«ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ УРОГЕНИТАЛЬНОГО ТРИХОМОНИАЗА В ГЕНДЕРНОМ АСПЕКТЕ ...»

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего

профессионального образования «Саратовский государственный

медицинский университет имени В.И. Разумовского» Министерства

здравоохранения Российской Федерации

На правах рукописи

Горчаков Дмитрий Александрович

ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ УРОГЕНИТАЛЬНОГО

ТРИХОМОНИАЗА В ГЕНДЕРНОМ АСПЕКТЕ

14.03.03 – Патологическая физиология Диссертация на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Научный руководитель доктор медицинских наук, профессор Луцевич Игорь Николаевич Саратов –

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ………………………………………………….…. ВВЕДЕНИЕ…………………………………………………………………......... ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ ОБ ЭТИОЛОГИИ, КЛИНИКЕ И

ПАТОГЕНЕЗЕ, ЭПИДЕМИОЛОГИИ УРОГЕНТИАЛЬНОГО

ТРИХОМОНИАЗА………………… …………………..………………………. Этиология трихомониаза – биология и морфология Trichomonas 1.1.

vaginalis…………….…………………………………….…………...…….……. 1.2. Клиника и патогенез трихомониаза, гендерные особенности ….…....…. 1.3. Эпидемиология трихомониаза ………………………………..…………... 1.4. Гендерные аспекты лабораторной диагностики трихомониаза………… 1.5. Экспериментальные исследования Trichomonas vaginalis…….…….….. 1.6. Заключение……………………………………………………………….… СОБСТВЕНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ………………………………………….... ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ……………… Общая характеристика обследованного контингента больных 2.1.

трихомониазом ………………………………………..……………………….... 2.2. Методы эпидемиологических исследований…………………………….. 2.3. Методы лабораторных исследований …………………………………….. 2.3.1. Микроскопические и культуральные методы………………………...... 2.3.2. Иммунологические, молекулярно-биологические методы, оценка оксидант/антиоксидантного статуса…………………………………………… 2.4. Методы экспериментальных исследований………………………………. 2.5. Статистическая обработка результатов………………………………...…. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ………………………………………......... ГЛАВА 3. МОНИТОРИНГОВЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ……………………… 3.1. Гендерные особенности эпидемиологических процессов распространения трихомониаза……………………………………………………………………. 3.2. Гендерные особенности иммунного статуса больных трихомониазом различного течения………………………………………………….………….. 3.3. Гендерные особенности показателей антиоксидантного статуса больных трихомониазом различного течения…………………………………………… 3.4. Гендерные особенности эффективности методов лабораторной диагностики трихомониаза……………………………………………………... ГЛАВА 4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ…………………. 4.1. Культивирование урогенитальных трихомонад, полученных от пациентов различного гендера, в стационарных условиях…...……................ 4.2. Выращивание урогенитальных трихомонад, полученных от пациентов различного гендера, в условиях проточного культивирования……………… 4.3. Экспериментальное изучение формирования резистентности урогенитальных трихомонад к препаратам 5-НИ в условиях проточного культивирования………………………………………………………………… ГЛАВА 5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ………………………………….. ВЫВОДЫ…………………………………………………...………….…….... ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ………………………………........ СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ………………………………….………………..

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

IgA – иммуноглобулины класса А IgG – иммуноглобулины класса G IgM – иммуноглобулины класса М CD – кластеры детерминант FGF-b – фибробластный фактор роста hЕGF – эпидермальный фактор роста ТФ – токоферол ацетат АКМ – активные кислородные метаболиты АОК – антиоксидантный коэффициент ВИЧ – вирус иммунодефицита человека ВОЗ – Всемирная организация здравоохранения ДГПЖ – доброкачественная гиперплазия предстательной железы ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота ДМЕМ –модифицированная по способу Дульбекко питательная среда Игла ИППП – инфекции, передаваемые половым путем ИФА – метод иммуноферментного анализа ЛКЦ – лечебно-консультативный центр ЛПУ – лечебно-профилактические учреждения МДА – малоновый диальдегид НСТ – нитросиний тетразолий ОКВД – областной кожно-венерологический диспансер ПОЛ – перекисное окисление липидов ПЦР – метод полимеразной цепной реакции УПМ – условно патогенные микроорганизмы УФ – ультрафиолет ФИ – фагоцитарный индекс ЦПМ – цитоплазматическая мембрана 5-НИ – 5-нитроимидазол

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования Трихомониаз по-прежнему остаётся серьёзной медико-социальной проблемой, существенно снижающей репродуктивную функцию человеческих популяций. Трихомониаз, его хронические формы, значительно увеличивают предрасположенность к заражению другими ИППП, в том числе ВИЧ-инфекцией (Аковбян В.А., 2000; Теличко И.Н., 2007; Petrin D., 1998). Актуальность проблемы урогенитального трихомониаза обусловлена, недостаточной изученностью патогенеза, высоким процентом диагностических ошибок. Мало изучены гуморальный и клеточный иммунитет при этой инвазии (Иванов А.М. с соавт., 2009), процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) и антиоксидантной (АО) защиты у больных трихомониазом с учётом гендерных особенностей (Колесникова Л.И. с соавт., 2011; Горчаков Д.А., Луцевич И.Н., 2013).

Показатели распространенности урогенитального трихомониаза до конца не уточнены (еще в 1962 г. И.И. Ировец сообщил, что трихомониазом поражено до 10% населения Земли). По официальным данным ВОЗ в мире в настоящее время ежегодно заболевают 180-200 млн. человек. Среди проституток, а также женщин с белями процент больных трихомониазом достигает 70-80%, при скрининговом обследовании различных контингентов выявляется до 5-30% женщин, больных урогенитальным трихомониазом, и до 6-15% мужчин – носителей инвазии (Adrian Mindel et al., 2013).

За период с 1997 года по 2008 год в России наблюдалось некоторое снижение заболеваемости трихомониазом: с 370 до 217 случаев на 100 тыс.

населения (Кубанова А.А. с соавт., 2010; Кисина В.И., 2005, 2010; Иванова М.А.с соавт., 2005, 2009). С.Р. Утц с соавт. (2012) установили аналогичную динамику снижения всех ИППП, включая трихомониаз, в Саратовской области.

Несмотря на позитивную эпидемиологическую динамику, наблюдается целый ряд и негативных процессов. Формируется социально-экономическая очаговость ИППП и трихомониаза в частности. В отдельных регионах наблюдается устойчиво высокий уровень заболеваемости этой протоинвазией, изменяется клиника трихомониаза, образуются резистентные популяции урогенитальной трихомонады (Захаркив Ю.Ф. с соавт., 2006;

Рюмин Д.В., Сюч Н.И., 2009; Белькова Ю.А., Козлов С.Н., 2011; Van Der Pol V., 2007).

Социально-экономическая очаговость трихомониаза и целого ряда других ИППП обусловлена теми глобальными экономическими и социальными изменениями, произошедшими в нашей стране в начале XXI века (Луцевич И.Н. с соавт., 2009; Кисина В.И., 2010; Горчаков Д.А. с соавт., 2010).

T. vaginalis обладает совершенным механизмом такого биологического феномена как наследуемая модификационная или неканоническая изменчивость (Инге-Вечтомов С.Г.1982; Женермон Ж., 1987; Софьин В.С. с соавт., 2005; Глыбочко П.В. с соавт., 2007; Горчаков Д.А. с соавт., 2011;

Diana F. Harp, 2011). Под влиянием различных средовых факторов, в том числе и лекарственных, урогенитальная трихомонада существенным образом изменяет свой фенотип, сохраняя патогенность. Модифицированный фенотип наследуется на протяжении нескольких поколений. Такого рода изменчивость T.vaginalis в значительной мере затрудняет диагностику трихомониаза, как микроскопическими методами, так и молекулярногенетическими, а также может лежать в основе механизмов резистентности к противопротозойным препаратам 5-НИ ряда.

Неканоническая изменчивость паразита может иметь различные проявления при паразитировании у хозяев различного гендера.

Понятие «гендер» особенно актуально при заболеваниях, передаваемых половым путем, в современных условиях сексуальной революции и распространения транссексуальности и гомосексуализма (Заславский Д.В., 2008; Пронина А.А., 2012). Венерические заболевания называют «болезнями поведения». Вероятность заражения ими во многом зависит от различных форм поведения в межличностных отношениях.

Таким образом, необходимость дальнейшего изучения проблем эпидемиологии, этиологии, патогенеза урогенитального трихомониаза, патогенетического обоснования принципов диагностики и лечения этой инвазии с учетом гендерного аспекта определили актуальность предпринятого исследования.

Установить патогенетические особенности урогенитального трихомониаза с учетом гендерной принадлежности больных.

Задачи исследования:

Изучить гендерные особенности эпидемиологических процессов трихомониаза в Саратовской области.

Выявить различия в патогенезе нарушений иммунного статуса и оксидант/антиоксидантной системы у пациентов мужского и женского полов при трихомониазе.

Разработать рекомендации по эпидемиологическому и лабораторному мониторингам трихомониаза с учётом гендерных особенностей.

Изучить морфо-физиологические особенности клинических изолятов этиологического объекта - Trichomonas vaginalis, полученных от пациентов мужского и женского полов в условиях стационарного и проточного культивирования.

Исследовать динамику развития резистентности Trichomonas vaginalis к препаратам 5-НИ ряда in vitro в гендерном аспекте для обоснования новых путей этиологической терапии.

Научная новизна исследования:

эпидемиологических процессов трихомониаза в Саратовской области, его социально-экономическая очаговость.

иммунного статуса и состояния антиоксидантной системы больных трихомониазом различного течения и гендерной принадлежности.

Впервые изучена фенотипическая изменчивость клинических изолятов Trichomonas vaginalis, полученных от пациентов мужского и женского полов микроферментёре собственной конструкции.

Выявлена динамика развития устойчивости Trichomonas vaginalis, полученных от пациентов различного пола, и установлен один из возможных механизмов резистентности к препаратам 5-НИ ряда.

Научно-практическая ценность исследования:

Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о наличии у Trichomonas vaginalis изменчивости, формирование которой имеет гендерные особенности.

изменчивости могут быть использованы при разработке алгоритмов лабораторной диагностики и критериев излечиваемости трихомониаза.

резистентности Trichomonas vaginalis к 5-НИ ряда необходимо учитывать при назначении курса лечения больным с учётом их пола.

Реализация результатов исследования Результаты диссертационного исследования используются в лечебнодиагностическом процессе ММУП «Лечебно-консультативный центр, г.

Саратов»; ГУЗ «Саратовский областной кожно-венерологический диспансер»; в клинике кожных и венерических болезней ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздрава России (акты внедрения №11, №12, №13 от 18.02.2014 г.).

Основные положения работы используются при чтении лекций и проведении практических занятий на кафедрах клинической и лабораторной диагностики ФПК и ППС, кожных и венерических болезней ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздрава России (акты внедрения №98, №99 от 10.01.2014 г.).

Положения, выносимые на защиту:

Патогенез нарушений иммунного статуса и оксидант/антиоксидантной системы больных трихомониазом различного клинического течения имеет гендерные особенности.

2. Trichomonas vaginalis модификационным изменениям, что объясняет многочисленные артефакты диагностики и лечения трихомониаза.

Существует гендерная зависимость патогенетичсеких механизмов формирования резистентности Trichomonas vaginalis к препаратам 5-НИ Гендерные особенности трихомонадной инвазии должны учитываться при эпидемиологическом мониторинге и при лабораторной диагностике этого заболевания, а также при назначении методов и схем лечения с применением иммуномодуляторов.

Апробация диссертации представлены на объединенном Пленуме Научных советов Российской Федерации по экологии человека и охране окружающей среды и по медико-экологическим проблемам здоровья работающих «Научно-методические и законодательные основы обеспечения генетической безопасности факторов и объектов окружающей и производственной среды в целях сохранения здоровья человека» (Москва, 2010).

