«5-НТ2А-АНТАГОНИСТЫ В РЯДУ НОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ БЕНЗИМИДАЗОЛА И ИЗУЧЕНИЕ ИХ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ...»

Государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

«ВОЛГОГРАДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ

УНИВЕРСИТЕТ»

Министерства здравоохранения Российской Федерации

Государственное бюджетное учреждение

«ВОЛГОГРАДСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР»

На правах рукописи

МАЛЬЦЕВ ДМИТРИЙ ВАСИЛЬЕВИЧ

5-НТ2А-АНТАГОНИСТЫ В РЯДУ НОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ

БЕНЗИМИДАЗОЛА И ИЗУЧЕНИЕ ИХ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОГО

ДЕЙСТВИЯ

14.03.06 – фармакология, клиническая фармакология

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

академик РАН, Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Спасов Александр Алексеевич ВОЛГОГРАД –

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. 5-HT2А-РЕЦЕПТОРЫ: СТРОЕНИЕ, ФУНКЦИИ,

ЛОКАЛИЗАЦИЯ. ЛИГАНДЫ 5-НТ2А РЕЦЕПТОРОВ И ИХ

ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ПОТЕНЦИАЛ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)................. 1.1. Классификация, строение и распределение 5-HT2А-рецепторов................. 1.2. Локализация 5-HT2А-рецепторов

1.3. Функции 5-HT2А-рецепторов

1.4. Лиганды 5-HT2А-рецепторов

1.5. Производные бензимидазола: перспективы поиска новых веществ с 5-HT2А-антагонистическим действием

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы исследования

2.2. Методы исследования

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ ПОИСК СОЕДИНЕНИЙ,

БЛОКИРУЮЩИХ 5-НТ2А-РЕЦЕПТОРЫ, СРЕДИ ПРОИЗВОДНЫХ

БЕНЗИМИДАЗОЛА

3.1. Изучение 5-HT2А-антагонистических свойств производных N9имидазо [1,2-]бензимидазола на модели серотонин-индуцированной активации тромбоцитов

3.2. Определение показателей IC50, LD50 и терапевтического индекса соединений лидеров

3.3. Зависимость серотониноблокирующих свойств производных имидазобензимидазола от химической структуры

3.4. Зависимость антисеротонинового эффекта изучаемых веществ от их физико-химических свойств

3.5. Заключение

ГЛАВА 4. ВЛИЯНИЕ СОЕДИНЕНИЯ РУ-476 НА ИЗМЕНЕНИЕ

СОСУДИСТОГО ТОНУСА И КРОВОТОКА, ИНДУЦИРОВАННОГО

СЕРОТОНИНОМ

4.1.1. Влияние соединения РУ-476 на вызванное серотонином изменение скорости кровотока во внутренней сонной артерии

4.1.2. Влияние соединения РУ-476 на серотонин индуцированное изменение скорости кровотока в мозговых артериях

4.2. Воздействие соединения РУ-476 на изменение скорости кровотока в мозговых артериях при введении серотонина в условиях ишемии мозга крыс

4.3. Влияние соединения РУ-476 на системное артериальное давление........... 4.4. Влияние соединения РУ-476 на хронотропное действие серотонина......... 4.5. Заключение

ГЛАВА 5. АНТИТРОМБОТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА СОЕДИНЕНИЯ РУ-476..... 5.1. Действие соединения РУ-476 на агрегацию тромбоцитов

5.2. Изучение антитромботического действия соединения РУ-476................. 5.3. Заключение

ГЛАВА 6. ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ЦЕНТРАЛЬНЫХ

МЕХАНИЗМОВ НЕЙРОТРОПНОГО ДЕЙСТВИЯ СОЕДИНЕНИЯ

РУ-476

6.1. Влияние соединения РУ-476 на 5-HT3 и 5-HT4 - рецепторы in vitro......... 6.1.1. Влияние соединения РУ-476 на 5-HT3-рецептор

6.1.2. Влияние соединения РУ-476 на 5-HT4 рецептор

6.2. Взаимодействие соединения РУ-476 с модуляторами основных нейромедиаторных систем in vivo

6.2.1. Воздействие соединения РУ-476 на гиперкинез, вызванный гидрокситриптофаном у мышей

6.2.2. Воздействие соединения РУ-476 на ареколиновый тремор

6.2.3. Влияние соединения РУ-476 на никотиновый тремор

6.2.4. Влияние соединения РУ-476 на судорожный эффект пикротоксина..... 6.2.5. Действие соединения РУ-476 на стереотипное поведение, вызванное апоморфином

галоперидола

6.2.7.Действие соединения РУ-476 на эффекты L-ДОФА

6.2.8. Влияние соединения РУ-476 на гипотермический эффект резерпина... клофелина

6.2.10. Действие соединения РУ-476 на стереотипное поведение, вызванное фенамином

6.3. Заключение

ГЛАВА 7. АНАЛЬГЕТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ СОЕДИНЕНИЯ РУ-476....... адъювантного артрита

7.2. Влияние соединения РУ-476 на формалиновую гиперальгезию............... 7.3. Заключение

ГЛАВА 8. ОБЩИЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА СОЕДИНЕНИЯ

РУ-476

8.1. Изучение острой токсичности вещества РУ-476

8.2. Изучение возможных нейротоксикологических эффектов соединения РУ-476

8.3. Заключение

ГЛАВА 9. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы.

Для серотониновых рецепторов 2 типа показано участие в различных функциях организма, как в норме, так и при патологиях [Мирзоян Р.С. и др., 2006; Чейдо М.А., 2010; Мирзоян Р.С. и др., 1999; Воронина Т.А. с соавт., 2010]. Опосредуемые 5-НТ2А рецепторами эффекты вовлечены в процессы контроля функционального состояния тромбоцитов (активация, агрегация), тонуса сосудов, развития воспалительных реакций, а так же возникновения и проведения болевых импульсов [Berger M. et al., 2009; Макаров В.А. с соавт., 2005]. В связи с этим, 5-НТ2А рецептор вызывает значительный интерес как фармакологическая мишень, при создании высокоэффективных препаратов для коррекции нервно-психотических расстройств, лечения цефалгий мигренозного типа [Амелин А.В., 2011; Воронина Т.А. с соавт., 2011].

В настоящее время в практической медицине используется ряд средств корректирующих нарушение гемостаза и транзиторные цереброваскулярные расстройства, в том числе мигрень, у которых доказана 5-НТ2Аантагонистическая активность [Green A.R., 2006; Середенин С.Б. с соавт., 1998].

Однако уже имеющиеся лекарственные средства (ципрогептадин, метерголин, рисперидон) являются низкоэффективными препаратами второго ряда, которые так же обладают целым рядом побочных эффектов и противопоказаний [Амелин А.В., 2011].

На основании указанного выше актуальным и целесообразным стал поиск новых эффективных соединений с 5-НТ2А антисеротониновым действием, и разработка на их основе средств для лечения функциональных нарушений сосудисто-тромбоцитарного звена, мигрени. В ранее проведенных исследованиях была обоснована перспективность изучения конденсированных производных бензимидазола с целью выявления новых антагонистов 2А подтипа серотониновых рецепторов [Горягин И.И., 2008; Tomi M. et al., 2003;

Анисимова В.А. с соавт., 2010; Анисимова В.А. с соавт., 2012].

Степень разработанности. На сегодняшний день для 5-НТ2А рецепторов доказано участие в формировании значительного количества патологических состояний - мигрень, гипертензия, обсессивно-компульсивные расстройства, ожирение [Krupali G. et al., 2011; Adams J. W. et al., 2008; Leysen c соавт., 1984;

Gamoh S. et al., 2013; Nagаtomo T. et al., 2004]. В России отсутствуют препараты, способные эффективно блокировать 2А подтип серотониновых рецепторов [Амелин А.В. с соавт., 2011].

Целью исследования является поиск новых веществ, обладающих 5-НТ2Аантагонистической активностью в ряду новых производных бензимидазола и изучение их фармакологических свойств.

Для решения указанной цели были поставлены следующие задачи:

Изучить влияние новых производных бензимидазола на 5НТ2А-рецепторы на модели in vitro.

применением логико-структурных методов.

Определить активность новых соединений в отношении серотониновых 5-НТ2А-рецепторов на экспериментальных моделях нарушения мозгового и системного кровотока и сравнить их с Исследовать антиагрегантные и антитромбогенные свойства наиболее активного соединения на моделях in vivo и in vitro.

Провести оценку влияния наиболее активного соединения на основные медиаторные системы мозга с определением возможного спектра рецепторной и нейротропной активности.

Изучить обезболивающую активность соединения на моделях периферической гипералгезии.

Изучить острую токсичность наиболее активных соединений.

эффектов наиболее активного соединения.

Научная новизна.

Впервые была изучена 5-НТ2-серотониноблокирующая активность производных имидазо[1,2-]бензимидазола, содержащих циклические и нециклические алкильные остатки в боковой цепи, присоединенные к атому N9.

коррелирует с показателями заряда азотсодержащего радикала в положении N9.

Диэтиламиноэтил и 4 - метоксифенил в N9 и С2 положениях, вносили наиболее значимый вклад в уровень фармакологической активности.

В результате проведенных экспериментов установлено, что соединение РУ-476 (N9-пиперидиноэтил замещенное имидазо[1,2-]бензимидазола) по уровню 5-НТ2А-антагонистической активности проявляет равную кетансерину активность и превосходит ципрогептадин. Установлена способность экспериментального соединения эффективно снижать уровень серотонин индуцированной активации и агрегации тромбоцитов. Получены данные об отсутствии у соединения РУ-476 антитромботической активности, на моделях артериального тромбоза индуцированного электрическим током и аппликацией хлоридом железа (III).

Впервые показана способность соединения РУ-476 снижать серотонин индуцированный спазм сосудов, болевую чувствительность, а также возможное взаимодействие с агонистами/антагонистами дофаминергической, серотонинергической и ГАМК-ергической медиаторными системами мозга.

Научно-практическая значимость.

Выявленные в ходе проведенного исследования закономерности между серотониноблокирующей активностью производных бензимидазола и их структурой и физико-химическими свойствами расширяют знания и могут быть полезны при целенаправленном поиске новых соединений с 5-НТ2А-блокирующей активностью.

возможностью блокировать 5-НТ –индуцированную активацию и агрегацию тромбоцитов, снижать вызванный серотонином спазм сосудов, изменять эффекты медиаторов дофамин- и ГАМК–ергических нейромедиаторных систем, а также анальгетическое действие позволяют рекомендовать лабораторным шифром РУ-476.

Методология и методы исследования.

осуществлялся из современных высокоинформативных методов имеющихся в ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет»

Министерства здравоохранения Российской Федерации и ГБУ ВМНЦ.

Исследование осуществлялось на нелинейных половозрелых самцах мышей, крыс и морских свинок, а также кроликах-самцах. Основные методы исследования, направленные на изучение сосудистых, антитромботических, нейромедиаторных и анальгетических свойств соединения РУ-476 проводились согласно методическим рекомендациям по проведению доклинических исследований лекарственных средств [Мирзоян Р.С. с соавт., 2012; Воронина Т.А., Гузеватых Л.С., 2012].

Реализация результатов исследования.

Результаты выявленных закономерностей между структурной и физикохимической характеристикой исследованного ряда производных имидазо[1,2-] бензимидазола, содержащих циклические и нециклические алкильные остатки в боковой цепи, присоединенные к атому N9 с их 5-НТ2А антагонистической активностью, внедрены в работу по оптимизации синтеза соединений с 5-НТ2А блокирующей активностью, которая проводиться на базе НИИ физической и органической химии Южного Федерального университета. Результаты работы внедрены в лекционные курсы на кафедрах фармакологии, фармакологии и биофармации ФУВ, фармацевтической и токсикологической химии Волгоградского государственного медицинского университета, кафедре фармакологии Саратовского государственного медицинского университета, кафедре фармакологии Пермской государственной медицинской академии, кафедре фармакологии Северо-Западного государственного медицинского университета.

