«СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ И МУКОЗАЛЬНЫХ СЕКРЕТОВ У ЗДОРОВЫХ МУЖЧИН И ЖЕНЩИН ...»

Из полученных результатов видно, что, несмотря на действие различных активаторов микробной и немикробной природы, процент нейтрофилов, находящихся на поверхности слизистых, способных образовывать внеклеточные ловушки, ограничен и не превышает 34% от общей популяции нейтрофильных гранулоцитов. Из этого можно высказать предположение, что к образованию внеклеточных ловушек способна ограниченная субпопуляция нейтрофилов, входящая в состав мукозальных секретов.

Активация нейтрофильных гранулоцитов, входивших в состав мукозальных секретов, и пирогеналом, и ФМА приводила к снижению количества жизнеспособных клеток в составе секретов репродуктивного тракта и слюны (таблица 4.1.2). Достоверных различий при сравнении количества жизнеспособных нейтрофилов после активации пирогеналом и после активации ФМА выявлено не было ни в слюне, ни в вагинальном, ни в цервикальном секрете, независимо от пола обследуемых лиц и фазы менструального цикла у женщин.

немикробной природы наименьшее количество жизнеспособных нейтрофильных гранулоцитов содержалось в составе секрета слюны у женщин как в первую, так и во вторую фазы менструального цикла, а наибольшее количество жизнеспособных клеток оставалось в цервикальном секрете.

Таблица 4.1.2 – Сравнительный анализ процентного содержания жизнеспособных нейтрофилов в различных мукозальных секретах после активации пирогеналом и ФМА, % (M ± m) Ранее в работе отмечалось, что у мужчин в слюне выше содержание жизнеспособных нейтрофилов по сравнению с данным показателем у женщин, данная закономерность сохранялась и после активации нейтрофилов слюны иммуностимуляторами.

Следующим этапом в изучении влияния активаторов на соотношение морфологических форм нейтрофильных гранулоцитов, входящих в состав различных биологических секретов, была оценка количества клеток, находящихся в состоянии апоптоза, и мертвых нейтрофилов, данные представлены в таблице 4.1.3 и таблице 4.1.4. Как следует из приведенных таблиц, активация и пирогеналом, и ФМА не приводила к значимым изменениям двух данных показателей, количество клеток в состоянии апоптоза и мертвых нейтрофилов оставалось на том же уровне, что и в контроле.

Таблица 4.1.3 – Сравнительный анализ процентного содержания нейтрофилов в состояние апоптоза в различных мукозальных секретах после активации пирогеналом и ФМА, % (M ± m) Таблица 4.1.4 – Сравнительный анализ процентного содержания мертвых нейтрофильных гранулоцитов в различных мукозальных секретах после активации пирогеналом и ФМА, % (M ± m) входивших в состав мукозальных секретов, активаторами микробной и немикробной природы происходило изменение их морфологического состава. Наблюдалась активация клеток, входивших в состав мукозальных секретов, что выражалось в росте количества нейтрофильных внеклеточных ловушек, при этом процент жизнеспособных нейтрофилов падал. Количество мертвых нейтрофилов и клеток в состоянии апоптоза оставалось неизменно.

Из чего можно сделать вывод, что к образованию внеклеточных ловушек способны только жизнеспособные нейтрофильные гранулоциты, мертвые клетки и нейтрофилы, вставшие на путь апоптоза, по-видимому, образовывать внеклеточные ловушки в мукозальных секретах после воздействия активаторов не могут.

4.2 Оценка лизосомальной активности нейтрофилов мукозальных секретов после активации пирогеналом и ФМА После активации нейтрофильных гранулоцитов слюны, вагинального и цервикального секретов как пирогеналом, так и ФМА наблюдалось усиление лизосомальной активности по сравнению с контролем, результаты представлены в таблице 4.2.1. Разницы между показателями лизосомальной активности нейтрофильных гранулоцитов, активированных пирогеналом, и нейтрофилов активированных ФМА установлено не было ни в одном из исследуемых мукозальных секретов, независимо от пола обследуемых лиц и фазы менструального цикла у женщин. Было установлено, что максимальные значения лизосомальной активности нейтрофилов мукозальных секретов имели активированные нейтрофильные гранулоциты цервикального секрета у женщин в первую фазу менструального цикла.

При изучении влияния пирогенала и ФМА на лизосомальную функцию нейтрофилов слюны было установлено, что показатели лизосомальной активности нейтрофильных гранулоцитов оставались неизменными у женщин на протяжении всего менструального цикла. При этом, если при исследовании неактивированной слюны у мужчин по сравнению с женщинами была отмечена более низкая активность лизосом, то после активации разницы в показателях лизосомальной активности между мужчинами и женщинами выявлено не было.

Нейтрофильные гранулоциты секрета влагалища в интактном состоянии показывали более высокую лизосомальную активность в фолликулярную фазу менструального цикла, чем в лютеиновую. Однако после действия пирогенала и ФМА разницы в значениях лизосомальной активности нейтрофильных гранулоцитов вагинального секрета в первую и вторую фазы менструального цикла не наблюдалось.

лизосомальную активность нейтрофильных гранулоцитов в различных мукозальных секретах, (n = 15, M ± m) лизосомальной активности неактивированных нейтрофилов цервикального секрета изменялись на протяжении всего менструального цикла, в фолликулярную фазу выше. Эта же закономерность сохранялась и после активации секрета пирогеналом и ФМА.

Таким образом, пирогенал и ФМА усиливали функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов мукозальных секретов, что выражалось в росте показателей лизосом. После воздействия активаторов микробной и немикробной природы в слюне и вагинальном секрете независимо от фазы менструального цикла, а в слюне и от пола доноров, показатели лизосомальной активности нейтрофилов достигали определенных значений. В цервикальном секрете показатели лизосомальной активности нейтрофильных гранулоцитов имели четкую зависимость от фазы менструального цикла.

4.3 Оценка фагоцитарной функции нейтрофильных гранулоцитов различных мукозальных секретов в ответ на стимуляцию пирогеналом У мужчин, а так же у женщин в обе фазы менструального цикла после активации пирогеналом и ФМА в популяции нейтрофилов, входящих в состав секретов слюны, влагалища и шейки матки, увеличивалось число клеток активно захватывающих латексные частицы по сравнению с контролем, а так же возрастал такой показатель фагоцитоза как интенсивность (таблица 4.3.1).

У женщин в первую фазу менструального цикла во всех исследуемых мукозальных секретах разницы в действии пирогеналом и ФМА выявлено не было. У женщин во вторую фазу менструального цикла активация ФМА слюны и вагинального секрета приводила к усилению активности и интенсивности фагоцитоза относительно показателей нейтрофилов активированных пирогеналом.

Изучение показателей местного иммунитета слюны показало, что в неактивированном состоянии фагоцитарная активность нейтрофильных гранулоцитов слюны у мужчин превышала эти же показатели у женщин на протяжении всего менструального цикла. После активации пирогеналом и ФМА различий в показателях активности и интенсивности фагоцитоза, а так же фагоцитарного числа выявлено не было. В среднем в слюне и у мужчин, и у женщин после действия активаторами 60% нейтрофилов активно захватывали частицы латекса.

Таблица 4.3.1 – Влияние пирогенала и ФМА на фагоцитарную функцию нейтрофильных гранулоцитов различных мукозальных секретов, (M ± m) АкФ – активность фагоцитоза ИнФ – интенсивность фагоцитоза ФЧ – фагоцитарное число У женщин в течение менструального цикла в цервикальном и вагинальном секретах не происходило изменений показателей фагоцитарной активности нейтрофильных гранулоцитов, как в контроле, так и после действия активаторов. После активации нейтрофилов вагинального и цервикального секрета пирогеналом и ФМА число активно фагоцитирующих клеток составляло около 60%, так же как и в слюне.

Таким образом, воздействие иммуностимуляторов микробной и немикробной природы на клетки, входящие в состав мукозальных секретов, приводило к усилению фагоцитарной активности. Не все нейтрофильные гранулоциты слизистых оболочек, даже после активации, способны к внутриклеточному уничтожению микроорганизмов. Процент нейтрофилов, активно захватывающих чужеродные объекты в слюне, вагинальном и цервикальном секретах, составлял около 60% от общего числа клеток и не зависил от пола донора и фазы менструального цикла.

