Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего

профессионального образования

«ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ

УНИВЕРСИТЕТ»

МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

На правах рукописи

УДК: 612.015.13:611.33-018.73 Животова Елена Юрьевна

УЧАСТИЕ РЕГУЛЯТОРНЫХ ПЕПТИДОВ В ПОДДЕРЖАНИИ

ТКАНЕВОГО ГОМЕОСТАЗА СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ЖЕЛУДКА

03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Научный консультант:

заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор С.С. Тимошин Хабаровск –

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Регуляторные пептиды как особый класс биологически активных веществ

1.2. Участие опиоидных пептидов в процессах поддержания тканевого гомеостаза

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Характеристика исследуемых веществ

2.2. Характеристика исследуемых клеточных популяций

2.3. Методика проведения экспериментов

2.4. Метод индометацин-индуцированного повреждения слизистой оболочки желудка

2.5. Метод этанол-индуцированного повреждения слизистой оболочки желудка

2.6. Определение площади поражения слизистой оболочки желудка......... 2.7. Гистологическая обработка экспериментального материала................ 2.8. Метод авторадиографии

2.9. Иммуногистохимический метод определения уровня экспрессии Ki-

Иммуногистохимический метод детекции апоптоза

2.10.

Определение гистамина флюориметрическим методом................ 2.11.

2.12. Хемилюминесцентный анализ

2.13. Статистическая обработка экспериментальных данных

ГЛАВА 3. ВЛИЯНИЕ ЛЕЙ-ЭНКЕФАЛИНА И ЕГО АНАЛОГОВ НА

СОСТОЯНИЕ ТКАНЕВОГО ГОМЕОСТАЗА СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ

ЖЕЛУДКА В ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ УСЛОВИЯХ

3.1. Состояние вопроса

3.1.1. Участие синтетического лиганда опиоидных рецепторов даларгина в регуляции физиологических процессов

3.1.2. Участие даларгина в регуляции тканевого гомеостаза

3.2. Влияние лей-энкефалина и его аналогов на процессы синтеза ДНК в слизистой оболочке желудка белых крыс

3.2.1. Влияние пятикратного введения лей-энкефалина Tyr–Gly–Gly–Phe– Leu на процессы синтеза ДНК в СОЖ белых крыс

3.2.2. Влияние пятикратного введения [D-Аla]2-лей-энкефалина Tyr–DAla–Gly–Phe–Leu на процессы синтеза ДНК в СОЖ белых крыс............... 3.2.3. Влияние пятикратного введения НАЛЭ Phe – D – Ala – Gly – Phe – Leu – Arg на процессы синтеза ДНК в СОЖ белых крыс

3.2.4. Влияние пятикратного введения даларгина Tyr – D-Ala – Gly – Phe – Leu – Arg на процессы синтеза ДНК в СОЖ белых крыс

3.3. Влияние даларгина на фоне блокады NOS на синтез ДНК в СОЖ белых крыс………………………………………………………………….. 3.4. Влияние лей-энкефалина и его аналогов на процессы свободнорадикального окисления в слизистой оболочке желудка белых крыс......... 3.4.1. Влияние лей-энкефалина Tyr – Gly – Gly – Phe - Leu на процессы свободнорадикального окисления в слизистой оболочке желудка белых крыс

3.4.2. Влияние [D-Аla]2-лей-энкефалина Tyr–D–Ala–Gly–Phe–Leu на процессы свободнорадикального окисления в слизистой оболочке желудка белых крыс

3.4.3. Влияние НАЛЭ Phe-D-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg на процессы свободнорадикального окисления в слизистой оболочке желудка белых крыс........ 3.4.4. Влияние даларгина Tyr – D-Ala – Gly – Phe – Leu – Arg на процессы свободнорадикального окисления в слизистой оболочке желудка белых крыс

3.5. Влияние лей-энкефалина и его аналогов на процессы свободнорадикального окисления в сыворотке крови белых крыс

ГЛАВА 4. ВЛИЯНИЕ ОПИОИДНЫХ ПЕПТИДОВ НА СОСТОЯНИЕ

ТКАНЕВОГО ГОМЕОСТАЗА СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ЖЕЛУДКА В

УСЛОВИЯХ ПАТОЛОГИИ

4.1. Состояние вопроса

4.2. Механизмы поддержания тканевого гомеостаза при НПВПгастропатиях

4.2.1. Участие центрального звена интегративных систем в поддержании тканевого гомеостаза слизистой оболочки желудка при НПВПгастропатиях

4.2.2. Участие местных факторов в поддержании тканевого гомеостаза слизистой оболочки желудка при НПВП-гастропатиях

4.2.3. Состояние свободнорадикальных процессов при НПВПгастропатиях

4.3. Механизмы нарушения тканевого гомеостаза под влиянием этанола.. 4.4. Современные направления профилактики гастропатий

4.5. Влияние лей-энкефалина и его аналогов на состояние тканевого гомеостаза слизистой оболочки желудка в условиях патологии.......... 4.5.1. Влияние лей-энкефалина и его аналогов на площадь повреждения слизистой оболочки желудка, индуцируемого индометацином................ 4.5.2. Влияние лей-энкефалина и его аналогов на процессы синтеза ДНК в слизистой оболочке желудка животных, получавших индометацин........ 4.5.3. Влияние лей-энкефалина и его аналогов на свободнорадикальный статус в слизистой оболочке желудка и крови животных, получавших индометацин

4.5.4. Влияние даларгина на процессы синтеза ДНК в слизистой оболочке желудка животных, получавших индометацин на фоне блокады NOS.... 4.5.5. Влияние лей-энкефалина и его аналогов на концентрацию гистамина в тканях желудка белых мышей, получавших индометацин... 4.6. Влияние даларгина на тканевой гомеостаз слизистой оболочки желудка при НПВП-гастропатии у больных остеоартрозом

4.6.1. Влияние даларгина на процессы пролиферации слизистой оболочки желудка при НПВП-гастропатии у больных остеоартрозом

4.6.2. Влияние даларгина на процессы апоптоза слизистой оболочки желудка при НПВП-гастропатии у больных остеоартрозом

4.7. Влияние даларгина на тканевой гомеостаз на модели этанолиндуцированного повреждения слизистой оболочки желудка

4.7.1. Влияние даларгина на площадь повреждения слизистой оболочки желудка, индуцируемого этанолом

4.7.2. Влияние даларгина на процессы синтеза ДНК в слизистой оболочке желудка животных, получавших этанол

4.7.3. Влияние даларгина на свободнорадикальный статус в слизистой оболочке желудка животных, получавших этанол

ПРОЦЕССЫ СИНТЕЗА ДНК И СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОЕ ОКИСЛЕНИЕ

В СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКЕ ЖЕЛУДКА

5.1. Состояние вопроса

5.1.1. Система ренин-ангиотензина, ее участие в морфогенетических процессах

5.2. Влияние ангиотензина II на состояние тканевого гомеостаза в различных клеточных популяциях белых крыс

5.2.1. Влияние ангиотензина II на ДНК-синтетические процессы эпителиоцитов слизистой оболочки желудка белых крыс

5.2.1.1. Влияние ангиотензина II на ДНК-синтетические процессы эпителиоцитов слизистой оболочки желудка половозрелых белых крыс

5.2.1.2. Влияние ангиотензина II на ДНК-синтетические процессы в эпителиоцитах желудка новорожденных белых крыс

5.3.1. Влияние эналаприла на состояние тканевого гомеостаза слизистой оболочки желудка в физиологических условиях

5.3.1.1. Влияние эналаприла на процессы синтеза ДНК в слизистой оболочке желудка в физиологических условиях

5.3.1.2. Влияние эналаприла на процессы свободнорадикального окисления в слизистой оболочке желудка животных в физиологических условиях

5.4.1. Влияние эналаприла на состояние тканевого гомеостаза слизистой оболочки желудка при этанол-индуцированном повреждении слизистой оболочки желудка

5.4.1.1. Влияние эналаприла на площадь повреждения слизистой оболочки желудка, индуцированного этанолом

5.4.1.2. Влияние блокады NOS на площадь повреждения слизистой получавших эналаприл

5.4.2. Влияние эналаприла на процессы синтеза ДНК в слизистой оболочке желудка животных, получавших этанол

5.4.3.1. Влияние эналаприла на процессы свободнорадикального окисления в слизистой оболочке желудка животных, получавших этанол

5.4.3.2. Влияние блокады NOS на процессы свободнорадикального окисления в слизистой оболочке желудка у животных, получавших этанол на фоне введения эналаприла

5.5. Влияние ингибиторов АПФ на процессы пролиферации у больных с хроническим гастритом, сочетающимся с артериальной гипертонией..... ГЛАВА 6. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ................. ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АКМ – активные кислородные метаболиты АОРЗ – антиоксидантная антирадикальная защита АПФ – ангиотензинпревращающий фермент АТII – ангиотензин II АТ1, АТ2 – рецепторы ангиотензина ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография ГП – гидроперекиси липидов ИМ – интенсивность метки ИМЯ – индекс меченых ядер НАЛЭ – неопиатный аналог лей-энкефалина НПВП – нестероидные противовоспалительные препараты ПГ – простагландины ПОЛ – перекисное окисление липидов РАС – ренин-ангиотензиновая система РП – регуляторные пептиды СРО – свободнорадикальное окисление СОЖ – слизистая оболочка желудка ХМЛ – хемилюминесценция ЦОГ - циклооксигеназа EGF – epidermal growth factor Erk – extracellular-regulated kinase – mitogen-activated protein (MAP) kinase GRK – G-protein-coupled receptor kinase JNK – c-Jun-N-terminal kinase L-NAME – NG-nitro-L-arginine methyl ester NK-B – nuclear factor kappa B NO – nitric oxide NOS – nitric oxide sinthase cNOS – constitutive NOS iNOS – inducible NOS OGF – Opioids Growth Factor

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Широкое внедрение в клиническую практику эндоскопических методов исследования выявило значительную распространенность эрозивно-язвенных поражений верхних отделов пищеварительного тракта [106, 300]. Нарушения целостности слизистой оболочки желудка (СОЖ) и двенадцатиперстной кишки встречаются от 4 до 20-30% случаев эндоскопических обследований [96, 300], причем в пожилом возрасте частота эрозивных поражений возрастает до 73% [14].