Основные положения, выносимые на защиту.

являются перспективным классом соединений для поиска новых антагонистов 5-НТ2А-рецепторов.

2. Соединение под лабораторным шифром РУ-476 (9-диэтиламиноэтил-2метоксифенил) имидазо[1,2-а]бензимидазола) по влиянию на 5-НТ2Арецепторы равно кетансерину и превосходит ципрогептадин.

3. Вещество РУ-476 способно эффективно блокировать серотонин индуцированную активацию и агрегацию тромбоцитов, но не обладает антитромботическим действием.

4. Соединение РУ-476 выражено блокирует серотонин индуцированное снижение скорости кровотока в общих сонных и области средней мозговой артериях, обладает анальгетическим действием.

Апробация работы.

Основные материалы диссертации докладывались и обсуждались на I Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых, Москва, 2013 г.; XVII и XVIII Региональных конференциях молодых исследователей Волгоградской области, 2012-13 гг.; 70, 71 и 72 итоговых научных конференциях студентов и молодых ученых Волгоградского государственного медицинского университета, Волгоград, 2012-14 гг.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 10 работ (из них 3 статьи в рецензируемых изданиях, рекомендуемых Минобрнауки).

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 178 страницах машинописного текста, иллюстрирована 15 рисунками, 34 таблицами. Состоит из введения, обзора литературы (глава I), главы материалы и методы (глава II), экспериментальной части (главы III-VIII), обсуждения результатов (глава IХ), выводов и списка литературы, включающего 187 источников, в том числе зарубежных.

ГЛАВА 1. 5-HT2А-рецепторы: строение, функции, локализация.

Лиганды 5-НТ2А рецепторов и их терапевтический потенциал (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) 1.1. Классификация, строение и распределение 5-HT2А-рецепторов Начиная со времени обнаружения серотонина в головном мозге в году Дальстремом и Фуксом, а также изучения опосредованных им эффектов, появилось множество работ по поиску и исследованию соединений, селективно взаимодействующих с серотониновыми рецепторами [Laura Cristina Berumen et al., 2012]. При этом непосредственно 2А подтип был обнаружен ещ в году Гаддумом и Пицарелли, хотя на тот момент его приняли за дофаминовый рецептор. Только через 22 года, в 1979 году, Пероутка и Снитке определили его как серотониновый рецептор 2А подтипа [Peroutka S.J., Snyder S.H., 1979]. В настоящее время сформировалось представление о разнообразии серотониновых рецепторов, которые представлены семью различными типами и более чем шестнадцатью подтипами [Alexander S.P.H. et al., 2010; Hannon J., Hoyer D., 2008]. Расшифрована полипептидная структура серотониновых рецепторов различных подтипов, определена их топология.

Серотониновые рецепторы локализованы практически во всех органах и тканях [Hannon J., Hoyer D., 2008].

Рецепторы для серотонина относятся к двум классам (рис. 1.1):

- Ионотропные, являющиеся катионными каналами, которые закрываются и открываются лигандами (5-НТ3 рецепторы) [Kitson S.L., 2007].

G- протеин сопряженные рецепторы (5-НТ1, 5-НТ2, 5-НТ4-7).

НТ-рецепторы Рис. 1.1 Классификация серотониновых рецепторов (IUPHAR, 2014).

Тип 5-НТ2-рецепторов объединяет 3 подтипа: 5-НТ2А, 5-НТ2В и 5-НТ2С рецепторы [Rahman W. et al., 2011]. Все эти рецепторы имеют альфа-спирали, семикратно пронизывающие мембрану (трансмембранные домены) (рис. 1.2).

Группы доменов соединены длинными цепочками белков, три петли которых направлены во внеклеточное пространство, а три – в сторону цитозоля.

Третья внутриклеточная петля предназначена для связывания с G-белком.

Отмечается, что каждый из трансмембранных сегментов состоит из 25- аминокислот. Макромолекула рецептора также имеет внеклеточный N- и внутриклеточный С – концевые участки [Weinstein H., 2006].

К активации рецептора приводит взаимодействие с аспартатом и глутаматом в ТМ III, а также ТМ VII, что характерно для многих G белок связанных рецепторов [Jufang Shan et al., 2012; Kristiansen K. et al., 2000].

Исследования по точечному мутагенезу свидетельствуют, что взаимодействие между основным азотом лигандов и боковой цепью аспартата 155 в III домене, содержащего карбоксильную группу, приводит к «заякориванию» лиганда.

Аминогруппа серотонина и некоторых других 5-НТ2 лигандов, помимо вышеуказанного взаимодействия, может образовывать водородную связь с боковой цепью серина 159 и аспартата 155 в ТМ III [Kristiansen K. et al., 2000;

Weinstein H., 2006]. Однако другая часть специфических лигандов, у которых аминогруппа является частью цикла, не склонна к данному взаимодействию изза стерических затруднений. Также существуют данные о влиянии на уровень связывания различных участков в ТМ V: S239, F240, F243, и F244. Так, мутация ТМ на участке F243A приводила к снижению связывания -метил-серотонина, кетансерина, ритансерина и спиперона, но не оказывала никакого эффекта на связывание серотонина и N-диметилтриптамина [Shapiro D. A. et al., 2000].

Также существует мнение об особом вкладе Asn 363 и Tyr 370 в связывании лиганда и передаче сигнала [Karuppiah Kanagarajadurai et al., 2009].

Рис. 1.2 Структура 5-НТ2А-рецептора [Bubar M.J., Cunningham K.A., 1 – клеточная мембрана 2 – трансмембранные спирали 5-НТ2А-рецептора,, – субъединицы G-белка.

рецепторов для построения 5-НТ2-рецептора, а также данные по точечному ароматических аминокислот в 6 и 7 доменах прямо участвуют в связывании лигандов [Kristiansen K. et al., 2000].

К ним относится триптофан в положениях 200, 336 и 367, фенилаланин в положениях 340 и 365, умеренно стабильный тирозин в положении 370. Кроме того остатки фенилаланина в положениях 243 и 244 специфически принимают участие в связывании лигандов посредством - взаимодействия [Jufang Shan et al., 2012].

Останавливаясь на различиях в строении и синтезе этих белков у разных видов, стоит отметить, что ген человека, кодирующий 5-НТ2А рецептор, локализован в 13q14-q21 хромосоме [Krupali G. Mistry et al., 2011]. 5-НТ2А рецептор представляет собой гликопротеин, состоящий из 471 аминокислоты;

отмечается сходство в строение рецептора у человека, крыс и мышей [Stam N.J.

et al., 1992].

разрабатываются для человека, а большая часть исследований проводится на тканях, клетках, органах животных, и следовательно, существуют проблемы гетерологичности этих рецепторов между собой. Обращает внимание, что 5НТ2А подтип наименее отличается у этих видов, выделяется сходство по длине аминокислотной последовательности, в отличие от В и С подтипов. В то же время для В подтипа при одинаковой последовательности существуют различие по составу аминокислот [Garlow S.J. et al., 1993]. В целом аминокислотные последовательности 3-х подтипов гомологичны на 50%, а их трансмембранные регионы - на 70-80% [Krupali G., Mistry et al., 2011].

Давая общую характеристику трем подтипам 5-НТ2 рецепторов, следует отметить, что все 3 подтипа рецептора сопряжены с фосфолипазой С посредством -субъединицы Gq ГТФ связывающего белка. 5-НТ2А рецептор в классическом представлении связан с Gi/Go белками. Указанные виды белков участвуют в активации фосфолипазы С [Bryan L. Roth, 2011], благодаря которой стимулируется образование инозитолтрифосфата (IP3), диацилглицериновый (DAG) каскад, а также повышается внутриклеточный Ca2+ [Rang H.P. et al., 2001; Michelle Day et al., 2002]. Как частный случай конечным результатам может становиться стимулирование синтеза арахидоновой кислоты [Berumen L. C. et al., 2012].

Через G белок содержащий, и субъединицы [Masson J. et al., 2012], может активироваться не только PLC, но и PLD. Посредством данной липазы активируется фосфатидная кислота, через которую происходит влияние на PLC, стимулирующей образование DAG. PLD также непосредственно влияет и на extracellular signal-reguleted kinase (ERK) как 1, так и 2 [Berumen L. C. et al., 2012]. Так, методами in silico установлено, что PKL для 2А подтипа серотониновых рецепторов и PLA2 для комбинации 5-НТ2А/1А серотониновых рецепторов снижали активность ERK как 1, так и 2 типов [Chang C. W. et al., 2008].

инозитолтрифосфат и диацилглицерол. Агонисты этих рецепторов индуцируют гидролиз фосфатидилинозитола [Michelle Day et al., 2002].

серотониновых рецепторов возможно взаимодействие и связь с различными G белками [Canal C. E. et al., 2010]. Такие вариации зависят не только от структуры рецептора, но и от места, где он располагается.

Хотя 5-НТ2А рецепторы известны как G - белок сопряженные рецепторы, у них существуют и альтернативные механизмы пострецепторной передачи [Massonn J. et al, 2012], одним из которых является связь с аррестиновым путем (рис. 1.3). Это подтверждено рядом исследований с использованием arrestin 2 нокаутных животных [Cullen L. Schmid, Laura M. Bohn, 2010; Jonethan D. et al., 2007; Cullen L. Schmid et al., 2008; Fiorica-Howells E. et al., 2002].

Рис. 1.3 Возможные пострецепторные механизмы действия 5-НТ2А рецептора. (Jonethan D et al., 2007).

стречается упоминание об участии серотониновых рецепторов 2А подтипа в регуляции гликоген синтаз - киназы 3 (GSK3). Отмечается, что в данном типе регуляции не задействованы стандартные механизмы через протеин липазу С и протеин киназу L [Abigail M. Polter and Xiaohua Li, 2011].

дофаминовые D2 рецепторы, указывают на преобладание аррестинового пути.

Такой механизм регуляции в дальнейших исследованиях косвенно был подтвержден и для 5-НТ2А рецептора [Schmid C. L., Bohn L. M., 2010]. При этом данный механизм инактивации отмечается как для агонистов, так и для антагонистов и зависит от состояния 5-НТ2А рецептора и других рецепторных систем. Механизм регуляции через аррестиновый путь изучался, в основном, для препаратов, преимущественно относящихся к атипичным нейролептикам [Polter A.M., Xiaohua Li, 2011].

Среди белков, способных регулировать действие Gq-связанные рецепторы, выделяются кавеолин-1 и синапс-связанный белок 90 (SAP 90), которые участвуют в передаче и корректировке сигнала, в том числе и у 5НТ2А-рецептора [Anushree Bhetnagar et al., 2004; John A. Allen et al., 2008].

биохимическим каскадом, приводящим к запуску ещ большего количества путей биохимических каскадов химических реакций [Chang C. W. et al., 2008;

John A. Allen et al., 2008].

1.2. Локализация 5-HT2А-рецепторов Большинство исследователей говорит о локализации серотонина в теле нервной клетки [Хауликэ И., 1978]. Подтверждением этого они считают неравномерное распределение медиатора в разных структурах ЦНС: отсутствие его в мякотных волокнах и высокую концентрацию в сером веществе мозга [Pais D.J. et al., 1968]. При участии агониста 1-(2,5-диметокси-4-йодофенил l)-2аминопропана (DOI) была установлена постсинаптическая локализация 5-НТ2А рецептора [Muchimapura S. et al., 2003], а позднее рецептор был обнаружен и пресинаптически [Miner L. A. et al., 2003].

серотониновых рецепторов находится в пирамидных нейронах, в большей части регионов коры головного мозга, базальных ганглиях и в меньшем количестве в гиппокампе [Bombardi C., 2012; Mareka G. J. et al.,2001; Aghajanian G. K., Marek G. J., 1999; Stein D. J. et al., 2007].