4.4 Оценка показателей НСТ-теста нейтрофилов слюны, вагинального и цервикального секретов в ответ на стимуляцию пирогеналом и ФМА Из данных приведенных в таблице 4.4.1 следует, что действие пирогенала у женщин в слюне, вагинальном и цервикальном секретах, независимо от фазы менструального цикла, не приводит к значимым изменениям кислородзависимого метаболизма. При этом воздействие ФМА на нейтрофилы мукозальных секретов вызывало усиление кислородзависимого метаболизма, что выражалось в росте показателей активности и интенсивности НСТ-теста.

Таблица 4.4.1 – Влияние пирогенала и ФМА на показатели НСТ-теста нейтрофильных гранулоцитов различных мукозальных секретов, (M ± m) Примечание для таблицы 3.4.1:

Акт – активность НСТ-теста Ин – интенсивночть НСТ-теста ФР – функциональный резерв В слюне у женщин в первую и вторую фазы менструального цикла активация ФМА приводила к росту показателей как спонтанного, так и индуцированного НСТ-теста относительно неактивированных клеток. Как и в контроле, после действия активаторов различной природы разницы между показателями у женщин в различные фазы менструального цикла не установлено. У мужчин и в контроле, и после активации секрета слюны пирогеналом и ФМА показатели и спонтанного, и индуцированного НСТтеста не отличались от показателей у женщин. У мужчин в слюне, в отличие от женщин, активация пирогеналом приводила к усилению кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов.

Активация ФМА нейтрофильных гранулоцитов вагинального и цервикального секретов приводила к увеличению кислородзависимого метаболизма, при этом полученные значения спонтанного и индуцированного НСТ-теста достоверно превышали не только контрольные значения, но и показатели клеток после активации пирогеналом.

И у женщин в первую и вторую фазы менструального цикла, и у мужчин во всех исследованных мукозальных секретах после активации пирогеналом и ФМА наблюдалось снижение показателей функционального резерва нейтрофильных гранулоцитов, входивших в состав секрета, по сравнению с контролем.

После активации нейтрофильных гранулоцитов биологических секретов ФМА были отмечены такие же закономерности, как и при активации секретов пирогеналом, а именно: минимальные значения спонтанного НСТ-теста имели нейтрофилы вагинального секрета, а максимальные значения индуцированного НСТ-теста – нейтрофильные гранулоциты цервикального секрета.

Таким образом, активация мукозальных секретов и у мужчин, и у женщин пирогеналом и ФМА усиливала функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов, что выражалось в росте показателей количества внеклеточных ловушек, усилении лизосомальной активности, увеличении показателей фагоцитарной активности и НСТ-теста. Однако, по всей видимости, не все нейтрофильные гранулоциты подвергались активации, на что косвенно указывал тот факт, что не зависимо от выбранного активатора количество внеклеточных ловушек в биологических секретах не превышало 40%, а так же не более 60% клеток способны активно захватывать чужеродные частицы.

В ходе выполнения работы так же было установлено, что после воздействия пирогеналом и ФМА на исследуемые мукозальные секреты происходило уменьшение функционального резерва нейтрофильных гранулоцитов по сравнению с неактивированными клетками. Причиной этого могло служить как уменьшение количества жизнеспособных нейтрофильных гранулоцитов, входящих в состав секретов после активации, так и неоднородность популяции нейтрофилов, а именно тот факт, что, повидимому, не все нейтрофилы способны продуцировать активные формы кислорода в ответ на стимуляцию.

Глава 5 Особенности функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов цельной крови, лейкоцитарной взвеси и чистой фракции до и после активации у здоровых женщин и мужчин 5.1 Оценка количества внеклеточных ловушек, присутствующих в цельной крови, лейкоцитарной взвеси и чистой фракции нейтрофилов Одним из этапов исследования была оценка содержания внеклеточных ловушек, обнаруживающихся в цельной крови, лейкоцитарной взвеси и чистой фракции нейтрофилов. При сравнении количества нейтрофильных внеклеточных ловушек, присутствующих у здоровых доноров в цельной крови, лейкоцитарной взвеси и чистой фракции нейтрофильных гранулоцитов, было установлено, что минимальное количество внеклеточных ловушек входило в состав цельной крови и лейкоцитарной взвеси (таблица 5.1.1).

неактивированной цельной крови и лейкоцитарной взвеси у мужчин и у женщин в первую и вторую фазы менструального цикла содержалось одинаковое количество нейтрофильных внеклеточных ловушек, и данный показатель не превышал 2% от общей популяции нейтрофилов. Количество внеклеточных ловушек в выделенной чистой фракции нейтрофилов составлял около 4% от общего количества нейтрофильных гранулоцитов, данный показатель не зависил от пола обследуемых лиц и фазы менструального цикла у женщин.

Таблица 5.1.1 – Сравнительная анализ количества внеклеточных ловушек, присутствующих в цельной крови, лейкоцитарной взвеси и чистой фракции нейтрофилов у здоровых мужчин и женщин, % (M ± m) нейтрофилов Примечание для таблицы 5.1.1:

* - достоверность отличий между показателями цельной крови и лейкоцитарной взвесью ** - достоверность отличий между показателями цельной крови и чистой фракции нейтрофилов Следующим этапом в работе была оценка влияния активатора микробной природы (пирогенал) и активатора немикробной природы (ФМА) на процесс формирования внеклеточных ловушек нейтрофильными гранулоцитами цельной крови, лейкоцитарной взвеси и чистой фракции нейтрофилов.

производилась в фиксированных препаратах венозной гепаринизированной крови, окрашенных по Романовскому-Гимзе, данные приведены в таблице 5.1.2. Установлено, что после воздействия пирогеналом и ФМА число внеклеточных ловушек, образованных нейтрофильными гранулоцитами цельной крови, оставалось таким же, как и в контроле, и не отличалось ни в одной пробе, независимо от пола обследуемых лиц и фазы менструального цикла у женщин.

Таблица 5.1.2 – Влияние пирогенала и ФМА на формирование внеклеточных ловушек нейтрофилами цельной крови, % (M ± m) Для оценки количества нейтрофильных внеклеточных ловушек, присутствующих в лейкоцитарной взвеси и чистой фракции нейтрофилов, применяли метод окраски акридиновым оранжевым, который позволял не только определить количество внеклеточных ловушек, но и оценить соотношение различных морфологических форм нейтрофильных гранулоцитов.

Изучение морфологических форм нейтрофильных гранулоцитов лейкоцитарной взвеси после активации пирогеналом и ФМА показало, что под действием активаторов изменений в процентном соотношении различных форм нейтрофилов не происходило (таблица 5.1.3).

сегментированным ядром, нейтрофилов с недифференцированным ядром и нейтрофильных внеклеточных ловушек не изменялись под действием активаторов и не зависили от пола обследуемых лиц и фазы менструального цикла у женщин.

Таблица 5.1.3 – Влияние пирогенала и ФМА на формирование внеклеточных ловушек нейтрофилами лейкоцитарной взвеси, (M ± m) Группа Активатор Морфологические формы нейтрофилов (%) После активации пирогеналом и ФМА нейтрофилов, выделенных из нейтрофильных внеклеточных ловушек по сравнению с неактивированными клетками (таблица 5.1.4) как у мужчин, так и у женщин в первую и вторую фазы менструального цикла. При этом следует отметить, что количество нейтрофильных внеклеточных ловушек после активации ФМА было достоверно выше, чем после активации нейтрофилов пирогеналом. Разницы в количестве НВЛ между показателями у мужчин и у женщин выявлено не было.

И у женщин, и у мужчин в чистой фракции нейтрофилов после воздействия пирогеналом процент внеклеточных ловушек составлял не более 17%, после активации ФМА количество НВЛ составляло не более 25% от общей популяции нейтрофилов.

Таблица 5.1.4 – Влияние пирогенала и ФМА на формирование внеклеточных ловушек нейтрофилами, выделенными из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина, (M ± m) Группа Активатор Морфологические формы нейтрофилов (%) n= Примечания для таблицы 5.1.4:

* - достоверность отличий при сравнении контроля с пирогеналом ** - достоверность отличий при сравнении контроля с ФМА *** - достоверность отличий при сравнении пирогенала с ФМА Таким образом, на основании полученных данных, можно заключить, что в состав цельной крови, лейкоцитарной взвеси и чистой фракции нейтрофилов входят внеклеточные ловушки. Минимальное количество внеклеточной ДНК было обнаружено в препаратах цельной крови и лейкоцитарной взвеси. Действие пирогенала и ФМА в чистой фракции нейтрофилов активировало формирование внеклеточных ловушек, в отличие от цельной крови и лейкоцитарной взвеси, в которых действие активаторов не изменяло морфологический состав популяции нейтрофилов.

