«МУЛЬТИФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНЫЕ МИКРОЧАСТИЦЫ ДЛЯ ПЕРОРАЛЬНОЙ ДОСТАВКИ РЕКОМБИНАНТНЫХ ИНСУЛИНОВ ...»

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

имени М.В.ЛОМОНОСОВА

Химический факультет

Кафедра химической энзимологии

На правах рукописи

Печенкин Михаил Александрович

МУЛЬТИФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНЫЕ

МИКРОЧАСТИЦЫ ДЛЯ ПЕРОРАЛЬНОЙ ДОСТАВКИ

РЕКОМБИНАНТНЫХ ИНСУЛИНОВ

03.01.06 – Биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 02.00.06 – Высокомолекулярные соединения Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научные руководители:

д.х.н., в.н.с., профессор ИЗУМРУДОВ В.А.

к.х.н., с.н.с., доцент БАЛАБУШЕВИЧ Н.Г.

Москва –

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Инсулин. Общие сведения

1.1. Структура и физико-химические свойства

1.2. Биологическая активность инсулина

1.3. Биосинтез и регуляция секреции инсулина

1.4. Механизм действия инсулина

Глава 2. Способы доставки инсулина

2.1. Традиционные методы введения инсулина

2.2. Альтернативные методы введения инсулина

2.2.1. Доставка через слизистую ротовой полости

2.2.2. Пульмонарная доставка

2.2.3. Назальная доставка

2.2.4. Трансдермальная доставка

2.2.5. Окулярная доставка

Глава 3. Пероральная доставка инсулина

3.1. Полиэлектролитные системы доставки

3.2.

Защита инсулина от протеолиза

3.2.1. Действие носителя

3.2.2. Ингибиторы протеолитических ферментов

Небелковые ингибиторы

3.2.2.1.

Белковые ингибиторы

3.2.2.2.

3.3. Транспорт инсулина через эпителий кишечника

3.3.1. Мукоадгезия

3.3.2. Захват М-клетками

3.3.3. Трансцеллюлярный путь

3.3.4. Парацеллюлярный путь

ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 4. Материалы и методы

4.1. Материалы и реактивы

4.2. Оборудование

4.3. Методы исследования

4.3.1. Получение микрочастиц с использованием альгината и хитозана

4.3.2. Получение микрочастиц с использованием декстрансульфата и хитозана.......... Турбидиметрическое титрование инсулина декстрансульфатом

4.3.2.1.

Получение микроагрегатов комплекса (инсулин-декстрансульфат)................ 4.3.2.2.

Постадийная адсорбция полиэлектролитов

4.3.2.3.

4.3.3. Включение ингибиторов протеаз в полиэлектролитные микрочастицы............... Включение на стадии образования комплекса (белок-декстрансульфат)........ 4.3.3.1.

Включение на стадии сорбции поликатиона

4.3.3.2.

4.3.4. Характеристика полиэлектролитных микрочастиц

Растровая электронная микроскопия

4.3.4.1.

Конфокальная флуоресцентная сканирующая микроскопия

4.3.4.2.

Оптическая микроскопия

4.3.4.3.

Определение -потенциала микрочастиц

4.3.4.4.

Определение белка

4.3.4.5.

Определение декстрансульфата

4.3.4.6.

Определение хитозана

4.3.4.7.

Определение содержания активного ингибитора протеаз с использованием 4.3.4.8.

трипсина

Определение содержания активного ингибитора протеаз с использованием 4.3.4.9.

химотрипсина

4.3.4.10. Определение содержания активного овомукоида

4.3.5. Высвобождение белков и декстрансульфата из микрочастиц

pH-зависимое высвобождение

4.3.5.1.

Кинетика высвобождения инсулина в модельных средах

4.3.5.2.

4.3.6. Определение формы высвобождения белков из микрочастиц

Гель-хроматография

4.3.6.1.

Высокоэффективная жидкостная хроматография

4.3.6.2.

4.3.7. Изучение факторов, влияющих на активность протеаз

Влияние Ca2+, ЭДТА и декстрансульфата

4.3.7.1.

Влияние микрочастиц

4.3.7.2.

4.3.8. Изучение протеолитической деградации инсулина

Определение активности трипсина

4.3.8.1.

Определение активности -химотрипсина

4.3.8.2.

Деградация белка в модельных средах

4.3.8.3.

Анализ количества недеградированного белка

4.3.8.4.

4.3.9. Определение связывания микрочастицами ионов кальция

4.3.10. Определение связывания микрочастицами муцина

4.3.11. Изучение действия микрокапсулированного инсулина in vivo

4.3.11.1. Определение содержания глюкозы в плазме крови

4.3.11.2. Определение содержания инсулина в плазме крови

4.3.11.3. Изучение на здоровых кроликах

4.3.11.4. Изучение на крысах с диабетом

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 5. Разработка методов анализа полиэлектролитных микрочастиц.................. 5.1. Определение хитозана при наличии белка и полианионов в смеси

5.2. Определение активности протеаз при наличии полиэлектролитов в смеси.............. Глава 6. Инсулинсодержащие полиэлектролитные микрочастицы

6.1. Исследование микрочастиц из альгината и хитозана

6.1.1. Получение микрочастиц из альгината и хитозана

6.1.2. Высвобождение белка из альгинат-хитозановых микрочастиц

6.2. Исследование микрочастиц из декстрансульфата и хитозана

6.2.1. Получение микрочастиц из декстрансульфата и хитозана с инсулином человека

6.2.2. Включение быстродействующих аналогов инсулина

6.2.3. Включение ингибиторов протеаз

6.2.4. Высвобождение белка и декстрансульфата из полиэлектролитных микрочастиц....

6.2.5. Исследование формы высвобождения белков из полиэлектролитных микрочастиц

6.2.6. Мукоадгезивные свойства полиэлектролитных микрочастиц

6.2.7. Са2+-связывающая способность полиэлектролитных микрочастиц

6.2.8. Защитное действие полиэлектролитных микрочастиц от протеолитических ферментов

Глава 7. Исследование биологического действия микрокапсулированного инсулина..

7.1. Исследование сохранения активности инсулина

7.2. Исследование гипогликемического действия инсулина при пероральном введении здоровым кроликам

7.3. Исследование фармакологического действия инсулина при пероральном введении крысам с диабетом

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

s – число стадий адсорбции полиэлектролитов Алг – альгинат натрия средней степени вязкости Апр – апротинин из легких быка АЦЦ – N-ацетил-L-цистеин БАПНА – N-бензоил-L-аргинина паранитроанилид БАЭЭ – N-бензоил-L-аргинина этиловый эфир БСА – бычий сывороточный альбумин БТПНА – N-бензоил-L-тирозина паранитроанилид БТЭЭ – N-бензоил-L-тирозина этиловый эфир ДС – декстрансульфат натрия, 500 кДа ЖКТ – желудочно-кишечный тракт ИББ – ингибитор трипсина и химотрипсина из сои типа Баумана-Бирк Инс – рекомбинантный инсулин человека ИП – ингибитор протеаз ИТК – ингибитор трипсина из сои типа Кунитца нПЭК – нерастворимый полиэлектролитный комплекс Овм – овомукоид из утиных яиц о-ФА – ортофталевый альдегид ПАВ – поверхностно активные вещества ПКК – плотные контакты клеток эпителия Трип – трипсин из поджелудочной железы быка ТРИС – трис-(гидроксиметил)-метиламин ТФУ – трифторуксусная кислота Хим – -химотрипсин из поджелудочной железы быка Хит – хитозан, 400 кДа, степень деацетилирования 85 % экстракт ИББ/ИТК – белковый экстракт из сои, обогащенный ингибиторами трипсина и химотрипсина типа Баумана-Бирк и трипсина типа Кунитца

ВВЕДЕНИЕ

Сахарный диабет занимает третье место в мире по распространенности после сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний. Сахарным диабетом в мире болеют более 300 миллионов человек, при этом около 10 – 15 % из них болеют диабетом первого типа — в их поджелудочной железе инсулин не синтезируется совсем или производится в недостаточном количестве. Больные вынуждены строго контролировать уровень глюкозы в крови путм постоянных инъекций инсулина, что, в свою очередь, может повлечь за собой такие нежелательные последствия, как гиперинсулинемию и липоатрофию.

Были исследованы альтернативные пути доставки инсулина, тем не менее, на настоящий момент существует лишь одна доступная на рынке форма неинвазивного инсулина, хотя было предложено множество идей, разработок и препаратов, проходящих различные фазы клинических испытаний. Большое внимание учных уделяется созданию пульмонарной, интраназальной и трансдермальной форм доставки гормона. Однако наиболее естественным и удобным способом введения инсулина была бы пероральная доставка. Это связано с тем, что в норме секретируемый инсулин из поджелудочной железы попадает в печень через кровеносные сосуды, а печень, в свою очередь, контролирует количество инсулина, достигающего другие органы и ткани. При пероральном введении инсулин из тонкого кишечника через брыжеечную и воротную вену также попал бы в печень. Таким образом, при пероральной доставке был бы возможен контроль секреции инсулина, который отсутствует при инвазивном введении и других альтернативных путях его доставки. Ключевой довод в пользу разработки такой системы состоит в том, что большинство пациентов предпочтет таблетки инъекциям и ингаляторам.

Однако, биодоступность белков, введнных перорально, не превышает 1 – 2 %.

Связано это с тремя основными причинами. Во-первых, это гидролиз белка при экстремальных значениях pH желудочного сока; во-вторых, расщепление белка под действием протеолитических ферментов желудка и тонкого кишечника; и, в-третьих, низкая проницаемость мембран клеток кишечника для больших белковых молекул.

Разрабатываются специальные системы доставки белковых препаратов, направленные на преодоление вышеперечисленных проблем. Однако многие методы микрокапсулирования (получение липосом, смешанных мицелл, множественных эмульсий, микроэмульсий и др.) не лишены серьзных недостатков, среди которых использование органических растворителей и жстких условий капсулирования, что в случае инсулина может привести к значительной потере активности. На основе полиэлектролитов созданы системы доставки, способные с различной специфичностью высвобождать белки в заданных отделах желудочно-кишечного тракта. К ним относятся включение белка в различные гидрогели, образование наночастиц ионотропным гелеобразованием и адсорбцией усиливающих биодоступность агентов на агрегатах белка.

В работе для микрокапсулирования инсулина выбрана последовательная адсорбция противоположно заряженных природных полиэлектролитов на микроагрегатах комплекса белок-полианион. Способ характеризуется простотой методики и возможностью проведения в мягких водных условиях при комнатной температуре. Полиэлектролитные микрочастицы являются стабильными и pH-чувствительными.

Целью настоящей работы являлось получение полиэлектролитных микрочастиц, обеспечивающих повышенную биодоступность рекомбинантных инсулинов при пероральном применении.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

Получить и охарактеризовать полиэлектролитные микрочастицы, содержащие рекомбинантные инсулины.

Выявить свойства микрочастиц, обеспечивающие увеличение биодоступности инсулина при пероральном введении.

Включить в полиэлектролитные микрочастицы белковые ингибиторы протеолитических ферментов для защиты микрокапсулированного инсулина от воздействия протеаз желудочно-кишечного тракта.

Оценить in vivo биологическое действие препарата микрокапсулированного

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Инсулин. Общие сведения Структура и физико-химические свойства 1.1.