Пленуме Научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды Российской Федерации «Актуальные проблемы здоровья человека и среды его обитания» (Москва, 2011).

2-м Континентальном Конгрессе дерматологов МОД ( СПб., 2011);

Конференции дерматологов и косметологов Приволжского Федерального округа (Казань, 2011).

Международном форуме по проблемам науки, техники и образования (Москва, 2012).

Личный вклад автора в исследование Автор диссертационного исследования – врач-дерматовенеролог высшей категории, лично принимал участие в обследовании больных ИППП; проводил эпидемиологический анализ трихомониазной патологии на территории Саратовской области за период с 2008 по 2012 гг.; производил забор биологического материала и определение лабораторных показателей.

Принимал непосредственное участие в назначении лечения больным, контроле их состояния во время и после лечения. Автор является разработчиком патента на полезную модель мужского урологического тракта для проточного культивирования патогенных микроорганизмов, на которой им лично была проведена основная часть экспериментальных исследований.

В работе соискателем самостоятельно проанализированы истории болезни больных трихомониазом за 2008 – 2012 гг.; полученные в результате научного исследования материалы, выполнена статистическая обработка, сформулированы выводы и практические рекомендации.

Публикации По материалам диссертации опубликованы 12 научных работ, из них в рецензируемых журналах перечня ВАК Минобрнауки РФ, 1 монография.

Получен патент на полезную модель №126703 «Модель мужского урологического тракта для проточного культивирования патогенных микроорганизмов».

Объём и структура работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы, трех глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и практических рекомендаций, библиографического указателя; изложена на 134 страницах, содержит 5 таблиц, иллюстрирована 14 рисунками. Список литературы включает 287 наименований (207 отечественных и иностранных источников).

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Эффективность лечения и профилактики трихомонадной инвазии, отличающейся сложным патогенетическим механизмом, разнообразием возможностей современных диагностических технологий и их комбинаций. В происходящих в системе «паразит-хозяин» при протоинвазии, а тем самым и контроль качества и эффективности лечебно-профилактических адаптивных возможностей, эволюции.

Этиология трихомониаза - биология и морфология Трихомониаз относится не к инфекциям, которые вызываются эукариотическим организмом Trichomonas vaginalis (Павловский Е.Н., 1941;

Догель В.А. 1975).

общебиологических позиций к проблемам, которые имеют место при диагностике, лечении и профилактике этого заболевания. (Софьин В.С. с соавт., 2003; Глыбочко П.В. с соавт., 2007; Пляченко Д.А., 2007; Горчаков Д.А. с соавт., 2010). Проблема заключается в том, что Подцарство Protozoa – «Простейшие» далеко не примитивные организмы, как следует из их исторически сложившегося таксономического названия, и относятся к Царству – Animalia «Животные». В этот таксономический уровень они подвижностью, гетеротрофным и голозойным типом питания (Полянский Ю.И., Райков И.Б. 1977; Полянский Ю.И. 1981; Sleigh M.A 1973).

оформленное ядро, содержащее наследственный материал весьма большого объёма. По данным исследователей из The Institute for Genomic Research (TIGR) T. vaginalis содержит в своем геноме 80-90 млн. пар нуклеотидных оснований, при этом функционально активных генов насчитывается 25- тысяч ( Djana F. Harp, Indrajit Chowdhury, 2011).

Такой сложный и объёмный геном позволяет предположить, что эти микроскопические одноклеточные представляют определённую ступень в эволюции эукариот, давших начало ряду прогрессивных филогенетических ветвей (Полянский Ю.И., 1981; Карпов С.А., 2001; Дмитриев Г.А., с соавт;

2005; Samuelson J., 1999; Djana F. Harp, Indrajit Chowdhury, 2011).

Открытие Trichomonas vaginalis связывают с именем французского ученого Донне (Alfred Franois Donn) в 1836 году. С.Р.Утц с соавт. (2013) указывают на более позднюю дату, руководствуясь малоизвестными биографическими данными учёного. По мнению авторов, Донне точно идентифицировал T. vaginalis в 1845 году, а не в 1836 году, как указывает большинство источников. Донне описал простейшего, жгутиконосца, которого обнаружил в соскобах из женских половых путей при остром воспалении последних, изначально полагая, что это вызвано гонореей.

Несколько позже им было установлено, что этот организм часто встречается в женских половых путях. Сегодня трудно сказать, почему этот паразит не был обнаружен в мужском урогенитальном тракте. Не исключено, что в тот период времени T. vaginalis паразитировала исключительно в женских половых путях (Утц С.Р. с соавт., 2013).

пересматривалось и сейчас наиболее обоснованной с эволюционной точки зрения является систематика С.А. Карпова (2001), согласно которой Parabasalea, отряду Trichomonadida, семейству Trichomonadidae, роду Trichomonas, виду Trichomonas vaginalis.

Выявлено более 60 видов трихомонад, способных паразитировать у рыб, амфибий, рептилий, птиц и крупного рогатого скота (Карпов С.А., 2001). У человека обнаружено только три вида трихомонад: урогенитальные – T. vaginalis (Donne, 1836), ротовые – Т. tenax (Т.elongata) (Muler, 1773), кишечные - Т. intestinalis (Т. hominis) (Davaine, 1860). Т. tenax и Т. intestinalis не вызывают воспалительный процесс в урогентальном тракте человека, пищеварительного тракта (Sogin MX., 1998; Суханова К.М., 2000; Теличко И.Н., 2007).

Биологии и морфологии Trichomonas vaginalis посвящено достаточно Фундаментальный характер носят исследования Бакшеева Н.С., Падченко И.К. (1972), Падченко И.К. (1977), Овчинникова Н.М., Делекторского В.В.

(1986), Васильева М.М. (1990), Цветковой А. с соавт. (1990), Ильина И.И.

(1991), Бедновой В.Н. с соавт. (1996), Межеветиновой Е.А. (1999), Клименко Б.В с соавт. (2001); А.С. Козлюка, В.А. Козлюка (2001); Копылов В.М. с соавт. (2001), Дмитриева Г.А. с соавт.(2005); Теличко И.Н., 2007; Сюч Н.И. с соавт.(2010); обзоры Thomason J.L., Gelbart S.M. (1989), Dino Petrin et al.

(1998), С Bogdan (1999), J. Samuelson (1999).

Размеры клетки Т. vaginalis в среднем составляют 10-20 мкм, Т. tenax мкм, Т. intestinalis - 8 мкм. В чистой культуре Trichomonas vaginalis имеет овальную или округлую форму длиной 10 мкм и шириной 7 мкм (Рюмин Д.В., Сюч Н.И., 2009). И.И. Ильин (1991) предполагает что величина трихомонад зависит от стадии заболевания: мелкие особи (8-10 мкм) чаще определяют при остром течении заболевании, крупные — до 30-45 мкм — при хроническом.

Выявлены определённые особенности в размерах клетки трихомонад, связанные с полом хозяина. T. vaginalis, выделенные от больных женщин, больше по размерам и составляют в среднем 1923 мкм, в то время как выделенные от мужчин — 1315 мкм (Козлюк А.С., Козлюк В.А. 2001).

Фенотип урогенитальной трихомонады меняется в зависимости от физико-химических условий среды и фазы роста (Копылов В.М. с соавт., 2001; Глыбочко П.В. с соавт., 2007; Горчаков Д.А. с соавт, 2012; Batailard I.F.,1982). Когда трихомонада прикрепляется к клетке хозяина, она приобретает амебовидную форму с многочисленными псевдоподиями, повторяющими контур эпителиальной клетки (Овчинников Н.М., Делекторский В.В., 1986; Клименко Б.В. с соавт., 2001; Bogdan С., 1999).

Строение трихомонады может существенно изменяться и в результате воздействия противопротозойных препаратов, причем в одних случаях они увеличиваются в размерах, а в других уменьшаются (Полещук Н.Н. с соавт., 2004; Сюч Н.И., Мачкалян К.Э., 2004; Рюмин Д.В., Сюч Н.И., 2009; Махлай Н.С., 2010; Морева Ж.Г. с соавт., 2010).

В настоящее время, благодаря электронной микроскопии, доказано существование нескольких форм Trichomonas vaginalis. Исследования Н.М.

Овчинникова и В.В. Делекторского (1986) убедительно показали, что и в культурах, и в свежевыделенном материале от больных трихомониазом Т.

vaginalis может существовать одновременно как минимум в трех морфологических формах: грушевидной (жгутиковой), амебоидной и круглой (шаровидной). Уретральные трихомонады отличаются по морфологии и размерам от вагинальных (Клименко Б.В., 2001 г).

Однако в лабораторно-клинической практике основополагающим диагностическим критерием является грушевидная или амебоидная формы (Дмитриев Г.А., Сюч Н.И., 2005; Марданлы С.Г., Куляш Г.Ю., 2011).

Уретральные трихомонады отличаются от цервикальных не только размерами, но и морфологией (Клименко Б.В., с соавт., 2001; Полещук Н.Н. с соавт., 2003; Naidoo S. еt al., 2001). В одном мазке можно различить до морфотипов с хорошо выраженными признаками тех или иных форм трихомонад (Полещук Н.Н. с соавт., 2004). При этом в уретре мужчин можно встретить все морфотипы, в простате они менее разнообразные.

ланцетовидную и овальную форму, а вагинальная имеет самые большие размеры из всех выявленных морфотипов, благодаря комфортной среде обитания. Полещук Н.Н. с соавт. (2004) считает, что эти трихомонады не способны инфицировать уретру мужчин, а инвазионной формой является цервикальная.

Фенотип Т. vaginalis зависит от клинической формы вызываемого ей заболевания. Козлюк А.С., Козлюк В.А. (2001), используя культуральноцитологический метод с использованием диагностикума «ТрихомонаСкрин» установили, что при острых воспалительных процессах простейшие имели классическую грушевидную форму, которая при дальнейшем культивировании сменялась шаровидной. Аналогичные результаты получил И.Н. Теличко (2007). При хронических простатитах и хронических цервицитах выявлены трихомонады, лишенные жгутиков и неправильной, амёбовидной формы с активной фагоцитарной деятельностью.

Ядро клетки Т. vaginalis имеет овальную форму, в отличие от кишечных трихомонад (Т. hominis), имеющих ядро округлой формы.

Диаметр ядра в среднем составляет 3-5 мкм (Овчинников О.Н, Делекторский В.В, 1986; Honingberg В.М., 1990). Строение ядра характерно для эукариотов.

Оно окружено двухслойной ядерной мембраной, пронизанной многочисленными порами; иногда наблюдается два ядра. Снаружи ядерная мембрана покрыта рибосомами. Содержимое ядра состоит из мелкозернистой кариоплазмы и ядрышка (Овчинников Н.М., Делекторский В.В., 1986).

Хроматин в ядре рассеян диффузно. Около ядра наблюдаются скопления гранул элементов эндоплазматической сети.

Ундулирующая мембрана Т.vaginalis достигает середины клетки.

Напротив, у кишечной трихомонады она протягивается за пределы клетки и заканчивается свободным жгутом. Ундулирующая мембрана характерна только для паразитических простейших (Суханова K.M., 2000; Карпов С.А., 2001). Honingberg B.M., King V.M. (1964) полагают, что формирование этой структуры у паразитов вызвано особыми условиями среды обитания.

Ундулирующая мембрана не только орган движения, она увлекает пищевые ундулирующей мембраны и жгутиков в пищевом процессе говорит и наличие в них лизосом (Овчинников Н.М., Делекторский В.В., 1986).

В цитоплазме жгутики прикрепляются к специальным структурам — блефаропластам, содержащим АТФ. Предполагается, что блефаропласты обеспечивают рост жгутиков и энергетику их движения (Nielsen et al., 1976).

