«СИНТЕЗ КАРОТИНОИДОВ У ДРОЖЖЕЙ И ПЕРСПЕКТИВА ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ...»

1) образование первичного С5 – предшественника;

2) биосинтез бесцветных С40-соединений из С5 – предшественника;

3) образование каротиноидов путем дегидрирования фитоина, который превращается в ликопин через фитофлюин, -каротин и нейроспорин (эти полиены часто встречаются в следовых количествах у многих грибов и бактерий);

4) этап циклизации;

5) образование каротиноидов с числом углеродных атомов цепи больше С40 и ксантофиллов.

До настоящего времени нет единого мнения относительно пути образования каротиноидов дрожжами. По мнению одних авторов, образование пигментов происходит по следующей схеме:

-каротинторулинторулародин. Симпсон (SIMPSON et.al., 1964), изучавший каротиноиды Rhodotorula glutinis 48-23, считает, что возможны два пути образования каротиноидов дрожжами. В первом случае, красные дрожжи могут образовываться последовательно из -каротина. Согласно второму, общим предшественником каротиноидов является – каротин; красные пигменты – торулин и торулародин у Rhodotorula glutinis синтезируются, по – видимому, из -каротина (ЕРШОВ и др., 1992.). По данным Вечер с соавт. (1968), первым из окрашенных каротиноидов образуется -каротин и только после него начинает синтезироваться торулин, а затем торулародин. Авторы предполагают, что -каротин является предшественником торулина, а торулин – предшественником торулародина. У дрожжей, согласно SIMPSON (1972) превращение каротиноидов идет по схеме:

Рисунок 1. Путь биосинтеза каротиноидных пигментов у дрожжей К общим свойствам каротиноидов можно отнести их нерастворимость в воде и хорошую растворимость во многих органических растворителях: хлороформе, бензоле, гексане, петролейном эфире, четыреххлористом углероде и др. Гидроксилсодержащие каротиноиды лучше растворяются в спиртах (метанол, этанол) (BARNETT et. al., 1983).

Растворы каротиноидов в органических растворителях при спектрофотометрических исследованиях дают характерные полосы поглощения, в основном, в видимой области спектра, а стереоизомеры показывают их также и в ультрафиолетовой области. Это один из наиболее точных показателей, используемых при идентификации этих веществ (PATTERSON, 1971; BRITTON, 1990;).

Характерной является также особенность каротиноидов избирательно абсорбироваться на минеральных и некоторых органических абсорбентах, что позволяет разделять их при помощи методов хроматографирования (TAM i coaut., 1986;

БОЛОТОВ, 1998)). Для отдельных каротиноидов характерны некоторые специфические реакции, в том числе цветные. Следует учитывать, что каротиноиды в чистом виде характеризуются высокой лабильностью - они весьма чувствительны к воздействию солнечного света, кислорода воздуха, нагреванию, воздействию кислот и щелочей. Под воздействием этих неблагоприятных факторов они подвергаются окислению и разрушению. В то же время, входя в состав различных комплексов (например, протеиновых), они проявляют большую стабильность, чем в свободном состоянии (ВЕЧЕР и др., 1967; CUNIGHAM, 2001).

В настоящее время имеется обширная литература, посвященная проблеме каротиногенеза микроорганизмов (САССОН, 1987; БЕРКЕР, 1990). В живой клетке ход биосинтеза каротиноидов регулируется рядом внешних и внутренних факторов. К внешним факторам относятся, в первую очередь, свет и температура; к внутренним – обмен веществ. Количество каротиноидных пигментов, образующихся в клетках микроорганизмов, в большей степени зависит от видовой принадлежности. По данным Авчиевой и др. (АВЧИЕВА и др., 1998), комбинация торулародин – торулин для различных представителей рода Rhodotorula составляет 67-94% от суммы пигментов. У видов Rh. glutinis и Rh. flava среди пигментов много -каротина, соответственно 23,9 и 61,5 % от суммы (Биотехнология.., 1988). Большое влияние на рост клеток и синтез пигментов микроорганизмами оказывают физико-химические факторы среды: аэрация, температура, свет, реакция среды.

Влияние света. Впервые влияние света на пигментообразование дрожжей было отмечено Лоддером. Он наблюдал, что Rhodotorula в темноте образует мало пигмента и выглядит слабо розовой, а на свету эта культура имела интенсивный розовый цвет. В дальнейшем Праус и Дир показали, что свет ускоряет биосинтез каротиноидов у Rhodotorula gracilis в стадии роста. В более поздних работах Праус отметил, что под влиянием света увеличивается доля каротинов и их антиокислительная активность по сравнению с торулином (Каротинсинтезирующие др.., 1980). В стадии жирообразования освещение увеличивает относительное содержание - и – каротинов (ЕРШОВ и др., 1992). Исследователями отмечено, что яркий свет угнетает пигментообразование дрожжей, слабый – иногда стимулирует его. Интенсивность освещения оказывает влияние на качественный состав каротиноидов. Темновая культура содержит больше – каротина (до 30 % от суммы пигментов) и мало торулародина (около 4 %). На свету соотношение обратное: – каротин составляет 10%, а торулародин – 21%, от общего содержания каротиноидов (ДОКУТОВИЧ и др., 1995). В ряде исследований показано, что для усиления синтеза каротиноидов достаточно кратковременного воздействия светом на определенной стадии развития микроорганизмами; при этом достигали такого же эффекта, как и в результате непрерывного освещения культуры на протяжении всего процесса ферментации (PILAR et.al., 1995; QIU HONG-DUON et. al., 2001). Ученые предполагают, что свет активирует соединения, которые используются как предшественники полиеновой природы или как катализаторы, которые после активации дегидрируют предшественники. Показано, что организмы одного и того же вида поразному реагируют на свет: у одних он вызывает угнетение каротиногенеза, у других – его стимуляцию (АВЧИЕВ и др., 2004).

Влияние аэрации. Аэрация является одним из важнейших факторов в регулировании образования таких продуктов метаболизма дрожжей, как каротиноиды (ХИГГИНС, 1988;

ПРИЩЕП, 2000; ДЕНИСЕНКО, 2000). Исследования влияния аэрации среды на процесс каротиногенеза у дрожжей Rhodotorula glutinis показали, что концентрация кислорода в среде оказывала заметное влияние на количественное содержание каротиноидных пигментов в биомассе дрожжей. Наиболее активный синтез каротиноидов у дрожжей наблюдался при аэрации 7,0 л/л/мин (280мкг каротиноидов на 1г сухих дрожжей). При этом суммарное количество – каротина и торулародина, обладающих А-витаминной активностью, составляло свыше 70% от общего количества пигментов (SANDMAN, 2001).

Кислород оказывает положительное влияние на рост дрожжей Phafia rhodozyma и стимулирует биосинтез каротиноидов (ДЕНИСЕНКО, 2000).

Влияние температуры. Температура, как одно из важных условий для регулирования роста микроорганизмов, оказывает влияние не только на скорость размножения клетки, но и на скорость биосинтетических процессов в ней, а в итоге – на состав синтезируемых продуктов (Каротинсинтезирующие др.., 1980; БРИТТОН, 1980;

ФЕОФИЛОВА и др., 2001; ФЕОФИЛОВА и др., 2003). Литературные данные о влиянии температуры на каротиногенез, в основном, сводятся к тому, что каротиноидный состав у дрожжей остается неизменным в довольно широких пределах колебаний температуры (CHEN, 1999). У Rhodotorula sanniei, например, каротинообразование происходит в интервале температур от 14 до 28 °С, а у Rh. rubra и Phycomyces blakesleanus - в интервале от 5 до 25 °С. В большинстве случаев колебания температуры вызывают лишь количественные изменения в синтезе микроорганизмами (ЗАЛАШКО, 1991). Однако у некоторых микроорганизмов наблюдается и качественное изменение каротиноидного комплекса. Так, при низких температурах (5°С) в культуре Rh. glutinis наблюдается высокое содержание – и - каротинов – 92-96% от общей суммы при 25°С – и каротины составляют только 43-47 % от всех пигментов. При значительном повышении температуры с 5 до 25°С и достаточной аэрации значительно усиливается синтез торулина и торулародина (FRENGOVA et. al., 1994).

Влияние состава питательной среды. Процесс биосинтеза каротиноидов очень лабилен и в большой степени зависит от состава питательной среды и свойств микробной клетки (РАЗУМОВСКИЙ и др., 1975; ДЕБАБОВ, 1988; ДЕНИСЕНКО, 2000). Для синтеза каротиноидов важное значение имеет источник углеродного питания (ВАСИЛЬЧЕНКО, 1992; QIU HANG-DUON et al., 2001).

Подробные исследования по выявлению лучших источников углерода для каротиногенеза дрожжей были проведены в Чехословакии с культурой Rhodotorula gracilis и в Германии с культурой Rh. rubra (SANDMAN, 2001). Лучшее развитие и образование пигментов у Rhodotorula gracilis наблюдалось на средах с глюкозой, фруктозой, сахарозой, ксилозой (Каротинсинтезирующие др.., 1980; BARRETO et. al., 2002). По данным Виттманн, культура Rhodotorula хорошо развивалась и образовывала больше пигментов, когда источником углеродного питания были глюкоза, фруктоза, тростниковый сахар и глицерин. На среде с тростниковым сахаром образовывалось больше - каротина (в два раза), хотя дрожжи развивались хуже (SANDU, 1997).

