«РАЗРАБОТКА БИОМАТЕРИАЛОВ ДЛЯ РЕКОНСТРУКТИВНОЙ ХИРУРГИИ НА ОСНОВЕ КСЕНОПЕРИКАРДИАЛЬНОЙ ТКАНИ ...»

ксеноперикарда – это компания «НеоКор» (г. Кемерово) [2], Научный центр сердечнососудистой хирургии им. А.Н. Бакулева (г. Москва) и компания «Кардиоплант»

(г. Пенза), входящая в состав группы компаний ЗАО НПП «МедИнж» — крупного российского производителя изделий медицинского назначения. Основное отличие этих продуктов – технология обработки и консервации биологической ткани. Московские и кемеровские производители ксеноперикарда ориентированы только на рынок кардиохирургии и не заинтересованы в диверсификации производства и освоении новых областей, например общей хирургии, урологии и гинекологии, нейрохирургии и других.

Ксеноперикардиальная пластина «Кардиоплант», которая успешно вытесняет аналоги (занимает до 65% рынка на 2013год) с рынка кардиохирургии, позволяют делать вывод о конкурентоспособности имеющейся и перспективности разрабатываемых технологий перед указанными производителями. Кроме того, начатые сотрудниками медицинского института Пензенского Государственного Университета и Центрального Института Травматологии и Ортопедии им Н.Н. Приорова экспериментальные исследования по возможности применения ксеноперикарда в разных областях реконструктивновосстановительной хирургии говорят о перспективности данного подхода. Поэтому комплексность настоящей работы имеет высокую практическую значимость.

Предлагаемые способы обработки и стабилизации биологической ткани позволяют получать продукт с индивидуальными характеристиками и свойствами для широкого применения при реконструктивных операциях.

Хирургия грыж брюшной стенки, хирургия диафрагмальных грыж, хирургическое лечение перитонита (использование ксеноперикарда для закрытия лапаростомной раны в условиях абдоминального компартмент-синдрома), реконструктивновосстановительная хирургия внепеченочных желчных путей (использование биоматериалов для протезирования желчных протоков), укрытие паренхиматозных органов при резекции (например, укрытие культи доли печени при резекции), укрепление зоны анастомозов при резекционных вмешательствах на пищеводе, желудке и кишечнике.

Изучение возможности применения ксеноматериалов в абдоминальной хирургии представляет собой новую главу большой научно-практической работы [4, 8, 26, 28, 36].

Пластика вентральных грыж – одна из наиболее распространённых операций и остаётся наиболее сложной проблемой современной герниологии из-за высокого числа рецидивов. В России ежегодно выполняется до 100 000 грыжесечений. При этом число операций прогрессивно растет. Несмотря на множество работ, посвящённых различным аспектам хирургического лечения этого заболевания, проблема остаётся не разрешённой, так как до настоящего времени отсутствуют единые подходы к выбору той или иной операции, нет унифицированной всеобъемлющей классификации, принятой повсеместно, в изучении результатов лечения часто отсутствуют объективные критерии без видимости тенденции.

Низкая эффективность многочисленных аутопластических методов, используемых при грыжесечении, частые рецидивы и, как следствие этого – инвалидизация больных, обуславливают необходимость поиска новых способов лечения и новых пластических материалов. Это в полной мере относится к лечению всех видов грыж.

Сотрудниками медицинского института Пензенского государственного университета разработаны способы ненатяжной протезирующей герниопластики с использованием в качестве протеза ксеноперикардиальной пластины производства ООО «Кардиоплант» при паховых и послеоперационных вентральных грыжах. Проводятся экспериментальные исследования по изучению возможности применения ксеноперикарда для укрытия культи (ран) полых органов брюшной полости и забрюшинного пространства. Для закрытия дефекта брюшной стенки при управляемой лапаростомии с целью профилактики эвентрации перфорированная ксеноперикардиальная пластина использована у двух больных с распространенным гнойным перитонитом. Отмечены высокие прочностные качества материала, отсутствие адгезии прилежащих петель кишечника, стойкость материала в гнойной ране [3, 4].

Ксеноперикард с недавнего времени применяется при протезировании сухожилий, укреплении связочного аппарата суставов. Под руководством профессора Митрошина А.Н. и профессора Сиваконь С.В. сотрудниками медицинского института ПГУ проведено исследование биоинтегративных свойств ксеноперикардиальной пластины «Кардиоплант» для реконструктивно-восстановительных операций в травматологии и ортопедии. Исследование произведено на 15 кроликах породы «Шиншилла» в соответствии с «Правилами гуманного обращения с лабораторными животными», методическими указаниями МЗ РФ «Деонтология медико-биологического эксперимента» (1987), а так же Хельсинкской декларацией от 1975 г. с пересмотром от 1983 г. Животным под внутрибрюшным тиопенталовым наркозом дугообразным разрезом на н/3 голени обнажали ахиллово сухожилие, из него иссекали участок длиной 3 см., формируя дефект. В дефект имплантировали трансплантат, представляющий собой трубку, сшитую из ксеноперикарда, соответствующую диаметру сухожилия.

Ушивали кожу. На конечность накладывали гипсовую повязку на 3 недели. Животным предоставляли полную свободу движений. Изучали характер тканевых перифокальных реакций на имплантацию ксеноперикардиального трансплантата, изменения в ксеноперикарде с течением времени и характера его биоинтеграции, возможность прорастания соединительной ткани в просвет трубчатого трансплантата из зоны контакта с сухожилием. Через год зона имплантации трансплантата внешне мало отличается от интактной части сухожилия. Отмечается незначительное увеличение диаметра регенерата по сравнению с сухожилием. На продольных и поперечных разрезах регенерат представляет собой плотную волокнистую структуру, похожую на сухожилие. Волокна имеют желтоватый цвет. Трансплантат визуализируется не на всех участках, просвет его на всём протяжении заполнен рыхлой соединительной тканью.

При микроскопии выявляется полное замещение ксеноперикарда волокнистым соединительнотканным регенератом. Материал имплантата, начиная с шести месяцев после имплантации, разрушается и замещается коллагеном. Положительные результаты экспериментального исследования позволили применить разработанный ксеноперикард в клинической практике. Сотрудниками кафедры травматологии, ортопедии и военноэкстремальной медицины медицинского института Пензенского государственного университета под руководством профессора А.Н. Митрошина и профессора С.В. Сиваконь разработаны способы пластики поврежденных крупных и мелких сухожилий (ахиллово сухожилие, сухожилия сгибателей пальцев кисти), а так же способы укрепления связочного аппарата крупных суставов с использованием в качестве пластического материала ксеноперикардиальной пластины производства ООО «Кардиоплант». Выполнены протезирующие операции у пациентов с травмой сухожильного аппарата верхней и нижней конечности. Всего выполнено 48 операций у 36 больных. Получен хороший функциональный результат в сроки до 24 месяцев наблюдения у всех оперированных пациентов [38, 39].

Возможно применение ксеноперикарда при следующих операциях: пластика мочевыводящих путей, гинекологические слинги, укрепление мышц тазового дна, урослинги, закрытие культи почки.

Сотрудниками кафедры хирургии медицинского института Пензенского государственного университета под руководством доцента Вихрева Д.В. разработан способ резекции почки с укрытием культи пластиной модифицированного ксеноперикарда производства ООО «Кардиоплант». Техническим результатом предлагаемого способа является достижение надежного гемостаза раневой поверхности почки, регенерация соединительнотканной оболочки почки и ее паренхимы без явлений фиброза с восстановлением анатомической целостности органа.

Наиболее частыми причинами возникновения стрессового недержания мочи являются чрезмерная подвижность или смещение уретры и шейки мочевого пузыря при напряжении и/или недостаточность сфинктерного механизма, который не обеспечивает достаточного сопротивления при резких подъемах внутрибрюшного и внутрипузырного давления. Из множества описанных хирургических методов коррекции стрессового недержания мочи в настоящее время наиболее часто применяются минимально агрессивные модификации слинговых операций и использование уретральных вдавливающих средств [84, 126].

Существует широкий выбор материалов для проведения подобных операций, включающий разные биологические трансплантаты, а также синтетические материалы [34, 104, 126]. К преимуществам использования ксенотрансплантатов относятся отсутствие необходимости в дополнительном оперативном вмешательстве на больном с целью получения аутотрансплантата, ликвидация риска заражения через чужеродный трансплантат, минимальная частота инфекционных осложнений. Не происходит эрозирования и инкапсуляции как при использовании синтетического материала [95].