5.2 Оценка функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов Для определения внутриклеточного кислородзависимого метаболизма методом проточной цитофлюориметрии исследовали гепаринизированную венозную кровь 60 здоровых доноров: 30 мужчин и 30 женщин в первую и вторую фазы менструального цикла. В качестве активатора применялся ФМА. Результаты исследования представлены в таблице 5.2.1.

Таблица 5.2.1 – Определение кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов периферической крови здоровых доноров методом проточной цитофлюориметрии, (M ± m) Группа Спонтанная реакция Индуцированная реакция Индекс фаза м.ц., n= фаза м.ц., n= Из полученных результатов было установлено, что показатели кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов цитофлюориметрии, не зависили от пола обследуемых лиц и также оставались неизменными у женщин на протяжении всего менструального цикла. У здоровых лиц 28% нейтрофилов крови в неактивированном состоянии генерировали активные формы кислорода в системе НАДФНоксидазы, что выражалось в флуоресценции клеток в зеленой области спектра, а после активации нейтрофилов ФМА процент данных клеток возрастал до 86%. Индекс стимуляции нейтрофильных гранулоцитов в среднем имел значение 3,5.

Оценка фагоцитарной активности нейтрофильных гранулоцитов периферической крови методом проточной цитофлюориметрии основана на применении в качестве объекта фагоцитоза St. aureus, конъюгированных с флуоресцеин изотиоцианатом. Анализ показал, что 93% нейтрофилов активно захватывали St. aureus (таблица 5.2.2). Различий в показателях активности и интенсивности фагоцитоза у доноров разного пола выявлено не было.

нейтрофильных гранулоцитов периферической крови здоровых доноров методом проточной цитофлюориметрии, (M ± m) n= n= n= Таким образом, из приведенных данных можно сделать вывод, что использование для оценки функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов метода проточной цитофлюориметрии является эффективным и возможно применение в практических целях для получения более точных данных и уменьшения времени постановки методик.

5.3 Изменение экспрессии рецепторов CD11b и CD95 на нейтрофильных гранулоцитов периферической крови до и после активации ФМА нейтрофильных гранулоцитах периферической крови проводили методом проточной цитофлюориметрии с использованием одноцветных реагентов CD11b, меченого флуорохромом флуоресцеинизотиоцитат (FITC), и CD95, меченого флуорохромом фикоэритрин (PE). Результаты оценивались как у нативных нейтрофильных гранулоцитов, так и у нейтрофилов, активированных ФМА. На рисунке 1 представлены две гистограммы распределения рецепторов CD11b и CD95 на интактных (гистограмма А) и активированных (гистограмма Б) нейтрофильных гранулоцитах.

Рисунок 1 – Гистограммы распределения рецепторов CD11b и CD95 на интактных (А) и активированных (Б) нейтрофильных гранулоцитах Использование для детекции сигнала двух каналов проточного цитофлуориметра позволило разделить все нейтрофильные гранулоциты на четыре популяции:

- нейтрофилы, экспрессирующие на своей поверхности оба рецептора CD11b и CD95 (CD11b+CD95+);

- нейтрофилы, экспрессирующие на своей поверхности только рецептор CD11b (CD11b+CD95-);

- нейтрофилы, экспрессирующие на своей поверхности только рецептор CD95 (CD11b-CD95+);

- нейтрофилы, неэкспрессирующие на своей поверхности ни рецептора CD11b, ни рецептора CD95 (CD11b-CD95-).

Данные по распределению всех четырех популяций представлены в таблице 5.3.1.

Таблица 5.3.1 – Распределение рецепторов CD11b и CD95 на интактных и активированных нейтрофильных гранулоцитах периферической крови здоровых доноров, % (M ± m) первая фаза м.ц., ФМА 3,91±0,65* 73,13±2,73* 20,35±2,78* 2,72±0,53* n= вторая фаза м.ц., ФМА 2,95±0,39* 70,45±2,27* 25,87±1,82* 2,63±0,38* n= n= Примечание для таблиц 5.3.1 – 5.3.2:

* - достоверность отличий при сравнении контроля с ФМА Исследование показало, что распределение рецепторов на нейтрофильных гранулоцитах не зависит от пола обследуемых лиц и от фазы менструального цикла у женщин.

При изучении распределения рецепторов CD11b и CD95 на интактных нейтрофильных гранулоцитах было установлено, что максимальное количество клеток 83% на своей поверхности имели рецептор CD11b и не несли рецептор CD95. Менее 10% приходилось на нейтрофилы, не имеющие на своей поверхности ни рецептора CD11b, ни рецептора CD95. Близок к этому процент нейтрофилов, экспрессирующих на своей поверхности оба рецептора. При этом следует отметить, что неактивированые нейтрофильные гранулоциты, экспрессирующие только рецептор CD95, представлены в цельной крови в количестве не более 1%.

После воздействия на нейтрофильные гранулоциты ФМА изменялось процентное соотношение всех четырех популяций клеток. Происходило снижение количества клеток CD11b+CD95- до 73%. Также уменьшалось количество нейтрофилов CD11b+CD95+ и клеток CD11b-CD95- до 4% и 3% соответственно. После активации ФМА наблюдалось достоверное увеличение количества нейтрофильных гранулоцитов, экспрессирующих на своей поверхности лишь рецептор CD95, с 0,5% до 25%.

При постановке анализа на проточном цитофлюориметре было замечено, что популяция нейтрофильных гранулоцитов неоднородна по показателям бокового и прямого светорассеивания. И в гистограмме можно было выделить две области клеток: первая – нейтрофильные гранулоциты с высокими показателями прямого светорассеивания, получившие сокращенную аббревиатуту ВППС; вторая – нейтрофильные гранулоциты с низкими показателями прямого светорассеивания, получившие сокращенную аббревиатуту НППС (рисунок 2).

активированной (Б) популяции нейтрофильных гранулоцитов по показателям бокового и прямого светорассеивания. Гейт А – нейтрофилы с высокими показателями прямого светорассеивания (ВППС), гейт Е – нейтрофилы с низкими показателями прямого светорассеивания (НППС).

После активации нейтрофильных гранулоцитов ФМА происходило перераспределение нейтрофильных гранулоцитов по показателям прямого светорассеивания и изменялось процентное соотношение двух субпопуляций нейтрофилов (таблица 5.3.2).

нейтрофильных гранулоцитов по показателям бокового и прямого светорассеивания между мужчинами и женщинами в первую и вторую фазы менструального цикла разницы выявлено не было ни у интактных, ни у активированных нейтрофилов.

гранулоцитов цельной крови на долю ВППС нейтрофилов в среднем приходилось 90% от общего числа клеток, 10% составляли НППС нейтрофилы. После активации ФМА наблюдалось увеличение содержания НППС нейтрофилов до 30%.

гранулоцитов по показателям прямого светорассеивания, (M ± m) м.ц., n= м.ц., n= n= Следующим этапом исследования являлась оценка распределения рецепторов CD11b и CD95 в субпопуляциях нейтрофильных гранулоцитов с высокими и низкими показателями прямого светорассеивания, данные представлены в таблице 5.3.3.

При сравнении субпопуляций ВППС и НППС нейтрофильных гранулоцитов было установлено, что входящие в их состав клетки различались между собой по экспрессии на своей поверхности рецепторов CD11b и CD95. В субпопуляции нейтрофилов с высокими показателями прямого светорассеивания преобладали клетки, имеющие на своей экспрессирующих в своей поверхности только один рецептор CD95, содержалось менее 1%. В субпопуляции нейтрофильных гранулоцитов с низкими показателями прямого светорассеивания же больше половины клеток не экспрессировали на своей поверхности ни рецептора CD11b, ни рецептора CD95.

Таблица 5.3.3 – Распределение рецепторов CD11b и CD95 в интактных субпопуляциях нейтрофильных гранулоцитов периферической крови здоровых доноров, % (M ± m) первая фаза нейтрофилы n= вторая фаза нейтрофилы n= n= Примечания для таблиц 5.3.3 – 5.3.4:

* - достоверность отличий при сравнении нейтрофилов с высокими и низкими показателями прямого светорассеивания Поскольку активация нейтрофильных гранулоцитов приводила к изменению их физических свойств, то нами было высказано предположение, что изменения также могут происходить и с рецепторным аппаратом. Исходя из данного предположения, было изучено распределение рецепторов CD11b и CD95 в субпопуляциях нейтрофильных гранулоцитов с высокими и низкими показателями прямого светорассеивания после активации ФМА.