Инсулин (от лат. insula – остров) – основной гормон, регулирующий углеводный обмен. Инсулин представляет собой небольшую белковую молекулу массой 5808 Да, состоящую из двух полипептидных цепей (рис. 1). Изоэлектрическая точка инсулина равна 5,35. А-цепь содержит 21 аминокислотный остаток и одну дисульфидную связь, В-цепь состоит из 30 аминокислотных остатков. Цепи соединены между собой двумя дисульфидными связями [1].

Рис. 1. Строение молекулы инсулина человека.

Структура инсулина отличается высокой консервативностью, и различия в молекуле из разных источников наблюдаются преимущественно в положениях А8, А9, А10 и В30. Наиболее близки по своей первичной структуре к инсулину человека инсулины свиньи и кролика, которые отличаются только одной аминокислотой в положении B30.

В растворе молекулы инсулина легко переходят в агрегированное состояние, которое зависит от температуры, pH и содержания цинка. Гексамерная единица кристаллического цинк-инсулина состоит из трех димеров, располагающихся вокруг оси, проходящей через два атома, каждый из которых координирован на имидазольные группы остатка гистидина в положении В10 (рис. 2). Димеры инсулина соединены в кристаллы водородными мостиками между пептидными группами в положениях 24 и 26 С-концевого остатка В-цепи. Размер гексамерной единицы составляет около 5 – 6 нм (по данным Protein Data Bank).

Рис. 2. Пространственная структура инсулина человека. 1 – мономер инсулина;

2 – гексамер инсулина.

Биологическая активность инсулина 1.2.

Практически во всех тканях организма инсулин влияет на обмен углеводов, жиров, белков и электролитов, увеличивая транспорт глюкозы, белка и других веществ через мембрану клетки [2]. Инсулин снижает содержание глюкозы в крови, задерживая распад гликогена и синтез глюкозы в печени, и в то же время повышает проницаемость клеточных мембран для глюкозы, способствуя ее переходу в ткани и использованию в реакциях пентозофосфатного цикла, а также ускоряет синтез гликогена в мышцах.

Присутствие этого гормона в организме обусловливает преобладание синтеза белков и жирных кислот над их распадом, способствует переходу углеводов в жирные кислоты и образованию жиров [1].

взаимодействия с клетками-мишенями) недостаточности инсулина вызывает развитие сахарного диабета. Общим результатом неконтролируемого диабета является гипергликемия, стойкое увеличение содержания глюкозы в крови, что со временем приводит к серьезному повреждению многих систем организма, особенно нервов и распространенности после сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний. По данным ВОЗ за 2011 год диабетом в мире больны 346 млн человек [3]. Только в России зарегистрированных больных около 3 миллионов, однако, истинная распространенность заболевания – около 10 млн человек, и по этому показателю наша страна находится на 4 месте в мире [4]. В США диабетом страдают почти 26 млн человек (8,3 % населения) [5].

Выделяют два основных вида диабета. При диабете первого типа (ранее известном как инсулинозависимый, юношеский или детский), нарушена выработка инсулина в поджелудочной железе, вследствие чего необходимо ежедневное введение инсулина.

Диабет второго типа (ранее называемый инсулиннезависимым или взрослым) развивается в результате неспособности организма эффективно использовать вырабатываемый инсулин. Диабет второго типа, которым страдает большинство людей с диабетом в мире, в значительной мере является результатом излишнего веса и физической инертности.

Пониженная толерантность к глюкозе и нарушение гликемии натощак (более 5,5 мМ) характеризует промежуточное или преддиабетическое состояние. Такие больные подвергаются высокому риску заболевания диабетом второго типа, хотя это и не является неизбежностью.

Биосинтез и регуляция секреции инсулина 1.3.

Инсулин синтезируется -клетками островков Лангерганса поджелудочной железы.

Ген, контролирующий этот процесс, локализуется на коротком плече 11р15.5 хромосомы между геном тирозингидроксилазы и геном, ответственным за синтез инсулиноподобного фактора роста 2 [6].

Первоначально на рибосомах шероховатой эндоплазматической сети синтезируется неактивный пептид-предшественник – препроинсулин, превращающийся в активную форму после ряда химических превращений (рис. 3). Он представляет собой белок, построенный из 110 аминокислотных остатков c молекулярной массой 11500 Да, и включает в себя расположенные последовательно L-пептид, B-пептид, C-пептид и A-пептид. Время жизни препроинсулина составляет около 1 мин. Почти сразу после синтеза в эндоплазматической сети от этой молекулы отщепляется сигнальный L-пептид из 24 аминокислот, необходимый для прохождения синтезируемой молекулой через гидрофобную липидную мембрану эндоплазматической сети. Образующийся проинсулин транспортируется в составе микропузырьков к комплексу Гольджи. Проинсулин представлен одной полипептидной цепью, содержащей 84 аминокислотных остатка с молекулярной массой около 9 кДа и практически лишенной биологической активности.

Превращение неактивного проинсулина в активный инсулин происходит путем частичного протеолиза: отщепление с С-конца полипептидной цепи С-пептида, содержащего 33 аминокислотных остатка. Длина и первичная структура С-пептида подвержена бльшим изменениям у разных видов животных, чем последовательность цепей А и В инсулина [2].

Рис. 3. Схема биосинтеза инсулина (By Takometer at en.wikipedia [CC-BY-2. (http://creativecommons.org/licenses/by/2.5)], from Wikimedia Commons).

Конверсия проинсулина в инсулин протекает при участии двух эндопептидаз:

первого и второго типа, а также карбоксипептидазы E [7]. Эндопептидаза 1-го типа необходима для отщепления С-терминального фрагмента, в результате чего образуется промежуточная форма проинсулина – интермедиат-I, в котором С-пептид отделен от терминальной группы А-цепи. Другая форма проинсулина, интермедиат-II, образуется под воздействием эндопептидазы 2-го типа. В интермедиате-II С-пептид отделен от С-конца В-цепи. Образование интермедиата-I происходит при отщеплении двух аминокислот:

Lys-64 и Arg-65 от А-цепи, а интермедиата-II – при отщеплении Arg-31 и Arg-32 от В-цепи. С помощью карбоксипептидазы E происходит полное отщепление двух соответствующих аминокислот (32 – 33 и 65 – 64), в результате чего образуются С-пептид и инсулин [2]. У человека образование инсулина из проинсулина в основном происходит через формирование интермедиата-I. Активность эндопептидаз и экспрессия соответствующих генов в -клетках регулируются количеством проинсулина в гранулах, а синтез последнего регулируется глюкозой на трансляционном и посттрансляционном уровнях. На основании проведенных исследований Wicksteed B. и др. высказали предположение, что гиперпроинсулинемия, наблюдаемая у некоторых больных сахарным диабетом второго типа, может быть следствием нарушения конверсии проинсулина в инсулин и недостаточности гена, ответственного за синтез эндопептидазы [8].

В созревшей грануле инсулин находится в кристаллической форме, тогда как С-пептид – в растворимом состоянии. При нормальном состоянии организма количество инсулина в -клетках поддерживается на постоянном уровне точным балансом его секреции, биосинтезом из проинсулина и внутриклеточной деградацией инсулина. В случае, когда потребность в инсулине увеличивается, скорость его деградации снижается, и эта регуляция осуществляется по принципу обратной связи. Период полужизни секреторной гранулы составляет несколько дней, и если за этот период не происходит экзоцитоза, то инсулин деградируется в лизосомах внутри -клетки. Находящиеся в секреторной грануле белки различаются биологической активностью и длительностью существования. Так, период полураспада инсулина составляет 3 – 10 мин, С-пептида – около 30 мин, проинсулина – 20 – 23 мин [2]. Секреция инсулина происходит посредством экзоцитоза.

В физиологической регуляции синтеза инсулина доминирующую роль играет концентрация глюкозы в крови. Так, повышение содержания глюкозы в крови вызывает увеличение секреции инсулина в панкреатических островках, а снижение ее содержания – наоборот, замедление секреции инсулина. Контроль по типу обратной связи рассматривается как один из важнейших механизмов регуляции содержания глюкозы в крови, -клетки чувствительны даже к незначительным ее изменениям. Увеличение скорости секреции инсулина наблюдается при концентрациях внутриклеточной глюкозы между 5,5 и 17 мМ, причем максимальная стимуляция секреции инсулина имеет место при содержании глюкозы около 8 мМ. Секреция инсулина в ответ на стимуляцию глюкозой представляет собой двухфазную реакцию, состоящую из стадии быстрого, раннего высвобождения инсулина, называемой первой фазой секреции (продолжительность 1 – 3 мин), и второй фазы (продолжительность 25 – 30 мин) [2].

Необходимо отметить, что глюкоза, поступающая в кровь из желудочнокишечного тракта (ЖКТ), способствует более значительному высвобождению инсулина из -клеток поджелудочной железы и, естественно, более высокому уровню инсулина в сыворотке крови по сравнению с тем же количеством глюкозы, но введенной внутривенно. Такая разница в стимуляции высвобождения инсулина в ответ на одинаковое количество глюкозы объясняется тем, что поступившая в ЖКТ глюкоза стимулирует секрецию инсулина не только повышенным ее уровнем в крови, но и посредством активации механизма, включающего секрецию ряда гормонов ЖКТ:

гастрина, секретина, холецистокинина, глюкагона, желудочного ингибиторного полипептида или глюкозозависимого инсулинотропного пептида [9].

Механизм действия инсулина 1.4.

Свое биологическое действие на уровне клетки инсулин осуществляет через соответствующий инсулиновый рецептор. Он представляет собой тетрамерную белковую структуру, являющуюся составной частью мембраны клетки. Рецептор включает две субъединицы, каждая из которых также состоит из двух частей. Полипептидная цепь -субъединицы состоит из 719 аминокислотных остатков, -субъединица включает аминокислотных остатков. Две -субъединицы и две -субъединицы ковалентно связаны дисульфидным мостиком (рис. 4). Количество рецепторов инсулина на клетке зависит от ткани-мишени. Так, эритроцит, находящийся в центральном кровообращении, содержит около 40 инсулиновых рецепторов, тогда как гепатоциты — более 200 000 на клетку [2].

-Субъединица располагается внеклеточно и содержит два специфических сайта для связывания инсулина, тогда как -субъединица условно состоит из трех частей:

незначительной длины внеклеточной части, трансмембранного домена и внутриклеточной инсулинрегулируемой белковой тирозинкиназной активности. Трансмембранный домен рецептора к инсулину стабилизирует те конформационные изменения, которые возникают после взаимодействия -субъединицы с рецептором. Между субъединицами существуют дополнительные С-О и С-N связи через боковые цепи.

Рис. 4. Структура рецептора и механизмы действия инсулина [2].

ГЛЮТ-4 – глюкозный транспортер (мышечно-жировой тип);

Р60/65, Р85, Р110 – регуляторные белки рецептора, участвующие в трансдукции инсулинового сигнала;

СИР-1 – субстрат инсулинового рецептора;

МАРК – митогенактивированная протеинкиназа;

МАРКК – митогенактивированная протеинкиназа-киназа;

S6 – рибосомальный белок;

Ras – мембранный ГТФ связывающий белок.