На кафедре «Хирургия» медицинского института Пензенского государственного университета под руководством профессора Митрошина А.Н. и доцента Вихрева Д.В.

начаты экспериментальные и анатомические исследования возможности применения биосовместимого материала ксеногенного происхождения [6] – ксеноперикарда для пластики мочевого пузыря и выполнения слинговых операций при стрессовом недержании мочи у женщин. На базе гинекологического отделения (зав. отделением А.Б. Дементьева) областной детской клинической больницы им. Н.Ф. Филатова выполнены операции с использованием ксеноперикардиальной пластины при выпадении внутренних органов у 4 больных и стрессовом недержании мочи у двух больных. Осложнений не обнаружено, получен хороший клинический эффект. В настоящее время проводится патентный поиск, готовится заявка на изобретение.

Кроме вышеуказанных областей реконструктивной хирургии возможно применение ксеноперикарда и в таких сферах как: детская хирургия (лечение пороков развития брюшной и грудной стенки, гастрошизис, омфалоцеле, врожденная диафрагмальная грыжа); торакальная хирургия (закрытие дефектов грудной стенки и укрытие культи легкого/бронха при резекции); офтальмология (восстановление стенок глазницы при травмах, ожогах и операциях, хирургическое лечение макулодистрофии, отслойки сетчатки и склеропластики); нейрохирургия (пластика твердой мозговой оболочки); хирургическая стоматология и челюстно-лицевая хирургия (косметологические операции на лицевом черепе, формирование границы между окружающей соединительной тканью и образуемым остеоидом в лунке после удаления корня зуба для последующей фиксации стоматологического импланта).

Накопленный многолетний положительный опыт применения ксеногенных материалов в сердечно-сосудистой хирургии, в частности ксеноперикарда, натолкнул ряд исследователей на проведение исследований по возможностям их использования в ряде других направлений хирургии. Однако упоминания о подобных исследованиях в отечественной литературе встречаются крайне редко [26, 28].

ГЛАВА 2. БИОМЕДИЦИНСКИЕ ТРЕБОВАНИЯ К

КСЕНОПЕРИКАРДИАЛЬНОЙ ТКАНИ

реконструктивно-восстановительной медицины и тканевой инженерии. Настоящая работа носит резкий практический характер и является этапом разработки новых изделий. Поэтому в исследовании много внимания уделено требованиям к разрабатываемым материалам и методам оценки его действия на организм.

Используемые в реконструктивных операциях имплантируемые материалы должны быть не только совместимы по своим биологическим свойствам с тканями реципиента, но и обладать необходимыми физико-механическими характеристиками.

Кроме того, рассмотрение физико-механических характеристик материалов (изделий медицинского назначения) – также необходимый этап оценки биологической безопасности и клинической эффективности изделия [11, 48, 53]. Такое рассмотрение имеет большое значение для заключения о соответствии предложенного материала клиническим требованиям. Установление связи физико-механических характеристик материалов, используемых в клинической практике, с их биосовместимостью и клинической эффективностью является все еще развивающейся областью исследований.

Однако существуют несколько примеров того, как эти связи себя проявляют.

Среди них – биологические материалы для реконструктивных операций.

Исследование их физико-механических характеристик необходимы для получения более полной информации о структуре и свойствах, а также для формулирования рекомендаций к применению материала в той или иной хирургической операции. В виду того, что ксеноперикардиальная ткань находит все новое применение в хирургии, требования к этому материалу расширяются. К примеру, операции, где ксеноперикард служит заплатой и не подвергается механическим стрессам, требования к физикомеханическим параметрам материала минимальны. Однако в случае использования ксеноперикарда в травматологии и ортопедии при пластике сухожильно-связочного аппарата механические параметры трансплантата играют решающую роль.

Изучению механических свойств ксеноперикарда посвящено много работ [9, 56, 57, 72, 74, 87, 103, 114, 115, 127] и нужно заметить, что этот материал достаточно хорошо изучен. Прочностные характеристики ксеноперикардиальной ткани зависят от направленности белковых волокон. Ксеноперикард обладает достаточно выраженными анизотропными свойствами [113,115]. Прочностные характеристики у образцов, выкроенных вдоль направления волокон структурных белков, значительно превосходят прочностные характеристики образцов с поперечным направлением. Абсолютные показатели прочности и упругих свойств ксеноперикардиальной ткани не одинаковы в разных источниках. Это связано с конкретным видом и режимом обработки ткани.

При исследовании физико-механических свойств ксеноперикардиальной ткани определяют следующие основные параметры:

максимальное напряжение/прочность на разрыв относительное удлинение модуль упругости (зависимость напряжение – относительное удлинение) Для определения физико-механических параметров биоткани используют как простые экспериментальные механические установки [66], так и более сложные испытательные машины производства компаний «Tiratest» или «Instron» [33]. Выбор установки зависит от поставленных задач. Как правило, информации об указанных характеристиках достаточно, чтобы сделать вывод о том, что представляет собой материал и насколько адекватно он прошел цикл обработки и модификации. Однако существуют некоторые области, выдвигающие более высокие требования к материалу.

Например, при разработке биологических искусственных клапанов сердца – изделия класса риска, большое значение имеет степень и равномерность зашивки материала сшивающим агентом. Исследователь должен обладать информацией о глубине проникновения глутарового альдегида в ксеноперикардиальную ткань. Неравномерная зашивка коллагена (зашивка по поверхности) может привести к образованию многослойности биоматериала и, как следствие, ограничение механических свойств створок клапана при циклических нагрузках. В таких случаях упругие свойства биоткани определяются по «истинным диаграммам деформирования» [13, 35] для продольной и поперечной деформации при одноосном и однородном растяжении образцов в предполагаемых главных направлениях анизотропии механических свойств.

Исследования деформационно-упругих характеристик методом релаксационной спектрометрии помогает изучить структуру биологической ткани и установить связь с получаемыми физико-механическими характеристиками и связь их изменений в результате обработки (дубящими, сшивающими и т.п. агентами).

Из физико-химии полимеров известно, что образование дополнительных сшивок (на стадии стабилизации ксеноткань обрабатывается сшивающим агентом) в системе должно приводить к увеличению модуля упругости. Возможно поэтому, в большинстве работ в качестве критериев определения степени сшивки и исследований, пространственно сшитых структур предлагается использовать методы определения физико-механических характеристик, таких как разрушающее напряжение при растяжении, определение модуля упругости, метод релаксационной спектрометрии.

2.2. Гистологические и гистохимические методы контроля ксеноперикарда Помимо контроля физико-механических свойств ксеноперикарда для контроля качества обработки биоткани используются гистологические и гистохимические методы исследований и контроля структур соединительных тканей, изучение физикомеханических свойств, анализ содержания солей Са2+. Ниже в таблице 1 приведен обзор гистологических и гистохимических методов контроля качества ксеноперикардиальной ткани.

Таблица 1 – Гистологические и гистохимические методы контроля структур соединительных тканей Метод окрашивания Структура ткани Результат окрашивания гематоксилин-эозином элементы цвет, Окраска по методу Ван- Коллагеновые Коллагеновые волокна окрашиваются в Окраска орсеином Эластические Эластические волокна соединительной Окраска Эластические и Эластические волокна окрашиваются в гематоксилин- коллагеновые жёлтый цвет, пикрофуксином волокна, ядра коллагеновые волокна - в красный цвет;

Окраска по методу Коллагеновые Коллагеновые волокна соединительной Импрегнация Коллагеновые Коллагеновые волокна - коричневый, серебром волокна, ядра ядра клеток - светло-коричневый.

метод Вейгерта Эластические При окраске они приобретают чернорезорцин-фуксином) волокна синий цвет кальция путем обработки пирогалловой кислотой и едким натром выявления импрегнации раствором гипосульфитом натрия Реакция с толуидиновым Гликозаминогли Изменение окраски с синей на

ГЛАВА 3. ОБРАБОТКА КСЕНОПЕРИКАРДИАЛЬНОЙ ТКАНИ

ГА является важным реагентом в области биомедицины, широко используется в качестве сшивающего агента для подготовки биопротезов, таких как клапаны сердца, сосудистые трансплантаты, эластические хрящи, ксеносухожилия и искусственная кожа, для фиксации клеток, иммобилизации ферментов и для сшивки белков и полисахаридов в препаратах контролируемой доставки препаратов. С появлением исследований, посвященных консервирующим свойствам ГА в 1969 г., реагент был успешно использован при подготовке биопротезов клапанов сердца. За последние 45 лет тысячи пациентов получили биоклапаны, фиксированные в ГА. Крупнейшие мировые компании («Edwards Lifescines», «Medtronic», «Sorin Group», «Vascutek Terumo Company» и другие) и по сей день используют ГА в качестве стабилизатора биоткани для изготовления биотрансплантатов и даже живой ткани во время проведения операции [80]. Такая ткань искусственного клапана сердца гарантирует пациенту высокое качество жизни.

