Главная >> Диссертации - все темы

Pages: |

| 2 | 3 |

«МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ И БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЛЕВЫХ ИЗОЛЯТОВ ВИРУСА ЛЕЙКОЗА ПТИЦ, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ...»

-- [ Страница 1 ] --

ФГБУ «НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВИРУСОЛОГИИ

ИМ. Д.И. ИВАНОВСКОГО» МИНЗДРАВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

На правах рукописи

ПЛОТНИКОВ ВАДИМ АЛЕКСЕЕВИЧ

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ И БИОЛОГИЧЕСКАЯ

ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЛЕВЫХ ИЗОЛЯТОВ ВИРУСА ЛЕЙКОЗА

ПТИЦ, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИЙСКОЙ

ФЕДЕРАЦИИ

Специальность 03.02.02 - вирусология

ДИССЕРТАЦИЯ

На соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководительдоктор биологических наук, профессор Алипер Т. И.

Москва-

3.4. Определение и сравнительный анализ первичной структуры вариабельной области гена envelope изолятов вируса лейкоза птиц, выделенных на птицефабриках России в 2009-2011 гг.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЯ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АГ – антиген;

АТ – антитела;

БСА – бычий сывороточный альбумин;

ВЛП – вирус лейкоза птиц;

ВРЭ – вирус ретикулоэндотелиоза птиц;

ВСР – вирус саркомы Рауса;

ДСН – додецилсульфат натрия;

ДМСО – диметилсульфоксид;

ИФА – иммуноферментный анализ;

КЭ – куриные эмбрионы;

КК – культура клеток;

ЛЛ – лимфоидный лейкоз;

ЛС-комплекс- лейкозно-саркомный комплекс;

мРНК – матричная РНК;

МАТ – моноклональные антитела;

МПА - мясо-пептонный агар;

МПБ - мясо-пептонный бульон;

МППБ - мясо-пептонный печеночный бульон;

МСК – метод связывания комплимента;

н/о – не обнаружен;

ОТ – обратная транскриптаза;

п.н – пар нуклеотидов;

ПЦР – полимеразно-цепная реакция;

РИФ – реакция иммунофлюоресценции;

РН – реакция нейтрализации;

РЭК – развивающиеся эмбрионы кур;

РНИФ – реакция непрямой иммунофлюоресценции;

РФ – Российская Федерация;

СПФ – свободные от патогенного фактора;

ТС – тканевая среда;

ФБР – фосфатно-буферный раствор;

ФС – метод фенотипического смешивания;

ФЭК – фибробласты эмбрионов кур;

ЦНС – центральная нервная система;

ЭДТА – этилендиаминотетраацетат;

ADOL – лаборатория онкогенных болезней птиц, США;

dNTP – дезоксорибонуклеотидтрифосфат;

dATP – дезоксиаденозинтрифосфат;

ELISA - enzyme-linked immunosorbent assay

ВВЕДЕНИЕ

Наиболее широко встречающийся в природе ретровирус, вызывающий неопластические заболевания домашней птицы - это вирус лейкоза птиц (ВЛП). Кроме индуцирования опухолей и негативного влияния на продуктивность птицы, он является потенциальным контаминирующим агентом живых вирусных вакцин.

ВЛП является членом лейкозно-саркомной (ЛС) группы, относящейся к подсемейству Orthoretrovirinae семейства Retroviridae [207], и по свойствам гликопротеинов вирусной оболочки классифицируется на шесть подгрупп: A, B, C, D, E и J [53, 186]. Экзогенные (подгруппы A, B, C, D и J) и эндогенные вирусы (подгруппа Е) имеют полностью сформированный геном, т.е. не являются дефектными и для трансформации клеток требуют активации генов хозяина (протоонкогенов) [55, 88].

новообразований; в естественных условиях самым распространенным видом опухолей, вызываемых этой группой, является лимфоидный лейкоз (ЛЛ) или В-клеточная лимфома, первично-образующаяся в Фабрициевой сумке и инициируюшая образование метастазов в висцеральных органах [87, 186].

Экзогенные ВЛП передаются обычно как вертикально, так и горизонтально, в процессе, требующем наличия полной инфекционности вируса.

Эндогенные вирусные гены (ev) наследуются, как гены хозяина и могут быть, или не быть экспрессированы [24, 61]. Полностью инфекционные эндогенные вирусы могут предаваться конгенитально, горизонтально или восприимчивость цыплят, увеличивая продолжительность виремии и последующей толерантности к инфицированию вирусами подгруппы А [9, 61, 88].

вызываемых ВЛП, складываются из-за увеличения смертности и развития субклинической инфекции. Смертность из-за индуцирования новообразований у птиц может достигать до 20% [94], а субклиничекая инфекция вызывает понижающее действие на большое количество показателей производительности, таких как яйценоскость и качество яиц [108, 109, 242]. Совокупный эффект болезни наносит экономические потери, исчисляемые миллионами долларов ежегодно в США [184]. В 1990-х годах бройлерные хозяйства США охватили вспышки миелоидного лейкоза, экономические потери от которых поставили под угрозу целую бройлерную отрасль птицеводства [182, 189, 190, 242].

распространении ретровирусов в птицеводческих хозяйствах Российской Федерации. Исследования, направленные на изучение распространения вируса лейкоза птиц были проведены сотрудниками НПО «НАРВАК» в 2001гг. Частота ВЛП-пораженных хозяйств составила 50% в 2001; 64,7% в 2002; более 80% в 2003. Антиген ВЛП выявлен у птицы в возрасте от 7 до 480 дней [3].

Лечение ретровирусных инфекций не приводит к значительному положительному результату, также не существуют эффективных вакцин против ВЛП. Поэтому основной контроль данных инфекций основан на выявлении и удалении из стада инфицированной птицы [87]. Именно поэтому необходимо совершенствовать и внедрять методы диагностики.

Кроме того, во многих вакцинах медицинского и ветеринарного применения в качестве субстрата для размножения вируса обычно используются эмбрионы кур и культуры клеток куриных фибробластов.

Применение этих субстратов в качестве компонентов для производства вакцин требует особого контроля в связи с широким распространением в птицеводческих хозяйствах нашей страны и других стран мира (Европа, Америка, Азия) разных вирусных инфекций с латентным и острым течением, в том числе вызываемых вирусами лейкоза птиц, вирусами анемии цыплят.

Кроме того, отсутствие периодического контроля куриных эмбрионов и клеток куриного происхождения, использующихся для культивирования вирусов, может привести к контаминации вирусами животных создаваемых вакцинных препаратов для людей. Поэтому создание эффективной и быстрой биологических образцах является актуальной темой.

Цели и задачи исследований.

циркулирующих в птицеводческих хозяйствах Российской Федерации, а также разработка тест-системы ПЦР для выявления и дифференциации различных подтипов генома вируса.

Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:

- провести широкомасштабный мониторинг наличия ВЛП и антител к нему в коммерческих птицеводческих хозяйствах РФ;

- разработать тест-систему для выявления и дифференциации ВЛП подтипов A-D и J методом полимеразно-цепной реакции, оценить ее чувствительность и специфичность;

диагностических исследований. Разработать Методические рекомендации по выявлению вируса лейкоза птиц в куриных эмбрионах и культурах клеток куриного происхождения методом ПЦР;

- получить банк полевых изолятов ВЛП, циркулирующих на территории РФ и определить их биологические свойства;

- провести молекулярно-генетический анализ полевых изолятов ВЛП, выделенных на территории РФ, проанализировать филогенетические отношения российских и зарубежных полевых изолятов.

Объект исследвания. Исследование посвящено изучению вируса лейкоза птиц (ВЛП) ретровируса, вызывающего неопластические негативного влияния на продуктивность птицы, он является потенциальным контаминирующим агентом живых вирусных вакцин.

Предмет исследования. Основные результаты получены в процессе изучения распространения ВЛП в комммерческих птицеводческих хозяйствах РФ, а также исследования молекулярно-генетических и чувствительной и специфичной тест-системы ПЦР для выявления и дифференциации различных подгрупп ВЛП.

Теоретические и методологические основы исследования. В основу научно-квалификационного исследования легли вопросы вирусологии, молекулярной вирусологии, лабораторной диагностики ВЛП. В процессе работы применялись современные молекулярные и вирусологические эпидемиологические методы. Для анализа значимости выявленных закономерностей применялись современные методы оценки.

Информационная база исследования. В качестве информационных источников использовались научные публикации российских и зарубежных исследователей, материалы конференций, нормативные документы, инструкции к использованным в работе тест-системам, собственные результаты исследований.

Личный вклад автора состоит в сборе биологических образцов, выполнении исследований по молекулярной и серологической диагностике ВЛП в биологических материалах, участию в разработке и тестировании диагностической тест-системы на основе ПЦР, изучению молекулярнобиологических характеристик полевых изолятов ВЛП. Автором лично выделены и изучены молекулярно-биологические свойства 13 полевых изолятов ВЛП. Все материалы, представленные в диссертационной работе, были обобщены и проанализированы лично автором.

Научная новизна. Получена новая информация о распространенности лейкоза птиц в коммерческих птицеводческих хозяйствах Российской Федерации 2005-2011 г.г.

Проведен молекулярно-биологический анализ российских вирусных изолятов ВЛП, выделенных в 2009-2011 гг., проведено сравнение с зарубежными штаммами. Впервые проведен филогенетический анализ полевых изолятов ВЛП. Установлено, что выделенные нами отечественные изоляты ВЛП, незначительно отличаются от зарубежных.

дифференциации ВЛП подтипов A-D и J методом полимеразно-цепной реакции». Тест-система предназначена для выявления и дифференциации генома ВЛП в сыворотке крови, в образцах тканей и опухолей, полученных от птиц, а также для анализа качества эмбрионов и клеточных культур птичьего происхождения.

Основные положения, выносимые на защиту.

- Широкомасштабный мониторинг птицеводческих хозяйств РФ на наличие вируса лейкоза птиц (ВЛП) и антител к нему методами ИФА и ПЦР поможет выявить эпизоотическую ситуацию по распространению ВЛП и антител к нему на территории Российской Федерации;

- Разработанная «Тест-система для выявления и дифференциации ВЛП подтипов A-D и J методом полимеразно-цепной реакции» характеризуется аналитической чувствительностью 10 копий РНК/мкл, специфичностью 100% и позволяет определять возбудителя в культуре клеток и в биологическом материале.

- Разработанная тест-система ПЦР позволяет проводить диагностику вируса птичьего лейкоза различных подгрупп, как для единичной особи, так и для группы птиц. Своевременная диагностика вируса птичьего лейкоза может существенно улучшить состояние поголовья в птицеводческих хозяйствах.

-Создание банка полевых изолятов ВЛП, выделенных на территории Российской Федерации в 2009-2011 г.г. позволит провести их биологический и молекулярно-генетический анализ.

- Филогенетический анализ первичной структуры фрагмента envelope-гена незначительно отличаются от изолятов, выделенных на территории других стран, что наводит на мысль об общем предшественнике.

Практическая значимость.

Результаты, полученные при выполнении диссертации, позволили птицеводческих хозяйствах РФ.

представляющий подгруппу J, депонирован в государственную коллекцию вирусов Российской Федерации (ФГБУ “НИИ вирусологии им. Д.И.

Ивановского» Минздрава России).

документации (инструкция по применению от 21.05.2009 и ТУ 9388-003изв. №1 от 20.05.2009) «Тест-системы для выявления и дифференциации ВЛП подтипов A-D и J методом полимеразно-цепной реакции». Данная тест-система может использоваться в региональных мониторинга ВЛП.

улучшить контроль чистоты куриных эмбрионов и клеток куриного происхождения, использующихся для культивирования вирусов, при производстве вакцинных препаратов для людей и животных.

Тест-система может также быть использована для проведения научнопрактических занятий в Университетах и Институтах медицинского и ветеринарного профиля Министерства Образования РФ.

Подготовлен проект Методических рекомендаций по выявлению вируса лейкоза птиц в куриных эмбрионах и культурах клеток куриного происхождения методом полимеразной цепной реакции. Методические рекомендации предназначены для использования организациями, зарегистрированными в Российской Федерации, выпускающими и контролирующими медицинские, ветеринарные иммунобиологические, профилактические препараты, и специалистами научных лабораторий.

Методические рекомендации находятся на рецензии в Роспотребнадзоре.

Внедрение результатов работы.

Нормативно-техническая документация «Тест-системы для обнаружения и дифференциации вирусов лейкоза птиц подтипов AD и J»

была передана для производства в ООО «ВЕТБИОХИМ». Разработанная тест-система используется более 5 лет в ветеринарных региональных диагностических лабораториях.

Апробация работы.