Влияние состава питательных сред с различными источниками углерода на содержание каротиноидов дрожжей Phaffia rhodozyma было изучено Подопригора (ПОДОПРИГОРА и др., 1996), который в качестве источников углерода использовал экстракты растительных шротов: яблочного, виноградного, томатного, кукурузного. Было определено, что наличие данных экстрактов способствовало увеличению синтеза каротиноидных пигментов на 40-65% (БАЛХАНТ и др., 1991).

Фанг с соавторами изучали влияние глюкозы и пептона, в качестве источников углерода и азота для выращивания штамма Phaffia rhodozyma и синтеза каротиноидов (FANG et al., 1996). Ими был установлен стимулирующий эффект глюкозы в диапазоне концентраций от 1,5 до 3,5%, который обеспечивает увеличение выхода астаксантина до 1454 мкг/г сухой биомассы (SCHOROEDER, JONSON E.A.,1993).

Источники азота также оказывают существенное влияние на каротиногенез микроорганизмов. Избыток в среде азота подавляет пигментообразование (АТАМАНЮК и др., 1971). Отсутствие азота в момент активного размножения клеток изменяет направление обмена веществ, переключая его с синтеза белковых соединений на образование безазотистых веществ, какими являются, в частности, каротиноиды (YOUNG et. al., 2001).

Влияние различных источников азота на каротиногенез дрожжей Rhodotorula представлено в исследованиях таких авторов, как Атаманюк (1970), Ими были испытаны различные азотистые вещества - серин, валин, лизин, триптофан, метионин, глутаминовая кислота, мочевина, гликокол, гистидин и азотнокислый аммоний. Наиболее благоприятным для образования пигментов оказался азотнокислый аммоний и аминокислоты треонин и лейцин (РАЗУМОВСКИЙ и др., 1975).

Для процесса каротиногенеза важное значение имеет соотношение в среде углерода к азоту, что было установлено еще Шопфером в опытах с культурами Phycomyces blakesleanus (COODWIN,1980). Более подробное изучение проведено с Rhodotorula gracilis. Были испытаны различные среды с соотношениями углерод/азот – 10:1, 20:1, 40:1, 80:1, 160:1 и среда без азота. В качестве источника углерода использовались глюкоза, в качестве азота – фосфорнокислый аммоний. Оптимальным соотношением углерода к азоту для каротиногенеза является 40:1. При таком соотношении лучше усваивается глюкоза (BRAMELY, 1992).

Влияние биологически активных веществ и химических реагентов на синтез каротиноидов. – ионон стимулирует синтез каротиноидов Phycomyces blakesleanus, если он добавляется, когда компоненты среды не полностью израсходованы грибом (ПРИЩЕП и др., 2000). В этом случае биосинтез – каротина увеличивается в 2-4 раза.

Однако меченный – ионон не включался в – каротин. Он оказывал каталитическое действие на ранние этапы синтеза изопреноидов (ФЕОФИЛОВА, 1994).

Опыты, проведенные с культурой гриба Blakeskea trispora, показали, что действие – ионона на данную культуру зависит от состава среды. В питательной среде без масла – ионон сильно ингибирует рост гриба (ВАСИЛЬЧЕНКО и др., 1992). В питательной среде с глюкозой и маслом – ионон, внесенный в концентрации 0,1% через 24 часа после начала ферментации, существенно улучшает рост мицелия и повышает содержание каротина.

Для интенсификации процесса каротинообразования у Spirulina platensis Мельников и соавт. (1997) предлагают использовать в питательной среде ацетат натрия, что позволит увеличить выход каротиноидов на 100-170% (МЕЛЬНИКОВ, 1997).

Васильченко и соавт. изучали действие растительных масел на каротиногенез Blakeslea trispora. Показано, что замена кукурузного масла на смесь масел, обеспечивающую оптимальный жирнокислотный состав, приводит к увеличению – каротина на 30% (ВАСИЛЬЧЕНОКО, 1992).

Атаманюк и соавт. исследовали действие подсолнечного, камфорного, кедрового масел на каротинообразование дрожжей Rhodotorula gracilis K-1. Выявлено, что значительный стимулирующий эффект на синтез каротиноидов в биомассе оказывает подсолнечное масло (РАЗУМОВСКИЙ и др., 1975).

В качестве стимуляторов каротиногенеза используют также триспоровые кислоты, соединения, содержащие – иононовое кольцо (ретинол, – ионон) и фенилпроизводные (диметилфталат, вератрол) (CERADO-OLMEDO, 1989). Стимулирующим свойством обладает цитрусовая пульпа или цитрусовое масло, дрожжевые экстракты (QIU HANGDUAON, 2001; ФЕОФИЛОВА, 1994). Мукоровый гриб Blakeslea trispora является сверхсинтетиком -каротина, причем роль индуктора выполняют триспоровые кислоты (ТСК). В свою очередь, ТСК образуются из -каротина (enternet: http//www.biolab. com).

Аминокислоты также усиливают образование каротиноидных пигментов. Показано, что на среде с недостатком глюкозы, которой едва хватает для развития гриба Phycomyces, добавление лейцина и валина стимулировало образование пигментов в 4 раза (Godwin 1972). По данным, которые представили Разумовский П.Н. и Атаманюк Д.И.

(1975) аминокислоты, добавленные в синтетическую среду вместо сернокислого аммония или других источников азота, повышали выход биомассы и синтез каротиноидов (РАЗУМОВСКИЙ и др., 1975; CHEN et. al., 1999).

Чешскими и белорусскими учеными изучалось действие ряда кислот трикарбонового цикла на каротиногенез микроорганизмов. Было показано, что лимонная и яблочная кислоты оказались самыми эффективными. Они увеличивали образование каротиноидов у Spirulina platensis в 1,5 раза (PRIGGOTT et. al., 1994; МАНАНКИНА и др., 1997).

В последние годы особое внимание уделяется вопросам использования незаменимых химических элементов для управления ростом и метаболизмом микробных культур (УПИТИС, 1983; ФЕДОРОВИЧ, 1989; ДЕДЮХИНА, 1992; RUDIC. a., 1997). Известно, что отдельные виды микроорганизмов характеризуются различной потребностью в химических элементах для роста и биосинтеза вторичных метаболитов (RUDIC. a., 2000.;

ROTARU. a., 2001). Каротиногенез стимулируется у некоторых микроорганизмов ионами Fe+ и Mn+ (ФЕДОРОВИЧ, 2000; RUDIC. a., 2003), координационные соединения магния стимулируют биосинтез – каротина у зеленой водоросли Haematococcus pluvialis (РУДИК, 1993; RUDIC. a., 1999; RUDIC, 2000; RUDIC. a., 2000;

RUDIC. a., 2001, RUDIC. a., 2003).

При внесении в питательную среду различных доз микроэлементов Са и Mg было установлено, что отсутствие Са в среде угнетающе действовало на рост дрожжей Rhodotorula glutinis, а его добавление стимулировало накопление биомассы и увеличивало количество синтезируемых каротиноидов (ЗАЛАШКО, 1991; WALKER, 1998).

Итак, дальнейшее развитие биотехнологии включает разработку эффективных методов, направленных на повышение выхода биомассы микроорганизмов с высоким содержанием каротиноидов.

3. Биологические функции и область применения каротиноидов Большое разнообразие каротиноидов в растительном, животном и микробном мире и то, что на протяжении всей эволюции растения производят, а животные и человек поглощают каротиноиды, содержащиеся в продуктах их ежедневного рациона, модифицируют и аккумулируют их специфическим образом, неизбежно возникает вопрос об их функциональном назначении (NEAMU, 1986; КАРНАУХОВ, 1993; CANIZARES – VALLANUEVA, 1998). Хотя многие аспекты физиологических функций каротиноидов остаются невыясненными до конца, можно с уверенностью утверждать, что они играют важную роль в различных физиологических процессах, без которых жизнь в существующей форме была бы невозможна. Для растений фундаментальное значение имеет функция каротиноидов, связанная с процессом фотосинтеза, который стал основой всей жизни на земле, когда геохимические источники энергии на нашей планете были исчерпаны (после глобального энергетического кризиса, произошедшего на нашей планете около 5 миллиардов лет назад). Растения абсорбируют энергию солнечного света и благодаря этому синтезируют из углекислого газа и воды органические вещества, которые и являются основой как животной, так и человеческой пищевой цепи. В процессе фотосинтеза производится кислород, образующий кислородную атмосферу, в которой большинство органических молекул могли быстро разрушаться, если бы не были защищены от подобных побочных эффектов этого процесса (также как и от других неблагоприятных факторов). В предотвращении негативных проявлений этих процессов (например, индуцирование энергии и защита органических молекул от разрушения окислением) ключевая роль принадлежит каротиноидам ( МЕЦЛЕР, 1986; SANDMAN, 2001). Как светопоглотители, каротиноиды разделяют с хлорофиллом ключевую роль в энергетическом метаболизме высших растений. Поглощая свет, они трансформируют захваченную световую энергию в реакционные центры пигментов, где она преобразуется в электрическую, а затем и в химическую в форме АТФ, которая уже пригодна для синтеза различных соединений. Не менее важна мембраностабилизирующая функция каротиноидов, что значимо для жизни в кислородной атмосфере (SCHOROEDER et al., 1993; YOUNG et al., 2001).

