«АПОПТОЗ И ОКСИД АЗОТА В РЕГЕНЕРАЦИИ ТРАВМИРОВАИНОИ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ВЕРХНЕЧЕЛЮСТНОГО СИНУСА ...»

Г осударственное бюджетное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

«Тихоокеанский государственный медицинский университет»

Министерства здравоохранения Российской Федерации

На правах рукописи

Едранов Сергей Сергеевич

АПОПТОЗ И ОКСИД АЗОТА В РЕГЕНЕРАЦИИ ТРАВМИРОВАИНОИ

СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ВЕРХНЕЧЕЛЮСТНОГО СИНУСА

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Научный консультант доктор медицинских наук, профессор П.А. Мотавкин Владивосток Оглавление Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Анатомо-физиологическая характеристика верхнечелюстного синуса

1.2. Анатомо-гистологическая характеристика околоносовых пазух крысы

1.3. Оксид азота в репарации и реорганизации слизистых оболочек....... 1.3.1. Оксид азота как трофический фактор

1.3.2. Идентификация оксида азота в слизистой оболочке верхнечелюстной пазухи

1.4. Феномен апоптоза

1.4.1. Механизм апоптоза

1.4.2. Молекулярные факторы апоптоза в условиях физиологической и репаративной регенерации

1.5. Межклеточные мессенджеры в регуляции репаративных процессов и апоптоза

Глава 2. Материал и методы исследования

2.1. Экспериментальная модель посттравматического синусита................. 2.2. Моделирование травматического перелома верхнечелюстного синуса

2.3. Клинический материал

2.4. Детекция NADPH-диафоразы и iNOS

2.5. Идентификация апоптоза

Глава 3. Нитроксидергические механизмы апоптоза при экспериментальной травме

3.1. Топография NADPИ-диафоразы и iNOS в слизистой оболочке верхнечелюстного синуса при односторонней деафферентации......... 3.2. Топография NADPИ-диафоразы и iNOS в слизистой оболочке верхнечелюстного синуса при переломе костей черепа

3.3. Апоптоз в слизистой оболочке верхнечелюстного синуса при односторонней деафферентации

3.4. Апоптоз в слизистой оболочке верхнечелюстного синуса при переломе костей черепа

Глава 4. Апоптоз и нитроксидсинтезирующие системы при патологии верхнечелюстного синуса человека

4.1. Клинико-морфологическая характеристика стадий посттравматического воспаления и репарации слизистой оболочки верхнечелюстного синуса

4.2. Топография NADPH-диафоразы и iNOS в слизистой оболочке верхнечелюстного синуса в условиях травмы и хронического воспаления

Заключение

Список сокращений

Список литературы

Введение Актуальность проблемы. Нарушение целостности верхнечелюстного си­ нуса - широко распространенная самостоятельная патология, сопровождающая различные типы переломов костей скулоорбитоверхнечелюстного комплекса (Бесшапочный С.Б., Краснолобов В.М., 1976; Бутюкова В.А., 1977; Бутюкова В.А. и др.,1979; Бесшапочный С.Б., 1984, 1990; Зуев В.П., Гусев Э.П., 1988;

Трунин Д.А., 2001; Pape K., 1969). При синус-лифтинге возникают две пробле­ мы: с одной стороны - послеоперационный гайморит, развивающийся в 3-20% случаев, а с другой - предсуществующая патология околоносовых пазух, кото­ рая ограничивает показания к данной операции (Maksoud M.A., 2001; SchwartzArad D. et al., 2004; Costa F. et al., 2008). Исследования на экспериментальной модели доказали структурную перестройку эпителия верхнечелюстной пазухи при посттравматической репарации (Едранов С.С., 2005; Едранов С.С. и др., 2005). Однако, объяснить это лишь прямым травматическим повреждением тканей невозможно, так как в процесс вовлекались клетки, расположенные на значительном расстоянии от места перелома.

Современная концепция гибели клетки базируется на двух основных меха­ низмах: апоптозе и некрозе (Ярилин А.А., 1998; Лушников Е.Ф., Аброси­ мов А.Ю., 2001; Пальцев М.А., 2002; Матвеева Н.Ю. и др., 2006; Калиничен­ ко С.Г., Матвеева Н.Ю., 2007; Sloviter R., 2002; Marretta R.M., Ales F., 2010;

Khoury M.P., Bourdon J.C., 2011). Понимание этих процессов исторически про­ исходило не одновременно. Начиная с работ R. Virchow (1859) было выполнено детальное морфологическое описание смерти клетки, названной некрозом, под которым понимали необратимые изменения тканей. По мере развития гистоло­ гических методов исследования стало ясно, что некроз представляет собой не одномоментный, а растянутый во времени процесс (Серов В.В., 2001). В году W. Flimming был описан хроматолиз - процесс быстрого «растворения»

образовавшихся при распаде фрагментов ядра. В 1890 году C. Weigert ввел тер­ мины «аутолиз», «пикноз» и «кариолизис». Со временем стали появляться ги­ потезы о существовании естественного механизма клеточной смерти, позволя­ ющего поддерживать качественные и количественные показатели клеточных популяций на оптимальном, генетически детерминированном уровне. Подоб­ ный механизм элиминации клеток детально описал A. Gluksmann в середине прошлого века, но только в 70-х годах ХХ столетия, в работах J.F. Kerr было впервые введено понятие программированной гибели клеток или апоптоза (Kerr J.F. et al., 1972).

В то время как некроз представляет собой необратимую смерть клетки, апоптоз на определенных этапах может быть задержан или предупрежден (Лушников Е.Ф., Абросимов А.Ю., 2001). Поэтому особую актуальность при­ обретает анализ механизмов активации апоптоза, его временного и простран­ ственного распространения в клеточной популяции. Изучение апоптоза при травматическом повреждении и регенерации слизистой оболочки является пер­ спективным и с точки зрения возможности влияния на патологический процесс (Khoury M.P., Bourdon J.C., 2011).

Оксид азота, обладая широким спектром регуляторного, фармакологиче­ ского и токсического действия влияет на процессы клеточной смерти, физиоло­ гической и репаративной регенерации (Lipton S.A., 1999; Ushmorov A. et al., 1999; Prast H., Philippu A., 2001). Это соединение является одним из главных факторов клеточной сигнализации и межклеточного взаимодействия (Vin­ cent S.R., 1994; Pelligrino D.A. et al., 1996; Yoshioka Y. et al., 2003). Оксид азота регулирует тонус сосудистой стенки, угнетает агрегацию тромбоцитов и их ад­ гезию к эндотелию, стимулирует ангиогенез, обладает цитотоксическим дей­ ствием, участвуя таким образом в механизмах противомикробного, противови­ русного и противоопухолевого иммунитета. В зависимости от условий он мо­ жет активировать или подавлять апоптоз, избирательно воздействуя на опреде­ ленные типы клеток (Калиниченко С.Г., Матвеева Н.Ю., 2007; Бершова Т.В. и др., 2009; Dawson, Snyder, 1994; Dawson W.L., 1995; Glockzin S. et al., 1999;

Choi B.M. et al., 2002).

Вместе с тем нельзя исключить влияния на процессы репаративной регене­ рации и нейрогенных механизмов. При травме стенок гайморовой пазухи, в случае перелома верхняя челюсть с костями носа отделяется от скуловых ко­ стей. В результате этого в 100% случаев травмируются подглазничный и верх­ ние альвеолярные нервы, что ведет к нарушениям всех видов поверхностной чувствительности (Крюков К.И., 2008).

Нарушения иннервации вызывают в тканях нейродистрофические измене­ ния, явления воспалительного характера, нарушения морфофункциональной специфичности клеток, их некроз и апоптотическую гибель (Григорьева Т.А., 1966; Князев Г.Г., 1992; Keller J.N. et al., 1998).

Установлено, что начальный период апоптоза при деафферентации индуци­ руется экспрессией фактора роста нервов, который при взаимодействии с ре­ цептором p75 запускает механизмы клеточной смерти (Frade J.M., Barde Y.A., 1999; Banasiak A.G. et al., 2000; Friedman W.J., 2000). Необратимую активацию этого процесса при перерезке нервов опосредуют проапоптотические ферменты - эффекторные каспазы и ген (Thornberry N.A., Lazebnik Y., 1999; Li J. et al., 2002; Itoh K. et al., 2004). Так, при пересечении слухового нерва апоптоз нейронов слуховых ядер отмечается уже в первые сутки после травмы, а пере­ резка зрительного нерва у мышей активирует апоптоз более 90% ганглиозных нейронов сетчатки (Матвеева Н.Ю., 2006; Калиниченко С.Г., Матвеева Н.Ю., 2007; Frade J.M. et al., 1997, 1999; Kalinichenko S.G., Matveeva N.Yu., 2008). Ме­ нее известны механизмы программированной гибели клеток в ответ на пересе­ чение периферических нервов (Мотавкин П.А. и др., 1994).

С этих позиций приобретают особую актуальность данные, характеризую­ щие апоптоз и патогенетическую роль оксида азота при посттравматической регенерации слизистой оболочки.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в установ­ лении роли апоптоза и оксида азота в репаративных процессах травмированной слизистой оболочки верхнечелюстного синуса.

В соответствии с избранным направлением были сформулированы следу­ ющие задачи исследования:

1. Создать экспериментальную модель деафферентации средней зоны лица и верхнечелюстного синуса на лабораторном животном - белая крыса;

2. Исследовать топографию конститутивной и индуцибельной изоформы NOсинтазы и NADPH-диафоразы в слизистой оболочке гайморовой пазухи у человека и крыс в норме и на разных этапах регенерации.

3. Дать оценку клинико-морфологических изменений при репарации верхне­ челюстного комплекса у человека после травмы и установить их связь с динамикой распространения апоптоза.

4. Исследовать качественные и количественные характеристики апоптоза клеток слизистой оболочки верхнечелюстного синуса при деафферентации и механическом повреждении у крыс.

5. Установить топографию и распределение Bcl-2- и р53-иммунореактивных клеток на разных этапах регенерации слизистой оболочки у человека и 6. На основе полученных результатов и данных литературы представить обобщенную модель взаимоотношений NO-синтезирующих, про- и антиапоптотических факторов при травме и воспалении поврежденной слизи­ стой оболочки.

7. Обосновать закономерности развития апоптоза и механизмов цитотоксического и протективного действия оксида азота в репарации слизистой обо­ лочки верхнечелюстной пазухи.

Научная новизна. В настоящей работе проведено комплексное исследова­ ние топографии и активности NO-синтезирующих ферментов и факторов апоптоза в поврежденной слизистой оболочке верхнечелюстного синуса чело­ века и крысы.

Впервые продемонстрированы клинико-морфологические критерии и ста­ дии репарации скуловерхнечелюстного комплекса у человека на разных сроках после травмы и неправильно консолидированного перелома.

Впервые представлена экспериментальная модель деафферентации средней зоны лица и верхнечелюстного синуса.

Впервые установлен феномен апоптоза клеток слизистой оболочки верхне­ челюстного синуса при деафферентации и экспериментальной травме костей черепа у крысы.

Впервые изучена динамика NADPH-диафоразы и индуцибельного изофер­ мента NO-синтазы в клетках слизистой оболочки и проведен сравнительный анализ изменений, связанных с их апоптозом при хроническом риносинусите у человека.

Впервые исследована связь апоптоза с механизмами цитотоксического и протективного действия оксида азота в период восстановления слизистой обо­ лочки после травмы.

Теоретическая и практическая значимость работы. Изучены топография и активность нитроксидсинтезирующих ферментов и факторов апоптоза в условиях репаративной регенерации слизистой оболочки верхних дыхательных путей и полости рта для выяснения роли модулирующих цитопротективных и цитотоксических эффектов и обоснования рациональной терапии стоматологи­ ческих заболеваний.

Создана адекватная экспериментальная модель деафферентации верхнече­ люстного синуса, имеющая реальные перспективы для дальнейших исследова­ ний в стоматологии и отоларингологии, разработки новых патогенетически ориентированных программ терапии острого и хронического синуситов, а так­ же рекомендаций по реабилитации пациентов после травм костей лицевого че­ репа, гайморотомии, реконструктивных операций на средней зоне лица, в том числе дентальной имплантации и синуслифтинга.