ГА-сшивки в коллагеновых тканях значительно снижают скорость биорезорбции ткани, что делает её биосовместимой и нетромбогенной при сохранении анатомичной целостности, прочности и гибкости. Другие альдегиды являются менее эффективными в формировании химически, биологически и термически стабильных поперечных связей.

Ткани, сшитые ГА сохраняют упруго-деформативные свойства структуры фибриллярного коллагена, что делает их пригодными для биопротезирования. Среди альдегидов, которые могут быть использованы для сшивки белковой матрицы, ГА имеет преимущество, т.к. он реагирует достаточно быстро, может охватывать различные расстояния между молекулами белка, а также может вступать в реакцию с большим количеством доступных аминогрупп в молекуле. Это приводит к более плотно сшитой структуре. ГА используется чаще всего в качестве сшивающего агента, нежели любой другой реагент, поскольку это дешевле, доступнее и он легче растворяется в воде.

Водные растворы альдегида состоят из смеси свободного альдегида, моно- и дигидратированных молекул ГА, мономерных и полимерных циклических гемиацеталей и др, ненасыщенных полимеров. В растворе свободный ГА, циклический гемиацеталь (б) и олигомеры (с) находятся в равновесии друг с другом (Рис. 1).

Рисунок 1 – Равновесие глутарового альдегида в водном растворе Содержание свободного альдегида в растворе ГА как правило, не более чем 4%.

Скорость полимеризации ГА в водном растворе зависит от концентрации, рН и температурных циклов. Водный ГА может полимеризоваться при щелочных рН до выхода непредельных продуктов (Рис. 2).

Рисунок 2 – Полимеризация водного раствора ГА в щелочной среде Химизм сшивки ГА. Реакции полимеризации ГА с первичными аминами показана на Рис. 3, которая также подтверждается данными ИК и УФ спектроскопии. Поперечные сшивки в меж- и внутримолекулярных взаимодействиях образуют ковалентные связи.

Это может происходить двумя путями: формирование основания Шиффа по реакции альдегидной группы с аминогруппой лизина или гидроксилизина (Рис. 3) или альдольной конденсации между двумя соседними альдегидами. Связь основания Шиффа не очень стабильна, в то время как продукт альдольной конденсации стабилен.

ГА не только взаимодействует с аминогруппами, но также может реагировать с карбокси-, амидо- и другими группами белков.

Рисунок 3 – Реакция полимеризации ГА с первичными аминами Ряд активности ГА с определенными соединениями выглядит следующим образом:

первичные амины> пептиды> гуанидины> вторичные амины> гидроксильные группы.

По сравнению с формальдегидом и другими альдегидами, поперечные сшивки являются более стабильными, т.к. ГА вступает в реакцию с белками, такими как альбумин и коллаген, в том числе и мукополисахаридами, в том числе, гепарином.

Механизм сшивки глутаровым альдегидом молекул коллагена (кросс-линк) представлен на Рис.4.

Рисунок 4 – Механизм сшивки глутаровым альдегидом молекулы белка ГА широко используется в качестве сшивающего агента для изготовления клапанов из ткани бычьего перикарда или обработки свиных аортальных комплексов и клапанов [85, 86, 93, 97, 98]. За последние 45 лет эти клапаны были имплантированы тысячам пациентов с очень высокой степенью клинического успеха. По сравнению с механическими клапанами, клапаны, обработанные ГА, имеют то преимущество, что они являются биосовместимыми, нетромбообразующими и не разрушают клетки крови, то есть не требуют антикоагулянтной терапии после имплантации. Ткань клапанов также обладает хорошими гемодинамическим свойствами, аналогичными свойствам живой ткани. Использование ГА оказалось успешным в снижении механической и структурной деградации клапанов, а также в снижении послеоперационной инфекции.

Стабилизация ГА выполняет следующие функции:

1) является эффективным стерилизатором в комбинации с выдержкой в формальдегиде после фиксации, 2) уменьшает антигенность белка соединительной ткани, 3) влияет на механические свойства ткани.

Концентрации ГА, которые используют для обработки ткани клапанов колеблется от 0,2 до 0,6%. Более низкие концентрации альдегидов являются неэффективными стерилизаторами, особенно в отношении некоторых видов микобактерий. Более высокие концентрации альдегидов могут сделать ткань слишком жёсткой. Условия фиксации, такие как чистота, концентрация, температура, рН и степень воздействия альдегида определяют тип и степень сшивки и в результате конечные свойства материала.

Хотя метод изготовления ткани клапанов с использованием ГА, как правило, удовлетворителен, были и неудачи. Возможные причины неудач заключаются в следующих основных моментах — разрыв поперечных связей, поглощение белков плазмы, гидролиз коллагена коллагеназой, механические поломки фибрилл коллагена и иммунологические реакции. Однако нет никаких доказательств того, что можно было бы отнести эти проблемы к методу сшивания ткани с использованием ГА. Водные растворы ГА являются сложными, способными претерпевать различные типы реакций.

Все подобные реакции с участием ГА могут способствовать изменению качества фиксации. Поэтому нужны более фундаментальные исследования по методам фиксации белков с использованием ГА для выяснения природы реакций, которые могут пролить свет на причины выхода из строя ткани клапанов. Соединения полиэпоксидов активно используются как агенты, образующие в ткани поперечные сшивки. Они, как сообщается, обеспечивают более выраженный антикальциевый эффект по сравнению с ГА. Непосредственная роль ГА в процессе кальцификации является неопределенной, поэтому преждевременно делать вывод, что эпоксисоединения будет работать лучше, чем ГА, не правильно.

Сшивки ГА не могут быть пригодны для материалов, где происходит взаимодействие и инфильтрации в толщу клеток и для обработки хирургических ран такие материалы не годны. С другой стороны, если определенные коллагеновые структуры остаются нетронутыми после имплантации в ткань, то отказ имплантатов вследствие клеточного вторжения может быть предотвращен путем сшивки ГА.

Также в некоторых работах [68, 89] было изучено влияние сшивки ГА на иммунологический ответ. Антигенность ткани перикарда, фиксируемой в 0,2% ГА и в 1% ГА, изучали на кроликах. Было обнаружено, что ткани, более сильно сшитые ГА, показали меньше антигенности.

ГА, будучи универсальным сшивающим агентом, имеет большое значение в подготовке биологических протезов. Излишне говорить, что остаточный ГА в имплантатах вреден, и достаточно, проявляя осторожность, удалить непрореагировавший ГА до имплантации, чтобы снизить токсичность. Аминокислоты, такие как L-глутаминовая кислота и глицин были использованы, чтобы нейтрализовать остаточный ГА, а также активные концы альдегида в ткани матрицы после сшивания.

Эти альдегид-обработанные материалы показали низкую цитотоксичность в клетках в культуре. Эти результаты также были обнаружены в методах по эндотелизации ткани in vivo. Эффективность промывки биопротезов и важность носителей были должным образом подчеркнуты в литературе, это устранило бы по крайней мере первичный цитотоксический эффект ГА. Различные методы фиксации были изучены для того, чтобы преодолеть некоторые из неблагоприятных последствий сшивания ГА на механические свойства ткани. Они показали очень обнадеживающие результаты. Были подготовлены ГА-фиксированные ткани с механическими свойствами напоминающие натуральные ткани. Однако наличие таких методов, которые смогли бы преодолеть такие проблемы, как разрыв и кальциноз биопротезов, в долгосрочной перспективе еще предстоит выяснить.

Были предложены альтернативные методы зашивки ткани, чтобы преодолеть некоторые из проблем, как считается, связанных со сшиванием ГА. Полиэпоксиды, глицерол, карбодиимиды, и т.д. были изучены в качестве сшивающих агентов вместо ГА. Обработка полиглицидиловым эфиром и сшивка ГА, как сообщается, механически эквивалентны при изготовлении биопротезов из бычьего перикарда. Хотя створка свиного аортального клапана, фиксированная полиглицидиловым эфиром, показала меньше кальцификации, чем ГА-фиксированные имплантаты в исследованиях подкожным оперированием, они также показали не очень хорошие результаты в сопротивлении ферментативной деградации. Таким образом, у ГА-фиксированных биопротезов, похоже, много достоинств по сравнению с недостатками, которые связаны с этим реагентом в качестве потенциального сшивающего агента. Более фундаментальные исследования по химии сшивки белка с использованием ГА может пролить свет на некоторые проблемы, связанные, как считается в настоящее время, с этим реагентом [82].