Клиническое и социальное значение нарушений целостности СОЖ определяется не только их широкой распространенностью, но и тяжелыми осложнениями. Эрозивно-язвенные поражения слизистой оболочки желудка являются основной причиной желудочно-кишечных кровотечений, а показатель летальности при этой патологии составляет более 10% [6, 96].

Усугубляет опасность осложнений факт бессимптомного латентного течения эрозивных поражений СОЖ. Более 50% больных, госпитализированных в связи с желудочными кровотечениями, имели бессимптомное течение гастропатии [520, 605].

Этиологические факторы и патогенетические механизмы развития эрозивно-язвенных поражений желудка сложны и многообразны. Острые эрозивно-язвенные поражения желудка чаще всего являются следствием стрессового состояния организма - психогенного стресса, травмы, ожогов, хирургического вмешательства. Эрозивно-язвенные поражения СОЖ у пострадавших с травмами наблюдаются в 24-89% случаев, осложнения острых язв кровотечениями - от 13,8 до 86,3% случаев. Летальность при кровотечениях составляет около 64% [50].

Острые эрозивно-язвенные поражения слизистой оболочки желудка характерны для тяжелой почечной, сердечной, печеночной и легочной недостаточности, для гиповолемического шока [572, 592]. Эрозивно-язвенные поражения желудка выявляют в первые часы пребывания в отделениях интенсивной терапии у подавляющего большинства больных [591].

В качестве причины эрозивно-язвенных поражений СОЖ также называют алкоголь и лекарственные препараты (нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП), кортикостероиды, дигиталис и т.д.). НПВП - самая распространенная группа лекарственных средств, используемых в клинической практике и повседневной жизни [86]. При этом у пациентов регистрируется НПВП-гастропатия с выраженными эндоскопическими и клиническими проявлениями: субэпителиальными геморрагиями, эрозиями, язвами [238].

Эрозии и язвы СОЖ присущи синдрому Золлингера-Эллисона, некоторым эндокринным заболеваниям, болезни Крона. Хронические эрозии СОЖ зачастую являются следствием геликобактерного гастрита [14].

Ранее главной причиной изъязвления СОЖ считали чрезмерную продукцию соляной кислоты желудочного сока. Действительно, у больных эрозивными гастритами и дуоденитами, как правило, кислотопродуцирующая функция желудка повышена [14]. Однако в настоящее время превалирует мнение, что высокий уровень кислотности желудочного сока превращается в повреждающий фактор лишь при снижении защитной способности СОЖ.

Нарушение целостности желудочного эпителия - это ежедневный процесс. В норме восстановление целостности эпителия происходит за 15- мин [663]. Быстрое восстановление целостности СОЖ осуществляется за счет комплекса протективных факторов.

Совокупность компонентов защиты слизистой составляет иерархию.

Первый уровень защиты слизистой представлен факторами, секретируемыми в просвет желудка (бикарбонаты, слизь, поверхностно-активные фосфолипиды, иммуноглобулины и др.). Второй уровень - это собственно желудочный эпителий. При постоянном физическом или химическом повреждении эпителиоцитов их высокий регенераторный потенциал является важнейшим механизмом защиты. Третий уровень - это микроциркуляторное русло слизистой оболочки в сочетании с ее афферентной иннервацией.

Повреждение слизистой через афферентную иннервацию увеличивает кровоток в микроциркуляторном русле, что ограничивает повреждение и ускоряет регенерацию. И, наконец, четвертый уровень - это сторожевые клетки, такие, как тучные клетки и макрофаги, которые способны обеспечить адекватный воспалительный ответ на проникновение чужеродного материала в СОЖ [662].

Несмотря на многочисленность факторов, обеспечивающих защиту СОЖ от повреждения, критическую роль в этом процессе играют простагландины и NO. Эти медиаторы влияют на все компоненты защиты слизистой оболочки желудка: ингибируют секрецию кислоты, стимулируют секрецию бикарбонатов и слизи, повышают кровоток в слизистой, ускоряют процессы репарации. Оба медиатора ингибируют активность тучных клеток и адгезию лейкоцитов к сосудистому эндотелию. Кроме того, они способны действовать как иммуномодуляторы. Супрессия синтеза простагландинов и NO значительно увеличивает чувствительность СОЖ к повреждению. К дополнительным факторам, поддерживающим целостность СОЖ, относят системы кальцитонин-ген-родственного пептида и белков теплового шока [187, 395]. Таким образом, защита СОЖ – это не статический, а динамический процесс [662].

По-видимому, независимо от этиологии, нарушение целостности СОЖ возникает вследствие дисбаланса факторов агрессии и факторов защиты.

Если в отношении язвенной болезни терапевтические подходы разработаны на уровне стандартных рекомендаций, подкрепленных огромным клиническим опытом, то в отношении симптоматических гастропатий такого значительного опыта не существует. Очевидно, что задачей терапии должно быть комплексное повышение устойчивости СОЖ к повреждающим факторам – развитие адаптивной цитопротекции [420].

Имеющиеся в распоряжении клиницистов терапевтические подходы позволяют в той или иной степени корригировать отдельные компоненты патогенетических механизмов, участвующих в нарушении целостности СОЖ. Главенствующим направлением традиционной терапии является применение различных антисекреторных средств (антацидных и антихолинергических препаратов, антагонистов гистаминовых Н2рецепторов, ингибиторов протонной помпы). Антисекреторные препараты в большинстве стран Западной Европы занимают 3-е место по финансовым объемам продаж. Вместе с тем, это направление терапии не всегда достаточно эффективно и зачастую сопровождается выраженными побочными эффектами. Частым осложнением антисекреторной терапии является учащение диареи [427]. Блокаторы Н2-рецепторов способны индуцировать побочные реакции в виде беспокойства, дезориентации, делирия и галлюцинаций; приводить к анафилаксии; отрицательному ино- и хронотропному эффектам, экстрасистолии и атриовентрикулярной блокаде [643, 650]. Нередко длительное использование антисекреторных препаратов приводит к «ускользанию» эффекта: имеет место вторичное повышение кислотопродукции в желудке за счет компенсаторного возрастания уровня гастрина [179].

Синтетический аналог простагландинов Е2 мизопростол обладает цитопротективными и антисекреторными свойствами. Однако многие пациенты вынуждены отказываться от применения этого препарата из-за выраженного побочного эффекта - диареи. Кроме того, показана способность препаратов этой группы увеличивать инвазивность и потенцировать прогрессию роста опухолей [189].

проблемы эрозивно-язвенных поражений СОЖ привели к использованию в лечении целого ряда препаратов: донора окиси азота сиднофарма [73], анксиолитика грандаксина [24]. Сложность патогенетических механизмов нарушения целостности СОЖ определяет либо неизбежность полипрагмазии, либо необходимость поиска новых комплексных лекарственных средств, обеспечивающих поддержание целостности СОЖ. Такие лекарственные средства должны обладать цитопротективным и антиоксидантным микроциркуляцию, нормализовывать вегетативный баланс организма, оказывать седативное влияние на ЦНС. Подобное комплексное воздействие на организм оказывают некоторые регуляторные пептиды.

В последние годы основное внимание исследователей проблемы состояния слизистой оболочки желудка, нарушения ее целостности и пути восстановления было посвящено изучению H. рylori в этих процессах.

Благодаря этому достигнут значительный прогресс в исследовании внутриклеточных и тканевых механизмов поддержания тканевого гомеостаза.

Достаточное внимание уделено оценке РП, имеющих отношение к факторам, точкой приложения которых является гастродуоденальный тракт – гастрину [361], соматостатину [536], трефоиловым пептидам [402], а также факторам инсулиноподобному фактору роста [410].

В литературе приводятся единичные сведения о позитивном влиянии внутрибрюшинное введение коротких пролин- и глицинсодержащих пептидов повышает устойчивость СОЖ к повреждающим воздействиям [142]. Выявлено выраженное противоязвенное влияние пептида семакс (синтетического аналога АКТГ 4-7) на течение поражений СОЖ при эмоциональном стрессе, кислотной модели язвообразования и воздействии НПВП [41]. Адаптационные возможности СОЖ значительно повышают трефоиловые пептиды, продуцируемые слизеобразующими клетками слизистой оболочки желудка [402]. Хорошо известна высокая эффективность синтетического лей-энкефалина даларгина в комплексной терапии язвенной болезни [2, 162]. Проведенное нами ранее клинико-экспериментальное исследование выявило выраженное позитивное влияние даларгина на течение НПВП-гастропатии [140].

В то же время участие регуляторных пептидов, на первый взгляд не имеющих прямого отношения к регуляции тканевого гомеостаза, таких как ангиотензин II, эндотелин, исследовано недостаточно. Так, повышение ангиотензинпревращающего фермента уменьшают повреждение желудка у собак при геморрагическом шоке [255], снижают частоту эрозивно-язвенных поражений СОЖ, индуцированных эмоциональным стрессом [327], приемом НПВП [391]. Использование ингибиторов ангиотензинпревращающего сопровождающейся язвенной болезнью желудка или двенадцатиперстной кишки, приводит к существенной положительной динамике обеих патологий [112].

Хотя по проблеме участия опиоидных пептидов в регуляции многочисленные исследования, механизмы их защитного действия на эпителий слизистой оболочки желудка остаются неясными [21].