Каротиноиды вовлекаются в различные защитные механизмы:

благодаря наличию сопряженных двойных связей, могут связывать синглетный кислород и ингибируют образование свободных радикалов, предупреждая их негативное действие на организм;

обеспечивают защиту от ультрафиолетового излучения, так как могут трансформировать энергию УФ-света в видимый свет, что проявляется в явлении флуоресценции (например свечение пыльцы некоторых цветковых растений, спор грибов и водорослей и т. д.);

выступают в роли антиоксидантов, защищая чувствительные ткани и лабильные соединения от окисления.

Одна из важнейших функций каротиноидов — А-провитаминная активность.

Животные и человек не способны синтезировать витамин А, который является незаменимым для зрения, роста, репродукции для защиты от различных бактериальных и грибковых заболеваний и нормального функционирования кожи и слизистых. Витамин А не образуется в растительных тканях и может быть получен только путем преобразования провитамин-А активных каротиноидов (прежде всего, -каротина, а также -каротина, криптоксантина, 3,4-дигидро--каротина, астаксантина, кантаксантина и др.) (БУКИН, 1991; ГОМБОЕВА и др., 1998). Представляет интерес влияние каротиноидов на эндокринную систему, особенно это касается полового развития и созревания, оплодотворения, прохождения репродуктивных процессов (ХРАПОВА, 1982; БУКИН, 1991). Одной из важнейших функций каротиноидов — это способность образовывать комплексы с протеинами. Известно, что маленькие молекулы (аллостерические эффекторы) изменяют агрегационное состояние протеинов, тем самым, стабилизируя их протеиновую и ферментную активность. Эта способность также обуславливает изменение проницаемости мембран. Установлена иммуностимулирующая роль каротиноидов.

Например, обнаружено, что рыбы с высоким содержанием каротиноидов в организме были значительно более устойчивы к инфекционным и грибковым заболеваниям; цыплята — устойчивы к энцефалопатии и т. д. (ШЕЛЕПОВА, 1992; JYONOUCHI et. al., 1995).

Каротиноиды увеличивают цитостатическую активность клеток-киллеров, замедляют рост опухоли и ускоряют ранозаживление. Каротиноиды проявляют аппетитстимулирующую активность (и физиологически, и этиологически). Весьма важной, проявляющейся внешне, функцией каротиноидов является их способность обеспечивать яркую окраску организмов, которая может выполнять сигнальную функцию.

Перечень основных установленных функций каротиноидов вспомогательный антенный пигмент Проводники энергии света Оказывают влияние на работу эндокринной системы

Защита от неблагоприятных факторов внешней среды Мембраностабилизирующая функция Мембраностабилизирующая функция Сигнальная функция В зависимости от природы каротиноидов, их получают путем синтетического и микробного синтеза, экстрагируют из растительных источников и водорослей (RUDIC.a., 1990; RUDIC. a., 2001). Из всех известных каротиноидов промышленным способом получают – каротин, ликопин, кантаксантин, этил – – апо- 8 – каротиноат, – апо – – каротиналь (ФЕОФИЛОВА, 1994). Главный каротиноид, который получают в больших количествах – это – каротин. Его получают путем химического синтеза две фирмы «Hoffman – La Roshe» (США) и «BASF» (Германия). В настоящее время начато «Уралбиофарм» (Россия) (ФЕОФИЛОВА, 1994; www.uralbiopharm.ru). Биологическая роль витамина А, а следовательно и бета-каротина, общеизвестна. Входя в состав сетчатки глаза, он в виде родопсина участвует в акте зрения, при недостатке его развивается "Куриная слепота" (человек плохо видит в сумерки) (ХРАПОВА, 1982; КАРНАУХОВ, 1993; ГОМБОЕВА и др., 1998). Весь мировой опыт однозначно свидетельствует, что в современных условиях обеспечить человека оптимальным количеством витаминов за счет потребления обычных продуктов нереально. Необходимо создать продукты, обогащенные витаминными и биологически активными добавками. К наиболее перспективным пищевым добавкам относятся каротины (БУКИН, 1997). Из одной молекулы -каротина в организме образуется 2 молекулы провитамина А. Каротин, как и витамин А, относится к незаменимым витаминам и должен поступать в организм человека и животных постоянно (RUDIC i coaut., 1995; ГОМБОЕВА и др., 1998). Витамин А крайне необходим для нормального состояния кожи и слизистых оболочек глаза, бронхов и желудка. Недостаток его ведет к воспалению верхних дыхательных путей и желудка и провоцирует возникновение катарам, бронхитов, гастритов и язв. Роговица глаза становится сухой, воспаляется и изъязвляется. Кожные покровы становятся грубыми, неэластичными (СЕРГИЕНКО, 2001).

До недавнего времени каротин и каротиноиды использовали, главным образом, как пищевую добавку (краситель), а не с целью повышения витаминной ценности продуктов (БУКИН, 1991; ЧИБИЛЯЕВ, 1998; www.tereza.ru). Однако исследования последних лет установили самостоятельные функции каротина. Он повышает защитные силы организма против вредного действия радиационного облучения, образования злокачественных опухолей (имеет так называемые радио - и канцерогенные свойства) (RUDIC, 1995;

БУКИН, 1997; BLACK, 1998). Доказано, что каротин понижает риск возникновения сердечно-сосудистых и желудочно-кишечных заболеваний (FORTES, 1998; YONG, 2001).

В последние годы становится все более популярно применение каротинсодержащей продукции в различных областях пищевой промышленности, таких как масложировая (производство маргарина, масла коровьего, жиров, майонеза); молочная (производство мороженого); хлебобулочная и макаронная (производство булок, батонов, макарон, рожек, лапши, чипсов); кондитерская (производство печенья, конфет) и сыроваренная (производство сыра) (БЕРКЕР, 1990; CUNNIGHAM, 2001). Основными принципами использования каротиноидов в производстве являются улучшение цвета продукта, если цветонасыщение недостаточно и не отвечает ожиданиям потребителя, стандартизация цвета и внешнего вида продуктов питания, например, компенсация сезонного цвета таких продуктов как масло и сыр; восстановление цвета, утерянного в процессе производства;

придание бесцветному продукту соответствующий цвет и витаминизация продуктов питания (VLSUTEAN, 1998; ДЕНИСОВ, 1999; http://www.iaci.ru). Полезные свойства каротинов заключаются в том, что эти вещества предупреждают развитие онкологических заболеваний, согласно данным Национального ракового Института США, повышают иммунитет ко многим другим заболеваниям, являясь антиоксидантами, предотвращают процессы старения в организме, являясь сильными радиопротекторами, способствуют выводу тяжелых металлов из организма (ШЕЛЕПОВА, 1992; БУКИН,1997;

www.uralbiopharm.ru). -каротин - это витамин роста и его постоянное потребление будет увеличивать рост последующих поколений. Каротинсодержащие препараты способствуют улучшению зрения, широко используются при лечении ожогов, язв, для лечения больных в послеоперационном и постклимактерическом периоде, согласно исследованиям Клиники лечебного питания Института питания РАМН, используются при лечении колитов, геморроя, язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки (ФОМИНА,1998; ДЕЕВ, 2004).

Использование каротинсодержащей продукции в парфюмерно-косметической промышленности. В настоящее время выпускаются жирорастворимые формы микробиологических каротинов, что позволяет широко использовать их в парфюмернокосметической промышленности (YOUNG et al., 2001). -каротин является мощным антиоксидантом, обеспечивающим в организме прерывание цепных свободнорадикальных реакций, защиту макромолекул и биомембран клеток от повреждений, являясь серьезным фактором повышения резистентности организма к различным патогенным воздействиям, в том числе к новообразованиям (www.medi.ru). -каротин усиливает регенерацию многослойного эпителия, что позволяет его использовать в дерматологии, гинекологии, при лечении заболеваний, связанных с поражением эпителия. При накожном применении бета-каротин не только влияет на обменные процессы в самой коже, но и усваивается через кожу, оказывая благоприятное воздействие на организм в целом. Введение каротина в зубные пасты, крема, помады, шампуни, краску для волос позволяет предупредить старение кожи, устранить морщины, раздражение, зуд, смягчить кожу, уменьшить ее сухость, способствовать заживлению царапин, трещин, улучшить внешний вид кожи и ее общее состояние (www.vitmarket.ua).

Использование каротинсодержащей продукции в животноводстве.

Систематические исследования, проведенные на крупном рогатом скоте, подтвердили теорию, согласно которой -каротин является жизненно важным веществом и в некоторых функциях не может быть заменен витамином А у животных, не получающих -каротин в достаточном количестве (КОЛЬЦОВА и др., 1984; ГОМБОЕВА, 1998). В результате наблюдаются нарушения функций организма, впоследствии приводящих к повреждениям всех соответствующих органов. В результате этого, воспроизводительная способность животного ухудшается (КАЛУНЯНЦ, 1980). Открытию -каротина, как незаменимого биокатализатора плодовитости, предшествовал ряд интересных наблюдений. Давно известно, что животные во время летнего выпаса получают большое количество каротина, тогда как в зимний период у них наблюдается его недостаток. Результаты многочисленных экспериментов, проведенных в полевых условиях во многих странах мира доказывают, что -каротин оказывает положительное воздействие на плодовитость крупного рогатого скота, при условии, что ухудшение плодовитости не обусловлено другими грубыми недостатками в кормлении и содержании (ПЕТРУНЯКА, 1979;

www.biolab.angelcities.com). Иными словами, -каротин может быть эффективным только сельскохозяйственных животных (http://vitamarket.com.ua).