Гормон-рецепторное взаимодействие осуществляет -субъединица рецептора, содержащая связывающие с инсулином сайты. За распознавание и высокоспецифичное связывание инсулина с -субъединицей рецептора ответствен участок В-цепи от 22-го до 26-го аминокислотного остатка [9]. Взаимодействие с гормоном изменяет конформацию субъединицы, что активирует тирозинкиназу -субъединицы (до связывания с инсулином -субъединица оказывает ингибирующее влияние на тирозинкиназную активность).

Активирование тирозинкиназы ведет к аутофосфорилированию нескольких тирозиновых остатков внутриклеточного домена -субъединицы, включая Туr-960, который инициирует взаимодействие фосфотирозинсвязывающего домена с белками инсулинорецепторного субстрата 1. Тирозинкиназа является очень важным элементом в Аутофосфорилирование трех остатков тирозина (Туr-1146, Туr-1150 и Туr-1151) активирует активность киназ в 10 – 20 раз.

С-терминальный фрагмент -субъединицы содержит два остатка тирозина (Туr-1316 и Туr-1322), которые вместе с N-терминальной областью юкстамембранного домена, содержащего остаток Туr-960 и областью, называемой «регуляторным доменом», участвуют в выполнении рецептором своей специфической функции. Юкстамембранный домен отвечает за две важные функции рецептора: распознавание субстратов и эндоцитоз инсулинстимулированного рецептора. С-терминальный фрагмент регулирует передачу инсулинового сигнала.

Активированный после взаимодействия с инсулином рецептор активирует фосфолипазу С и фосфатидилинозитол 3-киназу, что приводит к гидролизу мембранных фосфолипидов, сопровождающемуся образованием инозитолтрифосфата и диацилглицерина. Диацилглицерин также стимулирует протеинкиназу С.

Активированный рецептор запускает цепочку последовательного фосфорилирования других белков, включая серинкиназную активность, цАМФ-зависимые протеинкиназы, а также взаимодействует с ГТФ-связывающими белками или цАМФ, приводя к активированию фосфорилирования-дефосфорилирования, результатом чего и является изменение функции мембраны клетки.

Глава 2. Способы доставки инсулина Традиционные методы введения инсулина 2.1.

Основным методом лечения сахарного диабета первого, а зачастую и второго типа, является регулярное введение инъекций инсулина для поддержания его уровня в крови пациента. Данный способ обладает существенными недостатками, такими как:

необходимость жесткого соблюдения диеты, распорядка сна, отдыха, физических нагрузок и еды, жестко привязанных к введению инсулина при 1 – 2 инъекциях в день;

либо потребность в специальном обучении и жестком самоконтроле уровня глюкозы и количества вводимого инсулина при частом введении – до 7 раз в сутки. При этом существует сложность соблюдения больным режима и схемы лечения вследствие боли и дискомфорта постоянных инъекций. В среднем за свою жизнь больные диабетом первого типа получают около 80000 инъекций.

По продолжительности действия препараты инсулина делят на инсулины короткого, промежуточного (среднего) и длительного действия. Быстродействующие препараты характеризуются быстрым началом и небольшой продолжительностью действия: инсулин всасывается в кровь и начинает действовать спустя 15 – 30 мин после инъекции. Такие препараты вводятся непосредственно перед основными приемами пищи:

завтраком, обедом и ужином. Максимальная активность (или пик действия, пик активности) приходится на интервал между 1,5 – 3 ч от момента введения.

Продолжительность действия (около 6 – 8 ч) зависит от дозы инсулина: чем большее количество простого инсулина введено, тем дольше он работает. К таким инсулинам относятся аспарт, лизпро, хумалог, хумулин-R, инсулрап, хоморап, моносуинсулин и другие [10].

Препараты средней продолжительности действия составляют самую большую группу препаратов [11]. Они начинают действовать через 1 – 3 ч после введения, имеют разные пики активности: между 4 и 8 или 6 и 12 ч от инъекции, и продолжительность действия – от 10 – 16 ч до 18 – 24 ч. К этим препаратам относятся семиленте, инсулонг, ленте, монотард, протафан, актрафан, хумулин-М и другие. Для получения более продолжительного эффекта в инсулин добавляют вещества, замедляющие его всасывание.

Комбинация инсулина и вещества-замедлителя обычно приводит к образованию кристаллов, которые под кожей постепенно высвобождают инсулин, и тот всасывается в кровь [10]. Инъекции этих инсулинов делают обычно 2 раза в сутки. Также существуют смеси из быстродействующего инсулина и инсулина средней продолжительности действия.

Препараты с продолжительностью действия более 24 ч (до 36 – 38 ч) называются инсулинами длительного действия. При этом время определяется приблизительно, т.к.

всасывание инсулина всегда зависит от индивидуальных факторов. Длительно действующие инсулины начинают действовать через 4 – 6 ч, пик активности – между 14 и 22 – 24 ч, общая продолжительность действия – 28 – 36 ч. К ним относятся ультратард, ультраленте-илетин-1, хуминсулин ультралонг и другие.

Следует отметить, что реально продолжительность действия инсулинов меньше указанной, поэтому для воссоздания базисной секреции инсулина препараты длительного действия вводят не через 36, а через 24 ч, а средней продолжительности действия – два раза в сутки [11].

Однако, даже комбинируя различные инсулины, не удается достичь постоянной концентрации инсулина плазмы, аналогичной физиологическому уровню [12]. Также в этом случае невозможно повторить естественный путь секреции, поскольку вводимый инъекционно инсулин сначала попадает в периферийные ткани [13], в отличие от вырабатываемого поджелудочной железой инсулина, сначала проходящего через печень.

Несмотря на широкую распространенность, все традиционные препараты инсулина обладают серьезными недостатками [9]. В их числе вариабельность абсорбции и значительные интра- и межиндивидуальные различия фармакодинамического эффекта.

Традиционная инсулинотерапия также часто сопровождается гиперинсулинемией и липодистрофией. Все это существенно снижает качество жизни пациентов. Введение в практику удобных в употреблении инсулиновых шприц-ручек позволило несколько улучшить, но не изменить ситуацию. Инъекционное введение не позволяет имитировать естественное изменение уровня инсулина в крови. Также возможны сложности вследствие разницы гликемического контроля день ото дня, не смотря на единство дозы и места введения. Из-за задержки в абсорбции инсулина после введения возможно избыточно высокое содержание гормона в крови между приемами пищи и, как следствие, гиперинсулинемия. От постоянных инъекций в одно место возможны зуд, аллергия, и даже липодистрофия.

Более точный контроль уровня инсулина позволяет достичь инсулиновая помпа [14]. Данное медицинское устройство обеспечивает непрерывное подкожное введение инсулина. Инсулиновая помпа является альтернативой многократным ежедневным инъекциям инсулина инсулиновым шприцом или инсулиновой шприц-ручкой и позволяет проводить интенсивную инсулинотерапию в сочетании с мониторингом уровня глюкозы и подсчетом количества углеводов. Однако и этот метод не лишен недостатков. Его распространение ограничивают сложность и дороговизна устройства, проблема фиксации на теле, осложнения от постоянного нахождения подающей иглы в теле, а также необходимость подбора индивидуального режима работы аппарата. Как и при инъекционном введении, потребление избытка или недостатка сахаров может привести к временной гипо- или гипергликемии. Также, постоянное наличие катетера представляет риск инфицирования и образования язвы, у некоторых пациентов может развиваться липодистрофия.

Альтернативные методы введения инсулина 2.2.

Инсулин – единственная молекула, которая привлекла огромное внимание ученых, занимающихся доставкой лекарственных средств: со времени открытия инсулина, уже к 2001 году было опубликовано более 2000 статей, посвященных различным аспектам его доставки [15]. Хорошо контролируемая и экономичная система доставки лекарства должна сохранять биологическую, физическую и химическую целостность препарата в процессе его приготовления, хранения и после доставки [16].

Были исследованы пульмонарный, назальный, буккальный, пероральный, трансдермальный, окулярный, ректальный, вагинальный и др. пути доставки инсулина [17]. Тем не менее, на настоящий момент существует лишь одна доступная на рынке клиническая форма неинвазивного инсулина, хотя было предложено множество идей, разработок и препаратов, проходящих различные фазы клинических испытаний. Связано это не только с различными сложностями неинвазивной доставки белков, но и с длительностью клинических испытаний. После получения положительных результатов доклинических исследований для действующего вещества создается лекарственная форма и допускается к клиническим испытаниям, которые состоят из трех фаз. Первая фаза клинических исследований должна подтвердить безопасность вещества, вторая — его эффективность в лечении заболевания, при проведении третьей изучаются отдаленные последствия применения препарата. И только при условии успешного прохождения всех клинических испытаний лекарственный препарат может быть зарегистрирован и разрешен к применению. Все это требует длительного времени и больших финансовых вложений.

2.2.1. Доставка через слизистую ротовой полости Доставка через ротовую полость позволяет обеспечить прямой доступ инсулина в кровоток, избегая его деградации в ЖКТ, может быть остановлена в любой момент и удобна для пациентов. Легкодоступность данной области для доставки позволяет больным применять системы самостоятельно. Однако низкая проницаемость, относительно небольшая поверхность, ток слюны и проглатывание, ведущие к удалению лекарства, представляют существенную сложность.

Среда ротовой полости представляет определенную трудность для системной доставки лекарств. Требуется высвобождение белка из системы доставки в месте абсорбции (в буккальной или сублингвальной зоне), а далее транспорт через слизистую и попадание в кровоток. При этом значительную роль играют физиологические аспекты ротовой полости, такие как pH, объем жидкости, ферментативная активность, проницаемость слизистой и др. [18].

В отличие от агрессивной изменяющейся среды ЖКТ, среда ротовой полости относительно постоянна, что обеспечивается постоянной секрецией слюны. По сравнению с секретом ЖКТ, слюна более подвижна, содержит меньше муцина, и имеет низкую протеолитическую активность [19]. Тем не менее, аминопептидазы могут представлять угрозу при буккальной доставке инсулина. Показано, что протеолитическая активность гомогенатов буккальной ткани различных видов позволяла гидролизовать ряд белков [20].

Слюна обеспечивает влагой среду ротовой полости, однако ее ток ограничивает время преждевременному проглатыванию лекарства до того, как произойдет абсорбция на слизистой. Способность лекарства удерживаться в месте абсорбции является фактором, определяющим успешность системы доставки лекарства через буккальную слизистую.

продолжительного контакта лекарственной формы и слизистой рта, позволяя продлить время абсорбции [21].

Таблица 1. Характеристика слизистой ротовой полости [22].

НК – некератинизированная ткань, К – кератинизированная ткань физиологический барьер при доставке. Толщина слизистой и ее проницаемость варьируется в зависимости от области и состава эпителия (табл. 1). Поверхность ротовой полости выстлана многослойным эпителием. Участки, подвергающиеся механическим кератинизированным эпителием, схожим с эпидермисом кожи. Такой эпителий содержит нейтральные липиды, такие как церамиды и ацилцерамиды, которые носят барьерную функцию, и слабопроницаем даже для воды. Эта часть слизистой называется жевательной.