Оценивались, так же как и ранее четыре популяции клеток: CD11b+CD95+, CD11b+CD95-, CD11b-CD95+, CD11b-CD95-. Данные представлены в таблице 5.3.4.

После воздействия на нейтрофильные гранулоциты цельной крови ФМА было отмечено, что в обеих субпопуляциях нейтрофильных гранулоцитов содержалось одинаковое количество клеток экспрессирующих на своей поверхности и рецептор CD11b, и рецептор CD95. В субпопуляции экспрессировали на своей поверхности только рецептор CD11b. В состав субпопуляции ВППС нейтрофилов после активации ФМА входили также и клетки экспрессирующие только рецептор CD95 и клетки, не имеющие обоих рецепторов, но их количество в сумме не превышало 2%.

Таблица 5.3.4 – Распределение рецепторов CD11b и CD95 в активированных субпопуляциях нейтрофильных гранулоцитов периферической крови здоровых доноров, % (M ± m) первая фаза нейтрофилы n= вторая фаза нейтрофилы n= n= После активации ФМА в субпопуляции НППС нейтрофильных гранулоцитов более 70% клеток экспрессировали только рецептор CD95, около 20% клеток имели на своей поверхности лишь рецептор CD11b, остальные нейтрофилы несли либо оба рецептора (2% клеток), либо не обнаруживали рецепторов (5% клеток).

На следующем этапе исследования нам было интересно проследить изменения в экспрессии рецепторов на нейтрофильных гранулоцитах после активации ФМА как в общей популяции клеток, так и в двух субпопуляциях.

Поскольку из данных приведенных выше следует, что распределение рецепторов на интактных и активированных нейтрофильных гранулоцитах не зависило от пола обследуемых лица и так же не менялось у женщин на протяжении всего менструального цикла, то было принято решение объединить все показатели в одну группу.

При изучении распространения CD11b+CD95+ нейтрофильных гранулоцитов было установлено, что, как при анализе общей популяции нейтрофилов, так и при изучении ВППС и НППС субпопуляций нейтрофилов, после действия активатора наблюдалось снижение количества клеток экспресирующих на своей поверхности оба рецептора (рисунок 3).

Рисунок 3 – Анализ распределения CD11b+CD95+ нейтрофильных гранулоцитов до и после активации ФМА В ходе выполнения работы было установлено, что после активации нейтрофильных гранулоцитов ФМА происходило снижение количества CD11b+CD95- клеток по сравнению с контролем в общей популяции нейтрофилов (рисунок 4), несмотря на то, что после активации в субпопуляции ВППС нейтрофилов наблюдался рост клеток, несущих только рецептор CD11b. Это объясняется тем фактом, что после действия ФМА количество НППС клеток увеличивалось до 30%, а данная субпопуляция нейтрофилов в интактном и активированном состоянии имела в своем составе малое количество клеток CD11b+CD95-.

ВППС НФ

НППС НФ

Рисунок 4 – Анализ распределения CD11b+CD95- нейтрофильных гранулоцитов до и после активации ФМА нейтрофильных гранулоцитов цельной крови экспрессировало на своей поверхности только рецептор CD95 (рисунок 5). После активации процент этих клеток в общей популяции нейтрофильных гранулоцитов вырастал до 20%, при этом рост происходил исключительно за счет субпопуляции НППС нейтрофилов, в субпопуляции ВППС клеток до и после активации количество CD11b-CD95+ нейтрофилов не превышало 1%.

Рисунок 5 – Анализ распределения CD11b-CD95+ нейтрофильных гранулоцитов до и после активации ФМА В неактивированном состоянии, как уже было сказано ранее, нейтрофильных гранулоцитов. Однако, поскольку основной вклад в общую популяцию нейтрофилов составляли ВППС клетки, то при анализе общей популяции нейтрофилов CD11b-CD95- клеток обнаруживалось малое количество (рисунок 6). После активации нейтрофилов ФМА наблюдалось популяциях нейтрофильных гранулоцитов.

НППС НФ

Рисунок 6 – Анализ распределения CD11b-CD95- нейтрофильных гранулоцитов до и после активации ФМА Таким образом, было установлено, что по своей природе популяция нейтрофильных гранулоцитов неоднородна и при использовании метода проточной цитофлюориметрии в ней можно выделить две субпопуляции по измерению показателей размера и структуры клеток. После активации происходит перераспределение нейтрофильных гранулоцитов между двумя субпопуляциями, увеличивается количество клеток, имеющих более низкие показатели прямого светорассеивания (меньший размер клеток).

нейтрофильных гранулоцитах периферической крови было установлено, что две субпопуляции нейтрофилов различаются не только по показателям размера и структуры клеток, но и по распределению рецепторов на них. В интактном состоянии в субпопуляции ВППС нейтрофилов 89% клеток субпопуляции НППС нейтрофилов больше половины клеток не имеют на своей поверхности ни рецептора CD11b, ни рецептора CD95. После активации нейтрофильных гранулоцитов ФМА происходят следующие изменения рецепторного аппарата клеток: в субпопуляции нейтрофилов с высокими показателями прямого светорассеивания количество клеток, имеющих только рецептор CD11b, увеличивается до 96%, а в субпопуляции нейтрофилов с низкими показателями прямого светорассеивания 74% клеток начинают экспрессировать на своей поверхности рецептор CD95.

Две субпопуляции нейтрофильных гранулоцитов, разделенные по показателям прямого светорассеивания на проточном цитофлюориметре, различаются между собой не только по размеру, массе клеток и рецепторному аппарату, но, по всей видимости, и по набору выполняемых функций. В субпопуляцию нейтрофилов с высокими показателями прямого светорассеивания входят клетки, отвечающие за миграцию клеток в очаг воспаления, распознание объекта фагоцитоза и, вероятно, за формирование внеклеточных ловушек. Субпопуляцию нейтрофилов с низкими показателями прямого светорассеивания представляют клетки, которые после воздействия раздражителя активируются и уходят в апоптоз.

Нейтрофильные гранулоциты – клетки, представляющие одну из первых линий защиты организма от внедрения патогенов [144, 163]. Это профессиональные охотники за микробами, обладающие самой высокой подвижностью среди всех клеток организма человека [85]. Изучение строения, физиологии нейтрофильных гранулоцитов, биохимического состава их гранул, структуры синтезируемых ими метаболитов и роли этих клеток в регуляции иммунного гомеостаза является одной из актуальных проблем иммунологии [76, 70, 15, 55, 73].

Нейтрофил оснащен богатым набором рецепторов, которые позволяют чутко и дифференцированно реагировать на малейшие изменения окружающей среды [28, 63, 137]. Связывание рецепторов нейтрофильного гранулоцита с бактериальными компонентами приводит к активации клетки [15].

Нейтрофильные гранулоциты периферической крови не являются однородной клеточной популяцией и показывают значительные различия в составе мембран, экспрессии рецепторов для активаторов, стимулировании респираторного взрыва, и некоторых других функций и метаболических возможностей [95, 98].

Нейтрофилы, традиционно, относят к тканевым фагоцитирующим клеткам [54, 42, 58, 15]. Они первые приходят в очаг воспаления, где проявляют разнообразные виды активности [85]. В крови содержится малое количество всех нейтрофилов, большая часть их осуществляет свои функции в тканевых депо и на слизистых оболочках: цервикальной и вагинальной слизи, слюне, слизи, покрывающей кишечный эпителий [15, 17, 92]. При этом, на поверхности слизистых оболочек встречается большое количество жизнеспособных и функционально активных нейтрофильных гранулоцитов [18, 66, 60].

Известно, что нейтрофильные гранулоциты, выходя на поверхность слизистых оболочек и встречаясь с различными представителями микрофлоры и другими компонентами секрета, активируются [15, 85, 163].

Подготовленный нейтрофил может оказывать свое действие на объект, вызвавший его активацию, различными способами: фагоцитировать и уничтожать его в фаголизосомах [15], секретировать наружу биологически содержимое гранул [15, 84], или формировать во внеклеточном пространстве нейтрофильные внеклеточные ловушки [17, 127, 194, 173].