С использованием поликлональных антител также были доказаны высокие уровни содержания серотониновых рецепторов в обонятельной луковице, неокортексе, кластруме, грушевидной коре, мамиллярных органах, ядрах моста, красном ядре и ядрах шва [Charnay Y., Leger L., 2010]. В коре головного мозга [Stein D. J. et al., 2007;. Puig M. V, Gulledge A. T., 2011] многие иммунореактивные нейроны были обнаружены в II-VI слоях [Allen J.A. et al., 2008]. При использовании метода иммуноэлектронной микроскопии 5-НТ2А рецептор зафиксирован непосредственно под утолщением постсинаптической мембраны асимметричных синапсов [Hamadaa S. et al., 1998].

вентральном стриатуме [Borroto-Escuela D.O. et al., 2010]. Эти рецепторы широко распространены в периферических тканях. Они обнаружены в сосудах, мочевом пузыре, желудочно-кишечном тракте, миометрии матки, тромбоцитах [Hannon J., Hoyer D. et al., 2008].

Высказывается мнение и о связи серотонина с митохондриями. Это предположение подтверждается данными экспериментов с гомогенатами тканей, согласно которым 60—70% серотонина мозга крыс осаждаются в митохондриях [Гребников В.А., 1981].

1.3. Функции 5-HT2А-рецепторов Особый интерес специалистов по разработке лекарственных препаратов представляет 5-НТ2А подтип рецепторов не только среди иных серотониновых рецепторов, но и в сравнении с 2С и 2В подтипами. Это обосновывается в физиологических функций серотонина [Ramage A.G., Villaln C.M., 2008].

Так, для 5-НТ2А типа рецепторов отмечается роль в регуляции сердечнососудистой системы [Nagetomo T. et al., 2004], в частности, наличие тромботических и сосудосуживающих эффектов [Krupali G. et al., 2011; Adams J. W. et al., 2008], влияние на агрегацию тромбоцитов [Leysen и соавт., 1984]. В связи с чем 2А подтип серотониновых рецепторов участвует в целом ряде заболеваний: возникновение приступов мигрени, легочной артериальной гипертензии, брадикардии, спазме коронарных артерий, ишемической болезни сердца и других [Gamoh S. et al., 2013; Nagаtomo T. et al., 2004].

Существует мнение, что почти все неблагоприятные эффекты серотонина в отношении сосудистой системы опосредуются рецепторами 5-НТ2-типа [Wiernsperger N.F., 1994]. Однако, помимо 2 типа, сосудистая и тромботическая активность способна регулироваться и 1 типом серотонин чувствительных рецепторов, что отражается в возможной стратегии лечения артериальных тромбозов при одновременном блокировании 1В и 2А серотониновых рецепторов [Moerland M. et al., 2011], что показано на примере соединения SL65.0472-00.

Локализация 2А серотониновых рецепторов в тромбоцитах обуславливает как активацию, так и агрегацию тромбоцитов. В частности, для кетансерина и ципрогептадина экспериментальным путем показана способность снижать коллаген индуцированную агрегацию тромбоцитов [Nagetomo T. et al., 2004].

При этом интерес представляет и участие рецептора в увеличении ионов Са 2+ в сосудах, тем самым способствуя сокращению гладкомышечной мускулатуры [Krupali G. et al., 2011].

Известно, что некоторые 5-НТ2- антагонисты способны снижать чувства тревоги и страха. Отмечается, что проявление анксиолитического эффекта для 5-НТ-ергических средств неоднозначно, а также более характерно для селективных блокаторов серотониновых рецепторов 2 типа, в том числе и 2А подтипа [Hearn J. K., 2005]. Кроме того, известно, что 5-HT2А рецепторы вовлечены в формирование множества поведенческих реакций, особенно в процессы тревоги, оборонительной реакции, но не паники [Onaivi E.S. et al., 1995]. При этом за счет высокой концентрации рецепторов в центральной нервной системе особый акцент делается на психотропную активность [Celada P. et al., 2013]. Естественно, эффекты серотонина тесно сопряжены с другими медиаторными системами. Так, через 2А и 2С подтипы может опосредоваться негативное влияние на адренергическую и дофаминергическую системы, а посредством 1 - и 2-адренергических рецепторов может происходить взаимодействию нейромедиаторную трансмиссию. Через 5-НТ2А рецепторы осуществляется регуляция состояния беспокойства, настроения, реакционной способности к психологическому стрессу, самоконтроля, мотивации и антидепрессантов [Hamon M., Blier P., 2013]. Сами 5-НТ2А рецепторы давно зарекомендовали себя как мишень для атипичных антипсихотических средств (клозапин, миртазапин и селективный 5-HT2A-антагонист М100907) [Celada P. et al., 2004]. Для таких соединений показана высокая эффективность в снижении негативных симптомов шизофрении [Krupali G. et al., 2011]. Существуют данные, указывающие на связь между 5-HT2A-активацей и галлюценогенезом [Halberstadt A.L. et al., 2013].

Среди всего многообразия процессов в центральной нервной системе, в котором задействуется серотонинергическая система, выделяется участие и, соответственно, возможность влияния на процессы обучения и памяти. Это подтверждается не только положительными эффектами D-диэтиламида лизергиновой кислоты, но и негативным воздействием на процесс обучения проявляющие 5-НТ2А антагонистическое действие, обладают таким влиянием.

Для D-бром лизергиновой кислоты, LY53,857 и кетансерина данного эффекта отмечено не было [Harvey J. A., 2003].

Существуют экспериментальные данные об участии серотониновых рецепторов 2А подтипа в регуляции аппетита и метаболизма. Исследования на мышах, связанные с блокадой рецептора лекарственными соединениям, выявили негативные влияния, связанные с увеличением массы тела и гиперфагией, что, в свою очередь, приводило к снижению уровня глюкозы. При этом блокирование действия серотонина, в особенности 2А типа, может положительно сказаться на чувствительности к инсулину при диабете [Krupali G. et al., 2011].

Антагонизм в отношении 5-НТ2А-рецепторов имеет потенциал для защиты от факторов риска и вносит вклад в лечение сердечно-сосудистых заболеваний, в том числе связанных с метаболическим синдромом, обусловленных ожирением [Krupali G. et al., 2011]. Одновременно с этим, за счет того что 2А подтип серотониновых рецепторов локализован в кардиомиоцитах, серотонин может приводить к развитию гипертрофии сердца и, как показывают исследования, через кальмодулин киназу/гистондезацетилазу 4 использование антагонистов серотонина приводит к снижению негативных эффектов серотонина на кардиомиоциты [Lairez O. et al., 2013].

1.4. Лиганды 5-HT2А-рецепторов Серотонин является эндогенным агонистом 5-НТ2А-рецепторов. В результате ряда проведенных исследований был получен препарат серотонина адипинат, который используется за рубежом в качестве антигеморрагического средства, связанного с его способностью повышать агрегацию тромбоцитов и тем самым укорачивать время кровотечения [Glennon R.A., 1987].

Полные или частичные агонисты 5-HT2A-рецепторов оказывают эффекты "классических" галлюциногенов: ЛСД, псилобицина и мескалина [Chen C. C. et al., 2008; Weinstein, H., 2006]. Одними из потенциально известных галлюциногенов - агонистов 5-НТ2А-серотониновых рецепторов являются 1DOI), 1-(2,5-диметокси-4диметокси-4-йодфенил)-2-аминопропан бромфенол)-2-аминопропан (DOB) и 1-(2,5-диметокси-4-метилфенил)-2аминопропан (DOM) [Glennon R.A., 1987]. Данные соединения используются в экспериментальных исследованиях.

Группой ученых изучен новый антидепрессант миртазапин, который является антагонистом 5-HT2 и 5-НТ3 рецепторов. Воздействуя на этот рецепторный комплекс, миртазапин приводит к снижению тревоги и эффективен как послеоперационный противорвотный препарат [Chen C. C. et al., 2008].

Одним из самых высокоафинных по отношению к 5-НТ2А-рецептору препаратом, проявляющим выраженный антагонизм, является кетансерин (рис.

1.4). Одновременно с этим антагонистические свойства проявляются у данного препарата к альфа-адренергическому рецептору [Janssen P. A. J., 1983]. Он способен блокировать 5-НТ1С-серотониновые рецепторы. Благодаря этому вызывает расширение кровеносных сосудов и оказывает антигипертензивное действие. Изначально данный препарат разработан для лечения гипертензии и используется на данный момент. Также возможно применение этого лекарственного средства при нарушениях периферического кровообращения (перемежающаяся хромота, болезнь Рейно и др.) [Du W. M. et al., 2003].

Благодаря влиянию препарата на 5-HT2A-рецепторы тромбоцитов снижается тромбообразование, в связи с чем кетансерин назначают также при периферических тромбофлебитах, геморроидальном тромбозе. Также было обнаружено, что кетансерин проявляет некоторую кардиотоксичность, удлиняя интервал QT на ЭКГ [Van Nueten J.M., 1984], при этом существуют экспериментальные данные о кардиопротективных свойствах при ишемических заболеваниях сердца [Grover G. J. et al., 1993]. Препарат используется только в зарубежной практике. К нему по химической структуре близок ритансерин, который обладает большей селективностью к 2А подтипу серотониновых рецепторов, более низкими показателями сродства к альфа-адренорецепторам.

Для ряда препаратов, проявляющих 5-НТ2А-антагонистическое действие, характерно использование в лечении дискенезии, возникающей при длительном применении L-ДОФА, применение при лечении болезни Паркинсона. Это показано на примере соединения ACP-103, известного как пимавансерин, а также клозапина и ритансерина [Ferguson M.C. et al., 2010; McFarland K. et al., 2011; Henderson J. et al., 1992; Bersani G. et al., 1990]. В последнее время появились публикации о возможных негативных эффектах ритансерина, выявленных в клинических исследованиях. Отмечалось, что помимо снижения локомоторной активности, препарат отягощал симптомы самого заболевания, для ACP-103 и клозапина таких эффектов отмечено не было [Huot P. et al., 2012].

Метисергид Рис. 1.4 Химические структуры антагонистов серотониновых рецепторов второго типа (5-НТ2).

Рис. 1.4 (окончание) Химические структуры антагонистов серотониновых рецепторов второго типа (5-НТ2).

Рисперидон и оланзепам применяются в психиатрии в комплексном лечении шизофрении и других психотических состояний с преобладанием продуктивной, негативной или аффективной симптоматики; а также некоторых поведенческих расстройств на фоне деменции либо задержки умственного развития [Raja M., 2009; Jasovi-Gasi M., Mari N., 2004].

Для антагонистов 5-НТ2А-рецепторов, кетансерина и метисергида, характерно проявление анальгетических эффектов на моделях гиперальгезии, вызванной 3%-й каолин-каррегановой смесью [Radhakrishnan R. et al., 2003]. В свою очередь метисергид остается одним из эффективных профилактических средств при мигрени, для препарата также отмечается способность блокировать эффекты серотонина, приводящие к вазоконстрикции и изменению давления, эффективно снижать различные эффекты 5-гидрокситриптамина на сосуды скелетной мускулатуры [Fujiwara T., Chiba S., 1995]. Из осложнений наблюдается увеличение веса и периферические отки. При использовании препарата более 6 месяцев может развиться ретроперитонеальный, плевроперикардиальный и субэндокардиальный фиброз. Это осложнение встречается достаточно редко.

Препарат, использующийся в России, неселективный Н1-5НТ2антагонист, ципрогептадин. Данное средство проявляет Н1-антагонистическое действие и обладает более низкой специфичностью к серотониновым рецепторам [Glennon R.A., 1987]. Основные фармакологические действия антигистаминное и противоаллергическое. Оказывает выраженное антисеротониновое действие, при этом ещ слабое м-холинолитическое и седативное. Отмечается эффективность ципрогептадина при ишмических поражениях головного мозга [Nagetomo T. et al., 2004]. Из представленных на Российском фармацевтическом рынке препаратов с 5-НТ2А антагонистической активностью только для ципрогептадина показано применение при мигрени (табл. 1.1).