При неблагоприятных условиях T.vaginalis «прячет» жгутики в цитоплазму и трансформируется в овальную форму, что послужило поводом для того, чтобы предположить способность трихомонад к образованию цист. Эта догадка в последствии не нашла подтверждения. От базальных тел, блефаропластов внутрь клетки отходят различные цитоскелетные структуры:

формирующие гребень, к которому прилегает возвратный жгутик. Основной функцией этих структур является связывание и укрепление возвратного жгутика с поверхностью клетки (Овчинников О.Н., Делекторский В.В., 1986;

Honingberg В.М., 1978; Раздольская Н.В. 2009). Пельта серповидной формы, состоит из многочисленных микротрубочек, расположенных по всей ее длине. Аксостиль проходит по всей длине клетки простейшего, а его задний плазмалеммой. Пельта-аксостилярный комплекс образует развитый цитоскелет всех парабазалий.

митохондрии, что представляет одну из их специфических особенностей (Овчинников О.Н., Делекторский В.В., 1986; Суханова К.М., 2000;

Honingberg В.М., King V.M., 1964). Морфо-функциональным аналогом гидрогеносомы получили вследствие того, что они способны вырабатывать молекулярный водород. В клетке трихомонад гидрогеносомы расположены около вогнутой поверхности косты (паракостальные) и возле аксостиля (паракостилярные) (Honingberg В.М., 1978). Размер гидрогеносом составляет от 0,5 до 1,0 мкм в диаметре. Снаружи эти органеллы покрыты плотной мелкозернистый матрикс (Овчинников О.Н., Делекторский В.В., 1986;

Honingberg В.М., King V.M., 1964; Honingberg В.М., 1990; Benchimol M., 2001).

Ультрагистохимическое исследование гидрогеносом показало высокую активность ферментов MG2F-3ABIICIIMORI и транспортной (Na+, К+) зависимой АТФ-азы и аденилатциклазы, что свидетельствует о наличии активного ионного транспорта в этих органеллах (Беднова В.Н., 1989). В отличие от митохондрий в гидрогеносомах отсутствуют кристы, цитохромы и ДНК (Nielsen М., Diemer N.H., 1976).

По мнению J. Kulda (1999), гидрогеносомы могут обеспечивать лекарственную устойчивость трихомонад. В цитоплазме также содержатся активность.

Т. vaginalis имеет диплоидный набор хромосом 2п=6, однако половой процесс не известен (Yuh Y.S. et al., 1997).

В 1964 году И.К. Падченко подробно описал стадии развития урогенитальной трихомонады, первым из отечественных ученых указав на одновременно существовать в различных формах: грушевидной, амебоидной и возможно округлой. Наиболее типичной, с точки зрения морфологии, является грушевидная форма клетки (Овчинников О.Н. с соавт., 1987;

Козлюк А.С., Козлюк В.А. 2006).

сопровождается изменением формы и величины клетки, клетка становится крупнее (30 мкм). Амебоидные формы Т.vaginalis обладают выраженной фагоцитарной активностью по отношению к эпителиальным клеткам, лейкоцитам и эритроцитам (Васильев c соавт. 1988; Баткаев Э.А., Рюмин Д.В., 2002; Дмитриев Г.А., 2003; Козлюк А.С., Козлюк В.А. 2006).

Honingberg В.М. (1990) отмечал, что в отдельных случаях они полностью повторяют форму эпителиальной клетки, на поверхности которой паразитируют, образуя многочисленные псевдоподии.

В настоящее время многими исследователями ставится под сомнение наличие округлых морфологических форм Т. vaginalis (Ильин И.И., 1991;

Баткаев Э.А., Рюмин Д.В., 2002; Клименко Б.В. и др., 2001). В то же время фундаментальные исследования И.Н. Теличко (2007) убедительно доказывают жизнеспособность таких форм и их патогенность. Аналогичные данные представлены в работе Пляченко Д.А. (2007).

Единственной известной формой размножения Т.vaginalis является митотическое деление клетки (Падченко И.К. с соавт. 1974; Суханова К.М., 2000; Honingberg В.М., 1990). Митотическое деление клетки сопровождается сложной перестройкой цитоплазматических органелл.

направлении. Помимо монотомии у Т. vaginalis известен также способ множественного деления клеток (Падченко И.К. 1977; Овчинников О.Н. и др., 1987; Клименко Б.В. и др., 2001). При данном способе размножении ядра делятся без цитокинеза, в результате чего образуются многоядерные клетки простейшего. У людей, больных трихомонозом, такие клетки образуются в большей степени в период лекарственной терапии, а в культурах in vitro при добавлении в питательную среду различных солей и щелочей (Клименко Б.В.

с соавт., 2001).

Изучение антигенных свойств влагалищной трихомонады было начато ещё в 50-60-е годы ХХ столетия (Террас Ю.Х., 1964; Корик Л.М., 1966;

Lanceley, 1953). Honigberg В.М. (1978) установил, что количество серотипов, определяемых поверхностными антигенами, колеблется от 2 до 8. Ackers J P.

(1990) выделил 8 серотипов. Некоторые исследователи считают, что степень патогенности различных серотипов определяется поверхностными антигенами (В.Н. Беднова соавт., 1996). Существенный вклад в изучение серологических свойств урогенитальной трихомонады внес И.Н. Теличко (2007), детерминант у этого простейшего.

В ходе эволюции у влагалищной трихомонады сформировались довольно эффективные механизмы защиты против организма хозяина. Так, жгутики препятствуют контакту простейшего с клеткой-фагоцитом, а комплекс ферментов, выделяемых трихомонадами в окружающую среду (гиалуронидаза, нейраминидаза, клеточный разъединяющий фактор и др.) могут использоваться паразитами как средства агрессии к клеткам и тканям организма человека (Баткаев Э.А., Рюмин Д.В., 2001).

модификационной изменчивости Trichomonas vaginalis и ее потенциально высоких адаптационных возможностях (Софьин В.С. с соавт., 2003). При этом модификационная изменчивость носит наследственный характер, что является уникальным явлением для животного мира, но характерным для Пляченко Д.А., Софьин В.С., 2005; Пляченко Д.А., с соавт., 2007; Горчаков Д.А. с соавт., 2011; Горчаков Д.А. с соавт., 2012).

Глава 1. 2. Клиника и патогенез трихомониаза, гендерные особенности Клиническая манифестация урогенитального трихомониаза, описанная в многочисленных учебниках, пособиях и руководствах, претерпела за более чем вековую историю этой нозологии существенные изменения. Согласно данным ряда авторов трихомониаз в последние годы характеризуется следующими особенностями: латентностью, склонностью к переходу в хроническую форму, субъективно-асимптомную, увеличением числа осложнений, частыми рецидивами (Жуков В.И., 1982; Абдумаликов P.A., 1995; Чеботарев В.В. и соавт., 2003; Чуприн А.Е., 2005;Теличко И.Н., 2007;

Djana F. Harp et al., 2011; Christina A Myzny et al., 2013).

Предполагается, что трихомонадная инвазия в ряде случаев может проявляться в виде бессимптомного носительства, просто носительства и латентного течения. Бессимптомное носительство наблюдается в случаях отсутствия у простейших условий для быстрого размножения. Просто носительство связывают с отсутствием каких-либо заметных патологических проявлений инфекции, когда инфекция пребывает в «заторможенном»

состоянии, при этом расходуется минимум ресурсов макроорганизма. Для латентного течения характерны внешне скрытые, но существенные локальные и системные изменения. Выраженная симптоматика появляется лишь тогда, когда изменения в слизистой достигают критических масштабов и приводят к серьезным поражениям органов. В хронических случаях отсутствуют такие симптомы как боль и бели, несмотря на обнаружение трихомонад в отделяемом мочеполовых органов, что особенно характерно для беременных (Клименко Б.В. с соавт., 2001).

У мужчин трихомонада была обнаружена значительно позднее. В 1888 году Kunster обнаружил влагалищную трихомонаду у мужчин в моче, а Marchand и Miura. В 1910 году трихомонада была выделена профессором кафедры кожных и венерических болезней Московского медицинского университета Иваном Фёдоровичем Зеленевым из секрета предстательной железы у мужчин с простатитом. (Анчупане И.С., 1992; Утц С.Р. с соавт., 2013).

Среди практикующих врачей до настоящего времени существует убеждение в том, что трихомониаз не является моноэтиологической патологией и что хронически персистирующая трихомонада не нуждается в удалении (Тиквинский O.K., Михайленко В.В., 1999). Такое мнение есть не что иное, как возврат к далекому прошлому. До 1927 года на трихомониаз мужчин уже существовал взгляд как на сапрофитное носительство.

У мужчин трихомонады поражают уретру, семенные пузырьки, предстательную железу, купферовы железы, мочевой пузырь и почечные лоханки. (Ильин И.И., 1991; Тиквинский О.Е. с соавт., 1999; Скрипкин Ю.К.

с соавт., 2001; Dino Petrin et al., 1998).

Воспалительная реакция в мочеполовых путях развивается при наличии большого количества паразитов (Межевитинова Е.А., 1999).

Нередко развивается восходящая инфекция-инвазия мочевыводящих путей (цистит, пиелит, пиелонефрит). Осложнения при трихомонадных уретритах у мужчин происходят чаще, чем при гонорее (Иванов О.Л., 1999; Скрипкин Ю.К. с соавт., 2001).

Trichomonas vaginalis, попадая в половые пути нового хозяина, начинают адаптироваться к условиям обитания. В зависимости от этих условий формируются соответствующие морфотипы и поведенческие реакции, включая способ питания (Козлюк А.С., Козлюк В.А., 2001; Сюч Н.И., Рюмин Д. Ю., 2009). При неблагоприятных условиях трихомонада прикрепляется к клеткам эпителия за счёт адгезии и начинает активно фагоцитировать клеточные элементы. Адгезия трихомонад к эпителиальным клеткам, фагоцитоз клеток хозяина, выделение цистеинпротеиназ являются существенными факторами патогенеза урогенитального трихомониаза (Козлюк А.С., Козлюк В.А., 2001; Marlene Benchimol, 2004; Ivana V. Radonjic et al., 2005).

Клиническое течение трихомониаза зависит как от вирулентности чувствительности и реактивности организма человека. Ю.Х. Террас (1964) установил, что клиническая форма уретрита зависит от вирулентности влагалищной трихомонады. Им было установлено, что из 155 клинических изолятов (автор называл их «штаммами») 69 оказались сильной вирулентности, 65 – средней и 21 – слабой. Из 39 изолятов Trichomonas vaginalis, выделенных от больных, страдавших острым трихомонадным уретритом, 37 были сильной вирулентности и только 2 слабой. Из изолятов, полученных от хронических и латентных больных трихомониазом, сильной и средней вирулентности было 46 (73%) и слабой вирулентности – 17 (23%).

Ряд исследований показали, что Trichomonas vaginalis не вырабатывает экзотоксины как таковые, но токсигенным действием обладают метаболиты её жизнедеятельности (Kulda J.1967; Krieger J N, et al., 1990). При этом не следует считать, что трихомониаз обусловлен только местным процессом, протекающем на территории урогенитальных органов мужчин и женщин.

Каких-то специфических, «трихомонадных» поражений клеток и тканей этих органов не отмечается (Дмитриев Г.А., Сюч Н.И., 2005). Несомненно, трихомонадная инвазия отражается на общем состоянии больного, и здесь отчётливо должны прослеживаться гендерные особенности (Горчаков Д.А. с соавт., 2012).

Тем не менее в ряде работ показано, что при определенных условиях трихомонады не вызывают никаких ответных реакций или провоцируют развитие слабо манифестных симптомов (Васильев М.М., 1990;

Анчупане И.С., 1992; Абудуев И.К, 2001; Клименко Б.В. с соавт., 2001).

Возникает своего рода динамическое равновесие, которое под влиянием тех или иных факторов может нарушиться как в сторону развития заболевания, так и в сторону его затухания, сопровождающегося элиминацией трихомонад (Абдумаликов Р.А., 1995).