Результаты работы представлены на IX международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 27-30 ноября 2008 г.), на VI Международном ветеринарном конгрессе по птицеводству (Москва, 26- апреля 2010), на семинарах USDA-ARS Avian disease and Oncology Laboratory (ADOL) (13 сентября 2009 г. и 20 мая 2011 г.). Материалы диссертации доложены и рассмотрены на заседаниях ученого совета ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского» в 2005-2008 г.г.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ, из них статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК МинОбрНауки России для публикаций основных результатов исследования.

Структура и объем и диссертации.

Диссертация изложена на 146 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 2 глав собственных исследований, их обсуждения, выводов, практических предложений, списка литературы и приложений.

Работа иллюстрирована 9 таблицами, 2 гистограммами, рисунками и 3 приложениями. Список литературы включает 279 источников, состоящий из 9 работ отечественных и 270 зарубежных авторов.

Благодарности.

Автор выражает искреннюю благодарность проф. Гребенниковой Т.В, к.б.н. Дудниковой Е.К., к.б.н. Южакову А. Г., к.б.н. Елисеевой О. В., к. б. н.

Алексееву К. П. – за практическую помощь в выполнении отдельных этапов работ, проф. Гребенниковой Т.В. – за консультационную помощь и ценные замечания при написании диссертационной работы.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Историческая справка Лейкоз птиц (гематолимфоматоз, диффузный остеопороз, лимфоидный лейкоз, эритробластоз, миелобластоз) – злокачественная пролиферативная болезнь, вызываемая ретровирусами ВЛП и характеризующаяся поражением, главным образом, органов кроветворения. Лейкоз птиц распространен посевместно. При обследовании некоторых птицехозяйств нашей страны установлено, что до 80% проб сыворотки крови положительны в отношении вирусов лейкоза [4, 5].

Вирусы лейкоза птиц являются представителями семейства Retroviridae и были классифицированы как основной вид рода Alpharetrovirus подсемейства Orthoretrovirinae [207]. Все существующие штаммы были разделены на 6 подгрупп: A, B, C, D, E и J [53, 186].

Изучением лейкоза птиц занимались уже давно. Самым ранним сообщением было написано Roloff [211] о случае «лимфосаркомата» в году, а Caparini [46] в 1896 году описал лейкемию домашней птицы. В году Butterfield [41] поставил диагноз «нелейкозного лимфаденоза» у трех кур в Соединенных Штатах. В 1908 году в Копенгагене Ellermann и Bang [85] открыли новую ветвь науки – вирусную онкологию, они впервые передали эритролейкемию и миелоидную лейкемию цыплятам путем инокуляции бесклеточного фильтрата. Данному открытию не придали особой неопластическая болезнь. Ellermann и Bang также, первыми предложили слово «лейкоз» для обозначения лейкимичных и нелейкемичных случаев болезни.

Ellermann первым дал классификацию патологических форм лейкоза птиц, которая все еще актуальна в настоящее время. В своей монографии Ellermann [84] описал три типа лейкемии: эритроидную («внутрисосудистый лимфоидную («лимфатический лейкоз»).

В раннем десятилетии ХХ века над возможностью экспериментальной передачи саркомы птиц работал Rous. В 1909 году он успешно трансплантировал клетки саркомы от одной курицы другой [213]. Вскоре экпериментально передаваться через бесклеточные фильтраты. В следующие два десятилетия были открыты еще 20 перевиваемых опухолей птиц, передаваемых через фильтраты [18, 34, 38].

В 1920-1930 годах было выполнено огромное количество исследований по экспериментальной передаче опухолей и было выделено множество штаммов вируса лейкоза птиц [34]. В это время разрешался вопрос о том, какие каузативные агенты вызывают три вида опухолей. Эритроидный и миелоидный лейкозы легко передавались в чистой или смешанной формах, лимфоидный лейкоз не обладал данной особенностью. Только в 1946- доказательства экспериментальной передачи лимфоидного лейкоза через фильтраты и доказал вирусную этиологию данной формы лейкоза с помощью эспериментов, выполненых Burmester с сотрудниками [33, 36].

Значительное и быстрое накопление инфрмации о лейкозе птиц и каузативных вирусах произошло после 1960 года. В это время были взаимодействия вируса лейкоза птиц и клеток-«хозяина» на клеточном уровне [120, 247, 248, 259].

В настоящее время уже определены нуклеотидные последовательности генома многих штаммов вируса лейкоза птиц [21, 81, 148, 222, 228, 235].

1.2. Характеристика ВЛП 1.2.1. Классификация Международного Комитета по Таксономии Вирусов были отнесены к роду Alpharetrovirus подсемейства Orthoretrovirinae семейства Retroviridae в году [98]. До этого вирусы лейкозно-саркомной группы относили к роду птичьих ретровирусов типа С [130, 207, 260]. ВЛП по новой классификации являются представителями рода Alpharetrovirus, кроме ВЛП сюда отнесли онкогенные вирусы саркомы Рауса (RSV): RSV-В, RSV-С, RSV-D, и дефектно-реплекативные вирусы: вирус карциномы птиц Мила-Хилла (ACMHV-2), вирус миелобластоза птиц (AMV), вирус миелоцитоматоза птиц 29 (AMCV-29), вирус саркомы птиц СТ10 (ASV-CT10), вирус саркомы Фуджинами (FuSV), вирус саркомы UR2 (UR2SV) и вирус саркомы Y (Y73SV). Основными признаками, по которым вирусы ВЛП объединены в род Alpharetrovirus, являются структура генома, структура белков, круг естественных хозяев и заключенные онкогены.

Кроме рода Alpharetrovirus, представителем которого является ВЛП, подсемейство Orthoretrovirinae включает еще 5 родов: Betaretrovirus, Gammaetovirus, Deltaretrovirus, Epsilonretrovirus и Lentiretrovirus.

Достаточно хорошо изучен представитель рода Betaretrovirus – вирус рака молочной железы мышей (ВРМЖМ). ВРМЖМ раньше был известен как вирус Биттнера. В 1936 году Joseph Bittner описал его как «молочный фактор», передающийся вертикальной экстра-хромосомальной передачей при аденокарценом молочной железы у некоторых линий инбредных мышей.

Вирус передается как вертикальным, так и горизонтальным путями.

Экзогенные вирусы передаются от матери потомству через молоко и вызывают раннее образование аденокарцином у потомства. Эндогенные вирусы в форме провирусной ДНК, встраиваются в половые клетки и сегрегируются как обычные клеточные гены. Новообразования у мышей, метастазируются в другие органы.

Изученным представителем Gammaretrovirus является вирус лейкемии мышей Абельсона (AbMLV), вызывающий инфекционную болезнь Абельсона у мышей, характеризующуюся прогрессивной трансформацией мышиных лимфоидных клеток и возникновением лимфосарком. Вирус передается как вертикальным, так и горизонтальным путями [50, 149, 271, 274].

Представителем Deltaretrovirus является вирус лейкоза КРС (BLV), характеризующееся образованием и развитием неоплазии лимфоцитов и лимфоузлов. Естественными хозяевами являются крупный рогатый скот.

Заболевание может быть широко распространено в стаде, но лишь у некоторых особей развивается лимфосаркома со смертельным исходом.

Инфекция распространяется горизонтальным путем. Восприимчивые животные обычно инфицируются под воздействием зараженных лимфоцитов [2].

Представителем Epsilonaretrovirus является – вирус дермальной саркомы судака (WDSV), вызывающий кожные новообразования у морских судаков Северной Америки. Каузативный вирусный агент, вызывающий эпидермальную неоплазию, выделен у судака Stizostedion vitreum. Инфекция передается при прямом физическом контакте с другими рыбами, а также через воду, содержащую инфекционные вирусные частицы [262].

Наиболее хорошо изученным представителем Lentiretrovirus является – вирус иммунодефицита человека 1 (HIV-1), вызывающий синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД). Инфекция может передаваться через кровь, семенные жидкости, вагинальные жидкости, преэякулят и грудное молоко. В данных образцах ВИЧ-1 может существовать в форме свободных вирусных частиц, так и вируса внутри инфицированных иммунных клеток. Вирус ВИЧ-1 инфицирует основные клетки иммунной системы человека, такие как Т-клетки помощников, особенно CD4+ Т-клетки, макрофаги и дендрические клетки. ВИЧ-инфекция приводит к понижению неинфицированных близлежащих клеток, прямая вирусная гибель клеток и лимфоцитами CD8, которые распознают инфицированные клетки. Когда уровень CD4+ Т-клеток снижается ниже критического уровня клеточная иммунная система теряет свою эффективность и инфицированный человек становится постепенно более восприимчивым к условно-патогенным инфекциям [150, 264, 272].

1.2.2. Морфология и физические свойства Морфология и форма вириона схожа с морфологией ретровирусов типа С. Вирионы ВЛП сферической или овальной формы (Рис.1) размером 80- нм; нуклеокапсид 35-45 нм, покрытый липидной оболочкой. На поверхности имеются характерные выступы длиной около 8 нм в диаметре с закругленной головкой [4]. Внутренний нуклеокапсид длиной примерно 3-5 нм;

промежуточную и внешнюю оболочки. Вирионы имеют плавучую плотность 1,154-1,17 г/мл в градиенте сазарозы [210].

Рис. 1. Строение и структура вириона ВЛП 1.2.3. Организация генома и свойства кодируемых белков РНК вирусного генома проходят седиментацию при 60-70S. Так же выявляется РНК при 4-5S, которая является, в основном, тРНК хозяина.

Считается, что данная тРНК не играет никакой роли при репликации вируса [52, 53]. Однако, праймер тРНК, ассоциированный с 70S РНК, встречается в вирионах и играет определенную роль в цикле размножения вируса. При седиментации 18S и 28S обнаруживаеся небольшое количество рибосомальной РНК, вирусной и клеточной мРНК. Геномная РНК 60-70S является димерной и расщепляется на две субъединицы при 34-38S.

Геном ВЛП рассматривается как «псевдодиплоидный» из-за наличия двух идентичных положительных однонитчатых РНК, которые содержат генетический материал вируса. Для генетического материала ВЛП характерно наличие двух различных форм: вирус - ассоциированная РНК и провирусная ДНК (Рис.2) [29, 30].

Рис. 2. Геномные структуры вирусной РНК и провирусной ДНК ретровирусов: вирусная РНК представлена тонкой линией на верху рисунка, структура провируса после обратной транскрипции – снизу Последовательности структурных генов ВЛП от 5'- до 3'-конца молекулы РНК представлены тремя генами gag, pol и env. Эти гены кодируют соответственно белки группоспецифичных антигенов вириона, протеазу, РНК-зависимую ДНК-полимеразу и гликопротеины наружной оболочки вирионов [53, 78, 136]. Структурные гены фланкируются концевыми геномными последовательностями, связанными с репликацией и трансляцией вирусной РНК. Геном состоит из 7,2 тысячи п.н. [122, 123, 266].

Структурные белки ВЛП. Weiss с соавторами подробно изучили природу, локализацию и синтез белков ретровирусов птиц [266, 267].

Вирионы ВЛП содержат пять негликолизированных белков, кодированных геном gag. Р27 – главный антиген gs (27 кДа), является компонентом капсидного антигена (CA), р19 – матричный белок (MA) и р12нуклеокапсидный белок (NC) вовлечены в процессинг и упаковку РНК. В то же время р15 и протеаза (PR) участвуют в расщеплении белковпредшественников р10. Ген env кодирует два оболочечных гликопротеина вируса gp85 и gp37. Гликопротеин gp85 (SU) формирует структуры в виде закругленных головок на поверхности вируса, которые определяют специфичность подгруппы ретровирусов птиц. Белок gp37 (ТМ) представляет собой трансоболочковую структуру, которая прикрепляет головки к оболочке. Данные белки, связываясь друг с другом, образуют димер, называемый вирусным гликопротеином (ВГП) [147].

Фермент обратная транскриптаза кодируется геном pol и входит в комплекс, состоящий из бета-субъединицы (58 кДа) и альфа-субъединицы (58 кДа). Данные субъединицы представляют собой РНК - зависимую ДНКполимеразу и ДНК:РНК гибрид-специфическую рибонуклеазу Н, соответственно. Также описаны рибонуклеаза, диоксирибонуклеаза, нуклеозидтрифосфат, нуклеотидная киназа, протеинкиназа, нуклеотидтрансферраза, РНК-метилаза, гексокиназа, аминоацил-тРНКсинтетаза. Считается, что данные ферменты являются клеточными контаминантами [245, 247].

1.2.4. Репликация вируса Репликация вируса лейкоза птиц происходит как у всех ретровирусов с характерным образованием провирусной ДНК, которая встраиваеся клеточный геном «хозяина» при помощи фермента обратной транскриптазы.