Известные препараты с 5-НТ2 - антагонистическим действием.

препарата Метисергид конденсированное При профилактике мигрени Метерголин конденсированное При профилактике мигрени, Месулергин конденсированное При болезни Паркинсона Перитол производное ципрогептадина При аллергических Сарпогрелат производное 4-оксобутановой При сахарном диабете, Для лечения расстройств сна применяют такие антагонисты 5-HT2A серотониновых рецепторов как эпливансерин, пимавансерин и волинансерин. Имеются данные, что антагонист серотониновых рецепторов, ритансерин, улучшает качество сна [Hanley N.R., Hensler J.G., 2002].

Селективный антагонист 5-HT2A-рецепторов сарпогрелат используется в клинике ряда зарубежных стран как препарат, снижающий агрегацию тромбоцитов при заболеваниях периферических артерий [Miyazaki M., Higashi Y. et al, 2007].

Рисперидон является антагонистом 5-НТ2A и D2-рецепторов дофамина, относится к числу атипичных нейролептиков, действующих, в частности, на негативные симптомы шизофрении, и вызывает экстрапирамидные нарушения.

Активность рисперидона обуславливается образованием активного метаболита -9-OH-рисперидон [Fuller R.W., Steinberg M., 1976].

Из вышеизложенного видно, что антагонисты 5-НТ2-серотониновых рецепторов используются при коррекции нарушений гемостаза, транзиторных цереброваскулярных расстройства и психических расстройствах (табл. 1).

В связи с этим большое внимание уделяется синтезу и поиску новых высокоактивных веществ, способных блокировать 5-НТ2А- рецепторы.

Так, высокая антисеротониновая активность и достаточно низкая токсичность среди разрабатываемых в России соединений были обнаружены у тропоксина. Для него была показана антисеротониновая активность как в отношении 2А подтипа рецепторов, так и аффиность к 5-НТ1 типу [Горбунов А.А. с соавт., 2010; Ганьшина Т.С., 2004].

АТ-1015 соединение с 5-НТ2А антагонистическим действием, способное вазоконстрикцию [Kihara H. et al., 2000], также может снижать лауреат индуцированное поражение периферических сосудов у крыс, отмечалась потенциальная антитромботическая активность [Kihara H. et al., 2001]. Однако при клиническом испытании соединения, направленного на изучение возможного лечения перемежающейся хромоты, для изучаемого соединения достоверных результатов терапевтической значимости получено не было [Hiett W. R. еt al., 2004].

метаболитом является R-96544, производное пирролидина. Для соединения Rизучена способность снижать агрегацию тромбоцитов, вызванную серотонином с АДФ. [Ogawa T. еt al., 2004]. Для соединения проводятся исследования возможности применения при остром и хроническом панкреатите [Ogawa T. еt al., 2005].

Для соединения AR246686 экспериментальным путем была показана способность снижать вызванную АДФ агрегацию тромбоцитов, которая усиливалась серотонином, а также изменять скорость образования тромба и время кровотечения [Adams J. W. аt al., 2008].

SL 65.0472 антагонист 5НТ1В/2А, для которого экспериментальным путем была показана способность снижать вызванное серотонином сокращение сосудов, на модели ишемии задних конечностей собаки [Barbe F., et al., 2003].

Для гетероциклических аналогов 1192U90, 2-амино -N-( 4- (4- (1,2бензизотиазол- 3-ил) -1-пиперазинил) бутил) бензамида была показана способность связываться с D2, 5-HT2 и 5-HT1A рецепторами [Norman M.H. et al., 1996].

веществ с 5-HT2А-антагонистическим действием Существует много данных о перспективе использования производных бензимидазола как лигандов различных типов серотониновых рецепторов [Sparatore A. et al., 1991; Borsini F. et al., 1991; Sukalovi V. et al., 2005], в том числе и 2 типа [Moss N. et al., 2009]. Для производных арилпиперазин-1-илэтил-бензимидазола содержащих 2-метоксифенил и 2-хлорфенил показана способность к связыванию с 5-НТ2А и D2 рецепторами [Tomic M. et al., 2011].

Также для веществ этого химического ряда были выявлены различные виды активностей: антигипоксическая, антиоксидантная, антиагрегантная, антиаритмическая [Спасов А.А. с соавт., 2006; Анисимова В.А. с соавт., 20101;

Анисимова В.А. с соавт., 20102]. Особое место занимают потенциальные антипсихотические эффекты среди производных бензимидазола, к примеру для 5-[2-[4-(2-метокси-фенил)-пиперазин-1-ил]-этил]-1,3-дигидро-бензимидазол-2тиона [Tomi M. et al., 2003].

На базе Волгоградского Государственного Медицинского Университета и НИИ ФОХ Южного Федерального Университета проводятся исследования бии трициклических конденсированных бензимидазольных систем как потенциальных антисеротониновых средств. Так, отмечается закономерность между способностью блокировать 5-НТ3-серотониновые рецепторы и физикохимическими свойствами трициклических конденсированных бензимидазольных систем – производных имидазобензимидазола [Черников М.

В., 2008; Колобродова Н.А., 2012].

Для производных 1-арилпиперазина показана способность блокировать 5-НТ1А- и 5-НТ2А-рецепторы, а для 2-пиперазинобензимидазола оказывать 5НТ3-антагонистическое действие [Сергеев, П.В., 2003]. Для производных имидазо[1,2-а]бензимидазола, 2,3-дигидроимидазо[1,2-a]бензимидазола и триазоло[1,5-a]бензимидазола показана способность блокировать 5-НТ2рецепторы [Горягин И.И., 2008].

Кроме того в рамках проводимых исследований на базе кафедры фармакологии Волгоградского Государственного Медицинского Университета методами прогнозирования антисеротониновой активности и 2D-QSAR (Quantitetive Structure-Activity Reletionships) замещенных имидазобензимидазолов определена прогнозная оценка как «активных» соединений с высокой вероятностью проявления 5-НТ2Аантагонистической активности.

Таким образом, представляется интересным проведение поиска 5-НТ2Аантагонистов в ряду новых производных бензимидазола и изучение их фармакологического действия.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы исследования В исследовании было изучено 25 производных N9-имидазо[1,2-] бензимидазола, разделнных на 3 группы (табл. 2.1):

с диэтиламиноэтильным заместителем в N9 положении – 10 соединений;

с пиперединоэтильным заместителем в N9 положении – 9 соединений;

с морфолиноэтильным заместителем в N9 положении – 6 соединений.

Все вещества синтезированы в НИИ физико-органической химии Южного федерального университета.

реактивы: серотонина гидрохлорид («Sigma», США), кетансерина тартрат («Sigma», США), ципрогептадин («Sigma», США), ритансерин («Sigma», США), ондансетрон («Лэнс-Фарм», Россия), ацетилхолин йодистый («СпектрХим», Россия), тиклопидин (Тиклид, «Sanofi-syntelabo», Франция), атропина сульфат («Sigma», США), диклофенак-натрий («Хемофарм А.Д.», Сербия), буторфанола тартрат («Московская фармацевтическая фабрика», Россия), адъювант Фрейнда («Grand Island Biological Company», США), динатриевая соль аденозин-5-дифосфорной кислоты (АДФ) (Sigma, США), адреналина гидрохлорид («Ренам», Россия), коллаген («Ренам», Россия), формалин («Биомед», Россия), диазепам (Реланиум, «Польфа», Польша), никотин («Sigma», США), ареколин («Фармакон», Россия), резерпин («Sigma», США), Biomedical», США), 3,4-диокси-L-фенилаланин («Sigma», США), 5-гидрокси-Lтриптофан («Sigma», США), пикротоксин («Sigma», США), карбахол («Sigma», Выражаем признательность ведущему научному сотруднику лаборатории синтеза биологически активных соединений, к.х.н. В.А. Анисимовой за синтез и предоставление субстанций веществ для настоящего исследования.

США), натрия хлорида раствор 0,9% («Эском», Россия), а также химически чистые натрия хлорид, калия хлорид, калия дигидрофосфат, кальция хлорид, глюкоза («Агат-мед», Россия), магния сульфат, натрия гидрокарбонат, трисоксиметил)-аминометана гидрохлорид, натрия цитрат, кислота соляная (Реахим, Россия).

Исследование проведено на 12 кроликах-самцах породы «шиншилла»

массой 3 – 3,5 кг, 5 нелинейных морских свинках обоего пола массой 300-450 г, 303 белых аутбредных крысах-самцах массой 170-300 г, 267 белых аутбредных мышах-самцах массой 20-30 г. Животные содержались в виварии кафедры относительной влажности воздуха 40-50% и температуре 22-24С на стандартной полнорационной диете для лабораторных животных (ГОСТ Р 50258-92). Содержание животных и экспериментальные манипуляции отвечали Международным рекомендациям Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемым при экспериментальных исследованиях (1997), а также правилам лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (приказ Минздравсоцразвития РФ от августа 2010 г. № 708н и приказ Минздравсоцразвития России протокол №6 от 22.12.2012). Все исследования были одобрены к проведению Региональным независимым этическим комитетом при ГБУ «Волгоградский медицинский научный центр» (протокол №89-2009 от 04.02.2009 г.) Химическое строение N -замещенных имидазобензимидазола вещества I. 2-замещенные 9-диэтиламиноэтил-имидазо[1,2-] бензимидазола II. 2-замещенные 9-морфолиноэтил-имидазо[1,2-] бензимидазола III. 2-замещенные 9-пиперединоэтил-имидазо[1,2-] бензимидазола 2.2. Методы исследования 2.2.1 Методы экспериментального поиска 5-НТ2А-блокирующего действия 5-НТ2А антагонистическое действие новых соединений изучалось на модели in vitro серотоннин-индуцированной активации тромбоцитов методом малоуглового светорассеивания [Деркачев Э.Ф. с соавт., 1998] на приборе «Ласка-1К» (С-Петербург, Россия).

Исследование проводилось на 12 кроликах-самцах породы «шиншилла»

массой 3-3,5 кг. У кролика из краевой ушной вены забиралась кровь, стабилизировалась 3,2% раствором цитрата натрия (рН 6,0) в соотношении 9: и центрифугировалась в течении 12 минут при 1000 об/мин. Отобранные образцы обогащенной тромбоцитами плазмы помещались в кювету уже содержавшую буферный раствор. Объем кюветы 8 мл. Вносимое количество тромбоцитов стандартизировали, основываясь на плотности светопропускания, равное 50-60 у.е. Перемешивание пробы в кювете осуществлялось с использованием магнитного волчка.

Изменения, происходящие в кювете, фиксировались благодаря узкому параллельному лучу света, направленного под углом в 90о к стенке кюветы.

Поток света, проходя через кювету, попадал на расположенные на другой стороне фотодиоды, с шагом в 2 градуса расположенных в диапазоне углов от 0 до 90. Полученные через фотодиоды результаты через преобразующий блок поступали на персональное компьютерное устройство, где отображалось в графической форме.

После добавления в кювету с тромбоцитами плазмы индуктора серотонина в концентрации 1 мкМ осуществлялась активация тромбоцитов кролика. Изменения светопропускания фиксировались до времени выхода показателей на стабильный уровень - плато. Измерения, в которых наблюдались эффекты, вызванные введением только серотонина, принимались за контрольные.

В опытных измерениях за 2 минуты (время экспозиции) до введения индуктора в кювету вносилось изучаемое вещество. Первоначальный поиск регрессионного анализа осуществлялся расчет IC50.

В качестве препарата сравнения использовали кетансерин в концентрации 1 мкМ.

проявление их блокирующего действия в отношении серотониновых рецепторов Для изучения зависимости между структурой исследуемых соединений и учитывающий базовую структуру, а также изменение заместителей в N9 и C положениях.

Рис. 2.1 Порядок нумерации радикалов производных бензимидазола, использованный при расчете физико-химических параметров.