Урогенитальные трихомонады фиксируются в уретре на клетках плоского эпителия, могут проникать в железы мочеиспускательного канала и лакуны, внедряться в дополнительные половые железы. Некоторые авторы отмечают способность трихомонад продвигаться по лимфатическим путям вплоть до лимфоузлов (Аковбян В.А., 2000; Твердохлеб С.А. с соавт., 2001).

По мнению И.И. Ильина (1991), у мужчин трихомонады находятся главным образом в дистальном отделе уретры. Но некоторые авторы (Скрипкин Ю.К., Мордовцев В.Н., 1999; Чуприн А.Е., 2005; Теличко И.Н., 2007) утверждают, что не уретра, а предстательная железа служит основным местом обитания трихомонад. Установлено, что довольно часто при асимптомном носительстве трихомонады локализуются в предстательной железе (от 10,6% до 27,8%).

Trichomonas vaginalis нельзя отнести ни к чисто полостным, ни тканевым паразитам, так как они могут обитать как на эпителии слизистых урогенитального тракта мужчин и женщин, так и проникать достаточно глубоко в ткани, благодаря наличию протеаз (Coombs G.H., North M.I., 1983;

Fiori P.L. et al., 1999). Это обуславливает такие клинические проявления как инфильтраты, различной степени выраженности в подслизистом слое, эрозии и язвы, метаплазия эпителия. Очевидно, что именно с выделением протеолитических экзоферментов и других биологически активных веществ связан механизм воспалительных явлений при трихомониазе. Об этом говорит и тот факт, что инстилляция в уретру здоровых мужчин взвеси убитых трихомонад не вызывает воспалительных явлений, в то же время вытяжка из суспензии трихомонад может вызвать уретрит (Honigberg B.M. et al., 1964). На основе этих экспериментов, был сделан вывод: адгезия трихомонад к эпителию слизистых мочеполовых путей – один из основных механизмов патогенеза трихомониаза. Особенно при паразитировании Trichomonas vaginalis в женских гениталиях (Alderete J. F., 1986; Borchardt K.

et al., 1996).

Объективно манифестная форма трихомонимаза у мужчин выражена менее интенсивно, чем у женщин. В то же время каких-либо специфических патогистологических изменений в тканях уретры у мужчин и женщин при трихомониазе не отмечается (Бакшеев Н.С., Падченко И.К., 1971; Клименко Б.В. с соавт., 2001).

уменьшению гликогена в эпителии слизистой ладьевидной ямки, что приводит к нарушению кислотного барьера и облегчает развитие условнопатогенной и сапрофитной флоры (И.И.Ильин, 1991).

Однако острую трихомонадную инвазию следует считать чисто протозойным процессом, если одновременно не произошло заражение гонококками, хламидиями или другими патогенными микроорганизмами (Копылов В.М. с соавт., 2001; Dino Petrin et al., 1998).

Существенную роль в развитии трихмониазного процесса может играть так называемая TANK-функция Trichomonas vaginalis. Понятие TANKфункции трихомонады предложено на III Международном конгрессе по акушерству и гинекологии (г. Одесса, 2000 г.) и использовано для удобства обозначения уникального свойства этого паразита (Венцковский Б.М. с соавт., 2000).

Трихомонада напоминает цистерну (TANK - англ. – “цистерна”) и по своим линейным размерам превышает во много раз размеры вирусных и микробных частиц. Её размеры и способность к активному эндоцитозу позволяют паразиту «поглощать» и более крупные субстанции. Многими авторами было отмечено, что внутри трихомонады могут находиться гонококки, сперматозоиды и т.д. В 1999 году В. В. Делекторским и О.А.

Голодовой было доказано, что трихомонада является резервуаром не только для возбудителей бактериальных инфекций, но и для микоплазменной и хламидийной инфекций. Полноценного фагоцитоза, то есть образования эндосом и лизиса захваченных частиц, при этом не происходит. Другими словами, трихомонада является неким универсальным защитным и транспортным средством для множества остальных ИППП, т.е. выполняет TANK-функцию.

TANK-функцией объясняются многие случаи неудач в лечении гонореи, хламидиоза, микоплазмоза, а также вирусных поражений полового тракта.

С TANK-функцией трихомонад может быть связана многоочаговость поражения при данном заболевании, его хронизация, проблемы в его лечении (Щербакова Н.И., Брагина Е.Е., 1982; Овчинников Н.М., Делекторский В.В., 1986; Васильев М.М., 1990; Копылов В.М. с соавт., 2001;

Козлюк А.С., Козлюк В.А., 2001).

Практический интерес при изучении патогенеза трихомониаза представляют исследования иммунологического статуса больных (Апчел А.В., 2010; Иванов А.М. с соавт., 2009). Ответные реакции иммунной системы также имеют гендерные особенности. Н.К. Абудуев (2001) своими исследованиями доказал, что наиболее частыми изменениями в иммунном статусе организма мужчин с инфекциями мочеполового тракта, независимо от этиологического фактора, являются выраженный лимфоцитоз, повышенное содержание в крови В-лимфоцитов и снижение показателей фагоцитарной активности нейтрофилов. Отмечается как увеличение, так и уменьшение абсолютного и относительного содержания и функциональной активности Т- и В-лимфоцитов в периферической крови.

Гуморальное звено иммунитета характеризовалось высокой концентрацией в сыворотке крови IgG и IgM. Кроме того, отмечены нарушения фагоцитарной активности лейкоцитов (Абулаев Н.К., 2001).

А.А. Зикеевой (2012) были выявлены изменения иммунного статуса у пациентов мужского пола с папилломавирусной инфекцией в сочетании с урогенитальным трихомониазом, что свидетельствовало об активной реакции иммунной системы на одновременную агрессию вирусного и паразитарного агентов. По данным автора, это проявлялось угнетением фагоцитарной активности макрофагов и гранулоцитов; гиперплазией Т-клеточного звена (с увеличением как относительного, так и абсолютного числа СD3+клеток), что было обусловлено не только увеличением относительного и абсолютного числа СD4+ Т-клеток за счет уменьшения относительной доли и абсолютного числа NК-клеток, но и увеличением абсолютного числа СD8+ Т-клеток;

увеличением в сыворотке крови количества С3 и С4 компонентов комплемента, уровней IgM, С-реактивного белка и циркулирующих иммунных комплексов (Зикеева А.А., 2012) Исследования показали, что иммунная система человека не остаётся безучастной к любому воздействию чужеродного фактора на организм человека в независимости от первичной локализации инфицирования или инвазирования.

Разумеется, что адекватность и сила этого ответа зависит от множества эндогенных и экзогенных факторов (Хаитов Р.М. с соавт., 2000).

Одним из таких факторов неоднозначности иммунного ответа являются гендерные особенности. Гендерные различия в иммунной системе мужчин и женщин, проявляются не только в периоды гормональной перестройки, но и в другие периоды жизни (Татарчук Т. Ф. с соавт., 2003).

Согласно данным C.J. Grossman et al. (1994) у женщин как гуморальная, так и клеточная составляющие иммунного ответа более выражены, чем у мужчин (длительнее продолжительность иммунного ответа, более низкий порог для его развития, а также выше пик антител). Это подтверждает существование феномена, называемого в литературе иммунологическим половым диморфизмом. Он состоит, прежде всего, в более выраженной реакции женского организма на экзогенные инвазивные факторы — инфекция, чужеродное вмешательство и др. Так, уровень IgM выше у женщин, чем у мужчин, а уровень IgG практически не отличается. Кроме того, у женщин обнаружен более высокий уровень Т-хелперных и меньшее содержание Тсупрессорных клеток, то есть более выраженная активация В-системы иммунитета, что и объясняет вышеупомянутые различия в содержании антител (Grossman C.J. et al., 1994). Общеизвестно, что на все экзогенные факторы женский организм реагирует более остро, чем мужской. Это прослеживается как на уровне системного иммунитета, так и на уровне секреторного (местного).

Сложность и гендерная неоднозначность патогенеза трихомонадной инфекции связаны еще и с тем, что при этом заболевании складываются интеграционные и конкурентные взаимоотношения патогенных микроорганизмов и симбионтов, формирующих индивидуальный микробиоценоз у больных (Муравьева В.В., Анкирская А.С., 1999; Клименко Б.В. с соавт., 2001; Софьин В.С. с соавт., 2003; Малова И.О., 2004).

С биохимической точки зрения трихомониаз женщин является дисбиотическим явлением, в основе которого лежат конкурентные метаболические взаимоотношения между ацидофильной и анаэробной микрофлорой. Нарушение функциональной активности эпителия создает благоприятные условия среды для жизнедеятельности трихомонад (Кира Е.Ф., 2001; Corbeil L.B., 1995).

Можно предполагать, что в последнее время несколько увеличилось число пациенток с торпидными формами заболевания. Это может быть связано с широким применением препаратов из группы 5-нитроимидазолов в неадекватных дозировках, что приводило к увеличению доли резистентных штаммов Т. vaginalis (Горчаков Д.А. с соавт., 2012; Утц С.Р. с соавт., 2013).

У мужчин трихомониаз зачастую может протекать асимптомно или клинически субманифестно. Значительные расхождения в описаниях клинической симптоматики трихомониаза разными авторами трудно объясняются и, скорее всего, связаны с типом ЛПУ, в котором проводилось исследование, социальным статусом контингента, а также квалификацией врачей (Горчаков Д.А. с соавт., 2012; Утц С.Р. с соавт., 2013).

У мужчин, больных хроническим трихомониазом изменяется видовой состав условно-патогенной микрофлоры уретры (Андрейчев В.В., 2011) Появляются такие условно патогенные микроорганизмы как E. faecalis, St.

aureus., E. сoli, которые у здоровых лиц отсутствуют (Чуприн А.Е. с соавт., 2005). Исследованиями было установлено, что эти микроорганизмы подавляют механизмы естественной резистентности и поддерживают воспалительный процесс в урогенитальном тракте мужчин.

Таким образом, как у женщин, так и у мужчин при хронизации специфический гендерный характер, далеко не всегда учитываемый при лечении.

Трихомонадоносительство реже наблюдается в лечебных учреждениях, где концентрируются больные с манифестными формами. В частных клиниках, напротив, преимущественно выявляются лица с субманифестными формами и бессимптомным носительством (Сосновцева О.П., Софьин В.С., 2001).

Высокая частота диагностики трихомонад у бесплодных мужчин, а также воздействие их на подвижность сперматозоидов in vitro, дает основание считать, что этот микропаразит является причиной мужского бесплодия. В то же время трихомонады скорее всего не являются приорететной причиной бесплодия, поскольку их сравнительно часто выявляют у беременных (Молочков В.А. с соавт., 2006).

В последние годы широко обсуждается роль активных форм кислорода (АФК) и инициируемых ими свободнорадикальных процессов при различных патологических процессах. В нормальных условиях активность этих процессов находится на невысоком уровне, но при стрессовых ситуациях (а заражение венерическим заболеванием, несомненно, является стрессом) происходит усиленное образование АФК. Под действием АФК происходит избыточная и неконтролируемая активация процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ). Это может привести к усилению патологического состояния, вызванного самим возбудителем (Шебзухова Ф.К., 2010).

При трихомониазе наступает истощение определенных звеньев антиоксидантной системы или их срыв, что обуславливает необходимость назначения антиоксидантных комплексов (Мавров Г.И., Чинов Г.П., 2011).

Наиболее сильными естественными антиоксидантами являются витамины (Е, А, С) и микроэлементы (цинк, медь, селен). Недостаток цинка играет важную роль в развитии устойчивости трихомонад к препаратам нитроимидазольного ряда.

Предположения о патогенности других видов трихомонад — кишечной и ротовой оказались не обоснованными. При попадании этих видов в урогенитальный тракт как мужчин так и женщин — они гибнут не вызывая патологических изменений (И.И. Ильин, 1991).