Использование каротинсодержащей продукции в аквакультуре. Каротиноиды являются веществами, которые входят в состав животных организмов. В мире животных, благодаря каротиноидам, появляется окраска у рыб и других представителей морской фауны (СОИН, 1975; МИКУЛИН, 1993). В настоящее время каротиноиды выпускаются фирмой BASF в виде 10 %-ного сухого порошка в мелких гранулах. Это означает, что активный ингредиент, каротиноид, заключен в оболочку и защищен микрокапсулой.

Микрокапсулы растворяются в пищеварительном тракте рыб, после чего каротиноид абсорбируется и поступает в ткани – мишени, в которых проявляется эффект пигментации. Для обеспечения эффективной пигментации рыб используются продукты кантаксантин и астаксантин, как отдельно, так и в составе смесей (www.uniagro.ru;

ЧЕРНЯЕВ, 1988). Использование данных препаратов способствует усилению сопротивляемости организма рыб к различным заболеваниям, повышает способность к оплодотворению и подавляет мутации (КАРНАУХОВ, 1988). Для сохранения выживаемости и интенсификации роста личинок рыб, широкое распространение находят дрожжи, входящие в состав стартовых кормов для рыб (CADAR, 1990; МИКУЛИН, 2000).

Таким образом, библиографический анализ показал, что среди микроорганизмов, обладающих способностью к биосинтезу каротиноидов можно выделить красные дрожжи Sporobolomyces, Phaffia, Rhodosposporidium, Cryptococcus, Sporidiobolus, Sterigmatomyces и Rhodotorula, которые способны продуцировать биомассу с высоким содержанием каротиноидов. Дальнейшее развитие биотехнологии должно заключаться в разработке эффективных методов получения микробной биомассы с высоким содержанием каротиноидных пигментов путем использования различных физических и химических факторов. Следовательно, остаются актуальными проблемы разработки новых способов получения каротиноидов микробиологическим путем и усовершенствование применяемых методов. Высокая биологическая ценность каротиноидов, получаемых микробиологическим путем, обеспечила их широкое применение в различных областях пищевой, парфюмерно-косметической промышленности, а также в животноводстве и аквакультуре в качестве биодобавок и каротинсодержащих препаратов. Необходимость поиска высокопродуктивных штаммов дрожжей, способных синтезировать высокое количество каротиноидов показала важность изучения особенностей каротиногенеза у дрожжей под влиянием различных факторов, разработки различных способов направленного синтеза каротиноидов и биотехнологии получения новых препаратов на базе дрожжевых каротиноидов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Предметом исследований служили 14 штаммов дрожжей рода Rhodotorula и Sporobolomyces из рабочей коллекции лаборатории «Микробные продукты» и Национальной Коллекции Непатогенных Микроорганизмов: Rhodotorula gracilis CNMNYS-02, Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03, Sporobolomyces pararoseus CNMN-YS-01, Rhodotorula rubra CNMN-YS-09, Rhodotorula mucilaginosa CNMN-YS-10 и штаммы Rhodotorula gracilis CNMN-YS-I/3, Rhodotorula gracilis CNMN-YS-I/4-04, Rhodotorula gracilis CNMN-YS-II/6, Rhodotorula gracilis CNMN-YS-II/9, Rhodotorula gracilis CNMN-YS - II/15, Rhodotorula gracilis CNMN-YS-V/12, Rhodotorula gracilis CNMN-YS-IV/14, Rhodotorula gracilis CNMN-YS-II/5-05, Rhodotorula gracilis CNMN-YS-III/20-06, полученные после -излучения культуры Rhodotorula gracilis CNMN-YS-02.

2.2 Питательные среды для культивирования каротинсинтезирующих дрожжей использованы питательные среды:

1. Питательная среда на пивном сусле (LODDER, KREEGER VAN RIJ, 1952):

Размешивается 1 кг солодовой муки с 2,6 л водопроводной воды при постоянном перемешивании в течение 3 часов при температуре 45°С, затем температуру поднимают до 63°С, продолжая перемешивание еще 1 час. После фильтрации смесь стерилизуют минут при 120°С (1 bar), повторно фильтруют и разбавляют до 15° Blg (определяют по сахарометру). Достигается значение рН до 5,4.

Для получения агаризованного пивного сусла в жидкую среду добавляется 2% агара и смесь стерилизуют при 110°С (1/2 bar)в течение 15 минут.

2. Среда Лундина (КВАСНИКОВ, 1986) следующего состава (г/л): (NH4)2SO4KH2PO4-1.0; NaCl- 0.5; MgSО4•7H2O-1.0; FeCl3•7H2O - следы; Сахароза – 40.0; Вода водопроводная 1л; рН = 5,5.

3. Среда синтетическая – MS-1 (г/л) (КВАСНИКОВ, 1986): (NH4)2SO4-5.0;

KH2PO4-1.0; MgSО4•7H2O-0.5; CaCl2•2H2O-0.1; NaCl-0.1; Глюкоза-40.0; Вода водопроводная 1л; рН = 5,5.

4. Питательная среда MZ - 30 (г/л) (MD 1328 ): Глицерин – 40.0; Меласса – 20.0; KH2PO4 – 1.0; NaCl – 0.5, MgSO4•7H2O-0,5; CaCl2 – 1.0; Fe2SО4•7H2O- 0, (следы); Вода водопроводная 1л; рН = 5,5 (USATI, 2002).

2.3. Биостимуляторы, индукторы и координационные соединения металлов Для повышения биосинтетического потенциала дрожжей были использованы:

Нетрадиционные источники питания - экстракты растительных шротов агропромышленного производства – виноградный, томатный, яблочный.

Способ получения экстракта из отходов агропромышленного производства:

80,0-100,0 г сухого шрота разбавляется 1 литром водопроводной воды, стерилизуется текучим паром (3 этапа). Экстракт фильтруют и определяют содержание общего сахара.

Индукторы - растительные масла: подсолнечное, соевое, кукурузное, оливковое и ретинол.

Предшественники -ацетат натрия (NaCH3COO), ацетат цинка ([Zn(CH3COO)2 4Н2О)]) и лимонная кислота (С6Н8О7).

Координационные соединения переходных металлов – [Zn(Gly)Dl-Ser)], [Zn(Dl-Ala)(LSer)], предоставленные др. хим. наук

Л. Чапуриной, Интситут Химии АНМ и [Fe2NiO(CCl3COO)6(CH3OH)3], [Fe2Mn(CCl3COO)6(CH3OH)3], синтезированные сотрудниками Института Химии АНМ, под руководством академика К. Турта, институт Химии АНМ.

Термостат ТС-80М-2 (Россия);

Автоклав (ГК/100/3);

Спектрофотометр SF -26;

Аминокислотный анализатор ААА-339 «Microtehnica» (Чехия);

Центрифуга – MPW -310 (Польша);

Весы «ВТ -500»;

Аналитические весы – ВЛР – 200;

Качалка – КВ-357;

Роторный испаритель.

В ходе исследований были использованы:

- углеводы: глюкоза, сахароза, мальтоза, инозит, маннит, лактоза, рамноза, арабиноза, галактоза, ксилоза и глицерин;

- соли: (NH4)2SO4; KH2PO4; MgSO4 7H2O; FeSO4 6H2O; CaCl2; NaCl,,Cu SO4; KMnO4;

- химические реагенты: петролейный эфир, гексан, ацетон, соляная кислота, диэтиловый эфир, хлороформ, спирт, безводный сернокислый натрий, окись алюминия (III и IV степени по Брокману).

Морфокультуральные и физиологические свойства штамма Rhodotorula специализированной литературе (БАБЬЕВА, ГОЛУБЕВ, 1979; KREGER – Аминокислотный состав идентифицировали на анализаторе ААА- «Microtehnica» (Чехия) классическим методом (Новые методы анализа аминокислот, 1974). Исследования проводились совместно с сотрудниками Центра Метрологии и Автоматизации научных исследований Академии Наук Количественное определение сахаров по Бертрану (Большой практикум по Определение содержания внутриклеточных липидов по методу Bligh и Dyer Методы исследования каротиноидных пигментов а) Экстракция пигментов:

- микробная биомасса доводится до концентрации 10мг/мл дистиллированной водой;

- клетки дрожжей разрушаются методом гидролиза 1N HCl в течении 15 минут на водяной бане при температуре 90°С;

- экстракция пигментов проводится на основании модифицированного метода Петерсона (PETERSON et al., 1958; Каротинсинтезирующие дрожжи, 1980).

б) Колоночная хроматография, на окиси алюминия III и IV степени по Брокману (ВАКУЛОВА Л.А., КУЗНЕЦОВА А.И., 1964, TMA, NEAMU, 1986; ТЕРЕШИНА В.М., 1994).

в) Идентификация каротиноидных пигментов производится на основании спектров поглощения света каротиноидами (TMA, NEAMU, 1986; БРИТТОН, 1986;

ТЕРЕШИНА, 1994).

Определение количества хроматографически очищенных пигментов:

Где: С - содержание каротиноидов, мкг/г А.С.В.;

D - оптическая плотность раствора по максимуму поглощения;

V - объем элюата, мл;

E - коэффициент экстинкции соответствующего пигмента;

Р - навеска сухой биомассы, взятой на экстракцию, г.