На сегодняшний день среди биосовместимых материалов несколько обособленно стоят материалы ксеногенного происхождения. Связано это, прежде всего, с малым числом научных исследований, посвященных изучению возможности применения данных материалов в различных отраслях хирургической практики. Имеющиеся же наработки носят локальный характер, поскольку возможность проведения данных исследований обусловлена близостью производства данных материалов, прежде всего, для нужд сердечно-сосудистой хирургии.

Ксеноперикардиальная ткань является широко используемым материалом для изготовления различных биопротезов (биопротезов клапанов, моностворок, кондуитов, пластических материалов, биопротезов сосудов большого диаметра и т.д.). Существуют различные химико-ферментативные методы обработки ксеноперикарда. Основной целью всех методов модификации является создание ткани, обладающей рядом свойств, таких как :

- иммуноинертность, - высокая резистентность биологической ткани к кальцификации, - минимальный риск тромбоэмболий, -сохранение структуры коллагеновых волокон, - высокая плотность поперечной сшивки коллагена, - возможность имплантации пациентам молодого и даже детского возраста, - высокая гемосовместимость, - хорошее моделирование в месте имплантации, - нулевая хирургическая порозность, -прочностные деформативные характеристики, сопоставимые с таковыми тканей в месте его применения, - минимально выраженные адгезивные свойства, - устойчивость к инфекции и способность к эндотелизации.

Типичные недостатки имплантатов из биологического материала – склонность их к биорезорбции или кальцификации; возможное проявление нежелательных иммунных реакций; опасность инфицирования. В ряде регионов использование биологических ксеноматериалов затруднено из-за социальных и религиозных особенностей.

Распространенным риском при длительном применении имплантатов из биотканей является склонность к кальцификации – образование кальцийсодержащих отложений на поверхности или в объеме имплантируемых изделий. Это огромная проблема для всех разработчиков МИ. Как правило, это приводит к потере функциональных свойств имплантатов и необходимости реоперации. Различают внутреннюю и внешнюю локализацию отложений. При внутренней локализации для биотканей характерно внутрифибриллярное, при наружной – межфибриллярное отложение и отложение на поверхности. Иногда они связаны с образованными при взаимодействии имплантата со средой организма структурами: тромбами, капсулой псевдоинтимы. Кальцификация биоматериалов представляет собой сложный и многостадийный процесс. Поэтому для его исследования привлекают различные физические, биомеханические, иммунологические методы, используют эксперименты как в условиях in vitro, так и в условиях in vivo.

Применение практически любой методики обработки ксеноперикарда преследует цель полного удаления из биоматериала клеточных элементов, водорастворимых белков и концевых теллопептидов коллагена, как основных антигенов, и сохранение фибриллярных белков (коллаген и эластин), не нарушая при этом их тинкториальных свойств [20], а также последующую антикальциевую обработку биоматериала. Поэтому в этой работе обзор методов модификации ткани и способы её антикальциевой обработки будут рассмотрены вместе.

Наиболее часто встречается ксеноперикард, обработанный глутаровым альдегидом [31, 63, 98, 112, 124].

Методы химической обработки биоткани для изготовления биопротезов с использованием глутарового альдегида защищены патентами на изобретение [44, 116].

Ткань обрабатывается ГА, приготовленном на различных видах буферных растворов, например, на фосфатном (рН=7.4) или более распространенном HEPES-буфере (рН=7.4) с последующей стабилизацией поверхностно-активными веществами. Основная цель использования поверхностно-активных веществ в данной технологии - профилактика кальцификации биоткани. В качестве поверхностно-активных веществ, ингибиторов кальциноза в данном случае используют додецилсульфат натрия, лаурил-сульфат натрия, тритон X-100 и другие. Они легко проникают в биоткань, сорбируются на коллагене и протеогликанах, способствуют разрушению межмолекулярных связей, за исключением ковалентных, и образованию дополнительных свободных аминогрупп.

Ингибирующее действие SDS на процессы кальциноза биоткани связывают с активацией фиксации ионов кальция из среды с образованием защитного кальциевого слоя и с его способностью удалять из биоткани кислые фосфолипиды [88].

Клетки или их фрагменты животного-донора биоматериала могут инициировать реакции иммунного отторжения имплантата в организме реципиента. С целью предотвращения иммунологических реакций необходимо удалить все клетки или их фрагменты из биопротеза на этапе его приготовления. Данная цель достигается частично путем использования глутаральдегида в процессе фиксации ткани, путем отмывки тканей на начальном этапе обработки дистиллированной водой или гипотоническими растворами, что приводит к лизису клеток.

Продолжительность работы имплантатов из биоматериалов, обработанных глутаральдегидом, ограничена процессами биодеградации компонентов биоматериала под действием протеолитических ферментов организма реципиента. В то время как резорбция коллагеновых волокон биопротеза предотвращается благодаря образованию поперечных сшивок при обработке глутаральдегидом, волокна эластина подвержены ферментативной деградации, что приводит к уменьшению срока службы имплантата.

Установлено, что добавление танниновой кислоты (tannic acid) к системе на стадии фиксирования глутаральдегидом может существенно повышать устойчивость волокон эластина к ферментативной деградации [78, 79].

Использование глутаральдегида для фиксации и стерилизации имплантатов из биоматериалов имеет и побочный эффект, обусловленный высокой токсичностью данного вещества. Для снижения токсического эффекта глутаральдегида используют следующие подходы:

а) нейтрализация глутаральдегида;

б) использование в качестве стерилизующего агента и раствора для хранения имплантата нетоксичных систем [118, 119, 121];

в) использование в качестве агента для фиксации менее токсичных соединений (Ultifix-метод [73]).

В целом, нужно сказать, что помимо всех преимуществ, отрицательные эффекты традиционных методов обработки биоматериала ГА хорошо известны [72, 70, 99, 111], так же как и известны методы борьбы с этими недостатками. Учитывая это обстоятельство, минусы использования ГА не влияют на потребность в широком применении этого реагента в биомедицине.

Так же в литературе описаны способы обработки биоткани с целью подавления ее минерализации путем контактирования ткани с водным раствором четвертичной аммонийной соли, в составе которой есть, по крайней мере, один из алкильных радикалов, содержащих 7-15 атомов углерода (Авт. св. СССР 4405327, МКИ 6 А 61 F 2/24, 1983). Недостатком этого способа является тот факт, что обработка раствором четвертичной аммониевой соли лишь экранируют поверхность биоткани, ограничивая, таким образом, доступ минеральных (кальциевых и фосфатных) соединений, а при малейшем нарушении этого "экрана" процесс минерализации развивается. Кроме того, отсутствие ферментативной обработки не обеспечивает снижения иммуногенности.

Ферментативная обработка биоткани необходима для разрушения клеточных элементов (иммуногенных компонентов). В 1988 г. был описан способ подготовки биоткани для ксенопротезирования путем ферментативной обработки террилитином в фосфатном буферном растворе (из расчета 30 протеолитических единиц на 1 г веса влажной ткани ПЕ/г) в течение 4 ч при 43oС, последовательной отмывки в кислотном растворе (20 г лимонной кислоты, 100 г хлорида натрия и 1 л воды), в 1 М растворе гидрокарбоната натрия и растворах хлорида натрия, выдержки в многократно заменяемом растворе глутарового альдегида в буферном растворе с возрастающей концентрацией и стерилизации (Авт. св. СССР 1398855, МКИ 6 А 61 F 2/24, 1988).

Недостатками данного способа являются высокая концентрация фермента, вызывающая разрушение коллагеново-эластической основы биоткани, высокая температура ферментативной обработки, что может привести к снижению активности фермента, а также использование фосфатного буферного раствора в качестве растворителя фермента и лимонной кислоты для создания кислой среды при отмывке, что приводит к образованию нерастворимых фосфатов и цитратов и дальнейшей минерализации биоткани.

В целях уменьшения расхода фермента и предотвращения минерализации биоткани данный метод был модернизирован и описан в патенте РФ № 2197818 [45].