Среди математических способов был выбран подход Фри – Уилсона [Голендер В.Е., Розенблит А.Б., 1978]. Для метода важным условием становится знание структуры химического соединения, а уже после наблюдаемые проявления действия на мишень. Такой подход характерен при описании структуры с возможностью в дальнейшем использования е в построении уравнений регрессии.

Использованный подход предполагал, что вклад каждого заместителя в биологическую активность (применительно данного исследования - 5-НТ2Аблокирующее действие) суммируется с другим, что согласно математическим закономерностям возможно отобразить в линейном регрессионном уравнении:

s1,2,3…n – набор заместителей;

a0 – базовая активность ряда;

0,1,2,3…n – вклады соответствующих заместителей в суммарную активность соединений.

При этом каждый элемент s принимает всего два значения:

1, если соответствующий заместитель присутствует в соединении;

0, если соответствующий заместитель отсутствует в соединении.

Тем самым переменные искусственно переводятся в бинарные, облегчая нахождение коэффициента регрессии.

В конечном итоге для определения вклада каждого отдельного заместителя в проявление биологического ответа использовалось следующее уравнение:

2.2.3 Изучение зависимости влияния изучаемых веществ от их физико-химических свойств Для всех изученных соединений были определены некоторые физикохимические характеристики:

коэффициент распределения вещества в системе n-октанол/вода, характеризуя способность вещества в преодолении биологических барьеров за счет способности растворяться в жирах (Vellarkad N.

для отображения возможности влияния внешних электрических полей на заряд вещества была рассчитана величина молекулярной молекулы в электрическом поле (cм3/моль). Данный стерический параметр вычислялся по аддитивной схеме [Arup K., Gordon M., величины липофильности и молекулярной рефракции были рассчитаны как для заместителей в N9 и C2 положениях, так и для были построены первичные 3D модели молекул, исследуемых соединений с учетом солеобразующего и кислотного остатков.

Проведена первичная оптимизация молекул путем минимизации использованием программ MOPAC, в приближении Остина АМ [Минкин В.И. и соавт., 1997]. Были рассчитаны парциальные заряды атомов методом Хюкеля (Extended Huckel Charges) с использованием квантово-химических методов [Burkert U.N.L., 1982; Розенблит А.Б. и соавт., 1983].

Расчты квантово-химических методов реализованы в программе обеспечения «CS Chem3D® 8.0».

Для всех изученных соединений были рассчитаны:

1. Средний заряд с учетом и без учета знака для радикалов в С2, С3 и N9 положениях, также для вышеуказанных радикалов были определены максимальные и минимальные положительные и 2. Средний заряд с учетом и без учета знака, максимальные и минимальные положительные и отрицательные заряды для всей 4. Суммарный заряд не водородных атомов бензольного кольца с 5. Суммарный заряд не водородных атомов среднего имидазольного 6. Суммарный заряд не водородных атомов внешнего имидазольного 7. Средний заряд на кислотном остатке у заместителя атома углерода 8. Средний заряд на кислотном остатке у атома N в 1 положении с Были вычислены квадраты изучаемых физико-химических характеристик соединений.

Проведен анализ корреляции между указанными параметрами изучаемых соединений и уровнем проявляемого 5-НТ2А -антагонистического действия в рядах производных с морфолиноэтильным, пиперединоэтильным и диэтиламиноэтильным заместителями в N9 положении, а также для всех изученных соединений в целом.

Полученные показатели молекулярной рефракции, липофильности и зарядов производных бензимидазола использовались при построении многопараметрового регрессионного уравнения, для расчета применялась статистическая программа «Statistica 6.0».

2.2.4 Изучение изменения скорости кровотока во внутренней сонной артерии при введении серотонин Изучение действия соединений на кровоток в каротидной системе проводили на 28 наркотизированных хлоралгидратом (400 мг/кг) белых беспородных крысах-самцах массой 250-300 граммов, разделенных на 4 группы (1 контрольную, 3 опытных) [Мирзоян Р.С. с соавт., 2012].

Для введения веществ предварительно катетеризировалась бедренная вена. Повышенное содержание серотонина моделировали внутривенным введением 20 мкг/кг серотонина гидрохлорида в 0,2 мл изотонического раствора. Введение серотонина повторяли трехкратно с интервалом в 20 минут.

Изучаемые 5-HT2A-антагонисты вводились внутривенно за 30 мин до моделирования серотонинового спазма в эквимоляльной дозировке:

кетансерин 0,55 мг/кг, ципрогептадин 0,35 мг/кг и РУ-476 - 0,5 мг/кг. Группе контроля вводили изотонический раствор хлорида натрия в эквивалентном объеме.

Динамику кровотока изучали во внутренней сонной артерии, для чего производили измерение линейной скорости кровотока на общей сонной Регистрацию скорости кровотока осуществляли с помощью допплерографа ультразвукового компьютеризованного для исследования кровотока ММ-Д-К («Минимакс–допплер-К», г. Санкт-Петербург, ООО «СП Минимакс»), предназначенного для исследования кровотока в крупных и мелких артериальных и венозных кровеносных сосудах в тканях живого организма.

Диаметр датчика составлял 2 мм.

О результатах судили по уровню влияния исследуемого вещества на исходный уровень кровотока, а главное, по способности изменять разницу между скоростью до и после введения моноамина.

2.2.5 Изучение серотонининдуцированного изменения скорости кровотока в мозговых артериях Эксперимент проводился на 26 половозрелых крысах самцах 250- граммов, разделенных на 4 группы (1 контрольную, 3 опытных). Регистрацию локального кровотока проводили в теменной области головного мозга крыс с помощью ультразвукового допплерогрофа «ММ-Д-К» («Минимакс» СанктПетербург, Россия) [Мирзоян Р.С. и соавт., 2011]. После фиксации головы животного в стереотаксисе, в теменной кости, бором просверливалось отверстие диаметром 0,3 см до поверхности твердой мозговой оболочки, которая сохранялась интактной. После чего датчик УЗДП-010-01 с рабочей частотой 25 МГц, диаметром 0,3 см устанавливался на расстоянии 6-7 мм дистальнее основания среднемозговой артерии по направлению ее центральной ветви.

Для введения серотонина и исследуемых веществ катетеризировалась бедренная вена. Вещества исследовались в эквимоляльных дозах: кетансерин 0,55 мг/кг, ципрогептадин 0,35 мг/кг и РУ-476 - 0,5 мг/кг. Серотонин вводился в дозе 20 мкг/кг.

После установки ультразвукового датчика фиксировали линейную скорость мозгового кровотока до введения вещества (исходные значения), после чего через бедренную вену вводили раствор с изучаемым соединением. С 18 по 20 минуту после введения вещества фиксировался уровень линейной скорости мозгового кровотока и влияние вещества на состояние мозговых сосудов (посредством изменения скорости кровотока). На 20 минуте после введения вещества вводился серотонин, в течение 20 минут регистрировались изменения скорости кровотока в области средней мозговой артерии. Особое внимание уделялось максимальному падению линейной скорости в первые минуты после серотонинового спазма.

По итогам эксперимента определялся уровень влияния исследуемого вещества на исходный уровень кровотока, а главное, способность снижать констрикторные эффекты серотонина (посредством уменьшения разницы между скоростью до и после введения моноамина).

2.2.6 Изучение изменения скорости кровотока в мозговых артериях при введении серотонина в условиях ишемии мозга крыс Для изучения влияния 5-НТ2А антагонистов на сосудистый тонус сосудов головного мозга в условиях ишемии использовалась модель неполной глобальной ишемии [Александрин В.В., 2012]. Эксперимент проводился на половозрелых крысах самцах 250-300 граммов, разделенных на 4 группы ( контрольную, 3 опытных). Так, на первом этапе после наркотизации хлоралгидратом (400 мг/кг) у грызунов осуществлялся доступ к общим сонным артериям, после чего сосуды выделялись и перевязывались. Перевязка осуществлялась на обеих сонных артериях нитью и дублировалась на расстоянии 5-6 мм. После чего за животным осуществлялось пристальное наблюдение и уход. Через 3 суток выжившие особи включались во второй этап эксперимента. Данный этап включал в себя непосредственный доступ к области среднемозговой артерии в теменной области и измерение мозгового кровотока в условиях серотониновой нагрузки, описанных выше.

На указанной модели вещества исследовались в эквимоляльных дозах:

кетансерин 0,55 мг/кг, ципрогептадин 0,35 мг/кг и РУ-476 - 0,5 мг/кг..

Контрольным животным вводился физиологический раствор в объеме, эквивалентном вводимым опытным животным.

2.2.7 Изучение системного артериального давления Эксперимент проводился на 26 половозрелых крысах самцах 250- граммов, разделенных на 4 группы (1 контрольную, 3 опытных). Регистрация показателей диастолического и систолического артериального давления осуществлялась электроманометром на механотронных датчиках с малым объемом смещения (0,05 мл на 250 мм рт.ст.), с помощью компьютерного гемодинамического анализатора на базе программы ВЕАТ (Москва, Россия) [Спасов А.А. с соавт., 2012].

Для введения серотонина и исследуемых веществ катетеризировалась бедренная вена. Вещества исследовались в эквимоляльных дозах: кетансерин 0,55 мг/кг, ципрогептадин 0,35 мг/кг и РУ-476 - 0,5 мг/кг. Серотонин вводился в дозе 20 мкг/кг.

2.2.8 Изучение хронотропного эффекта Изменение частоты сердечных сокращений фиксировали на основании полученных диаграмм в программе «Минимакс–допплер-К» на модели изучения серотонининдуцированного изменения скорости кровотока в мозговых артериях. После ручной обработки диаграмм (подсчета количества пиков) полученные результаты приводились к общепринятым значениям (количеству ударов за 1 мин).

Вещества исследовались в эквимоляльных дозах: кетансерин 0,55 мг/кг, ципрогептадин 0,35 мг/кг и РУ-476 - 0,5 мг/кг. Был рассчитан уровень изменения частоты сердечных сокращений для контрольной группы животных.

Учитывались следующие показатели: исходный уровень частоты сердечных сокращений до введения вещества; уровень частоты сердечных сокращений на 20 минуте после введения вещества; максимальное падение уровня частоты сердечных сокращений после введения серотонина.

2.2.9 Модели артериального тромбоза Экспериментальный тромбоз, индуцированный хлоридом железа (III).

Антитромботическую активность соединений проводили на модели артериального тромбоза у крыс, вызванного поверхностной аппликацией 50% раствора хлорида железа (III) (ч., «Мосреактив» Россия) [KurzK.D., 1990].

Данная модель основана на развитии в очаге поражения (месте нанесения раствора хлорида железа (III)) реакции Хабера-Вейса, с образованием белого (артериального) тромба, основу которого составляют тромбоциты.

Исследование проводилось на 22 крысах самцах массой 270-310 г.

Период инкубации составлял 30 минут, вещества вводились внутрибрюшинно, так как на модели изменения скорости мозгового кровотока использовался парентеральный путь введения. Животные были разделены на 5 групп: контрольную и 4 опытных. Вещества исследовались в эквимоляльных дозах.

Соединение РУ-476 было изучено в дозе 0,5 мг/кг. Препаратами сравнения по механизму действия были выбраны кетансерин в дозе 0,55 мг/кг и ципрогептадин в дозе 0,35 мг/кг, в качестве эталонного препарата по эффекту был выбран клопидогрел в дозе 7,32 мг/кг.

Предварительно крысы наркотизировались хлоралгидратом в дозе мг/кг внутрибрюшинно. Выделяли сонную артерию длиной до 4 см, очищая от сопутствующих тканей. Под артерию подводили парафиновую пленку с загнутыми краями, между которыми помещался ватный диск размером от 4 до 9 мм, на ватный диск наносился 50% раствор хлорида железа (0,025 мл), пленка Parafilm позволяла предотвращать повреждение окружающих тканей.

Проксимальнее участка нанесения раствора хлорида железа устанавливался ультразвуковой датчик (частота 25 МГц). Скорость кровотока регистрировалась с использованием ультразвукового доплерографа («Минимакс–допплер-К», г.