г) Определение содержания каротиноидов в смеси (без предварительного разделения) (Вечер, Куликова, 1980):

1. Определение концентрации каротиноидов (мкг/мл):

Где: С1- концентрация -каротина, мкг/мл;

С2-концентрация торулина, мкг/мл;

D450 - оптическая плотность раствора при 450 нм;

D509- оптическая плотность раствора при 507 нм;

D537- оптическая плотность раствора при 450 нм;

2. Определение количества каротиноидов (мкг/г А.С.В.):

Где: А - количество каротиноидов (мкг/г А.С.В.);

С - концентрация каротиноидов, мкг/мл, по максимуму поглощения;

V – объем элюата, мл;

m - навеска сухой биомассы, взятой на экстракцию, г.

Определение содержания цинка в биомассе дрожжей Используется спектрофотометрический метод (пат. MD 1701, 2001) определения цинка, состоящий из следующих этапов:

1. разделение, разрушение и кислотный гидролиз биомассы.

2. отделение, экстракция и определение цинка.

3. обработка результатов:

Расчет количества цинк (мг %) производится на основе уравнения:

Где: А Zn - оптическая плотность дитизоната цинка при длине волны 538 нм;

Аэкстракт – оптическая плотность экстракта при длине волны 538 нм;

Аэкстракт - оптическая плотность экстракта при длине волны 620 нм.

К - константа, представляющая собой отношение между оптической плотностью при 538 нм 620 нм для чистого дитизона.

33,3 – коэффициент пересчета содержания цинка.

m – масса пробы, взятой для определения, г.

Количественное определение гликогена В пробирки наливают по 0,5 мл раствора, содержащего 20 -200 мкг гликогена (испытуемая проба) и 50, 100 и 200 мкг глюкозы (для построения стандартной кривой).

Для контроля на реактивы в две пробирки наливают по 0,5 мл воды. Во все пробирки приливают по 5 мл антронового реактива. Добавление реактива следует проводить быстро, так, чтобы струя реактива попадала в центр проб. Для этого используют пипетку с широким носиком. Смесь немедленно тщательно перемешивают и помещают на 10- минут в водяную баню комнатной температуры, а затем переносят в кипящую водяную баню на 15 мнут. По окончании нагревания пробирки быстро охлаждают в проточной воде и оставляют в теплом месте на 30 минут. Окрашенные растворы колориметрируют на фотоэлектроколориметре с красным фильтром (620 нм) в кювете толщиной 0,5 см.

Количество глюкозы в испытуемых пробах с гликогеном рассчитывают по стандартной кривой, которую строят для каждой серии определений. Для пересчета на содержание гликогена, полученное количество глюкозы умножают на 0,9 (молекулярная масса глюкозы в гликогене равна 162,1, глюкозы С6Н12О6 – 180,1; 162,1:180,1 = 0,8999, или 0,9) (ГИЛБЕРТ и др., 1967; КОНРАД, 1975).

При изучении влияния факторов на рост и биосинтез каротиноидов дрожжей каждый опыт проводился в 3-х повторностях и 3-х параллельных определениях. Для финального результата был проведен статистический анализ результатов (ДОСПЕХОВ, 1985).

Оптимизация питательной среды для культивирования дрожжей была проведена в соответствии с математической матрицей планирования эксперимента (МАКСИМОВ, 1980).

СКРИНИНГ ДРОЖЖЕЙ, ОБЛАДАЮЩИХ ПОВЫШЕННОЙ

СПОСОБНОСТЬЮ К БИОСИНТЕЗУ КАРОТИНОИДНЫХ

ПИГМЕНТОВ

ДЕНИСОВ, 2000). Из ряда гемотрофных микроорганизмов, как продуцентов каротиноидов, можно выделить дрожжи рода Rhodotorula, Cryptococcus, Rhodosporidium, Phaffia, Sporobolomyces (GOODWIN, 1980; CERDA-OLMEDO, 1989; ФЕОФИЛОВА, 1994;

АВЧИЕВА, 2000).

Практически все каротиноиды представляют собой или тетратерпены, т.е. С40соединения, углеродный скелет которых построен из восьми С5-изопреновых фрагментов, или их производные. Основная структура молекулы симметрична и состоит из двух С20половин, примером такого соединения может служить ликопин – красный пигмент томатов. Основная структура иногда бывает модифицирована: на одном или обоих концах молекулы может присутствовать шестичленное (или иногда пятичленное) кольцо, как например у -каротина, который рассматривается как «прародитель» для всей группы каротиноидов (Каротинсинтезирующие.., 1980; БЕРРИ,1985; BRITTON, 1990).

Каротиноидные углеводороды известны под названием каротинов. Все их производные с кислородсодержащими функциональными группами именуются ксантофиллами. В каротиноидах обнаруживается большинство обычных групп, например, гидрокси-, метокси-, эпокси-, кето-, альдегидная и карбоксильная группы; при этом соответствующие группы могут быть этерифицированны или гликолизированы. У микроорганизмов каротиноиды сопровождаются, обычно, бесцветными алифатическими полиенами - фитоином и фитофлюином (ANHILD et. al., 1995; КИРИЛЛОВА и др.,1996).

За последние десять лет, благодаря интенсивному и комплексному использованию новейших методов исследования (газожидкостная хроматография, спектроскопия поглощения видимого света, количественный анализ, спектрофотометрический анализ, рамановская спектроскопия, линейный и круговой дихроизм), наблюдается значительный прогресс в химии каротиноидов, судить о котором можно по следующему примеру: в 1946 г. было известно около 70 каротиноидов, из которых для 30-40 была установлена определенная структура, а в настоящее время число известных нам каротиноидов достигло 500, из них досконально изучено около 300 (JENSEN, 1970; BANWELL, 1972;

CAREY, 1978; БРИТТОН, 1986; ФЕОФИЛОВА, 1994).

Выделение, в последние годы, из природных источников большого числа каротиноидов объясняется не только применением новых методов, но и тем, что объектами исследования стали микроорганизмы, у которых были идентифицированы чрезвычайно интересные по химическому строению каротиноиды. Микроорганизмы представляют удобный объект исследования, так как обладают способностью быстро накапливать на простых синтетических средах большое количество биомассы, богатой этими пигментами (GOODWIN, 1980; BABIEVA, 1991; CHATTOPODHYA, 1997). Особое внимание и повышенный интерес проявляется к группе каротиноидов, обладающих способностью образовывать витамин А (http://www.cnshb.ru/vinntei/index.htm). К их числу относятся -, -, -каротины и также ксантофиллы (торулародин и ликопин), часто встречающиеся у микроорганизмов. Среди микроорганизмов, как потенциальных источников каротиноидных пигментов, можно выделить дрожжи, которые обладают рядом ценных в производственном отношении свойств: высокой способностью к размножению на многих углеродсодержащих субстратах, неприхотливостью к минеральному питанию, ограниченными потребностями в физиологически активных веществах, способностью к размножению при низких значениях рН и, следовательно, культивировании, а также крупноклеточной структурой, позволяющей легко отделять их от культуральной жидкости (ДЕБАБОВ, 1988; Промышленная микроб.., 1989; CALO et.

al., 1995).

Несмотря на множество исследований по селекции, проблема продуцентов каротиноидов продолжает до настоящего времени привлекать внимание специалистов. В данном контексте получение новых данных о количественной и качественной характеристике биосинтеза каротиноидных пигментов у дрожжей открывает новые возможности для современной биотехнологии.

Исходя из выше изложенного, целью проводимых исследований является изучение качественного состава каротиноидов дрожжей и отбор штаммов, обладающих способностью к повышенному синтезу каротиноидов.

3.1. Продуктивность и содержание общего количества каротиноидов в Известно, что скорость роста и количество продуцируемой биомассы определяется физиологическими особенностями штамма и условиями культивирования. Данные микроорганизмов (БАБЬЕВА, 1971). Исходя из выше сказанного, перед нами была поставлена задача исследовать продуктивность, количественный и качественный состав каротиноидов у 14 штаммов дрожжей, принадлежащих к роду Rhodotorula и роду Sporobolomyces из рабочей коллекции лаборатории „Produi microbieni” Института Микробиологии АНМ и хранящиеся в Национальной Коллекции Непатогенных Микроорганизмов.

Выращивание дрожжей осуществляли на пивном сусле, в условиях периодического культивирования в 1-литровых колбах Эрленмейра на качалке (180 об/мин) в течение суток при 26С, освещении 12-15 тыс эрг/см. Для инокуляции использовали 3-суточную культуру, выращенную на пивном сусле. В результате исследований было установлено, что способность пигментных дрожжей продуцировать биомассу зависит от видовой принадлежности штамма (рис.3.1).