Таким образом, в настоящее время механизм патогенного действия трихомонад и клиника трихомониаза изучены достаточно подробно, но практически отсутствуют исследования в этом направлении, посвященные гендерным особенностям возникновения и течения паразитоза, что не способствует разработке и внедрению полноценных и эффективных лечебнопрофилактических программ и проектов.

В 1927 году появились сведения о половом пути передачи трихомонадного уретрита от больных женщин здоровым мужчинам (А.

Сарек, 1927). В дальнейшем это было подтверждено клиническими экспериментами на добровольцах. Окончательно «узаконили в равных правах» на трихомонадную инвазию мужчин и женщин многочисленные международные симпозиумы в 1954-1959 гг. и участники научной группы ВОЗ в Женеве в 1978 году. Ученые и эксперты полностью подтвердили мнение, что это заболевание поражает мужчин и женщин в равной степени.

Десятый пересмотр Международной статистической классификации болезней и проблем, связанных со здоровьем (МКБ-10) 1995года определил следующую нозологическую нишу и терминологию:

А 59 ТРИХОМОНИАЗ, А 59.0 Урогенитальный трихомониаз * — вульвовагинит — уретрит — простатит — баланопостит — цистит (* бели вагинальные, вызванные Trichomonas vaginalis) А 59.8 Трихомониаз других локализаций.

Таким образом, установлено, что мочеполовой трихомониаз является многоочаговой инвазией, передающейся главным образом половым путем.

Необходимость рассматривать эпидемиологию трихомониаза как систему взглядов на проблему, обусловлена социально-экономической и социально-экологической очаговостью эпидемиологического процесса данного заболевания, нюансами взаимоотношений частной и государственной медицины, биологией самого возбудителя трихомониаза, которые существенным образом влияют на достоверность диагностики (Луцевич И.Н. с соавт., 2011; Горчаков Д.А. с соавт. 2012).

Недооценка биологических особенностей урогенитальной трихомонады Т. vaginalis, отношение к этому организму как к микробу, а к трихомониазу как к инфекции, а не как к инвазии, привело к стабильно напряженной, а порой и непредсказуемой эпидемиологической ситуации, связанной с этим заболеванием, передаваемым половым путем (Луцевич И.Н с соавт., 2011) Длительное время наблюдались, если не увеличение, то постоянно высокая частота инфекционно-воспалительных заболеваний урогенитального тракта, как мужчин, так и женщин, вызываемых урогенитальной трихомонадой (Яцуха М.В. с соавт.,1982; Васильев М.М., 1990; Reynolds M.W. et al., 2000; Fiori P.L. et al., 1999). По данным А.А.Кубановой и Л.И.

Тихоновой урогенитальный трихомониаз в 1999 г. составлял в среднем по регионам РФ 327,3 случая на 100 тыс. населения.

По Российской Федерации в конце первого десятилетия XXI века на 100 тыс. населения ежегодно регистрировалось от 261 до 343 случаев (Ермоленко Д.К. с соавт., 2007).

Уровень заболеваемости мочеполовым трихомониазом в различных регионах России в 2007 году составил 283–290 случаев на 100 000 населения.

М.А. Ивановой с соавт. (2005) в 2004 году в РФ зарегистрировано более тысяч случаев трихомониаза, что составило 43,8% от всех выявленных ИППП. Эти же авторы отмечают снижение заболеваемости трихомониазом к 2008 году до 167 случаев на 100 тыс. населения (Иванова М.А. с соавт., 2009).

Действительно, последние годы отмечается снижение заболеваемости этой протозойной инвазией, уменьшается количество случаев хронических форм, практически отсутствуют осложнения со стороны мочевыделительной системы.

По Саратовской области в 2006 году было выявлено 249 человек, заболевших трихомониазом на 100 тыс. населения, а к концу 2012 года только 95,6 на 100 тыс. населения. При этом процент заболевших женщин стабильно был выше, чем мужчин – от 78% в 2006 году до 85% в 2012 году.

Такой дисбаланс настораживает и напоминает «пожар на торфянике»

(Горчаков Д.А. с соавт., 2012).

Особое значение имеет состояние генофонда человеческих популяций различных регионов, которое обуславливает специфику паттерна общественного здоровья в этих регионах и формирует социальноэкономическую очаговость заболеваемости трихомониазом (Софьин В.С., Сосновцева О.П., 2001; Баранов В.С. с соавт., 2000; Горчаков Д.А. с соавт., 2012).

В 2009 году определена цифра в 170 млн. человек больных трихомониазом во всем мире. Эта же цифра появилась впервые в обзоре Dino Petrin (1998), который в свою очередь ссылался на доклад Center for Disease Control and Prevention (1998).

В Западной Европе на тот период количество зафиксированных случаев трихомониаза различных форм составляло около 11 млн., в Соединенных Штатах – 8 млн. случаев (Van Der Pol V., 2007).

David A Levis (2010) приводит интересные данные по гендерному распределению эпидемиологии трихомониаза в Великобритании (рис. 1).

С 1998 по 2007 год наблюдалась картина стойкого превалирования заболеваемости женщин урогенитальным трихомониазом по сравнению с мужчинами. Автор не исключает, что этот факт в некоторой степени обусловлен именно гендерными, а не только сексуально-биологическими отличиями между полами, «сексуальной революцией», которая началась в 90-е годы прошлого столетия и продолжается по сей день (David A Levis, 2010).

Пронина Е.А (2012) отмечает, что межличностные отношения лиц с ИППП характеризуются переживанием дисгармонии по следующим индикаторам: напряженность, отчужденность, конфликтность и агрессивность, а значит, на психологическом уровне заражение инфекциями, передающимися половым путем, во многом зависит от форм поведения в межличностных отношениях.

При изучении ею гендерных различий выявлено, что для фемининных женщин характерны высокие показатели напряженности, отчужденности и агрессии в межличностных отношениях, высокий уровень переживания одиночества.

Андрогинные женщины характеризуются менее высоким уровнем социального самоконтроля по сравнению с фемининными, при этом обладают выраженными показателями переживания одиночества.

Андрогинные мужчины имеют схожие показатели с показателями андрогинных женщин. В их межличностных отношениях особо представлены высокие показатели напряженности, отчужденности, конфликтности, агрессивности, социального самоконтроля и переживания одиночества по сравнению с маскулинными мужчинами.

В межличностных отношениях маскулинных мужчин наблюдаются средние показатели изучаемых параметров.

На основе данных, полученных в исследовании Е.А. Прониной (2012), выявлено, что на психологическом уровне заражение инфекциями, Количство больных Рис. 1. Распределение больных трихомониазом по полу в Великобритании за 1998-2007 гг.

передающимися половым путем, во многом зависит от различных форм поведения в межличностных отношениях.

Это означает, что эпидемиологические процессы ИППП в немалой степени обусловлены гендерной стратификацией.

Отмечено, что в последние годы трихомониаз все чаще миксируется с инфекциями мочеполового тракта. Ю.А. Белькова., С.Н. Козлов (2011) приводят следующие цифры по совместному паразитированию Т. vaginalis с патогенной флорой: микоплазама – 47,3%, гонококки – 29,1%, уреаплазма хламидии 18,2%, гарднереллы – 31,4% и грибы – 15,7%. По мнению авторов, инвазионно-инфекционный микст протекает более агрессивно, характеризуясь торпидным течением и устойчивостью к проводимой терапии.

На долю острого трихомониаза приходится от 33,1–55,4% при моноинвазии, и до 44,6–66,9% при микст-инвазии. Хронический трихомониаз, протекающий как моноинвазия, встречается в 22,2–30,3% случаев, как смешанная инфекция-инвазия – в 69,7–77,8%. По данным ряда авторов частота бессимптомного паразитоносительства T.vaginalis среди обследованных женщин составляет 10–35%, а среди мужчин – 2–41% (Захаркив Ю.Ф., 2005; Захаркив Ю.Ф., Позняк А.Л., 2006).

Беспорядочная половая жизнь с частой сменой партнёров способствует трансмиссии микробных ассоциаций и изменению эндоэкологических сообществ, что неминуемо приводит к формированию резистентности трихомонады к противопротозойным препаратам (Софьин В.С. с соавт., 2003; Горчаков Д.А. с соавт., 2011).

Частая смена партнёров имеет в настоящее время чёткую гендерную ориентацию в связи с коммерциализацией сексуальных отношений, падением нравственности, сменой сексуальной ориентации (Лузан Н.В. с соавт.,1999;

Завьялов А.И. с соавт., 2007; Луцевич И.Н. с соавт., 2011). Однозначным в этой эпидемиологической картине за последние годы остаётся одно – трихомониаз уверенно лидирует среди ИППП (Утц С.Р. с соавт., 2013).

В последнее время в литературных источниках все чаще высказывается мнение о том, что официальные статистические показатели заболеваемости не отражают истинной распространенности ИППП среди населения (Дмитриев Г.А. с соавт., 2005; Иванова М.А., с соавт., 2009; Горчаков Д.А. с соавт., 2012).

Это связывают с отсутствием регистрации определенной части больных при оказании теневых медицинских услуг. Так, в официальную отчетность не входит контингент, составляющий наиболее высокую группу гомосексуальные связи, заключенные и др.). Эти социальные группы способны поддерживать высокий уровень заболеваемости ИППП в общей популяции (Лузан Н.В., с соавт., 1999; Соколовский Е.В. с соавт., 1999;

изменившимся социально-экономическим, демографическим и правовым условиям (Дмитриев Г.А. с соавт., 2005; Кисина В.И., 2010; Луцевич И.Н. с соавт., 2011).

Социальные факторы могут служить с одной стороны причиной эпидемического распространения ИППП, но, с другой - единственным условием успешной борьбы с ними и их ликвидации (Аковбян В.А., 1998;

Горчаков Д.А. с соавт., 2012).

В соответствии с требованиями ВОЗ по основным принципам и национальным стандартам лечения ИППП, необходимо добиваться не только этиологического выздоровления и ограничения распространения инфекции, но и предупреждения низкого комплаентного поведения пациентов (Кисина В.И. 2010). Последнее не возможно без учёта гендерных особенностей эпидемиологических процессов происходящих в системе «паразит-хозяин»

при трихомонадной инвазии.

В результате анализа литературных источников установлено, что трихомониаза представляет собой весьма противоречивую картину в мире, Российской Федерации в целом, и регионах Российской Федерации.

1.4. Гендерные аспекты лабораторной диагностики трихомониаза Лабораторной диагностике трихомониаза мужчин и женщин различной локализации и форм посвящены обширные и глубоко научные обзоры отечественных и зарубежных авторов.

Медико-биологические и технологические основы российской школы лабораторной диагностики трихомонадной инвазии были заложены в работах Терраса Ю.Х. (1964); Падченко И.К. (1964), Бедновой В.Н. и Васильева М.М. (1985), Овчинникова Н.М., с соавт. (1987); Васильева М.М.

(1990); Вахнина Т.Е. (1990). Затем продолжены и существенно дополнены исследованиями Маловой И.О. (2000); Кисиной В.И. (2002); Савичевой А. М.

с соавт., 2004; Дмитриева Г.А. и Сюч Н.И. (2005); Копылова В.М. с соавт.

(2005); Козлюк А.С., Козлюк В.А. (2006); Глыбочко П.В.с соавт. (2007);

Теличко И.Н. (2007); Иванова А.М. с соавт. (2010); Сюч Н.И. с соавт. (2010);

Мавзютова А.Р. с соавт. (2010); Марданлы С.Г. и Куляша Г.Ю. (2011).

Из зарубежных работ, посвященных этой проблеме, заслуживают внимание труды Rein M.F., Muller M. (1984); Catterall R.D. (1972); Dino Petrin et al. (1998); Mirchaghani A., Warton A. (1998); Cindi van der Schee et al. (1999);

Marlen Benchimol (2004); Ivana V. Rabonjic (2005), Simpson P. (2007).

