«БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ КОРРЕКЦИИ ОСТРОГО ВОСПАЛЕНИЯ ЛИПИДАМИ ПЕЧЕНИ ТРЕСКИ ...»

2.8.4 Гистологическая оценка повреждения уха Гистологическая оценка включала в себя микроскопию пораженного уха у животных из группы. Весь материал непосредственно после некропсии был фиксирован в достаточном количестве 10% нейтрального забуференного формалина не менее 24 часов, после чего материал проходил стандартную обработку в спиртах нарастающей концентрации, просветлен в хлороформе и залит в парафин. С парафиновых блоков были изготовлены срезы толщиной 4- мкм. Для микроскопического исследования срезы были окрашены гематоксилином и эозином. Морфологическое исследование гистологических препаратов проводилось при помощи светооптического микроскопа Zeiss AxioScope A1 (Carl Ziess, Germany), микрофотографии были сделаны с помощью камеры AxioCam ICc1 (Carl Zeiss, Germany).

Микроскопическая оценка включала в себя анализ степени воспалительных изменений в коже уха по 5 признакам: лейкоцитарно-плазмоцитарная реакция;

степень выраженности воспалительных изменений на разных уровнях слоев кожи;

глубина поражения; фиброз и склероз.

Анализ для каждого исследованного животного был представлен в баллах, характеризующих патологические изменения по следующей шкале: 0 баллов Отсутствие каких-либо патологических изменений в ткани; 1 балл Патологический процесс представлен: слабо выраженной лейкоцитарноплазмацитарной инфильтрацией эпидермального слоя, без вовлечения дермальных структур. 2 балла - Умеренная воспалительная инфильтрация, дермы, без поражения хрящевой ткани. 4 балла - диффузная лейкоцитарноплазмацитарная инфильтрация некроз с тенденцией к распространению и переходу на хрящевую ткань, с формированием деструктивного склероза. баллов - некроз с вовлечением всех структур (эпидермиса, дермы, хряща), с формированием выраженных склеротических изменений.

Бальная система была использована впервые и разработана специально для оценки патологии контактного дерматита.

2.9 МЕТОД АНАЛИЗА ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ДЕЙСТВИЯ

ЛИПИДНОГО КОМПЛЕКСА НА МОДЕЛИ ОСТРОГО ВОСПАЛЕНИЯ

“КАРРАГЕНИНОВЫЙ ВОЗДУШНЫЙ МЕШОЧЕК” У КРЫС

Было сформировано 6 групп по 7 животных в каждой группе в соответствии с планом эксперимента (Таблица 8) Интактные (введение п/к физ. раствора) + плацебо (5% Контроль (введение п/к каррагенина без лечения) + За шесть дней до начала лечения крыс помещали в СО 2 камеру до достижения анестезии на 30 секунд. Стерильным шприцом объемом 20 мл, заполненным воздухом, вводил 20 мл воздуха подкожно во внутрикапсульную область спины крысы. Эта инъекция воздуха создает воздушный мешочек. Спустя 3 дня вводили 10 мл воздуха в то же место. Эта вторая инъекция составляет половину от первоначального объема воздуха и используется, чтобы поддержать целостность воздушного мешочка без увеличения раны.

На 6 день под СО2 анестезией вызывали воспаление, вводя 5 мл 0,5 % раствора каррагенина (-Carrageenan, Sigma-Aldrich, USA) непосредственно в мешочек, используя шприц на 5 мл, 20 G.

каррагенина.

Липидный комплекс тестировали в трех различных дозах 4 мг/кг, 0,4 мкг/мл и 0,04 мкг/мл. Растворителем служил 5% ДМСО. ЛК в каждой концентрации вводили в одинаковом объеме 1 мл на каждое животное внутрь мешочка. В качестве плацебо служил раствор 5% ДМСО.

В качестве препарата сравнения использовали препарат Диклофенак в лекарственной форме раствор для инъекций 25 мг/мл (Hemopharm, Сербия).

Диклофенак вводили внутрь мешочка сразу после инъекции раствора каррагенина. Терапевтическая доза для человека равна 2 мг/кг (исходя из максимальной дозы 150 мг на человека массой 70 кг). Поскольку препарат вводили внутрь мешочка, метаболический коэффициент при расчете дозы не учитывали. Для крысы массой 200 г доза была равна 2 мг/кг или 400 мкг на животное. Ампула диклофенака представляет собой раствор объемом 3 мл, содержащий 75 мг действующего вещества "диклофенак". 400 мкг на крысу соответствует 17 мкл раствора для инъекций. Поскольку вводимые объемы должны быть равными для всех вводимых веществ, 17 мкл раствора для инъекций был доведен до объема 1000 мкл физиологическим раствором.