Rhodotorula gracilis-CNMN-YS-III/20- Rhodotorula gracilis CNMN-YS-II/ Rhodotorula gracilis-CNMN-YS-II/5- Rhodotorula gracilis-CNMN-YSIV/ Rhodotorula gracilis-CNMN-YSV/ Rhodotorula gracilis-CNMN-YS-II/ Rhodotorula gracilis-CNMN-YS-II/ Rhodotorula gracilis-CNMN-YS-II/4- Rhodotorula gracilis CNMN-YS-II/ Rhodotorula mucilaginosa-CNMN-YS- Rhodotorula rubra-CNMN-YS- Sporobolomyces paroroseus CNMN-YS- Rhodotorula gracilis-CNMN-YS- Rhodotorula gracilis-CNMN-YS- Рисунок 3. 1. Продуктивность дрожжей рода Rhodotorula и рода Sporobolomyces Согласно представленным результатов, способностью накапливать клеточную массу в наибольших количествах обладают штаммы дрожжей Rhodotorula gracilis CNMNYS-02, Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03, Rhodotorula mucilaginosa CNMN-YS-10, Sporobolomyces parаroseus CNMN-YS-01, Rhodotorula rubra CNMN-YS-09 и Rhodotorula gracilis CNMN-YS-I/3, количество продуцируемой биомассы при этом варьирует от 8, до 12,57 г/л сухих веществ. Следует отметить, что большим потенциалом к активному росту обладают культуры Rhodotorula mucilaginosa CNMN-YS-10 и Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03, которые накапливают сухую биомассу в количестве 11,73 и 12,57 г/л, соответственно.

Параллельно была исследована способность дрожжей к каротинообразованию. В результате проведенных экспериментов установлено, что суммарное количество каротиноидов в биомассе варьирует от рода и вида исследуемых штаммов (рис.3.2).

CNMN-YS-09 и Rhodotorula mucilaginosa CNMN-YS-10 синтезируют наименьшее соответственно).

Rhodotorula gracilis-CNMN-YS-III/20- Rhodotorula gracilis CNMN-YS-II/ Rhodotorula gracilis-CNMN-YS-II/5- Rhodotorula gracilis-CNMN-YSIV/ Rhodotorula gracilis-CNMN-YSV/ Rhodotorula gracilis-CNMN-YS-II/ Rhodotorula gracilis-CNMN-YS-II/ Rhodotorula gracilis-CNMN-YS-II/4- Rhodotorula gracilis CNMN-YS-II/ Rhodotorula mucilaginosa-CNMN-YS- Rhodotorula rubra-CNMN-YS- Sporobolomyces paroroseus CNMN-YS- Rhodotorula gracilis-CNMN-YS- Rhodotorula gracilis-CNMN-YS- Рисунок 3.2. Содержание каротиноидов в биомассе дрожжей рода Rhodotorula и рода Следует отметить, что в результате исследований была установлена самая высокая способность к каротинообразованию у культур Rhodotorula gracilis CNMN-YS-02 и Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03, которые на пивном сусле (6 Blg) синтезируют в среднем 659,26 и 703,42 мкг/г с.в. соответственно.

Эти данные свидетельствуют о том, что штаммы пигментных дрожжей, хранящиеся в Национальной Коллекции Непатогенных Микроорганизмов Академии Наук Молдовы, не уступают, а в некоторых случаях и превосходят по каротинообразующей способности другие известные штаммы дрожжей, о чем свидетельствуют литературные данные. Так, согласно исследованиям Кириллова Л.М. и Зайченко А.М., культура Rhodotorula glutinis синтезирует в среднем 700-720,65 мкг/г сухого вещества общего количества каротиноидов (КИРИЛЛОВА и др., 1996), штамм дрожжей Phaffia rhodozyma синтезирует, в среднем, 489,52 мкг/г пигментов (ПОДОПРИГОРА, 1996).

3.2. Качественный состав каротиноидных пигментов дрожжей рода Каротиноидные пигменты являются полиенами, которые имеют хромофор, представляющий собой систему сопряженных двойных связей, отвечающую за поглощение видимого света. В большинстве случаев в их образовании участвует сопряженная или ароматическая -электронная система, в которой присутствуют добавочные электрон-донорные или электрон-акцепторные группы. Разделение зарядов, характерное для молекул этого типа, вносит значительный вклад в общую резонансную структуру, что приводит к высокой степени стабилизации, особенно в возбужденном состоянии (Пигменты, 1971; BRITTON et al. 1981; BRITTON, 1990). Природные пигменты поглощают видимый свет в видимом диапазоне (380 - 750 нм) спектра электромагнитного излучения. Поэтому спектр поглощения видимого света имеет по крайней мере один максимум поглощения при длине волны (мах характерной для хромофора молекулы пигмента. Это свойство, а также общая картина спектра дают полную информацию о молекулярной структуре и обычно используются при первых попытках идентифицировать пигмент. Положение мах сильно зависит от используемого растворителя, а у некоторых групп пигментов и от величины рН ( ФЕОФИЛОВА, 1978; TAMA i coaut., 1986; CHEN, 1999).

Спектры поглощения света чрезвычайно ценны также для точного, чувствительного и воспроизводимого качественного анализа пигментов. Интенсивность полосы поглощения при какой-либо длине волны регистрируют экспериментально, как адсорбцию, экстинкцию, поглощение или оптическую плотность раствора. Она прямо пропорциональна как концентрации пигмента в растворе, так и расстоянию, проходимому светом через раствор (законы Ламберта- Бэра) (CAREY, 1978; NEAMU, 1983; БРИТТОН, 1986).

Исходя из того, что одним из главных показателей при идентификации и самой важной характеристикой пигментов является его спектр адсорбции, был изучен качественный состав каротиноидного комплекса биомассы дрожжей рода Rhodotorula и Sporobolomyces.

В результате спектрофотометрического анализа каротиноидных пигментов дрожжей были получены спектральные кривые, которые служили основой для их идентификации, согласно общепринятым методам (TMA.a., 1986; БРИТТОН, 1986;

ТЕРЕШИНА, 1994).

Как показали исследования, штаммы дрожжей, относящиеся к роду Rhodotorula и роду Sporobolomyces, синтезируют пигмент с характерной оранжевой окраской. Путем использования метода спектрофотомерии, была получена спектральная кривая изучаемого каротиноида, максимальное поглощение которого, как видно на рисунке 3.3.-3.9 (кривая 1) приходится на мах = 450 нм, что соответствует, согласно литературным данным, каротину (TMA. a., 1986).

Штаммам дрожжей Rhodotorula gracilis CNMN-YS-02 (рис.3.3 (а)), Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03 (рис.3.8 (б)), Rhodotorula gracilis CNMN-YS-I/3 (рис.3.3 (б)), Rhodotorula gracilis CNMN-YS-I/4-04 (рис.3.5(б)), Rhodotorula gracilis CNMN-YS-V/ CNMN-YS-II/5-05 (рис.3.6(а)), Sporobolomyces parаroseus CNMN-YS-01 (рис. 3.8(а)) и Rhodotorula mucilаginosa CNMN-YS-10 (рис.3.9 (а)) свойственна способность к синтезу пигмента желтого цвета. Исследование пигмента в видимом диапазоне волн показало, что максимум его поглощения сдвигается в более длинноволновую область, по сравнению со спектром -каротина, и составляет 462 нм (кривая 2). Полученные результаты свидетельствуют о том, что данный пигмент является -каротином.

Спектр поглощения света каротиноида с характерным ярко-розовым цветом, как показали исследования, присущ всем видам исследуемых штаммов дрожжей (рис.3.3-3.9, кривая 3). Полученные спектральные кривые имели четко выраженный максимум поглощения света в видимом диапазоне при мах = 480 нм, соответствующий торулину– (3’, 4’-дегидро – -каротин), молекула которого содержит одно кольцо -ионона, одно дегидро--ионное и 13 сопряженных двойных связей и, согласно литературе, обладает только лишь наполовину А-провитаминной активностью ( Каротинсинтезирующие.., 1980; BRITTON, 1990).

Рисунок 3.3. Спектральные характеристики каротиноидных пигментов дрожжей Rhodotorula gracilis – CNMN-YS-02 (а) и Rhodotorula gracilis – CNMN-YS-I/3 (б) Рисунок 3.4. Cпектральные характеристики каротиноидных пигментов дрожжей Rhodotorula gracilis CNMN-YS-II/6 (а) и Rhodotorula gracilis CNMN-YS-II/9 (б) Рисунок 3.5. Cпектральные характеристики каротиноидных пигментов дрожжей Rhodotorula gracilis CNMN-YS-III/20 (а) и Rhodotorula gracilis CNMN-YS-II/4 -04 (б) Рисунок 3.7. Cпектральные характеристики каротиноидных пигментов дрожжей Rhodotorula gracilis CNMN-YS-IV/14 (а) и Rhodotorula gracilis CNMN-YS-IV/15 (б) Рисунок 3.8. Cпектральные характеристики каротиноидных пигментов дрожжей Sporobolomyces pararoseus CNMN-YS-01 (а) и Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03 (б) Рисунок 3.9. Спектральные характеристики каротиноидных пигментов дрожжей Rhodotorula mucilаginosa CNMN-YS-10 (а) и Rhodotorula rubra CNMN-YS-09 (б) Следует отметить, что только культуры дрожжей Rhodotorula gracilis CNMN-YS- (рис. 3.3 (а)), Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03 (рис.3.8 (б)) и Rhodotorula mucilаginosaCNMN-YS-10 (рис. 3.9 (а)) из исследуемых нами штаммов обладают способностью к биосинтезу пигмента кирпичного цвета. На основании спектрофотометрического исследования была получена спектральная кривая пигмента в диапазоне волн от 350 до нм. Анализ спектра поглощения света показал, что данный каротиноид максимально поглощает свет в диапазоне волн от 450 до 470 нм. Отсутствие четкого пика каротиноидного спектра не позволило идентифицировать пигмент, вследствие чего он был назван пигментом Х (кривая 4).

