы и их обсуждение.

1. Кинетические аспекты взаимодействия медиатора с биокатализатором в суспензионном виде Кинетические характеристики взаимодействия ДХФИФ с суспензией клеток G.oxydans Для выявления кинетических закономерностей взаимодействия медиатора с биокатализатором на первом этапе работы спектрофотометрическим методом были определены эффективные константы скорости и начальные скорости восстановления медиатора в присутствии избытка клеток G.oxydans и субстрата (этанола и глюкозы).

Для этого измеряли в кинетическом режиме оптическую плотность раствора, содержащего ДХФИФ, суспензию бактерий G.oxydans и избыток субстрата, при разомкнутой цепи и коротком замыкании БТЭ, в присутствии и в отсутствие кислорода.

Известно, что в большинстве случаев кинетика восстановления медиатора бактериальными клетками соответствует реакции первого порядка по медиатору, т.е. C C0 e kt (где C0 и C - начальная и текущая концентрации медиатора в измерительной кювете соответственно, k – константа скорости реакции) (Sibel D. Roller et al., 1984). С другой стороны оптическая плотность раствора ДХФИФ прямо пропорциональна его концентрации, поэтому D D0 e kt (где D и D - начальная и текущая оптические плотности раствора при длине волны 600нм).

Данные по оптической плотности были обработаны в виде зависимости ) от времени, где D0 и D –начальная и текущая оптические плотности реакln( ционной смеси (Рис.1 и 2).

ln(D0/D) Тангенс угла наклона линейной зависимости является эффективной константой скорости реакции. Полученная константа скорости является эффективной, поскольку включает в себя концентрации биокатализатора и субстрата, константу адсорбционного равновесия и константу скорости переноса электрона на электрод в режиме короткого замыкания.

Кинетика восстановления медиатора биокатализаторами в присутствии этанола как в режиме разомкнутой цепи, так и в режиме короткого замыкания соответствует реакциям первого порядка (табл.1).

Таблица 1. Эффективные константы скорости ( k ) и начальные скорости (v) реакции восстановления ДХФИФ бактериями G.oxydans при различных условиях.

Из полученных результатов можно сделать следующие выводы. При использовании этанола в качестве субстрата эффективные константы скорости реакции восстановления ДХФИФ клетками G. оxydans на порядок большие, чем при использовании глюкозы.

В режиме короткого замыкания из-за реакции окисления восстановленной формы медиатора на аноде скорость исчезновения окисленной формы ДХФИФ в 2-3 раза меньше, чем в режиме разомкнутой цепи. Присутствие кислорода практически не влияет на скорость восстановления ДХФИФ. Это можно объяснять либо более высокой скоростью взаимодействия бактериальных клеток с медиатором, чем с кислородом, либо присутствием избытка субстрата и биокатализатора, что обеспечивает одновременно восстановление и кислорода, и медиатора.

Оценка конкуренции между медиатором и растворенным кислородом.

Для аэробных бактерий, таких как G.oxydans, кислород является естественным конечным акцептором электронов и может конкурировать с медиатором при получении электронов с дыхательной цепи бактерий.

Для определения скорости восстановления кислорода бактериями G. oxydans измерили концентрацию кислорода в системе, содержащей этанол, суспензию бактерий G. оxydans в отсутствие и в присутствии ДХФИФ (рис.3).

Результаты обработки экспериментальных данных показывают, что присутствие кислорода не влияет на скорость восстановления медиатора (табл.1) и присутствие медиатора не влияет на скорость восстановления кислорода. При одинаковых экспериментальных условиях скорости восстановления кислорода и ДХФИФ составляют 130±20 (мкмоль электронов).л-1.г-1.с-1 и 150±30 (мкмоль электронов).л-1.г-1.с-1 соответственно, т.е. одинаковы. В литературе описаны подобные случаи для других видов бактерий и медиаторов (Escherichia coli и тионин, Bacillus subtilis и метиленовый синий, Proteus vulgaris и метиленовый синий) где скорости восстановления медиатора и кислорода бактериями близки (Sibel D. Roller, 1984).