Положения, выносимые на защиту:

1. Травматические и деафферентационные повреждения верхнечелюстного синуса вызывают селективные морфологические и цитохимические аль­ терации клеток различных слоев слизистой оболочки;

2. Апоптоз является постоянным компонентом вторичного повреждения слизистой оболочки и имеет специфическую динамику на разных стадиях хронического воспаления;

3. Динамика изменения TUNEL-иммунореактивных клеток, а также локализа­ ция NADPH-диафоразы и индуцибельной NO-синтазы в слизистой оболочке верхнечелюстного синуса видоспецифичны и зависят от этиологии повре­ ждающего фактора.

4. Репаративные и цитотоксические процессы в слизистой оболочке обусловлены кооперативным взаимодействием различных популяций NO-синтезирующих, р53- и Bcl-2- иммунореактивных клеток.;

Степень достоверности и апробация результатов. Степень достоверно­ сти результатов проведенного исследования определяется соответствием его дизайна критериям доказательной медицины, анализом репрезентативных вы­ борок, достаточным объемом наблюдений с использованием современных раз­ ноплановых методов исследования. Примененные статистические методы адек­ ватны поставленным задачам, а сформулированные положения, выводы и прак­ тические рекомендации аргументированы и логически вытекают из анализа по­ лученных данных По теме исследований опубликована 1 монография и 30 научных работ, из которых - в изданиях, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией для публикации результатов диссертаций на соискание ученой степени докто­ ра и кандидата наук.

Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на Тихоокеан­ ских научно-практических конференциях ВГМУ (Владивосток, 2004-2008), Приморских краевых ежегодных конференциях «Хирургия лица» (2006-2008), Имплантологических коференциях «Восток-Запад» (Владивосток, 2010, 2011), Должановских чтениях (Воронеж, 2011), IV научной конференции «Микроцир­ куляция в клинической практике» памяти проф. В.В. Куприянова (Москва, Университет дружбы народов, 2012).

1.1. Анатомо-физиологическая характеристика верхнечелюстного синуса Верхнечелюстная (гайморова) пазуха - парная придаточная полость носа, располагающаяся в толще верхней челюсти и являющаяся самой большой из всех околоносовых пазух. Получила свое название от имени британского хи­ рурга Nathaniel Highmore (1613-1685), впервые описавшего ее патологию.

Форму верхнечелюстной пазухи человека можно сравнить с трехгранной пирамидой, основание которой составляет внутренняя, или носовая, стенка, а верхушка направлена к скуловой кости. Помимо основания, пазуха имеет три поверхности: верхнюю - глазничную, передненаружную - лицевую и заднена­ ружную, обращенную к подвисочной и крылонебной ямкам.

Правая и левая пазухи, как правило, асимметричны - левая больше правой, их высота у взрослого человека колеблется от 2,3 до 4,3 см, ширина - от 1,9 до 3,0 см, объем - от 4,2 до 20,5 см3 (Михалойц Н.И., 1938). Линейные размеры и объем гайморовых пазух у мужчин превышают таковые у женщин (Костоманова Н.Е., 1957, 1960). У детей верхнечелюстная пазуха развивается по мере роста лицевого скелета и к 10 годам имеет те же взаимоотношения с соседними ана­ томическими структурами, что и у взрослых.

Слизистая оболочка пазухи выстлана многорядным мерцательным эпителием с бокаловидными клетками, который лежит на собственной пластинке, содержа­ щей слизистые железы. Бокаловидные клетки диаметром 5-10 мкм, продуцирую­ щие слизь, расположены в эпителиальном пласте неравномерно. Альвеолярные и альвеолярно-трубчатые железы, вырабатывающие слизь и серозный секрет, рас­ положены в собственной пластинке и подслизистом слое. Их толщина достигает 75-100 мкм, а диаметр - 0,2-0,4 мм (Бабияк В.И. и др., 2002).

В последнее время особое внимание уделяется строению структур боковой стенки носа и остиомеатального комплекса - системы анатомических образова­ ний в области переднего отдела средней носовой раковины (от - отвер­ стие, - ход). Остиомеатальный комплекс и включает в себя следующие структуры: латеральную поверхность средней носовой раковины, крючковид­ ный отросток (формирует медиальную стенку воронки), воронку (принимаю­ щую слизь из верхнечелюстной пазухи, передней группы клеток решетчатой и лобной пазух и распределяющую воздух для циркуляции по этим синусам), от­ верстие верхнечелюстной пазухи (которое открывается в передненижнюю часть воронки), переднеэтмоидальные воздушные клетки и воздушное про­ странство вокруг всех этих структур. Различные патологические процессы в воздушных синусах, открывающихся в воронку и сопровождающиеся отеком, гиперплазией или полипозом слизистой оболочки, приводят к сужению или за­ крытию остиомеатального комплекса, что, в конечном итоге, ведет к наруше­ нию воздухообмена в пазухах и усугубляет течение патологического процесса (Волков А.Г., 2000).

В настоящее время выделяют семь функций, осуществляемых околоносовыми пазухами: 1) облегчение костей черепа; 2) улучшение резонанса голоса;

3) увлажнение и согревание воздуха; 4) увеличение области обонятельной мембра­ ны; 5) амортизация при механических воздействиях на лицевой скелет; 6) тепловая изоляция мозга; 7) стимуляцию роста и архитектоники черепа (Gluck U.,1991).

По мнению Б.М. Сагаловича (1967), главной функцией околоносовых па­ зух, являющихся частью дыхательной системы, является проведение воздуха.

При вдохе через средний носовой ход, где расположены устья околоносовых пазух, проходит большая часть воздуха. Эта закономерность подтверждена с помощью электроизмерительной аппаратуры на человеке и в экспериментах на животных. Через средний носовой ход поступает 75-80%, через верхний - до 10%, через нижний - 10-15% вдыхаемого воздуха. Такое распределение обес­ печивает оптимальное согревание и увлажнение воздуха (Ульянов Ю.П., 1998, 2000). На формирование воздушного потока оказывает влияние так называемый «носовой клапан» - узкое пространство, ограниченное сверху латерально­ каудальным краем верхнего латерального хряща и его фиброзно-перепончатым прикреплением к краю грушевидного отверстия, медиально - перегородкой но­ са и снизу - нижним краем грушевидного отверстия. Кроме него на направле­ ние потока воздуха влияют объем нижних носовых раковин и присасывающее действие околоносовых пазух.

Во время вдоха в полости носа создается отрицательное давление, которое позволяет части увлажненного, очищенного и согретого воздуха выходить из околоносовых пазух и формировать первую порцию, попадающую в нижние от­ делы дыхательной системы. При выдохе давление в полости носа возрастает, и основная масса воздуха проходит через нижний носовой ход, увлажняя его обо­ лочку (Козлов М.Я., 1985). На процесс циркуляции воздуха в полостях носа и околоносовых пазух оказывают влияние и другие факторы: строение остиомеатального комплекса, ширина естественных отверстий пазух, преобладающий типа дыхания (носовое дыхание способствует более быстрому обмену газового состава и кислорода в пазухе, чем ротовое). Необходимо отметить, что значи­ тельная часть абсорбированного кислорода может быть непосредственно ис­ пользована слизистой оболочкой, на что указывали B. Drettner и R. Aust (1977).

Не менее важной функцией околоносовых пазух является защита внутрен­ ней среды организма от различных неблагоприятных факторов. Первым барье­ ром на их пути становится мукоцилиарный аппарат, основой которого являют­ ся реснички, расположенные на апикальной поверхности эпителиальных кле­ ток. Совокупность ресничек составляет мерцательное поле, которое обеспечи­ вает процесс очищения слизистой оболочки пазухи - мукоцилиарный клиренс.

Каждая ресничка опирается на базальную гранулу. От базальных гранул в глубь цитоплазмы отходит одна или несколько нитей, толщиной до 100 ^, ко­ торые в совокупности образуют реснитчатый конус, вершиной обращенный к клеточному ядру. Длина ресничек одной клетки одинакова, количество их ко­ леблется от 200 до 300. Ресничка состоит из одной или двух центральных и де­ вяти периферических фибрилл, покрытых оболочкой. Между ресничками вы­ являются мелкие протоплазматические выросты, ответственные за функцию всасывания и формирование слизистого слоя на поверхности эпителиальной клетки. Слизистое покрытие состоит из двух слоев - реснички окружены перицилиарной жидкостью (золь), верхний слой - гель обеспечивает вязко­ эластические свойства секрета, в него погружены верхушки ресничек. Функци­ онирование (биение) ресничек возможно только при наличии на поверхности клетки слизи. В поддержании физиологического соотношения «золь-гель»

важная роль принадлежит микроворсинкам и бокаловидным железистым клет­ кам (Плужников М.С. и др., 1995, 2008).

Мерцание ресничек имеет две важные физиологические характеристики направление и силу. Общим признаком для околоносовых пазух является мер­ цание ресничек к устью пазухи (в верхнечелюстной пазухе направление мерца­ ния образует фигуру звезды). Направление движения ресничек обусловлено свойствами самой клетки и подчиняется закону «все или ничего» (они могут прекратить движение, но направление этого движения для клеток конкретной области строго определено), что доказал эксперимент Брюкке (Пискунов М.С., 1993). Сила биения ресничек определяет способность их к перемещению слизи­ стого покрытия. По данным Ballenger, полученным при эксперименте на соба­ ках, давление, оказываемое на слизистую пробку в лобной пазухе, составило мм вод. ст. (цит. по: Волков А.Г., 2000).

Функциональное состояние мерцательного эпителия может изменяться под влиянием различных факторов. Б.М. Сагалович (1967) разделил эти факторы на механические (давление воздушного потока), физические (изменение темпера­ туры вдыхаемого воздуха), химические (изменение рН среды) и биологические (бактериальные, вирусные, грибковые). Мукоцилиарная система также обеспе­ чивает фагоцитоз секрета слизистой оболочки, его протеазно-ингибиторный потенциал, мукозальный иммунитет, калориферную и рефлекторную функции полости носа и околоносов^^х пазух (Плужников М.С. и др., 1995, 2008).

Слизистая оболочка полости носа и околоносовых пазух обладает комплек­ сом неспецифических и специфических факторов общего и местного иммуни­ тета (ведущая роль принадлежит механизмам локальной защиты). Респиратор­ ный и железистый эпителий обеспечивают врожденные неспецифические ме­ ханизмы защиты - мукоцилиарный транспорт и секрецию бактерицидных про­ дуктов (лизоцима, лактоферрина, ^-интерферона). Неспецифическая клеточная реакция опосредуется полиморфноядерным, моноцитарным и макрофагальным фагоцитозом.

Специфическая защита слизистой оболочки полости носа и околоносовых пазух осуществляется на основе взаимодействия иммунокомпетентных Т- и Влимфоцитов глоточной миндалины и собственной пластинки слизистой обо­ лочки с клетками респираторного и железистого эпителия (Быкова В.П., 1995, 1999). Мукозоассоциированная лимфоидная ткань обеспечивает мукозальный иммунитет на фоне выработки секреторного иммуноглобулина А, который при­ знан основным фактором противоинфекционной защиты слизистой оболочки носовой полости и околоносовых пазух (Быкова В.П., 1999).

Нормальное функционирование придаточных пазух носа возможно в усло­ виях их постоянной аэрации и дренирования. При воспалении же слизистой оболочки полости носа, вследствие отека, нарушается отток секрета из пазухи, что приводит к его застою и параличу мерцательной активности эпителия.

Накопление экссудата в просвете околоносовых пазух провоцирует формиро­ вание болевого и интоксикационного синдромов (Чистюхина И.О., 1998).