Провирусные гены транскибируются в вирусные РНК, которые транслируют и синтезируют белки, входящие в структуру вириона. Объяснение данных событий репликации вируса, подробно описаны и экспериментально доказаны Weiss с сотрудниками [266, 267].

Проникновение вируса в клетку. Адсорбция вириона клеточной мембраной наблюдалась даже в клетках резистентных к данной инфекции, но является неспецифическим процессом [198]. Клеточное проникновение зависит от наличия рецепторов на поверхности клеточной мембраны, кодируемых генами клетки-«хозяина», специфичных для каждой подгруппы.

Dales и Hanafusa [72] при наблюдении за процессом вакуолизации вирионов клеткой обнаружили, что вирусная РНК появлялась в ядре в течение минут после вакуолизациии.

В последние годы был достигнут значительный прогресс в понимании природы данных рецепторов, используемых вирусами лейкоза птиц различных подгрупп [103, 111, 229, 278]. Рецептор для ВЛП подгруппы А, обозначающийся как TVA, относится к человеческому рецептору с липопротеинами низкой плотности [151, 275, 278]. После связывания вируса лейкоза птиц подгруппы А с рецептором, запускаются конформационные изменения в вирусном наружном гликопротеине, которые в свою очередь запускают слияние вируса с клеточной мембраной и проникновение вируса в клетку [151, 278]. Рецепторы для вирусов подгрупп B, D и Е, обозначающиеся как TVBs3 и TVBs1, сходные с рецепторами цитокинов рецепторами функциональной смерти клетки и ответственны за индуцирование сигналов, ведущих к апоптозу клетки [6, 76, 137, 171, 205].

Рецептор для вируса саркомы и лейкоза птиц подгруппы С TVC относится к рецепторам суперсемейства иммуноглобулинов млекопитающих [6, 54, 56, 83]. Рецепторы клеток-«хозяина», используемые вирусом лейкоза птиц подгруппы J недавно были классифицированы исследователями как куриный Na(+)/Н(+) обменный протеин типа 1 (chNHE1) [45].

Синтез и интеграция вирусной ДНК. Уникальная особенность птичьих и других ретровирусов, которая характеризует вирусную репликацию – это образование ретровирусной ДНК от матричной вирусной РНК, интеграция вирусной ДНК (провирус) в геном клетки-«хозяина» и образование новой формирования ретровирусной ДНК: 1) синтез первой (минус) цепи вирусной ДНК, возможно с формированием гибридного комплекса РНК:ДНК; 2) удаление РНК из гибридного комплекса при помощи фермента РНКазы-H и формирование второй (плюс) цепи вирусной ДНК на основе матрицы минусцепи ДНК, дающей начало увеличению линейных спаренных ДНК (данные двойные молекулы уже обнаруживаются в цитоплазме клетки через несколько часов после инфицирования); и 3) миграция линейной ДНК в клеточное ядро.

Линейная ДНК встраивается в «хозяйскую» ДНК при помощи фермента интегразы. Интеграция может происходить во многих сайтах ДНК и инфицированные клетки могут содержать до 20 копий вирусной ДНК.

Провирусные гены совпадают с копиями РНК вириона и так же последовательностью – длинным терминальным повтором (LTR). Данные повторные последовательности образуются от терминальных регионов транскрипции вирусной ДНК и РНК. LTR могут также вызывать аномальный процесс транскрипции генов «хозяина», ведущий к развитию онкогенеза [25, 115, 206, 230].

Транскрипция. Формирование новых вирионов в инфицированных клетках является результатом транкрипции и трансляции провирусной ДНК.

Процесс включают в себя две основные стадии: 1) Транскрипция вирусной РНК на матрице провирусной ДНК при помощи фермента «хозяина» РНКполимеразы. Молекулы вирусной РНК действуют как мРНК во взаимодействии с полирибосомами или они служат как геномные РНК для сформированных вирионов. Новая вирусная РНК обнаруживается через полирибосомами и транслируют формы белков, кодируемые генами gag, pol и env, которые входят в состав вириона. Продукт gag-гена является расщепляется на белки, входящие в состав сердцевины вириона. Продукт polгена – предшественник белка (180 кДа) Pr180gag-pol включает в себя продукты gag-гена, который затем расщепляется на ферменты вирусную полимеразу и РНКазу. Продукт env-гена – предшественник (90 кДа) Pr90env от которого образуются вирусные наружные белки gp85 и gp37. Вирусные белки локализуются в цитоплазме клетки в виде серповидных структур, которые формируются в полноценные вирионы и затем отпочковывающиеся от клетки [17, 19, 20, 54, 116, 277].

Клеточная трансформация и образование опухолей. Существуют два основных типа стратегий онкогенеза, вызываемых ретровирусами птиц [58].

Остротрансформирующие вирусы различаются onc-генами, полученными от нормальной клеточной нуклеотидной последовательности, которые ответственны за неопластическую трансформацию [62, 162, 199]. Вирусы саркомы Рауса (ВСР) несут src-гены, которые кодируют трансформационноpp60src активностью. Считается, что метаболический дисбаланс ассоциированный с трансформации [23, 124, 125, 226]. Оnc-гены, ассоциированные с другими остротрансформирующими вирусами, кодируют разные транформационноассоциированные белки.

Медленно трансформирующие вирусы, такие как LLV, не обладают onc-генами, но вызывают трансформацию клеток опосредованно через активацию клеточных onc-генов. Молекулярные исследования показали, что LLV-провирус встраивается в «хозяйский» c-myc локус и экспрессируется вирусной нуклеотидной последовательностью LTR-промотера. Генетические делеции являются характерной особенностью индуцирования лимфомы интегрированным провирусом [48, 209]. Считается, что эспрессия c-myc гена встраиваемым промотером инициирует лимфогенетический процесс, но для полного развития лимфоидного лейкоза необходимо каскадная активация других трансформирующих генов, таких как B-lym [10, 28, 58, 124, 131, 140].

1.2.5. Устойчивость ВЛП чувствительны к эфиру, актиномицину Д [100]. Онкогенные вирусы лейкоза птиц термолабильны и быстро инактивируются при температуре свыше 46°С, погибают при 37°С в течение двух суток в зависимости от окружающей среды, при 4°С – через 3-4 недели. При 60°С инактивация происходит за 1,5-2 часа, при 100°С – за 5-10 минут, при температуре ниже -60°С ретровирусы птиц могут храниться в течение нескольких лет без потери инфекционной активности [2, 4, 5].

ВЛП не устойчив при pH 5-9. Под действием УФ-лучей вирусы инактивируются за 45-60 минут [4].

Мгновенная гибель их происходит под действием 30%-го раствора хлорамина и 5%-го раствора карболовой кислоты. При замораживании и размораживании вирус разрушается и выделяется антиген gs [159]. В лиофилизированном состоянии ВЛП сохраняют активность до 9 лет [2, 4].

1.2.6. Антигенные свойства В состав ретровирусов входят типо- и группоспецифические антигены Типоспецифический АГ обусловлен белковыми компонентами (АГ).

вирусной оболочки и характерен для каждого из 4-х известных ВЛП. Вирусы с различными типоспецифическими АГ имеют гликопротеидный компонент с различной РНК.

Все вирусы ЛС-комплекса разделены на 6 АГ подгрупп: А (RSV-RAVRSV-RIF-1, RSV-FAV-1, AWV-1, RPL-12, MH-RSV, SR-RV-1), B (RSV- RAV-2, SR-RSV-2, AWV-2, RSV-RIF-2, HA-RSV, RAV), C (RSV-RAV-3, PR- RSV), D (CZ-RSV, RSV-RAV), E и F (RAV-50, RPL-22, RAV-5). Разделение вирусов на АГ-подгруппы основано на различии оболочек вирионов, интерферирующей активности в отношении вируса саркомы Рауса и способности поражать определенные фенотипы клеток [144, 267]. В природе наиболее распространены вирусы подгрупп А, реже В и С и почти никогда не встречаются представители остальных подгрупп [43, 160, 219]. Недавно описана новая группа вирусов ЛС-комплекса, относящихся к новой подгруппе J [184, 187].

В связи с разнообразием АГ свойств ВЛП для индикации их в исследуемом материале и изучения распространения в хозяйствах используют штаммы наиболее ярких подгрупп: А (RSV-RAV-1), B (RSVRAV-2), C (PR-RSV), D (CZ-RSV) [2, 4, 39].

Патогенность. Большинство штаммов ВЛП были выделены из различных типов новообразований много лет назад. Впоследствии они многократно пассировались на цыплятах или в клеточных культурах.

Штаммы вирусов могут вызывать формирование более одного типа опухолей. Спектр онкогенности каждого штамма имеет свои характерные черты, однако довольно часто он частично совпадает с ответными реакциями на другие штаммы. Например, штамм RPL-12 продуцирует лимфоидный лейкоз, эритробластоз, фабросаркомы, гемангиомы и остеопетроз. А штамм BAI-А продуцирует миелобластоз, саркомы, остеопетроз, гемангиомы, лимфоидный лейкоз, нефробластомы, текомы, опухоли клеток гранулезы и эпителиомы [167]. В большинстве проводившихся ранее исследований штаммы вирусов не были генетически очищены [224]. Поэтому всегда возникал вопрос: способность какого-то определенного штамма вызывать развитие различных новообразований была результатом присутствия в вирусном препарате смеси различных типов вирусов с разными онкогенными свойствами или же это плюрипотентные свойства единственного генетического типа. Исследования показали, что могут приниматься два объяснения. Клоноочищенные штаммы ВЛП могут вызывать широкий спектр новообразований в дополнение к лимфоидному лейкозу, в том числе эритробластоз, остеопетроз и нефробластомы [202]. Другие штаммы вируса состоят из смесей. Так, например, дефектные вирусы острой лейкемии требуют для проведения репликации недефектного вируса или вирусапомощника [221]. В такой ситуации онкогенные свойства могут проистекать от дефектного вируса или вируса-помощника. Тем не менее клоноочищенные штаммы вируса эритробластоза независимо от вируса-помощника могут индуцировать эритроблатоз [114, 156]. Изменения в степени взаимодействия между различными чистыми штаммами вируса можно продемонстрировать с помощью методов гибридизации нуклеиновых кислот, при этом разница может быть связана с онкогенными свойствами. Такая разница может заключаться в присутствии особого гена v-onc у сильно трансформирующих трансформирующих вирусов [124, 152, 231].

1.2.7. Культивирование одиннадцатидневных чувствительных эмбрионов развиваются опухолевые пустулы, которые можно сосчитать через 8 дней. Количество пустул находятся в линейной зависимости от дозы вируса [80, 145].

Количество вируса можно подсчитать с помощью внутривенной инокуляции этих вирусов в 11-дневные восприимчивые куриные эмбрионы.

В течение 2 недель после вылупления образуется большое количество новообразований, в основном эритобластоз, хотя могут развиваться также эндотелиальные опухоли, нефроблатомы и хондромы. У большинства кур, переживших острые неоплазмы, спустя 100 дней после инокуляции развивается ЛЛ [153, 198].

ВЛП и ВСР вызывают быструю неопластическую трансформацию клеток при их инокуляции на монослойные культуры фибробластов куриных эмбрионов. Происходит пролиферация трансформированных клеток и в течение нескольких дней образуются разрозненные колонии или очаги количественной оценки вируса [248].

Размножение большинства штаммов ВЛП происходит в культурах фибробластов без продуцирования какого-либо очевидного цитопатического разнообразных диагностических методов. Вирусы лейкоза подгрупп В и D использоваться в вирусологических методах [112, 113]. Помимо этого, фибробластов при продолжительном пассировании вирусом лейкоза птиц [42].

1.3. Генетическая вариабельность штаммов ВЛП Вирусы лейкоза птиц, выделенных от птиц классифицируются на подгруппы А, B, C, D, E и сравнительно недавно выявленную подгруппу J [182]. Данная классификация основывается на хозяинах-мишенях, на моделях интерференции вирусного наружного белка и кросс-нейтрализации.

ретровирусных частиц, взаимодействует с рецептором клетки-мишени.

детерминантой, определяющий фенотип подгрупп. ВГП также определяет иммунизированных кур, показывают высокую специфичность в реакциях с вирусами той же самой подгруппы, а также есть данные что и на тип вируса из той же подгруппы [246]. Данная антигенная вариация между ВЛП может быть специфичная к подгруппам и в то же время типоспецифичная в подгруппе [134]. Ген env кодирует два белка gp85 и gp37. Данные белки синтезируются как единый полипептид, который проходит процессинг и транспортируется к клеточной мембране, где они остаются связанными дисульфидными связями [146]. Белок gp85 содержит детерминанты подгрупповой специфичности, нейтрализации и связывания с рецептором [27].