Сущность способа состоит в том, что биоткань для ксенопротезирования перед ферментативной обработкой выдерживают в течение 15-72 ч в гипертоническом растворе хлорида натрия 1-10%-ной концентрации, обрабатывают ферментом в боратном буферном растворе при 32-37OС, отмывают сначала в 0.6-6%-ном растворе уксусной кислоты, затем в растворе гидрокарбоната натрия и растворах хлорида натрия, выдерживают в многократно заменяемом растворе глутарового альдегида в буферном растворе с возрастающей концентрацией и стерилизуют. Так же биоматериал, может быть, подвергнут ферментативной обработке с целью удаления конкретных иммуногенных факторов (антигенов), представленных преимущественно соединениями на основе углеводов.

В US Patent Application № 6696060 [123] рекомендовано использование гликозидаз (например, альфа-галактозидазы) для удаления углеводных остатков и использование протеиногликанразрушающих факторов (гиалуронидазы, хондроитиназы АВС) для разрушения протеогликанов.

В современной научной литературе часто встречаются методы обработки ксеноперикарда, основанные на обработке биоткани 2-5%-ным раствором диглицидилового эфира этиленгликоля с последующей обработкой раствором гепарина с концентрацией не менее 100 МЕ/мл (Пат. РФ 2008767 С1, МКИ 6 А 01 N 1/00, 1994), диэпоксисоединениями [51, 52, 59, 60, 62].

Такая обработка придает ксеноперикарду высокую прочность, сохраняя при этом его естественную пластичность, биосовместимость и отсутствие кальциевой дегенерации, что характерно для всех биопротезов, традиционно обработанных глютаровым альдегидом [63, 61].

Естьь мнение, что замена глутарового альдегида на диэпоксид способствует значительному снижению кальцификации у взрослых пациентов (до 0,1% от общего количества имплантаций) [2]. Однако у детей раннего возраста частота развития кальцификации биопротезов остается высокой даже при использовании эпоксидной консервации. Кальцинозу подвержено до 20% от имплантированных биопротезов [30].

изготовленных на основе биоматериалов, являются: а) наличие фосфолипидов; б) наличие остаточных или непрореагировавших молекул глутаральдегида в тканях биопротеза.

Эффективная экстракция фосфолипидов и холестерина из ткани может быть достигнута путем предварительной обработки (до фиксации ГА) биоматериала 80% этанолом (рН раствора 7,4) в течение 24 часов [71] либо путем использования в процессе фиксации ткани смеси [122] из фиксирующего агента (глутаральдегид, формальдегид, эпоксиды, карбодиимиды, диизоционаты), денатурирующего агента (этанол, изопропиловый спирт, ацетон, эфиры с небольшой алкильной цепью, кетоны, мочевина) и поверхностно-активного вещества (SDS, Triton X-100, Triton X-114, Igepal, Nonidet P40). В US Patent №6479079 [120] приведены примеры экстракции липидов спиртовыми смесями различного состава (низшие спирты, высшие спирты, многоатомные спирты, органические растворители) при повышенной температуре из бычьего перикарда.

С целью нейтрализации непрореагировавших молекул глутаральдегида биоматериал после стадии фиксации обрабатывают 0,01 – 0,5 М раствором глицина [US Patent 20030068815 Sterilized xenograft tissue]. Другие способы нейтрализации и детоксикации глутаральдегида: а) обработка фиксированного биоматериала уразолом (urazole) в 0,1 М ацетатном буфере при рН 4,5 и температуре 370С в течение 7 дней [112] б) обработка гомоцистеиновой кислотой (homocysteic acid) [124]; азотсодержащими веществами (амины, гетероциклы, аминокислоты) [128].

Кроме того, в US Patent 4648881 [117] уделяется большое внимание составу буферов, используемых для транспортировки, хранения, промывки и фиксации тканей.

В частности на всех этапах обработки биоматериала предлагается избегать использования буферов, в состав которых входит фосфат, поскольку авторами обнаружено, что в таком случае кальцевание биоматериалов значительно снижено.

Авторами найдено, что наиболее пригодным для обработки биоматериалов является буфер 0,002 – 0,05 М HEPES с рН 7,1 – 7,5 (наиболее оптимальный 0,02 М HEPES с рН 7,3). Авторами рекомендовано использование буферов, в состав которых вместо фосфата входят борат, карбонат, какодилат, а также буферов MOPS, PIPES. Авторы сообщают также, что использование в процессе обработки биоматериалов солей двухвалентных металлов (магния, бария, стронция, меди, цинка), являющихся конкурентами кальция за места связывания в ткани, ведет к снижению кальцификации имплантатов. Согласно данному патенту свиные клапаны, доставленные в 0,02М HEPES с рН 7,3, зафиксированные в 0,02М HEPES с рН 7,3 + 0,25% MgCl2 +0,625% глутаральдегид, отмытые в 0,02М HEPES с рН 7,3 + 0,26% MgCl2, стерилизованные в 0,02М HEPES с рН 7,3 + 0,26% MgCl2 + 4% формальдегид, отмытые и сохраненные в 0,02М HEPES с рН 7,3 + 0,26% MgCl2 + 0,625% глутаральдегид, демонстрировали значительное снижение кальциноза опытах с лабораторными животными.

Значительное снижение уровня кадьциноза биопротезов сердечных клапанов было показано в лабораторных исследованиях, в которых в процессе фиксации тканей использовался хелатообразующий агент – ЭДТА [110]. С помощью электронной лучевой томографии было показано, что у некоторых пациентов удалось уменьшить обызвествленные атеросклеротические бляшки с помощью применения комбинации этого хелатора и антибиотика тетрациклина [90].

Было установлено большое сходство между процессом кальцификации клапана, особенно аортального, и процессом кальцификации при атеросклерозе.

Предотвращение кальцификации ГА-фиксированного бычьего перикарда показано при обработке биоткани 40% раствором октандиола [103]. В работе [76] продемонстрировано снижение кальциевой дегенерации бычьего ГА-фиксированного перикарда с помощью хелатора TPEN без какого-либо влияния на его долговечность.

Несмотря на разногласия в научном сообществе, некоторое количество современных работ посвящены методу антикальциевой обработки с использованием лимонной кислоты. Кроме декальцифицирующего действия, щелочные цитраты также имеют некоторые другие полезные свойства, такие как предупреждение образования кристаллов кальция [83, 101, 102, 109, 125], регулирование метаболизма кальция и некоторые противовоспалительные свойства [91], что дает авторам работ основание рассматривать щелочные цитраты в качестве бойцов передовой линии в борьбе по удалению и/или предотвращению кальцификации на нативных человеческих клапанах сердца [69].

Так же перспективными в плане подавления кальций-связывающей активности биоткани представляются фармакологические препараты из группы дифосфонатов.

Дифосфонаты являются регуляторами обмена кальция и используются при различных его нарушениях. Данные соединения подавляют преципитацию фосфата кальция из растворов, блокируют его трансформацию в гидроксиапатит, предотвращая тем самым его кристаллизацию.

В настоящее время синтезированы уже три поколения фармпрепаратов данного класса; в том числе, отечественный Ксидифон. Для иммобилизации на биоматериал оптимальным следует считать препарат второго поколения Аредиа, выпускаемый компанией «Новартис» и зарегистрированный в России.

По химической структуре это – 3-амино-1-оксипропилидендифосфоновая кислота, боковая аминогруппа которой может быть использована для образования связи со свободной группой диэпоксида, не вступившей в реакцию поперечной сшивки (так называемая masking group). Именно этот механизм был использован в исследованиях 80-х годов, выполненных как зарубежными, так и отечественными учеными. Эти работы доказали антикальциевую эффективность ковалентной иммобилизации аминосодержащих дифосфонатов на биоматериалы, консервированные глутаральдегидома так же на эпоксиобработанный перикард. Биоматериал, модифицированный дифосфонатом, исследовали путем световой микроскопии с окраской препаратов гематоксилин-эозином и пикрофуксином по Ван-Гизону [30].

Итак, литературные данные пестрят информацией о том, насколько разные подходы могут быть к проблеме обработки ксеноткани. Это говорит о том, что в настоящее время, несмотря на активное изучение данной проблемы, единого решения не существует, и поиск ответа на этот вопрос продолжается.

Таким образом, современные медицинские технологии позволяют дистанционно выполнять сложнейшие оперативные вмешательства, оказывать высокотехнологичную лечебную и диагностическую помощь, которая несколько лет назад казалась просто фантастикой. Однако, не смотря на все достижения медицинской науки, остаются проблемы, которые были актуальны как во времена Гиппократа, так и в настоящее время. Это проблемы восстановления или полного замещения органов и тканей человека.