В настоящее время защитная функция слизистой оболочки околоносовых па­ зух является частым предметом исследования в норме и при острых воспалитель­ ных процессах. Экссудативное воспаление в параназальных синусах имеет свои особенности и это, прежде всего, касается его локальных проявлений (Гладуш Ю.И., 1990). М.И. Говорун и А.А. Горохов (1994) исследовали слизистую оболочку околоносовых пазух у пациентов, впервые заболевших острым синуси­ том. Они установили, что носовая слизь в данной ситуации имела более кислую среду, скорость ее перемещения была значительно меньше, чем у здоровых лиц, что, по мнению авторов, свидетельствовало об угнетении функции мерцательного эпителия. Г.П. Захарова (1997, 2006) обнаружила у больных хроническим риносинуитом достоверное уменьшение скорости мукоцилиарного транспорта, наруше­ ние всасывательной и выделительной функций слизистой оболочки полости носа и околоносовых пазух, а также морфологические изменения, на клеточном и суб­ клеточном уровнях. Подтверждена и особая роль средней носовой раковины в фи­ зиологии и патофизиологии носа и околоносовых пазух, так как от топографо­ анатомических и гистотопографических особенностей ее строения зависит дре­ нажная и вентиляционная функции пазух, выводные соустья которых открывают­ ся в средний носовой ход (Чистюхина И.О., 1998).

Кроме анатомических причин, способствующих нарушению носового дыха­ ния (искривления, шипы, гребни перегородки носа, синехии, увеличение объема передних решетчатых клеток, гипертрофия нижней носовой раковины), к разви­ тию хронического синуита могут привести нарушения нейротрофического ком­ понента. Одной из особенностей верхней челюсти является наличие в ней круп­ ных чувствительных ветвей тройничного нерва, повреждение которых неизбежно при переломах (Лимберг А.А., 1994; Кабаков Б.Д., Малышев В.А., 1981). В случае перелома верхняя челюсть с костями носа может отделяться от скуловых костей.

В результате этого травмируются нижнеглазничный и верхние альвеолярные не­ рвы, что проявляется нарушением всех видов поверхностной чувствительности кожи подглазничной области, верхней губы, крыла носа, слизистой оболочки верхнего свода преддверия рта и зубов, а также нарушением электровозбудимости зубов верхней челюсти (Швырков М.Б. и др., 1999). Повреждения тройничного нерва вызывают не только функциональные, но и морфологические измененя в тканях лица и органах полости рта (Крюков К.И., 2008).

В опытах на кроликах было показано, что хроническое раздражение верхне­ го шейного симпатического ганглия приводит к развитию дистрофического процесса, появлению воспалительно-деструктивных изменений в слизистой оболочке околоносовых пазух, характерных для синуита (Коломийцев В.П., Коротченко В.В., 1990). Это позволило отнести нейротрофическую регуляцию к числу ведущих факторов, способных влиять на состояние слизистой оболочки носа и околоносовых пазух.

Г. Повертовски (1968) считал, что изучение морфологии слизистой оболоч­ ки придаточных пазух усложняется тем, что у некоторых больных еще до трав­ мы могли быть изменения вследствие перенесенных синуситов. Эту точку зре­ ния поддержали В.Р. Гофман и др. (1998), которые при секционных исследова­ ниях обнаружили патологические изменения в слизистой оболочке околоносовых пазух у 47,6% умерших, однако в их историях болезни жалоб со стороны ЛОР-органов не отмечалось, а проведенный в ряде случаев прижизненный эн­ доскопический ЛОР-осмотр патологии пазух не выявил.

1.2. Анатомо-гистологическая характеристика околоносовых пазух крысы Верхнечелюстной синус крысы расположен на наружной поверхности верхней челюсти кпереди от подглазничного отверстия. Его латеральная стенка образована костным возвышением, а медиальная - плоской наружной стенкой лунки резца. Обе стенки пазухи соединяясь образуют щелеводное пространство шириной около 0,1 см, вытянутое в сагитальной плоскости и несколько расши­ ряющееся кзади (рис. 1.1). В верхнем дистальном отделе стенки пазухи расхо­ дятся, образуя элипсовидное отверстие размером 0,10^0,15 см, открывающееся рядом с подглазничным отверстием (Едранов С.С., 2005; Едранов С.С. и др., 2005). Подглазничный нерв, выходящий из этого отверстия, является непосред­ ственным продолжением верхнечелюстного нерва, который иннервирует лице­ вую часть морды животного (рис. 1.2) (Карпилов Г.Х., 1937).

Конфигурация и размеры верхнечелюстной полости меняются в мезиодистальном направлении и относительно окружающих анатомических структур.

Силиконовые оттиски верхнечелюстной пазухи крысы, полученные трансальвео­ лярным способом, имели форму запятой, расположенной горизонтально. Расши­ ренная часть синуса направлена дистально и кнаружи от лунки резца и не выходит задней границей за апекс альвеолы. Сужающаяся часть направлена вперед и меди­ ально, косо пересекает центральную ось резца чуть кпереди середины длины нижней кривизны лунки, где они сообщаются через точечное отверстие (рис. 1.3) (Едранов С.С., 2005). Максиллярное отверстие открывается сразу под носовой ра­ ковиной в передней части носовой полости. Общая длина верхнечелюстной пазу­ хи от максиллярного отверстия до дистальной границы приблизительно 0,8 см, длина расширенной части - 0,20-0,25 см, высота - 3,8-4,0 см.

Рис. 1.1. Топография верхней челюсти крысы (фронтальный срез ADI - верхушка корня резца (apex dentalinci sivus); CN - полость носа (cavum nasi); LS - ла­ теральная стенка (lateral surface) назухн; MS - медиальная стенка (medial surface) назухн;

SM - верхнечелюстная пазуха (sinus maxillaris). Окр. гематоксилином и эозином, ^50.

Рис. 1.2. Отпрепарированная голова белой крысы:

глазное яблоко и параорбитальная клетчатка смещены кверху; препаровочная игла указывает на ногдлазннчнын нерв.

Рис. 1.3. Фронтальный гистотопографический срез верхней челюсти крысы:

естественное сообщение (1) верхнечелюстной назухн (2) и лунки резца (3). Окр. гематокси­ лином и эозином, ^50 (увеличено при печати).

Слизистая оболочка верхнечелюстной пазухи крысы выстлана однослой­ ным многорядным мерцательным эпителием с ярко выраженным мукоциллиарным аппаратом - на 1 мм2 приходится 170,9±7,3 реснитчатых эпителиоцита и 10,8±2,1 бокаловидной клетки (соотношение ^15:1). Толщина эпителиального пласта пазухи - 19,9±2,6 мкм. Собственная пластинка слизистой оболочки со­ держит большое количество простых альвеолярных желез, лимфоидных эле­ ментов и групп тучных клеток (рис. 1.4). Площадь профильного поля мастоцитов находится в пределах 322,3±9,5 мкм2 (Едранов С.С., 2005).

Электронная микроскопия фрагментов слизистой оболочки продемонстри­ ровала известные особенности строения различных клеток: эпителиоцитов, фибробластов, лаброцитов и др. (рис. 1.5).

При рентгенанатомическом исследовании верхнечелюстные пазухи крысы определяются как парные замкнутые полости в виде овалов, вытянутых в ди­ стальном направлении и уплощенных с медиальной стороны, симметрично расположенные впереди от подглазничных отверстий и латеральнее резцов (рис. 1.6) (Едранов С.С. и др., 2004).

Рис. 1.4. Слизистая оболочка верхнечелюстного синуса белой крысы:

1 - мерцательный эпителий, 2 - простые альвеолярные железы собственной пластинки.

Фронтальный гистотопографический срез, окр. гематоксилином и эозином, ^100.

Рис. 1.5. Ультраструктура клеточных элементов интактной слизистой оболочки а - фибробласты; б - тучные клетки; Я - ядро, СГ - секреторные гранулы. Электронограмма, ^75000.

Рис. 1.6. Визиограмма лицевого отдела головы белой крысы в горизонтальной а - лицевой отдел; б - носовой отдел; в - корни резцов; г - верхнечелюстной синус; д - вы­ резка подглазничного отверстия; е - височный отросток верхней челюсти (передний отдел скуловой дуги).

1.3. Оксид азота в репарации и реорганизации слизистых оболочек Оксид азота - универсальный межклеточный мессенджер - представляет собой исключительно важный регулятор физиологических функций (Ва­ нин А.Ф., 1998; Реутов В.П. и др., 1998; Реутов В.П., 2000; Мотавкин П.А. и др., 2000). В норме он осуществляет регуляцию внутри- и межклеточных процес­ сов. За последние два десятилетия стало известно, что главный механизм дей­ ствия оксида азота связан с увеличением внутриклеточной концентрации цик­ лического гуанозинмонофосфата и активацией через систему G-киназ Са2+насосов эндоплазматического ретикулума (Borutaite et al., 2006; McCarty, 2009).

Другим механизмом является активация при участии оксида азота ADPрибозилтрансферазы и высвобождение ионов кальция. Наконец, образование NO+ - одного из промежуточных продуктов метаболизма оксида азота - влияет на проницаемость кальциевых каналов. Обнаружение описанных свойств поз­ волило причислить оксид азота к таким вторичным мессенджерам, как цикли­ ческие аденозин- и гуанозинмонофосфат, ионы кальцая, инозитолтрифосфат и Philippides A. et al., 2000).

1.3.1. Оксид азота как трофический фактор Нарушение механизмов регуляции с участием оксида азота отмечают при травме, гипертензии, ишемии, тромбозах, инфекциях, иммунном ответе, опухо­ левом росте (Мотавкин П.А., Гельцер Б.И., 1998; Покровский В.И., Виногра­ дов Н.А., 2005; Serrano C. et al., 2004; Nikolovska S. et al., 2005; Thomas M.S. et al., 2005). Степень продукции этого соединения определяет в конечном итоге его эффекторное действие на мишень, которое реализуется по двум основным механизмам: цитотоксическому и цитопротективному (Narayanan V., 1997; de la Rosa E., de Pablo F., 2000; H of R.J., Hosking L., 2000; Ott S.R. et al., 2000;

Monti B. et al., 2001; Yang E.S., Park J.W., 2006).

Трофическая активность оксида азота неразрывно связана с его цитопротективным эффектом в условиях гипоксии, травмы или воспаления (Wilkins A.

et al., 2004). A. Wilkins и A. Compston (2005) впервые доказали, что оксид азота могут секретировать формирующиеся аксоны, прорастающие в окружающую ткань в процессе посттравматической регенерации. В серии работ было показа­ но, что оксид азота функционирует в этих условиях как нейротрофин, подобно фактору роста нервов, нейтротрофину-3 и мозговому нейротрофическому фак­ тору (Klocker N. et al., 1998, 2000; Tzeng S.F., Huang H.Y., 2003; Estevez A.G. et al., 2006).

Взаимосвязь функциональных пулов оксида азота и нейротрофинов проде­ монстрирована при репаративной регенерации эпителия и соединительной тка­ ни кожи, а также слизистой оболочки кишечника (Raap U., Kapp A., 2010). В этой ситуации оксид азота выполняет функцию стыковочного звена в про­ странственных взаимодействиях между клетками. Предполагается, что эти эф­ фекты поддерживаются нитроксидопосредованной вазодилятацией и положи­ тельным влиянием этого газа на процессы метаболической компенсации по­ вреждения.

Тесная взаимосвязь сигнальных мессенджеров, а также общность их триг­ герных механизмов позволяют наряду с локальным воздействием на них ис­ пользовать модулирующие влияния через системы регуляторов, осуществляю­ щих контроль за экспрессией вторичных клеточных мессенджеров, цитокинов и других сигнальных молекул, а также за запуском генетических программ апоптоза, антиапоптозной защиты, усиления трофического обеспечения (Choi B.M. et al., 2002; Niidome T. et al., 2006). Такие модуляторные влияния устраняют общую дезинтеграцию во взаимодействии сложных и часто разно­ направленных молекулярно-биохимических механизмов, возникающих при травме или воспалении. Очевидно, оксид азота в этих процессах играет ключе­ вую регулирующую роль. Избирательность такого действия объясняется уни­ кальными свойствами молекулы NO. Малая величина, отсутствие заряда, нали­ чие одного электрона с неспаренным спином придают ему высокую реакцион­ ную способность и проницаемость. Напротив, короткий (не более 10 мс) период полужизни молекулы существенно ограничивает ареал ее максимальной актив­ ности, который едва превышает 7 мкм (Реутов В.П. и др., 1998; Реутов В.П., 2000). Молекулярные свойства оксида азота препятствуют его депонированию во внутриклеточных органеллах, однако идеально подходят для быстрой про­ странственной сигнализации между соседними клеточными элементами. Спе­ цифичность и направленность регуляторного действия данного соединения за­ висит, с одной стороны, от типов клеток-мишеней, имеющих развитую систему гуанозинмонофосфатзависимой трансдукции и достаточный уровень раствори­ мой гуанилатциклазы - внутриклеточного рецептора оксида азота, а с другой от физиологического состояния клеток-эффекторов, экспрессирующих различ­ ные изоформы нитроксидсинтазы (NOS) (Горен А.К., Майер Б., 1998).