Самые заметные свойства РНК-вирусов, особенно ретровирусов, это их генетическая нестабильность и разнообразие. Данные свойства могут проявляться в результате большого количества ошибок при синтезе вирусной антигенных вариантов вирусов может происходить в присутствии или исследований антигенной вариации у ретровирусов млекопитащих [117, 154, 175, 272], существование таких вариаций у птичьих ретровирусов, особенно у ВЛП, исследований проведено незначительно.

1.3.1. Сравнительный нуклеотидный анализ гена env вирусных изолятов ВЛП подгрупп A-J Zhuan c соавторами сравнивали геномную последовательность двух изолятов ВЛП подгруппы В [279]. В ходе исследований, было установлено, что идентичность аминокислотной последовательности gp85 2 изолятов была 95,4%, идентичность с другими референтными штаммами ВЛП подгруппы В была 91,0-94,9% и меньше чем 87,9% с ВЛП подгрупп А, С, D, E и J.

Сравнение нуклеотидной последовательности gag и pol генов показало, что гомология gag-гена и pol-гена двух изолятов в сравнении с референтными штаммами других подгрупп составляла примерно 93%. Гомология LTRпоследовательности 2-х изолятов с другими экзогенными ВЛП подгруппами A, B, C, D, J составляла 72,6-88,3%, но только 51,5% в сравнении с эндогенными ВЛП подгруппы Е. Идентичность LTR между двумя штаммами ВЛП-В составляла только 74,8% и была несколько ниже, чем идентичность других генов.

Исследования Bova c cоавторами подгрупп ВЛП показали, что последовательности и образует пять кластеров hr1, hr2, vr1, vr2 и vr3 [26].

Два больших кластера hr1 и hr2 демонстрировали очень значительную вариабельность нуклеотидной последовательности, при этом hr2-домен показывал высокую вариабельность в сравнении с hr1-доменом. В исследованиях Dorner и Coffin было установлено, что домены hr1 и hr2 у всех подгрупп ВЛП в основном отвечали за специфичность связывания рецепторов подгруппами A-Е у определенных фенотипических групп кур, которые отличались восприимчивостью к ВЛП различных подгрупп [79].

В дальнейших исследованиях K.Venugopal с соавторами было подтверждено, что аминокислотные замены распределялись в вирусном гликопротеине [258]. В данном исследовании группировка вариабельных последовательностей находилась рядом с вариабельными доменами hr1, hr2 и Несмотря на высокий уровень вариабельности нуклеотидной vr3.

последовательности в hr1, hr2 и vr3, множество позиций внутри данных регионов было неизменным. Эти данные были получены, когда были установлены и изучены нуклеотидные последовательности этих регионов у ВЛП подгрупп А, B, C, D и Е. Bai с соавторами в исследованиях установили, что у нуклеотидной последовательности штамма HPRS-103, который относится к подгруппе J, содержалось очень мало консервативных остатков:

1 из 11 в домене hr1, 2 из 6 – в hr2 и 2 из 4 – в vr3 [15, 16]. В исследованиях K.Venugopal с соавторами только единственный консервативный остаток (глицин) в домене hr1 оставался у 11 исследованных изолятов, в одном изоляте был остаток аспартатовой кислоты в данной позиции [256, 258].

Кроме того, домен hr2 у различных вирусных последовательностей, показал очень высокий уровень вариации. При этом, два консервативных аминокислотных остатка у ВЛП всех подгрупп, включая штамм HPRS- (аргинин и лизин), были сохранены в последовательностях вирусов. Данные результаты наводят на мысль, что аминокислотные остатки в данных позициях являются необходимыми и не могут быть заменены.

ВЛП подгруппы А используют низкоплотный липопротеиновый рецептор (НПЛПР) для проникновения в клетку-мишень. В исследованиях Rong с соавтами было показано, что основные аминокислотные остатки в hr домене играют важную роль в распознавании рецептора и событиях пострецепторного связывания в момент вирусного проникновения [212].

1.3.2. Филогенетические отношения изолятов ВЛП Филогенетический анализ является одним из основных подходов в молекулярной эпидемиологии, позволяющим определить степень родства между полевыми изолятами, выделенными во время различных вспышек, и референтными штаммами. Генетическую и антигенную вариабельность вирусов изучают методом частичного секвенирования определенных фрагментов геномов и аминокислотных последовательностей различных вирусных изолятов и сравнения их с рядом наиболее известных референтных штаммов, нуклеотидные и аминокислотные последовательности которых расшифрованы полностью. Надежность данного метода проявляется в том, что результаты, получаемые при секвенировании различных фрагментов геномов, четко согласуются между собой.

Основным инструментом филогенетического анализа является сравнение близких по структуре или по функции генов или белков, и, прежде всего, сравнение их первичных последовательностей. Имея множество подобных последовательностей, возможно восстановить эволюционные связи между генами и целыми организмами. Эволюционные связи иллюстрируются древовидной структурой, называемой филогенетическим деревом.

филогенетическое дерево, в котором ВЛП подгруппы A, B, C, D и E образовывали одну филогенетическую группу, показывая близкие отношения между ними [258]. Двенадцать изолятов ВЛП подгруппы J, штамм HPRS- и эндогенные ретровирусные элементы из EAV-семейства, образовывали вторую родовую группу. Члены EAV-семейства E51и EAV-HP показали высокую дивергенцию в сравнении друг с другом. Двенадцать изолятов группировали вместе три кластера, один из изолятов формировал с HPRS- один кластер. Три изолята образовывали второй кластер и семь изолятов – третий кластер. Включение нуклеотидных последовательностей ВЛП подгрупп J и определенных эндогенных ретровирусных последовательностей в один филогенетический род показывает близкие отношения ВЛП подгруппы J и E51 с EAV-HP.

Филогенетический анализ нуклеотидной последовательности env-гена различных птичьих ретровирусов подтверждает результаты, что штамм HPRS-103 обособлен от других известных подгрупп ВЛП, и является более близким к EAV-семейству эндогенных ретровирусов. Кроме того, внутри данного семейства наблюдалась также большая дивергенция, но близкое эволюционирование штамма HPRS-103 в результате рекомбинации с envпоследовательностями эндогенных элементов [218, 252]. Дивергенция между «хозяйских» видов было не больше чем то что экзогенные варианты ВЛП подгруппы J циркулируют в полевых условиях.

1.4. Клинические признаки У молодых кур, индеек и диких куриц, зараженных некоторыми вирусами лейкоза (RAV-1, RAV-60, MAV-2[0]), развивались анемия, гепатит, иммунодепрессия и истощение. Некоторые из них погибали [67, 236, 267]. У кур, инокулированных ВЛП RAV-1, отмечалось развитие миокардита и хроническое расстройство кровообращения. У кур, зараженных RAV-7, менингоэнцефаломиелита [268]. После инфицирования in ovo штаммом RAV-1 наблюдалась устойчивая инфекция ЦНС с воспалительными поражениями и клиническими признаками болезни. Анемия является следствием апластического криса в костном мозге, когда эритроциты не могут внедрять железо в гемоглобин и проявляют уменьшенное время выживания [71]. Изменения в иммунной системе является следствием прекращения созревания B-клеток и блокады в развитии Т-клеток супрессоров из-за препятствия синтеза функционального интерлейкина- [142].

Вирусная инфекция в отсутствии явных клинических признаков заболевания неблагоприятно воздействует на продуктивность кур-несушек.

Куры, являющиеся носителями вируса, несут на 25-35 меньше яиц на курицу при содержании в птичнике до 497-дневного возраста. После половозрелого созревания яйценоскость снижается, при этом куры несут яйца меньшего размера и с более тонкой скорлупой. Смертность таких кур от причин, не связанных с новоборазованиями, выше на 5-15%, фертильность на 2,4% ниже, выводимость цыплят меньше на 12,4% в сравнении с незараженными курами [85, 240]. Эти вирусы подобным образом воздействуют на бройлерные породы кур, но, помимо этого, вызывают устойчивое и небольшое замедление (до 5%) в скорости роста [69, 109]. В других работах [108, 133, 238] были рассмотрены исследования пониженной продуктивности кур, пораженных ВЛП, а также генетические последствия такого поражения.

Снижение выработки спермы не связывают с присутствием в ней ВЛП. Тем не менее, имеется ряд доказательств воздействия ВЛП на качество спермы и ее способность к оплодотворению [223].

Инкубационный период и клинические признаки различиаются при разных формах лейкоза птиц.

Лимфоидный лейкоз. При экспериментальном заражении восприимчивых цыплят лимфоидный лейкоз появлялся в возрасте 14- недель [31]. Ранее 14-недельного возраста заболевание наступало крайне редко. При полевых вспышках случаи лимфоидного лейкоза могут быть в любое время после 14-недельного возраста. Наибольшая заболеваемость приходится на период половой зрелости [214].

Внешние признаки болезни не являются специфическими. Гребень может стать бледным, сморщенным, а иногда синюшным. Часто наблюдается потеря аппетита, истощение и слабость. Брюшко часто бывает увеличенным, а перья иногда покрываются пятнами уратного и желного пигмента. При помощи пальпации обнаруживается увеличение печени, фабрициевой сумки и почек. Когда начинают развиваться клинические признаки, ход болезни становится быстрым [37, 38].

Эритробластоз. На инкубационный период влияет источник вируса, штамм вируса, доза, путь заражения, возраст и генетическая структура носителя. Основным определяющим фактором является наличие или отсутствие у вирусного штамма вирусного онкогена. Данный онкоген ативирует промоторную втавку клеточного онкогена с-erb B и, тем самым, индуцирует эритробластоз с длительным латентным периодом [82, 194, 217, 255]. Полевые штаммы и вирусы, пассированные в клеточной культуре, индуцируют эритробластоз после более длительного инкубационного периода [31]. Полевые случаи заболевания эритроблатозом наблюдаются у птиц после трехмесячного возраста [87, 195].

Самыми ранними симптомами являются заторможенность, общая слабость, а также легкая бледность или цианоз гребешка. При развитии болезни бледность или цианоз могут усиливаться. Как правило, наблюдается слабость, истощение и диарея. Кроме того, может наблюдаться обильное кровотечение из перевых фолликул. Продолжительность такого состояния измеряется от нескольких дней до нескольких месяцев. При сильной анемии, цвет гребешка может измениться от светло-желтоватого до почти белого [87].

Миелобластоз. Самым изученным штаммом вируса, вызывающим преимущественно миелоблатоз, является ВАI-А. Штаммы являются дефектными и содержат вирусы-помощники подгрупп А и В [105]. После заражения восприимчивых однодневных цыплят большой дозой вируса изменения в крови могут наблюдаться через 10 дней. Пик смертности наступает приблизительно в течение одного месяца. После этого срока количество случаев гибели птиц намного меньше [64].

Симптомы миелобластоза схожи с симптомами эритробластоза.

Сначало, появляется заторможенность, общая слабость и легкое побледнение гребешка. При развитии болезни эти признаки становятся более заметными.

Наблюдается потеря аппетита, обезвоживание, истощение и диарея. Может наблюдаться кровотечение из перьевых фолликулов, вызванное снижением свертываемости крови. Продолжительность течения болезни може быть разной, но в основном она больше, чем при эритроблатозе [276].

1.5. Паталогоанатомические и гистологические изменения В конкретной стае кур могут случаться одно и более характерных новообразований, индуцированных вирусами лейкоза птиц.

Опухолевые состояния.

Лимфоидный лейкоз. Часто поражает птиц в возрасте приблизительно 4-месячного возраста [31]. Самой характерной особенностью является присутствие включений с обширными узелковыми новообразованиями в бурсе. Лимфоидный лейкоз обычно вызывается вирусами ВЛП, но иногда наблюдаются случаи индуцированные вирусами ретикулоэндотелиоза. При микроскопическом исследовании диагностируются форменные большие лейкоциты или лимфобласты в новообразованиях, присутствие внутрифолликуллярных новообразований в бурсе. Опухоли распространяются и на другие ткани, такие как печень и селезенка. При этом происходит обширное узелковое увеличение данных органов. Опухолевыми иммуноцитохимических методов В-клеточные маркеры и иммуноглобулины М можно обнаружить в опухолевых клетках [59, 164].

Опухоли мягкие на ощупь, гладкие и блестящие. На срезе цвет поверхности может быть от слегка сероватого до светло-кремневого. Иногда может случаться некроз. При узелковой форме опухоли могут варьировать от 0,5 мм до 5 см в диаметре, могут быть единичными или множественными.

Гранулярная форма, которая больше проявляется в печени, состоит из множества небольших узелков диаметром менее 2 мм и однаково расположенных по всей паренхиме. При диффузной форме орган приобретает слегка сероватый цвет, становится непропорционально увеличенным и рыхлым. Иногда печень становится твердой, фиброзной и приобретает почти песчаный цвет.