гранулоцитов периферической крови и слизистых секретов, а так же появление современных иммунологических методов исследования врожденного иммунитета определило цель работы – изучение показателей функциональной активности интактных и активированных нейтрофильных гранулоцитов мукозальных секретов (слюны, вагинального секрета и цервикального секрета) и цельной периферической крови у здоровых мужчин и женщин.

Для достижения поставленной цели было проведено исследование, в котором приняло участие 30 практически здоровых мужчин и 30 практически здоровых небеременных женщин в первую и вторую фазы менструального цикла, чей возраст варьировался от 18 до 35 года. У всех обследуемых дополнительно происходил забор цервикального и вагинального секретов на 7-10 и 21-23 дни менструального цикла. Группы были сформированы в зависимости от задачи исследования: в контрольной группе исследования проводили на интактной цельной крови, лейкоцитарной взвеси, нейтрофилах, выделенных из периферической крови на двойном градиенте фиколлверографина, слюне, цервикальном или вагинальном секретах, без присутствия активатора; в опытной группе объектом изучения служили цельная кровь, лейкоцитарная взвесь, нейтрофилы, выделенные из периферической крови на двойном градиенте фиколл-верографина, слюна, цервикальный или вагинальный секреты после активации экзогенными факторами микробной и немикробной природы.

Как уже упоминалось ранее, нейтрофильные гранулоциты, выходя на поверхность слизистых оболочек, активируются и погибают. В этой связи одной из задач исследования была сравнительная оценка процентного соотношения морфологических форм нейтрофильных гранулоцитов, а так же количество внеклеточных ловушек, входящих в состав различных мукозальных секретов. Для этого применялся сложный метод окрашивания с использованием двух красителей: синьки Эванса и Sytox Green [52].

Проведенное исследование показало, что у мужчин в состав слюны входит достоверно большее количество жизнеспособных и мертвых нейтрофилов, а нейтрофильных гранулоцитов в состоянии апоптоза содержится меньше по сравнению с женщинами, как в первую, так и во вторую фазы менструального цикла. Количество внеклеточных ловушек у мужчин было достоверно выше по сравнению с этим показателем у женщин в первую фазу и значимо ниже, чем у женщин во вторую фазу менструального цикла. Таким образом, было установлено, что процентное соотношение морфологических форм нейтрофильных гранулоцитов и количество НВЛ в слюне зависит от пола.

морфологического состава популяций нейтрофильных гранулоцитов мукозальных секретов на протяжении менструального цикла у женщин.

В ходе выполнения работы было установлено, что у женщин количество внеклеточных ловушек, присутствующих в слюне, цервикальном и вагинальном секретах, зависит от фазы менструального цикла, а именно:

наблюдается рост данного показателя во вторую фазу цикла. Число нейтрофилов в состоянии апоптоза, во всех исследованных мукозальных секретах, у женщин во вторую фазу ниже, чем в первую. Количество жизнеспособных и мертвых нейтрофилов, входящих в состав секретов у женщин остается постоянным на протяжении всего менструального цикла.

Эстрадиол и прогестерон – важные гормоны, контролирующие репродуктивную функцию женского организма. Они также способны оказывать ярко выраженное иммуномодулирующее действие [81]. Данные специфическими рецепторами — ER и PR, которые обнаруживаются на клетках иммунной системы [187, 111]. В лютеиновую фазу достигается более высокая концентрация прогестерона и эстрадиола по сравнению с фолликулярной фазой [23]. Именно увеличение концентрации данных гормонов может служить причиной того, что во вторую фазу менструального цикла у женщин в мукозальных секретах наблюдается рост количества внеклеточных ловушек, о чем косвенно свидетельствует исследование, проведенное Смирновой Т.Г. (2013), которое показало, что эстрадиол и прогестерон стимулируют формирование внеклеточных ловушек у нейтрофилов, выделенных из периферической крови женщин.

Еще одной возможной причиной роста внеклеточных ловушек во вторую фазу менструального цикла может служить тот факт, что в первую фазу менструального цикла из цервикального канала и влагалища в основном высеваются лактобактерии, единичные дрожжеподобные грибы рода Candida менструального цикла в цервикальном канале и во влагалище чаще обнаруживаются представители факультативной флоры: стафилококки, дрожжеподобные грибы, E. сoli, Enterobacter spp. и Enterococcus spp. [31, 30, 11, 2, 8, 26, 84]. Микрофлора полости рта также крайне разнообразна и включает бактерии (стафилококки, палочковидные лактобактерии, лептотрихии и др.), грибы (актиномицеты, Candida), простейшие, вирусы. В течение менструального цикла в слюне происходят количественные изменения состава представителей разных микроорганизмов (увеличение во вторую фазу) при этом видовое представительство остается постоянным [7].

Раннее исследователями было доказано, что E. coli, Staphylococcus aureus и Candida albicans нейтрофильными гранулоцитами, выделенными из периферической крови на двойном градиенте фиколл-верографина [59, 84, 188, 112, 149, 109], возможно та же закономерность действует и в мукозальных секретах.

При изучении количества нейтрофильных внеклеточных ловушек, присутствующих в различных биологических секретах, было показано, что наибольшее количество внеклеточных ловушек присутствует в слюне. В вагинальном и цервикальном секретах количество внеклеточных ловушек не превышало 10% от общей популяции нейтрофилов.

Изучение морфологических форм нейтрофильных гранулоцитов, входящих в состав слюны, цервикального и вагинального секретов, показало, что наибольшее количество жизнеспособных клеток присутствовало в цервикальном секрете женщин и составляло 48% от общей популяции нейтрофилов, что достоверно выше, чем в вагинальном секрете и слюне.

Наименьшее количество мертвых нейтрофилов входило в состав слюны 6%, в вагинальном и цервикальном секретах данный показатель достигал значений 13%, в среднем в состав мукозальных секретов входит небольшое количество мертвых клеток. При оценке количества нейтрофильных гранулоцитов, находящихся в состоянии апоптоза в различных биологических секретах, было установлено, что минимальное значение данный показатель имеет в популяции нейтрофильных гранулоцитов цервикального секрета, а максимальное – в слюне.

Параллельно с этим так же определялась функциональная активность интактных нейтрофильных гранулоцитов слюны, вагинального и цервикального секретов. Фагоцитарную активность определяли по методу Фрейдлин И.С. (1986), внутриклеточный кислородзависимый метаболизм оценивали с помощью НСТ-теста в модификации Маянского А.Н. и Виксмана М.К. (1979), а также считали лизосомальную активность нейтрофильных гранулоцитов [74].

гранулоцитов слюны, было установлено, что этот показатель у мужчин значимо ниже, чем у женщин, как в первую, так и во вторую фазы менструального цикла. У мужчин показатели фагоцитарной функции нейтрофильных гранулоцитов слюны достоверно выше, чем у женщин независимо от фазы менструального цикла. Показатели кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов слюны не зависят от пола обследуемых лиц.

Проведенное исследование показало, что лизосомальная активность нейтрофильных гранулоцитов репродуктивного тракта женщин зависит от фазы менструального цикла: в первую фазу значения достоверно выше, чем во вторую. Даная закономерность не наблюдается в слюне. Было установлено, что показатели фагоцитоза и НСТ-теста нейтрофильных гранулоцитов слюны, вагинального и цервикального секретов у женщин остаются неизменными на протяжении всего менструального цикла.

Наибольшие показатели лизосомальной активности по сравнению с другими секретами были выявлены у нейтрофильных гранулоцитов слюны, минимальные значения определялись при оценке вагинального секрета.

В основе защитной функции нейтрофильных гранулоцитов лежит фагоцитарный процесс, заключающийся в их способности распознавать, поглощать, убивать и переваривать микробные клетки [17]. При анализе фагоцитарной функции нейтрофильных гранулоцитов в различных биологических секретах было установлено, что наибольшее количество нейтрофилов, активно фагоцитирующих чужеродные объекты, содержится в цервикальном секрете у женщин.

Результаты оценки кислородзависимого метоболизма нейтрофильных гранулоцитов слизистых секретов показали, что наиболее высокие показатели НСТ-теста определяются у нейтрофилов цервикальной слизи.

На поверхности слизистых оболочек нижних отделов репродуктивного тракта здоровых женщин, а так же в составе слюны находится большое количество лейкоцитов, при этом доминирующими клетками, как слюны, так и цервикального и вагинального секретов, являлись нейтрофилы [84].