свободнорадикальных процессов в поддержании структурного гомеостаза.

Этот вопрос изучен недостаточно и находится в динамическом равновесии.

Трудно не согласиться с мнением Е.Б. Меньщиковой о том, что взгляд на соотношение физиологических и патологических процессов образования свободных радикалов сходен с известной дилеммой «казнить нельзя помиловать», где каждый исследователь сам определяет место запятой [130].

Таким образом, анализ литературы и результаты проведенных предварительных исследований позволяют предполагать участие ряда РП в балансе факторов агрессии и факторов защиты СОЖ. Однако механизмы позитивного влияния одних и негативного влияния других РП остаются малоизученными. Высокая клиническая и социальная значимость проблемы поражения СОЖ, а также перспектива широкого внедрения препаратов на базе различных семейств РП в медицинскую практику определили выбор темы данного исследования.

Цель исследования: изучение характера и закономерностей влияния регуляторных пептидов из семейства опиоидных пептидов и компонентов ренин-ангиотензиновой системы на поддержание тканевого гомеостаза слизистой оболочки желудка в физиологических условиях и в условиях патологии.

Задачи исследования:

Изучить взаимосвязь между структурой и характером влияния лей-энкефалина и его аналогов на процессы синтеза ДНК слизистой оболочки желудка у лабораторных животных в физиологических условиях.

Изучить взаимосвязь между структурой и характером влияния лей-энкефалина и его аналогов на процессы свободнорадикального окисления в слизистой оболочке желудка у лабораторных животных в физиологических условиях и в условиях эрозивно-язвенного процесса.

Изучить характер влияния исследуемых аналогов лей-энкефалина на пролиферативный потенциал слизистой оболочки желудка при индуцированном индометацином эрозивно-язвенном поражении.

Исследовать участие NO-синтазы в реализации протективного действия олигопептидов при индуцируемом индометацином эрозивноязвенном процессе СОЖ.

Оценить общность механизмов гастропротекции даларгина при этанол- и индометацин-индуцированном эрозивно-язвенном процессе.

Изучить влияние даларгина на процессы пролиферации и апоптоза в слизистой оболочке желудка больных остеоартрозом при НПВПгастропатиях.

Изучить характер влияния на тканевой гомеостаз слизистой оболочки желудка компонентов системы ренин-ангиотензина в физиологических условиях.

Изучить характер влияния на тканевой гомеостаз слизистой оболочки желудка компонентов системы ренин-ангиотензина в условиях патологии.

Научная новизна Впервые проанализирована зависимость между структурой ряда химических аналогов лей-энкефалина и их влиянием на процессы пролиферации в слизистой оболочке желудка.

Впервые показано, что высокая биологическая активность аналога лей-энкефалина – даларгина – по отношению к слизистой оболочке желудка определяется сочетанием ряда факторов: повышенной устойчивостью к действию эндопептидаз (наличие D-Ala2), сродства к опиатным рецепторам (наличие Tyr), активацией системы NOS-NO (отличительный фактор – присутствие Arg).

Впервые на основании собственных данных, а также работ, выполненных в лаборатории, и сведений литературы установлено, что добавление к структурной молекуле опиоидного пептида молекулы аргинина существенно увеличивает цитопротективные свойства.

Впервые показано, что нормализация процессов пролиферации и регенерации слизистой оболочки желудка под воздействием даларгина обусловлена сочетанием активации синтеза ДНК, ослаблением процессов апоптоза и оптимизацией свободнорадикального статуса в слизистой оболочке желудка.

Впервые показано, что ингибитор ангиотензинпревращающего фермента эналаприл осуществляет свое протективное действие по отношению к слизистой оболочке желудка за счет способности нивелировать проявления оксидативного стресса, активировать систему NOS-NO и нормализовывать синтез ДНК в слизистой оболочке желудка.

Теоретическая и практическая значимость Экспериментальные сведения о способности даларгина оказывать протективное действие при приеме НПВП получили дальнейшее развитие в клинической практике как метод профилактики и лечения нарушений целостности слизистой оболочки желудка при НПВП-гастропатиях.

Экспериментальные данные о способности эналаприла оказывать нормализующие действие на синтез ДНК позволяют рекомендовать ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента как оптимальное средство в комплексном лечении больных с артериальной гипертонией и сопутствующим хроническим гастритом.

Установленные закономерности влияния регуляторных пептидов на состояние тканевого гомеостаза СОЖ в физиологических условиях и при патологии могут использоваться при планировании направленного синтеза пептидов, обладающих цитопротективными свойствами.

Полученные экспериментальные данные могут быть использованы при подготовке лекционного материала по специальностям патологическая анатомия, патологическая физиология, фармакология в ВУЗах медицинского и биологического направления.

Степень достоверности и апробация результатов.

Степень достоверности результатов проведенного исследования определяется соответствием его дизайна критериям доказательной медицины, анализом и достаточным объемом выполненных наблюдений с использованием современных разноплановых методов исследования.

Примененные статистические методы адекватны поставленным задачам, сформулированные положения, выводы и практические рекомендации аргументированы и логически вытекают из анализа полученных данных.

Основные положения диссертации представлены на VI съезде Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов»

(Новосибирск, 2009), итоговой научно-практической конференции, посвященной 80-летию ДВГМУ (г.Хабаровск, 2010); XI международной научно-практической конференции «Фундаментальные и прикладные промышленности» (г.Санкт-Петербург, 2011); научно-практической конференции ДВГМУ (г.Хабаровск, 2012); XII международной научнопрактической конференции «Фундаментальные и прикладные исследования, разработка и применение высоких технологий в промышленности» (г.СанктПетербург, 2012), научно-практической конференции «Актуальные вопросы патологической анатомии в Хабаровском крае» (г.Хабаровск, 2012), IV Международной научно-практической конференции "Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине" (г.Санкт-Петербург, 2012).

Личный вклад автора.

Планирование экспериментов, анализ материалов, использованных в диссертационной работе, написание статей, написание диссертационной работы выполнены автором лично. Все эксперименты, включая уход за животными, введение исследуемых веществ, морфометрическая оценка повреждения СОЖ, изготовление препаратов для авторадиографического исследования, подготовка проб для оценки процессов свободнорадикального окисления, обработка полученных результатов выполнены автором лично (иммуногистохимические исследования: определение экспрессии антигена Ki-67, реакции апоптоза для TUNEL меченых клеток), к.м.н. Евсеева А.Н.

(описание гистоморфологической картины поражения СОЖ); д.м.н. Лебедько О.А. (метод хемилюминесценции). Проведенные экспериментальные исследования послужили основой для использования даларгина при коррекции НПВП-гастропатий, а также применения ингибиторов АПФ в лечении гипертоний, сочетающихся с хроническим гастритом. Клиническая часть работы (наблюдение, углубленное обследование, включая фиброэзофагогастродуоденоскопию с прицельной биопсией СОЖ) осуществлялась врачами ГБУЗ «Консультативно-диагностический центр»

«Вивея» (к.м.н. Болоняевой Н.А.) и НУЗ «Дорожная клиническая больница на станции Хабаровск - 1 ОАО «РЖД» (к.м.н. Авиловой А.А.). Автором (при иммуногистохимическое исследование биоптатов СОЖ наблюдаемых пациентов.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту Высокая морфогенетическая активность даларгина обусловлена способностью стимулировать синтез ДНК, оптимизировать состояние ослаблять процессы апоптоза.

Благодаря высокой морфогенетической активности даларгин уменьшает язвенно-эрозивные поражения в желудке, индуцированные нестероидными противовоспалительными препаратами и этанолом.

желудка ингибиторами АПФ обусловлено их способностью нормализовать синтез ДНК, оптимизировать процессы СРО и активировать систему NOSNO.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Регуляторные пептиды как особый класс биологически активных веществ Регуляторные пептиды (РП) являются эффективными средствами нейроиммуноэндокринной коммуникации между органами и тканями [1].

Успехи современной пептидной химии во многом революционизировали наши представления о функционировании интегративных систем. Выявление рецепторов РП на нейронах, эндокринных клетках и иммуноцитах, а также доказательства синтеза пептидов в этих клетках позволили сформировать концепцию регуляторного континуума [10, 174]. Одним из главных свойств, присущих регуляторным пептидам, является наличие плейотропии – способности каждого соединения оказывать влияние на несколько физиологических функций. В связи с имеющейся полифункциональностью представляется сложным выделение одной или нескольких основных функций у каждого биорегулятора. Так, сходные по химической структуре РП могут значительно различаться в физиологической активности, и, наоборот, близкие по функции пептиды способны иметь значительные отличия в структурных формулах. Одним из наиболее существенных свойств регуляторных пептидов является их способность к оптимальному и в высшей степени мобильному сочетанию синтеза и/или высвобождения (рилизинга) в нужном месте и в нужное время [174]. Регуляторные пептиды, индуцируя выброс одних или, наоборот, задерживая выработку других пептидных регуляторов, вызывают волну каскадных процессов [10, 165]. Принципы регуляторных каскадов объясняют наличие длительных эффектов короткоживущих пептидов [10, 55].

физиологического процесса, обеспечивая его успешное протекание и координацию с состоянием других систем организма. В настоящее время известно, что в организме млекопитающих содержится около 2000 РП, подразделяющихся на 60-65 семейств [85]. Основной группой РП являются олигопептиды, содержащие в своей структуре от 2 до 50 аминокислотных остатков. Помимо длины аминокислотной цепи, олигопептиды отличаются от белков рядом физико-химических и функциональных особенностей.