На сегодняшний день биоматериалы на основе мягких тканей ксеногенного происхождения нашли наибольшее применение в реконструктивно-восстановительной хирургии в силу очевидных преимуществ перед имплантатами другой природы. Одним из самых распространенных среди таких биоматериалов является модифицированный ксеноперикард. Он на протяжении нескольких десятилетий успешно применяется в межжелудочковой перегородок, создания искусственных клапанов сердца, протезирования магистральных сосудов и т.д. Накопленный положительный опыт применения ксеноперикарда в сердечно-сосудистой хирургии натолкнул ряд исследователей на проведение тестов по возможности его использования в других направлениях хирургии.

В силу того, что область клинического применения ксеноперикарда расширяется, растут и требования к этому материалу. Если раньше исследователей интересовала биоткань, пригодная только для кардиохирургии с узким спектром требований, то сегодня хирургам нужен биоматериал с самыми разными физико-механическими и биорезорбируемыми параметрами.

ксеноперикарда с целью получения «интеллектуальных» имплантатов с заданными характеристиками и является частью большой научно-исследовательской работы по созданию медицинских изделий нового поколения.

II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

4.2. Определение физико-механических параметров ксеноперикарда Исследование зависимости «напряжение — относительное удлинение» для определения модуля упругости проводилось на экспериментальной установке. Для исследования выбирались однородные по толщине образцы ткани перикарда, толщина ткани определялась микрометром не менее чем в 10 точках, на ткани выбирались участки одинаковой толщины, после чего из нее специальным приспособлением вырубались образцы шириной 2 мм и длиной 20-30 мм. Образцы закреплялись в зажимах таким образом, чтобы рабочая часть образца составляла 18-20 мм.

Используемая установка позволяла оценивать ряд физико-механических свойств образцов при их нахождении в физиологическом растворе. Во время проведения измерений образцы помещались в 0,9% раствор хлорида натрия (физиологический раствор). Расчет сечения растянутого образца выполняли с учетом его несжимаемости.

Образцы представляли собой прямоугольные параллелепипеды, объем которых определялся путем произведения трех измерений. В результате удлинения образца при приложении нагрузки, увеличивается высота параллелепипеда, и уменьшается площадь поперечного сечения. Формула для расчета поперечного сечения:

S= (lo* h* a)/( lo+l) lo – начальная длина образца, мм h – толщина образца(0,25-0,4 мм) a – ширина образца (в условиях эксперимента 2 мм.) l – удлинение образца при приложении нагрузки, мм Исследования проводились в диапазоне температур от 20 до 24оС.

Все исследования зависимости напряжение – относительное удлинение проводили в области упругих деформаций.

В этой области зависимость относительного удлинения от напряжения описывается законом Гука:

Где - напряжение Па, рассчитываемое по формуле:, где F- приложенная сила, H;

S – площадь поперечного сечения, м2;

E – модуль упругости, Па.

Область упругих деформаций определяли по следующим признакам: если после каждого цикла нагружение-снятие нагрузки, образец мгновенно восстанавливал свои первоначальные размеры, то данная область относилась к области упругих деформаций.

Модуль упругости определяли по тангенсу угла наклона прямых в координатах напряжение – относительное удлинение.

Исследование остальных физико-механических характеристик экспериментального материала определяли на испытательной машине «Instron Biopuls 3342 (0,5 кН)» с анализом следующих параметров: максимальная нагрузка, напряжение при растяжении при максимальной нагрузке, относительное удлинение при растяжении.

4.3. Исследование скорости резорбции биоматериалов на модели in vitro Исследование скорости резорбции материала определяли на модели in vitro.

Определяли время резорбции образцов ксеноперикарда в боратном буферном растворе (рН=7,4). Испытание окислительной деструкции матриксов проводили в реактиве Фентона (рН=7,4). Последний содержит 100 мкмоль/л сульфата железа (Fe2+) и 1 ммоль/л 3 % Н2О2. Образцы высушивали до постоянной массы при 70-850С. Измеряли массы с точностью до 0,0001 г, затем погружали в модельную среду, инкубировали при 370С и извлекали по прошествии 2, 4, 12 недель. Образцы снова высушивали и взвешивали. Резорбцию образцов, сопровождающуюся уменьшением массы, отмечали, взвешивая образцы на сроках 2, 4 и 8 недель. Частота смены среды: 1 раз в 3 дня.

4.4. Исследование местного действия биоматериалов после имплантации

Работа выполнена на базе вивария ФГБОУВПО «Пензенской государственной сельскохозяйственной академии» под руководством профессора Г.И. Боряева.

Эксперименты на животных (крысах линии Wistar) выполнены с соблюдением всех правил асептики, в соответствии с международными и Российскими принципами и нормами, регламентированными приказами МЗ СССР № 176 от 12.08.1977, № 1179 от 10.10.1983, № 267 МЗ РФ от 19.06.2003, Хельсинской декларацией Всемирной медицинской ассоциации о гуманном отношении к животным (1964), Европейской конвенцией по биоэтике (1996), основами законодательства РФ (1993). Была использована биологическая модель для изучения тканевой реакции на имплантируемый материал и процесса его биоинтеграции в эксперименте на мелких лабораторных животных — крысах. Морфологические особенности подкожной жировой клетчатки человека и крыс сходны по некоторым параметрам. Общими являются: рыхлая соединительнотканная основа, ячеистое строение, плотность кровеносных сосудов. К достоинствам операций на мелких лабораторных животных можно отнести экономичность и возможность выполнения операций в сравнительно небольшом помещении, без привлечения дополнительных средств и специалистов.

Эксперимент проводили на самцах крыс, породы Wistar, массой 220-260г.

Животных содержали на стандартной лабораторной диете. За 24 часа до проведения оперативного вмешательства животные не получали пищи. Перед процедурой имплантации удаляли шерсть с поверхности кожи крыс. Экспериментальную биологическую модель создавали путем имплантации образцов испытуемых материалов под кожу в область межлопаточного пространства подопытным животным. Область имплантации характеризуется малой подвижностью подлежащих анатомических образований. Кроме того, область межлопаточного пространства является одной из наименее доступных для самого животного, таким образом, вероятность его вмешательства в экспериментальный процесс сводится к минимуму. Операцию проводили в стерильных условиях, под эфирным наркозом. Подкожные карманы формировали с помощью стерильного заостренного шпателя. Разрез закрывали рассасывающейся нитью. Рану обрабатывали антисептиком и закрывали клеем медицинским БФ-6.

4.5. Гистологическое исследование образцов биоматериала Исследования проводились в соответствии с ГОСТ Р ИСО 10993-6-2009 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 6.

Исследования местного действия после имплантации". Тканевую реакцию и изменение структуры биоматериала после имплантации изучали методом световой микроскопии с окраской препаратов гематоксилин-эозином и по Вейгерт-Ван-Гизону.

Образцы биоткани фиксировались в нейтральном 5% формалине не менее чем на 24 часа. После фиксации из образца в произвольном порядке иссекался фрагмент размером 10х10 мм и помещался в емкость с проточной водой не менее чем на 6 часов.

Затем для обезвоживания образцы обрабатывались спиртом с возрастающей концентрацией (50% и 60% по 4-6 часов; 70%, 80% и 90% по 8-12 часов; в 2-х порциях100% спирта по 12-24 часов). Обезвоженные образцы помещались в чистый хлороформ на 1-1,5 часа с двухкратной сменой хлороформа. Затем куски помещались в смесь хлороформа с парафином (1:1) при температуре 370С, на 3-6 часов. После пропитывания куски выкладывались в силиконовую форму и заливались парафином. С парафинового блока с помощью микротома МЗП-01 «Техном» делали срезы толщиной 5- гистологические стекла с целью депаранифизации погружали в две порции ксилола на 2-4 минуты в каждой порции. Для удаления ксилола стекла погружали в спирты нисходящей концентрации: 96% - на 2-3 минуты, 70% - на 2 минуты. Остатки спирта удаляли погружением стекла в дистиллированную воду на 2 минуты.

Окраска предполагает использование основного красителя гематоксилина, окрашивающего базофильные клеточные структуры (ядро, рибосомы, РНК-богатые участки цитоплазмы) ярко-синим цветом, и спиртового красителя кислого эозина Y, окрашивающего эозинофильные структуры клетки (цитоплазма) красно-розовым цветом.