Нейтрофильные гранулоциты, мигрирующие на поверхности слизистых оболочек, играют важную роль в их противомикробной защите [15].

Наибольшее значение в антимикробной устойчивости гениталий принадлежит нейтрофилам цервикального секрета, поскольку по количеству и функциональной активности они превосходят гранулоциты других секретов репродуктивного тракта женщины [67, 92]. Доказано, что нейтрофилы, содержащиеся в секрете слизистой оболочки шейки матки, функционально полноценны, обладают высокой фагоцитарной активностью и кислородзависимой цитотоксичностью, мощным лизосомальным аппаратом [18, 40].

В ответ на микробные и немикробные стимулы нейтрофилы активно формируют во внеклеточном пространстве сетеподобные структуры, состоящие из нуклеиновых кислот и ферментов [127]. Формирование нейтрофилами внеклеточных ловушек является важным механизмом врожденного иммунитета [127, 194]. Образование НВЛ - это механизм защиты, работающий в тканях и на поверхности слизистых оболочек. Скорее всего, формирование внеклеточных ловушек является одним из важных механизмов участия нейтрофильного гранулоцита в противоинфекционной защите именно слизистых оболочек [17, 62].

Установлено, что популяции нейтрофильных гранулоцитов, входящих в состав слюны, вагинального и цервикального секретов, различаются между собой и по морфологическому составу, и по функциональной активности.

количество жизнеспособных клеток, которые активнее, чем нейтрофилы слюны и вагинального секрета, проявляют свою лизосомальную активность.

Клетки, входящие в состав цервикального секрета, в большем количестве и интенсивнее, чем в других секретах участвуют в процессе захватывания чужеродных частиц и уничтожения их путем фагоцитоза, а также имеют более высокий кислородзависимый потенциал. Нейтрофилы слюны хоть и обладают более низкой фагоцитарной и лизосомальной активностью по сравнению с клетками цервикального и вагинального секрета, но содержат в своем составе наибольшее количество нейтрофильных внеклеточных ловушек.

Из полученных данных можно высказать предположение, что нейтрофильные гранулоциты цервикального и вагинального секретов выполняют свою бактерицидную функцию, как за счет фагоцитоза, так и путем образования НВЛ, нейтрофилы же слюны уничтожают чужеродные микроорганизмы путем внеклеточного киллинга с помощью нейтрофильных внеклеточных ловушек.

Таким образом, на поверхности слизистых оболочек канала шейки матки, влагалища и ротовой полости имеется богатый арсенал клеточных (представленных в основном нейтрофильными гранулоцитами) факторов, обеспечивающих постоянную защиту от проникновения чужеродных агентов. В цервикальном канале концентрация этих факторов значительно выше по сравнению с влагалищем, что делает секрет шейки матки основным барьером на пути восходящей инфекции. Полученные данные не только не противоречат ранее проведенным исследованиям [66, 60, 84], а еще раз с привлечением дополнительных методов демонстрируют важную роль нейтрофильных гранулоцитов в защите слизистых оболочек.

Следующей задачей исследования являлось изучение влияния пирогенала и ФМА на процесс образования внеклеточных ловушек и соотношение морфологических форм нейтрофильных гранулоцитов в слюне, вагинальном и цервикальном секретах, а так же на функциональную активность нейтрофилов.

Установлено, что воздействие обоих препаратов приводит к усилению формирования внеклеточных ловушек нейтрофильными гранулоцитами слюны и слизистых оболочек репродуктивного тракта женщин. Количество нейтрофильных внеклеточных ловушек, присутствующих в слюне у мужчин после активации пирогеналом и ФМА, не отличалось от такого же показателя у женщин независимо от фазы менструального цикла. При сравнении количества внеклеточной ДНК, содержащейся в секретах у женщин в разные фазы менструального цикла после воздействия пирогеналом и ФМА, значимых различий выявлено не было.

Из полученных результатов видно, что к формированию внеклеточных ловушек способна ограниченная субпопуляция нейтрофилов мукозальных секретов. Несмотря на действие активаторов число нейтрофилов, находящихся на поверхности слизистых, способных образовывать внеклеточные ловушки не превышает 34%.

Активация нейтрофильных гранулоцитов мукозальных секретов, и пирогеналом, и ФМА приводит к снижению количества жизнеспособных клеток. Ранее в работе отмечалось, что у мужчин в слюне содержится больше жизнеспособных нейтрофилов по сравнению с данным показателем у женщин, данная закономерность сохраняется и после активации нейтрофилов слюны иммуностимуляторами.

Таким образом, после активации нейтрофильных гранулоцитов, входящих в состав мукозальных секретов, пирогеналом и ФМА происходило изменение их морфологического состава: наблюдался рост количества нейтрофильных внеклеточных ловушек, при этом процент жизнеспособных нейтрофилов падал, количество мертвых нейтрофилов и клеток в состоянии апоптоза оставалось неизменно. Этот факт свидетельствует о том, что к образованию внеклеточных ловушек способны только жизнеспособные нейтрофильные гранулоциты.

исследованиям [62, 64, 127], в которых показано, что пирогенал и ФМА индуцируют экструзию ДНК во внеклеточное пространство нейтрофильными гранулоцитами, выделенными из периферической крови, по всей видимости, данные правила действуют и на нейтрофилы мукозальных секретов.

функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов мукозальных секретов, что выражается в росте показателей лизосомальной активности клеток, а также увеличением числа клеток, активно захватывающих кислородзависимый метаболизм, что выражается в росте показателей НСТтеста.

Полученные результаты, сопоставимы с данными, полученными в работе Смирновой Т.Г. (2013). При исследовании влияния пирогенала на чистую фракцию нейтрофилов, выделенных из периферической крови, фагоцитарную активность нейтрофилов, при этом не оказывает влияния на показатели НСТ-теста.

Однако, по всей видимости, не все нейтрофильные гранулоциты мукозальных секретов подвергались активации, на что косвенно указывал тот факт, что независимо от выбранного активатора количество внеклеточных ловушек во всех исследованных биологических секретах не превышало 34%, а также не более 66% клеток способны активно захватывать чужеродные частицы.

В ходе выполнения эксперимента также было установлено, что после функционального резерва нейтрофильных гранулоцитов по сравнению с интактными клетками. Причиной этому могло служить как уменьшение количества жизнеспособных нейтрофильных гранулоцитов, входящих в состав секретов после активации, так и неоднородность популяции нейтрофилов, а именно тот факт, что не все нейтрофилы способны продуцировать активные формы кислорода в ответ на стимуляцию.

Следующей задачей исследования являлась оценка количества внеклеточных ловушек, входящих в состав цельной крови, лейкоцитарной взвеси и чистой фракции нейтрофилов у мужчин и у женщин в разные периоды менструального цикла. Оценка количества внеклеточных ловушек в цельной крови производилась в фиксированных препаратах венозной гепаринизированной крови, окрашенных по Романовскому-Гимза. Для исследования лейкоцитарной взвеси и чистой фракции нейтрофилов применялся метод индикации НВЛ при окраске акридиновым оранжевым [51].

Результаты исследования показали, что у мужчин и у женщин в первую и вторую фазы менструального цикла в неактивированной цельной крови и лейкоцитарной взвеси содержится одинаковое количество нейтрофильных внеклеточных ловушек и данный показатель не привышает 2% от общей популяции нейтрофилов. Количество нейтрофильных внеклеточных ловушек в выделенной чистой фракции нейтрофилов составляет около 4%, данный показатель также не зависит от пола обследуемых лиц и фазы менструального цикла у женщин.

Следующей задачей была оценка влияния активатора микробной природы (пирогенал) и не микробной природы (ФМА) на образование внеклеточных ловушек нейтрофильными гранулоцитами цельной крови, лейкоцитарной взвеси и чистой фракции нейтрофилов.

Установлено, что после воздействия пирогеналом и ФМА число внеклеточных ловушек, образованных нейтрофильными гранулоцитами цельной крови и лейкоцитарной взвеси, оставалось таким же, как и в контроле и не отличалось ни в одной пробе независимо от пола обследуемых лиц и фазы менструального цикла у женщин.

После активации пирогеналом и ФМА нейтрофилов, выделенных из периферической крови на двойном градиенте плотности фиколлверографина, наблюдалось достоверное увеличение количества нейтрофильных внеклеточных ловушек по сравнению с неактивированными клетками. Разницы в числе НВЛ между показателями у мужчин и у женщин выявлено не было. После воздействия пирогеналом процент внеклеточных ловушек составлял 16%, после активации ФМА – 24% от общей популяции нейтрофилов.