Определенная пространственная структура белков стабилизирована многочисленными внутримолекулярными взаимодействиями между аминокислотных остатков и недостаточные для поддержания стабильной пространственной структуры связи олигопептидов позволяют последним проявлять большую конформационную подвижность, а их химическим радикалам изменять пространственное расположение и подстраиваться под специализированные рецепторные структуры [76]. Чаще всего концентрация РП в тканях составляет 10-12-10-9 М, а в нервной системе и желудочнокишечном тракте – 10-8-10-6 М. По мнению И.П. Ашмарина, самой многочисленной и гибкой группой физиологических регуляторов РП стали в связи с тем, что эволюция пептидных регуляторов и рецепторов к ним отличается относительной простотой: в результате точечных мутаций при очень ограниченном числе замен аминокислотных остатков возможно возникновение новых регуляторов с новыми физиологическими свойствами [85]. Большинство регуляторных пептидов образуется из физиологически неактивных белков-предшественников с помощью специфических протеаз, которые в нужный момент «вырезают» необходимую аминокислотную последовательность. Так из одного предшественника может появиться целая группа пептидов, и, напротив, у одного пептида может быть несколько предшественников [102]. Регуляторные пептиды способны вызывать различные эффекты в зависимости от особенностей взаимодействия с клетками, оказывая: а) аутокринное влияние; б) паракринное действие; в) нейроэндокринное дистантное действие; г) нейро-трансмиттерное действие в области синаптических контактов; д) нейромодуляторное действие на специализированных межклеточных контактов [256, 553].

физиологических эффектов РП. Регуляторные пептиды, модулируя функции центральной нервной системы [626], обеспечивают нейропротекцию развивающегося мозга [655]. Они оказывают выраженное ноотропное действие [84], влияют на когнитивную функцию [57, 586]. Нейропептид Y, вазопрессин, субстанция P, холецистокинин, эндорфины, энкефалины, соматостатин участвуют в эмоциональных и ответных реакциях на стресс патофизиологический фактор тревожных расстройств, депрессии, посттравматического стресса, алкогольной зависимости и эпилепсии [263], нейротензин контролирует пространственное обучение [464], соматостатин модулирует моторную и когнитивную функции [586]. Аргинин-вазопрессин распадается в организме на несколько линейных фрагментов (с 4-го по 9-ый аминокислотные остатки), которые обладают ярко выраженным антидепрессивным действием, ноотропной активностью, не уступающей, а зачастую превосходящей активность целой молекулы аргинин-вазопрессина в отношении поведенческих реакций, улучшения обучения, памяти [84].

Средствами, подавляющими пищедобывательное поведение, являются бомбезин [457], нейротензин [422], а нейропептид Y усиливает проявление этой функции [263].

Полифункциональность РП иллюстрируется широким вовлечением различных олигопептидов в антиноцептивный эффект. Кроме опиоидных пептидов, такими свойствами обладают нейропептид Y [588], соматостатин [242], холецистокинин [290].

В регуляцию температурного гомеостаза вовлечены нейротензин [608], бомбезин [27].

Эффекты регуляторных пептидов на сердечно-сосудистую систему многообразны. Аргинин-вазопрессин и ангиотензин играют существенную роль в генезе артериальной гипертензии [454, 653]. Субстанция Р, нейропептид кальцитонин-ген-связанный пептид, предсердный натрийуретический пептид, мозговой натрийуретический пептид и C-тип натрийуретического пептид проявляют кардиопротекторные свойства, регулируя процессы ангиогенеза и гипертрофии миокарда [325].

пептидных групп и их производных показал, что пептиды в широком диапазоне концентраций, а многие даже в ультра малых дозах (менее 10 -12 М) способны активно модулировать сократительную активность лимфатических сосудов, проявляя протекторное и корригирующее действия, устраняя нарушения микроциркуляции, возникающие при различных патологических состояниях [103]. Как нарушение экспрессии нейропептидов, так и дисрегуляция нейропептидных сигнальных путей могут негативно отразиться на гомеостазе сердечно-сосудистой системы [325].

Регуляторные пептиды оказывают воздействие на функциональное состояние желудочно-кишечного тракта, регулируя моторику [601], секрецию, пристеночное пищеварение [297, 315].

При этом пептиды принимают участие в воспалительных реакциях, демонстрируя как долгосрочные энтеропротективные качества, так и при провоспалительный сигналинг [422].

субстанция Р, нейрокинин, брадикинин и эндотелин-1 осуществляют представлять потенциальную мишень для терапевтического вмешательства [234].

Регуляторные пептиды принимают активное участие в модуляции активности иммунокомпетентных клеток [157]. Они регулируют состояние толерантность [492].

Регуляторные пептиды вовлечены в организацию структурного гомеостаза организма, непосредственно влияя на клеточную пролиферацию и апоптоз [263, 656, 668]. Роль регуляторных пептидов в формировании структурного гомеостаза иллюстрируется их участием в развитии неопластических процессов [306]. Активация рецепторов ангиотензина II может способствовать прогрессии некоторых опухолей и образованию метастазов [283, 388]. В свою очередь, ингибиторы АПФ способствуют регрессии опухолевых процессов молочной железы, простаты, легкого [236, 534, 627]. Противоопухолевые свойства демонстрирует соматостатин [228], -эндорфин [537]. В то время как нейротензин [259], субстанция Р [567], вазоактивный интестинальный пептид [652], брадикинин [341], нейрокинин [567] потенцируют туморогенез.

координировать функции организма с целью обеспечения гомеостаза демонстрируют их фрагменты. В качестве иллюстрации представлений об активном участии продуктов метаболизма РП в формировании регуляторного континуума могут служить пролин- и глицинсодержащие ди- и трипептиды.

В условиях иммобилизационного стресса пролин- и глицинсодержащие ди- и антикагулянтно-фибринолитические эффекты в организме, причем наибольшим защитным эффектом обладают дипептиды [105].

Основные системы, ответственные за поддержание гомеостаза, имеют единый механизм химической регуляции. Именно наличие универсального жизнедеятельностью организма, — нервную, эндокринную и иммунную — в единый механизм регуляции функций. Ключевым звеном данного механизма являются продукция и секреция клеточных медиаторов, объединенных общим названием "регуляторные пептиды" [157].

Анализ всех регуляторных программ медиаторов и регуляторных пептидов позволил сформировать представление об информационной сети индуктивных связей эндогенных соединений с круговым и секторальным движением информации. Круговые ребра жесткости подобной конструкции формируют медиаторы, опиоиды, регуляторные пептиды-гормоны. В первую очередь их задача состоит в инициации на разных физиологических уровнях интеграционных процессов для всего организма. Кроме того, за ними сохраняются и специализированные наборы программ. Эволюционные преобразования системы организма могут идти или по пути к определенным и относительно постоянным условиям их функционирования, или по пути приспособления к более изменчивым условиям. Основные принципы общей конструкции системы регуляторных пептидов, медиаторов и других биологически активных веществ предоставляют возможность для любых эволюционно-адаптационных преобразований организма [91].

Таким образом, концепция функционального континуума регуляторных пептидов предполагает множественную зависимость каждой физиологической функции от определенного комплекса РП, с одной стороны, плейотропность действия каждого РП, с другой стороны, а также каскадный характер влияния определенного РП на синтез и выброс других РП.

Регуляторные функции пептидов в организме определяются характером запускаемых реакций, в первую очередь биохимическими каскадами, инициированными взаимодействием определенных регуляторных пептидов со специфическими рецепторами. В итоге конкретный физиологический эффект определяется природой пептида, типом рецептора и его локализацией [56].

Из всех РП семейство опиоидных пептидов наиболее многочисленно и достаточно хорошо изучено. Как и все регуляторные пептиды, представители этого семейства обладают широким спектром биологического действия.

Опиоидэргические механизмы регулируют функции нервной системы. В связи с выраженной антиноциптивной активностью опиоиды представляются эффективными и относительно недорогими аналгетиками [437]. Эндогенная опиоидная система и эндогенные опиоидные пептиды играют важную роль в механизмах эмоционально-поведенческих реакций. Высокоспецифичный лиганд µ-рецепторов эндогенный тетрапептид позвоночных - эндоморфин- (Tyr-Pro-Trp-Phe-Nh2) при системном введении оказывает антидепрессантное и анальгетическое действие [42]. Эндоморфин-2 (Tyr-Pro-Phe-Phe-NH2), наиболее специфичный из известных эндогенных лигандов µ-опиоидных рецепторов, способен влиять на спонтанное поведение животных, вызывая, помимо антидепрессантного, анксиолитический эффект [43]. Эндогенная стресс-индуцированная активация -опиоидных рецепторов сопровождается возникновением депрессии, тревожных расстройств, дефицитом внимания и памяти [328, 519]. Этот факт объясняет применение антагонистов данного типа рецепторов в качестве средств выбора при терапии депрессии и тревожных расстройств [428]. Повышенное содержание казоморфинов влияет на процессы развития опиоидной системы ребенка и может быть причиной нарушений психомоторного развития детей, вплоть до таких тяжелых заболеваний, как аутизм [132].

Опиоидные механизмы обеспечивают контроль пищедобывательного поведения и потребления жидкости [421, 425].

Эндогенные опиоиды являются составной частью интегративной нейроиммуноэндокринной системы, что определяет их участие в иммуновоспалительных реакциях [364].

Модулирующее влияние опиоидов на систему дыхания обеспечивается периферических механизмов В реализации опиоидиндуцированной респираторной депрессии [630] участвуют различные типы рецепторов [381], стимуляция которых может определять снижение частоты дыхания (в связи с увеличением времени вдоха) и возникновение кашлевого рефлекса [472]. Наряду с этим, данные литературы свидетельствуют о стимулирующем влиянии на респираторные процессы агонистов - и µ1опиоидных рецепторов [558].