Дно полости рта и щеки, которые должны быть мягкими при пережевывании пищи и речи, покрыты некератинизированным эпителием, сходным с пищеводом, называемым выстилающим [18]. Некератинизированный эпителий значительно более проницаем, чем кератинизированный [23]. Благодаря этому он представляет собой наименьшую преграду для доставки белка и предпочтителен для доставки. Специализированная слизистая, находящаяся на верхней поверхности языка, менее пригодна для доставки лекарств [24].

Жевательная, специализированная и выстилающая слизистые составляют примерно 25, и 60 % соответственно [25]. Благодаря большей проницаемости слизистой по сравнению с другими отделами рта, основной интерес представляют буккальный и сублингвальный путь.

Главным недостатком буккальной области является время обновления эпителия.

Для буккального эпителия оно составляет от 3 до 8 дней по сравнению с 30 днями для эпителия кожи, 20 – 25 днями для остальных частей слизистой рта, включая сублингвальную [22]. Последняя также состоит из некератинизированного эпителия и имеет хорошую проницаемость, но подвержена сильному току слюны.

Различные вещества проникают через эпителий с различной скоростью в зависимости от их химической природы и типа ткани. Лекарство может быть транспортировано через эпителий пассивной диффузией, активным транспортом, с помощью веществ-переносчиков или другими специализированными механизмами.

Большинство исследований показывают, что пассивная диффузия через эпителий парацеллюлярным или трансцеллюлярным путями является основным механизмом транспорта лекарств через буккальную слизистую [19]. Хотя предполагается, что это может быть один и тот же путь [22].

Продолжающиеся исследования по разработке доставки белков через слизистую ротовой полости привели к разработке нескольких традиционных и новых лекарственных форм в виде растворов, таблеток/пастилок, жевательных резинок, спреев, пластырей и пленок, гидрогелей, полых волокон и микросфер. Подобные системы обычно предназначены для доставки а) лекарств с быстрым высвобождением и быстрым началом действия, б) лекарств с пульсирующим высвобождением с быстрым появлением лекарства в кровотоке и последующим поддержанием концентрации лекарства в рамках терапевтического профиля, в) лекарств с контролируемым высвобождением в течение длительного промежутка времени.

Спрей является одной из альтернатив твердым лекарственным формам и способен доставить лекарство в слюну или на слизистую ротовой полости. Поскольку спрей доставляет лекарство в виде частиц или капель, обеспечивается быстрый доступ лекарства к месту абсорбции. Например, изучение фармакокинетики спрея для буккальной доставки на пациентах с диабетом первого типа не выявило достоверного различия в уровне глюкозы, инсулина и C-пептида в плазме крови по сравнению с инъекционным введением [26]. В исследовании Xu H. и др. [27] инсулин в виде спрея проходил слизистую щек за счет соевого лецитина и пропандиола. Результаты экспериментов на крысах и кроликах показали, что доставка инсулина через буккальную слизистую является удачной альтернативой инъекциям инсулина.

В последние годы на фармацевтическом рынке появился препарат Oral-Lyn – спрей инсулина человека, показанный к применению при диабете первого и второго типа. Он технологической платформе RapidMist, запатентованной системе буккальной доставки лекарственных средств Generex [28]. В ходе изготовления препарата активное лекарственное вещество помещается в раствор в комбинации с усилителями абсорбции и другими вспомогательными веществами.

Жидкая лекарственная форма Oral-Lyn удобно доставляется к поверхности ротовой полости с помощью простого устройства, подобного ингаляторам от приступов астмы, без доставки в легкие. Во рту инсулин абсорбируется богатой сосудами буккальной слизистой.

После получения в 2005 году соответствующего одобрения, Oral-Lyn стал доступен в Эквадоре для лечения диабета второго типа. Данный успех способствовал началу 3 фазы испытания в Европе и США. В Северной Америке 3 фаза испытаний препарата Oral-Lyn была начата в апреле 2008 года. 14 мая 2009 года Oral-Lyn был запущен на рынок Ливана компанией Benta SAL. Препарат был представлен с контейнером, содержащим 400 МЕ препарата рекомбинантного инсулина человека. В сентябре 2009 года Управление по контролю качества продуктов и лекарств США одобрило Oral-Lyn для программы исследования лечения новым лекарствами. Данная программа позволяет компаниям обеспечивать доступ к лекарствам, разрабатываемым для лечения пациентов с тяжелыми заболеваниями, но еще не одобренным. Такое одобрение дается только препаратам, показавшим свою эффективность в ходе клинических испытаний и не имеющим способной заменить их альтернативы.

2.2.2. Пульмонарная доставка потенциальную поверхность для абсорбции, площадь которой на 95 % состоит из бронхиол, каналов альвеол и альвеол. Альвеолы покрыты очень тонким (0,1 – 0,2 мм) монослоем эпителиальных клеток. Для усиления доступности и предотвращения быстрого удаления лекарства движением слизи мерцательным эпителием желательно использование мукоадгезивных агентов [29]. Транспорт молекул через эпителий не вполне изучен, однако известно, что для достаточно небольших белков, таких как инсулин, ключевую роль играет парацеллюлярный транспорт между эпителиальными клетками [30]. Для более крупных молекул более характерен трансцитоз.

Параметры дыхания человека имеют огромное влияние на внутрилегочную абсорбцию [31]. Все они должны быть изучены при исследовании абсорбции инсулина (курение, астма, заболевания легких, физические нагрузки и способность пациента дышать через ингалятор).

Первым коммерческим препаратом ингаляционного инсулина стал Exubera компании Pfizer. При коммерческом запуске в Великобритании в 2005 году препарат не был рекомендован для постоянного использования Национальным институтом здоровья и качества медицинской помощи Великобритании, кроме доказанных психиатром или психологом случаев навязчивого страха инъекций [32]. В 2006 году Управление по контролю качества продуктов и лекарств США и Европейское агентство лекарственных средств выдали одобрение на использование препарата Exubera при лечении диабета первого и второго типа. Применение Exubera вызывало повышение количества антител к инсулину по сравнению с подкожным введением, которое однако не приводило к заметным изменениям в метаболизме [33]. В большинстве исследований функция легких оставалась стабильной, хотя и повышалась диффузия CO [34]. У применявших препарат наблюдался кашель от слабого до умеренного, уменьшавшийся со временем [34].

Использование препарата для лечения диабета было противопоказано больным с хроническими заболеваниями легких (астма, хроническая обструктивная болезнь легких), а также курильщикам и бросившим курить менее чем за 6 месяцев до начала использования препарата.

В устройстве Exubera использован порошок, содержащий 60 % инсулина и вспомогательные вещества (маннитол, глицин, нитрат натрия). Порошок упакован в блистеры с содержанием от 1 до 3 мг инсулина (около 28 и 84 МЕ соответственно), что эквивалентно дозам 3 и 9 МЕ при подкожном введении [33, 35]. Биодоступность по сравнению с инъекционным введением гормона составляет около 10 %. Было заявлено, что ингаляционный инсулин имеет такую же эффективность, что и инъекционный инсулин, с точки зрения контроля уровня глюкозы и периода полужизни в крови.

Фармакокинетика препарата продемонстрировала максимум действия через 55 мин и более быстрое возвращение к базальному уровню по сравнению с подкожным введением [35]. Препарат использовался как быстродействующая форма инсулина и обычно применялся перед едой. Вместе с тем обычно по-прежнему требовалась дополнительно инъекция инсулина длительного действия перед сном [32]. Точная дозировка являлась одной из главных проблем применения ингаляционного инсулина [35].

Хотя Exubera был первым ингаляционным инсулином, и ожидалось, что он предлагает удобную альтернативу ежедневным инъекциям, продукт не пользовался популярностью у больных. Компания-производитель потратила значительные суммы на рекламу препарата для повышения спроса, но не преуспела в этом. Препарат был отозван с рынков США и Европы из-за слабого спроса в третьем квартале 2007 года. В январе 2008 года крупнейший производитель инсулина в мире, компания Novo Nordisk A/S, объявила о прекращении разработки собственных версий ингаляционного инсулина, известных как AERx iDMS-ингаляционная система инсулина [36]. Аналогично в марте 2008 года Eli Lilly and Company прекратила попытки разработки своего препарата Air Insulin. На данный момент лишь компания MannKind Corporation по-прежнему оптимистично смотрит на перспективы создания ингаляционного препарата.

2.2.3. Назальная доставка Основным преимуществом носовой полости для доставки инсулина является ее высокая насыщенность сосудами. Фармакокинетический профиль доставляемого назально инсулина близок к внутривенному введению [37] и позволяет имитировать естественный «пульсирующий» профиль секреции инсулина [38].

Разработка системы назальной доставки с повышенной абсорбцией макромолекул и водорастворимых лекарств по-прежнему остается нерешенной задачей. Главной причиной является короткое время пребывания лекарства в носовой полости вследствие движения слизи мерцательным эпителием и физического удаления доставляемого инсулина за 15 – 30 мин [39]. Трудностями также являются низкая проницаемость эпителия и ферментная деградация [38]. В связи с этим эффективная абсорбция инсулина не происходит без применения вспомогательных агентов, усиливающих абсорбцию и увеличивающих проницаемость эпителия, продлевающих пребывание носителя гормона в носовой полости, а также защищающих белок от действия протеаз. В противном случае абсорбция оказывается пренебрежимо мала. Надо учитывать, что данный способ доставки неприменим при заложенности носа и рините. Насморк также ухудшает доступность инсулина за счет сокращения времени пребывания в носовой полости.

Преодоление барьера эпителия при назальной доставке возможно транс- или парацеллюлярным путями. Гидрофильные белковые молекулы, такие как инсулин, охотнее используют парацеллюлярный путь через плотные контакты эпителиальных клеток (ПКК). Соединения размером до ~1000 Да проходят легко, а для больших молекул биодоступность составляет лишь 1 – 2 %, и для ее повышения требуется раскрытие ПКК [40]. Так взаимодействие хитозана с клеточными мембранами эпителия носовой полости вызывает структурную реорганизацию ПКК-связанных белков, что приводит к повышению проницаемости эпителия для лекарства [41].

Вспомогательные вещества, усиливающие абсорбцию или раскрывающие ПКК, должны быть быстродействующими, а их действие должно быть обратимым. В противном случае высока вероятность побочных эффектов. Часто такие агенты в количествах, необходимых для эффективной абсорбции, вызывают повреждения слизистой [42].

Природа протеолитических ферментов носовой полости пока не полностью изучена. В гомогенате слизистой носа ферментативный гидролиз инсулина приводил к деградации более 90 % белка за 1 ч [42]. Хотя данный способ исследования не позволял разделить гидролиз эндо- и экзопротеазами, и вследствие этого результат можно считать завышенным, гидролиз остается серьезной преградой, особенно для небольших белков [37].

2.2.4. Трансдермальная доставка Преимуществами кожи, как области для доставки лекарств, является легкодоступность и большая площадь поверхности (1 – 2 м2). Однако кожа представляет собой эффективный барьер, ограничивающий проникновение крупных, гидрофильных полипептидов, каким является инсулин [43]. Верхний роговой слой обеспечивает эту непроницаемость за счет богатого липидами матрикса [44]. Изучались различные методы преодоления барьера кожи для обеспечения абсорбции инсулина. Их можно разделить на 2 группы: химические (вспомогательные вещества и липосомы) и физические (в основном ионтофорез и сонофорез).