Таким образом, в цельной крови, лейкоцитарной взвеси и чистой фракции нейтрофилов присутствуют нейтрофильные внеклеточные ловушки.

Минимальное количество внеклеточной ДНК было обнаружено в препаратах цельной крови и лейкоцитарной взвеси. Действие пирогенала и ФМА в чистой фракции нейтрофилов активировало продукцию внеклеточных ловушек, в отличие от цельной крови и лейкоцитарной взвеси, в которых действие активаторов не изменяло морфологический состав популяции нейтрофилов. Различий в показателях между лицами разного пола и женщинами в разные периоды менструального цикла обнаружены не были.

У здоровых доноров в образцах цельной крови наблюдается минимальное количество внеклеточных ловушек, либо не обнаруживается совсем [61, 131], это может быть связано с тем, что в цельной крови присутствуют факторы препятствующие формированию нейтрофильных внеклеточных ловушек в кровеносном русле как в интактном состоянии, так и после воздействия активаторов. В работе Савочкиной А.Ю. было установлено, что добавление аутологичной сыворотки и плазмы крови к отмытой фракции нейтрофильных гранулоцитов оказывают стабилизирующее действие на нейтрофильные гранулоциты и блокируют формирование нейтрофильных внеклеточных ловушек, даже после их активации. Присутствие в цельной крови блокаторов формирования нейтрофильных внеклеточных ловушек имеет огромный биологический смысл – образование внеклеточных ловушек не должно происходить в кровяном русле, так как это может вызвать закупорку мелких сосудов нитями ДНК [112].

Проточная цитофлюориметрия дает возможность оценить практически все параметры фагоцитарного звена иммунной системы, где наряду с идентификацией поверхностных рецепторных молекул фагоцитов широко применяются и иные подходы к изучению функционального статуса клеток [37].

Для определения внутриклеточного кислородзависимого метаболизма и фагоцитарной функции нейтрофильных гранулоцитов методом проточной цитофлюориметрии использовали гепаринизированную венозную кровь здоровых доноров: мужчин и женщин в первую и вторую фазы менструального цикла. В качестве активатора применялся ФМА.

У здоровых лиц 28% нейтрофилов крови в неактивированном состоянии генерировали активные формы кислорода в системе НАДФНоксидазы, что выражалось в флуоресценции клеток в зеленой области спектра, а после активации нейтрофилов процент данных клеток возрастал до 80. Индекс стимуляции нейтрофильных гранулоцитов в среднем имел значение 3,6. Анализ показателей фагоцитарной активности нейтрофильных гранулоцитов периферической крови показал, что 90% нейтрофилов активно захватывали St. aureus, конъюгированный с флуоресцеин изотиоцианатом.

Показатели кислородзависимого метаболизма, активности и фагоцитоза нейтрофильных гранулоцитов периферической крови, определенные методом проточной цитофлюориметрии, не зависят от пола обследуемых лиц менструального цикла.

Выполняющие одинаковые функции клетки одной популяции могут различаться по степени проявления неспецифической активности, т. е.

морфологически неразличимы [65, 13]. Кроме того, морфологически однородные клетки одной популяции могут проявлять различную специфическую функциональную активность, т.е. быть функционально неоднородными [48, 89]. Нейтрофильные гранулоциты периферической крови не являются однородными и показывают значительные различия в составе мембран, гранул, экспрессии рецепторов для активаторов, стимулировании респираторного взрыва, и некоторых других функций и метаболических возможностей [95].

При постановке анализа на проточном цитофлюориметре было замечено, что популяция нейтрофильных гранулоцитов периферической крови не однородна по показателям бокового и прямого светорассеивания. И в ней можно было выделить две области клеток: первая – нейтрофильные гранулоциты с высокими показателями прямого светорассеивания, получившие сокращенную аббревиатуту ВППС; вторая – нейтрофильные гранулоциты с низкими показателями прямого светорассеивания, получившие сокращенную аббревиатуту НППС. После активации нейтрофильных гранулоцитов ФМА происходило перераспределение нейтрофильных гранулоцитов по показателям прямого светорассеивания.

гранулоцитов цельной крови на долю ВППС клеток в среднем приходилось 90% от общего числа клеток, 10% составляли нейтрофилы с низкими показателями прямого светорассеивания. После активации ФМА наблюдалось увеличение содержания НППС нейтрофилов до 30%.

Нейтрофильные гранулоциты оснащены богатым набором рецепторов, которые позволяют им быстро и дифференцировано реагировать на малейшие изменения окружающей среды [63, 137]. Следующей задачей исследования являлось оценка распределение рецепторов CD11b и CD95 на нейтрофильных гранулоцитов периферической крови между двумя субпопуляциями до и после их активации, в качестве активатора было принято решение использовать ФМА. CD95 антиген принадлежит к так называемому семейству рецепторов клеточной гибели и высоко экспрессируется на активированных лейкоцитах [146, 143]. CD95 антиген исследователи в основном связывают с индукцией лейкоцитами апоптоза [190]. CD11b играет роль в миграции макрофагов из кровяного русла в очаг воспаления в процессе иммунного ответа [170], является молекулой межклеточной адгезии [102, 185].

нейтрофильных гранулоцитах цельной крови проводили методом проточной цитофлюориметрии с использованием одноцветных реагентов CD11b, меченого FITC, и CD95, меченого PE. Использование для детекции сигнала двух каналов проточного цитофлуориметра позволило разделить все нейтрофильные гранулоциты на четыре популяции:

- нейтрофилы, экспрессирующие на своей поверхности оба рецептора CD11b и CD95 (CD11b+CD95+);

- нейтрофилы, экспрессирующие на своей поверхности только рецептор CD11b (CD11b+CD95-);

- нейтрофилы, экспрессирующие на своей поверхности только рецептор CD95 (CD11b-CD95+);

- нейтрофилы, неэкспрессирующие на своей поверхности ни рецептора CD11b, ни рецептора CD95 (CD11b-CD95-).

нейтрофильных гранулоцитов было установлено, что входящие в их состав клетки различались между собой по экспрессии на своей поверхности рецепторов CD11b и CD95. В популяции ВППС нейтрофилов преобладали клетки CD11b+CD95-, при этом CD11b-CD95+ нейтрофилов содержалось менее 1%. В популяции НППС нейтрофильных гранулоцитов больше половины клеток не экспрессировали на своей поверхности ни рецептора CD11b, ни рецептора CD95.

Поскольку активация нейтрофильных гранулоцитов приводила к изменению их физических свойств, то было высказано предположение, что изменения также могут происходить и с рецепторным аппаратом нейтрофилов. Исходя из данного предположения, было изучено распределение рецепторов CD11b и CD95 в субпопуляциях нейтрофильных гранулоцитах с высокими и низкими показателями прямого светорассеивания после активации ФМА. Оценивались, так же как и ранее, четыре популяции клеток: CD11b+CD95+, CD11b+CD95-, CD11b-CD95+, CD11b-CD95-.

Установлено, что через 30 минут после воздействия ФМА в обеих субпопуляциях нейтрофильных гранулоцитов содержалось одинаковое активированных ВППС нейтрофильных гранулоцитов наибольшее количество клеток (96%) экспрессировали на своей поверхности только рецептор CD11b.

После активации ФМА в состав субпопуляция нейтрофильных гранулоцитов с низкими показателями прямого светорассеивания входило 74% CD11b-CD95+ 20% CD11b+CD95нейтрофилы несли либо оба рецептора (2%), либо не экспрессировали рецепторов (5%).

Таким образом, было установлено, что по своей природе популяция нейтрофильных гранулоцитов неоднородна и при использовании метода проточной цитофлюориметрии в ней возможно выделить две субпопуляции.

После активации происходит перераспределение нейтрофильных гранулоцитов между двумя субпопуляциями, увеличивается количество клеток, имеющих более низкие показатели прямого светорассеивания (меньший размер клеток).