Рис.3. Кинетика расходования кислорода в случаях присутствия и отсутствия медиатора при разомкнутой цепи.

Ранее было установлено, что гомогенизат G.oxydans, полученный после ультразвуковой обработки бактериальных клеток, обладает удельной активностью по этанолу 2,78 Е/мг, что соответствует скорости восстановления этанола 46,3 мкмоль г 1 с1 (Islami M., 2008). Даже если предположить, что целые клетки обладают удельной активностью в 10 раз меньшей, чем гомогенизат клеток, т.е.

4,6 мкмоль г 1 с1, то такое значение все равно значительно выше, чем суммарная скорость восстановления ДХФИФ и кислорода. Таким образом, отсутствие конкуренции между медиатором и кислородом можно объяснить присутствием избытка биокатализатора в условиях эксперимента и тем фактом, что весь присутствующий в системе кислород полностью расходуется за 10 минут, что видно на рисунке 3.

Кинетические характеристики взаимодействия ДХФИФ с суспензией мембранной фракции, выделенной из G. оxydans Известно, что способность G. oxydans быстро окислять спирты и моносахариды обусловлена в основном мембранно-локализованными дегидрогеназами. Эти ферменты в свободном состоянии могут непосредственно взаимодействовать с ДХФИФ. Ферменты в мембранной фракции, выделенной из бактериальных клеток, становятся более доступными субстратам и медиатору, что делает ее перспективным биокатализатором в БТЭ.

Эффективные константы скорости и начальные скорости восстановления ДХФИФ в присутствии мембранной фракции в качестве биокатализатора и этанола в качестве субстрата были определены спектрофотометрическим методом (табл.2).

Таблица 2. Эффективные константы скорости (k) и начальные скорости (v) реакции восстановления ДХФИФ мембранной фракцией в присутствии этанола при различных условиях.

Кинетические характеристики Результаты обработки экспериментальных данных показывают, что кинетика восстановления медиатора мембранной фракцией в присутствии этанола в режимах разомкнутой цепи и короткого замыкания соответствует реакциям первого порядка. Присутствие кислорода в реакционной среде, как в случае с суспензией клеток, практически не влияет на скорость восстановления медиатора.

Можно видеть, что при использовании мембранной фракции в качестве биокатализатора скорости восстановления медиатора примерно в 6-7 раз выше, чем при использовании целых клеток G.oxydans (табл.1 и табл.2).

2. Влияние операционных условий БТЭ на скорость восстановления медиатора Влияние природы субстрата. Известно, что бактерии G.oxydans обладают широким спектром окисляемых субстратов, для выявления влияния природы субстрата на скорость восстановления медиатора были определены скорости взаимодействия бактерий G.oxydans с ДХФИФ при использовании различных спиртов и моносахаридов.

Рис 4. Субстратная специфичность микроорганизмов G.oxydans.

А-спирты, Б – моносахариды (на вертикальной оси дано соотношение констант скоростей, полученных спектрофотометрически, для кислородного электрода – соотношение ответов сенсора).

Полученный портрет субстратной специфичности в основном согласуется с результатами, полученными с помощью биосенсора на основе кислородного электрода (рис.4).

Бактериальные клетки обладают самыми высокими скоростями взаимодействия с ДХФИФ при использовании этанола, н-пропанола и глюкозы в качестве субстратов окисления. Для линейных одноатомных спиртов при увеличении числа атомов углерода от 2 до 4 скорость восстановления медиатора и скорость потребления кислорода уменьшается. Для первичных спиртов скорости восстановления медиатора и кислорода выше, чем для вторичных.