Химические вспомогательные вещества способны повысить проницаемость, облегчая транспорт инсулина, или модифицируя природу рогового слоя [45]. Включение инсулина в липосомы не улучшало трансдермальный транспорт инсулина из-за размера самих липосом, не позволяющего проникать через тонкие поры (< 30 нм) внешнего слоя кожи [43]. В последних исследованиях использовали принцип трансферосом, являющихся сверхгибкими, легкодеформируемыми липидными носителями, способными включать молекулы поверхностно-активных веществ (ПАВ) [46]. При применении трансферосом с инсулином, Transfusulin®, скорость доставки составила около 50 % по сравнению с инъекционным введением. Системное снижение уровня глюкозы наблюдалось не менее 16 ч после однократного неинвазивного накожного введения инсулина в трансферосомах [46].

Для повышения проницаемости трансдермального инсулина исследовался катодный ионофорез. Метод использует слабый электрический потенциал обеспечения транспорта заряженной молекулы инсулина и может контролировать скорость доставки гормона [47]. Ионофорез имеет низкую эффективность, которую можно повысить сбриванием волос или повреждением рогового слоя [48]. Тем не менее, количество доставляемого инсулина оказывается недостаточным для поддержания нормального уровня глюкозы у больных, а безопасность длительного применения метода не была доказана.

сонофорезом, также можно использовать для повышения трансдермального проникновения инсулина в виде раствора или в смеси с гидрогелем [44, 49]. После его применения у животных и людей наблюдалось снижение уровня глюкозы в крови [49, 50].

Данный метод кажется интересным, однако требуются дополнительные продолжительные исследования.

Компанией 3M была разработана платформа для микроструктурированной трансдермальной доставки белка, основанная на микроиглах. Она позволяет объединить удобство трансдермальной доставки с эффективностью инъекционного введения, расширив область доставляемых трансдермально лекарств [51]. Система позволяет обеспечить местную или системную доставку крупных и трудно доставляемых молекул, включая белки, пептиды и вакцины. Однако ее применение для доставки инсулина ограничено необходимостью множественных введений белка в течение длительного времени, что может привести к повреждению кожных покровов и воспалению.

Также были предложены методы переменного давления и электроимпульсного открытия клеточных пор, но их разработка находится только в начальной стадии [44]. К настоящему моменту результаты исследований по трансдермальной доставке инсулина для лечения сахарного диабета очень ограничены. Совмещение химических и физических методов может оказаться эффективным, но слабо исследовано и требует дальнейшего изучения.

2.2.5. Окулярная доставка Многочисленные исследовательские группы проводили исследования системной доставки лекарств через слизистую глаз. Этот путь предлагает простую доставку, а скорость абсорбции в кровоток сравнима с инъекционным введением. Кроме того, ткани глаз гораздо менее чувствительны к развитию иммунологических реакций. Побочных эффектов не наблюдалось при долговременном ежедневном применении (до 3 месяцев) [52].

Примером разработки системы окулярной доставки инсулина может служить работа Xuan B. и др. по исследованию глазных капель гормона [53]. Для увеличения абсорбции инсулина в кровоток на кроликах исследовалось влияние pH и усилителей абсорбции. Было показано, что окулярная доставка гораздо более эффективна при высоких pH (8,0), чем при низких (3,5). Усилители абсорбции, такие как гликохолат и фусидовая кислота, дополнительно повышали абсорбцию инсулина. Перспективным вспомогательным веществом для разработки окулярной системы доставки инсулины является хитозан [54].

Доставка инсулина через слизистую глаза не является приоритетным направлением разработки. В первую очередь это связано с медленной абсорбцией лекарства и быстрым его удалением с поверхности слезой. Короткое время пребывания лекарственной формы инсулина на поверхности глаза вынуждает усиливать абсорбцию инсулина, повышая количество вносимого белка [29].

К другим возможным путям доставки инсулина относятся ректальный и вагинальный. Они изучались вскоре после открытия инсулина, но столкнулись с проблемой транспорта через слизистую и очень низкой биодоступности. Использовались несколько классов усилителей абсорбции (соли желчных кислот, дигидрофузидат, циклодекстрины, ПАВ и хелатирующие агенты), но все они вызывали тяжелые местные реакции [55]. В связи с этим и ректальный, и вагинальный пути также не представляют реальной возможности обеспечения инсулиновой терапии.

Глава 3. Пероральная доставка инсулина Среди способов неинвазивной доставки пероральный путь кажется наиболее интересным для белков и пептидов, но требует наиболее сложных подходов.

Наиболее привлекательной областью при пероральной доставке является тонкий кишечник. Площадь его поверхности почти на 2 порядка больше, чем у остальных отделов ЖКТ вместе взятых, всасывание веществ в данном отделе происходит наиболее легко, и pH его среды нейтрально (табл. 2). Тонкий кишечник взрослого человека обладает поверхностью 250 м2 [13], что определяется его основной функцией – переваривать и всасывать питательные вещества, воду и витамины из пищи, при этом служить барьером для патогенов, токсинов и непереваренных макромолекул. Эпителий, выстилающий тонкий кишечник, состоит в основном из 2 типов клеток: цилиндрических эпителиальных клеток энтероцитов, отвечающих за всасывание веществ, и бокаловидных клеток, выделяющих слизь. Также есть отдельные эндокринные клетки. На внешней стороне поверхность энтероцитов покрыта микроворсинками. Образующаяся щеточная каемка увеличивает поверхность абсорбции на 2 порядка [56]. Она покрыта гликокаликсом – слоем сульфатированного мукополисахарида.

Таблица 2. Сравнение слизистых оболочек отделов ЖКТ [22].

Ротовая полость Тонкий кишечник Толстый кишечник Прямая Экспериментально было показано, что интенсивность снижения уровня глюкозы при пероральной доставке инсулина зависит от места доставки в ЖКТ. Различные отделы тонкого кишечника существенно различаются по проницаемости для инсулина: эпителий двенадцатиперстной кишки в 6 – 10 раз менее проницаем, чем эпителий тощей и подвздошной кишок [57]. Последняя, как было показано на крысах [58] и собаках [59], обеспечивает наиболее эффективную доставку гормона.

Пероральный путь является также и наиболее естественным способом доставки инсулина. Известно, что все вещества, всасываемые в кровь из ЖКТ, проходят через печень и в ней перерабатываются [60]. В норме секретируемый инсулин из поджелудочной железы попадает в печень через кровеносные сосуды; печень, в свою очередь, контролирует количество инсулина, достигающего другие органы и ткани [61].

При всасывании в тонком кишечнике инсулин абсорбируется через верхнюю брыжеечную вену, далее переносится в воротную вену и также попадает в печень (рис. 5). Инсулин, попадающий в печень, напрямую ингибирует высвобождение глюкозы из печени [62]. Она также контролирует количество гормона в крови и способна выводить его избыток [61].

При подкожном введении такого контроля не осуществляется, что часто ведет к серьезным осложнениям, таким как гипогликемия, атеросклероз, заболевания сердца, ограниченные функции мозга и др.

Рис. 5. Схема абсорбции, биораспределения и удаления инсулина после перорального и подкожного введений крысам [63].

Однако доставка белка в тонкий кишечник сопряжена с большим количеством барьеров, понижающих биодоступность инсулина. В естественных условиях биодоступность гормона не превышает 0,5 % [13]. Это связано это с тремя основными причинами:

во-первых, это гидролиз белка в агрессивной среде желудочного сока;

во-вторых, расщепление белка под действием протеолитических ферментов тонкого кишечника;

в-третьих, низкая проницаемость мембран клеток кишечника для больших белковых молекул, не обладающих липофильностью [64].

При разработке пероральной формы инсулина исследовались различные подходы, увеличивающие биодоступность инсулина: разнообразные покрытия, полимерные микрочастицы, липосомы, смешанные мицеллы, множественные эмульсии, микроэмульсии, микросферы, гидрогели, место-специфичные системы доставки, усилители проницаемости эпителия и абсорбции, ингибиторы ферментов, модификация химической структуры инсулина и др. [22, 52, 65 – 67]. Для перорального использования предлагалось использование матриксных таблеток с инсулином, получаемых компрессией или гранулированием [68].

Также предлагался простой способ доставки инсулина в разбавленном растворе, что должно было ускорять проход через желудок и снижать концентрацию протеаз в тонком кишечнике [69, 70]. Был показан эффект снижения на 40 % глюкозы на здоровых и диабетических кроликах в дозе 25 МЕ/кг, а также на крысах с диабетом в дозе 63 МЕ/кг.

Данный метод не позволил решить проблему низкой проницаемости эпителия. Вместе с тем, поскольку не был показан эффект повышения концентрации инсулина в крови, часть эффекта могла быть вызвана обильным введением воды (6 мл на крысу, 15 мл на кролика), что достигало 3 % веса животного.

Таким образом, хотя в ряде случаев показаны положительные результаты исследований на животных, следует всегда учитывать удобство использования конечным потребителем – человеком. Это касается таких разработок, как, например, интрадуоденального введения по катетеру, или рассмотренного выше введения инсулина с большими объемами жидкости: очевидно, их практическое использование вызывает большие вопросы [66].

Полиэлектролитные системы доставки 3.1.

Распространенной стратегией в разработке пероральных систем доставки стало включение инсулина в полимерные матрицы, способные высвобождать белок в заданном отделе ЖКТ. Используемые полимеры должны быть биосовместимы, стабильны и биодеградируемы [67]. Установлено, что полиэлектролитные комплексы могут сохранять устойчивость в широком диапазоне изменения внешних условий (pH, ионной силы, температуры), а затем быстро и обратимо реагировать на очень незначительные их колебания кардинальным изменением молекулярных характеристик и фазового состояния [71]. Особенно ценно, что перестройка комплексов может осуществляться в условиях, благоприятных для функционирования природных полиионов (белков, ферментов, нуклеиновых кислот).

Покрытие инсулина pH-чувствительной оболочкой способно защитить его от деградации в желудке. Оболочка должна оставаться стабильной при низких pH, соответствующих pH желудка, и высвобождать инсулин при значениях pH, соответствующих кишечнику (рис. 6) [56]. Наиболее известна группа полимеров Eudragit, состоящих из сополимера метакриловой кислоты и метилметакрилового эфира и растворяющихся в pH выше желудочной [72].

Рис. 6. Схема обратимого набухания полимерных частиц с изменением pH.

Микро- и нанокапсулирование – привлекательная технология получения новых средств доставки инсулина, имеющих контролированное высвобождение, целеспецифическую доставку и минимизацию побочных эффектов [73]. Основной задачей является обеспечение сохранения активности белка и его эффективный транспорт из просвета кишечника в кровоток. Другими словами, инсулин должен быть защищен от сильнокислой среды желудка, протеаз ЖКТ, и высвобождаться и абсорбироваться в тонком кишечнике. Важно, что частицы размером не более нескольких микрометров обеспечивают продолжительное пребывание в ЖКТ [29]. Мукоадгезия частиц малого размера продлевает время нахождения в тонком кишечнике, а также обеспечивает прочный контакт с эпителием [74].