Гистопатология. Опухоли состоят из множества лимфоидных клеток, которые немного варьируют по размеру, но все находятся на одной и той же стадии развития. У них имеется плохо определяемая цитоплазматическая оболочка, много базофильной цитоплазмы и везикулярные ядра, в которых присутствует скопление лейкоцитов по краю, а также скопление хроматина и одного или более ацидофильных ядрышек [51, 166].

Эритроидный лейкоз. У птиц, погибших от любой формы заболевания, обычно обнаруживается общая анемия в совокупности с петехиальным кровотечением в различных органах, например, в мышцах, под кожей и во внутренних органах [200]. Может наблюдаться тромбоз, инфаркт и разрыв печени или селезенки. Кроме того, могут быть подкожный отек в легких, гидроперикард и асцит, а также фибринозный сгусток на вентральной поверхности печени [201].

Самым характерным макроскопическим изменением является диффузное увеличение печени и селезенки, и в некоторой степени и почек.

Эти органы мягкие и рыхлые, а их цвет обычно бывает от ярко-красного до коричнево-красного. Печень вследствие дегенерации может быть покрыта пятнами вокруг центральных вен долей этого органа. Костный мозг становится гиперпластическим, очень мягким или водянистым, а по цветукроваво-красным или вишнево-красным. Кроме того, могут присутствовать кровотечения [201].

При сильной анемии внутренние органы и органы иммунной системы, особенно селезенка, как правило, атрофируются [209].

Гистопатология. Микроскопические исследования костного мозга на ранних этапах эритроблатоза позволяют выявить наличие в кровеносных синусоидах быстро пролиферирующих эритроблатов, которые не могут развиваться. На более поздних этапах болезни костный мозг состоит из гомогенных эритроблатов с маленькими островками миелопоэтической активности, а также небольшим слоем жировой ткани или отсутствием ее.

При наличии соответствующей анемии количество эритропоэтических клеток может уменьшаться [158].

Уменьшения во внутренних органах связаны в основном с гемостазом.

Это ведет к расширению синусоидов, что особенно заметно в печени, селезенке и костном мозге. При развитии процесса синусоиды становятся значительно расширенными и приводят к сдавливающей атрофии паренхимы [177].

Основными клетками, вовлеченными в патологический процесс, являются эритробласты. Эти клетки имеют большое круглое ядро с малым количеством хроматина. Кроме того, у них имеется одно или два ядрышка и большое количество цитоплазмы, которая является базофильной.

Эритробласты имеют неправильную форму. Часто у них имеется псевдоподия. На эритробластах имеются физиологические маркеры, которые определяют их как членов эритроцитного порядка [171].

Миелоидный лейкоз. Поражает в основном взрослых особей, но иногда наблюдается у молодых птиц возрастом примерно 5 недель. При миелобластозной форме наблюдается увеличенная печень, селезенка и другие органы, изменения в данных органах сходны с лимфоидном лейкозом.

В хронических случаях печень может быть твердой. В печени, а иногда и в других внутренних органах, могут появиться диффузные опухолевые узелки серого цвета. Костный мозг обычно твердый. Его цвет может быть от крсновато-серого до серого. На более поздних стадиях болезни печень, почки и селезенка имеют сероватые инфильтрации, которые являются обычно диффузными, но часто придают органу пятнистый или зернистый вид [114].

Гистопатология. Микроскопическое обследование паренхиматозных органов позволяет выявить скопление миелоблатов внутри сосудов и вокруг них с изменчивой долей промиелоцитов. Инфильтрация и пролиферация особенно обширны вне синусоидов и вокруг путей воротных вен в долях печени. Следовательно, проявляется заметное замещение первоначальной ткани патологическими клетками, в противоположность однородному внутрисосудистому лейкостазу, встречающемуся при эритроблатозе.

Интенсивная миелобластная активность в костном мозге ограничивается внутрисоидальными областями [110, 143, 187].

Патологические и гематологические особенности миелобластоза и эритробластоза частично совпадают во многих естественно возникающих случаях инфицирования [8, 193].

1.6. Эпизоотологические особенности ВЛП Экзогенные ВЛП являются широко распространенными вирусами, циркулирующими в коммерческих птицеводческих хозяйствах во всех странах, несмотря на то, что многие птицеводческие компании разрабатывают и проводят программы искоренения ВЛП. Вирусы подгруппы А встречаются наиболее часто по сравнению с вирусами подгруппы В. В исследовании Calnek B. W. [42] 1,6-12,5% эмбрионов, полученных от коммерческих стад кур, содержали ВЛП подгруппы A, при этом наблюдалось значительное распространение ВЛП в каждом стаде. ВЛП подгруппы В встречаются относительно нечасто и распространяются чрез яйца намного реже, чем ВЛП подгруппы А.

Вирусы подгрупп С и D встречаются в полевых условиях очень редко.

Но было сообщение, что ВЛП подгрупп А, В, С и D были выделены в коммерческих птицеводческих хозяйствах в Финляндии, при этом 5 из наблюдаемых стад имели антитела ко всем четырем подгруппам ВЛП [219].

Антитела к ВЛП подгрупп А и В были найдены у домашних кур и диких пернатых птиц в Кении и Малайзии, также были сообщения, что в Кении найдены антитела к ВЛП подгруппы D [160]. Вирусы подгруппы F были выделены у обыкновенных и зеленых фазанов [94, 104]. Вирусы подгруппы G выделены в Эфиопии у серебряных и золотых фазанов [47, 90].

Эндогенный вирус подгруппы Н был выделен от венгерской куропатки [121] и вирус подгруппы I выделен от перепелки Гамбела [251]. Также были выделены вирусы от монгольского и свайнова фазанов, китайской куропатки и кур, но они пока не помещены ни в одну из известных подгрупп [47]. Ни один вирус из известных подгрупп ВЛП не был найден у японских перепелов, голубей, пекинской и московской уток [47].

Эндогенные локусы подгруппы Е присутствуют практически во всех стадах и могут экспрессироваться как экзогенные вирусы лейкоза подгруппы Е. Однако, вирусные локусы подгруппы Е не проявляют онкогенность.

Нуклеотидная последовательность ДНК, схожая с вирусом RAV-0 – эндогенным ретровирусом птиц, была найдена в зародышевых клетках у многих видов домашних кур и некоторых семейств отряда курообразных.

Куропатки, фазан обыкновенный, шотландский тетерев и кустарная дикая курица содержали нуклеотидную последовательность, комплементарную RAV-0, тогда как цесарка, перепел, павлин и индейка не имели такую последовательность [61, 101, 128, 170].

ВЛП подгруппы J распространен глобально и поражает в основном кур мясных пород. Антитела к новой подгруппе J были найдены у 3 из 5 линий кур мясной породы, у 7 линий несушек ВЛП-J обнаружить не удалось [192].

При использовании вирусологических и серологических методов распространение ВЛП подгруппы J было зафиксировано как высокое, на уровне 87% [79]. Похожие результаты были доложены другими авторами из других стран [70, 249, 273]. Потери от развития неопластических форм лейкоза, в основном от миелоидного лейкоза, могут составлять от 50% зараженного поголовья. Кроме потерь от опухолей, присутствие экзогенной ВЛП инфекции неблагоприятно влияет на яйценоскость, размер яйца, фертильность, выводимость птенцов, скорость роста и неспецифическую смертность [91, 94].

Изучение распространения ВЛП в нашей стране начались только в 1970-х годах [9], после выполнения исследований по созданию группы кур, исследованиях частота выявления ВЛП подгруппы А варьировала от 4,1 до 42,3% от количества исследованной птицы. Были также обнаружены антитела к ВЛП подгруппы В с частотой 2,7 -25,9% и к ВЛП подгруппы С – 2,7-11,5%. Антител к подгруппе D не обнаружили [9].

На данный момент недостаточно информации о распространении ВЛП в птицеводческих хозяйствах Российской Федерации. Исследования, направленные на изучение распространения вируса птичьего лейкоза были проведены сотрудниками НПО «НАРВАК» в 2001-2003 г.г. [3]. Частота хозяйств пораженных ВЛП составила 50% в 2001; 64,7% в 2002; более 80% в 2003. Антиген ВЛП выявлен у птицы в возрасте от 7 до 480 дней.

Дифференциация ВЛП по подгруппам в данных исследованиях не проводилась.

1.6.1. Распространение ЛЛ лишь в некоторых случаях приводит к значительным потерям, например 23% в коммерческих племенных стаях [182, 183]. Тем не менее, спорадические случаи бывают в большинстве стад. De Boer [74, 75] отмечал в своей работе, что смертность от ЛЛ в Нидерландах составляла 2,18% среди Исследовались различные образцы, полученные в период с 1973 по 1979 гг.

Частота заболеваний ЛЛ у кур может уменьшаться из-за большого распространения вируса инфекционной бурсальной болезни (ВИББ) [66, 132]. И наоборот, наличие вируса болезни Марека 2 серотипа (ВБМ-2) в стаде увеличивал частоту случаев ЛЛ у вылупившихся цыплят некоторых линий кур после контакта с ВЛП [74, 95]. Также было отмечено повышение частоты заболеваний спонтанной бурсальной лимфомой у цыплят породы молекулярной и in situ гибридизации бурс, полученных от цыплят коинфицированных ВЛП и ВБМ серотипа 2, показал, что ВБМ близко ассоциировался только с трансформированными бурсальными клетками.

Исследования in vivo также показали, что ВБМ серотипа 2 увеличивал генную экспрессию вирусов лейкоза птиц и вируса саркомы Рауса [96, 181].

По сравнению с ЛЛ эритробластоз встречается в полевых условиях не часто [183]. Отмечалось, что в виде исключения он встречается у пятинедельных птиц эпозоотически [119]. Имеются очень мало сообщений о миелоблатозе в естественных условиях. Случаи этого заболевания встречались спорадически. Спорадические случаи миелоцитоматоза всречались у молодых птиц [204, 253]. Болезнь наблюдалась примерно у 1% птиц у двух обследованных бройлерных стад в одном птицеводческом хозяйстве.

До недавнего времени и до признания существования новой подгруппы ВЛП J, болезнь в форме миелоцитоматоза в основном проявлялась спорадичечески у молодых и взрослых птиц [161]. Общая заболеваемость в 27% миелобластозом была отмечена у кур мясных пород, инокулированных штаммом HPRS-103 подгруппы J ВЛП [168]. Высокий уровень опухолей, индуцируемых ВЛП подгруппы J, был отмечен во многих странах [66, 219, 249, 273]. Смертность превышала на 1,5% нормальный уровень смертности в неделю в некоторых стадах коммерческих бройлеров [94].

Из всех других опухолей, не относящихся к лейкозным, гемангиомы составляют до 25 и 19%, а нефробластомы до 19 и 3-10% у бройлеров [44, гемангиосарком у несушек были зарегистрированы в Израиле [40].

Недостаточно информации относительно частоты развития опухолей соединительных тканей. Они не часто становятся основной причиной смерти.

У бройлеров такие опухоли составляют около 20% от всех новообразований, не относящихся к лейкозной группе [44]. Тем не менее, встречаются случаи эпизоотии. Perek сообщал о вспышках гистиоцитных сарком в стаде из одногодовалых кур [196]. Опухоли были обнаружены у 400 птиц или 90% от общего числа стада, обследованных на протяжении четырех месяцев Остеопетроз встречается во многих местах и эпизоотии случались спорадически у бройлеров. Было отмечено, что остеопетроз встречается у всех видов кур, при этом чаще этим заболеванием поражались петухи [127].

У индеек остеопетроз встречается очень редко [120].

1.6.2. Вирусоносительство Естественными носителями для всех вирусов ВЛП-группы являются куры [192]. Также вирусы выделены от фазанов, куропаток и обыкновенных перепелов. При проведении исследований в лабораторных условиях, было установлено, что некоторые представители ВЛП имеют широкий круг хозяев и адаптируются к росту в необычных хозяевах. Для этого вирусы пассировали в очень молодых животных или проводили индуцирование толерантности перед инокуляцией вируса. Вирус саркомы Рауса имеет самый широкий круг хозяев. Он может вызывать развитие опухолей у кур, фазанов, цесарок, уток, голубей, японских перепелов, индеек и каменных куропаток.

Некоторые штаммы ВСР способны индуцировать развитие опухолей у млекопитающих [126, 180, 259], включая представителей обезьян [141].