Санкт-Петербург, ООО «СП Минимакс»).

Перед апликацией хлоридом железа фиксировался исходный уровень средней линейной (Vam, см/сек) скорости кровотока, после чего фиксировалось время и скорость образования тромба. Соединение РУ-476, кетансерин и ципрогептадин вводили предварительно за 30 мин, клопидогрел за 2 часа до начала эксперимента.

Фиксировалось время полной окклюзии, а также время снижения скорости кровотока на 50%, 90%, 95% и 99,9%.

Экспериментальный тромбоз, индуцированный электрическим током.

экспериментального тромбоза, индуцированного электрическим током, основывалось на модели Guglielmi G. [Guglielmi Getal, 1991] в модификации.

Особенностью такого вида тромбообразования является вовлечение в процесс АТФ, который начинает активно вырабатываться как ответная реакция на повреждение эндотелия стенки сосудов, электрическим током. Результатом данного воздействия является образование тромба.

Исследование проводилось на 23 крысах самцах массой 270-310 г.

Период инкубации составлял 30 минут, вещества вводились внутрибрюшинно, так как на модели изменения скорости мозгового кровотока использовался парентеральный путь введения. Животные были разделены на 5 групп: контрольную и 4 опытных. Вещества исследовались в эквимоляльных дозах.

Соединение РУ-476 было изучено в дозе 0,5 мг/кг. Препаратами сравнения по механизму действия были выбраны кетансерин в дозе 0,55 мг/кг и ципрогептадин в дозе 0,35 мг/кг, в качестве эталонного препарата по эффекту был выбран клопидогрел в дозе 7,32 мг/кг.

Предварительно крысы наркотизировались хлоралгидратом в дозе мг/кг внутрибрюшинно. Выделяли сонную артерию длиной до 4 см, очищая от сопутствующих тканей. Электроды закреплялись вплотную к сосуду, но так, чтобы не передавливать и не нарушать кровообращение в артерии, на места контакта наносился акустический гель. На 1-2 см дистальнее устанавливался ультразвуковой датчик. Скорость кровотока регистрировалась с использованием ультразвукового доплерографа («Минимакс–допплер-К», г.

Санкт-Петербург, ООО «СП Минимакс»). Индукция тромбоза наружной сонной артерии проводилась постоянным электрическим током напряжением 12 В, сила тока соответствовала 10 мА. Стимуляцию прекращали только после полной окклюзии сосуда. Соединение РУ-476, кетансерин и ципрогептадин вводили предварительно за 30 мин, клопидогрел за 2 часа до начала электроситмуляции. Регистрировалось время полной окклюзии, а также время снижения скорости кровотока на 50%, 90%, 95% и 99,9%.

2.2.10 Исследование агрегации тромбоцитов Влияние на агрегацию тромбоцитов изучаемых веществ исследовали на двухканальном лазерном анализаторе агрегации тромбоцитов ("Биола", г.

Москва) по методу [Born G.V., 1962] в модификации [Габбасова З.А. и др., 1989]. Метод основан на измерении светопропускания в оптическом канале изменяющегося количества тромбоцитов.

Была использована богатая тромбоцитами плазма крови кроликов, которую забирали из краевой ушной вены. Кровь центрифугировали в течение 12 мин при 1000 об/мин. В кювету агрегометра объемом 0,3 мкл вносили мкл богатой тромбоцитами плазмы, после чего в опытном измерении добавляли 30 мкл индуктора. В контрольном измерении в кювету предварительно вносилось изучаемое вещество объемом 10 мкл, после 5 мин инкубации добавлялся индуктор и фиксировался уровень агрегации. Агрегацию индуцировали коллагеном (50 мкг/мл), АДФ (5 мкM), адреналином (10 мкМ) и серотонином (1 мкМ). В качестве препарата сравнения по механизму эффекту была выбрана ацетилсалициловая кислота (100 мкМ).

Об уровне антиагрегантного действия судили посредством расчета разницы между опытным и контрольным значением.

основных нейромедиаторных систем in vivo Влияние на никотиновый тремор Никотиновый тест позволяет изучить способность исследуемых соединений, воздействовать на N-холинрецепторы. Так, никотин в больших дозах (более 4 мг/кг) способен усиливать нервно-мышечную передачу. Такая способность никотина выражалась в возникновении тремора и судорог у испытуемых животных. При низких дозах вводимого никотина (до 2 мг/кг) возникновения судорог не наблюдается, что можно использовать для определения влияния изучаемого вещества на эффекты N-холиномиметика [Андреева Н.И., 2005].

Эксперименты были выполнены на 36 мышах, разделенных на 6 групп ( контрольных, 2 опытных) по 6 животных в каждой. Контрольные группы животных получали физиологический раствор, опытные группы – соединение РУ-476 внутрибрюшинно в дозах 0,5 и 5,0 мг/кг. Спустя 30 минут животным внутрибрюшинно вводился Н-холиномиметик - никотин по следующей схеме:

контрольной группе №1 в дозе 2 мг/кг, контрольной группе №2 – 4 мг/кг, опытным группам – 2 мг/кг. В ходе наблюдения за животными регистрировали латентный период развития тремора, отмечали наличие судорожных приступов и их латентность. О влиянии на Н-холинорецепторы судили по изменению показателей в опытных группах в сравнении с контрольными.

Влияние на ареколиновый тремор Известно, что в опытах на животных центральные холиномиметики (ареколин, оксотреморин) вызывают развитие гиперкинеза, судорог, гипотермии и других эффектов, что позволяет использовать данный тест для выявления центрального М-холинергического действия веществ [Андреева Н.И., 2005].

Тестирование проводилось на 18 крысах, разделенных на 3 группы ( контрольную, 2 опытных) по 6 животных в каждой. Соединение РУ- вводили внутрибрюшинно в дозах 0,5 и 5,0 мг/кг за 30 минут до введения центрального М-холиномиметика ареколина (15 мг/кг, внутрибрюшинно).

Контрольная группа животных получала физиологический раствор. При проведении теста регистрировали латентный период тремора и его длительность. О наличии у изучаемого соединения центрального Мхолиноблокирующего или М-холиномиметического действия судили по изменению измеряемых показателей в опытных группах по сравнению с контрольной.

Влияние на каталептогенный эффект галоперидола В данном тесте исследовалась способность вещества оказывать влияние на дофаминовые рецепторы 2 типа, локализованные в центральной нервной системе, блокируя их. Это выражалось в угнетении двигательной активности и ориентировочных реакций, а также в возможном возникновении каталепсии.

Проявление такой симптоматики является характерной чертой для типичных нейролептиков [Карпов В.Н., 1976; Маймете М.О. и соавт., 1985; Андреева Н.И., 2005].

Тестирование проводилось на 18 крысах, разделенных на 3 группы ( контрольную, 2 опытных) по 6 животных в каждой. Соединение РУ- вводили внутрибрюшинно в дозах 0,5 и 5,0 мг/кг, контрольной группе вводился изотонический раствор хлорида натрия. Через 1 час производилась инъекция галоперидола (3 мг/кг, внутрибрюшинно) и велось наблюдение за животными.

Развившуюся каталепсию оценивали по способности сохранять заданную непривычную позу в течение 15 секунд через 15, 30, 45, 60 и 120 минут после введения галоперидола по балльной шкале С. Morpugo (1962): 1 балл – передняя лапа слегка отводится и помещается на подставку высотой 3 см; балла – крыса стоит на задних лапах, одна передняя помещена на подставку высотой 10 см; 3 балла – крыса стоит на передних лапах, одна задняя лапа помещена на подставку высотой 10 см.

О наличии дофаминергического влияния судили по изменению выраженности каталептогенной реакции в опытных группах по отношению к контролю.

Влияние на гиперкинез, вызванный введением 5-гидрокситриптофана Методика основана на том, что метаболический предшественник серотонина 5-гидрокситриптофан (5-ГТФ) в дозах 200-300 мг/кг вызывает у мышей характерный гиперкинез в виде встряхивания головой. Механизм данного феномена связан с усилением серотонинергической нейропередачи в мозге путм стимуляции 5-HT2-серотониновых рецепторов [PeroutkaS. etal., 1981; PranzetelliM.R. etal., 1989].

Тестирование проводилось на 18 беспородных мышах, разделенных на группы (1 контрольную, 2 опытные) по 6 животных в каждой. Животным опытных групп внутрибрюшинно вводилось соединение РУ-476 в дозах 0,5 и 5,0 мг/кг, контрольным мышам производилась инъекция физиологического раствора. Через 1 час внутрибрюшинно вводился 5-ГТФ в дозе 300 мг/кг. После этого на протяжении 1 часа осуществлялся подсчет количества встряхиваний головой у мышей в течение 1 минуты с интервалом 10 минут. Влияние изучаемого соединения на регистрируемый показатель оценивалось в сравнении с контрольными показателями.

Влияние на эффекты резерпина Тест с резерпином позволяет оценивать влияние новых веществ на эффекты лигандов адренергической системы, поскольку резерпин является симпатолитиком и оказывает угнетающее влияние на ЦНС животных, вызывая уменьшение двигательной активности, гипотермию и угнетение процессов выработки условных рефлексов [Андреева Н.И., 2005].

Опыты проведены на 24 мышах самцах, разделенных на 2 контрольные и 2 опытные группы. Каждая группа состояла из 6 животных. Контрольная группа №1 не подвергалась действию резерпина и использовалась как интактный контроль, животным остальных групп внутрибрюшинно вводился резерпин в дозе 2,5 мг/кг. Развитие гипотермических эффектов резерпина длилось в течение 4 часов, после чего животным контрольных групп вводился внутрибрюшинно изотонический раствор хлорида натрия, животным опытных групп – соединение РУ-476 в дозах 0,5 и 5,0 мг/кг. Через 30 минут после введения веществ и 4 часа 30 минут после введения резерпина оценивали развитие у мышей гипотермии. Измерение ректальной температуры проводили электронным термометром («OMRON», Германия). О действии изучаемых веществ судили по изменению наблюдаемых реакций в опытных группах по сравнению с контрольными показателями.

Влияние на эффекты L-ДОФА Данный тест применяется для выявления у изучаемого соединения MAOингибирующего действия. Тест основан на возможности L-ДОФА в высоких дозах (500 мг/кг) вызывать у животных стереотипные движения, при этом если одновременно использовать вещества, способные ингибировать моноаминоксидазу, эффекты, связанные с проявлением стереотипных движений, возможно наблюдать и при введении низких доз L-ДОФА (100мг/кг) [Андреева Н.И., 2005].

Эксперимент был выполнен на 24 мышах, разделенных на 4 группы ( контрольных, 2 опытных) по 6 особей в каждой. Животным опытных групп внутрибрюшинно вводилось соединение РУ-476 в дозах 0,5 и 5,0 мг/кг, животным контрольных групп – изотонический раствор хлорида натрия. На минуте после введения вещества и физиологического раствора мышам контрольной группы №1 внутрибрюшинно вводился L-ДОФА в дозе 500 мг/кг, контрольной группе №2 и опытным группам – в дозе 100 мг/кг. В ходе эксперимента оценивали наличие и выраженность у животных стереотипии.

Измерения проводили с интервалом в 30 минут в течение полутора часов после введения L-ДОФА. Каждое животное наблюдалось в течение 1 минуты, во время которой экспериментатор оценивал уровень проявляемой стереотипии, используя больную шкалу оценок: 0 баллов – отсутствие стереотипии; 1 балл – отдельные стереотипные движения, в том числе непостоянное принюхивание; балла – непродолжительно длящаяся интенсивная стереотипия, в том числе лизание и грызение; 3 балла – постоянная и интенсивная стереотипия.

О наличии МАО-ингибирующего действия у изучаемого вещества судили по изменению показателей в опытных группах в сравнении с контрольными.