Энкефалины, динорфины и эндорфины обнаружены в клетках сердца [244]. Идентификация в органах сердечно-сосудистой системы опиоидных специализированных сайтов для «связывания» опиоидов позволяет говорить об опиоидной регуляции сосудистого тонуса, частоты и силы сердечных сопровождается снижением тонического влияния симпатической нервной системы [506]. Внутривенное введение производных эндоморфина вызывает гипотонию и брадикардию у наркотизированных крыс [291].

Регуляция моторной и секреторной активности желудочно-кишечного тракта обеспечивается функционированием энтеральной нервной системы, образованной совокупностью нейронов межмышечного и подслизистого сплетений, структуры которых экспрессируют опиоидные пептиды [350].

Наличие локальной опиоидной системы объясняет функциональную лабильность дигестивного тракта под влиянием экзогенных опиоидных аналгетиков. Мет-энкефалин, лей-энкефалин, -эндорфин, динорфин экспрессируются как кишечными нейронами, так и эндокринными клетками слизистой оболочки [384, 633]. Причем данная экспрессия имеет место на протяжении всей пищеварительной трубки, вплоть до ее дистальных отделов [350, 385, 633].

Опиоидные µ-, - и -подтипы рецепторов локализованы во всех отделах пищеварительного тракта млекопитающих, но их относительное распределение изменяется в зависимости от слоя и отдела [384, 633]. В межмышечном и подслизистом сплетениях тонкого и толстого кишечника широко представлены -опоидные рецепторы [446], однако наибольшую плотность в кишечнике человека (межмышечное, подслизистое сплетения, иммунные клетки собственной пластинки слизистой) имеют µ-рецепторы [633].

определяет эффекты опиоидных пептидов в отношении функциональных ответов желудочно-кишечного тракта. Так, введение µ1-(Lys7-dermorphin), µ2-(Trp4-Asn7-dermorphin) и 2-(D-Ala2-deltorphin II) – агонистов опиоидных рецепторов показало, что угнетение желудочной секреции и опорожнение желудка обеспечены µ2-типом [398]. Активация µ-опиоидных рецепторов медиальной порции ядра солитарного тракта снижает моторную активность желудка и уменьшает внутрижелудочное давление [465]. Прекращение пропульсивной моторики, изменение баланса жидкости и электролитов в ЖКТ как эффект агонистов опиоидных рецепторов на перистальтику тонкого кишечника, является результатом прерывания нейрононейрональной и нейроноэффекторной трансмиссии в структурах энтерального сплетения [384, 571].

Следует подчеркнуть, что эффекты опиодных пептидов определяются не только вовлечением различных субпопуляций рецепторов. Необходимо учитывать видовые реакции желудочно-кишечного тракта и способ введения пептидов. Так, селективные агонисты µ-опиоидных рецепторов при внутрицеребральном, интратекальном, подкожном и внутривенном введении у крыс или мышей уменьшают желудочно-кишечного моторику и транзиторные функции, ингибируют желудочную секрецию и подавляют экспериментально-вызванную диарею. Селективные агонисты -рецепторов, напротив, ослабляют транзиторную функцию ЖКТ только при интратекальном введении. При внутрицеребральном и подкожном введениях -агонисты также не изменяют секреторную функцию желудка, однако демонстрируют антидиаррейные эффекты. При интрацеребральном введении -агонисты не влияют на транзиторные функции гастроинтестинального тракта у крыс и мышей, не изменяют секреторную активность у крыс, но проявляют антидиаррейные эффекты у мышей. Однако агонист -опиоидных рецепторов при периферическом введении способен индуцировать повышение желудочной секреции [539]. При исследовании изолированной ткани из тонкого кишечника человека показано, что µ-, - и -рецепторы участвуют в опиоиод-индуцированной блокаде мышечной активности [384].

Локализация опиоидных рецепторов и их эндогенных пептидных лигандов в пищеварительной трубке и их роль в координации моторики и секреции подтверждает важное значение опиоидных рецепторов в поддержании гомеостаза желудочно-кишечного тракта [629].

Несмотря на эти многочисленные данные, участие опиоидных пептидов в становлении тканевого гомеостаза изучено недостаточно.

Участие опиоидных пептидов в процессах поддержания тканевого гомеостаза Физиологические эффекты опиоидных пептидов, их участие в функционировании регуляторного континуума достаточно представлены в информационном поле. Этим вопросам посвящены монографии [64, 161].

Представление об участии опиоидов в поддержании тканевого гомеостаза являются разрозненными и зачастую не дают представления о характере реакции процессов пролиферации на воздействие лиганда опиоидных рецепторов. Условно их можно разделить на две группы.

Согласно представлениям I. Zagon и его сотрудников, эндогенные лиганды опиоидных рецепторов оказывают ингибирующее воздействие на процессы синтеза ДНК и клеточное деление в различных клеточных способность эндогенных опиоидов в физиологических концентрациях угнетать синтез ДНК в культуре клеток мозга крысы [423]. Они подавляют ДНК-синтетические процессы в клетках глии, ингибируют пролиферацию астроцитов различных отделов мозга [589]. Лиганды опиоидных рецепторов потенцируют снижение количества мРНК µ-опиоидных рецепторов и супрессируют репликацию клеток нейробластомы человека [303, 387].

Агонист -опиоидных рецепторов DADLE в широком диапазоне доз значительно подавляет пролиферативные процессы в культуре дериватов мезенцефальных клеток крыс AF5 центральной нервной системы [289]. При этом возможны как изменения соотношения G(0)/G(1) фаз клеточного цикла [634], так и блокада G1 фазы [289].

Предполагается, что контроль опиоидами пролиферации клеток осуществляется посредством как аутокринных, так и паракринных механизмов [553]. Механизмы негативного влияния опиоидов на ДНКсинтетические процессы могут реализоваться различными путями:

активацией системы инозитолфосфата, G-белка [423] и протеинкиназы С [396]; снижением экспрессии ингибитора циклин-зависимой протеинкиназы эпидермального фактора роста и экстрацеллюлярной сигнал-регулируемой киназы [258].

Следует отметить, что основная часть исследований была проведена на культуре нервной ткани. Однако имеются подтверждения ингибиторных свойств лигандов опиоидных рецепторов и на других клеточных популяциях.

Модифицированные аналоги мет- и лей-энкефалина демонстрируют выраженную антипролиферативную активность в отношении культур клеток грудной карциномы МКФ 7, клеток лимфобластной лейкемии MOLT-4, обладают противоопухолевой активностью к клеткам рака гортани HEp-2 и лимфатических узлов рака прямой кишки [647].

Опиоидный фактор роста (OGF), присутствующий как в нормальных, так и в опухолевых клетках [299], обладает способностью ингибировать пролиферацию, активно участвуя в поддержании тканевого гомеостаза [372].

Это свойство in vitro OGF демонстрирует в отношении анапластического рака щитовидной железы [372], рака яичника человека SKOV-3 [299], гепатоцеллюлярной карциномы человека Нер G2 и Нер 3В [635], а также метастазов в печени рака прямой и ободочной кишки in vivo [258].

Опиоидный фактор роста дозозависимо ингибирует синтез ДНК в культуре клеток RTCFs (фибробластов Тенноновой капсулы хрусталика кролика) [542], подавляет неоинтимальную пролиферацию [505], cнижает активность ДНК-синтетических процессов в поврежденном эпидермисе при восстановлении последнего [632]. В свою очередь, нейтрализация OGF специфическими антителами сопровождается значительным увеличением числа клеток в различных культурах опухолей клеток, представителей более 90% новообразований [672].

Подтверждением вовлеченности опиоидных рецепторов в регуляцию ДНК-синтетических процессов является отмена эффекта при введении антагонистов опиоидных рецепторов. Так, антагонист опиоидных рецепторов налтрексон блокирует морфин-опосредованное снижение экспрессии µопиоидных рецепторов [303]. Кроме того, налтрексон стимулирует синтез ДНК и митотическую активность в культурах клеток: анапластического рака щитовидной железы [372], N115 мышиной нейробластомы, SK-N-MC нейробластомы человека, сквамозной карциномы головы и шеи [634] и HTфибросаркомы человека [671].

О способности морфина и даларгина оказывать ингибиторный эффект на пролиферацию лимфоцитов указывают данные А.А. Зозуля и др. [1990] [79]. Угнетение пролиферации спленоцитов под влиянием морфина отмечается в работе [277, 289]. В регуляции ответа иммуноцитов опиоидами пролиферативные процессы [497].

В литературе представлены многочисленные исследования, свидетельствующие о способности лигандов опиоидных рецепторов стимулировать процессы пролиферации.

При оценке характера влияния опиоидных пептидов на процессы пролиферации в целом ряде случаев используется селективный лиганд мюопиоидных рецепторов – морфин. Следует отметить, что морфин реализует свое влияние на процессы клеточного деления через те же сигнальные пути, что и пептидные лиганды опиоидных рецепторов. При этом возможны механизмы реализации эффектов, присущие непептидным лигандам, в частности, через популяцию µ-рецепторов. Морфин в широком диапазоне доз повышает выживаемость клеток SH-SY5Y нейробластомы после сывороточной депривации. Аналогичные свойства проявляет селективный µагонист DAMGO в культуре корковых нейронов коры мыши, стимулируя процессы Akt-фосфорилирования и фосфатидил-инозитол-3-К-зависимый сигнальный каскад [487]. Морфин оказывает стимулирующее влияние на пролиферацию в культуре клеток глиобластомы человека Т98G [436], способствует опухолевой неоваскуляризации модели рака молочной железы человека на мышах [373].

Дуализм эффектов морфина может быть определен как концентрацией, так и способом введения препарата: хроническое введение высоких доз морфина супрессирует рост опухоли [477], в то время как однократное введение или низкие дозы обеспечивают стимулирующий эффект [674].