Nehyba и его коллеги [163] обнаружили, что, несмотря на отсутствие виремии и развития нейтрализующих антител, ВЛП продолжает существовать, по крайней мере, в течение трех лет в тканях уток, которые были инокулированы эмбрионально ВЛП. Данное открытие показывает, что утки являются идеальным экспериментальным объектом для изучения персистенции ВЛП. Однако, у уток, инфицированных в эмбриональном возрасте вирусами ЛП подгруппы С, не наблюдалось клинических признаков болезни вскоре после вылупления [238, 250].

Сообщалось также об индуцировании лимфоидного лейкоза у страусов [107]. Некоторые штаммы вируса саркомы вызывают развитие опухолей у млекопитающих, в том числе обезьян. Остеопетроз может развиваться у восприимчивыми животными к инфекции, вызываемой ВЛП подгруппы J.

Штамм HPRS-103 ВЛП подгруппы J индуцировал развитие опухолей острой формы у индеек [185, 269].

1.6.3. Пути передачи Экзогенные ВЛП передаются двумя способами: вертикально-от курицы ее потомству через яйца и горизонтально-от птицы к птице через прямой или непрямой контакт [60, 215, 216]. Несмотря на то, что в обычных условиях лишь небольшая доля цыплят инфицируется вертикально, данный маршрут передачи является важным с точки зрения эпизоотологии. Это связано с тем, что такой маршрут позволяет поддерживать инфекцию при переходе от одного поколения к другому [239]. Большинство кур заражаются при близком контакте с врожденно-инфицированными птицами. Несмотря на важность вертикальной передачи в поддержании инфекции, горизонтальное инфицирование может также быть необходимым для поддержания интенсивности вертикальной передачи на достаточном уровне для недопущения исчезновения инфекции [185]. При непосредственном контакте инфекция не распространяется быстро. Вероятно, это связано с относительно коротким сроком жизни вируса вне носителя.

У зрелых кур имеется четыре серологических класса инфекций, вызванных вирусом лейкоза птиц: 1) отсутствие виремии, отсутствие антител (V-A+); 2) отсутствие виремии, наличие антител (V-A+); 3) наличие виремии, наличие антител (V+А-) [157, 215, 216]. Птицы в стадах, свободных от возбудителей инфекционных болезней (SPF), и генетически устойчивые птицы попадают в категорию V-А-. Генетически восприимчивые птицы в инфицированных стадах попадают в одну из трех других категорий.

Большинство – в категорию V-A+, а меньшинство (обычно менее 10%) – в категорию V+A-. Преобладающее количество кур категории V+A- передают вирус лейкоза птиц разной, но сравнительно большой доле своего потомства [189, 216]. Из кур, относящихся к классу V-А+, лишь небольшая доля передает вирус потомству. К тому же это происходит не всегда. Payne было установлено, что среди кур этой категории чаще передают вирус лейкоза птиц те особи, которые имеют низкий титр антител [183]. У врожденноинфицированных эмбрионов развивается иммунологическая толерантность к вирусу и после вылупления они попадают в класс V+A- с высоким уровнем вируса лейкоза в крови и отсутствием антител. Куры более старшего возраста (2 или 3 года) передают вирус в свои яйца реже и меньшими дозами, чем птицы, возраст которых менее 18 месяцев [35]. Инфицирование петухов, повидимому, не влияет на степень врожденного инфицирования потомства [155, 179].

горизонтального инфицирования оказывает влияние генетика носителя и штамма вируса лейкоза птиц [46]. При использовании электронного микроскопа наблюдалось почкование вируса на всех структурах репродуктивных органов петухов, за исключением герминальных клеток [77]. Это доказывает, что вирус лейкоза птиц не размножается в этих клетках.

Следовательно, петух выступает лишь как носитель вируса и источник контактного или полового инфицирования других птиц [163, 165].

Врожденное инфицирование эмбрионов тесно связано с распространением курами вируса лейкоза в яичном альбумине и с присутствием вируса в вагине курицы [189, 241]. Кроме того, эти особенности имеют сильную корреляцию с виремией.

Выделение вируса лейкоза птиц в яичный альбумин и, следовательно, последующая передача эмбриону – результат размножения вируса в альбуминсекретирующих железах яйцевода. Исследования с помощью электронного микроскопа показали, что уровень репликация вируса в яйцеводе значительный [77]. Почкование вируса происходит также в различных типах клеток яичника, кроме фолликулярных клеток и яйцеклеток. Таким образом, трансовариальная инфекция не кажется значительной [189]. Полного инфицирования эмбрионов или цыплят, полученных от яиц с вирусом лейкоза птиц в альбумине, не происходит. В исследованиях Spenсer и соавт. [241] и Payne и соавт. [189] было установлено, что только - эмбионов инфицировались в яйцах с содержанием вируса в альбумине. Данная нестабильная врожденная передача, возможно, является результатом нейтрализации вируса антителами или термальной инактивацией вируса.

В исследованиях с использованием электронного микроскопа вирусные частицы былы обнаружены во многих органах инфицированных эмбрионов, при этом вирус отпочковывался и аккумулировался в значительных количествах в панкреатических ацинозных клетках эмбрионов [135, 277].

Данные частицы, являющиеся высоко инфекционными, выделялись с пометом у недавно вылупившихся цыплят [32]. Инфекционный вирус также присутствовал в слюне и эскрементах более старших птиц, которые являются источником горизонтальной передачи вируса другим птицам [68, 102, 270].

Обычно, только у меньшинства птиц, инфицированных вирусом лейкоза птиц, развивается лимфоидный лейкоз, остальные птицы остаются носителями или разносчиками инфекции. Сообщалось, что у толерантных птиц к вирусу лейкоза (V+A-) вероятность смерти от лимфоидного лейкоза в несколько раз выше, чем у птиц с антителами (V-A+) [216]. Частота заболеваемости лейкозом быстро уменьшается в случае, если инфекция заносится цыплятам через несколько недель после вылупления [37], так как именно в данном возрасте у цыплят формируются устойчивые генетические отличия к восприичивости к лимфоидному лейкозу, которые равнозначны восприимчивости к вирусной инфекции [68].

Эндогенные ВЛП обычно передаются генетически в зародышевых клетках обоих полов. Многие из них являются генетически дефектными.

Именно поэтому они не могут привести к развитию инфекционных вирионов.

Однако, некоторые из них могут экспрессироваться в инфекционную форму в эмбрионах или у вылупившихся птенцов. В этой форме они передаются впоследствии экзогенным вирусам, хотя большинство кур являются генетически устойчивыми к такой экзогенной инфекции [69].

1.7. Методы диагностики ВЛП Быстрая и точная диагностика ВЛП – один из решающих моментов эффективной борьбы с болезнью и снижения экономических потерь у птицеводческих хозяйств. Диагностика ВЛП проводится комплексно с учетом эпизоотологических данных, результатов патологоанатомического вскрытия и гистологических исследований, выделения вируса на чувствительных биологических моделях и последующей идентификации с помощью ПЦР, РИФ, РСК, ИФА, КОФАЛ-тестов и постановки биопробы.

Выделение и идентификация ВЛП. Плазма, сыворотка и опухоль являются наилучшими материалами для выделения вируса [202]. Кроме этого, вирус можно выделить из большинства мягких органов тела, а также из оральных смывов и помета [32, 215], из альбумина только что снесенных яиц или из 10-дневного эмбриона яиц, снесенных курами, которые передают вирус вертикально [241], из перьевой пульпы и из семенной жидкости [223].

Все вирусы этой группы термолабильны и могут храниться длительное время при температуре ниже -60 С.

Первой успешной процедурой, разработанной для выделения вируса, была инокуляция чувствительных цыплят. Некоторые вирусы, например, вирус саркомы Рауса, продуцируют пустулы на хориоалантоисной оболочке эмбрионов в яйцах. Эти процедуры были в дальнейшем заменены на более быстрые и менее дорогостоящие методы с применением клеточных культур.

В настоящее время используются клетки фибробластов куриных СПФэмбрионов, чувствительных ко всем подгруппам ВЛП, кроме подгруппы E.

Культуру клеток сажают на плашку, вносят образец и инкубируют в течение 7 дней. После инкубирования собирают супернатант и замораживают в холодильнике на -700C, как вирусный изолят. Клетки фибробластов куриных эмбрионов разрушают ультразвуком и исследуют на наличие группоспецифического антигена ВЛП p27 при помощи коммерческих наборов ИФА [88, 129].

РИФ. Для данной реакции используют флюоресцирующую сыворотку к gs-антигену ВЛП [191]. В качестве исследуемого материала используют мазки крови кур, зараженные культуры ФЭК. Преимущество РИФ перед РСК и КОФАЛ-тестом заключается в том, что этот метод позволяет не только обнаружить антиген вируса, но и определить его локализацию на различных стадиях взаимодействия вируса и клетки.

РСК. Реакция заключается в индикации группоспецифического gsантигена ВЛП в исследуемом материале, с помощью известной положительной сыворотки. Так как реакция группоспецифическая, положительный результат должен быть получен при использовании сыворотки для любого серотипа.

КОФАЛ-тест. В принципе он не отличается от известной методики постановки РСК и используется для обнаружения гркппоспецифического антигена в культуре клеток фибробластов, инокулированной вирусом [196, 220]. Данный тест применяется в тех случаях, когда в исследуемом материале антиген ВЛП находится в невысоких титрах и не улавливается в РСК, но культивирование инокулированной культуры клеток необходимо проводить в течение 14 дней.

Данный метод проводится в две стадии: размножение вируса ВЛП и обнаружение gs-антигена ВЛП реакцией связывания комплемента (РСК) [196].

Антисыворотки для КОФАЛ-теста на gs-антиген получают от хомяков c саркомой, индуцированной ВСР (обычно используют штамм the SchmidtRuppin strain) [196]. Также для данного теста могут использоваться антисыворотки кроликов и других млекопитающих [11, 118, 191].

РИФ-тест. Его суть заключается в том, что ВЛП предотвращает развитие очагов трансформации в культуре ФЭК после заражения ее ВСР, т.е. тест основан на интерференции между ВЛП и ВСР [196, 208, 243].

Реакция является типоспецифичной и поэтому для контрольного заражения используют типовые штаммы ВСР подгрупп А, В, С, D, J. С помощью этого метода исследуют на содержание ВЛП КЭ, сыворотки крови и надосадочную жидкость из гомогенатов органов птиц подозрительных по заболеванию лейкозом [14, 173].

Иммуноферментный анализ (ИФА). Предложена модификация метода определения ВЛП, в основу которой положено сочетание методики культивирования клеток пульпы пера, с использованием микроплашек с экстрацеллюлозной основой и ИФА. Полученные результаты указывают на высокую чувствительность метода, позволяющего классифицировать генетическую чувствительность или резистентность птицы к ВСР в короткие сроки с небольшими экономическими затратами [49, 73, 92, 232].

дифференцировать экзогенные и эндогенные ВЛП. Получены пять линий гибридомных клеток, секретирующих моноклональные антитела к группоспецифическим gs-антигенам. Три гибридных клона секретировали моноклональные антитела к полипептиду p27 и два – к фосфопротеину р [49].

При сравнительном обнаружении группоспецифического gs-антигена ВЛП в альбумине яиц кур с помощью методов РСК и модифицированного ИФА с использованием моноклональных антител показана значительно большая чувствительность ELISA-метода [232].

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Наиболее чувствительным методом обнаружения ВЛП в различных биологических образцах является метод ПЦР; при использовании “гнездовой” системы праймеров разрешающая способность реакции очень высока [106]. Практически все праймеры разрабатываются к нуклеотидной последовательности env и LTR регионов.

Van Woensel, P.A., A. van Blaaderen с соавторами разработали метод ПЦР специфичный к ВЛП подгруппы A, который обнаруживал провирусную ДНК и вирусную РНК ВЛП [254]. Van Woensel, P.A., A. van Blaaderen c соавторами тестировали данный метод на различных образцах органов инфицированных цыплят. На второй неделе после инокуляции цыплят, вирусную РНК ВЛП-А удалось обнаружить в сумке Фабрициуса, тимусе, костном мозге, преджелудке, печени, селезенке, гонадах, мышцах и в крови.

На 4-неделе после инокуляции провирусную ДНК ВЛП-А обнаружили во всех органах.

E.J.Smith, S.M.Williams с соавторами разработали метод ПЦР для обнаружения ВЛП подгруппы J [233]. Праймеры были гомологичны Еэлементу и 3’-концу провирусному ВЛП-J. Данные авторы экстрагировали ДНК из клеток фибробластов, инфицированных штаммом HPRS-103 - прототипом ВЛП-J и полевыми изолятами ВЛП-J, выделенные от стад бройлеров с клиническими признаками миелоидного лейкоза. Данный метод обнаружения ВЛП был специфичен только для подгруппы J, вирусы подгрупп А, В, С, D и Е не обнаруживал. ПЦР также обнаруживал ВЛП-J в ДНК, эктрагированных из крови, гребня и пальца. Чувствительность данного метода обнаружения ВЛП-J составляла 10-15 г РНК или 210 копий ВЛП-J.