При выборе способа приготовления микро- и наночастиц основными критериями служат простота масштабирования и быстрота метода, сохранение активности молекулы инсулина, высокая эффективность включения и высокое содержание белка, необходимый размер частиц, безопасность полученной системы. При этом необходимо избегать действия агрессивных сред и органических растворителей, т.е. проводить процесс в мягких условиях. Этим требованиям отвечают описанные ниже способы получения полиэлектролитных частиц с инсулином для пероральной доставки: включение в гидрогели, получение наночастиц ионотропным гелеобразованием и получение микрочастиц постадийной адсорбцией (табл. 3).

Таблица 3. Основные методы получения полиэлектролитных частиц для пероральной доставки инсулина.

Включение в гидрогели Ионотропное гелеобразование Постадийная адсорбция полиэлектролитов на микроагрегатах инсулина * – после ультразвуковой обработки.

Акад. Плате Н.А. и проф. Валуевым Л.И. разработана система пероральной доставки инсулина в полиакриламидном гидрогеле [75]. Гидрогель синтезировали полимеризацией водных растворов акриламида и N,N’-метиленбисакриламида под действием окислительно-восстановительного катализатора. Модифицированные гидрогели получали полимеризацией той же мономерной смеси в присутствии ингибитора протеаз, взятого в больших количествах. Включение инсулина в гидрогель производили путем набухания лиофильно высушенного полиакриламидного гидрогеля в водном растворе инсулина. Гидрогель в высушенном состоянии делили на фракции по размеру частиц геля (наименьшая фракция с частицами не более 50 мкм в сухом виде, 500 – 600 мкм в набухшем) [75]. Модифицированный гель защищал доставляемый инсулин от кислой среды желудка и от протеолиза. Гипогликемический эффект был показан для фракции частиц наименьшего размера при использовании конъюгата с ингибитором в дозе 8 МЕ/кг на здоровых кроликах.

Besheer A. и др. получали pH-чувствительные гидрогели поли(метакриловой кислоты-этиленгликоля) [77]. Наименьшая фракция данного геля состояла из частиц размером до 43 мкм (в сухом виде). После введения in situ в подвздошную кишку крыс с гипогликемический эффект [78].

При простоте метода получения гидрогелей, образующиеся частицы имеют крупные размеры (не менее десятков микрометров в высушенном состоянии), что затрудняет проявление ими мукоадгезивных свойств.

полиэлектролитных наночастиц (табл. 3). Наночастицы получают простым смешиванием раствора заряженного полимера с поливалентным противоионом, например, хитозан с триполифосфатом [85], альгинат с кальцием [79] и др.

Cui F. и др. создали наночастицы комплекса хитозан-триполифосфат [86].

Эффективность включения белка составила до 80 %, размер частиц – 300 нм, а их -потенциал 30 – 40 мВ. За 10 ч при pH 7,4 из частиц высвобождалось 50 % белка. Pan Y. и др. изучали биодоступность наночастиц такого же состава размером 250 – 400 нм [85].

Гипогликемический эффект сравнивали с растворами инсулина и смеси инсулина с хитозаном. Введение раствора инсулина не изменяло уровень глюкозы в крови по сравнению с базальным, а эффект наночастиц с инсулином был выше, чем для смеси гормона с хитозаном. Аналогичные частицы использовались и для разработки назальной системы доставки инсулина [94].

Zhang N. и др. наночастицы из альгината и хитозана размером 350 нм с эффективностью включения белка 87 %. Содержание белка в наночастицах не превышало 10 % [82]. Частицы высвобождали 18 % инсулина в кислой среде и еще 20 % – в нейтральной. Таким образом, комплекс полиионов позволял получить частицы, высвобождающие инсулин в среде тонкого кишечника лучше, чем в среде желудка.

Однако эта разница оказалась невелика. Авторы предположили, что причина быстрого высвобождения белка в начале инкубации в кислой среде – ассоциация инсулина снаружи частиц, и как следствие, быстрое высвобождение этой фракции белка в желудке.

Sarmento В. и др. разработаны наночастицы с инсулином из альгината и хитозана размером 700 – 800 нм [80]. Эффективность включения белка достигала 92 %, содержание белка – до 14,3 %. Частицы обладали взрывным характером выделения инсулина: в первые 5 – 10 мин в pH 1,2 высвобождалось до 45 % белка, а при pH 6,8 через 4 ч еще 25 % [81]. Показано гипогликемическое действие и повышение уровня инсулина в крови после перорального введения частиц крысам с диабетом в дозах 50 и 100 МЕ/кг.

Снижение уровня глюкозы достигало 59 % и длилось до 18 ч, биодоступность составила 6,8 и 3,4 % соответственно для двух доз. В дозе 100 МЕ/кг наблюдалось повышение концентрации инсулина в крови животных на 1,2 нг/мл через 1 ч, максимальный эффект наблюдался через 6 ч и составил 2 нг/мл.

Sarmento В. и др. исследовали наночастицы из хитозана и декстрансульфата размером 500 – 1000 нм [83]. Эффективность включения белка достигала 96 %, содержание инсулина составило 0,5 – 3,8 %. -Потенциал наночастиц был нейтральным, либо отрицательным. Наночастицы практически не высвобождали инсулин в кислой среде pH < 6,0 в течение не менее 5 ч, а в нейтральной среде pH 6,8 более половины белка переходило в раствор за 1 ч инкубации. Для наночастиц размером около 500 нм было показано устойчивое снижение уровня глюкозы в крови при пероральном введении препарата в дозах 50 и 100 МЕ/кг [84]. Максимум эффекта наблюдался через 14 ч, а биодоступность составила 5,6 % для дозы 50 МЕ/кг. При пероральном введении в дозе 100 МЕ/кг микрочастицы вызывали повышение концентрации инсулина в крови на 0,1 нг/мл через 1 ч, 0,2 нг/мл через 6 ч. Максимальное повышение концентрации инсулина на 0,6 нг/мл наблюдалось через 10 ч.

Sonaje K. и др. разработаны наночастицы из хитозана и полиглутаминовой кислоты размером 218 нм с -потенциалом +25 [87]. Эффективность включения инсулина в наночастицы составила 71,8 %, а содержание белка – 19,1 %. На крысах с диабетом в дозе 30 МЕ/кг было продемонстрировано улучшение абсорбции инсулина из наночастиц. Пик концентрации инсулина в крови животных достигался через 5 ч после введения.

Общим недостатком полиэлектролитных наночастиц, получаемых методом ионотропного гелеобразования является низкое содержание инсулина (до 20 %), что приводит к доставке вместе с инсулином больших количеств носителя. Кроме этого дополнительное нанесение.

В последние годы широко изучается микрокапсулирование белков путем постадийной адсорбцией разноименно заряженных полиэлектролитов (метод LbL в англоязычной литературе) [95]. Метод был предложен в 1966 г. [96] и возродился в начале 90-х годов XX века [97]. В основе процесса формования лежит электростатическое взаимодействие заряженной подложки с противоположно заряженными цепями, которое достигается погружением подложки в разбавленный раствор полиэлектролита. В результате электростатического взаимодействия заряды подложки (например, отрицательные) нейтрализуются с образованием монослоя полимера (поликатиона). В результате действия стерического фактора добавление эквивалентного (по зарядам) количества цепей практически никогда не приводит к полной нейтрализации зарядов, зафиксированных на подложке на разном расстоянии друг от друга. Некоторые заряды подложки остаются не скомпенсированными, и для их нейтрализации необходимо вводить дополнительное число цепей. Таким образом, первая стадия адсорбции приводит к перезарядке (изначально отрицательной) поверхности и появлению на ней петель и хвостов, несущих избыточное количество (положительных) зарядов. Перезарядка является движущей силой процесса, поскольку именно она обеспечивает вторую и последующие стадии формования, когда подложку с адсорбированным полимером (поликатионом) противоположно заряженного полиэлектролита (полианиона). Чередующаяся много кратная адсорбция обеспечивает образование стабильных полиэлектролитных мультислоев с различными свойствами, которые во многом определяются природой используемых разноименно заряженных синтетических и природных полимерных компонентов [98]. При постадийной адсорбции возможен контроль свойств поверхности микрочастиц за счет последнего наносимого полиэлектролита. Однако из-за технологических особенностей данным методом сложно получать частицы с размером меньше микрометра. Включение инсулина в получаемые постадийной адсорбцией микрочастицы возможно одним из трех нижеперечисленных подходов.

Во-первых, инсулин может выполнять функцию поликатиона или полианиона, непосредственно участвуя в построении мультислоев. Например, при использовании в качестве ядер кристаллов гидрокортизона размером около 10 мкм удалось сформировать 5–10 бислоев инсулина и альгината [99]. При физиологическом значении pH 7, происходило постепенное и одновременное высвобождение гормона и гидрокортизона из сформированных микрочастиц, скорость которого падала с увеличением числа бислоев.

Авторы полагали, что подкожное введение подобных микрочастиц будет препятствовать падению уровня инсулина в крови как побочному нежелательному результату терапии кортикостероидами. Сдерживающим фактором подхода является относительно невысокое содержание белка в микрокапсулах.

Во-вторых, инсулин используют для формирования первоначальных агрегатов, играющих роль матрицы, на которую затем осуществляют послойную адсорбцию биополиэлектролитов.

Первоначально на микрокристаллах бычьего инсулина послойно адсорбировали полилизин и альгинат, формируя 4 – 15 бислоев и получая соответственно частицы размером 5 – 20 мкм [88]. При pH 7,4 инсулин из таких частиц высвобождался медленнее, чем из микрокристаллов гормона, причем высвобождение замедлялось с ростом числа бислоев.

Гораздо более широкое распространение получил способ формирования матриц из осажденных агрегатов. Причиной тому служит сравнительно невысокая концентрация хлористого натрия, необходимая для высаливания гормона, что не препятствует электростатическому взаимодействию биополиэлектролитов на последующих стадиях сорбции.

На микроагрегаты свиного инсулина размером 5 – 15 мкм, полученные высаливанием белка в NaCl при pH 3, попеременно адсорбировали высокомолекулярный декстрансульфат и протамин в 0,15 М NaCl, pH 3,0 [89]. В другом варианте функцию биополиэлектролитов выполняли полисахариды, а именно положительно заряженный хитозан и отрицательно заряженные декстрансульфат или хитозансульфат [90, 92].

Микрочастицы, покрытые одним – тремя бислоями полисахаридов, повторяли форму и размер ядер высоленных микроагрегатов белка, причем ультразвуковым воздействием удавалось уменьшить размер микрочастиц в 3 – 10 раз. При использовании протамина в качестве поликатиона размеры частиц не превышали 200 нм [89]. Микрочастицы отличались высокой эффективностью включения (60 – 80%) и высоким содержанием гормона (не менее 60%). Использование декстрансульфата наделяло частицы стабильностью в кислых средах независимо от количества стадий сорбции, тогда как в случае полиамфолита хитозансульфата для достижения той же цели требовалось наличие хотя бы одного бислоя. Инсулин, микрокапсулированный при pH 3, выделялся из микрочастиц при pH > 5, причем высвобождение замедлялось с увеличением числа бислоев.

Техникой последовательной адсорбции полияблочной кислоты и хитозана формировали два – шесть бислоев на высаленных микроагрегатах инсулина, а последующей обработкой микрочастиц ультразвуком снижали их размер до 200 нм [93].

Микрочастицы оставались стабильными в узком интервале pH 4 – 5, тогда как выше и ниже этих значений происходило высвобождение гормона. С увеличением числа бислоев скорость выделения инсулина из микрочастиц уменьшалась как в кислых, так и в нейтральных средах.