Спустя 6 часов после инъекции, животное подвергалось эвтаназии ингаляцией СО2. Для забора экссудата в воздушный мешочек каждой крысе вводили физиологический раствор по 10 мл, используя шприц 10 мл. Смешивали содержимое мешочка, мягко массируя область. Вскрывали воздушный мешочек сагиттальным разрезом поперек мешочка (5 см) и собирали весь объем экссудата в стерильную центрифужную пробирку на 15 мл.

Сразу после забора экссудат был исследован на клеточный состав при помощи ветеринарного гематологического анализатора ABACUS VET (Австрия).

Экссудат центрифугировали 10 мин при 300g. Отбирали 1 мл супернатанта и замораживали при -20°C до проведения анализа на содержание простагландина PGF2. Анализ PGF2 проводился с помощью набора для количественного опреления простагландина F2 методом иммуноферментного анализа Prostaglandin F2 EIA kit (Cayman Chemicals, USA).

2.10 МЕТОДЫ МАТЕМАТИЧЕСКОЙ СТАТИСТИКИ

Для всех данных была применена описательная статистика: данные проверены на нормальность распределения. Тип распределения определялся критерием Шапиро-Уилка. В случае нормального распределения были подсчитаны среднее значение и стандартная ошибка среднего, которые вместе со значением n представлены в итоговых таблицах. В случаях ненормального распределения была рассчитана медиана и квартильный размах. Межгрупповые различия анализировались параметрическими или непараметрическими методами, в зависимости от типа распределения. В качестве параметрического критерия был использован критерий Стьюдента для зависимых и независимых переменных.

В качестве непараметрических критериев – критерий Манна-Уитни. Различия были определены при 0.05 уровне значимости.

Статистический анализ выполнялся с помощью программного обеспечения Статистика 6.0 (StatSoft, США).

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1 ВЛИЯНИЕ ЛИПИДНОГО КОМПЛЕКСА НА ЭНЗИМАТИЧЕСКУЮ

Исследование влияния ЛК на энзиматическую активность 5-липооксигеназы (5-ЛОГ) проводилось с использованием коммерческого набора Lipoxygenase Inhibitor Screening Assay Kit (Cayman Chemical, USA) и очищенной 5-ЛОГ картофеля (Cayman Chemical, USA). В качестве препарата сравнения использовали неселективный ингибитор 5-ЛОГ – NDGA (Cayman Chemicals, USA) в концентрации 15 мкМ.

гидропероксидов, продуцируемых в реакции липоксигенации, и вычисляли энзиматическую активность фермента 5-ЛОГ в исследуемых образцах.

Вычисляли процент активности 5-ЛОГ в образцах, по сравнению с контролем (интактная 5-ЛОГ). Каждый образец исследовали в четырех параллелях.

Для проведения анализа образцы, в четырех параллелях каждой концентрации, смешивали в пропорциях, указанных в таблице 9.

Пропорции смешения образцов для исследования активности 5-ЛОГ Неселективный ингибитор 5-ЛОГ NDGA, мкМ Реакцию проводили при комнатной температуре на орбитальном шейкере в 4-х параллелях (повторностях). Время инкубации неселективного ингибитора NDGA/исследуемого препарата ЛК с 5-ЛОГ (фермент) и линоленовой кислотой (субстрат) составляло 10 минут. Энзиматический катализ останавливали внесением хромогена. Через 5 минут инкубации проводили измерение оптической плотности на длине волны 492 нм.

После снятия оптической плотности вычисляли следующие параметры:

1) Скорость реакции вычисляли по формуле:

А492/мин (ед.опт.плотности/мин) = (А492контроль - А492проба )/5 минут 2) Активность фермента 5-ЛОГ вычисляли по формуле:

Активность 5-ЛОГ (мкМоль/мин/мл) = А492/мин х 0,21мкл/9,47mM-1 х 0,09 мкл *Где 9,47 – коэффициент экстинкции определенный для данного исследования.

3) Процент ингибирования:

% ингибирования = (А492контроль - А492проба)*100/А492контроль Из данных, приведенных в таблице 8 видно, что неселективный ингибитор 5ЛОГ (NDGA) значительно снижал скорость реакции липооксигенации, по сравнению с контролем в 3,6 раза.

Из таблицы 10 видно, что изменение скорости реакции от концентрации ЛК носит дозозависимый характер.

Анализ влияния ЛК на скорось ферментативной реакции 5-ЛОГ в Неселективный (NDGA), 15 мкМ Примечание - * - различие статистически значимо в сравнение с контролем, по критерию Стъюдента,