Влияние концентрации субстрата. График зависимости начальной скорости восстановления ДХФИФ от концентрации субстрата имеет типичный для ферментативных реакций вид (рис. 5), поэтому экспериментальные данные аппроксимировали по уравнению Михаэлиса-Ментен, константа Михаэлиса для ферментных систем окисления этанола бактериями G.oxydans составила 0,045мМ.

Рис.5. Зависимость скорости восстановления Такой результат имеет одинаковый порядок по сравнению с константами Михаэлиса для алкогольдегидрогеназы, выделенной из G.oxydans [www.brendaenzymes.info].

Таблица 3. Константа Михаэлиса алкогольдегидрогеназы, выделенной из G. oxydans при температуре 25оС, рН=5,0, субстрат -PQQ.

Влияние содержания бактериальных клеток. Количество биокатализатора – бактериальных клеток, влияет на скорости окисления этанола и восстановления ДХФИФ. При увеличении содержания бактериальных клеток в суспензии возрастает скорость восстановления ДХФИФ, причем при содержании клеток выше 5мг/мл наблюдает эффект насыщения (Рис. 6).

Рис.6. Зависимость скорости восстановления ДХФИФ от содержания Влияние рН среды. рН среды оказывает существенное влияние на активность ферментов, функционирование целых клеток бактерий и окислительновосстановительные свойства ДХФИФ. Влияние рН фосфатного буферного раствора на скорость восстановления ДХФИФ исследовали методом спектрофотометрии в диапазоне рН от 5 до 8. Максимальная скорость восстановления ДХФИФ наблюдается в области рН 6 (рис.7), что соответствует данным по каталитической активности G.oxydans в условиях естественного окисления этанола, полученным с помощью кислородного электрода (рис.8).

Таким образом, значение рН среды в первую очередь влияет на активность бактерий, в то время как изменение окислительно-восстановительных свойств ДХФИФ не является решающим фактором.

Влияние ионной силы раствора Одним из факторов, которые могут влиять на активность бактериальных клеток является ионная сила раствора. Было определено влияние ионной силы фосфатного буферного раствора (рН=6) на скорость восстановления ДХФИФ клетками G. oxydans в диапазоне ионной силы от 10-4М до 0,1М.

Рис.9. Зависимость эффективной константы скорости восстановления ДХФИФ от логарифма ионной силы среды.

Как можно видеть, в относительно широком диапазоне ионной силы раствора эффективная константа скорости восстановления ДХФИФ практически не меняется, что свидетельствует об устойчивости уксуснокислых бактерий к изменению ионной силы раствора.

3.Кинетика взаимодействия иммобилизованных клеток Gluconobacter oxydans с медиатором.

Определение лимитирующей стадии при взаимодействии субстрата с иммобилизованными бактериальными клетками Gluconobacter oxydans Для разработки БТЭ, работающего в проточных системах, важной задачей является иммобилизация биокатализатора на электроде. В качестве матрицы для иммобилизации бактериальных клеток G.oxydans в работе использован сополимер поливинилового спирта (ПВС) и N- винилпирролидона. Данный сополимер отличается механической и химической устойчивостью, нетоксичностью для бактерий и способностью удерживать их в долгое время.

При использовании сополимера ПВС и N- винилпирролидона для иммобилизации бактерий на аноде диффузия субстрата к бактериям через слой матрицы затрудняется и в результате ограничивает общий процесс переноса электронов. Поэтому важно подобрать условия, в которых диффузия не является лимитирующим фактором.

Чтобы описать кинетические закономерности процесса переноса электронов в БТЭ на основе иммобилизованного биокатализатора анод с иммобилизованными бактериями G.oxydans представили в виде модели, учитывающей различные стадии: перенос субстрата и медиатора через слой полимера, их взаимодействие с ферментными системами бактериальных клеток, регенерацию фермента и медиатора (рис. 10). В стационарном состоянии системы имеется равенство потоков электронов и вещества на всех стадиях процесса биоэлектрокаталитического окисления субстрата.