Вовлечение µ-опиоидных рецепторов в регуляцию опухолевой прогрессии подтверждается работами [462, 580]. В культуре NSCLC клеток рака легкого, а также в образцах легочной ткани больных мелкоклеточным раком имеет место повышение экспрессии этого типа рецепторов в 5-10 раз.

Ингибирование экспрессии µ-опиоидных рецепторов снижает процесс метастазирования до 75%, их блокада при помощи антагониста опиоидных рецепторов периферического действия метилналтрексона уменьшает прогрессию опухоли до 85% [461].

Следует отметить, что в реализацию эффектов опиоидов вовлечены не только µ-рецепторы. Так, активация -опиоидных рецепторов обеспечивает стимуляцию пролиферативных процессов в культуре нейрональных клеток [672];

апоптотический сигналинг неонатальных кардиомиоцитов [319]. Агонист и -опиоидных рецепторов динорфин повышает пролиферативную активность клеток рака простаты [474]. Cтимуляция пролиферативных процессов мезанглиальных клеток опосредована повышением экспрессии опиоидных рецепторов [478].

Морфин активирует процессы пролиферации в эндотелиальных [440, 480], мезанглиальных [478] клетках. Повышение числа митозов и содержания ДНК в культуре клеток глии, стимуляция пролиферативных процессов и увеличение конечного количества нейронов гиппокампа под влиянием эндорфина отмечается в исследованиях [507].

Эндоморфин-1, эндоморфин-2 и дельторфин in vitro дозозависимо в физиологических концентрациях оказывают стимулирующее влияние на пролиферацию, миграцию и адгезию эндотелиальных клеток пупочной вены человека. Блокада опиоидных рецепторов с помощью налоксона отменяет полученные эффекты [639]. Паракринным влиянием эндогенных опиоидов Кардиопротективные свойства опиоидов (за счет снижения процессов апоптоза кардиомиоцитов) показаны при ишемии и реперфузии миокарда [535].

Анализ литературы, а также результаты исследований, выполненных на базе ЦНИЛ ДВГМУ, свидетельствуют, что влияние лигандов опиатных рецепторов на процессы клеточного деления имеет широкий диапазон.

Суперселективные агонисты µ-рецепторов вызывают угнетение пролиферации в эпителии роговицы и языка [146]. Агонисты µ-рецепторов – дерморфин и ДАГО – угнетают синтез ДНК только в эпителии роговицы [145]. Смешанные µ- и -агонисты (седатин и А17) стимулируют ДНКсинтетические процессы или при увеличении дозы, или при длительном курсе введения [28].

Стимулирующее влияние смешанного агониста опиоидных рецепторов подтверждается работами [135].

Угнетение синтеза ДНК в миокарде и достоверное снижение концентрации цАМФ в тканях сердца новорожденных белых крыс под влиянием однократного введения даларгина и селективного агониста опиоидных рецепторов динорфина (1-13) показано в исследованиях [36, 54].

Повышение ДНК-синтетической активности в миокарде новорожденных крыс под влиянием повторного введения агонистов µ-рецепторов А10 и DAGO продемонстрировано в работах [54, 109]. Однократное и повторное воздействие µ-агониста -казоморфина стимулирует пролиферативные процессы в миокарде новорожденных крыс [107].

Угнетение синтеза ДНК при однократном и его активация под влиянием пятикратного введения лигандов опиоидных рецепторов имеет место в эпителиоцитах и гладких миоцитах респираторного тракта [99].

Причем направленность изменений ДНК-синтетических процессов соотносима с активностью системы NOS-NO и состоянием редокс-статуса ткани [98, 99].

физиологических функций и их потенциальные морфогенетические возможности интересны как с общебиологической точки зрения, так и в прикладном аспекте.

Изучение пептидергической регуляции гомеостаза представляет собой новое научное направление, открывающее большие перспективы в познании фундаментальных механизмов жизнедеятельности и в разработке новых способов коррекции физиологических функций организма с целью профилактики и лечения различных заболеваний [174].

Многообразие свойств регуляторных пептидов предполагает их использование в качестве лекарственных препаратов. Лекарственные средства пептидной структуры привлекают внимание ученых и врачей по всему миру, что объясняется их высокой эффективностью, специфичностью, активностью, и у ряда пептидных препаратов – минимальным количеством побочных свойств [136].

Создание новых лекарственных препаратов на основе синтетических пептидных фрагментов является актуальным для современной биологии и медицины [184]. Терапевтическая эффективность в низких дозах при отсутствии побочных эффектов пептидных препаратов является важным фактором, определяющим необходимость проведения дальнейших разработок и научных изысканий в этой области [136].

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Характеристика исследуемых веществ Исследовали характер влияния лей-энкефалина и его структурных аналогов и представителя семейства вазоактивных пептидов – ангиотензина II на состояние структурного гомеостаза слизистой оболочки желудка в физиологических условиях и при патологии.

В экспериментах были использованы следующие регуляторные пептиды:

Лей-энкефалин - Tyr – Gly – Gly – Phe – Leu [D-Аla]2-лей-энкефалин – Tyr – D-Ala – Gly – Phe – Leu Ангиотензин II: H – Asp – Arg – Val – Tyr – Ile – His – Pro – Pro – OH рецепторов (молекулярная масса – 555,69 а.е.м.).

[D-Аla]2-лей-энкефалин – аналог лей-энкефалина, обладающий повышенной устойчивостью к действию эндопептидаз за счет замены Gly на D-Аla2, лиганд -опиоидных рецепторов (молекулярная масса – 569,71 а.е.м.).

НАЛЭ – структурный аналог лей-энкефалина, не обладающий сродством к опиатным рецепторам (молекулярная масса – 717,92 а.е.м.).

Даларгин – аналог лей-энкефалина, опиодный пептид, смешанный - агонист (молекулярная масса – 733,92 а.е.м.).

Ангиотензин II – октапептид, представитель семейства вазоактивных пептидов (молекулярная масса – 996,27 а.е.м.).

Вещества были синтезированы в лаборатории синтеза пептидов (зав.

использованием классического и твердофазного методов в лаборатории синтеза пептидов кардиологического научного центра РАМН (г. Москва).

Они были гомогенны при контроле методами тонкослойной хромотографии хроматографии). Абсолютное содержание пептидов в сухом веществе составляло не менее 97,5%. Идентификация веществ осуществлялась путем Н-ЯМР спектроскопии высокого разрешения (500 МГц).

лабораторией синтеза пептидов Российского кардиологического научнопроизводственного комплекса МЗ РФ д.м.н., проф. Ж.Д. Беспаловой.

Помимо веществ пептидной природы, в серии экспериментов с применением ингибиторного анализа использовали:

Метиловый эфир NG – нитро-L-аргинина или L-NAME («ICN Biomedicals Inc.», USA) – специфический неселективный ингибитор NOS [628].

Ингибитор ангиотензинпревращающего фермента – эналаприл (Enalapril) – карбоксилсодержащее соединение, активным веществом является эналаприл-малеат («GEDEON RICHTER»).

2.2. Характеристика исследуемых клеточных популяций Объектом исследования служил эпителий пилорического отдела желудка самцов белых мышей (рис. 1), 7-суточных и половозрелых самцов белых крыс. Данный вид эпителия является производным энтодермы.

Слизистая оболочка на своей поверхности имеет углубления – желудочные ямки, куда открываются железы желудка. Устье ямки открывается в полость желудка. Большую часть слизистой оболочки желудка занимают собственные железы, образованные высокоспециализированными клетками.

Существуют основные виды железистых клеток эпителия желудка: главные экзокриноциты, париетальные экзокриноциты, слизистые, шеечные мукоциты, эндокринные и недифференцированные клетки.

Рис. 1. Слизистая оболочка желудка мыши. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 11х Железы состоят из перешейка, шейки и главной части, представленной телом и дном. Как и почти во всех обновляющихся тканях, новообразование в желудке происходит в определенных ограниченных участках – генеративных или стартовых зонах [8, 417]. Пролиферация осуществляется в генеративной зоне, расположенной в шеечном отделе желез и перешейке [296]. На экспериментальных моделях было показано, что шеечные мукоциты можно расценить как недифференцированные эпителиоциты – источник регенерации как секреторного эпителия желез, так и эпителия желудочных ямок [424]. Недифференцированные эпителиоциты продуцируют спазмолитический полипептид, стимулирующий миграцию клеток и реэпителизацию [631]. Между шеечными мукоцитами и главными клетками обнаружены клетки переходного типа, имеющие признаки тех и других гландулоцитов, что позволяет говорить о возможной трансформации шеечных мукоцитов в главные клетки [8, 417].

Разделившиеся клетки перешейка характеризуются способностью к биполярной миграции. Бльшая часть образовавшихся клеток, созревая, мигрирует по боковым поверхностям ямок в сторону просвета желудка, возобновляя популяцию поверхностно-ямочного эпителия. Меньшая часть клеток мигрирует в сторону основания железы [296]. Эти клетки, которые можно назвать стволовыми, дают начало трем основным предшественникам клеток желудка: преямочным, прешеечным и препариетальным клеткам.

Париетальные клетки возникают из клеток предшественников в области шейки железы (либо непосредственно из препариетальных, или, реже, через преобразование преямочных и прешеечных клеток) и редко делятся в дифференцированном состоянии [424]. Главные клетки обновляются, повидимому, за счет своего «камбия» - клеток, расположенных на границе с шейкой железы. Изредка делятся дифференцированные главные клетки, обычно находящиеся ближе к дну железы. В эпителии слизистой оболочки желудка интенсивно обновляются клетки поверхностно-ямочного эпителия, медленнее обновляются париетальные и слизистые экзокриноциты. У грызунов и человека слизеобразующие эпителиальные клетки ямок мигрируют к поверхности желудка в течение 3-4 дней.