Хотя молекулы NO в свободном состоянии существуют всего несколько се­ кунд, длительность их действия может измеряться часами (Malinski Т. et al., 1993). Эндогенное образование оксида азота в ответ на какое-либо изменение внутренней среды приводит к высвобождению ряда других регуляторов, в том числе и модуляторных пептидов, для которых нитроксидзависимый сигнал яв­ ляется индуктором. Эффекторная последовательность этих факторов образует так называемый «регуляторный континуум», где их совместное действие одно­ направленно, а конечный эффект суммирован и продолжителен (Thermos K., 2008). Так, оксид азота способен регулировать активность про- и противовос­ палительных цитокинов через модуляцию активности их рецепторов (GurgulConvey E., Lenzen S., 2010). При этом восстановление нормального баланса цитокинов происходит более эффективно, чем при воздействии на отдельные цитокиновые системы (Tham C.L. et al., 2010). Как правило, подобные «цитокиновые эффекты» влияют на интенсивность образования оксида азота и проявляют выраженные трофические и генераторные свойства (EstеvezA.G., Jordan J., 2002).

1.3.2. Идентификация оксида азота в слизистой оболочке верхнечелюстной пазухи Наличие оксида азота в выдыхаемом воздухе впервые установлено L.E. Gustafsson и A.M. Leone в 1991 году (Gustafsson L.E. et al., 1991). Дальней­ шие исследования кондукторных отделов легких обосновали данные об уча­ стии оксида азота в генезе бронхиальной астмы и целого ряда воспалительных заболеваний верхних дыхательных путей. Гистохимические исследования и ко­ личественный биохимический анализ позволили выделить несколько источни­ ков этого соединения в бронхолегочной ткани. Во-первых, синтез оксида азота неизменно регистрируется в эпителии слизистой оболочки носовых путей и особенно - околоносовых пазух. Снижение выработки оксида азота здесь регимстрируется при полной обструкции остиомеатального комплекса и риносинуситах (Petruson K. et al., 2005). У человека наибольшая концентрация оксида азота определяется именно в околоносовых пазухах (Bommarito L. et al., 2008).

Определение его уровня является прецизионным методом диагностики функ­ ционального состояния слизистой оболочки пазух, а также их заболеваний и риносинуситов различного генеза (Degano B. et al., 2005; Valero A. et al., 2009).

Высокая активность NOS выявляется в железистом эпителии околоносовых пазух, в поступающих сюда нервных волокнах и эндотелии микрососудов (Riederer A. et al., 1996; Jorissen M. et al., 2001). У грызунов и человека обнару­ живается единообразный паттерн реакций на диафоразу никотинамидадениндинуклеотидфосфата (Nicotinamide Adenine Dinucleotide PHosphate - NADPH).

Активность этой диафоразы колеблется от умеренной до высокой и очень вы­ сокой и определяется по всему эпителию слизистой оболочки (de Winter-de Groot K.M., van der Ent C.K., 2009). Положительная иммунореактивность к нейрональной NOS определяется вокруг желез, в стенке мелких артерий и вен, к индуцибельному изоэнзиму - в покровном и железистом эпителии и клетках воспалительных инфильтратов, а эндотелиальная NOS - в железах собственной пластинки слизистой оболочки и сосудистом эндотелии (Мотавкин П.А., Гельцер Б.И., 1998; Furukawa K. et al., 1996; Maniscalco M. et al., 2001; Vural C., Gungor A., 2002).

В слизистой оболочке верхнечелюстной пазухи человека идентифицирова­ на кальций-независимая индуцибельная NOS (inducible Nitric Oxide Synthase iNOS). Этот энзим находится преимущественно в растворимой форме, менее зависим от кальмодулина и может экспрессироваться в эпителиальных клетках.

Имуннореактивность к iNOS регистрируется в шиповатом слое многослойного плоского эпителия, нейрональная NOS (Nitric Oxide Synthase) локализуется, главным образом, в подапикальной, а эндотелиальная NOS - только в апикаль­ ной части клеток железистого эпителия (Petruson K. et al., 2005). Таким обра­ зом, самой распространенной изоформой этого фермента в слизистой оболочке околоносовых пазух, по всей видимости, является iNOS. За выработку оксида азота отвечает активная мембраносвязанная изоформа энзима; другая изоформа NOS - растворимая - находится в цитоплазме эпителиоцитов в неактивном со­ стоянии (Lundberg J.O., 2008). Мембраносвязанную форму NOS инактивируют кальмодулин-зависимые протеинкиназы, которые стимулируют фосфорилирование каталитических субъединиц фермента. В результате перемещения фосфорилированной неактивной формы NOS из плазматической мембраны в гиа­ лоплазму последняя изолируется от процессов синтеза и экскреции оксида азо­ та, а цитозольный компартмент приобретает резистентность к его токсичности и не регулируется в сторону понижения активности системными стероидами.

Внутривенное введение L -аргинина увеличивает уровень носового оксида азота на 35% (Nakano H. et al., 2002).

Удельная концентрация оксида азота в просвете бронхов составляет 3­ 11 ppb, а в полости носа и носоглотке достигает 900-1000 ppb (Kirihene R.K. et al., 2002). При этом уровень атмосферного оксида азота, по данным хемиолюминисценции, не влияет на концентрацию его молекул в выдыхаемом воздухе (Вознесенский, 1999; Silkoff et al., 2000). Следует отметить, что экзогенный ок­ сид азота может диффундировать в эпителий слизистой оболочки полости носа и включаться в метаболический цикл нитроксидсинтаз (Nakano H., 2002). Сле­ дует подчеркнуть, что уровень оксида азота в околоносовых пазухах всегда значительно выше, чем в полости носа (Pasto M. et al., 2001; Andersson J.A. et al., 2002). Средняя концентрация этого газа в основной пазухе человека состав­ ляет 2575 ppb, в гайморовой - 6792 ppb (Kirihene R.K. et al., 2002). Описанная разница может быть связана с физической нагрузкой и гемодинамическими факторами (Imada M. et al., 1996; Qian W. et al., 2001; Serrano C. et al., 2004). Ес­ ли при обструктивном синдроме уровень оксида азота обычно значительно выше базального, то интенсивные нагрузки, напротив, снижают его выработку (Qian W. et al., 2001; Torretta S. et al., 2010).

К факторам, влияющим на содержание оксида азота в полости носа и околоносовых пазухах, относятся также гипоксия (при давлении кислорода меньше 10% от нормы), компоненты табачного дыма, ингибирующие синтез NOS, а также некоторые бактерии (Dillon W.C. et al., 1996; Al-Ali M.K., Howarth P.H., 1998; Chambers D.C. et al., 2001).

Большинство исследователей признают, что в условиях физиологической нормы помимо своих «стандартных» функций оксид азота может осуществлять локальную регуляцию мукоцилиарной активности в верхних дыхательных пу­ тях (Schlosser R.J. et al., 1995; Kirihene R.K. et al., 2002). Так, экзогенное подве­ дение L-аргинина или введение нитропруссида натрия ведет к усилению коле­ бательных движений ресничек носовой полости (Bruce C.T. et al., 2010). Это яв­ ление коррелирует с изменениями активности NADPH-диафоразы в клетках слизистой оболочки верхнечелюстной пазухи и поступающих сюда нервных волокнах (Runer T. et al., 1998).

В настоящее время получены твердые доказательства вовлечения оксида азота в патогенез аллергического и неаллергического ринитов, хронического риносинусита и бронхиальной астмы, при которых уровень его содержания в полости носа резко повышается (Невзорова В.А., 1997; Невзорова В.А. и др., 2006; Филлипова Н.А. и др., 2006; Craig T.J., 2010). Оксид азота оказывает непосредственное влияние на выраженность воспалительной экссудации в околоносовых пазухах (Bommarito L. et al., 2008).

В середине 80-х годов ХХ века внимание морфологов привлек тот факт, что активация макрофагов и нейтрофилов сопровождается усиленным синтезом ок­ сида азота. Оказалось, что в этих клетках оксид азота участвует в регуляции NADPH-оксидазной системы и в модуляции иммунного ответа. В настоящее время описанные феномены сложились в целостное представление об оксиде азота как факторе, направляющем развитие воспалительного процесса во всех тканевых системах (Сомова Л.М., Плеханова, 2006; Silkoff et al., 2000; Aita T. et al., 2001; Aguilaniu H. et al., 2003). Кроме того, избыточная продукция данного соединения сама по себе может быть причиной апоптоза и некроза различных клеток при травме, опухолевом росте, шоковых состояниях (Брюне Б. и др., 1998; Hersey P., Zhang X.D., 2003; Kashihara N. et al., 2003). Особенно чувстви­ тельны к действию оксида азота эпителиоциты, нервные и мышечные волокна, стволовые и камбиальные клетки (Saunders J.W., 1996). Основная роль в под­ держании этих состояний отводится iNOS.

Индукция фермента в слизистой оболочке может быть инициирована деге­ неративными, метаболическими и ишемическими изменениями, которые неиз­ бежно возникают в результате травмы или воспаления. Повышение активности iNOS в тканях носовой полости и околоносовых пазух отмечается при действии бактериальных эндотоксинов и провоспалительных цитокинов: факторов некроза опухоли, ^-интерферона и интерлейкина-1 (Guida J. et al., 2010). Со­ держание оксида азота в этих условиях коррелирует с функциональным состоя­ нием слизистой оболочки околоносовых пазух. Так, вызванная отеком обтура­ ция носовых ходов ведет к нарастанию отрицательного давления внутри пазу­ хи, а возникающая при этом гипоксия индуцирует экспрессию NOS в тканях ее слизистой оболочки (Andersson J.A. et al., 2002). Индукция NOS обратима и но­ сит адаптивный характер. Как правило, с момента индукции и до начала нара­ ботки оксида азота проходит несколько часов и именно в этот период происхо­ дит транскрипция и экспрессия белковых субъединиц энзима (Lundberg J.O., 2008). В свою очередь последствия индукции энзима связаны с деструктивны­ ми и/или протективными влияниями оксида азота на ближайшее микроокруже­ ние (Sanchez C.A. et al., 2010).

Активная экспрессия iNOS обнаруживается в зонах воспаления околоносо­ вых пазух, где основной пул фермента сосредоточен в цитоплазме нейтрофилов, эозинофилов, моноцитов и макрофагов (Pasto M. et al., 2001; Abba A.A., 2009). По периферии таких очагов обычно располагаются iNOSиммунопозитивные фибробласты (Сомова Л.М., Плеханова Н.Г., 2006). Пове­ дение оксида азота в этой ситуации связано с его быстрой реакционной способ­ ностью и цитотоксичностью, которую он проявляет в отношении бактерий, грибов или опухолевых клеток. Влияние оксида азота потенцируется супероксидными группами (О2) и образованием пероксинитритов (ONOO-). Последние, в свою очередь, распадаются на высокореактивные свободные радикалы OH^ и NO^2 - окончательные эффекторы токсичности оксида азота, ингибирующие дыхательную цепь митохондрий (Реутов В.П., 2000).

Деструктивное действие оксида азота реализуется через его участие в деаминировании молекул ДНК и потенциацию энергетического дисбаланса клет­ ки. Этот процесс унифицирован во всех типах клеток и сводится к активации поли(А^Р-рибоза)полимеразы, которая катализирует присоединение дополни­ тельных фрагментов ADP-рибозы к белкам-гистонам и ДНК (Сомова Л.М., Плеханова Н.Г., 2006; Pieper A.A. et al., 1999, 2000). Кроме того, оксид азота стимулирует ADP -зависимое рибозилирование глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, следующую за этим инактивацию фермента и нарушение реак­ ций гликолиза (Landis B.N., Lacroix J.S., 2009). Нитроксидзависимое поврежде­ ние ДНК, активация поли(А^Р-рибоза)полимеразы и рибозилирование нуклеи­ новых белков способствуют истощению и гибели патогенных клеток и микро­ организмов также за счет проапоптотического эффекта оксида азота.