Такая модель микробного электрода БТЭ аналогична модели ферментного электрода, поэтому для анализа процессов, протекающих на биоаноде с иммобилизованными бактериальными клетками, применили подход, который был использован для определения лимитирующей стадии процессов, протекающих на ферментном электроде.

Для определения лимитирующей стадии при взаимодействии субстрата с иммобилизованными бактериальными клетками G. oxydans была использована математическая модель ферментного электрода, приводящая в конечном итоге к выражению (Albery W.J., Bartlett P.N.,1985):

где j – поток электронов, протекающий через электрод; S – концентрация субстрата в растворе; k ' – эффективная константа скорости электрохимичеME ской реакции на микробном электроде; K ME – константа, эквивалентная константе Михаэлиса для микробного электрода; kS – константа скорости массопереноса субстрата.

Первый этап анализа для нахождения лимитирующей стадии заключается в нахождении kME по графику зависимости S/j от S. k’ME представляет собой обратную величину свободного члена уравнения линейной зависимости S/j от S (рис.10), полученное значение константы дано в таблице 5.

Рис. 11. Графическое определение эффективной константы kME.

Затем были найдены параметры и y, которые не имеют конкретного физического смысла, но позволяют представить экспериментальные данные в удобном для анализа виде.

После нескольких математических преобразований уравнение (1) можно привести к виду:

Для определения лимитирующей стадии процесса строили график зависимости у от.

Рис.12. Зависимость y от для анода с иммобилизованными Согласно применяемой модели, если скорость процесса лимитируется ферментативной реакцией, зависимость у от должна иметь вид горизонтальной линии, если же прямая зависимости у от отсекает на оси абсцисс отрезок, равный единице, то процесс лимитируется диффузией субстрата к частицам биокатализатора.

Было установлено, что в диапазоне концентраций этанола 0,25 – 8,0 мМ зависимость у от носит характер прямой, практически параллельной оси абсцисс, следовательно, скорость процессов, протекающих в системе, лимитируют ферментативная реакция.

В диапазоне концентраций этанола 0,012 – 0,12 мМ скорость процессов, протекающих в системе, лимитирует диффузия субстрата через полимерную матрицу к бактериальным клеткам, так как отрезок, отсекаемый прямой на оси абсцисс равен значению близкому к единице.

Таблица 5. Интервалы концентраций этанола и кинетические константы скорости лимитирующей стадии на аноде с иммобилизованными Лимитирующая стадия Интервал концентраций Ферментативная реакция 0,25 - 8, Таким образом, в области низких концентраций (от 0,012 до 0,12 мМ) лимитирующей стадией в анодном отделении БТЭ на основе иммобилизованных клеток G.oxydans является диффузия субстрата к частицам биокатализатора. В области более высоких концентраций (от 0,25 до 8,0 мМ) лимитирующей стадией процесса является ферментативная реакция.

Дальнейшие исследования кинетических закономерностей функционирования БТЭ на основе иммобилизованных биокатализаторов проводили в условиях, когда лимитирующей стадией процесса является ферментативная реакция.

Кинетические характеристики взаимодействия медиатора с иммобилизованными бактериями Для выявления кинетических закономерностей взаимодействия медиатора с иммобилизованными бактериями при использовании этанола в качестве субстрата в БТЭ использовали метод спектрофотометрии.

Результаты обработки экспериментальных данных показывают, что реакция восстановления ДХФИФ в режимах разомкнутой цепи и короткого замыкания БТЭ имеет первый порядок по медиатору. В таблице 6 представлены полученные эффективные константы скорости и начальные скорости восстановления ДХФИФ иммобилизованными клетками G.oxydans.

Таблица 6. Эффективные константы скорости (k) и начальные скорости (v) восстановления ДХФИФ иммобилизованными бактериями После иммобилизации бактериальных клеток в модифицированный ПВС константа скорости их взаимодействия с медиатором падает почти на 2 порядка (табл.2 и табл.6). Это можно объяснить уменьшением количества «активных центров» биокатализатора в результате взаимодействия его поверхности с иммобилизующей полимерной матрицей.