2.3. Методика проведения экспериментов лабораторные 7-суточные белые крысы обоего пола, крысы-самцы массой 180-200 г., выращенные в виварии ЦНИЛ ДВГМУ, а также белые мышисамцы массой 35-40 г., полученные ОАО «Дальхимфарм» из центрального питомника лабораторных животных (ЦПЛЖ) Российской академии медицинских наук, отделение Крюково. Животные содержались соответственно «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденным Приказом МЗ СССР № от 12.08.77 г., а также положениям «Европейской конвенции по защите позвоночных, используемых для экспериментальных и иных научных целей». До начала эксперимента с целью исключения феномена «реакции на новизну обстановки» животных наблюдали в течение 7-10 дней [88]. На протяжении всего эксперимента они содержались в виварии при температуре 20-22С, в световом режиме – день – ночь, в клетках площадью 0,6м2, свободном доступе к воде и пище. Все эксперименты проводились в весеннее-летнее время.

Растворы готовились стандартным образом. Введение пептидов осуществлялось внутрибрюшинно в область lig. inguinale из расчета 0,1 мл на 100 г. массы тела в интервале с 1000 до 1100 часов.

Лей-энкефалин и его синтетические аналоги вводились в дозе мкг/кг пятикратно; агиотензин II – в дозе 50мкг/кг и 100 мкг/кг однократно и пятикратно. Доза инъецируемых веществ была выбрана как оптимальная с учетом проведенных экспериментов в лаборатории ЦНИЛ ДВГМУ и анализа данных литературы [94, 98, 146]. В качестве контроля использовали интактных животных, а также животных, подвергнутых инъекции эквиобъемного количества (0,1 мл на 100 г. массы тела) стерильного 0,9% раствора NaCl в соответствующем режиме.

В дополнительных сериях экспериментов (с применением методов ингибиторного анализа) использовались:

Метиловый эфир NG – нитро-L-аргинина или L-NAME («ICN Biomedicals Inc.», USA) – специфический неселективный ингибитор NOS [628], который вводили за 30 минут до инъекции исследуемого пептида в дозе 9,33x10-5 моль/кг [78]. Последующее введение пептида осуществлялось колатерально.

Ингибитор ангиотензинпревращающего фермента – эналаприл (Enalapril) – вводили при помощи металлического зонда орально в виде суспензии в дозе 10 мг/кг в течение 14 дней. По данным литературы доза является оптимальной для проявления влияния препарата на процессы синтеза ДНК в различных популяциях клеток [456, 515].

Эвтаназию животных проводили методом быстрой декапитации предварительно оглушенных животных через 24 часа после заключительного введения исследуемых веществ. Выведение животных из эксперимента соответствовало требованиям «Европейской конвенции по защите позвоночных, используемых для экспериментальных и иных научных целей». Проведение исследований разрешено этическим комитетом ГБОУ ВПО ДВГМУ Миндрава. Всего в экспериментах было использовано животных.

Проведенные экспериментальные исследования послужили основой для использования даларгина при коррекции НПВП-гастропатий, а также применения ингибиторов АПФ в лечении гипертонии, сочетающейся с углубленное обследование, включая фиброэзофагогастродуоденоскопию с «Консультативно-диагностический центр» «Вивея» (к.м.н. Болоняевой Н.А.) и НУЗ «Дорожная клиническая больница на станции Хабаровск - 1 ОАО информированного согласия на участие в эксперименте.

Автором (при консультативном участии д.м.н. Флейшман М.Ю.) наблюдаемых пациентов.

I клиническую группу исследования составили больные остеоартрозом, «Консультативно-диагностический центр» «Вивея». I подгруппа - пациента, получавшие диклофенак в дозе 0,05 г 2 раза в сутки в течение дней. II подгруппа (26 человек) состояла из пациентов, получавших на фоне лечения диклофенаком в течение 28 дней даларгин по 0,002 г. в сутки.

Исследование проводилось до начала лечения и по окончании 28 дней лечения.

II клиническую группу исследования составили больные с умеренной гипертонией, при которой имел место сопутствующий гастрит, проходившие комплексное обследование и лечение в НУЗ «Дорожная клиническая больница на станции Хабаровск - 1 ОАО «РЖД». Больные были разделены на 3 подгруппы. В I вошли 66 пациентов, получавших эналаприл (ингибитор АПФ). Во II – 48 пациентов, получавших лизиноприл (ингибитор АПФ). В III – 22 пациента, получавших амлодипин (блокатор Са-каналов). Контрольную группу составили 12 человек, у которых в связи с диспепсическими Фиброэзофагогастродуоденоскопия (ФГДС) проводилась по общепринятой методике аппаратом фирмы «Олимпус» врачами соответствующих клиник.

слизистой оболочки желудка Варианты методик индометацин-индуцированного повреждения СОЖ отличаются способами введения НПВП, дозами и кратностью воздействия препарата. Возникновение деструкций СОЖ описано при внутрибрюшинном введении индометацина в дозе 30 мг/кг массы животного [378], подкожном введении индометацина (30 мг/кг) [229]. Jiang G.L. et al., [2009] повреждение СОЖ получали путем однократного внутрижелудочного введения индометацина (20мг/кг), растворенного в 4% диметилсульфоксиде [330].

Хотимченко М.Ю. и др. [2007] индуцировали нарушение целостности СОЖ путем внутрижелудочного введения индометацина (60 мг/кг), растворенного в физиологическом растворе [48, 143]. P. Maity et al. [2008] использовал индометацин, растворенный в дистиллированной воде, в дозе от 6 до 48 мг/кг [399]. В результате отработки различных экспериментальных моделей с использованием мышей и крыс, различных доз препарата и кратности его введения наиболее презентативные результаты были получены на подопытных мышах при однократном внутрижелудочном введении индометацина («Вalkanpharma») в дозе 250 мг/кг.

Животные содержались в условиях естественного светового режима, получали стандартный корм и воду ad libitum. Эксперименты проведены в соответствии с «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» [150], а также с положениями «Европейской конвенции по защите позвоночных, используемых для экспериментальных и и ных научных целей». За 24 часа до введения индометацина животным ограничивали доступ к пище с сохранением доступа к воде [498]. Индометацин-индуцированное повреждение СОЖ моделировали путем внутрижелудочного введения индометацина в дозе мг/кг (рис. 2, 3).

Рис. 2. Множественные язвы (желудок белой мыши, 48 часов после введения индометацина, 250 мг/кг). Ув. х Рис. 3. «Целующиеся» язвы (желудок белой мыши, 48 часов после введения индометацина, 250 мг/кг). Ув. х Для оценки протективного действия лей-энкефалина и его аналогов препараты вводили внутрибрюшинно в течение 5 дней в дозе 100 мкг/кг. В последний день курсового введения препарата животным при помощи зонда интрагастрально вводили индометацин в дозе 250 мг/кг. Контролем служили интактные животные, а также животные, получавшие эквиобъемное количество стерильного изотонического раствора хлорида натрия.

Выведение животных из эксперимента осуществляли путем быстрой декапитации с соблюдением методических рекомендаций по выведению из эксперимента и эвтаназии [95] через 48 часов после введения индометацина.

Данное время соответствует наличию максимальных деструктивных изменений в слизистой оболочке желудка.

2.5. Метод этанол-индуцированного повреждения слизистой оболочки желудка Модели этанол-индуцированного повреждения СОЖ отличаются дозами и кратностью воздействия. Внутрижелудочное введение половозрелым крысам 1 мл 50% этанола [334] считают соотносимым с количеством этанола, употребляемым взрослым мужчиной [527], а также достаточным для того, чтобы обеспечить микроциркуляторные нарушения в слизистой оболочке желудка [467] и спровоцировать образование эрозий [369, 523].

внутрижелудочное введение 70% этанола (4 мл/кг массы животного).

Уменьшение количества вводимого 70% этанола до 2 мл/кг массы животного вызывает возникновение умеренно выраженных повреждений [302]. Lee B. et al. [2010] моделировали этанол-индуцированное повреждение СОЖ путем введения в желудок мыши 0,2 мл 60% этанола в 0,3М HCl [229]. Весьма распространенной моделью является зондовое введение мышам и крысам этанола высоких концентраций: 4 мл/кг массы животного 100% («абсолютного») этанола [563], 1 мл 96% этанола половозрелой крысе [460], 0,1 мл 100% этанола на половозрелую мышь [566], 96% этанола (0, мл/мышь) [524]. Учитывая доступные данные литературы, были отработаны различные схемы эксперимента со спиртами разных концентраций на мышах и крысах. Для проведения экспериментов использовали беспородных белых мышей-самцов массой 25-30 г. Животные содержались в условиях естественного светового режима, получали стандартный корм и воду ad libitum. За 24 часа до введения этанола животным ограничивали доступ к пище, с сохранением доступа к воде [566]. Этанол-индуцированное повреждение СОЖ вызывали путем однократного введения 96% этанола ( мл/кг) (рис. 4, 5).

Рис. 4. Прободная язва (желудок белой мыши, 1 час после введения этанола 96%). Ув. х Рис. 5. Деструкции слизистой оболочки желудка (желудок белой мыши, 1 час после введения этанола 96%). Ув. х Для оценки протективного действия препаратов даларгин вводили внутрибрюшинно в дозе 100 мкг/кг в течение 5 дней до введения этанола.

Ингибитор ангиотензинпревращающего фермента вводили в желудок мыши при помощи металлического зонда в течение 14 дней до введения этанола.

По окончании курсового введения препаратов животные при помощи зонда получали этанол (96% 4 мл/кг, внутрижелудочно). В качестве контроля использовали интактных животных, а также животных, получавших эквиобъемное количество стерильного изотонического раствора NaCl.