Влияние на судорожный эффект пикротоксина В используемом методе изучается способность пикротоксина вызывать тремор и повторяющиеся клонические судороги. Такой эффект связан с его антагонистическим влиянием в отношении ГАМК - рецепторов [Воронина Т.А., Неробкова Л.Н., 2005].

Исследование проводилось на 18 мышах самцах, разделенных на контрольную и 2 опытные группы по 6 животных в каждой. РУ-476 изучалось в дозах 0,5 и 5,0 мг/кг, контрольной группе вводился изотонический раствор хлорида натрия. Все растворы вводились внутрибрюшинно за 30 минут до введения пикротоксина в дозе 2,5 мг/кг (инъкция производилась интраперитонеально). После этого в течение 1 часа вели наблюдение за животными, отмечая латентный период появления тремора, латентный период развития судорог и количество судорожных приступов. Изменение регистрируемых показателей в опытных группах оценивали в сравнении с контрольными показателями.

Влияние на эффекты апоморфина Апоморфин в малых (0,01-0,15 мг/кг) дозах вызывает стереотипные пресинаптическими дофаминовыми рецепторами и непосредственной их активацией [Раевский К.С., Наркевич В.Б., 2005]. Это дает возможность использовать данный эффект при анализе пресинаптического влияния веществ на дофаминовые рецепторы.

Эксперименты были выполнены на 18 крысах, разделенных на 3 группы по 6 животных в каждой (1 контрольную, 2 опытных). Соединение РУ- вводилось животным внутрибрюшинно в дозах 0,5 и 5,0 мг/кг, контрольная группа получала физиологический раствор. Спустя 30 минут животным вводился апоморфин (0,1 мг/кг, подкожно). Через 30, 60, 90 и 120 минут у животных оценивалась выраженность стереотипных движений. Для оценки использовалась балльная шкала: 0 баллов – отсутствие стереотипии; 1 балл – отдельные стереотипные движения, в том числе единичные случаи зевательных движений, непостоянное принюхивание; 2 балла – непродолжительно длящаяся интенсивная стереотипия, в том числе зевание, лизание и грызение; 3 балла – постоянная и интенсивная стереотипия. О выраженности влияния изучаемого соединения на данный феномен судили в сравнении с показателями контрольной группы.

Влияние на фенаминовую стереотипию Метод основан на способности фенамина влиять на дофаминергическую трансмиссию, так, за счет усиления активности указанной нейромедиаторной системы возникает стереотипное поведение [Раевский К.С., Наркевич В.Б., 2005].

Эксперименты были выполнены на 18 крысах, разделенных на 3 группы по 6 животных в каждой (1 контрольную, 2 опытных). Соединение РУ- вводилось животным внутрибрюшинно в дозах 0,5 и 5,0 мг/кг, контрольная группа получала физиологический раствор. Спустя 30 минут животным вводился фенамин в дозе 5,0 мг/кг внутрибрюшинно. За животными велось наблюдение в течение всего периода наблюдаемого стереотипного поведения, вплоть до его полного исчезновения стереотипии. О выраженности влияния изучаемого соединения на данный феномен судили в сравнении с показателями контрольной группы.

серотониновыми рецепторами in vitro Метод изучения 5-HT4-серотонинергической активности на изолированном пищеводе крысы Связь между серотониновой системой и системой холинергических нейронов разнообразна. Так, было показано расслабляющее влияние моноамина на спазм гладкой мускулатуры пищевода, оказываемый холинергическими нейронами спазм [Reeves J., Bunce K., Humphrey P., 1991;

Nagakura Y. et al., 1997; Smith J. et al., 2008]. Преимущественное влияние, за счет высокой концентрации рецепторов на данном участке ЖКТ, отдается типу серотониновых рецепторов. Данный тип рецепторов, как отмечают некоторые авторы, связан не только с непосредственным влиянием на рецепторы, но и через терминалы нервной системы посредством коррекции выделения ацетилхолина [Kilbinger H., Wolf D., 1992].

Исследование проводилось на пищеводе крыс самцов методом K. Miyeta [Miyeta K. et al., 1992]. Перед забором препарата животное умерщвлялось путм цервикальной дислокации. Препарат представлял собой фрагмент грудного отдела пищевода длиной 1,8-2,2 мм. После этого участок пищевода фиксировался в ванночке, заполненной раствором Кребса, объем ванночки составлял 10 мл (модель 4000, UgoBasileS.R.L., Италия). Производилась постоянная аэрация, также поддерживалась стабильная температура 37°С.

После фиксации препарат в обязательном порядке проходил адаптацию в течение 60 минут. Регистрация данных производилась посредством изометрического датчика (модель 7006, Ugo Basile S.R.L., Италия), соединнного с образцом, на самописце (модель 7050, Ugo Basile S.R.L., Италия). В начале эксперимента регистрировались исходные значение тонуса пищевода, посредствам карбохолина в концентрации 310-6 моль/л вызывали сокращение гладкой мускулатуры. В контрольном измерении релаксацию мышечной ткани вызывали введением в ванночку неселективного агониста серотониновых рецепторов - серотонина гидрохлорида в концентрации мкМ/л. Между экспериментами препарат отмывался. О результатах судили по способности изменять разницу между контрольным и опытным значениями.

Метод определения 5-НТ3-антагонистической активности.

Активность в отношении блокирования третьего типа серотониновых рецепторов изучалась на изолированной подвздошной кишке морской свинки [YoshidaS. et al., 2007].

Из-за высокого уровня взаимосвязи серотониновых рецепторов для устранения миметического влияния серотонина использовался 5-НТ2антагонист кетансерин в концентрации 110-7 моль/л.

Исследование проводилось на самцах морских свинок. Животные наркотизировались хлоралгидратом (400 мг/кг) и умерщвлялись. Срединным разрезом вскрывалась брюшная полость и осуществлялось извлечение отрезка подвздошной кишки на 4-5 см выше илеоцекального угла. Участок кишки помещался в раствор Кребса (состав в ммоль/л: NaCl 118,0; KCl 4,70; CaCl 2,52; MgSO4 1,64; NaHCO3 24,88; КH2PO4 1,18; глюкоза 5,55), где при постоянной аэрации отпрепарировались, получая препарат длиной 1,9-2,1 см.

Выделенные препараты закреплялись в ванночке объемом 10 мл (модель 4000, Ugo Basile S.R.L., Италия), где осуществлялась постоянная аэрация, а также поддерживалась стабильная температура 37°С. Адаптационный период составлял 30 минут. Регистрация данных производилась посредством изотонического датчика (Ugo Basile, Италия), соединнного с образцом, на самописце (модель 7050, Ugo BasileS.R.L., Италия). После регистрации исходных данных в ванночку добавлялся кетансерин и серотонин, далее записывались контрольные значения изменения мышечного тонуса. В опытном измерении предварительно вводилось изучаемое соединение и после серотониновых рецепторов. Все соединения изучались в концентрации 1 мкМ.

Отмывка препарата осуществлялась буферным раствором в течение 15 минут.

Степень блокирования рецепторов оценивалась путм сравнения значений спазмогенного эффекта в контрольном и опытном измерениях. В качестве препарата сравнения был выбран блокатор 5-НТ3-рецепторов - ондансетрон.

2.2.13 Методы изучения анальгетической активности Модель гиперальгезии, вызванной адъювантом Фрейнда.

Данный метод позволяет изучить обезболивающее действие изучаемого соединения в условиях гиперальгезии, формирующейся на фоне хронического воспаления [Iadarola M.J., 1988].

Исследование выполнено на 30 крысах, разделенных на 5 групп ( интактного контроля, 1 контрольную, 3 опытных) по 6 особей в каждой.

Для моделирования воспаления за 4 дня до эксперимента животным подкожно в вентролатеральную поверхность правой задней лапки вводился адъювант Фрейнда (взвесь БЦЖ в вазелиновом масле) в объеме 0,05 мл. Группе интактного контроля адъювант Фрейнда не вводился. В день исследования опытным группам внутрибрюшинно вводилось соединение РУ-476 0,5 мг/кг, ципрогептадин – 0,6 мг/кг, либо диклофенак натрия в дозе 2 мг/кг. Контрольная группа крыс получала физиологический раствор хлорида натрия. Через минут после введения препаратов определялся уровень гиперальгезии при точечном механическом давлении на тыльную поверхность лапы. Критерием достижения ноцицептивного порога, выражаемого в граммах, являлся рефлекс отдергивания лапы. Уровень анальгетического действия оценивали по изменению измеряемого показателя в опытных группах по сравнению с группой контроля.

Метод формалиновой гиперальгезии Данный тест позволяет определить возможность влияния веществ на острую боль, связанную с непосредственной активацией чувствительных волокон С/А (1 фаза), и последующую тоническую или воспалительную боль (2 фаза) [Dubuisson D., 1977].

Тестирование проводилось на 28 крысах, разделенных на 4 группы ( контрольную, 3 опытных) по 7 особей в каждой.

В день исследования опытным группам внутрибрюшинно вводилось соединение РУ-476 - в дозе 0,5 мг/кг, ципрогептадин – 0,6 мг/кг, либо диклофенак натрия в дозе 2 мг/кг. Контрольная группа крыс получала физиологический раствор хлорида натрия. Через 30 минут в вентролатеральную поверхность правой задней лапки подкожно инъецировалось 0,05 мл 0,5% раствора формалина и регистрировалась ответная реакция в виде вздрагивания лапки с 5-минутными интервалами в течение 60 минут. Число вздрагиваний в первые 10 минут отражает первую, острую фазу, а в период с 10 по 60 минуту – вторую, воспалительную фазу. Обезболивающий эффект соединений рассчитывали для каждой фазы отдельно по изменению количества ноцицептивных реакций в опытных группах в сравнении с группой контроля.

2.2.14 Изучение острой токсичности наиболее активных веществ Острую токсичность соединений изучали на 30 белых половозрелых внутрибрюшинном введении. За животными осуществлялся контроль в течение 14 дней, на протяжении которых регистрировались сроки гибели особей. Все исследования проводились в соответствии с требованиями и инструкциями Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития. На основании полученных результатов методом нелинейного регрессионного анализа рассчитывался токсикологический показатель - LD [Березовская И.В., 2010].

Для соединений - лидеров рассчитывался условный терапевтический индекс, отражающий широту терапевтического действия вещества, выраженный в отношении показателей летальной дозы (LD50) к эффективной концентрации (EC50).

2.2.15 Метод изучения нейротоксикологических эффектов соединения лидера нейротоксикологического действия. Изучение проводилось при использовании широкого набора тестов по S. Irwin [Irwin S., 1964]. Для исследования были отобраны 15 мышей - самцов, разделенных на 3 группы (1 контрольную, опытные). Исследуемое соединение вводилось внутрибрюшинно в дозах 5,0 и 0,5 мг/кг. Контрольная группа получала изотонический раствор хлорида натрия. Наблюдение за животными осуществлялось в течение 3 часов после непосредственного введения растворов. Перед введением у животных определялись исходные показатели в зависимости от проводимых тестов.

Изучаемые параметры повторно оценивались для каждого животного через каждые 30 минут после введения вещества.

Уровень влияния исследуемого соединения на организм животного оценивали при сравнении результатов всей батареи тестов между контрольной и опытной группами.

Изучаемые параметры были разделены на следующие группы:

настороженность, пугливость.

симптома Штрауба, характер походки, положение тела в обычной позе и после придания ему необычной позы, положение конечностей, общий мышечный тонус, болевая реакция.

Рефлексы (роговичный, слуховой, ипселатеральный/сгибательный).

экзофтальма, саливация, взъерошивание, частота дыхания.

Поведенческие реакции.

Для изучения возбудимости животного исследования проводились в установках "открытое поле" и актометре. В актометре определялась возбудимость по уровню двигательной активности. Тест "открытое поле", проводившийся в одноименной установке позволил оценить как уровень ориентировочно-исследовательского поведения, так и влияние на показатели эмоционального реагирования животных [Воронина Т.А., 2002]. Установка «открытое поле» представляла собой площадку диаметром 80 см с имеющимися 16 отверстиями в полу и разделенной на 25 квадратов с выделением центральной зоны поля, с освещенностью площадки 90 Лк.