Типичным для всех изучаемых штаммов каротинсинтезирующих дрожжей (рис.3.3-3.9), согласно проведенным исследованиям, является каротиноид суриковокрасного цвета. При определении спектра поглощения света данного каротиноида был зафиксирован максимум, который приходится на 507нм, что соответствует, согласно литературным данным, торулародину (3’4’ – дегидро –, – каротин – 16’ – карбоновая кислота) (кривая 5) (TAMA, NEAMU, 1986).

Для определения содержания каротиноидов в природных объектах метод колоночной хроматографии имеет существенный недостаток: в процессе определения каротиноидов происходит частичное окисление полиенов при снятии с поверхности хроматограммы тонкого слоя сорбента и элюации с него каротиноидов. Поэтому целесообразным представляется количественный анализ содержания каротиноидов, характерных для всех видов дрожжей Rhodotorula и Sporobolomyces (-каротин, торулин и торулародин) в их смесях спектрофотометрическим способом.

В результате определения содержания каротиноидов в биомассе дрожжей (табл.

3.1) было установлено, что -каротин - главный пигмент дрожжей, в наибольших количествах синтезируется дрожжами Rhodotorula gracilis-CNMN-YS-03 и Rhodotorula gracilis-CNMN-YS-II/9. Количество каротиноида в клеточной массе при этом составило 237,03 и 162,56 мкг/г с.в. соответственно.

Анализ данных, представленных в таблице 3.1 показал, что содержание торулина у штаммов дрожжей Rhodotorula gracilis CNMN-YS-02 и Rhodotorula gracilis-CNMN-YS- составляет 247,22 и 226,98 мкг/г сухих веществ соответственно. Эти же культуры синтезируют в самых больших количествах и торулародин (252,32 и 239,41 мкг/г с.в.

соответственно).

Таким образом, в результате проведенных исследований была получена полная информация о способности дрожжей рода Rhodotorula и Sporobolomyces из рабочей коллекции лаборатории «Produi microbieni» и Национальной Коллекции Непатогенных Микроорганизмов продуцировать биомассу с повышенным содержанием таких основных каротиноидных пигментов, как -каротин, -каротин, торулин и торулародин.

Содержание каротиноидных пигментов в дрожжах рода Rhodotorula и Rhodotorula gracilis CNMN-YS-02 158,82±5,15 247,22±0,88 253,22±1, Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03 237,03±1,59 226,98±2,14 239,41±0, Rhodotorula mucilаginosa CNMN-YS-10 64,27±0,56 59,69±0,77 68,66±0, Rhodotorula gracilis CNMN-YS-I/3 107,79±1,23 108,39±1,07 107,97±1, Rhodotorula gracilis CNMN-YS-I/4-04 74,69±1,17 139,00±0,62 151,79±1, Rhodotorula gracilis CNMN-YS-II/6 121,57±1,48 216,69±2,28 198,41±0, Rhodotorula gracilis CNMN-YS-II/9 162,56±1,34 139,54±0,51 143,68±1, Rhodotorula gracilis CNMN-YS - II/15 126,39±2,09 152,06±1,08 127,75±1, Rhodotorula gracilis CNMN-YS-V/12 113,74±0,86 108,55±0,84 119,11±0, Rhodotorula gracilis CNMN-YS-IV/14 113,18±1,46 149,55±0,60 161,35±0, Rhodotorula gracilis CNMN-YS-II/5-05 147,09±1,93 146,49±0,43 152,89±0, Rhodotorula gracilis CNMN-YS-III/20-06 130,96±1,95 136,71±1,77 154,49±0, Sporobolomyces pararoseus CNMN-YS-01 114,987±1,23 82,478±0,87 81,046±0, Изучение качественного состава каротиноидного комплекса дрожжей показало, что изучаемым штаммам дрожжей, в зависимости от их видовой принадлежности, свойственна способность к биосинтезу цветных каротиноидов - -каротина, -каротина, торулина, торулародина и пигмента Х. Характерным для всех штаммов является наличие в каротиноидном комплексе пигментов -каротина, торулина и торулародина.

Для дальнейших исследований по изучению направленного синтеза каротиноидов выбран штамм Rhodotorula gracilis-CNMN-YS-03, характеризующийся высокой способностью к продуцированию биомассы (12,57 г/л с.в.) и синтезом каротиноидов (до 703,42 мкг/г с.в.), который позволяет получить как - каротин, торулин, торулародин, так и -каротин и пигмент Х.

ВЛИЯНИЕ НЕТРАДИЦИОННЫХ ИСТОЧНИКОВ ПИТАНИЯ,

ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ, ИНДУКТОРОВ И МЕТАЛЛОКОМПЛЕКСОВ

НА ПРОДУКТИВНОСТЬ И БИОСИНТЕЗ КАРОТИНОИДОВ У

ДРОЖЖЕЙ

На направленность метаболических процессов особое влияние оказывают различные источники питания и энергии, а также введение в питательную среду различных предшественников биосинтеза, незаменимых химических элементов, витаминов и стимуляторов (RUDIC. a., 2001; АВЧИЕВ и др., 2004).

Синтез полезных для человека продуктов часто является вынужденным для микроорганизма. В природе эти способности могут не требоваться для роста и выживания.

Знание физиологии, биохимии и генетики продуцента помогает управлять желаемым биосинтезом и вынуждать микроорганизмы вести этот процесс в необходимом направлении (CANIZARES-VILLANUEVA et al., 1989; РУДИК, 1990; Микробная биотех.., 2000).

Для каждого направленного процесса микроорганизм должен быть приведен в соответствующее физиологическое состояние. Это значит, что его энергетические и конструктивные процессы должны быть настроены определенным образом. Подбираются оптимальные условия, как для роста, так и для биосинтеза продукта. Найдя приемлемые условия методами физиологии, можно далее улучшить процесс, зная биохимические пути биосинтеза продукта. (ФЕОФИЛОВА, 1974; БРИТТОН, 1986; BRAMLEY et. al., 1992).

Живые микроорганизмы подобны кибернетическим машинам, направленных на создание условий внутри их самих, необходимых для того, чтобы жизненные процессы могли безостановочно протекать, и чтобы шло самовоспроизведение живой системы.

Микроорганизмы обладают совершенными механизмами для постройки метаболизма в запрограммированном направлении к росту и увеличению биомассы без существенных изменений свойств. Если же условия не подходят для роста, то микроорганизмы обладают в высшей степени развитой способностью для ведения тех синтезов, которые допускают условия среды. Эти синтезы могут быть совершено не связанными с ростом и являться вторичным метаболизмом (BARNETT et. al., 1983; Промышленная микробиол..,1989;

ЗАЛАШКО, 1991; ВАСИЛЬЧЕНКО, 1994).

В зависимости от условий среды, изменяются метаболические процессы в клетке. На состояние клеток исключительно влияет химический состав среды и особенно концентрации питательных веществ, находящихся в относительном минимуме (RUDIC i alt., 200; QIU HONG – DUON et. al., 2001). Условия для многих синтезов, то есть физиологическое состояние для их протекания можно предсказывать на основании выявленных закономерностей, оптимизацией микробиологических процессов, состоящей из следующих этапов: 1) изучение динамики роста, биосинтеза продуктов, потребления субстратов в периодических культурах; 2) выявление лимитирующего рост фактора среды, недостаток которого депрессирует сверхсинтез целевого продукта; 3) подбор синтетической среды, обеспечивающей рост биомассы и последующий биосинтез продукта, каждый компонент продукта которого физиологически обоснован; 4) подбор практически доступной среды, на которой сверхсинтез экономичен (РАБОТНОВА, 1986; SANDMAN, 2001).

Знание зависимости между конкретными условиями среды с теми или иными сторонами жизнедеятельности клеток микроорганизмов позволяет регулировать рост, развитие и биосинтез необходимых веществ. Отсюда, поддерживая необходимые условия, можно в известной мере управлять ходом ферментативных процессов, накапливать биомассу и отдельные продукты метаболизма с заданными свойствами (FANG et. al., 1996;

ДЕНИСЕНКО, 2000).

В современной биотехнологии придается большое значение управляемому синтезу биологически активных веществ микроорганизмами (БЕРКЕР, 1990). В настоящее время научные исследования, направленные на изучение условий управляемого синтеза биологически активных веществ дрожжами, являются актуальными и перспективными.

Очевидна целесообразность поиска таких добавок к питательным средам, которые при производственном культивировании дрожжей увеличили бы выход биомассы и продуктов метаболизма одновременно.

эффективность использования нетрадиционных источников питания, индукторов, ([Fe2NiO(CCl3COO)6(CH3OH)3] и [Fe2Mn(CCl3COO)6(CH3OH)3]) для оптимизации питательных сред и разработка эффективных способов направленного синтеза -каротина, торулина и торулародина у дрожжей.

4.1. Влияние нетрадиционных источников питания на продуктивность и биосинтез каротиноидов дрожжами Rhodotorula gracilis CNMN - YS- Одним из главных факторов для активной жизнедеятельности дрожжей является присутствие в питательной среде доступных источников энергии, которыми являются углеводы. Выяснение первых метаболических путей (ферментации глюкозы в этанол и СО2), проделанных дрожжами, согласно литературным данным, являлось моделью для всех последующих исследований промежуточного метаболизма живых организмов (МЕЦЛЕР, 1986; ДЕБАБОВ,1988; CHEN et.al., 1999).