1.8. Иммунитет Активный иммунитет. В естественных условиях большинство цыплят заражаются экзогенным ВЛП от своих собратьев или окружающих предметов. После этапа кратковременной вирусемии у них развиваются вируснейтрализующие антитела, которые растут до высоких титров и остаются у птиц на всю жизнь [216]. Вируснейтрализующие антитела служат для ограничения у птицы количества вируса, что в свою очередь может ограничить неоплазию. Тем не менее, считается, что они оказывают малое непосредственное влияние на рост опухолей [31]. При инокуляции ВЛП цыплятам в возрасте от 4 недель и выше, кратковременная виремия наблюдалась после 1 недели, а образование антител наступало через 3 недели и позже [93]. В исследованиях естественно инфицированных цыплят после вылупления, антитела впервые обнаруживали только в 9-недельном возрасте.

В возрасте 14-18 недель 80% поголовья оказалось сероположительной, при этом отмечалось увеличение пропорции антител [186]. Чем моложе птица, тем больше продолжительность виремии и длительней период формирования антител. Инокуляция однодневных цыплят приводит скорее к долговременной виремии, чем к формированию антител.

У ВЛП-инфицированных птиц часто происходит формирование антител к gs-антигену, но это не оказывает никакого влияния на рост новообразований. Данных о клеточном иммунитете при ВЛП-инфекциях недостаточно. Вероятно, он направлен одновременно против вирусной инфекции и формирования новообразований. У птиц, инфицированных ВЛП или ВСР, встречаются также цитотоксические лимфоциты, направленные против антигенов вирусной оболочки [31, 227, 261]. Экспрессированные вирусные белки на поверхности опухолевых клеток являются основными мишенями клеточного иммунитета, но также сюда входят и невирусные поверхностные антигены трансформационно-специфических клеток.

При проведении исследований сарком Рауса было установлено, что опухоленесущий хозяин реагирует на опухоль-ассоциированные поверхностные антигены клеток (ОАПА). Эта реакция служит для замедления роста опухолей или вызывает регрессию. ОАПА могут быть вирусными структурными антигенами и поражаться антивирусными реакциями организма. Кроме того, они могут быть опухолевыми антигенами, появляющимися на опухолевой клетке. Такие опухолевые антигены могут быть вирусонаправленными, вирусспецифичными или депрессивными антигенами хозяина. ОАПА могут обозначаться как опухолеспецифичными антигенами трансплантации (ОСАТ), когда они индуцируют иммунитет in vivo поверхностные клеточные антигены (СТПА) при проведении их в исследованиях in vitro [97, 171, 212]. В настоящее время недостаточно данных о противоопухолевом иммунитете при ЛЛ. В некоторых случаях инфицирование ВЛП может сопровождаться иммуносупресией. Однако, Fadly и его коллеги [90] наблюдали, как иммунные функции В- и Т-клеток оставались нормальными на ранних и более поздних стадиях инфекции, вызванной штаммом RAV-1 ВЛП.

Генетически резистентные цыплята устойчивы к инфицированию и индуцированию развития опухолей ко всем подгруппам вирусов лейкоза и саркомы птиц. Обычно у них даже не развиваются антитела [63, 68, 99].

Генетическая устойчивость к развитию опухолей исследовалась, в основном, с саркомой Рауса, регрессия которой определялась наличием доминантного гена R-RS-1, распологающегося в главном комплеске гистосовместимости (Ea-B локус). Локус Ea-B также влияет на возникновение эритробластоза и меньшее влияние оказывает на лимфоидный лейкоз [12]. Bacon L.D. с соавторами сообщали [13], что некоторое влияние на регрессию саркомы Рауса оказывает локус лимфоцитного антигена Bu-1, а на лимфоидный лекоз – локус Th-1.

Генетическая устойчивость к развитию опухолей лимфоидного лейкоза, такая как у RPL линии 6, обусловлена бурсальными клетками, а не клеточными элементами иммунной системы, такими как клетками тимуса, формирующимися в тимусе или нелимфоцитарные клетки. Считается [203], что это происходит из-за внутренней неспособности бурсальных целевых клеток становиться инфицированными или трансформироваться и это является основным фактором генетической резистентности. и Humphries не обнаружили существенной разницы протекания бурсальной инфекции у чувствительных и резистентных линий кур [10].

представлены в основном иммуноглобулинами класса G, передаются от курицы своему потомству [183] через яичный желток. В результате у цыплят формируется пассивный иммунитет, который длится в течение 3-4 недель.

Такие пассивно приобретенные антитела задерживают инфицирование ВЛП [265, 271] и уменьшают частоту развития опухолей [32], снижают частоту вирусемии и распространение ВЛП [89]. Уровень и устойчивость иммунитета у цыпленка связаны с титрами антител в сыворотке его матери.

1.9. Меры борьбы и профилактики Ликвидация ВЛП из племенных стад один из самых эффективных методов за контролем ВЛП-инфекции. Племенные фабрики яичного и мясного напрвлений достигли значительного прогресса в уменьшении или полной ликвидации вирусов лейкоза птиц подгрупп А, B и J из элитных линий племенных кур [238].

Экзогенные ВЛП можно устранить из птичьих стад. Вплоть до года данная процедура применялась только для экспериментальных или специальных, свободных от специфических возбудителей инфекционных заболеваний, стад птиц. Это было связано с тем, что применявшиеся методы были длительными по времени, сложными и дорогостоящими. В дальнейшем, благодаря применению методов Spencer [238], такие процедуры стали возможными и для коммерческих стад.

Искоренение инфекции, вызванной ВЛП, направлено на прерывание вертикальной передачи вируса от курицы к ее потомству. Чтобы сделать стаю свободной от лейкоза необходимо выводить, выращивать и содержать в изоляции группы кур, которые не передают вирус своему потомству.

Процедура устранения ВЛП включает:

1) отбор способных к оплодотворению яиц от куриц, показавших негативную реакцию в тестах с использованием яичного альбумина или влагалищных мазков [65, 88, 89, 172, 186];

2) выведение цыплят в изоляции небольшими группами в клетках с проволочным полом, отказ от ручного метода определения пола цыплят путем исследования клоаки [89] и проведения вакцинации обычной иглой [93] для предотвращения механического распространения какой-либо остаточной инфекции;

3) проверку цыплят на ВЛП с помощью биологических тестов или ПЦР образцов крови и отбраковывание цыплят с положительной реакцией и других находящихся с ними в контакте цыплят [88, 89, 176, 225];

4) выращивание в изоляции свободных от ВЛП групп птиц. На практике отбор куриц с низкой степенью распространения вируса проще для выполнения, чем последующая проверка цыплят и выращивание их в изоляции для достижения полного устранения инфекции. Поэтому некоторые коммерческие птицеводческие хозяйства концентрируют свое внимание только на уменьшении степени инфицирования посредством проверки куриц.

Для многих линий кур был заметен прогресс в уменьшении степени распространения вируса, но некоторые линии плохо реагировали на отбор [172, 176]. Такая реакция не была связана с породами кур, а обусловлена, по всей вероятности, факторами внешней среды.

В США была разработана также программа для тестирования элитных племенных птиц, которая используется для устранения ВЛП подгруппы J у кур мясной породы [176, 238]. Данная программа включает в себя следующие процедуры:

А) исследуют клоакальные смывы у птиц 20-недельного возраста на наличие gs-антигена коммерческими наборами ИФА и позитивных на gsантиген кур отбраковывают;

Б) на 22 неделе исследуют сыворотки крови у птиц на виремию.

Изолированный вирус тестируют при помощи ПЦР для подтверждения подгрупповой специфичности;

В) на 23 неделе или старше отбирают по два первых яйца от каждой курицы и исследуют яичный альбумин на наличие gs-антигена, позитивных птиц на gs-антиген отбраковывают;

Г) на 26 неделе отбирают образцы мекониума от первых цыплят всех несушек и исследуют на gs-антиген, положительных цыплят и их родителей отбраковывают;

Д) примерно на 40 неделе повторно тестируют образцы альбумина и отбраковывают.

Данные пять процедур позволяют прогрессивно обследовать петухов и кур, а также их потомство на всех этапах их жизненного цикла.

Куры больше всего чувствительны к контактному инфицированию ВЛП сразу же после вылупления. Хотя основным источником инфекции являются другие цыплята, врожденно инфицированные ВЛП, разработаны ряд процедур, позволяющих уменьшить или исключить инфекцию, оставшуюся от предыдущих популяций птиц. Инкубаторы, выводные отделения, птичники и все оборудование необходимо чистить и дезинфицировать перед каждым новым их использованием. Опасность попадания в cтадо штаммов вируса, еще не присутствующих в популяции, можно исключить, если не смешивать яйца или цыплят из различных источников и выращивать цыплят в изолированных условиях, позволяющих предотвратить перекрестное заражение стад [89, 176].

Таким образом, анализ литературных данных показал, что ВЛП является широко распространенным вирусом, циркулирующим во всех хозяйствах многих стран. Самыми распространенными ВЛП являются представители подгрупп А, Е и J. ВЛП индуцирует образование обширных опухолей, тем самым наносит большие экономические потери для птицеводства.

Отсутствие периодического контроля куриных эмбрионов и клеток куриного происхождения, использующихся для культивирования вирусов, может привести к контаминации вирусами животных создаваемых вакцинных препаратов для людей, что отмечено в 5 главе последней редакции Европейской Фармацеи 2012.

Также анализ литературы показал, что ВЛП характеризуется высокой вариабельностью. Изучение механизмов антигенной вариабельности ВЛП позволило выявить фрагмент генома, кодирующий основной белок – наружный гликопротеин, структура которого определяет антигенные и подгрупповые особенности ВЛП. Данный фрагмент генома находится в гене env последовательности и образует пять кластеров hr1, hr2, vr1, vr2 и vr3. Два больших кластера hr1 и hr2 демонстрировали очень значительную вариабельность нуклеотидной последовательности, при этом hr2-домен показывал еще более высокую вариабельность в сравнении с hr1-доменом.

Данных о распространении ВЛП в хозяйствах Российской Федерации не достаточно. Изучение распространения ВЛП делает актуальной оценку эпизоотологической ситуации относительно ВЛП на территории России и позволит расширить представление о циркулирующих изолятах ретровирусов птиц в птицеводческих хозяйствах. Исследование и определение первичной структуры вариабельной области гена env позволит определить молекулярные свойства изолятов ВЛП, циркулирующих на территории Российской Федерации и сравнить их с зарубежными штаммами и разработать адекватные методы молекулярной диагностики ВЛП.

Отсутсвие препаратов для профилактики и лечения лейкоза птиц, делает основным и необходимым контроль данных инфекций, который основан на выявлении и удалении из стада инфицированной птицы. Именно поэтому необходимо совершенствовать и внедрять современные чуствительные и специфичные методы диагностики. Поэтому создание эффективной и быстрой тест-системы ПЦР для выявления вируса лейкоза птиц и в различных биологических необходимо и актуально.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1.1. Штаммы и изоляты вирусов ВЛП В работе были использованы следующие референтные штаммы вируса лейкоза птиц, любезно предоставленные Лабораторией Онкогенных Болезней Птиц (ADOL), США:

-штамм RAV-1, представитель ВЛП подгруппы A;

-штамм RAV-2, представитель ВЛП подгруппы B;

-штамм RAV-49, представитель ВЛП подгруппы C;

-штамм RAV-50, представитель ВЛП подгруппы D;

-штамм RAV-0, представитель ВЛП подгруппы E, -штамм ADOL-Hcl, представитель ВЛП подгруппы J.

Изоляты ВЛП Изоляты были получены из различных птицеводческих хозяйств России с неблагополучной обстановкой по опухолевым заболеваниям.

Выделенные изоляты, исследованные в данной работе, представлены в табл Полевые изоляты ВЛП, исследованные в данной работе 2.1.2. Культуры клеток Для выделения, размножения и титрования ВЛП использовали первично- и вторичнотрипсинизированные культуры клеток фибробластов от СПФ-эмбрионов кур (ФЭК), полученных из ФГУП «Щелковского Биопредприятия» и «Lohmann Tierzucht» (Германия).

Для выделения и дифференциации ВЛП использовали вторичные культуры клеток линий: line 0, line alv6, 15B1, DF-1/J, любезно предоставленные ADOL (США).