Включение оксида азота в структуру воспалительных реакций дополняется его иммуномодулирующим действием. Эта активность опосредована экспрес­ сией iNOS в цитоплазме тучных клеток и эозинофильных лейкоцитов при учакак ^ ^-интерферон, фактор некроза опухоли-^ и интерлейкинов 1, 1^, 4 (Покровский В.И., Виноградов Н.А., 2005;

Weinberger B. et al., 1998; Chung E.Y. et al., 2006; Galli S.J., Tsai M., 2010). Зна­ чительная продукция оксида азота противостоит вазокнстрикторному действию медиаторов воспаления, тормозит выделение гистамина из тучных клеток и за­ пускает апоптоз нейтрофилов. Однако высокие дозы оксида азота могут иници­ ировать прогрессирование эозинофильного воспаления, повреждение эндотелия и альвеолярного эпителия (Невзорова В.А., 1997; Zamora R. et al., 2000). Кроме того, некоторые цитокины (интерлейкины 4 и 10) и глюкокортикоиды обладают супрессивным действием в отношении продукции iNOS и выработки оксида азота макрофагами (Сомова Л.М., Плеханова Н.Г., 2006; Rose-John S., 2003;

Nishimoto N., Kishimoto T., 2004). Для его синтеза в цитозоле макрофагов тре­ буется NADPH^H. Этот же кофермент необходим для экспрессии радикалов кислорода с образованием супероксид-цитотоксической макрофагальной си­ стемы. Последняя конкурирует за оксид азота за овладение одним и тем же коферментом, так как каталаза одновременно ингибирует и синтез оксида азота и амебоцидную активность макрофагов (Estevez A.G., Jordan J., 2002).

Про- и антивоспалительное действие оксида азота можно рассматривать как взаимосвязанные феномены. При патологических состояниях в результате экс­ прессии iNOS, уровень наработки оксида азота резко повышается, достигая критических параметров, при которых его деструктивные эффекты становятся преобладающими. Они реализуются посредством вторичного образования ток­ сических анион-радикалов и пероксинитритов. Избыточная выработка оксида азота может также активировать апоптоз воспалительных клеток (Crosswhite P., Sun Z., 2010). С учетом роли свободных радикалов и оксида азота в развитии апоптоза ведутся активные поиски веществ, способных препятствовать их ток­ сическому воздействию на клетку (Buttke T.M., Sandstorm P.A., 1994;

Muresanu D.F., 2003).

Рассмотренные данные позволяют суммировать основные модуляторные эффекты оксида азота при клеточном повреждении и регенерации к следующим основным механизмам:

^ нормализация микроциркуляции за счет вазодилатации, антиагрегантного и антикоагулянтного действия;

^ бактерицидное действие, как собственное, так и опосредованное пероксинитритом, образующимся в тканях при взаимодействии оксида азота с супероксид-анионом (N 0 + 0 2-= 0 N 0 0 -);

^ индукция фагоцитоза бактерий нейтрофилами и макрофагами;

^ активация антиоксидантной защиты;

^ улучшение нервной проводимости (нейротрансмиссии);

^ регуляция специфического и неспецифического иммунитета;

^ регуляция апоптоза и предотвращение патологического рубцевания.

1.4. Феномен апоптоза Апоптоз (греч. ап^пт^^1^ — опадание листьев) - генетически запрограмми­ рованная естественная гибель клеток. Как основной механизм поддержания гистогенетического постоянства, апоптоз влияет на отбор и элиминацию уста­ ревших или избыточно образованных клеток, сокращает их содержание до фи­ зиологической нормы (Martin S.J., 2010). Апоптоз также вовлекается в меха­ низмы патологической реорганизации клеток в результате цитотоксических эффектов, травмы и воспаления.

В результате апоптоза клетка фрагментируется на отдельные апоптотические тельца, ограниченные плазматической мембраной. Фрагменты погибшей клетки обычно очень быстро (в среднем за 90 мин) фагоцитируются макро­ фагами либо соседними клетками. Морфологически регистрируемый процесс апоптоза продолжается 1-3 часа. Одной из основных функций апоптоза являет­ ся уничтожение дефектных клеток. В многоклеточных организмах апоптоз к тому же задействован в процессах дифференциации и морфогенеза, в поддер­ жании клеточного гомеостаза, в обеспечении важных аспектов развития и функционирования иммунной системы (Сербин М.Е., Щербак Е.В., 2004).

1.4.1. Механизм апоптоза В настоящее время клетки с признаками апоптотической гибели обнаруже­ ны во всех тканях, как в состоянии физиологической нормы, так и при различ­ ных дегенеративных процессах. В любом случае развертывание апоптотической программы носит однотипный характер. Процесс начинается с ядра клеток и вторично в него вовлекаются элементы цитоплазмы (Magno G., Joris I., 1995;

Lossi L., Merighi A., 2003; Ueda M. et al., 2004; Yan N., Shi Y., 2005).

Апоптоз, как всякое явление, имеет не одно, а несколько свойств и склады­ вается из последовательных фаз. Каждая фаза запускается соответствующей генетической программой, которая реализуется через генную индукцию, синтез сигнальных молекул и завершается активацией эндонуклеаз (Deng Y., Wu X., 2000; Dubrez L. et al., 2001; Estevez A.G. et al., 2006). Выделяют начальную, об­ ратимую, фазу апоптоза и конечную, в которой происходят основные морфо­ функциональные изменения клетки (Калиниченко С.Г., Матвеева Н.Ю., 2007).

Для начальных и промежуточных этапов апоптоза характерно большое разно­ образие молекулярных процессов (табл. 1.1). Терминальная фаза, определяю­ щая морфологическую картину, обусловлена общими для всех разновидностей апоптоза процессами и является необратимой.

Факторы, стимулирующие и инактивирующие апоптоз* Медиаторы воспаления (кальций ин­ терлейкины 1, 2, 4, 10, аденозин, про- ста и регенерации, индукторы опухо­ Опухолевые супрессоры, Т- Хелаторы кальция, цинк, белки теп­ лимфоциты, аутоантигены лового шока, циклоспорин А Блокаторы энергообмена, протеинкиСа/Mg-зависимой эндонуклеазы и наз, тирозинкиназ, фосфатаз и синте­ Оксид азота, окислительный стресс, Аденовирусы, вирус герпеса, Каспазы, эндонуклеазы, р53, проте- Протеинкиназа С, Bcl-2, эритропоэтин, андрогены, эстрогены инкиназа А, цитотоксические яды * По Пальцеву М.А. и др., 2003; Матвеевой Н.Ю., 2004, 2006; Green D.R., Reed J.C., 1998; Buki A. et al., 2000; Karnes H.E. et al., 2009; Dubikov A.I., Kalinichen­ ko S.G., 2010; Guan H. et al., 2010.

Апоптоз обычно противопоставляется другой форме гибели клеток - некрозу, который развивается при воздействии внешних по отношению к клетке повре­ ждающих агентов и неадекватных условий среды и проявляется набуханием клет­ ки и разрывом наружной мембраны с в^^ходом содержимого клетки в окружаю­ щую ткань. Если некроз всегда сопровождается высвобождением медиаторов вос­ паления, то апоптоз протекает без лейкоцитарной инфильтрации и перифокального воспаления (Робинсон М.В., Труфакин В.А., 1991; McConkey D.J. et al., 1996).

Существует целый ряд процессов, где клеточная гибель, происходит преимуще­ ственно по типу апоптоза: устранение клеток в раннем онтогенезе, физиологиче­ ская инволюция и уравновешивание митозов в зрелых тканях и клеточных попу­ ляциях, реализация процессов атрофии и регрессия гиперплазии, «альтруистиче­ ский» суицид мутантных и пораженных вирусами клеток, клеточная гибель после слабого воздействия агентов, которые при массивном поражении могут вызывать некроз (Цы^пленкова В.Г., Бескровнова Н.Н., 1996).

Начальные признаки апоптоза заключаются в конденсации хроматина, фрагментации ядра, уплотнении клетки и образовании цитоплазматических вы­ пячиваний. При электронномикроскопическом исследовании выявляется глыбчатый распад хроматина, примыкающего к ядерной мембране в виде дискрет­ ных компактных полулуний (Челышев Ю.А. и др., 2001). Ядро приобретает не­ правильную форму, ядрышко увеличивается в размере, гранулы его укрупня­ ются и рассеиваются. На начальной стадии апоптоза ядро сохраняет функцио­ нальную активность (Kam P.C., Ferch N.I., 2000). Глубокие инвагинации кариолеммы в сочетании с массами краевого хроматина представляют, по-видимому, единственные ранние признаки апоптоза (Dou Q.P., An B., 1998).

Выпячивания клеточной поверхности различной структуры и формы в виде протуберанцев или пузырьков, часто сравнивают с «закипанием» цитоплазмы:

она приобретает пузырчатый вид - блеббинг (Калиниченко С.Г., Матвее­ ва Н.Ю., 2007; Boutillier A.L. et al., 2000). Перед входом клетки в блеббинг об­ наруживается набухание митохондрий, соответствующее стадии открытия пор мембранных каналов и выходу в цитоплазму белков из межмембранного про­ странства (Fan G., Steer C.J., 1999). Эти события ведут к уплотнению органелл, которые, однако, сохраняют свою целостность на всех стадиях апоптоза (Hengarten O.M., 2000).

Наиболее значительные структурные преобразования обнаруживаются в митохондриях. Последние меняют форму, сморщиваются, их внутренняя структура дезорганизуется. При этом кристы меняют свою обычную конфигу­ рацию. На завершающей фазе апоптоза при фрагментации клетки, кристы по­ чти не определяются, а степень уплотнения митохондрий достигает максимума.

Описаны случаи внутриядерной локализации митохондрий в апоптотической клетке (Gibson E.M. et al., 2002). Механизмы перемещения митохондрий в ядро неизвестны. Предполагается, что этот феномен обеспечивает доставку к повре­ жденной ДНК каспазанезависимых активаторов апоптоза, а также переходу в митохондрии ядерных белков, вызывающих открытие пор во внутренней мито­ хондриальной мембране (Marretta R.M., Ales F., 2010).

Финальная стадия апоптоза характеризуется разрушением ДНК, фрагментаци­ ей ядра и распадом клетки на окруженные мембраной плотные фрагменты апоптозные (остаточные) тельца сферической, овоидной или неправильной пузыр­ чатой формы. Одни апоптозные тельца содержат фрагменты ядра, другие - только цитоплазму. Поэтому они выглядят как эозинофильные образования с включением базофильного мелкогранулярного материала. В дальнейшем апоптозные тельца элиминируются макрофагами. Следует подчеркнуть, что на протяжении всех ста­ дий апоптоза лизосомы погибающих клеток инактивированы (Boulares A.H. et al., 2002). При этом макрофаги не инициируют воспалительной реакции.

Факторы, индуцирующие и/или ингибирующие апоптоз, действуют на тран­ скрипцию генов, усиливают или ослабляют общие и специфические функции клетки. К сегодняшнему дню выделено немало разновидностей апоптоза и сдела­ ны попытки их обобщения под видом «апоптоидн^^х форм». Однако и в эти фор­ мы трудно укладывается апоптоз без участия ядра: «классическая» физиологиче­ ская смерть имеет его в качестве главной мишени. Молекулярные сценарии апоптоза запускаются в цитозоле или мембранных органеллах клетки, но реали­ зуются исключительно в ядре через репрессию генов и необратимый процесс межнуклеосомной фрагментации ДНК. Расщепление ДНК катализирует Ca2+/Mg2+-зависимая эндонуклеаза, которая работает на линкерных участках мак­ ромолекулы, поэтому хроматин не подвергается полному лизису, а лишь фраг­ ментируется. Длительность этой стадии варьирует у разных типов клеток и про­ должается в среднем 6-12 часов после индуцирующего стимула (Brakus S.M. et al., 2010). Распад ДНК происходит не одномоментно, а состоит из последовательн^^х этапов разделения молекулы по уровням сложности ее матричной организации.