Согласно приказа Министерства здравоохранения СССР № 1570 от 4.12.1986 г. регламентированными методами диагностики трихомониаза являлись микроскопия нативного или окрашенного мазка и культуральные исследования. Приказом № 398 от 23.12.2003 этот приказ был отменён, а новый, регламентирующий диагностику трихомониаза, не подготовлен и не издан. Таким образом, в настоящее время нормативно-правовая база диагностики трихомониаза в РФ отсутствует (Рыжих П.Г. с соавт., 2011).

Это обосновывает необходимость сравнительных исследований эффективности современных диагностических технологий (ПЦР, ИФА и др.) и разработки унифицированных алгоритмов лабораторной диагностики трихомониаза, в том числе при хроническом простатите, а также создание необходимой законодательной базы (Фриго Н.В., 2006; Фриго Н.В. с соавт., 2008; Чураков А. А., 2007; Рыжих П.Г. с соавт., 2011).

Несмотря на значительное количество работ, в которых отражены результаты клинико-лабораторных исследований T.vaginalis, весьма скуден литературный арсенал, посвящённый мониторингу трихомониаза с гендерных позиций, что, несомненно, отражается на качестве эпидемиологических исследований, лабораторной диагностике и лечении трихомониаза.

В связи с тем, что клинические симптомы довольно часто не отражают реальной картины заболевания, в обязательном порядке необходимо применение лабораторных методов диагностики.

свидетельствующие о том, что если диагноз трихомониаза ставился только на основании одной клиники, то у 88% инфицированных T.vaginalis женщин заболевание не было обнаружено, а у 29% неинфицированных женщин диагноз трихомонадное носительство был выставлен ошибочно. Sena A.C. et al. (2007) выделяли при помощи культурального метода T. vaginalis и подтверждали диагноз методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) у бессимптомно (Софьин В.С., 1999; Чураков А.А., 2007; Софьин В.С. с соавт., 2009).

Отмечаемое в последние десятилетия изменение иммунологической реактивности организма, снижение его резистентности к факторам агрессии микроорганизмов приводят к возрастанию значения смешанных инфекций в патологии урогенитальной системы с участием УПМ (Мавров И.И. с соавт., 2004; Трапезникова М.Ф. с соавт., 2004; Чуприн А.Е., 2005).

Это обстоятельство определяет особую значимость микроскопической диагностики трихомониаза у женщин (Марданлы С.Г., Куляш Г.Ю., 2011).

В настоящее время в России и за рубежом применяют четыре лабораторных метода определения Trichomonas vaginalis: микроскопический, культуральный, иммунологический и генодиагностический (молекулярнобиологический).

Микроскопия обеспечивает быстроту лабораторного заключения. При этом с практической точки зрения важно учитывать, что максимальная эффективность микроскопии достигается при клинически выраженном течении трихомониаза у женщин с чувствительностью тестирования 80–87% и специфичностью 94% и что показатели чувствительности микроскопии у мужчин, как отмечено выше, всегда меньше, чем у женщин. Причем у последних наиболее высока вероятность выявления трихомонад во влагалище, а минимум достоверности характерен для исследования материала из цервикального канала (Чураков А.А., 2007; Марданлы С.Г., Куляш Г.Ю., 2011).

Культуральный метод является наиболее надежным компонентом указанного диагностического комплекса и позволяет достигать чувствительности 88,7–95% и специфичности 94–100% и у женщин, и у мужчин при условии, что качество его проведения и качество питательных цитоморфологическом методе диагностики (Козлюк А.С., Козлюк В.А., 2001).

По мнению большинства авторов, основой надежной идентификации T.vaginalis может служить только выявление влагалищных трихомонад с типичной морфологией и/или характерной подвижностью (Дмитриев Г.А., Сюч Н.И., 2005; Чураков А.А., 2007; Марданлы С.Г., Куляш Г.Ю., 2011).

К методам непрямой диагностики мочеполового трихомониаза относятся серологические реакции, позволяющие определить титр иммуноглобулинов, циркулирующих в крови. В настоящее время используются различные методы определения антитрихомонадных антител:

агглютинация, фиксация комплемента, непрямая гемагглютинация (РНГА), иммуноферментный анализ (ИФА). Однако низкая иммуногенность и наличие различных серотипов Т.vaginalis значительно затрудняют получение достоверных результатов в иммунодиагностике. Отечественные наборы для определения антител к T. vaginalis методом ИФА на рынке медицинских иммунобиологических препаратов имеются, но, насколько нам известно, не сертефицированы и их применение в практической медицине оправдано только для исследовательских целей ввиду недостаточной информативности.

К тому же часто регистрируются ложноотрицательные результаты, когда наличие трихомонад в исследуемом материале подтверждается микроскопией и культуральным методом. Тем не менее, достоинством серодиагностики является то, что качественный состав выявляемых антител (IgM, IgG, IgA), их титр и сроки циркуляции в сыворотке крови позволяют оценить остроту и длительность воспалительного процесса, что важно как для ретроспективной диагностики, так и для контроля за реконвалесцентами (Дмитриев Г.А., Сюч Н.И., 2005; Теличко И.Н., 2007; Лобзин Ю.В. с соавт., 2009).

Разработка в конце 1980-х гг. методов циклической амплификации фрагментов генома и внедрение их в практику лабораторной диагностики предоставило возможность определения специфических нуклеотидных последовательностей. Пионером в диагностике мочеполового трихомониаза методом ПЦР был D.E. Riley, который в 1992 г. подобрал праймеры TVA5 и TVA6, комплементарные геномной последовательности, которая кодирует ферредоксин у Т. vaginalis. (Лобзин Ю.В. с соавт., 2009; Donald E. Riley et al., 1992; Madico G., 2000).

Отношение специалистов к этому несомненно прогрессивному методу диагностики трихомониаза и изучению Т. vaginalis неоднозначное, однако, высокоэффективных технологий, в том числе ПЦР, в лабораторную диагностику трихомониаза, результаты исследований зачастую оказываются ложноотрицательными. К основным причинам ложноотрицательных результатов ПЦР можно отнести следующие: участки ДНК в ядре Т.vaginalis, связанные с белками-гистонами, могут оказаться недоступными для праймеров; генотипическая изменчивость, в том числе консервативных участков ДНК Т.vaginalis; эмпирический подбор праймеров и использование монопраймерных тест-систем; нарушение технологии постановки ПЦР;

уменьшение концентрации ДНК в положительном контрольном образце и потеря или снижение активности ДНК-полимеразы; попадание ингибиторов ПЦР в исследуемую пробу. Причинами ложноположительных результатов обычно является случайная или систематическая контаминация исследуемого материала (Дмитриев Г.А., Сюч Н.И., 2005; Лобзин Ю.В. с соавт., 2009;.

Марданлы С.Г., Куляш Г.Ю., 2011).

трихомониаза многочисленными отечественными и зарубежными исследованиями доказано, что диагностическая чувствительность ПЦР значительно выше, особенно в Real –Time (Теличко И.Н., 2007; Рыжих П.Г. с соавт., 2011; Ryu et al., 1999; Schwebke J.R. et al., 2002).

ФГУН ЦНИИ эпидемиологии разработан тест, являющийся аналогом зарубежного теста выявления рРНК урогенитальной трихомонады ТМА (Gen-Probe) – АмплиСенс Т. vaginalis –РИБОТЕСТ на основе реакции транскрипционной амплификации НАСБА (Nucleus acid sequence-based amplification использованию в РФ (Рыжих П.Г. с соавт., 2011).

Проведен сравнительный анализ используемых в настоящее время прямых методов лабораторной детекции Trichomonas vaginalis при урогенитальном трихомониазе (УТ). Установлено, что независимо от топики (уретрит, уретропростатит) и длительности УТ у мужчин, а также интенсивности воспаления наибольшая чувствительность и специфичность характерны для полимеразной цепной реакции (ПЦР). Кроме того, значения показателей прогностической ценности отрицательного и положительного результатов могут выступать в качестве основных критериев при разработке новых диагностических тест-систем для ПЦР при УТ (Мавзютов А.Р. с соавт., 2010).

Эпидемиологические исследования показывают, что мужчины и женщины в равной степени заражаются трихомониазом, однако гендерные особенности диагностики свидетельствуют, что чаще диагностируется «женский» трихомониаз. В изученных литературных источниках мы не нашли исследований, посвящённых этой проблеме. Поэтому нет и гендерного алгоритма клинико-лабораторной диагностики трихомонадной инвазии у мужчин и женщин.

1.5. Экспериментальные исследования Trichomonas vaginalis Трихомониаз является сугубо антропонозной инвазией. Т.vaginalis эволюционно приспособилась к паразитированию в мочеполовых органах в начале у женщин, а затем у мужчин. Все попытки моделировать патогенетический процесс этой инвазии на животных закончились неудачей.

При введении различным животным, в том числе и приматам, живых клеток этого паразита формировались неспецифические воспалительные процессы различной интенсивности (Бакшеев Н.С., Падченко И.К., 1971; Астафьев Б.А.

с соавт., 1989; Клименко Б.В., с соавт., 2001; Corbeil L.B., 1995; Dino Petrin, 1998).

Оставался только один путь изучения биологии этого простейшего, традиционный для микробиологических исследований – культивирование на питательных средах in vitro. Возникли сложности, так как, в отличие от бактерий, искусственное выращивание Т. vaginalis требовало особого технологического подхода - сред и режимов культивирования (Беднова В.Н.

с соавт., 1981; Щербакова Н.И. с соавт., 1982; Беднова В.Н., Васильев М.М., 1982; Васильев М.М., 1990; Вахнина Т.Е., 1990; Цветкова А. с соавт., 1990;

Глыбочко П.В. с соавт., 2007; Пляченко Д. А., 2007; Теличко И.Н., 2007;

Махлай Н.С., 2008; Мавзютов А.Р., 2010; Thomason J.L., Gelbart S.M., 1989;

Beal C., 1992; Briselden et al., 1994; Borchardt V.L. et al., 1996). В то же время традиционные микробиологические и гистологические методы окраски, экспериментаторов и позволили существенным образом изучить жизненный цикл, морфологию и этологию простейшего (Падченко И.К., 1964; Яшкова Г.Н., 1977; Самохин В.Л., 2002; Савичева А. М., 2004; Сюч Н.И., Мачкалян К.Э., 2004; Рюмин Д.Ю., Сюч Н.И., 2009; Brugerolle G., 1975; Garber, G.E., 1987; Fiori P.L., 1999).

Электронная микроскопия внесла значительный вклад в изучении морфологии простейшего паразита (Овчинников Н.М., Делекторский В.В., 1986; Клименко Б.В., с соавт., 2001; Abonyi A., 1995; Mirchaghani A. еt al., 1998).

Иммунологические методы изучения культур Т. vaginalis позволили выявить антигенные детерминанты этого паразита, его серологические особенности и видоспецифичность, а также механизмы фагоцитарной активности и её роль в патогенезе трихомониаза (Террас Ю.Х., 1954; Юдин А.Л., 1976; Теличко И.Н., 2007; Krieger, J.N. et al., 1988; Rendon Maldonado J.G. et al., 1998; Z. Bogdan С., 1999).

жизнедеятельности Т. vaginalis внесла молекулярная генетика. Полимеразная культивированием Т. vaginalis позволили досконально изучить геном этого паразита и производить генно-инженерные манипуляции (Киселёв В.И. с соавт., 1999; Alderete J. F., 1992; Donald E., 1992; Roger A.J. et al., 1996;

Singh B., 1997; Cindi van der Schee, 1999; Mayta, 2000; Nath K., 2000; Simpson P., 2007).

Различные методы культивирования урогенитальной трихомонады in vitro экстраполировались в той или иной степени на организм человека и способствовали в немалой степени прогрессу в диагностике, лечении и профилактике этого социально значимого заболевания.