После извлечения стекла из дистиллированной воды на срез при помощи пипетки наносили 5-7 капели гематоксилина и выдерживали в течение 1-2 минут. После удаления гематоксилина стекло помещали под проточную воду на 2 минуты. После этого стекло помещали в эозин на 2-3 минуты. Для обезвоживания препарат помещали в растворы с возрастающей концентрацией спирта: 70% спирт – быстро 5-10 секунд; 96% спирт – в течение 2 минут. После обезвоживания стекло на 2 минуты погружали в ксилол. После ксилола препарат накрывали покровным стеклом. На окрашенный срез наносили 1-2 капли бальзама с последующим укрыванием его покровным стеклом.

Метод окраски микропрепаратов в гистологии, предназначенный для изучения структуры соединительной ткани. Красителем служит смесь кислого фуксина и пикриновой кислоты, причем первый компонент окрашивает коллагеновые волокна в ярко-красный цвет, а второй придает прочим структурам ткани жёлтую окраску. В результате окраски ядра клеток приобретают чёрный цвет, коллаген — красный, другие тканевые элементы (включая мышечные волокна и эритроциты) — желтые, фибрин — жёлтый или оранжевый.

Высушенные гистологические стекла с целью депаранифизации погружали в две порции ксилола на 2-4 минуты в каждой порции. Для удаления ксилола стекла погружали в спирты нисходящей концентрации: 96% - на 2-3 минуты, 70% - на минуты. Остатки спирта удаляли погружением стекла в дистиллированную воду на минуты. Наносили на срез 10 капель раствора йодной кислоты, оставили на 5 мин.

Поместили срезы в раствор Вейгерта, закрыли контейнер (предотвращение испарения этанола) и инкубировали ночь. Промывали срезы в дистиллированной воде. Наносили на срез 10 капель дифференцирующего кислотного буфера, оставили на 10 мин. Затем наносили на срез 10 капель железного гематоксилина Вейгерта 1 и добавили 5 капель железного гематоксилина Вейгерта 2, оставили на 10 мин. Подсиняли образцы в проточной воде в течение 10 мин. Затем наносили на срез 10 капель пикрофуксина по Ван-Гизону, оставили на 7 мин. Быстро (2-3 сек) промывали срезы в дистиллированной воде. Для обезвоживания препарат помещали в растворы с возрастающей концентрацией спирта: 70% спирт – быстро 5-10 секунд; 96% спирт – в течение минут. На окрашенный срез наносили 1-2 капли бальзама с последующим укрыванием его покровным стеклом.

микрофотографии препарата. Микроскопические исследования для изучения местного действия после имплантации проводились согласно ГОСТ Р ИСО 10993 6-2009.

Гистологические срезы изучали с использованием микроскопа Zeiss Imager A1 (Zeiss).

Изображения получали с помощью камеры AxioCam Mrc 5 (Zeiss).

4.6. Экспериментальные модели для оценки функциональных свойств ксеноперикардиальных биоматериалов в условиях in vivo 4.6.1. Экспериментальные животные и их содержание В качестве экспериментальных животных для оценки функциональных свойств ксеноперикардиальных биоматериалов были выбраны кролики породы Шиншилла массой до 3,5 кг. Выбор именно этих животных для модели имплантации биоматериала в брюшную стенку обусловлен наличием хорошо выраженной апоневротической структуры по средней линии брюшной стенки (Рис. 5), в отличие от лабораторных крыс, у которых апоневроз наружной косой мышцы живота выглядит как тонкая, трудно препарируемая соединительно-тканная структура.

Рисунок 5 – Передняя брюшная стенка экспериментального животного (по краям Имплантация биоматериала в этом случае могла быть крайне затруднительной, что повлияло бы на достоверность результатов оценки функциональных свойств. Выбор экспериментальных животных для модели имплантации биоматериала в мочевой пузырь обусловлен размерами лабораторных животных. Мочевой пузырь лабораторной крысы слишком мал.

Исследования были проведены в соответствии с требованиями «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ МЗ СССР №755 от 12.08.1987г.); федерального закона «О защите животных от жестокого обращения» от 01.01.1997г.; приказа № 267 МЗ РФ от 19.06.2003 г. ("Об утверждении Правил лабораторной практики") и требованиями «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях»

(Страсбург, 1986г.). Акклиматизация животных в виварии испытательного центра ЗАО НПП «МедИнж» проходила в течение 14 суток. Во время этого периода все животные оставались здоровыми. Кроликов содержали в стандартных условиях, в просторных металлических клетках с вентилируемым дном. Лабораторные животные содержались на стандартной диете. Микробиологический статус кормов соответствует ГОСТ Р 51849-2001 «Ветеринарно-санитарные нормы и требования к качеству кормов для непродуктивных животных» и не оказывает негативного влияния на результаты проводимого теста. Для питья использовали фильтрованную водопроводную воду в стандартных питьевых бутылочках. Микробиологический статус воды соответствует СанПиН 2.1.4.1074-01 «Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения». Доступ к воде и корму свободный. В качестве подстила использовали древесные опилки лиственных пород. В комнате содержания животных поддерживали постоянные условия окружающей среды: температура 18C, относительная влажность 50-65%, 12-ти часовой цикл освещения и 10-ти кратная смена объема воздуха комнаты в час. Температуру и влажность регистрировали и документировали раз в день.

4.6.2. Модель имплантации биоматериала в брюшную стенку Оценку функциональных свойств биоматериала «КБ-I» проводили на модели протезирования брюшной стенки. В качестве экспериментального животного были выбраны 15 половозрелых кроликов-самцов породы Шиншилла массой до 3,5 кг. Таким образом, была создана модель имплантации исследуемого ксеноперикардиального биоматериала, максимально приближенную к условиям протезирования брюшной стенки человека. Материалом сравнения в эксперименте была полипропиленовая сетка «Линтекс», производства г. Санкт - Петербург, широко применяемый синтетический препарат для укрытия дефектов соединительной ткани после грыжесечения. По окончании эксперимента проводили сравнительную оценку результатов имплантации синтетического материала и ксеноперикардиального биоматериала. Перед имплантацией было выбрито операционное поле. Кожу была обработана раствором йодопирона и 70% раствором этилового спирта. Животных подвергали общей анестезии методом масочного эфирного наркоза по открытому контуру. Выполняли срединный продольный разрез передней брюшной стенки и подлежащих тканей длинной 5 см.

Тупым путем препаровали ткани передней брюшной стенки до апоневроза наружной косой мышцы живота. Апоневроз рассекали в продольном направлении и помещали между его листками подготовленные имплантаты размером 2х2 см (Рис. 6).

Рисунок 6 – Имплантация ксеноперикардиального биоматериала (1) и полипропиленовой сетки (2) между краями рассеченного апоневроза кролика полипропиленовой нити «Premilene» 5/0 (BBraun). Ушивание рассеченной ткани передней брюшной стенки выполняли непрерывным швом рассасывающейся нитью «ПГА» 5/0 (МедИнж). Кожу в области операционной раны обрабатывали раствором йода. Мягкие ткани вокруг зоны операции инфильтрировали раствором антибиотика широкого спектра действия (цефазолин) из расчета 0,01 г на 100 г веса животного. Из состояния наркотического сна кролики выходили через 15-20 минут после прекращения подачи эфира. В послеоперационном периоде животных содержались в виварии на стандартном пищевом режиме. Проводилось наблюдение за состоянием операционных ран. Осложнений в раннем послеоперационном периоде выявлено не было. Из эксперимента животных выводили путем передозировки эфира через 3, 6 и 12 месяцев после операции. Из зоны имплантации полипропиленовой сетки и ксеноперикарда получали по 4 образца ткани размером 5х5 мм, которые помещали в 10% раствор нейтрального забуференного формалина, затем проводили гистоморфологическое исследование. Гистологическое исследование проводили по описанной ранее методике.

Светооптическое исследование окрашенных срезов проводили с помощью микроскопа фирмы «Carl Zeiss» под увеличением от 40 до 400 раз. Морфометрическое исследование выполняли с использованием фотографической насадки к микроскопу «Axioskop». В препаратах, полученных при вшивании в переднюю брюшную стенку кроликов ксеноперикардиального биоматериала и полипропиленовой сетки, посредством программ «Axiovision» и «Image Tool v.3.0» подсчитывали: количество фибробластов и фиброцитов, относительную площадь коллагеновых и эластических волокон, относительную площадь волокон ксеноперикардиального биоматериала. Кроме того, подсчитывали площадь коллагеновых и эластических волокон с серозной и фиброзной сторон ксеноперикардиальной пластины (окраска срезов по Ван-Гизону-Вейгерту).