Сначала формируются крупные фрагменты ДНК, содержащие 250-300 тысяч пар нуклеотидов. Микроскопически этот этап определяется как конденсация хрома­ тина с образованием выпячиваний ядерной мембраны (Домнина Л.В. и др., 2003).

Затем формируются фрагменты из 30-50 тысяч пар нуклеотидов. На последнем этапе происходит расщепление ДНК в участках сцепления нуклеосом и образова­ ние окончательн^^х фрагментов из 180-190 пар нуклеотидов (Brakus S.M. et al., 2010). Следует отметить, что некоторые ингибиторы топоизомеразы II индуциру­ ют апоптоз, вызывая формирование крупных фрагментов ДНК без нарушения межнуклеосомных связей (Бакеева Л.Е., 2003; Oh J.D. et al., 2000).

Апоптоз развивается в результате взаимодействия различных трофических факторов и инициируется генной индукцией, меняющей метаболические условия ближайшего микроокружения (Калиниченко С.Г., Матвеева Н.Ю., 2007;

Karnes H.E. et al., 2009). Этот процесс зависит от баланса трофических веществ (нейротрофический фактор роста мозга, фактор роста нервов, нейротрофин-3 и нейротрофин-4), которые активируют рецепторы внутриклеточных тирозин-киназ подтипов A, B и C и оказывают цитопротективное влияние (Zheng L.A. et al., 2000).

Однако, все трофины при взаимодействии с рецептором p75NTR (из семейства факторов некроза опухолей) запускают механизмы клеточной смерти (Bono F. et al., 1999; Oh J.D. et al., 2000). Необратимую активацию этого процесса опосредуют проапоптотические ферменты - каспазы (Perecko T. et al., 2010). Субстратом активированн^^х каспаз являются белки цитоскелета (Hyman B.T., 2011). Связывание трофинов с рецептором p75NTR неизбежно стимулирует активность каспазы-3 и каспазы-9, что приводит к фрагментации ДНК и протеолизу субклеточных органелл. По этой причине p75NTR часто называют «рецептором смерти» (Brakus S.M.

et al., 2010). В аппарате Гольджи экспрессируется дополнительный индуктор апоптоза каспаза-2, расщепляющая белок гольджин-160. Аппарат Г ольджи является также основным местом синтеза ганглиозида GM3 (Гужова И.В. и др., 2000). При индукции апоптоза GM3 переходит в митохондрии, где вызывает открытие мем­ бранных пор, способствуя выходу апоптогенных факторов в цитоплазму.

Апоптоз, вызванный каспазами, развивается за счет накопления свободных радикалов и, прежде всего, дериватов монооксида азота и ингибирования тка­ невых окислительных систем (Hyun H.J. et al., 2000). Избыточная продукция оксида азота в цитоплазме также стимулирует локальное образование супероксидных ионов, формирующих первичное звено цитотоксического эффекта, и указывает на участие этого соединения в регуляторной связи между энергети­ ческим статусом клетки и запуском ее апоптотической гибели.

1.4.2. Молекулярные факторы апоптоза в условиях физиологической и репаративной регенерации Как известно, воспалительную реакцию вызывают продукты поврежденных клеток. На основе последующей репарации на клеточном и внутриклеточном уровнях обеспечивается обширный диапазон приспособительных механизмов и функциональной активности в меняющихся условиях микросреды, а также вос­ становление и компенсация функций, нарушенных в результате воздействия патогенных факторов (Пальцев М.А. и др., 2003). Физиологическая регенерация не связана с действием повреждающих факторов и осуществляется с помощью апоптоза (Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В., 2002; Ziegler T.R. et al., 2003).

Около десяти лет назад на цитоплазматической мембране был открыт первый специализированный рецептор для индукции апоптоза - Fas-рецептор (FasR), так же называемый Cluster of Differentiation (CD) 95 или APO-1. FasR представлен практически на всех клеточных мембранах (Magata S., Goldstein P., 1995). Этот рецептор принадлежит к суперсемейству фактора некроза опухоли/фактора роста нервов (Boronat M.F. et al., 2001). Описаны его растворимые формы, которые об­ разуются за счет протеолитического расщепления мембранного домена, либо за счет транскрипции мРНК, кодирующей образование белка, соответствующего растворимой форме (Rho J. et al., 2001). Этот растворимый белок связывается с FasR и ингибирует Fas-опосредованный апоптоз (Takenaka K. et al., 1996). При связывании лиганда с рецептором происходит образование комплекса DISC (Death-Inducing Signaling Complex), в результате чего активируется каспаза-8 (Nagata S., 1997). Олигомеризация Fas приводит к наличию в его структуре «домена смерти» (DD - Death Domain), состоящего примерно из 80 аминокислотных остатков (Aizenman E. et al., 1990; Davidson F.F., Steller H., 1998). Другой домен смерти находится во внутриклеточном белке FADD (Fas-Associated Death Domain). Его «эффекторный домен смерти» (DED, Death Effector Domain), инду­ цирует зимогенную форму каспазы-8 с последующей активацией каспазы- (Geng Y.J. et al., 1998). При этом экспрессия FasR бывает снижена или нарушается проапоптическая сигнализация с этих рецепторов (Барышников А.Ю., Шиш­ кин Ю.В., 2002). При экспрессии Fas может провоцировать клетки с FasR к апоптозу и, тем самым, вызывать диффузные поражения (Ashkenazi A.M., Dix­ it V.M., 1998; Venn M.K., Conway E.L., 1998).

Другим важным фактором, индуцирующим апоптоз, является фактор некроза опухоли (TNF - Tumor Necrosis Factor). Семейство TNF включает, по крайней мере, 18 известных членов, из которых два - ^ и ^ - секретируемые цитокины, а остальные - молекулы клеточной мембраны (Робинсон М.В., Труфакин В.А., 1991; Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В., 1996; Botzler C. et al., 1999; Boulares A.H. et al., 2002). TNF^ является продуктом моноци­ тов/макрофагов, эндотелиальных, тучных и миелоидных клеток, клеток нейро­ глии. TNF^ (лимфотоксин ^ ) - производное активированных Т-лимфоцитов (CD4+ и CD8+), был найден в лимфатических узлах иммунизированных крыс (Robertson J.S. et al., 2003). Цитотоксическое действие TNF^ имеет комплекс­ ную природу. Обладая способностью индуцировать апоптоз, TNF^ вызывает образование в клеточной мембране активных форм кислорода, супероксидрадикалов и оксида азота (Boix J. et al., 1998). TNF^ на 28% гомологичен TNF^, существует в виде нековалентно связанного тримера, взаимодействует с теми же рецепторами, что и TNF^. В отличие от TNF^, TNF^ не имеет трансмем­ бранной формы, но может существовать в виде мембранассоциированного комплекса при связывании с лимфотоксином ^. Последний является трансмем­ бранным гликопротеином и известен как р33 (Zheng L. et al., 2000).

Однако TNF^ нельзя рассматривать как безусловный индуктор клеточной гибели. Имеются работы, в которых показано, что он может быть антиапоптозным фактором. TNF^ предотвращал апоптоз, вызванный антииммуноглобулиновыми антителами в клетках лимфомы Беркита линии Ramos (Robertson J.D., 2000; Yuan L., Neufeld A.H., 2000). Предполагают, что его антиапоптозный эф­ фект может быть связан с активацией одного из ключевых факторов тран­ скрипции - NF-^B, т.е. с перманентной продукцией короткоживущих ингиби­ торов апоптоза (d’Acquisto F. et al., 2001; Feng Z.W. et al., 2003).

Известен еще один член семейства TNF - TRAIL (TNF-related apoptosisinducing ligand), который экспрессируется на лимфоцитах и также способен ин­ дуцировать апоптоз. Другой член семейства - CD30-лиганд, взаимодействуя с рецептором CD30, может индуцировать как апоптоз, так и пролиферацию кле­ ток (Orlinick J.R., Chao M.V., 1998).

Однако ключевым моментом в промежуточных и терминальных стадиях апоптоза выступает активация каспаз (caspases - cysteine proteases which cleave proteins after an aspartic acid residue) - цистеиновых протеаз, расщепляющих белки после остатка аспарагиновой кислоты. Данные ферменты существуют обособлен­ но и функционируют как медиаторы сигнала апоптотической гибели (Cohen J.J., 1993; Cohen J.J., Squer M.K., 1997). Каспазы высоко гомологичны по своей амино­ кислотной последовательности и по субстратной специфичности. Каждый член семейства обозначается порядковым номером. Каспазы находятся в цитозоле в виде неактивных предшественников (прокаспаз) с молекулярной массой от 30 до 50 кДа и делятся на подсемейства - ICE (1, 4, 5) и CED-3 (2, 3, 6, 7, 8, 9, 10). Прокаспазы обладают незначительной протеолитической активностью, составляющей 1-2% активности зрел^^х каспаз (Фильченков А.А., 2003; Brakus et al., 2010).

Среди каспаз различают эффекторы - ферменты непосредственно гидроли­ зирующие структурные белки клетки, и индукторы, которые принимают апоптотический сигнал и передают его на эффекторные каспазы. Каспазы при­ сутствуют в клетке конститутивно, что позволяет быстро индуцировать апоптоз (Фильченков А.А., Абраменко И.В., 2001; Chae I.H. et al., 2004). Один из путей активации каспаз связан с взаимодействием индуктора апоптоза со специфиче­ скими рецепторами (например, активация каспазы-8 при взаимодействии Fasлиганда с FasR). Другой путь - активация каспазы-9 в результате образования гетеродимеров белками семейства Bcl-2. Третий путь активации - при помощи гранзима В, способного расщеплять и активировать каспазы. A.H. Boutillier et al. (2000) показано, что каспаза-9 активирует каспазу-3 после связывания с апоптогенными факторами митохондрий и аденозинтрифосфатом; каспаза- образует активные тетрамеры, принимая апоптогенную эстафету от адапторных белков, ассоциированных с «доменами смерти» Fas (Brakus S.M. et al., 2010).

Мишенями каспаз служат цитоплазматические (фодрин, актин, фосфолипаза А2, протеинкиназа С) и ядерные белки. К последним относят ламины (ком­ поненты ядерного скелета), ферменты репликации и репарации (топоизомеразы, poly(ADP-ribose)polymerase ДНК-зависимая протеинкиназа); регуляторные белки (рRb), гистон Н1 и ряд других белков, в том числе ферменты и ингибито­ ры, задействованные в клеточном гомеостазе (d’Amours R.H. et al., 1998;

Culmsee C. et al., 2005). Установлено, что активированная каспаза-6 расщепляет ядерный ламин А, связанный с кариолеммой и организующий структуру хро­ матина (McKinnon C.J. at al., 2002). Разрушение ламина приводит к конденса­ ции хроматина и способствует прикреплению его к внутренней поверхности ядерной мембраны с последующей ее деструкцией.

Описанные механизмы активации апоптоза будут неполными без учета комплексного действия молекулярных факторов, запускающих и ингибирую­ щих его при экзогенном повреждении. В настоящее время они выделены и оха­ рактеризованы как целое семейство генов и регулирующих актив­ ность пролиферации и апоптотической гибели соответственно (Atug F. et al., 1998; Vousden K.H., 2000; Karnes H.E. et al., 2010).

Ген (B-cell lymphoma/leukemia 2) впервые выявлен при исследовании транслокации t (14;18), характерной для фолликулярн^^х лимфом и в настоящее время является предметом активного изучения (Adams J.M., Cory S., 1998; Flusberg et al., 2001). В норме он локализован на полосе q21.3 18-й хромосомы челове­ ка. В 1990 году б^^ли получены моноклональные антитела к белку Bcl-2 (Hockenberry D.M. et al., 1990). Bcl-2 является интегральным мембранным протеином с молекулярной массой 25 кДа, который локализован в ядерной оболочке, на глад­ ком эндоплазматическом ретикулуме (на цитозольной стороне), в мембране мито­ хондрий. Этот белок обнаружен в митотическом ядре. Максимальная экспрессия Bcl-2 наблюдается в профазу и метафазу, уменьшается в телофазу и не обнаружи­ вается после разделения клетки на две дочерние. Недавние исследования показа­ ли, что Bcl-2 входит в состав ядерной поры, что может определять его функции в регулировании ядерного транспорта (Cheng T.H. et al., 1997; Boronat M.A. et al., 2001). Делеции трансмембранного домена уменьшают или полностью исключают способность Bcl-2 ингибировать апоптоз. Растворимая форма Bcl-2 взаимодей­ ствует с другими белками этого семейства, особенно с белками-ингибиторами апоптоза, нейтрализуя их эффект. Удаление трансмембранного домена у Вах предотвращает связывание этого белка с мембраной митохондрий, полностью устраняя его цитотоксичность (Makin G.W. et al., 2001).