Значение экспериментальных исследований возросло с появлением фактов устойчивости влагалищной трихомонады к препаратам 5-НИ ряда, которые являются с 1959 года основными лекарственными средствами при лечении трихомониаза всех форм (Дмитриев Г.А. с соавт., 1994; Гуськова Т.А. с соавт., 1999; Клименко Б.В. с соавт., 2001; Белькова Ю.А., Козлов С.Н., 2011; Kulda J., 1999).

Было проведено большое количество экспериментальных работ, посвящённых изучению механизмов формированию резистентности к различным препаратам, производным 5-нитроимидазола (Захаркив Ю.Ф. с соавт., 2006; Махлай Н.С., Бочкарева А.Н., 2010; Гуськова Т.А. с соавт., 1999;

Сюч Н.И., Мачкалян К.Э., 2004; Морева Ж.Г., 2005; Иванов А.М. с соавт., 2006; Горчаков Д.А. с соавт., 2012; Batailard I.F., 1982; Kulda J., 1999;

Upcroft P., Upcroft J.A., 2001; Rasoloson D. et al., 2002; Dunne R.L. et al., 2003; Barrientes F. J. et al., 2005).

Большинство экспериментальных работ проводилось по традиционной микробиологической технологии – во флаконах, пузырьках и пробирках. С помощью этих методов были изучены морфологические, культуральные и физиологические свойства T. vaginalis, её культуральные особенности, метаболизм.

Изучалось воздействие in vitro различного рода агентов (лекарственные препараты, химические соединения, электромагнитные и лазерные излучения, и др.) на урогенитальную трихомонаду (Яшкова Г.Н., 1977;

Щербакова Н.И., Беднова В.И., 1982; Брагина Е.Е., 1982; Сюч Н.И., Мачкалян К.Э., 2004; Иванов А.М. с соавт., 2006; Глыбочко П.В. с соавт., 2007; Пляченко Д.А., 2007; Рюмин Д.Ю., Сюч Н.И., 2009; Nielsen M.H., 1976;

Rein M.F., Muller M., 1982; Rasmussen S.E., 1986; Fukuda M. et al.,1996).

культивированию T. vaginalis в условиях максимально приближённым к реальным. Эксперименты по длительному культивированию этого простейшего впервые стал успешно проводить И.К. Падченко (1964), которому удалось поддерживать культуру вагинальной трихомонады в продолжение нескольких месяцев. Благодаря этим наблюдениям был изучен жизненный цикл и морфотипы T. vaginalis.

В последние годы наблюдалось уменьшение количества экспериментальных работ во всех областях медицины и венерология, к сожалению, не является исключением. Тем не менее, работы А.М. Иванова (2006), П.В. Глыбочко с соавт. (2007); А.Р. Мавзютова (2010), Н.С. Махлай (2010), Н.С. Махлай, А.Н. Бочкарева (2010), Ж.Г. Моревой с соавт. (2010), Д.А.Горчакова (2013), Makhlay NS. (2010), длительное культивирование паразита, вселяют надежду на оживление в чрезвычайно актуальной в теоретическом и практическом отношении области изучения особенностей этиологических факторов трихомониаза, обуславливающих их патогенное воздействие на организм.

Трихомониаз, история изучения которого насчитывает уже почти два века, по-прежнему остаётся социально значимой болезнью с нерешёнными до конца проблемами ее этиологии, патогенеза, эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики. Несомненно, существующий в настоящее время комплекс клинических и лабораторных методов диагностики трихомониаза всех клинических форм позволяет достаточно эффективно верифицировать это заболевание (Дмитриев Г.А., Сюч Н.И., 2005; Кисина В.И., 2010; Иванов А.М. с соавт., 2010; Луцевич И.Н. с соавт., 2011). В различных учебнометодических пособиях и руководствах для врачей представлено множество различных схем и комплексов лечения трихомониаза, наиболее эффективные из которых официально утверждены и регламентированы Министерством здравохранения Российской Федерации (Клинические рекомендации РОДВиК, 2012). Это, безусловно, сказалось на уровне заболеваемости трихомониаза, который неуклонно снижается, начиная с 2008 года (Иванова М.А. с соавт., 2009).

Тем не менее, учитывая социально-экономическую очаговость этого заболевания, обусловленную множеством факторов, в том числе и постоянно реформируемым здравоохранением (Горчаков Д.А. с соавт., 2012), остаются вопросы, на которые учёные и специалисты-практики ещё не дали ответа.

Одним из таких вопросов является вопрос о гендерной специфике трихомониаза в системе «паразит-хозяин». В значительном количестве публикаций авторы касаются только специфики половых особенностей диагностики, клиники, патогенеза и лечения трихомониаза. Однако целостной картины влияния гендера на самого возбудителя, изменчивость его фенотипа и, как следствие - на изменения его чувствительности к лекарственным препаратам, в настоящее время в литературных источниках нами не обнаружено.

Исходя из этого, актуальным является патогенетичское обоснование гендерных закономерностей, происходящих при трихомонадной инвазии, как в организме хозяина, так и паразита, с целью совершенствования имеющихся методов диагностики и лечения трихомониаза.

Данные этих исследований, несомненно, могут быть полезны при разработке новых лекарственных противопротозойных препаратов и новых схем реабилитации больных после лечения острых и хронических форм урогенитального трихомониаза.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Общая характеристика обследованного контингента больных В соответствии с целью и задачами настоящей работы было проведено комплексное обследование пациентов с диагнозом – трихомониаз (МКБ–10, А 59.0). Основные исследования по лабораторному мониторингу проводились в ММУП «Лечебно-консультативном центре г. Саратова» в 2008-2012 годах. Для экспериментальных исследований дополнительно использовалась клинико-лабораторная база ГУЗ «Саратовский областной кожно-венерологический диспансер», Клиники кожных и венерических болезней СГМУ и Клиники профпатологии и гематологии СГМУ.

Материалы для исследований набирались в соответствии с протоколом информированного согласия пациентов.

Обследовано 393 пациента – 210 женского пола и 183 мужского в возрасте от 18 до 42 лет. Все обследованные больные были с первично выявленным острым трихомониазом (уретрит, кольпит) и хроническими субманифестными и асимптомными формами. Диагноз обследованного контингента больных ставился на основании клинических данных, результатов микроскопии нативного (влажного) и окрашенного мазков, материалов культуральных и молекулярно-генетических исследований методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), ИФА.

В аналитическую обработку не включался клинический материал от пациентов с идиосинкразией к препаратам 5-НИ ряда, самостоятельно принимавших антибиотики до обращения в медицинское учреждение, пациентов страдавших почечной и печёночной недостаточностью. Также не исследовался материал пациентов с микст-инфекциями и инвазиями.

С использованием ИФА были обследованы 149 больных мужского и 152 пациента женского пола, согласившихся на данный вид исследования.

Настоящее диссертационное исследование проводилось по двум Саратовской области, патогенетических механизмов гендерных особенностей иммунного и антиоксидантного статуса больных с различным течением трихомониаза, а также научное обоснование гендерных принципов в исследования). Второе – экспериментальное. В условиях проточного лекарственной резистентности с учетом гендерной принадлежности.

2.2 Методы эпидемиологических исследований официальных статистических отчётов дерматовенерологической службы Саратовской области (ф.9 и ф.34 МЗ РФ), а также выборочный анализ дерматовенерологов и урологов. С этой целью было изучено 1356 историй болезни пациентов с диагнозом урогенитальный трихомониаз за период с 2006 по 2012 год.

следующие методы лабораторной диагностики: нативного (влажного) мазка, окрашенного мазка метиленовым синим или по Граму, культуральный метод, иммуноферментный анализ (ИФА) и метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Эти же методы использовались и в экспериментальной части работы.

2.3.1. Микроскопические и культуральные методы Для приготовления нативного мазка по рекомендации Б.В. Клименко с соавт. (2001) использовали не физиологический раствор, а раствор РингераЛокка комнатной температуры, в котором трихомонады более длительное время находятся в активном состоянии. Препарат готовили по методу «раздавленной» капли и микроскопировали при увеличении 400 с тёмнопольным конденсором. У женщин забор материал осуществляли из уретры, цервикального канала и заднебоковых сводов влагалища. У мужчин — из уретры.

В большинстве случаев одновременно с приготовлением влажного препарата готовили из этого же материала препарат для окраски метиленовым синим (1% раствор по Леффлеру) или модифицированным способом Грама. Выбор последнего метода обусловлен тем фактором, что урогенитальная трихомонада является грамотрицательным микроорганизмом (но не бактерией!) и это способствует лучшей идентификации паразита в «толпе» сопутствующих клеточных элементов инокулята.

При окраске метиленовым синим готовили 1% водный раствор метиленового синего. Высушенный на воздухе мазок фиксировали в течение 3 мин. 96% этиловым спиртом, высушивали, после чего на него наносили на 1 мин. раствор метиленового синего. Оставшийся краситель осторожно смывали слабой струей холодной воды и мазок высушивали. Трихомонады в препарате имели, как правило, округлую или овальную форму с интенсивно окрашенными в синий цвет ядрами; цитоплазма клеток была светло-синей, с нежной сетчатой структурой, вакуоли — бесцветны.

Для окраски по модифицированному способу Грама использовались следующие реактивы:

– 1% раствор генцианвиолета (1г генцианвиолета растворяется в 100 мл кипящей дистиллированной воды, полученный раствор пропускается в горячем виде через бумажный фильтр);

– водный раствор Люголя (2 г калия йодида растворяется в 300 мл дистиллированной воды, к полученному раствору добавляется 1г чистого йода, после чего раствор фильтруется через бумажный фильтр);

– 96% этиловый спирт;

– 1% водный раствор нейтрального красного (1г нейтрального красного растворяется в 100 мл дистиллированной воды и пропускается через бумажный фильтр).

Препарат накрывался полоской фильтровальной бумаги и заливался раствором генцианвиолета на 1-2 мин., после чего бумага снималась, препарат осторожно промывался водопроводной водой и на несколько секунд заливался раствором Люголя (до почернения мазка). Остаток раствора смывался, препарат обесцвечивался в 96% этиловом спирте до тех пор, пока с тонких участков препарата перестали стекать фиолетовые струйки. После смывания спирта водой препарат сразу же докрашивался в течение 3 мин.

раствором нейтрального красного, затем тщательно промывался и высушивался.

При микроскопии окрашенных мазков ядра клеток Т.vaginalis окрашивались в фиолетовый цвет, цитоплазма — в красно-оранжевый цвет разной интенсивности. Для микроскопирования мазков использовался лабораторный микроскоп «Биолам» при увеличении объектива 90 и окуляра 10.

Для посева исследуемого материала с целью диагностики использовали культуральную среду «Vagicult» фирмы «Orion Diagnostica» (Финляндия).

Культивирование проводилось в термостате при температуре 37 оС в течение 5-7 суток. На 3-5 день культивации проводили микроскопию выше перечисленными методами. Поскольку данная среда содержит все необходимые ингредиенты для жизнедеятельности простейшего в течение трёх-пяти суток, часть опытов in vitro проводили на ней. В части опытов применялся культурально-цитологический метод с использованием диагностикума "ТрихомонаСкрин" производства ТОО Биотехнологической компании Биосервис (Москва).

2.3.2. Иммунологические, молекулярно-биологические методы, оценка оксидант/антиоксидантного статуса С использованием ИФА были обследованы 149 больных мужского и 152 пациента женского пола. Обнаружение специфических антител класса G к Т. vaginalis проводили методом ИФА на тест-системах «ТрихомоноБестпроизводства ЗАО «Вектор-Бест»). Забор крови для IgG-стрип»

иммунологических исследований проводился из локтевой вены натощак в утренние часы с помощью вакутайнеров.