Влияние поверхностной плотности биокатализатора. Для того, чтобы процессы окисления субстрата и восстановления медиатора протекали с высокой скоростью, количество биокатализатора на поверхности анода должно быть достаточно большим.

С ростом поверхностной плотности бактериальных клеток до величины 4мг/см2 эффективная константа скорости реакции повышается, что свидетельствует об увеличении количества эффективных клеток - биокатализаторов. При более высоких плотностях биокатализатора эффективная константа скорости реакции почти не изменяется, что свидетельствует о присутствии «недействующего» количества биокатализатора (рис. 13).

Таким образом, для эффективной работы иммобилизованного биокатализатора бактериальные клетки G.oxydans целесообразно иммобилизовать в пределах плотности 2-4 мг/см2.

Рис.13. Зависимость эффективных констант скорости от содержания 3. Кинетика разрядки медиатора ДХФИФ на электроде Важной стадией в процессе переноса электронов в БТЭ является разрядка восстановленного медиатора на аноде. Для получения кинетических характеристик этого процесса получили и обработали вольтамперные кривые разрядки ДХФИФ на графитом электроде.

Выявление конкурирующих стадий. Для оценки числа электронов, участвующих в процессе электронного транспорта молекулами ДХФИФ вольтамперные зависимости были обработаны в координатах lgi=f(E) для разных скоростей развртки, где i - плотность силы тока.

Полученные результаты представлены на рисунке 14.

Рис.14. Зависимость плотности тока от потенциала в системе На основании уравнения Тафеля где Е – перенапряжение;

a, b – эмпирические коэффициенты, по тангенсу угла наклона полученых прямых был определен коэффициент b. Для системы ДХФИФ/буфер его среднее значение составило 0,26±0,02, а при аналогичной обработке серии опытов с использованием суспензии клеток и медиатора – 0,28±0,03.

Таблица 7. Значения коэффициента b уравнения Тафеля при разных скоростях развертки потенциала электрода.

Скорость развертки, мВ/c Если учесть, что поляризационные кривые получены в условиях, близких к равновесным, то рассчитанные значения коэффициента b указывают на участие в электрохимическом процессе окисления молекул ДХФИФ 0, электрона. Если данный процесс лимитируется стадией переноса заряда, число электронов должно быть 1 или 2 (значение коэффициента b при этом близко к 0,118 или 0,059).

Подобные зависимости были получены для графитовых электродов разного диаметра (4 мм, 3,7 мм, 3,5 мм, 3,2 мм). Установлено что, определяемый коэффициент b изменяется в зависимости от диаметра рабочего электрода. Полученный график представлен на рисунке 15.

Рис.15. Зависимость коэффициента b уравнения Тафеля от диаметра Для электрохимических процессов, лимитируемых переносом заряда, коэффициент b уравнения Тафеля не зависит от площади поверхности электрода.

Поэтому и число электронов 0,5, и факт зависимости коэффициента b от площади электрода свидетельствует о том, что процесс окисления ДХФИФ на графитовом электроде протекает в смешанном режиме, т.е. конкурирующими являются стадии диффузии, адсорбции частиц восстановленной формы ДХФИФ и переноса электронов от медиатора на электрод.

Скорость передачи электронов на электрод - скорость окисления медиатора на графитовом электроде должна быть пропорциональна степени заполнения поверхности электрода молекулами восстановленного медиатора:

где r - скорость окисления восстановленного медиатора на электроде, k - константа скорости передачи электрона от адсобированного восстановленного медиатора к электроду Mred - степень заполнения поверхности графитового электрода частицами восстановленного медиатора Степень заполнения определяется уравнением Лэнгмюра:

где C Mred, K Mred, CMox, K Mox - концентрации и константы адсорбционного равновесия восстановленной и окисленной форм медиатора соответственно.