Ключевой мишенью анти- и проапототических сигналов являются митохон­ дрии (Hegde R. et al., 2002; Brakus S.M. et al., 2010). Так, большая часть белка Bcl- своими гидрофобными основаниями прикрепляется к их наружной мембране.

Происходит это в местах сближения внутренней и наружной мембран, где физио­ логически существуют пермеабилизационные поры, называемые мегаканалами с диаметром до 2 нм. Эти поры функционируют как сенсоры для многих физиоло­ гических сигналов и таким образом передают информацию о метаболических процессах, происходящих в клетке (Deng Y. et al., 2002). Митохондрии, в котор^^х образовались большие (^2,9 нм) поры, освобождают протеазу AIF, способную ак­ тивировать каспазо-3-подобную протеазу. Появление AIF, а также цитохрома С, в цитоплазме является одним из факторов, запускающих апоптоз (Birbes H. et al., 2002). Происходящее при этом повышение проницаемости мембран митохондрий имеет еще одно следствие - падение трансмембранного потенциала, обусловлен­ ное увеличением проницаемости внутренней мембраны вследствие образования гигантских пор. К образованию пор может приводить действие церамидов, оксида азота, каспаз, амфипатическх пептидов, жирных кислот (Ferri K., 2000).

Вероятно, выживание или гибель клетки определяется соотношением белков Bcl-2 и Вах. Белок Вах на 45% гомологичен Bcl-2 и содержит константные обла­ сти ВР1, ВР2 и ВР3 дополнительно к С-концевому трансмембранному домену (Tsuruta F. et al., 2002). Для индукции экспрессии гена необходимо присут­ ствие функционально активного р53, так как промоторный участок содержит элементы, узнаваемые р53 (Лукьянова Н.Ю. и др., 2000; Gilmore A.P. et al., 2000).

В настоящее время сложилась целостная концепция, рассматривающая процесс программированной гибели как результат активации генетической программы самоуничтожения клеток при непосредственном воздействии на бе­ лок р53 (Bristow R.G. et al., 1996; Deng Y., Wu X., 2000). Повреждения, возни­ кающие в геноме, индуцируют ответ со стороны клетки, который включает в себя три типа реакций: задержка прохождения по циклу, репарация ДНК, ги­ бель клетки по механизму апоптоза (Галицкий В.А., 2003). Все эти три реакции находятся под «патронажем» гена относящегося к семейству генов су­ прессоров опухолевого роста (Zhao J. et al., 2000).

Белок р53 является конститутивным, функционально активным в виде тетра­ мера. Содержание его в клетке мало благодаря высокой скорости распада: время жизни белка не превышает 2 часов. По некоторым данным, полупериод жизни p составляет 5-20 мин (Yamaguchi N. et al., 2002). Предполагается, что ген р53 не обязателен для выполнения нормального клеточных функций. В то же время он чрезвычайно важен при стрессовых ситуациях, связанных с возникновением по­ вреждений. За что его называют «хранителем генома» (Фильченков А.А., Абра­ менко И.В., 2001; Nakano K., Vousden K.H., 2001). Повреждение ДНК приводит к возрастанию уровня белка р53 (Lewis R.W. et al., 2002). В клетке он существует в виде трех форм: латентной, активированной, апоптической. Считается, что одним из механизмов поддержания белка в латентной форме является его изоляция в ци­ топлазме (Лукьянова Н.Ю. и др., 2000). Перемещение р53 из цитоплазмы в ядро после повреждения ДНК ослабляет трансляционную репрессию. Предполагается, что подъем р53 до апоптического уровня достигается либо путем дальнейшей мо­ дификации активированной формы, либо за счет формирования сигнала, увеличи­ вающего активность белка выше порогового уровня (Dubrez L. et al., 2001). Акти­ вированный р53 одновременно осуществляет индукцию транскрипции генов время идентифицированы другие члены семейства р53, среди которых первым гомологом является р75. Его близкое сродство прослеживается на уровне первич­ ной структуры белка, особенно в центральном домене, ответственном за связыва­ ние с ДНК (Meier P. et al., 2000).

Рис. 1.7. Последовательность взаимодействия молекулярных факторов при запуске и инактивации апоптоза (Buki et al., 2000; Brakus et al., 2010).

Цитохромом С (cyt-c) в^^ходит в цитозоль, связывается с адаптерным белком Apaf-1 (apoptotic protease activating factor 1) и напрямую активируют каспазы 9 и 3. Далее в действие всту­ пает Ca2+/Mg2+-зависимая эндонуклеаза и процесс перемещается в ядро, где формируются эффекторные звенья апоптоза. Белок р53 ингибирует гены протеинов семейства Bcl-2 и ак­ тивирует гены белков семейства Bax. Длительно сохраняющий высокую активность р начинает стимулировать гены, запускающие апоптоз, одновременно ингибируя антиапоптозные гены и вызывая повышение проницаемости митохондриальной мембраны через экспрес­ сию Smac (митохондриальный белок, потенцирующий апоптоз через активацию каспаз и блокировании Bcl-2). PUMA (p53 upregulated modulator of apoptosis) - активатор апоптоза.

Митохондриальные поры закрывает белок Bcl-2, тем самым препятствует в^^ходу цитохрома С в цитозоль. IAPs (inhibitor apoptosis proteins) - группа белков, ингибирующих апоптоз.

Альтернативный выбор между генетическими программами апоптоза и антиапоптозной защиты определяет недостаточность трофического обеспечения, что также влияет на механизмы некротических и репаративных реакций (Сладкова Л.В. и др., 2000; Contestabile A., 2000). Учитывая, насколько сложным с точки зрения патофизиологии является процесс гибели клеток, включающий самые раз­ ные биохимические механизмы, есть основания полагать, что воздействие на эти механизмы может дополнительно повлиять на выживаемость клеток.

Таким образом, развитие апоптоза определяется балансом сдерживающих и активирующих факторов (рис. 1.7). Важно подчеркнуть, что идентификация экспрессии Bcl-2 и р53 при иммуноцитохимических исследованиях коррелиру­ ет с чувствительностью клетки к апоптозу: в процессе селекции они экспресси­ руется на низком уровне, а после созревания их экспрессия меняется и зависит от степени воздействия повреждающего агента (Flusberg D.A. et al., 2001). Этот факт дает возможность диагностики локализации Bcl-2 и р53 и, тем самым, достоверной оценки готовности клетки к вступлению в апоптоз.

1.5. Межклеточные мессенджеры в регуляции репаративных процессов и апоптоза Пути генетической регуляции апоптоза допускают возможность развития процесса в клетках, лишенных ядра, в условиях блокады синтеза белка, а также в изолированных ядрах находящихся вне клеток (Dubrez L., 2001). В связи с этим, события в ядре рассматриваются как важнейшие, но не обязательные для реализации апоптоза (Лушников Е.Ф., Абросимов А.Ю., 2001; Sloviter R., 2002).

На основании последних исследований можно утверждать, что отдельные компартменты клетки автономны в отношении апоптоза, а его эффекторы консти­ туционно экспрессированы в каждой клетке, при этом контроль над их актив­ ностью может осуществляться с помощью внутри- и межклеточных сигналов и дисфункции трофического обеспечения (Han S. et al., 2001).

Смерть клетки происходит через определенный промежуток времени. Так, процесс травматического повреждения клеток завершается в течение несколь­ ких минут, а воспаление и апоптоз развиваются в последующие часы и дни (Ribeiro-Resende V.T. et al., 2009). Цитопротекцию определяют как непрерыв­ ную адаптацию клеток к новым функциональным условиям. Она включает раз­ нообразные механизмы, направленные против факторов агрессии, в то время как репарация характеризуется постоянными процессами регенерации в случа­ ях естественных либо патологических повреждений (Пальцев М.А. и др., 2003;

Neary J.T., Zimmermann H., 2009). Трофическая функция определяет процессы пролиферации, миграции, дифференциации и выживания. Абсолютная сторона процесса определяет механизмы, вызывающие активацию ДНК и проявляющи­ еся усилением репаративного белкового синтеза. С другой стороны, механиз­ мы, вызывающие в итоге преимущественную активацию процессов в мембра­ нах, цитозоле и цитоплазматических органеллах, блокируют клеточную смерть и параллельно индуцируют появление репаративных молекул и межклеточных мессенджеров. Описанные процессы преимущественно контролируются тро­ фическими факторами и трофноподобными молекулами, а относительные свя­ заны с блокаторами ионных каналов, агонистами и антагонистами определен­ ных рецепторов, ловушками свободных радикалов и хелаторами металлов (Muresanu D.F., 2003). Все эти защитные механизмы могут быть естественными или фармакологически активированными. Они переплетены между собой и вместе инициируют как сохранение, так и регенерацию ткани.

В настоящее время совершенно ясно, что список механизмов клеточной смерти не является полным. Термин «активная клеточная смерть» был предло­ жен для обозначения варианта гибели клетки, при котором активируются внут­ риклеточные механизмы, в то время как термин «пассивная клеточная смерть»

призван сменить устаревшее понятие «некроз» (Sloviter R., 2002; Muresanu D.F., 2003). Некроз может быть вызван почти всеми патологическими воздействиями (включая физические, химические и биологические). Последовательность со­ бытий здесь всегда одинакова: осмолизис, вызванный клеточным отеком, при­ водит к пассивной смерти поврежденной клетки. Одним из вторичных его эф­ фектов является воспаление, вызываемое высвобождаемым клеточным содер­ жимым и сопровождающееся выработкой цитокинов. При травматическом по­ ражении или деафферентации, а также при многих медленнотекущих дегенера­ тивных заболеваниях, пусковыми моментами являются образование свободных радикалов и многочисленные процессы, приводящие к апоптотическому по­ вреждению. В случае некроза высвобождение клеточного содержимого оказы­ вает мощный провоспалительный эффект. Однако имеются доказательства, что воспалительные клетки и медиаторы могут успешно участвовать в процессах восстановления и выздоровления. Трофические и ростковые факторы влияют на жизнедеятельность клеток, регулируют воздействие на этот вид клеточной смерти, формируя, таким образом, важнейший протекторный механизм (Muresanu D.F., 2003). Возможность перехода апоптоза в некроз (апоптознонекротический континуум, апонекроз) недостаточно изучена, и это является предметом более широкого анализа проблемы.

Цитокины, факторы роста и их рецепторы - трансмиттеры межклеточн^^х вза­ имодействий. Они представляют собой эндогенные полипептиды, являются иде­ альными претендентами на роль корректоров повреждения, так как обладают нейропротективными, репаративными и пролиферативными свойствами (Хаитов Р.М. и др., 2000). Впервые они б^^ли описаны как низкомолекулярные фак­ торы, обусловливающие взаимодействие клеток иммунной системы. Эти медиато­ ры, секретируемые лимфоцитами и моноцитами, получили названия «лимфокины»

и «монокины» (Dinarello C.A., 1991; Muresanu D.F., 2003). Позднее б^^ло обнаруже­ но, что помимо иммуноцитов и другие клетки способны секретировать подобные или идентичные белковые медиаторы. В 1974 году для обозначения этих молекул б^^л предложен общий термин «цитокины» (Казначеев К.С., 1999; Arends M.J. et al., 1990). Рецепторами для цитокинов являются трансмембранные белки, лишенные протеинкиназной активности. Они способны приобретать эту активность путем взаимодействия с цитоплазматическими протеинтирозинкиназами Src-семейства (Heldin C.H., Westmark B., 1990). Через эти протеинкиназы цитокины осуществляют свои регуляторные функции (Робинсон М.В., Труфакин В.А., 1999).