На высоленные микроагрегаты инсулина адсорбировали высокомолекулярный декстрансульфат и соль FeCl3, а после формирования 3 – 9 бислоев обрабатывали раствором протамина [91]. Биологически активный инсулин высвобождался из микрочастиц при pH 7,4, причем скорость выделения падала с ростом числа стадий сорбции.

Другой вариант приготовления агрегатов инсулина основан на способности гормона взаимодействовать с полиэлектролитами с образованием нерастворимых белокполиэлектролитных комплексов [100, 101]. Смешением раствора свиного инсулина с растворами декстрансульфата или хитозансульфата при pH 3,0 получали белковые агрегаты размером 1 – 15 мкм. Агрегаты отличались высокой эффективностью включения гормона (90–95%) и его высоким содержанием (85–90%). На агрегатах формировали мультислои, используя кислые растворы отрицательно заряженного декстрансульфата и положительно заряженного протамина [89, 90] или хитозана [90, 92]. pH чувствительность приготовленных таким образом микрочастиц инсулина практически не отличалась от pH чувствительности микрочастиц, сформированных на высоленных микроагрегатах гормона [89, 90].

Недостатком микрочастиц, полученных с помощью микрокристаллов инулина, высоленных агрегатов или нерастворимых полиэлектролитных комплексов гормона является неоднородность формы и размера. Однако для пероральной доставки это не имеет принципиального значения.

Предпринимались попытки иммобилизовать белок в ядра, представляющие собой органические или неорганические микросферы строго фиксированного диаметра. Однако в данном подходе пока не удалось достичь высокой эффективности включения белка в частицы [95].

В-третьих, возможно включение инсулина в заранее приготовленные полиэлектролитные микрочастицы или микрокапсулы за счет изменения проницаемости полиэлектролитной оболочки. Различают открытое и закрытое состояния микрокапсул, когда белки соответственно проникают или не проникают в частицы.

Доступ белков в микрокапсулы регулируют изменением pH, ионной силы раствора, добавлением органических растворителей [73]. В полых микрокапсулах, полученных полным растворением микроядер, 90% белка включается в полиэлектролитные стенки и только 10% остается внутри частиц [74, 75]. В матриксных микрокапсулах, полученных частичным растворением ядер или предварительным включением полиэлектролитов внутрь ядер, белки распределяются по всему объему частиц [77]. Эффективность включения и концентрация белка в матриксных микрокапсулах выше, чем в полых частицах [102].

Разрабатывались полиэлектролитные частицы, контроль состояния которых определялся различными факторами. В большинстве случаев изменяющим состояние частиц воздействием служит кислотность среды, приводящая к изменению локального pH внутри микрочастиц. Если хотя бы один из используемых полиэлектролитов представляет собой слабое полимерное основание, слабую поликислоту или полиамфолит (например, белок), варьированием pH раствора можно менять плотность заряда и конформацию заряженных цепей, входящих в состав полиэлектролитных мультислоев. Присутствие в оболочках белков, имеющих относительно невысокие величины pI, может вызывать существенные pH зависимые колебания суммарного заряда частиц и изменения проницаемости полиэлектролитных стенок по отношению к белку.

Примером воздействия химического вещества может служить изменение проницаемости полиэлектролитной оболочки частиц, содержащих биферментную систему глюкозооксидаза–каталаза под действием глюкозы [103]. На высоленных в кислых средах микроагрегатах инсулина формировали пять бислоев глюкозооксидазы и каталазы, обрабатывая каждый бислой сшивающим агентом [104]. Иммобилизованные ферменты сохраняли высокую активность, а микрокапсулы оставались стабильными при pH 7,4.

Помещение микрочастиц в раствор глюкозы вызывало протекание двух сопряженных реакций: окисления глюкозы с образованием перекиси водорода и переработка перекиси каталазой. При накоплении глюконовой кислоты происходило уменьшение локального pH в микрочастицах, изменение проницаемости полиэлектролитной стенки и увеличение растворимости инсулина, что вызывало высвобождение гормона со скоростью, определяемой концентрацией глюкозы.

Присутствие в оболочке биополиэлектролитов, которые могут служить субстратами для ферментов, делает микрочастицы чувствительными к появлению таких ферментов в окружающей среде, что находит свое отражение в изменении проницаемости полиэлектролитной стенки по отношению к белкам. Добавление фермента хитозаназы приводило к деградации мультислойной полиэлектролитной стенки микрокапсул, состоящей из декстрансульфата и хитозана и высвобождению бычьего сывороточного альбумина, включенного в микрочастицы [105]. Аналогичный эффект наблюдали при воздействии гиалуронидазы на микрокапсулы, полученные попеременной адсорбцией гиалуроновой кислоты и полилизина [106]. Расщепление протеазами полиаргинина, входящего в состав оболочки микрокапсул в паре с декстрансульфатом, повышало проницаемость полиэлектролитной стенки для бычьего сывороточного альбумина, включенного в частицы [107].

Защита инсулина от протеолиза 3.2.

Белковые и пептидные лекарственные вещества могут абсорбироваться через слизистую оболочку ЖКТ и проходить в кровоток в нативном виде при условии, что они защищены от ферментативного гидролиза [108]. Однако перорально доставляемые пептиды могут встретить более 40 различных пептидаз при прохождении ЖКТ человека [109].

Среда желудка характеризуется низким pH (экстремально низким натощак, до 1,1) и заметной протеолитической активностью. Существует несколько классов пепсинов, из них в желудочном соке преобладает пепсин-А. Пепсины обладают достаточно широкой специфичностью, предпочтительно гидролизуя связи Phe-, Met-, Leu-, Trp-, и других гидрофобных остатков. Для защиты от протеаз желудка обычно используют описанные выше полиэлектролитные системы, позволяющие обеспечить высвобождение белка в заданном отделе кишечника. Другим подходом является использование ингибиторов пепсина. Однако благодаря эффективности защиты белка от среды желудка путем применения носителей с pH-чувствительным высвобождением, ингибиторы используются не часто. Пепстатин – наиболее широко распространенный эффективный ингибитор пепсина, является модифицированным пентапептидом. Ингибирование выделяемого в желудке пепсина имеет смысл в двух случаях. Во-первых, при доставке лекарства, которое должно действовать непосредственно в желудке: примером может служить эпидермальный фактор роста, используемый при лечении желудочной язвы [110].

Во-вторых, если доставляемый белок крайне подвержен гидролизу протеазами тонкого кишечника и должен быть высвобожден и абсорбирован в желудке вследствие этого.

Сообщалось, что использование пепстатина при доставке лекарств приводило к ряду побочных эффектов, вызванных ингибированием физиологически важных ферментов [66].

Группа Bernkop-Schnrch A. разрабатывала систему доставки эпидермального фактора роста в желудок, используя ковалентно присоединенный к носителю (карбоксиметилцеллюлозе) пепстатин А [111]. Примененный полианионный полимер является биоадгезивным и должен обеспечивать задержку лекарственной формы у стенок желудка.

Наибольшая концентрация протеолитических ферментов содержится в тонком кишечнике: в двенадцатиперстной кишке, в дальней части тощей и меньше в подвздошной кишке [57]. Одним из факторов стабильности пептидаз является их способность связываться с поверхностью эпителия или твердых остатках пищи, оставаясь активными. Отчасти это связанно с их катионной природой [109]. В просвет двенадцатиперстной кишки выделяются секретируемые в поджелудочной железе две группы пептидаз: сериновые эндопептидазы с сериновым остатком в активном центре и карбоксипептидазы с цинком в активном центре. Эндопептидазы трипсин, химотрипсин и последовательности около 50 %. Две группы карбоксипептидаз A и B в свою очередь гомологичны между собой. Соотношение трипсина к химотрипсину и к эластазе, выделяющихся поджелудочной железой после приема пищи, оценивается примерно 20:1: [109]. За сутки секретируется суммарно около 45 г вышеперечисленных ферментов.

Таблица 4. Специфичность панкреатических пептидаз [109].

Трипсин Химотрипсин Эластаза Рис. 7. Гидролиз инсулина человека химотрипсином и трипсином.

Различная специфичность ферментов позволяет эластазе расщеплять молекулу инсулина в шести местах А-цепи и двух местах В-цепи, химотрипсину – в пяти, трипсину – в двух на С-конце В-цепи (табл. 4, рис. 7). Карбоксипептидазы обладают наиболее широкой специфичностью, способны отщепить ряд алифатических аминокислот [109].

Действие карбоксипептидаз наблюдается в тандеме с сериновыми пептидазами. Так продукты гидролиза трипсином содержат концевые лизин и аргинин, которые являются объектами гидролиза для карбоксипептидазы B, а продукты гидролиза химотрипсина и эластазы являются субстратами для карбоксипептидазы A.

В тонком кишечнике выделяют две стадии гидролиза пищевых белков: гидролиз протеазами просвета кишечника и мембран-связанными протеазами щеточной каемки, а также протеазами цитозоля клеток эпителия, играющими важную роль при трансцеллюлярном транспорте белка.

-Химотрипсин является основным протеолитическим ферментом ЖКТ и ответственен за начальный гидролиз и разворачивание глобулярной структуры инсулина, делая его более доступным для атаки ферментами щеточной каемки эпителия и энтероцитов [112]. Сначала химотрипсин гидролизует карбоксильную сторону остатков B26-Tyr и A19-Tyr, а также быстро происходит гидролиз по связям B16-Tyr, B25-Phe и A15-Tyr (рис. 7). После этого становятся доступными для гидролиза практически все потенциально гидролизуемые связи за исключением лишь двух-трех.

Вторым по важности протеолитическим ферментом тонкого кишечника является трипсин. Данный фермент, гидролизующий карбоксильную сторону основных аминокислот лизина и аргинина, способен расщепить молекулу инсулина только в 2 местах: около остатков B29-Lys и B22-Arg (рис. 7). При этом первый метаболит, инсулин без конечного треонина, еще сохраняет инсулиноподобную активность [113].

При эквимолярном соотношении инсулина и фермента, потери от действия химотрипсина были значительно выше, чем от действия трипсина [113].

Выделено более 15 различных ферментов щеточной каемки эпителия [109]. Тем не менее было показано, что деградация ими инсулина крайне мала [57]. Инсулин, будучи сильно подвержен гидролизу протеазами просвета тонкого кишечника, лишь в незначительной мере гидролизуется связанными с мембраной ферментами щеточной каемки эпителия [114]. Последние специализируются на конечной деградации пептидов, предварительно гидролизованных в просвете тонкого кишечника, и малоэффективны против глобул крупных белковых молекул типа инсулина. У крыс гидролиз инсулина в просвете тонкого кишечника был в 16 раз значительней, чем потери активности белка на мембране щеточной каемки эпителия; у морских свинок разница составила 30 раз [114].

Химическая модификация лекарств является одним из важнейших подходов для того, чтобы обойти их переваривание в ЖКТ. Направленная модификация должна быть основаны на точном знании подструктур, подверженным ферментативному расщеплению.