Перед началом работы готовили промывочный раствор, контрольные образцы и рабочий раствор конъюгата. Перед постановкой ИФА лунки используемых стрипов промывались путём однократного внесения 300 мкл промывочного раствора в течение 5 минут. Затем во все лунки стрипов добавляли по 80 мкл раствора для разведения сывороток. В любые две лунки вносили по 20 мкл отрицательного контрольного образца (К), в одну лунку – 20 мкл положительного контрольного образца (К+), разведение К и К+ соответствовало 1 : 5. Во все остальные лунки вносили по 20 мкл испытуемых сывороток, получая разведение 1 : 5. Стрипы заклеивали клейкой плёнкой и инкубировали при 370С в течение 30 минут. Раствор конъюгата готовили в соответствии с инструкцией. По окончании срока инкубации содержимое лунок сливали в сосуд с дезинфицирующим раствором. Лунки стрипов промывали 5 раз промывочным раствором (не менее 300 мкл на лунку) и тщательно удаляли влагу. Далее в каждую лунку вносили по 100 мкл конъюгата в рабочем разведении. Стрипы заклеивали клейкой плёнкой и инкубировали при 370С в течение 30 минут. В это время готовили раствор хромогена. По окончании времени инкубации промывочным раствором промывали стрипы 5 раз. Затем в каждую лунку добавляли по 100 мкл раствора хромогена (бесцветного). Стрипы помещали в защищённое от света место и оставляли на 30 минут при температуре 18С. Реакцию останавливали добавлением в каждую лунку по 100 мкл стопреагента и немедленно измеряли оптическую плотность (ОП). Детекцию результатов осуществляли на спектрофотометре СФ-2000 при длине волны 450 нм.

проводилось по методу Манчини (Нго Т.Т., Ленхофф Г., 1988).

Функциональная активность нейтрофилов периферической крови определялась методом НСТ-теста in vitro (Герасимов И. Г., Калуцкая О. А., 2000).

использованием моноклональных антител (многоцветный анализ) и проточных цитометров EPICS XL (четырехцветный) фирмы Beckman Coulter;

FACS Calibur (четырехцветный) и CantoII (шестицветный) производства фирмы Becton Dickinson безотмывочным, двухплатформенным методом.

Гейтирование проводилось по CD45.

Состояние оксидант/антиоксидантной системы оценивали по уровню малонового деальдегида в мембранах эритроцитов по методу Ishichara Minoru (1978); концентрацию -токоферола определяли по методу Р.Ч.

Черняускене (1984) в модификации И.В. Тарасюк с соавт., (2008) с последующим расчётом антиоксидантного коэффициента (АОК) по методу Б.В. Давыдова (1991).

Особую роль в наших исследованиях играл молекулярно-генетический метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). С одной стороны он использовался как диагностический тест, и в этом случае мы применяли технологию реал-тайма, с другой - служил основным методом при изучении экзогенного воздействия протистоцидных препаратов на паразита in vitro. В этом случае мы использовали классическую схему ПЦР с электрофорезной детекцией.

Диагностику в режиме реал-тайма проводили на персональной системе ПЦР в реальном времени Dtlite производства НПФ «ДНК технология».

Использовались также коммерческие наборы реагентов марки АмплиСенс на основе методов ПЦР и НАСБА в реальном времени, выпускаемых ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора – АмплиСенс Trichomonas vaginalis транскрипционной амплификации (ТМА), позволяющей выявить жизнеспособных возбудителей (Рыжих П.Г. с соавт., 2011).

При проведении исследований методом ПЦР по классической схеме применялась тест система «АмплиСенс» производства ЗАО «Вектор-Бест».

2.4. Методы экспериментальных исследований Экспериментальные исследования были направлены на изучение жизнедеятельности урогенитальной трихомонады in vitro в условиях стационарного культивирования и проточного культивирования. Изучение морфологических и поведенческих особенностей культур урогенитальной трихомонады, полученных от больных полярных гендеров. Изучалась роль цитоплазматической мембраны (ЦПМ) простейшего в формировании лекарственной резистентности.

Стационарное культивирование проводили во флаконах объёмом 5 мл или в пробирках «Эппендорф». При этом проводилось пассирование культур на протяжении 21-30 дней с целью изучения морфофизиологических особенностей урогенитальной трихомонады, полученных от пациентов различного гендера в условиях длительного культивирования (Глыбочко П.В.

с соавт., 2007; Пляченко Д.А., 2007).

В экспериментальных исследованиях со стационарной культурой посев биоматериала производился вначале на диагностическую среду Vagicult, а затем материал пересевался на среду Джонсона Трассела в модификации ЦНИИКВИ МЗ РФ: в 1 л дистиллированной воды вносится белковый порошок 12,5 г (ТУ 64-3-204-84), получаемый из отхода при производстве лизоцима, хлорид калия 0,1 г, хлорид кальция 0,1 г, двууглекислый натрий 0,1 г, аскорбиновая кислота 0,6 г, лимонная кислота 0,12 г, оротоновая кислота 0,075 г, лактат кальция 1,0 г, мальтоза 10,0 г. Смесь стерилизуется при давлении 0,5 атмосферы в течение 30 мин. в текучепаровом стерилизаторе. После охлаждения стерильно вносятся 220 мл лошадиной сыворотки и антибиотики (из расчёта 1000 Ед/мл пенициллина, 1000 мкг/мл стрептомицина и 40 Ед/мл амфоглюкамина или 4000 Ед/мл линкомицина).

Объем посевной дозы составлял 0,1 мл на 1,0 мл среды. Количество активных клеток простейшего в посевной дозе составляло в среднем клеток на 1 мл среды.

Подсчет клеток T.vaginalis осуществлялся в камере Горяева. Для устранения активного передвижения трихомонад использовался метод Д.А.

Пляченко (2007). В камеру Горяева помещали полимерные микроволокна, что значительно облегчало технику подсчёта. Затем производили расчет числа клеток на 1 мл среды.

Проточное культивирование осуществляли на микроферментёре собственной конструкции (рис. 2).

питательной среды;

Рис. 2. Принципиальная схема действующей модели мужского урологического тракта для культивирования культивирования патогенных микроорганизмов с целью изучения их жизнедеятельности. Техническая эффективность прибора заключается в физиологических параметров человеческого организма: температура, внутренняя среда, объемные характеристики и, что особенно важно, циркуляция жидкости в органах урогенитального тракта мужчин.

Установка (действующая модель) для проточного культивирования патогенных микроорганизмов, имеет блок управления (10), в который входит ПК с программным обеспечением, соответствующим целям и задачам исследований, комплекс электронных реле, которые обеспечивают согласованное включение и выключение микрокомпрессора (4) и клапанов (4, 8).

Резервуаром для питательной среды (3) является емкость объемом мл в форме усеченного конуса, выполненная из полиэтилена, снабженная лючком (2) для заливки среды и выходным патрубком с автоматическим клапаном (4).

Микроферментёр (5) представляет собой полый эллипсоид из тефлона объемом 25-30 мл. Он состоит из двух разборных половинок, позволяющих быстро заменять субстрат-носитель и осуществлять стерилизацию.

Ферментер оснащён люком (6) для инокуляции материала и микродатчиками температуры и уровня рН, а также входным и выходным отверстиями, соединенными между собой полиэтиленовой перфорированной трубкой, имитирующей простатическую часть уретры. Выход ферментера соединен с выводным протоком, представляющим собой полипропиленовую трубку с коллагеновым покрытием внутренней поверхности длиной 150 мм.

Отработанная среда может быть направлена обратно в резервуар (3) или в емкость для сбора анализируемой среды (9). Вся установка находится в термостате (1) собственной конструкции объёмом 10 литров.

В экспериментальных исследованиях установка функционировала следующим образом. Производили заливку питательной среды в резервуар (3). Вводили параметры культивирования с помощью блока управления (10).

В соответствии с выбранной программой осуществлялось открытие-закрытие клапанов (4, 8) и заполнение микроферментёра питательной средой.

инокуляция заразного материала. Доза составляла 0,1 мл на 1,0 мл среды. В посевной дозе в среднем насчитывалось до 500 активных клеток простейших.

эксперимента) производилось тремя взаимоисключающими путями:

а) в нижнее отверстие выводного протока (7);

б) непосредственно в ферментёр (5);

в) в резервуар с питательной средой (3).

Затем происходило открытие клапана (4). Среда могла поступать или самотёком или за счёт работы микрокомпрессора погруженного типа, в зависимости от режимов культивации.

Далее в установке проводилась непосредственная культивация, сроки и режимы которой зависели от цели и задач эксперимента, вида возбудителя и т.д.

Сбор отработанного материала осуществлялся в емкость (9) для производился также непосредственно из ферментёра через лючок (6) или после раскрытия половинок ферментёра.

культивирования и возможность подкачки СО2 в ферментёр.

В качестве субстратов-носителей в ферментёре при разных схемах эксперимента, использовались четыре типа носителей-субстратов:

стеклянные Bioglass, целлюлозные микроносители ДЕ-53, Cytodex 3 c коллагеном и Cytodex 3 (Pharmacia Fine Chemicals АВ) с монослоем культуры клеток простаты.

Источником для получения культуры клеток простаты явились биопсийные образцы простаты пациентов (39 лет и старше) с ДГПЖ.

Образцы ткани помещались во флаконы с питательной средой ДМЕМ (модифицированная по способу Дульбекко питательная среда Игла), содержащей антибиотики: гентамицин (150 мкг/мл) и амфотерицин Б ( мкг/мл), тотчас же транспортировались в лабораторию, хранились при +40 0С не более 4-х часов. При использовании в качестве питательной среды модифицированную по способу Дульбекко среду Игла с низким содержанием кальция, магния и содержащей 10% сыворотки эмбрионов коров, а также с добавлением KGF в дозе 20 нг/мл, обеспечивался интенсивный рост и пролиферация клеток.

Полученная культура клеток простаты инокулировалась в ферментёр, куда после адаптационного периода (3-5 суток) производился посев или клинического биоматериала или культуры трихомонад, выращенной на среде Джонсона-Трассела (CPLM) в модификации ЦНИКВИ МЗ РФ.

осуществлялся в автоматическом режиме, который соответствовал физиологическим параметрам урологического тракта мужчин: температура 370С; рН = 6,8 – 7,2; среднесуточная скорость протока – 25 мл/час.

При оценке фенотипических изменений культивируемого паразита исследовались следующие морфологические признаки: размер и форма клеток, форма ядра и состояние перинуклеарного пространства, наличие или отсутствие жгутиков, длина аксостиля, подвижность, интенсивность роста при пересеве на стационарную среду.

Подсчёт клеток простейшего в проточной культуре производился на 3и, 7-е, 14-е и 21-е сутки. При этом пробы для анализа брались как непосредственно из ферментёра, так и на выходе из установки.

Исследовались межклеточные взаимоотношения трихомонад и клеток простаты – адгезия, мимикрия, фагоцитоз.

В ходе экспериментов нами была произведена оценка изменения барьерных функций мембран клеточной оболочки трихомонад, заключающаяся в измерении утечки УФ-поглощающих веществ до и после обработки 5-НИ. Измерение утечки УФ-поглощающих веществ проводили путем определения оптической плотности супернатанта при 260 нм в 1см кювете на спектрофотометре СФ-2000. В качестве УФ-поглощающего агента использовали оксид железа III (Fe2O3). Контролем служил супернатант культур, не подвергавшихся действию 5-НИ. Культуру трихомонад для этих экспериментов выращивали в пробирках «Эппендорф» на среде ДжонсонаТрассела.

2.5. Статистическая обработка результатов Статистический анализ результатов исследований проводился с помощью программы «STATISTICA 7.0» (StatSoft Inc., США), приложения Microsoft Office Excel 2007.

Исследуемые группы величин являлись несвязанными. Поэтому для определения вида распределения данных в выборке использовался критерий Шапиро-Уилка. В процессе статистической обработки использовались методы непараметрического анализа. Исследованные величины были представлены в виде выборочного среднего значения ±ошибка выборочной средней. Достоверность различий средних величин оценивали с помощью tкритерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

ГЛАВА 3. МОНИТОРИНГОВЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