Цитокины не всегда секретируются в свободном виде. В некотор^^х случаях они могут экспрессироваться на поверхности стимулированных клеток в виде мембранассоциированных молекул (Vilcek J., 2006). Однако независимо от того, секретируются они или только экспрессируются, цитокины обладают общим свойством - регулируют пролиферацию и дифференцировку клеток при связыва­ нии со специфическими рецепторами (Хаитов Р.М., 2000). Цитокины действуют, в основном, на пара- и аутокринном уровне или, подобно гормонам, - на клетки, удаленные на значительное расстояние (Heldin, Westmark, 1990). Эти дистантные эффекты выявлены только для 4 цитокинов: TNFa, интерлейкинов 1 и 6 и колони­ естимулирующего фактора макрофагов при тяжелой системной патологии типа септического шока (Фильченков А.А., Стойка Р.С., 1999).

Следует отметить, что роль цитокинов в регуляции апоптоза далеко не одно­ значна. Эффект зависит от вида цитокина, от типа клеток, на которые они воздей­ ствуют, от состояния их дифференцировки. Цитокины также могут играть роль в модуляции уровня эндогенных стероидов. Показано, что апоптоз можно вызвать не только путем введения экзогенн^^х стероидов, но и изменяя эндогенный уро­ вень гормонов. Использование цитокинов и ростов^^х факторов представляет со­ бой один из подходов к патогенетической терапии, особенно в онкологии (Vitetta E.S. et al., 1989; Muegge K., Durum S.K., 1990). Биологические эффекты цитокинов зависят от уровня их секреции и экспресиии соответствующих рецепто­ ров на клетках-мишенях. Важно подчеркнуть, что биологический эффект не явля­ ется свойством цитокина, а определяется характером рецептора для данного цитокина (Gonda T.J., d’Andera R.J., 1997). Большинство цитокинов секретируется не постоянно, а в ответ на воздействие антигенных, митогенных или других стиму­ лов. Получены данные о существовании ингибиторов, способн^гх снижать актив­ ность определенн^гх цитокинов (Akira S. et al., 1990; Sporn M.B., 1997). Если влия­ ние цитокинов на дифференцировку и пролиферацию клеток изучено довольно хорошо, то данные по их действию на апоптоз появились позднее. По мнению ря­ да авторов, роль цитокинов в регуляции апоптоза далеко не однозначна: эффект зависит от вида цитокина и от типа клеток, на которые он воздействует (Робин­ сон М.В., Труфакин В.А., 1991; Фильченков А.А., 1999, 2001; Cohen J.J., 1993).

Наиболее активными участниками в процессах апоптоза являются факторы роста, причем, среди них есть как его индукторы, так и ингибиторы (Клюшник, 1999). В начале 90-х годов ХХ века был описан целый ряд полипептидных фак­ торов роста, объединенных в группу трофических регуляторных субстанций, отличных по ряду характеристик от гормонов (Clark-Lewis I. et al., 1991). Эти факторы подобно гормонам обладают широким спектром биологического воз­ действия на клетки: стимулируют или ингибируют митогенез и дифференцировку, изменяют подвижность клеток и структуру их цитоскелета (Waring P. et al., 1991). В отличие от классических гормонов, факторы роста продуцируются неспециализированными клетками и обладают, как и цитокины, эндокринным, паракринным и аутокринным действием (Strasser A. et al., 2000). Кроме того, существует еще один способ действия факторов роста, который получил назва­ ние интракринного взаимодействия. Факторы роста при этом не секретируются и не нуждаются в поверхностных рецепторах. Они остаются внутри клетки и действуют как внутриклеточные мессенджеры, регулируя клеточные функции (Damjanov, 1996). К таким факторам относятся интерлейкин- 1, основной и кис­ лый фактор роста фибробластов, тромбоцитарный фактор роста (Козинец Г.И.

и др., 1982). Для подобных регуляторных белков, обладающих интракринным действием, необходимы сигнальная последовательность и внутриклеточная ло­ кализация (Soiampornkul R. et al., 2008).

В последние годы выделено и описано множество новых факторов роста, которые разделяются на семейства инсулиноподобного фактора, фактора роста фибробластов, трансформирующий фактор роста в, колониестимулирующий фактор, тромбоцитарный фактор роста, эпидермальный фактор роста, фактор рота нервов и другие (Riccio E.K. et al., 2002). Два последних фактора отнесены к активаторам апоптоза. Помимо них существуют факторы роста, пока не отне­ сенные к какому-либо семейству.

Рецепторы факторов роста - крупные трансмембранные гликопротеины, состо­ ящие из трех основных доменов: внеклеточного лигандосвязывающего, короткого трансмембранного и обширного цитоплазматического тирозинкиназного (Attisano L., Wrana J.L., 2002). Связывание фактора роста с рецептором вызывает его димеризацию или олигомеризацию и резкое усиление тирозинкиназной актив­ ности, направленной прежде всего на фосфорилирование тирозинов^^х остатков самого рецептора, а затем и других белков^^х субстратов (Mendelsohn J. et al., 2001).

При этом фосфотирозиновые участки рецептора становятся активными центрами для доменов многих сигнальных белков. Связываясь с рецепторами, они активиру­ ются и могут запускать работу сигнальн^^х путей апоптоза (Dennis W.C., 1996).

В регуляции апоптоза важная роль отводится фосфорилированию трофиновых рецепторов по тирозину, в котором принимают участие Ras-белки. Много­ численные исследования подтверждают роль этих белков как ключевых медиа­ торов в передаче сигнала со стимулированного рецептора (например, рецепто­ ры для цитокинов и ростовых факторов). Увеличение уровня Rasгуанозинтрифосфата осуществляется при действии различных экстраклеточных стимулов. Главная функция всех рецепторных протеинтирозинкиназ состоит в запуске так называемых Ras-зависимых сигнальных путей, связанных с актива­ цией продукта протоонкогена Важную роль в этом процессе играет адаптерный белок Grb2, содержащий два SH3 -домена и один SH2-домен и не обла­ дающий собственной ферментативной активностью. Он связывает Ras-белки с тирозинкиназным доменом рецептора (Vos M.D., 2000).

В начале 90-х годов прошлого века в молекулах цитоплазматических протеинтирозинкиназ обнаружили обособленные некаталитические домены длиною в 100-150 аминокислотных остатков, способные избирательно и с высокой аффин­ ностью связываться с фосфотирозиновыми участками мембранных рецепторов и других сигнальных белков. Они названы доменами Src-гомологии SH2, так как находятся вблизи каталитического домена Src-киназ SH1. Вслед за SH2-доменами б^^ли обнаружены более короткие SH3-домены Src-киназ длиной 50-80 амино­ кислотных остатков, для которых характерна способность связываться с полипролиновыми участками белков мембран и цитоскелета (Белоусова Н.А., 1999).

Новый киназный путь, близкий к МАР-киназному, был открыт при изучении действия некоторых провоспалительных цитокинов, стрессовых агентов и фак­ торов роста. Его конечным звеном является фосфорилирование продукта онко­ гена откуда он и получил свое название Jun-киназного сигнального пути:

Jnk - c-Jun N-terminal kinase, которые также известны как SAPK - stress-activated protein kinase (Yang J. et al., 1998). Оба сигнальных пути, и МАР-киназный, кото­ рый контролирует передачу молекулярного сигнала, предупреждающего апоптоз, и Jnk-путь, который принимает участие в передаче проапоптических сигналов, берут начало от единого общего звена - протеинкиназы, ассоцииро­ ванной с рецептором фактора роста. Этим и объясняется свойство факторов ро­ ста вызывать такие различные, но закономерно взаимосвязанные реакции кле­ ток-мишеней в виде выживания, пролиферации и дифференцировки.

Итак, апоптоз активируется либо внутренними, либо внешними стимулами.

Оба сигнала прямо или косвенно ведут к активации каспаз. Механизмы клеточной смерти имеют четкие различия. Наиболее значимым является временной аспект:

апоптоз в отличие от некроза длится дольше и может протекать годами (Ярилин А.А., 1998; Пальцев М.А., 2002). Тем не менее, гибель клеток иногда имеет од­ новременно черты двух процессов. Разрывы мембран, фрагментация ДНК, характе­ ризующие соответственно некроз и апоптоз, описывались иногда в одних и тех же клетках. Взаимоотношения патофизиологических механизмов и типов клеточной смерти могут быть кратко суммированы следующим образом: травма или иное по­ вреждение, например, воспаление, может приводить и к некрозу, и к апоптозу, в то время как альтерация сигнальной функции трофических факторов индуцирует только апоптоз (Muresanu D.F., 2003; Niidome T. et al., 2006). Наиболее проблемны­ ми остаются данные о времени наступления программированной гибели клеток от начала действия индуцирующего стимула и о динамике апоптоза в период восста­ новления после травмы. Дискутируется также вопрос о зависимости этого процесса от характера самого повреждающего фактора: нарушения иннервации, трофиче­ ской поддержки или травмы. А вместе с тем, решение этих вопросов остается ради­ кальной задачей в разработке средств избирательного управления апоптозом на всех этапах клеточной смерти и репарации поврежденной ткани.

Решение вопросов патогенеза посттравматических синуситов возможно при использовании адекватной лабораторной модели. О необходимости соединения общей патологии с зоологией для создания отдельной отрасли - сравнительной патологии, упоминал еще И.И. Мечников в своих «Лекциях о сравнительной патологии воспаления» (1954). Для изучения посттравматических изменений в слизистой оболочке придаточных пазух носа в рамках данной работы были вы­ браны белые крысы. Как показали результаты собственных исследований и анализ литературных данных, верхнечелюстная пазуха крысы является полно­ ценным анатомическим образованием системы верхних дыхательных путей, а общий план строения ее слизистой оболочки не отличается от такового в гайморовой пазухе человека (Волков А.Г., 2000; Бабияк В.И. и др. 2002; Едранов С.С. и др., 2004; Едранов С.С., 2005).

Важное преимущество выбранных лабораторных животных заключается в том, что они довольно устойчивы к инфекционным заболеваниям и дают боль­ шой приплод. Небольшая масса белых крыс, относительно простое содержание и успешное разведение их в лабораторных условиях позволяют проводить мас­ совые опыты (Западнюк И.П. и др., 1983).

2.1. Экспериментальная модель посттравматического синусита Экспериментальная часть работы выполнена на нелинейных красах-самцах ве­ сом 250-300 г. Травма верхнечелюстного синуса (ВЧС) смоделирована на животных, последствия деафферентации гайморовой пазухи изучены в экспе­ рименте на материале 55 наблюдений. Для контроля использованы данные, по­ лученные при исследовании 10 интактных крыс. Для исключения раздражаю­ щего влияния анестетика на слизистую оболочку воздухоносных путей опера­ ции проводились под общим неингаляционным обезболиванием (внутрибрюшинное введение пентобарбитала, 60 мг/кг). Животные содержались в стан­ дартных условиях вивария, эксперимент выполнен в соответствии с правилами и международными рекомендациями Европейской конвенции по защите позво­ ночных животных, используемых для экспериментальных и научных целей (86/609/ЕС), и правилами проведения работ с использованием эксперименталь­ ных животных (приложение к приказу МЗ СССР № 755 от 12.08.1977 г.).

Моделирование перелома проведено путем однотипной компрессии подглаз­ ничной области животного с усилием 2,4 кг (см. ниже). Для контроля эффектив­ ности повреждения использовали метод визиографии с помощью рентгеновского аппарата Evolution X3000 2C фирмы Asepti с компьютерным датчиком Schick.

Этот визиограф позволяет снизить дозу ионизирующего излучения в 3 раза по сравнению с пленочной рентгенографией, обеспечивает быстроту получения изображения, не требует обязательного фотопроцесса. Чувствительность датчика Schick выше, чем у рентгеновской пленки, что позволяет получать снимки высо­ кого качества в цифровом формате, удобном для измерений (Рабухина Н.А., Аржанцев А.П., 2003). Снимки проводились в горизонтальной и боковой проекциях с экспозицией 0,08 с при показателях на трубке 40 kV и 25 mAs^ После компрессии на визиограммах в горизонтальной проекции определя­ лись множественные повреждения костей лицевого отдела: перелом наружной стенки пазухи, перелом скуловой дуги, перелом верхней челюсти с изменением конфигурации подглазничного канала и компрессией подглазничного нерва (рис. 2.1).