Выведение животных из эксперимента осуществляли через 1 час после введения этанола путем быстрой декапитации предварительно оглушенных животных. Данное время соответствует наличию максимальных деструктивных изменений СОЖ.

2.6. Определение площади поражения слизистой оболочки желудка Для оценки степени повреждения слизистой оболочки желудка при экспериментально-индуцированных язвах используются различные методики: балльная оценка поражения СОЖ [183], определение язвенного индекса [313, 399], определение степени повреждения у каждого животного и тяжести повреждения в группе [48, 143]. Для определения средней площади дефектов СОЖ мы предпочли методику с использованием компьютерной морфометрической системы «МЕКОС-Ц». После эвтаназии извлеченные желудки вскрывали по большой кривизне, расправляли на предметном стекле. На них наносили 1% раствор флюоресцина и осуществляли определение площади поражения слизистой оболочки желудка. В нескольких сериях экспериментов была использована прямая морфометрия тканей желудка мышей с захватом изображения при малом увеличении. При этом на предметный столик системы «МЕКОС-Ц» мы помещали препарированный желудок мыши. Далее в связи с изменением параметров морфометрической системы «МЕКОС-Ц» была использована методика морфометрии фотографий желудка, выполненных с помещенным в кадр отрезком миллиметровой бумаги, который использовался в качестве эталона единицы длины (площади).

2.7. Гистологическая обработка экспериментального материала Непосредственно после эвтаназии у животных выделяли желудок.

Материал фиксировали в течение 24 часов в фиксаторе (этиловый спирт 70% - 100,0 мл, формальдегид 40% - 5,0 мл, уксусная кислота 92% - 5,0 мл) при комнатной температуре. Далее с целью вымывания формалина материал в течение суток промывали проточной водопроводной водой. После чего кусочки органов постепенно обезвоживались в спиртах восходящей концентрации. По общепринятой схеме осуществлялась проводка по батарее фенолов. После этого фрагменты желудка заключали в парафин (гистовакс) и готовили серийные срезы толщиной 5-6 мкм на микротоме Leica.

2.8. Метод авторадиографии Наиболее точным и объективным показателем состояния процессов пролиферации в целостном организме является уровень синтеза ДНК, для анализа которого использовали метод авторадиографии с 3Н-тимидином [66].

/Метил - Н/-тимидин (удельная радиоактивность 1530 ТБк/моль;

ФГУП «ИЗОТОП», г. Санкт-Петербург) вводили внутрибрюшинно за 1 час до предполагаемой эвтаназии в дозе 0,6 мкКu/г массы тела половозрелым крысам и 1 мкКu/г массы тела половозрелым мышам [66]. Срезы тканей помещали на обезжиренные стекла, депарафинировали в хлороформе и проводили по батарее восходящих спиртов. Выдерживали в термостате при температуре 37С не менее суток. Подготовленные срезы в условиях фотолаборатории, используя фонарь с затененным светом, покрывали эмульсией НИИХИМФОТО и KODAK Autoradiograhpy Emulsion, (Type NTB, for Light Microscope Autoradiograhpy). Для этого ее расплавляли в ультратермостате при температуре 40-42С с добавлением воды в соотношении 1:1 и пластификатора. Эмульсию наносили на препараты тонким слоем с использованием прямоугольной петли из металлической проволоки [66]. После высыхания препараты выдерживали 25-30 дней в светонепроницаемых ящиках при температуре 4-6С. Далее радиоавтографы проявляли при помощи особоконтрастного проявителя Д-19, фиксировали 33% раствором тиосульфата натрия. Время экспозиции подбирали индивидуально для каждой партии препаратов. Стекла тщательно промывали водой, окрашивали гематоксилином Лилли-Майера и эозином.

На препаратах оценивали индекс меченных 3Н-тимидином ядер (ИМЯ, %) и интенсивность метки (ИМ). Меченым считалось ядро, над которым проецировалось не менее 5 треков (рис. 6,7).

пролиферативных процессов, так как характеризует долю клеток популяции, ядра которых находятся в синтетической фазе клеточного цикла. Индекс меченых ядер подсчитывали путем соотношения количества ядер, меченных 3Н-тимидином, к общему количеству ядер и выражали в процентах. Для этого в каждой популяции просматривали 2000-2500 клеток.

Интенсивность метки - это показатель, косвенно характеризующий скорость синтеза ДНК [155]. Для оценки интенсивности метки подсчитывали среднее количество зерен серебра над 50 мечеными ядрами.

генеративных зонах исследуемых тканей на микроскопе Jenalumar, объектив х100, окуляр х 6,3.

Рис. 6. Слизистая оболочка желудка белой крысы. Авторадиография с Н-тимидином, докраска гематоксилином и эозином. Ув. 40х Рис. 7. Слизистая оболочка желудка белой крысы. Авторадиография с Н-тимидином, докраска гематоксилином и эозином. Ув. 90х 2.9. Иммуногистохимический метод определения уровня экспрессии Ki- Для фиксации гастробиоптатов был использован 10% раствор формалина на фосфатном буфере. После фиксации в течение суток препарат промывали в проточной воде, после чего помещали в 70% этанол. По общепринятой схеме осуществлялась проводка по батарее спиртов, растворителей и заключение в парафин.

Иммуногистохимическое определение экспрессии антигена Ki- проводили при помощи иммуногистохимической полимерной технологии Novolink (Polimer Detection System), NovocastraTM. Подсчет вели в продольных срезах желез желудка, удовлетворительных по техническому качеству. Индекс экспрессии антигена Ki-67 рассчитывали как процент позитивно-окрашенных эпителиоцитов после подсчета в среднем 2000- клеток (рис. 8).

Рис. 8. Гастробиоптаты антрального отдела желудка больных, получавших диклофенак. Иммуногистохимическое определение экспрессии антигена Ki-67. Ув. 40х Иммуногистохимическое определение экспрессии антигена Ki-67 было проведено при консультативном участии ведущего научного сотрудника Центральной научно-исследовательской лаборатории ДВГМУ, д.м.н.

М.Ю.Флейшман.

2.10. Иммуногистохимический метод детекции апоптоза Иммуногистохимическую реакцию для детекции апоптоза на серийных парафиновых срезах СОЖ проводили по общепринятой методике с демаскировкой антигенов с помощью протеиназы К (Proteinase K) и набора (ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit) – оба реактива фирмы «Millipore». Выявление продуктов реакции осуществляли с использованием диаминобензидин хромоген субстрата Substrate Kit for Proxidase «VECTOR NovaRED». Результаты иммуногмстохимической реакции для TUNEL меченых клеток оценивались в баллах полуколичественным методом по количеству позитивно окрашенных клеток эпителия желез СОЖ [470].

Ставили негативный и позитивный контроль. Подсчет проводили в продольных срезах желез желудка, удовлетворительных по техническому качеству. Экспрессию апоптоза оценивали после подсчета 2000-2500 клеток (рис. 9).

Результаты реакций по TUNEL выражались в баллах по 4-бальной системе: 1 балл – 5-10% окрашенных клеток, 2 балла – 10-20%, 3 балла – 20балла – более 40% [470, 620].

Рис. 9. Гастробиоптаты антрального отдела желудка больных, получавших диклофенак. Иммуногистохимическая детекция TUNEL меченых клеток.Ув. 40х Иммуногистохимические исследования для детекции апоптоза были проведены при техническом содействии ведущего научного сотрудника Центральной научно-исследовательской лаборатории ДВГМУ, д.м.н. М.Ю.

Флейшман.

2.11. Определение гистамина флюориметрическим методом При проведении данного вида исследований была использована методика флюориметрического определения гистамина по методу [156], принятая в ЦНИЛ ДВГМУ.

Пробы тканей гомогенизировали с 0,4N HClO4, готовили бутанольный экстракт и определяли содержание гистамина в кислотной фазе после обработки ортофталевым альдегидом. Измерение флюоресценции проводили с помощью спектрофлюориметра. Количество исследуемых веществ выражали в мкг на 1 г ткани (мкг/г).

2.12. Хемилюминесцентный анализ Для интегральной оценки процессов свободнорадикального окисления в гомогенатах желудка и сыворотке крови лабораторных животных хемилюминесценции производили на люминесцентном спектрометре «LSB» (Perkin Elmer). Сигнал стандартизировали с помощью встроенной программы «Finlab». Спонтанную и индуцированную Fe2+ ХЛ исследовали по принятому в лаборатории методу [25]. Определяли светосумму за 1 мин спонтанной ХЛ (Sсп), величину которая коррелирует с интенсивностью индуцированной ХЛ, свидетельствующий о содержании гидроперекисей липидов; светосумму (Sинд1) за 2 мин после «быстрой» вспышки, отражающую скорость образования перекисных радикалов липидной природы.

Инициированную Н2О2 в присутствии люминола кинетику ХЛ [9] потенциальную способность биологического объекта к перекисному окислению, и светосумме за 2 мин ХМЛ (Sind2), величина которой обратна активности антиоксидантной антирадикальной защиты (АОРЗ). Полученные результаты, измеряемые в милливольтах, рассчитывали на 1 г влажной ткани или в 1 мл сыворотки и выражали в относительных единицах.

Хемилюминесцентный анализ был проведен при консультативном участии ведущего научного сотрудника Центральной научноисследовательской лаборатории ДВГМУ, д.м.н. О.А. Лебедько.

2.13. Статистическая обработка экспериментальных данных Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью ПЭВМ в модуле Basic statistic программы Statistica 6,0. В каждой серии экспериментов определяли среднее арифметическое значение показателя и стандартную ошибку средней (М±m). Показатели подопытных и контрольных групп сравнивали с использованием t-критерия Стьюдента для независимых выборок. В случае повторных изменений применяли парный tкритерий Стьюдента. Считали, что статистически значимые различия между