Для подобных исследований достаточно рассмотреть отдельно деградацию каждым угрожающим белку ферментом, так как все основные ферменты выделены и имеются в продаже. Инкубация, например, пептида или белка в растворах, содержащих различные изолированные протеазы, такие как трипсин, химотрипсин, эластаза и др. при физиологических pH позволяет определить ферменты, в первую очередь ответственные за ферментативное расщепления. Благодаря узкой специфичности названных протеаз подверженные гидролизу аминокислоты могут быть идентифицированы и модифицированы [66].

Однако следует помнить, что химические изменения часто вызывают изменения в фармакологическом профиле препарата. В случае инсулина четыре из связей начального гидролиза белка химотрипсином являются важными для способности молекулы гормона связываться с рецепторами. Этот факт крайне ограничивает возможность химической модификации молекулы инсулина, не вызывающей критической потери его биологической активности [113]. Модификация молекулы белка приводит к получению нового химического соединения, для которого необходимо проводить обширные токсикологические исследования. В связи с этим подобная модификация, за исключением пегилирования, не представляет большого интереса для пероральной доставки белка [66].

В целях обойти протеолиз доставляемого белка в тонком кишечнике изучали возможность обеспечить его высвобождение в толстом кишечнике, где концентрация протеолитических ферментов сравнительно низка [115]. Для такой доставки обычно использовали полимерное покрытие, выдерживающее среды желудка и тонкого кишечника и разрушаемое микроорганизмами толстого кишечника [77]. Обитающие в толстом кишечнике более 400 родов микроорганизмов производят широкий спектр протеаз различных групп и его ферментативная активность сильно варьируется [109].

Было показано, что флора толстого кишечника играет основную роль в гидролизе панкреатических ферментов [116], тем не менее, в нем по-прежнему содержится их остаточная активность (около 1/6 у крыс [77]). В целом активность протеаз толстого кишечника оценивается в ~ 25 % от общей активности в тонком кишечнике [116]. Таким образом, опасность гидролиза доставляемого белка остается серьезной проблемой и при доставке в толстый кишечник, особенно учитывая значительное время доставки.

Дополнительными трудностями служат сильные различия в микрофлоре (как интра- так и межиндивидуальные), и время транзита, которое может очень значительно варьироваться (от нескольких часов до десятков часов) [109].

3.2.1. Действие носителя защищающих белок от ферментов липосом [117], наночастиц [118] и др. Их преимуществом является способность получать лекарственные препараты, используя лишь уже одобренные лекарственные вещества без дополнительных химических модификаций и дополнительного включения других фармакологически-активных агентов.

Как правило, такие носители способны защитить препарат от ферментативного расщепления либо путем создания пространственных затруднений доступа фермента к белку, либо непосредственно ингибируя ферменты. Наиболее простой из стратегий преодоления протеолиза белков была доставка белков совместно с полимерами, способными уменьшить активность протеаз. Для этого применяли полиаллиламин [119], полиакриловую кислоту в виде сополимера с крахмалом [120], гидрогель полиакриловая кислота–полиэтиленгликоль–хитозан [121], и др. Кроме этого использовали способность некоторых полимеров или матриц на их основе связывать Ca2+, тем самым снижая оригинальный подход покрытия альбумином матрицы, содержащей белок [123, 124].

Протеазы расщепляли альбумин, что защищало доставляемый белок.

способными ингибировать протеолитические ферменты относятся полиакрилаты, тиолированные полимеры и конъюгаты полимеров с ингибиторами. В то время как механизм взаимодействия конъюгата ингибитор-полимер зависит от иммобилизованного ингибитора, ингибиторное действие полиакрилатов и тиолированных полимеров основано на их способности к комплексообразованию. Кроме прямого комплексообразования двухвалентных катионов, таких как Zn2+ или Са2+, мембраносвязанные ферменты также могут быть ингибированы с помощью «ингибиторного дальнего действия» [125, 126].

мукоадгезивными полимерами щеточной каемки эпителия [127]. Несмотря на отсутствие прямого контакта между полимером и мембраносвязанными ферментами, было показано, что мукоадгезивные полимеры могут ингибировать мембраносвязанные протеолитические ферменты, например, аминопептидазу.

Двухвалентные катионы, в частности, Zn2+ и Ca2+, являются важными кофакторами для большинства протеолитических ферментов. Поэтому их удаление из среды приводит к комплексообразующих веществ, способных удалять ионы из структуры ферментов.

Однако общая проблема применения комплексообразующих полимеров для пероральной доставки лекарственных средств заключается в высокой концентрации данных ионов в ЖКТ.

мультифункциональным полимером является хитозан-ЭДТА. Была оценена его эффективность для пероральной доставки пептидов [128] и плазмидной ДНК [129], а также для трансдермальной доставки препарата [130]. Основная идея при разработке хитозан-ЭДТА заключалась в объединении мукоадгезивных свойств хитозана с известными комплексообразующими свойствами ЭДТА. Было показано, что полимер способен ингибировать цинкзависимые протеазы, в том числе аминопептидазы А, N, P и W, а также карбоксипептидазы А, В, М и P. Хотя способность хитозана-ЭДТА связывать ионы кальция выше, чем у полиакрилатов, полимер не проявлял ингибирующих свойств на кальцийзависимые протеазы, такие как эластаза, химотрипсин или трипсин. Тем не менее, хитозан-ЭДТА, который может быть дополнительно использован в качестве матрицы для контролируемой системы доставки лекарственных препаратов, остается важным инструментом для доставки подверженных ферментативному гидролизу лекарств [66].

Проводились подробные исследования ингибирующего действия полиакрилатов и их производных на протеазы просвета кишечника и связанные со щеточной каемкой [125].

Было показано, что производные полиакрилата способны ингибировать трипсин, химотрипсин и карбоксипептидазы А и В [125, 131]. Предполагается, что механизм их действия заключается в связывании двухвалентных катионов, таким образом воздействуя на активность зависимых от них ферментов. Если это так, то ингибиторная способность полимера оказывается зависимой лишь от плотности кислотных групп полимера [132].

Ингибирующая способность карбопола определяется связыванием кальция [133].

Для сополимера метакриловой кислоты напротив, было показано, что сам полимер обладает ингибирующей способностью, хотя его способность связывать кальций невелика. В работе [132] предполагается, что взаимодействие с полимерами ведет к структурным изменениям фермента, ведущим к его автолизу. Сообщалось также, что некоторые мукоадгезивные полимеры, например карбомер, поликарбофил, демонстрируют ингибиторную способность против различных протеаз просвета кишечника, однако этот эффект недостаточен, для защиты доставляемого белка от деградации [134]. Установлено ингибиторное действие поликарбофила, хитозана и хитозан-глутамата на карбоксипептидазу в концентрациях 10 мг/мл. Действие поликарбофила на трипсин было времязависимым и вызывало неполное ингибирование [126]. Среди других полимеров, способных уменьшить активность протеаз, применялись полиаллиламин [119], полиакриловая кислота в виде сополимера с крахмалом [120], гидрогель полиакриловая кислота–полиэтиленгликоль–хитозан [121] и др.

Таким образом, на способность полимеров уменьшать протеолитическое действие ферментов влияет целый спектр факторов, таких как связывание двухвалентных катионов, pH, ионная сила и др. Тем не менее, достаточность защитного эффекта этих полимеров для предотвращения ферментативного гидролиза доставляемого препарата будет в основном зависеть от используемой лекарственной формы. Простое добавление в лекарственную форму полимера, например, полиакрилата или его производных, не считается достаточным для ингибирования ферментов в ЖКТ [131].

В большинстве случаев описанные выше системы доставки могут в определенной степени защитить препарат от ферментативного расщепления в ЖКТ, но они не способны полностью предотвратить гидролиз. Наиболее эффективная защита от протеолиза наблюдалась при включение ингибиторов протеаз в состав матрицы, содержащей белковые лекарственные вещества.

3.2.2. Ингибиторы протеолитических ферментов Для защиты от воздействия протеолитических ферментов тонкого кишечника – трипсина, химотрипсина, карбоксипептидаз и эластазы – предлагался метод одновременной доставки инсулина с ингибиторами протеаз [135, 136]. Использование ингибиторов ферментов должно быть основано на точных знаниях о ферментах, ответственных за деградацию белка. Методы in vitro включают исследования стабильности препарата в среде соков желудка и просвета кишечника, изолированных протеаз или слизистой оболочки кишечника [137]. Основываясь на собранной таким образом информации, может быть выбран наиболее подходящий ингибитор.

Эффективность использования ингибиторов ферментов при пероральной доставке была неоднократно показана, но остается под вопросом, в частности из-за опасений в отношении потенциальной токсичности [66]. Считается, что защитить белки от протеолиза могут только высокие дозы ингибиторов, способные вызвать побочные эффекты. Сообщалось, что ингибиторы протеолитических ферментов в высоких дозах могут вести к системной интоксикации [138], нарушению переваривания и в некоторых случаях гипертрофии или гиперплазии поджелудочной железы вследствие нарушения регуляции выработки секрета [139]. В связи с этим важно ограничить область действия ингибитора местом всасывания лекарства. В подавляющем большинстве случаев ингибиторы протеаз ковалентно связывали с полимерной матрицей, что уменьшает их реакционную способность за счет диффузионных затруднений и не позволяет защитить белки, высвобождающейся из матрицы.

Для их предотвращения возможно использование систем доставки и ингибиторов, обеспечивающих профиль высвобождения ингибитора аналогичный доставляемому лекарству [131]. Это должно позволить минимизировать общее количество доставляемого ингибитора и, соответственно, вызываемые им побочные эффекты. Другим путем минимизации побочных эффектов является использование конъюгатов полимерингибитор. При этом остается риск побочных эффектов, вызванных механизмом обратной связи. Вследствие этого важна контролируемая доставка лекарства и эффективная защита лекарства самой системой доставки [66].

3.2.2.1.

Недостатком не основанных на аминокислотах ингибиторов является их потенциальная токсичность Вследствие этого такие ингибиторы протеаз представляют больше теоретический интерес для пероральной доставки белков.

гипогликемического эффекта перорально вводимого инсулина [135]. FK-448, небелковый ингибитор химотрипсина, обладающий низкой токсичностью, исследовался на крысах и собаках в качестве агента для пероральной доставки лекарств. Его совместное введение с инсулином усиливало абсорбцию последнего из кишечника. Другими низкотоксичными представителями небелковых ингибиторов являются камостата мезилат и соли желчных кислот [136]. Среди других небелковых ингибиторов протеаз тонкого кишечника человека для пероральной доставки инсулина применялись неаминокислотные химостатин и эластинал [140], ингибитор аминопептидазы пуромицин [108], а также содержащий пептидные части ингибитор трипсина антипаин [140, 141].

преимущество по сравнению ингибиторами, не основанными на аминокислотах. Они в целом проявляют меньшую токсичность, легко производятся и недороги. Однако их маленький размер ведет к быстрой диссоциации от места абсорбции доставляемого белка и всасыванию в ЖКТ. Для достижения необходимого ингибирующего действия и улучшению доступности белка in vivo требуются большие количества ингибитора. В связи с этим подобные ингибиторы протеаз представляют больший интерес для других неинвазивных путей доставки инсулина, особенно, для назальной доставки [66].

Немодифицированные аминокислоты являются обратимыми и конкурентными ингибиторами экзопротеаз [142], но их низкая ингибиторная активность делает их малопригодными для пероральной доставки лекарств. Модифицированные аминокислоты, имеют бльшую ингибиторную активность.