Известно, что ферментативное использование источников углерода дрожжами является их общей характеристикой. Все дрожжи способны к ферментации глюкозы, при этом интенсивность ферментации пропорциональна числу клеток и их физиологическому возрасту. Наличие витаминов в среде культивирования дрожжей также влияет на ход ферментации (IACOB, 1991).

По данным литературы, наибольшая часть стоимости производства биомассы приходится на сырье. Поиск эффективных дешевых источников сырья, с одной стороны, и эффективных путей утилизации отходов различных производств, с другой стороны, определяет целесообразность использования этих отходов и вторичных продуктов, как источников энергии и вещества для получения биомассы и каротиноидов (БАЛХАНТ и др., 1991; BARRETO, 2002).

Следует отметить важность изучения возможности использования отходов пищевой промышленности, богатых источниками углерода и, в свою очередь, создание экономных и эффективных питательных сред для культивирования дрожжей рода Rhodotorula – потенциальных источников каротиноидов.

Поэтому в наших исследованиях, в качестве нетрадиционных источников питания, были использованы экстракты виноградных, яблочных и томатных выжимок, являющиеся в Молдове вторичным сырьем агропромышленного комплекса.

Согласно литературным данным и нашим исследованиям, количество сахаров в экстрактах варьирует от 10 до 43 мг/мл. Самое высокое содержание сахаров – 43 мг/мл содержится в виноградном экстракте, в томатном экстракте - 10 мг/мл и яблочном экстракте – 33 мг/мл. Помимо сахаров, экстракты растительных шротов, согласно литературным данным, богаты витаминами РР и Е. Так, в яблочных отходах содержатся витамины группы РР (до 1,6%) и витамины Е (50 мг%); в виноградных выжимках витамина РР (3 мг%) и витамин Е (40 мг%). В томатных выжимках содержится витамина Е 89 мг%, каротиноидных пигментов – 18,5 мг% (ЩЕРБАКОВ, 1991).

В исследованиях за основу была взята питательная среда MZ-30, следующего состава (г/л): глицерин – 20.0; меласса – 20.0; KH2PO4 – 1.0; NaCl – 0.5, MgSO4•7H2O-0,5; CaCl2 – 1.0; Fe2SО4•7H2O- 0, 00003 (следы); экстракт растительных шротов до 1 л; рН 5,5. Инокулят дрожжей рода Rhodotorula вводился в среду культивирования в количестве 3-5%.

Культивирование проводилось при температуре +25-27C на качалке 180-200 об/мин, рН – 5,5-6,5, освещение 12-15 тыс. эрг/см2.

Первоначальной задачей было выяснение влияния присутствующих в составе среды культивирования экстрактов растительных выжимок на продуктивность и процесс каротинообразования штамма дрожжей Rhodotorula gracilis CNMN-YS -03.

Результаты проведенных исследований показали, что процесс аккумуляции клеточной массы дрожжей зависит от вида экстракта, присутствующего в среде культивирования дрожжей (табл. 4.1).

Влияние нетрадиционных источников питания на продуктивность и содержание каротиноидов у дрожжей Rhodotorula gracilis CNMN-YS - Варианты питательных сред MZ 30+экстракт виноградных 11,13±0,22 145,47 684,99±12,71 155,29 7624,22±73,93 225, выжимок MZ-30+экстракт томатных 15,63±0,11 204,27 624,14±4,47 141,49 9755,31±68,25 289, выжимок MZ-30+экстракт яблочных 12,34±0,36 161,27 549,45±17,72 124,56 6780,28±60,85 200, выжимок Данные, представленные в таблице, свидетельствуют о том, что рост дрожжей происходит активно на всех исследуемых вариантах сред, количество биомассы при этом увеличивается по сравнению с контролем на 45 - 104%. Отметим, что культивирование штамма Rhodotorula gracilis CNMN-YS - 03 на питательных средах, содержащих экстракт яблочных и томатных выжимок, способствует увеличению выхода клеточной массы дрожжей до 12,34 и 15,63 г/л соответственно, что на 64,27 и 104,27% больше контрольного значения. Наибольшая продуктивность биомассы, согласно представленным результатам, отмечена при добавлении к питательной среде экстракта томатных выжимок (15,63 г/л).

Изучение влияния экстрактов растительных шротов на процесс каротиногенеза дрожжей показало, что присутствие последних в питательной среде оказывает положительное действие на накопление пигментов в биомассе. Так, добавление в среду экстракта виноградных выжимок позволило увеличить количество каротиноидов в биомассе на 55,29 %, что составляет 684,99 мкг/г сухих веществ. Следует отметить, что процесс пигментообразования дрожжами усиливался и при внесении в питательную среду экстракта томатных и яблочных выжимок - на 41,49 и 24,56 %, соответственно, по сравнению с контролем. Было выявлено, что при культивировании штамма дрожжей Rhodotorula gracilis CNMN-YS - 03 на питательной среде, содержащей экстракт томатных выжимок, количество пигментов доходит до 9755,31 мкг/л, что в 2,8 раза больше контрольного значения.

Стимулирующий эффект экстракта томатных выжимок объясним, вероятно, не только содержанием сахаров, которые являются дополнительным источником энергии, необходимой для активной жизнедеятельности дрожжей, но и наличием в его составе микроэлементов и витаминов.

Характер влияния экстрактов растительных шротов на качественный состав пигментов дрожжей имеет ряд особенностей. На рисунке 4.1 представлены результаты изучения влияния экстрактов растительных шротов на биосинтез –каротина, торулина и торулародина.

Так, согласно результатам, представленным на рисунке 4.1(а), видно, что биосинтез – каротина дрожжами Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03 активизируется при культивировании на питательных средах, содержащих любой из исследуемых экстрактов растительных шротов. Содержание – каротина в клетках дрожжей при этом увеличивается на 21 - 27% по сравнению с контролем. Следует отметить, что максимальный стимулирующий эффект достигается при культивировании пигментных дрожжей на питательной среде с экстрактом томатных выжимок: количество – каротина составляет в данном варианте опыта 224, мкг/г с.в., или на 27 % больше по сравнению с контролем.

Рисунок 4.1. Влияние нетрадиционных источников питания на содержание -каротина (а), торулина (б) и торулародина (в) в биомассе дрожжей Анализ влияния экстрактов растительных шротов на биосинтез одного из представителей красной группы пигментов – торулина (3’, 4’-дегидро – -каротин) показал, что данный процесс также зависит от вида экстракта добавляемого в питательную среду для выжимок способствует увеличению количества торулина в клетках дрожжей на 20%, экстракта томатных выжимок - на 47 %, по отношению к контролю, а наличие в среде экстракта виноградных выжимок - увеличению выхода данного пигмента из 1 г сухой биомассы на 102%, что составляет 315,69 мкг/г сухих веществ.

Биосинтез торулародина, согласно результатам проведенных исследований, происходил активно на всех питательных средах, в состав которых входили экстракты растительных шротов. Однако, наилучшие результаты были получены при культивировании штамма дрожжей Rhodotorula gracilis CNMN-YS–03 на питательной среде с экстрактом томатных выжимок: выход торулародина увеличивался на 49% и составил 163,97 мкг/ г с.в.

(рис. 4.1 (в)).

Таким образом, проведенные исследования показали, что отходы агропромышленного производства - экстракты яблочных, виноградных и томатных выжимок - представляют практический интерес, как дополнительные компоненты питательных сред для культивирования пигментных дрожжей. Использование экстракта томатных выжимок в качестве компонента питательных сред для выращивания пигментных дрожжей позволяет увеличить выход биомассы и каротиноидов в 2,5 раза.

4.2. Влияние предшественников на продуктивность и биосинтез каротиноидов дрожжами Rhodotorula gracilis CNMN-YS - В современной биотехнологии очевидна целесообразность поиска таких добавок к питательным средам, которые позволят одновременно регулировать рост и синтез отдельных компонентов клетки дрожжей. Зная биохимические пути биосинтеза того или иного продукта, можно значительно улучшить процесс биосинтеза путем добавления в питательную среду для выращивания микроорганизмов предшественников получаемого продукта, ингибиторов или стимуляторов отдельных звеньев данного процесса ( БИРЮКОВ, 1985; ФЕОФИЛОВА, 1994).

Согласно современным представлениям, биосинтез каротиноидов может быть разбит на несколько стадий: образование С20 – промежуточного продукта геранилпирофосфата;

образование фитоина – первого С40 – каротина; ряд реакций десатурации; циклизация и связанные с ней реакции с участием двойной связи С -1,2; окончательные модификации. В процессе синтеза каротиноидов первым общим предшественником для всех видов каротинов является ацетат в виде ацетил – КоА, который в процессе биосинтеза подвергается восстановлению в две стадии до мевалоновой кислоты (ФЕОФИЛОВА, 1980; БРИТТОН, 1986; ЕГОРОВ, 1989; GIL–HWAN et al., 1990; CHEN et al., 1999).

Важную роль в процессе биосинтеза каротиноидов играют органические кислоты, входящие в состав трикарбонового цикла, к которым относятся трикарбоновые кислоты – лимонная, цисаконитовая, изолимонная, щавелевоянтарная и дикарбоновые кислоты яблочная, янтарная, кетоглутаровая, фумаровая и щавелевоуксусная (КОРОЛЕВА, 1979;