экспериментатору. После помещения животного в установку регистрировался ряд показателей [Буреш Я., Бурешова О., 1991], общее время наблюдения за каждой мышью составляло 2 минуты.

Показатели отражали:

-двигательную активность - горизонтальную (число пересеченных квадратов) и вертикальную (число вставаний на задние лапки, независимо осуществлялся он с опором на стенку установки или самостоятельно);

-ориентировочно-исследовательскую активность, выражающуюся в количестве заглядываний в отверстия;

-эмоциональный фактор - число актов груминга, количество выходов в центральную зону, количество фекальных болюсов (эмоциональность).

Для оценки реактивности животное перемещалось на открытое пространство (стол) хвостом к экспериментатору, после чего фиксировалось время принятия решения, результатом которого становилось целенаправленное движение животного. Таким образом производилась оценка характера реакции на изменение окружающей обстановки.

Настороженность определялась ориентировочными рефлексами, так, в непосредственной близости производился громкий хлопок посредством звукового раздражителя.

Пугливость животных оценивалась при прикосновении корнцангом.

Нервно-мышечная возбудимость Тремор, судороги, характер походки, изменения положения тела и конечностей оценивались посредством визуального наблюдения за животным.

Болевая реакция регистрировалась с помощью наложения на основание хвоста зажима (фиксировалось время вокализации).

Общий тонус скелетных мышц оценивался при попытке отдергивания передней лапки после е захвата (животному подносился металлический стержень, за который мышь хваталась передними лапками, после чего фиксировался факт попытки удержать стержень при попытке отнять его).

Изучение влияния соединения на рефлексы Роговичный рефлекс фиксировался по реакции отдергивания головы при раздражении роговицы (по наличию, либо отсутствию реакции на раздражение).

Слуховой рефлекс оценивался по реакции отдергивания головы при раздражении слухового прохода (по наличию, либо отсутствию реакции на раздражение).

Ипселатеральный сгибательный рефлекс измерялся путм сдавливания лапы зажимом с постоянным уровнем компрессии, во время которого производилась оценка времени возникновения и силы реакции.

Частота дыхания определялась при подсчте числа дыхательных движений у бодрствующих животных в течение 1 минуты.

2.2.16 Методы статистической обработки данных При парном сравнении независимых данных использовались T-тест и тест Манна-Уитни, для анализа зависимых данных использовали тест Вилкоксона.

Достоверность величины IC50 оценивалась методом линейного регрессионного анализа. Для многопараметровых исследований статистическая обработка результатов проводилась с использованием теста Вилкоксона, критерия Краскела-Уолиса с постобработкой тестом Данна, либо с использованием однофакторного дисперсионного анализа и теста Ньюмана-Кеулса в случае нормального распределения данных. Результаты динамических наблюдений обсчитывались с помощью двухфакторного ANOVA метода. Обсчет реализован в программе GraphPad Prism 5.0 и «Microsoft Excel 2002».

ГЛАВА 3. Экспериментальный поиск соединений, блокирующих 5НТ2А-рецепторы, среди производных бензимидазола Одним из актуальных направлений поиска новых лекарственных средств для лечения различных патологических состояний тонуса сосудов, состояния тревоги и страха, участие в процессах болевой чувствительности считается разработка соединений с 5-НТ2А– серотонинергическим действием [Roth B. L., 2011]. В связи с этим особое внимание уделяется изучению уже существующих блокаторов 2А типа серотониновых рецепторов. Так, была показана возможность для некоторых антагонистов взаимодействовия с сайтом связывания, расположенным в третьем трансмембранном домене рецептора, где после присоединения к Asp (3.32) нейтрализовался катионный участок лиганда [Rashid M. et al., 2003].

В ряде предшествующих работ, проводившихся на базе кафедры фармакологии Волгоградского медицинского университета, были изучены различные производные бензимидазола, индола, триазола, бензимидазолия, имидазобензимидазола на проявление активности в отношении 2 типа серотониновых рецепторов [K.F. Suzdalev et al., 2013; A. A. Spasov et al., 2013;

Анисимова В.А. с соавт., 2010]. По результатам кластерного анализа ранее проведенных исследований был определен перспективный ряд соединений в отношении проявления высокого уровня серотоноблокирующего действия, относящийся к производным N9-замещенных имидазо[1,2-]бензимидазола [П.М. Васильев, 2013].

В связи с этим для поиска новых соединений с высоким уровнем 5-НТ2Аантагонистического действия был выбран ряд соединений производных N9имидазо[1,2-]бензимидазола, синтезированных в НИИ физической и органической химии Южного федерального университета.

3.1. Изучение 5-HT2А-антагонистических свойств производных N9имидазо [1,2-]бензимидазола на модели серотонин-индуцированной активации тромбоцитов Для всех исследовавшихся соединений был изучен уровень их 5-НТ2Аантагонистического действия. Всего в скриннинговом исследовании было протестировано 25 соединений (табл. 3.1), являющихся производными N9имидазо[1,2-]бензимидазола.

Все изученные соединения демонстрировали различный уровень влияния имидазобензимидазола блокировали серотонин индуцированную активацию тромбоцитов выше 50%. Четыре соединения не проявили активности в отношении изучаемого типа рецептора. Для исследуемых соединений не было отмечено серотонин позитивного эффекта. 16% из изучаемой группы оказали незначительное влияние на эффекты серотонина, так, блокирующие эффекты РУ-615 не превышали -20 %. Остальные соединения в большинстве своем проявили себя как умеренно активные с диапазоном антагонистической активности от -50 до -20 %. Вещества с умеренным уровнем активности можно было условно поделить на 2 группы, различия в уровнях активности внутри групп были незначительны. Производные бензимидазола под шифрами РУ-1332, РУ-85, РУ-276 и РУ-295 снижали эффекты серотонина на 25,7 – 27,1%. Вторая группа демонстрировала более выраженное антагонистическое действие, так, у РУ-213, РУ-275, РУ-693 и РУ-205 этот диапазон составил от до -36,1 %. Промежуточное положение занимали соединения РУ183, РУи РУ-374. Самый высокий показатель 5-НТ2А-блокирующего действия среди умеренно активных соединений был у РУ-36 и составил -47,4±7,21 %.

5-НТ2A-серотониноблокирующая активность N9-замещенные имидазо[1,2бензимидазолав концентрации 110-6М (М±m) N9-замещенные имидазо[1,2-]бензимидазола Примечание:

- статистически значимо различаются по отношению к контролю, тест Манна-Уитни (р 3,4диметоксифенил (РУ-183). Несколько менее активными оказались соединения с толилом (РУ-276) и 3 метоксифенилом (РУ-615) в качестве С2-заместителей.

Исследуемые соединения с пиперединоэтильным заместителем в N9 положении антисеротониновой активностью не имели, за исключением снижения циклическую структуру. Так, соединения РУ-526 и РУ-1331 имевшие Рис. 3.2. Влияние заместителей в С положении на уровень 5-НТ2А блокирующей активности (%) в производных имидазо[1,2-]бензимидазола, с диэтиламиноэтилом в N9 положении.

третбутильный и метильный радикалы уступали более, чем в 2 раза наиболее активному соединению из изученного ряда (РУ-205).

Морфолиноэтил замещенные по N9 положению, как и пиперединоэтил возможности снижать серотониновый ответ. Наиболее значимыми для морфолиноэтил замещенных оказались группы с наличием гидроксо группы (РУ-374 и РУ-295). В отличие от ранее рассмотренных рядов производных имидазобензимидазола для морфолиноэтил замещенных характерно более значимое влияние метильной группы в С2 положении в сравнении с другими радикалами (РУ-1332). Производные с иными заместителями не приводили к значимым эффектам (РУ-397, РУ-474 и РУ-710).

На втором этапе был проведен анализ математическим методом ФриУилсона, позволяющий оценить уровень вклада изучаемого радикала в 5-НТ2А блокирующий эффект молекулы2.

Согласно проведенным расчетам диэтиламиноэтильный радикал в N положении увеличивал антисеротониновую активность на 15,2%, в то время как морфолиноэтил оказывал негативное влияние на серотониновые эффекты соединений.

Среди изучаемых радикалов в С2 положении трет-бутил, фенил и метил ощутимо снижали эффекты производных имидазобензимидазола. Для 3метоксифенила, 3,4 - диметоксифенила, 4 - этоксифенила и 4 - метоксифенила был установлен значимый вклад в антисеротониновую активность. Так, 4этоксифенил повышал 5-НТ2А-блокирующий эффект соединений на 38,5%, а для 3-метоксифенила, 3,4 - диметоксифенила этот показатель составил 7,2% и 13,5% соответственно (рис. 3.3).

Выражаем признательность старшему научному сотруднику НИИ фармакологии д.б.н. П.М. Васильеву за помощь при изучении зависимости между структурой исследуемых соединений и их биологической активностью R=0,75 F(2,23)=29,56 p=1,56·10- 1) 3,4- диметоксифенил8) 2- тиенил 2) 4-этоксифенил9) фенил 3) 3,4-дигидроксифенил10) Трет-бутил 4) 4-метоксифенил11) метил 5) 3-метоксифенил12) диэтиламиноэтил 6) 4-гидроксифенил13) пиперединоэтил 7) толил14) морфолиноэтил Рис. 3.3. Зависимость вклада заместителей в N9и C2 положении на 5-HT2А антисеротониновую активность.

Среди всех радикалов наибольший вклад был у 4 метоксифенильного заместителя (РУ-476) и составлял -52,7%. Остальные радикалы оказывали незначительное влияние на уровень исследуемого вида активности.

3.4. Зависимость антисеротонинового эффекта изучаемых веществ от их физико-химических свойств При анализе стерических, липофильных и электронных параметров блокирующего действия химической структуры от различных физикохимических параметров.

Коэффициент корреляции между физико-химическими параметрами изученныхN9-замещенные имидазо[1,2-]бензимидазола с диэтиламиноэтильным радикалом в N9-положении и 5-НТ2А-антагонистической № Физико-химический параметр Средний заряд N9 с учетом знака 3. атомов бензольного кольца (с положении с учетом знака Для производных с пиперединоэтильным заместителем в N9-положении отмечена тенденция обратной корреляции между зарядом радикала в С положении и проявлением антисеротонинового действия (табл. 3.4).

Для изученных соединений, относящихся к производным N9 -имидазо[1,2бензимидазола с диэтиламиноэтильным заместителем в N9 положении, значимый вклад внесли заряды изучаемых структур. Наиболее значимые показатели имели обратную зависимость, исключение составил заряд радикала в С2 положении (табл. 3.3).

При анализе всех производных имидазобензимидазола наиболее значимым показателем стал средний заряд радикала в N9 положении, что подтверждает выводы, сделанные посредством эмпирического анализа, и коррелирует с результатами математического анализа структуры активности соединений.

Коэффициент корреляции между физико-химическими параметрами изученныхN9-замещенные имидазо[1,2-]бензимидазола с пиперединоэтильным радикалом в N9-положении и 5-НТ2А-антагонистической № Физико-химический параметр заряд у радикала в С2 положении заряд у радикала в С2 положении заряд у радикала в С2 положении положении с учетом знака минимальный отрицательный заряд радикала в С2 положении и суммарный заряд неводородных атомов бензольного кольца (с учетом знака), для которых коэффициент корреляции составлял 0,6 и -0,6 соответственно.

При изучении соединений по изменению радикала в N9 положении отмечалось резкое увеличение коэффициента корреляции липофильности в группе с морфолиноэтильным заместителем, что свидетельствует о существенном вкладе морфолиноэтила в изменение физико-химических характеристик соединений (табл. 3.5). Однако, как показали результаты экспериментальной части исследования, данный радикал в N9 положении негативно влиял на уровень серотониноблокирующей активности базовой структуры соединения.