2.1.3. Растворы и реагенты Питательные среды, реактивы, растворы и сыворотки:

-питательная среда 199 производства фирмы «Sigma-Aldrich» (США);

-питательная среда F10 производства фирмы «Sigma-Aldrich» (США);

-питательная среда Лейбовиц, МакКой производства фирмы «SigmaAldrich» (США);

-0,5% раствор трипсина;

-0,25% раствор трипсина;

-0,02% раствор версена;

-сыворотки крови: крупного рогатого скота, телят, плодов крупного рогатого скота (фетальная);

-мясо-пептонный агар (МПА) производства ФГУП «Щелковский Биокомбинат»;

-мясо-пептонный бульон (МПБ) производства ФГУП «Щелковский Биокомбинат»;

-мясо-пептонный печеночный бульон (МППБ) под вазелиновым маслом (среда Китт-Тароцци) производства ФГУП «Щелковский Биокомбинат»;

-тиогликолевая Биокомбинат»;

-соево-казеиновый Биокомбинат»;

-агар Сабуро;

-0,9% раствор хлорида натрия;

-фосфатно-буферный раствор с рН 7,2-7,4;

-раствор Tween 80.

Для изготовления растворов использовали реактивы квалификации «ЧДА», «ХЧ», «ОСЧ» и дистиллированную воду (ГОСТ 6709-72).

Поликлональные антитела поликлональные антитела любезно предоставленные ADOL, США:

-anti-RAV-1;

-anti-RAV-2;

-anti-RAV-49;

-anti-RAV-50;

-anti-RAV-0;

-anti-ADOL-Hcl;

Моноклональные антитела моноклональные антитела любезно предоставленные ADOL, США:

-6AL42 специфичные к ВЛП-A и ВЛП–В;

-G2.3 специфичные к ВЛП-J.

Диагностические наборы Для выявления ВЛП методом иммуноферментного анализа (ИФА) использовался набор фирмы «Synbiotics» (Франция) согласно инструкции.

Содержание антител против ВЛП подгруппы J определяли с помощью иммуноферментного анализа («Sinbiotics », Франция) в соответствии с прилагаемой инструкцией.

2.1.4 Реагенты и наборы для молекулярной биологии -Набор для выделения ДНК из геля («Promega», DNA Purification System, Wizard );

-Набор для выделения ДНК из геля QIAEX II Gel Extraction Kit («QIAGEN»);

-Набор для очистки ПЦР-продуктов («Promega», Wizard™ PCR Preps DNA Purification system for Rapid Purification of DNA Fragments);

-Набор для получения кДНК («Invitrogen», cDNA Cycle Kit);

-Набор для выделения РНК (ООО «Ветбиохим», Россия).

Ревертаза (обратная транскриптаза) M-MLV(AMV) производства фирмы «Promega» (США);

Taq-полимераза производства фирмы «Promega» (США).

2.1.5. Оборудование При работе использовали следующее оборудование:

-СО2-инкубатор модель СО281R фирмы «New Brunswick Scientific»;

-инкубатор для куриных яиц (Россия);

Pages: |

| 2 | 3 |

Главная >> Диссертации - все темы

[ СКАЧАТЬ ОРИГИНАЛ ДОКУМЕНТА .pdf ]

Похожие работы:

«УДК 745/749+7.032(31) Курасов Сергей Владимирович ИСКУССТВО ТИБЕТА (XI-XX ВВ.) КАК ЕДИНАЯ ХУДОЖЕСТВЕННАЯ СИСТЕМА: ИКОНОЛОГИЯ И ЯЗЫК ОБРАЗОВ Специальность: 17.00.04 Изобразительное, декоративно-прикладное искусство и архитектура Диссертация на соискание ученой степени доктора искусствоведения...»

«СЕРГЕЕВА ЛЮДМИЛА ВАСИЛЬЕВНА ПРИМЕНЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЗАКВАСОК ДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МЯСНОГО СЫРЬЯ И УЛУЧШЕНИЯ КАЧЕСТВА ПОЛУЧАЕМОЙ ПРОДУКЦИИ Специальность 03.01.06 – биотехнология ( в том числе бионанотехнологии) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель Доктор биологических наук, профессор Кадималиев Д.А. САРАНСК ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ.....»

«Синельников Александр Алексеевич ПОВЫШЕНИЕ ЭКСПЛУАТАЦИОНОЙ НАДЕЖНОСТИ И ЭКОНОМИЧНОСТИ СВЕКЛОУБОРОЧНОГО КОМБАЙНА HOLMER В УСЛОВИЯХ СЕЛЬСКОГО ТОВАРОПРОИЗВОДИТЕЛЯ Специальность: 05.20.03 – Технологии и средства технического обслуживания в сельском хозяйстве Диссертация на соискание...»

«АНУФРИЕВ ДЕНИС ВИКТОРОВИЧ АДВОКАТУРА КАК ИНСТИТУТ ГРАЖДАНСКОГО ОБЩЕСТВА В МНОГОНАЦИОНАЛЬНОЙ РОССИИ Специальность 23.00.02. – политические институты, этнополитическая конфликтология, национальные и политические процессы и технологии Диссертация на соискание ученой степени кандидата юридических наук Научный руководитель – доктор юридических наук,...»

«РОЗАНОВ Филипп Иванович СОЦИАЛЬНОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ КАК ИНФОРМАЦИОННЫЙ ОБМЕН Специальность 09.00.11 – социальная философия Диссертация на соискание ученой степени кандидата философских наук Научный руководитель Доктор философских наук,...»

«ХА ВАН ЧЬЕН ФОРМИРОВАНИЕ СХЕМЫ БАЗИРОВАНИЯ ПРИ РАЗРАБОТКЕ ОСНАСТКИ ДЛЯ СБОРКИ УЗЛОВ ИЗ МАЛОЖЁСТКИХ ДЕТАЛЕЙ Специальность 05.02.08 – Технология машиностроения Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук Научный руководитель : кандидат технических...»

«ВИНОГРАДОВА ОЛЬГА ПАВЛОВНА ВОСПАЛИТЕЛЬНЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ ОГРАНОВ МАЛОГО ТАЗА С ПОЗИЦИИ СИНДРОМА СИСТЕМНОГО ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ОТВЕТА 14.01.01-акушерство и гинекология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научные консультанты: Доктор медицинских наук, профессор...»

«Мошкина Елена Васильевна Организационно-педагогическое сопровождение процесса подготовки студентов заочной формы в условиях электронного обучения 13.00.08 – Теория и методика профессионального образования ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научный руководитель : доктор педагогических наук, профессор,...»

«Князькин Сергей Игоревич ЭКСТРАОРДИНАРНЫЙ ХАРАКТЕР ДЕЯТЕЛЬНОСТИ НАДЗОРНОЙ СУДЕБНОЙ ИНСТАНЦИИ В ГРАЖДАНСКОМ И АРБИТРАЖНОМ ПРОЦЕССЕ 12.00.15 – гражданский процесс; арбитражный процесс Диссертация на соискание учной степени кандидата юридических наук Научный руководитель : Доктор юридических наук, профессор Фурсов Дмитрий Александрович Москва,...»

«Давыдов Алексей Алексеевич. МАТЕМАТИЧЕСКИЕ МОДЕЛИ ДЛЯ АНАЛИЗА ВРАЩАТЕЛЬНОГО ДВИЖЕНИЯ МАЛЫХ КОСМИЧЕСКИХ АППАРАТОВ Специальность 01.02.01 – Теоретическая механика. ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата физико-математических наук Научный руководитель : доктор физико-математических наук, профессор В.В. Сазонов Москва – 2012 2 Содержание Введение Глава 1. Исследование режима гашения угловой скорости космического аппарата в нештатной ситуации 1.1. Уравнения...»

«Абызов Алексей Александрович ОСНОВЫ ТЕОРИИ И МЕТОДЫ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ НАДЕЖНОСТИ ХОДОВЫХ СИСТЕМ БЫСТРОХОДНЫХ ГУСЕНИЧНЫХ МАШИН Специальность 05.05.03 – Колесные и гусеничные машины Диссертация на соискание ученой степени доктора технических наук Научный консультант – доктор технических наук,...»

«ТРОПКИНА Юлия Викторовна ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата педагогических наук ИННОВАЦИОННЫЙ ОПЫТ ОБУЧЕНИЯ ПИСЬМЕННОЙ РЕЧИ В ПРОФЕССИОНАЛЬНОЙ ПОДГОТОВКЕ И ПЕРЕПОДГОТОВКЕ СЛУШАТЕЛЕЙ ВОЕННО-МОРСКИХ ВУЗОВ 13.00.08 – Теория и методика профессионального образования Научный руководитель : доктор педагогических наук, профессор Чиркова Елена...»

«Боков Александр Викторович Численные методы исследования математических моделей геофизики и тепловой диагностики на основе теории обратных задач 05.13.18 — Математическое моделирование, численные методы и комплексы программ Диссертация на соискание учёной степени кандидата физико-математических наук Научный руководитель : доктор физико-математических наук, профессор В.П. Танана ЧЕЛЯБИНСК — 2014 Содержание Введение 4 1...»

«Жердев Павел Александрович ПЕРВОНАЧАЛЬНЫЙ ЭТАП РАССЛЕДОВАНИЯ ПРЕСТУПЛЕНИЙ, СВЯЗАННЫХ С ПОДДЕЛКОЙ ИЛИ УНИЧТОЖЕНИЕМ ИДЕНТИФИКАЦИОННОГО НОМЕРА ТРАНСПОРТНОГО СРЕДСТВА В ЦЕЛЯХ ЭКСПЛУАТАЦИИ ИЛИ СБЫТА Специальность 12.00.12 – криминалистика; судебно-экспертная деятельность; оперативно-розыскная деятельность Диссертация на соискание...»

«Вакуленко Андрей Святославович ОБЩЕСТВЕННОЕ МНЕНИЕ В СОЦИАЛЬНО–ИСТОРИЧЕСКОМ ПРОЦЕССЕ 09.00.11 – социальная философия Диссертация на соискание ученой степени кандидата философских наук Научный руководитель : доктор философских наук, профессор Зорин Александр Львович Краснодар – 2014 Содержание ВВЕДЕНИЕ.. ГЛАВА Теоретико–методологические основы изучения I. общественного мнения.. 1.1. Полисемантичность...»

«Загуляев Денис Георгиевич ОРГАНИЗАЦИЯ ОПЛАТЫ ТРУДА РАБОЧИХ НА ТЕХНИЧЕСКОМ ОБСЛУЖИВАНИИ ОБОРУДОВАНИЯ ПРОМЫШЛЕННЫХ ПРЕДПРИЯТИЙ Специальность 08.00.05. – Экономика и управление народным хозяйством (экономика, организация и управление предприятиями, отраслями и комплексами – промышленность; экономика труда) Диссертация на соискание учёной степени...»

«БУДАЙ ЛОРА ПАВЛОВНА ПЕДАГОГИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ СУБЪЕКТОВ ВОСПИТАТЕЛЬНОГО ПРОСТРАНСТВА МУЗЕЯ 13.00.01 – общая педагогика, история педагогики и образования Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научный руководитель – доктор педагогических наук Якушкина Марина Сергеевна...»

«Шепелева Лариса Петровна КОМПЬЮТЕРНАЯ ТОМОГРАФИЯ В ДИАГНОСТИКЕ ПЕРВИЧНОГО ТУБЕРКУЛЕЗА ОРГАНОВ ДЫХАНИЯ У ДЕТЕЙ И ПОДРОСТКОВ 14.01.16. – фтизиатрия 14.01.13. - лучевая диагностика и лучевая терапия ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора медицинских наук Научные консультанты: доктор медицинских наук, профессор АКСЕНОВА...»

«из ФОНДОВ РОССИЙСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННОЙ БИБЛИОТЕКИ Кулиш, Оксана Геннадьевна 1. Взаимосвязь оБраза семьи и развития самосознания у детей дошкольного, младшего школьного U подросткового возрастов 1.1. Российская государственная Библиотека diss.rsl.ru 2005 Кулиш, Оксана Геннадьевна Взаимосвязь образа семьи и развития самосознания у детей дошкольного, младшего школьного U подросткового возрастов [Электронный ресурс]: Дис.. канд. псикол наук : 19.00.01.-М.: РГБ, 2005 (Из фондов Российской...»

«ИЗ ФОНДОВ РОССИЙСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННОЙ БИБЛИОТЕКИ Патрушева, Тамара Николаевна Экстракционнопиролитический метод получения функциональных оксидных материалов Москва Российская государственная библиотека diss.rsl.ru 2006 Патрушева, Тамара Николаевна Экстракционнопиролитический метод получения функциональных оксидных материалов : [Электронный ресурс] : Дис. . дра техн. наук : 05.17.02. М.: РГБ, 2006 (Из фондов Российской Государственной Библиотеки)...»

наверх

<< ГЛАВНАЯ | КОНТАКТЫ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА (Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)