4.6.3. Модель имплантации биоматериала в мочевой пузырь экспериментальной модели «in vivo» (протезирования дефекта мочевого пузыря) на четырёх половозрелых кроликах-самцах породы шиншилла массой до 3,5 кг. Перед имплантацией было выбрито операционное поле. Кожу была обработана раствором йодопирона и 70% раствором этилового спирта. Животных подвергали общей анестезии методом масочного эфирного наркоза по открытому контуру. Эксперимент включал размещение ксеноперикардиального биоматериала (лоскуты размером 1х1 см) в теле мочевого пузыря. Причем серозной стороной биоматериал моделировали в просвет пузыря, фиброзной – к брюшине. Биоматериал фиксировали рассасывающимся шовным хирургическим материалом со средним сроком рассасывания нитью Safil 3/0 колющей иглой HS1/2 17 мм. Кожу в области операционной раны обрабатывали раствором йода.

Из состояния наркотического сна кролики выходили через 20-25 минут после прекращения подачи эфира. В послеоперационном периоде животных содержались в виварии на стандартном пищевом режиме. Проводилось наблюдение за состоянием операционных ран экспериментальных животных. Осложнений в раннем послеоперационном периоде выявлено не было. Выведение животных из опыта производили через 6 и 12 месяцев. Гистологическому исследованию по описанной выше методике подвергались микропрепараты, изготовленные из фрагментов стенки мочевого пузыря, содержащих имплантат. Изучали основные морфологические параметры тканевой реакции.

4.7. Статистическая обработка экспериментальных данных Полученные экспериментальные данные обрабатывали на персональном вычисление среднего значения, стандартного (среднеквадратичного) отклонения и стандартной ошибки среднего. Оценку среднего и уровень значимости различий между средними значениями каждой из экспериментальных групп и контроля оценивалась по критерию Стьюдента (t).

ГЛАВА 5. РАЗРАБОТКА ПРОТОКОЛОВ ОБРАБОТКИ

КСЕНОПЕРИКАРДИАЛЬНОЙ ТКАНИ

5.2. Методика обработки ксеноперикардиальной ткани За основу разработки взят способ подготовки биоткани для ксенопротезирования, описанный в Патенте РФ № 2197818. Обработка ксеноперикарда с целью получения биоматериала для имплантируемых изделий – многостадийный процесс. Сущность способа состоит в том, что биоткань после выдерживания в гипертонических растворах подвергается обработке протеолитическим ферментом. Подобранные условия действия фермента (температура, рН, концентрация) позволяют сохранить фибриллярные белки и полностью разрушить клеточные элементы, которые после инактивации фермента и инкубации в средах с разным осмотическим давлением удаляются из ткани вместе с водорастворимыми белками и концевыми теллопептидами коллагена, являющиеся основными носителями антигенности. При этом архитектоника и тинкториальные свойства коллагена и эластина сохраняются. После химико-ферментативной обработки материала проводится структурная стабилизация ткани раствором глутарового альдегида. ГА-сшивки в коллагеновых тканях значительно снижают скорость биорезорбции биоткани, что делает её биосовместимой и нетромбогенной при сохранении анатомичной целостности, прочности и гибкости. В итоге после химикоферментативной модификации и структурной стабилизации полученный биоматериал представляет собой биополимер из структурных белков. Общая схема получения бесклеточного материала из ксеноперикардиальной ткани представлена на Рис. 7.

Рисунок 7 – Схематическое изображение химико-ферментативной обработки Протоколы обработки ксеноперикардиальной ткани составлялись путем изменения и последующего комбинирования основных параметров обработки. Мы выделили следующие ключевые стадии обработки:

• концентрация фермента • температура ферментативной инкубации • инкубация в средах с разным осмотическим давлением • концентрация сшивающего агента Концентрация фермента. Концентрация протеолитического фермента при обработке биоткани в свою очередь влияет на 2 параметра, тесно связанных друг с другом – это разрушение/неразрушение клеточных элементов и структурных волокон (коллагеназная и эластазная активность). Для определения «рабочих» концентраций террилитина провели эксперимент по обработке биоткани разными концентрациями фермента при одинаковом времени и температуре. За основу была взята концентрация, которая используется при производстве коммерческого продукта компанией «Кардиоплант». В целях неразглашения коммерческой тайны мы обозначили её Х. В эксперименте участвовали 7 групп образцов соответственно с семью концентрациями фермента от низкой до высокой. Результаты оценивали по гистологическим срезам препаратов, окрашенных гематоксилин-эозином и по Ван-Гизону-Вейгерту. Основные критерии выбора результатов – отсутствие клеточных элементов, сохранность структурных волокон. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2 – Результаты эксперимента по изучению влияния концентрации фермента на состояние биоткани. (красным цветом обозначены результаты, не удовлетворяющие требованиям к биоимплантатам. зеленым цветом обозначены результаты, удовлетворяющие требованиям к биоимплантатам) Как видно из результатов, при использовании концентраций фермента Х, 1,5Х и 2Х биоматериала, отвечающего требованиям к имплантатам. Более низкие концентрации не приводят к разрушению клеточных элементов, что повышает риск иммуногенности, а при более высоких концентрациях фермент начинает проявлять эластазную и коллагеназную активность и разрушает белковую матрицу.

ферментативной обработки влияет на коллагеназную и эластазную активность террилитина. В эксперименте участвовали 6 групп образцов. Инкубацию проводили со стандартной концентрацией террилитина при температурах 30, 33, 35, 37, 39 и 43 оС в течение 40 минут. Результат оценивали по количеству разрушенных волокон коллагена и эластина на гистологических препаратах образцов после окрашивания по методу ВанГизона-Вейгерта. Данные эксперимента приведены на Рисунке 8.

Рисунок 8 – Динамика коллагеназной и эластазной активности террилитина Как видно из графика температурный оптимум ферментативной активности приходится на 37оС. При этом волокна структурных белков не повреждаются и соединительно-тканный каркас биоткани не повреждается. При температуре 35 оС в течение 40 минут инкубации фермент также не проявляет коллагеназной активности, однако обладает небольшой эластазной (повреждения эластических волокон при таком режиме обработки составляет не больше 3%).

В создании матрикса, роль в упруго-деформативных свойствах у которого минимальна, такой протокол обработки может оказаться полезным. Таким образом, мы выделили два температурных режима – 35 и 37оС, которые в дальнейшем использовали при разработке протоколов обработки ксеноперикардиальной ткани.

Инкубация в средах с разным осмотическим давлением. Для создания более рыхлой и пространственной структуры коллагено-эластического каркаса биоткань инкубировали в средах с разным осмотическим давлением. При этом биоткань после стандартного режима ферментативной обработки погружали в раствор ПИКЕЛЯ (9,5% хлористого натрия + 40% уксусной кислоты) на 2 часа для создания внутри ткани пониженного осмотического давления. Затем биоткань помещали в раствор дистиллята на 2,4,6,8 и 10 часов. Замеряли толщину биоткани на микрометре с цифровой головкой не менее чем в 10 точках. Фиксировали время, по прошествии которого ксеноперикард обретал максимальную толщину.

Рисунок 9 – Динамика увеличения толщины ксеноперикарда при инкубации в дистилляте Из рисунка 9 видно, что толщина биоткани не увеличивается после 6 часов экспозиции в дистилляте. Время экспозиции учитывали в дальнейшем при разработке методов модификации ксеноперикарда.

альдегида, которые используют для обработки биоткани для протезирования, колеблется от 0,1 % до 0,6 %. Более низкие концентрации альдегидов являются неэффективными стерилизаторами, особенно в отношении некоторых видов микобактерий. Более высокие концентрации альдегидов могут сделать ткань слишком жёсткой и впоследствии провоцировать кальциноз. Концентрация фиксирующего агента непосредственно определяет степень сшивания и в результате конечные свойства материала – их скорость деструкции протеазами реципиента и физико-механические свойства. На основании требований к разрабатываемым материалам, обзора литературы и накопленного опыта производства биопротезов сотрудников лаборатории биопротезирования ООО «Кардиоплант» были определены 3 «рабочих» концентрации сшивающего агента, которые использовались при разработке методов модификации ксеноперикарда – 0,1%, 0,25% и 0,5% исходя из того, что повышение концентрации глутарового альдегида в экспозициях ведет к увеличению сшивок, а следственно к увеличению прочностных характеристик и уменьшению скорости деструкции матрикса.

5.3. Матрица параметров протокола обработки биоматериалов Таким образом, после экспериментального изучения ключевых параметров технологии обработки биоткани были выбраны «рабочие» режимы каждого из них.