нейтрофильных гранулоцитах периферической крови было установлено, что две субпопуляции нейтрофилов различаются не только по показателям размера и структуры клеток, но и по распределению рецепторов на них. В интактном состоянии в субпопуляции ВППС нейтрофилов 89% клеток экспрессируют на своей поверхности только рецептор CD11b, а в субпопуляции НППС нейтрофилов больше половины клеток не имеют на своей поверхности ни рецептора CD11b, ни рецептора CD95. После активации нейтрофильных гранулоцитов ФМА происходят следующие изменения рецепторного аппарата клеток: в субпопуляции нейтрофилов с высокими показателями прямого светорассеивания количество клеток, имеющих только рецептор CD11b, увеличивается до 95%, а в субпопуляции нейтрофилов с низкими показателями прямого светорассеивания 74% клеток экспресируют на своей поверхности только рецептор CD95.

гранулоцитов, степень их зрелости определяются состоянием рецепторного аппарата нейтрофила [41]. Специфическая мембранная рецепция отражает адгезивные, поглотительные, цитолитические, апоптические способности нейтрофильных гранулоцитов находится в непосредственной зависимости от количества и плотности таких рецепторов, как CD11b, CD64, CD16, CD32, CD95 [29].

Две субпопуляции нейтрофильных гранулоцитов, разделенные по цитофлюориметре, различаются между собой не только по размеру, массе клеток и рецепторному аппарату, но, по всей видимости, и по набору показателями прямого светорассеивания входят клетки, отвечающие за миграцию клеток в очаг воспаления, распознания объекта фагоцитоза и, вероятно, за формирование внеклеточных ловушек. Субпопуляцию активируются и уходят в апоптоз.

1. Секреты слизистых оболочек помимо нейтрофильных гранулоцитов содержат в своем составе значительное количество внеклеточных ловушек. Количество нейтрофильных внеклеточных ловушек в слюне зависит от пола обследуемых лиц и фазы менструального цикла у женщин. У женщин во вторую фазу менструального цикла в слюне и секретах репродуктивного тракта наблюдается увеличение количества внеклеточных ловушек.

2. Клетки, присутствующие в цервикальном секрете, функционально более полноценны, чем нейтрофилы слюны и вагинального секрета, у них выше лизосомальная, фагоцитарная активность, а также они имеют более высокий кислородзависимый потенциал. Лизосомальная активность нейтрофильных гранулоцитов репродуктивного тракта женщин зависит от фазы менструального цикла: в первую фазу она кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов слюны, вагинального и цервикального секретов остаются неизменными на протяжении всего менструального цикла.

После активации пирогеналом и форбол-миристат-ацетатом нейтрофильных гранулоцитов мукозальных секретов, происходит относительное количество жизнеспособных клеток снижается, растет кислородзависимый метаболизм.

4. В состав цельной крови и лейкоцитарной взвеси входит 2% нейтрофильных внеклеточных ловушек. Количество внеклеточных ловушек в выделенной чистой фракции нейтрофилов составляет 4%, данный показатель не зависит от пола обследуемых лиц и фазы менструального цикла у женщин. Воздействие пирогеналом и форболмиристат-ацетатом увеличивает количество внеклеточных ловушек в лейкоцитарной взвеси с пирогеналом и форбол-миристат-ацетатом не приводит к росту числа нейтрофильных внеклеточных ловушек.

5. Популяция нейтрофильных гранулоцитов периферической крови неоднородна в своем составе, в ней можно выделить две области клеток: нейтрофилы с высокими и низкими показателями прямого светорассеивания. После активации происходит перераспределение нейтрофильных гранулоцитов между двумя субпопуляциями, увеличивается количество клеток, имеющих более низкие показатели светорассеивания с 10% до 30%.

В неактивированом состоянии в субпопуляции нейтрофилов с высокими показателями прямого светорассеивания 89% клеток экспрессируют на своей поверхности только рецептор CD11b, после активации уровень экспрессии возрастает до 95%. В субпопуляции нейтрофилов с низкими показателями прямого светорассеивания 65% клеток не несут на своей поверхности ни рецептора CD11b, ни экспресировать на своей поверхности рецептор CD95.

Список наиболее часто используемых сокращений АБП – антибактериальные пептиды АФК – активные формы кислорода БПИ – бактерицидный индуцированный протеин ВППС – высокий показатель прямого светорассеивания ГМ-КСФ – гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор ДМСО – диметилсульфоксид ДНК – дизоксирибонуклеиновая кислота ДХФ-ДА – дихлорофлуоресцеина диацетат ИЛ – интерлейкин ИФ – интерферон ЛПС – липополисахарид ЛЭ – лейкоцитарная эластаза НАДФН-оксидазы – никотинамидадениндинуклеотидфосфатфосфатзависимая оксидаза НВЛ – нейтрофильные внеклеточные ловушки НППС – низкий показатель прямого светорассеивания НСТ – нитросиний тетразоль РНК – рибонуклеиновая кислота ФИТЦ – флуоресцеина изотиоцианат ФМА – форбол-12-миристат-13-ацетат ФСБ – фосфатно-солевой буфер CD – кластер дифференцировки E.сoli – Escherichia coli FITC – флуоресцеина изотиоцианат Н2О2 – перекись водорода Ig – иммуноглобулин PE – фикоэритрин 1. Алексеев, Н.А. Клинические аспекты лейкопении, нейтропении и функциональных нарушений нейтрофилов / Н.А. Алексеев. – СанктПетербург : Фолиант, 2002. – 416 с.

2. Анкирская, A.C. Видовой состав и некоторые биологические свойствалактобацилл при различных состояниях микроэкологии влагалища / A.C. Анкирская, В.В. Муравьева // Акушерство и гинекология. - 2000. - № 3. - С. 26-28.

3. Бахов, Н.И. Концепция апоптоза / Н.И. Бахов, Ю.Ф. Майчук, А.В.

Корнев // Иммунология. - 1997. - № 3. - С. 62-64.

4. Белушкина, Н.Н. Молекулярные основы патологии апоптоза / Н.Н.

Белушкина, С.Е. Северин // Архив патологии. - 2001. - № 1. - С. 51-60.

5. Бережная, Н.М. Нейтрофилы и иммунологический гомеостаз / Н.М.

Бережная. – Киев : Наук, думка, 1988. – 189 с.

6. Боровиков, В.П. STATISTICA : искусство анализа данных на компьютере. Для профессионалов (+CD). / В.П. Боровиков. – СанктПетербург : Питер, 2003. – 688 с.

7. Боровский, Е.В. Биология полости рта / Е.В. Боровский, В.К. Леонтьев - Нижний Новгород : Изд-во НГМА, 2001. - 304 с.

8. Валышев, A.B. Анаэробная микрофлора женского репродуктивного тракта / A.B. Валышев, H.H. Елагина, О.В. Бухарин // Журн.

микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2001. - № 4. - С.

78-84.

липополисахарида Rhodobacter capsulatus на функциональные ответы и апоптоз фагоцитов крови человека при активации эндотоксинами :

автореф. дис. … д-ра биол. наук / М.Г. Винокуров. – Москва, 2007. – цитофлуориметрии / В.В. Войткова // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. – 2010. С. 220-225.

11.Воробьев, A.A. Бактерии нормальной микрофлоры: биологические свойства и защитные функции / A.A. Воробьев, Е.А. Лыкова // Журн.

микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1999. - № 6. - С.

102-105.

12.Герасимов, И.Г. Функциональная неравнозначность нейтрофилов крови человека: генерация активных форм кислорода / И.Г. Герасимов, Д.Ю. Игнатов // Цитология. - 2001. - Т. 43, № 5. - С. 432-436.

13.Герасимов И. Г. Неоднородность нейтрофилов в фагоцитозе и респираторном взрыве // Клин. лаб. диагн. – 2004. - № 6. - С. 34-36.

14.Герасимов, И.Г. Особенности активации нейтрофилов in vitro / И.Г.

Герасимов, Д.Ю. Игнатов // Цитология. - 2004. - Т. 46, № 2. - С. 155Долгушин, И.И. Нейтрофилы и гомеостаз / И.И. Долгушин, О.В.

Бухарин. – Екатеринбург : Изд-во УрОРАН, 2001. – 256 с.

16.Долгушин, И.И. Методы обнаружения нейтрофильных ловушек / И.И.

Долгушин, Ю.С. Шишкова, А.Ю. Савочкина // Аллергология и иммунология. – 2009. – Т. 10, № 4. – С. 458–462.

17.Долгушин, И.И. Нейтрофильные внеклеточные ловушки и методы оценки функционального статуса нейтрофилов / И.И. Долгушин, Ю.С.

Андреева, А.Ю. Савочкина. – Москва : Изд-во РАМН, 2009. – 208 с.

18.Долгушина В.Ф. Диагностика, лечение воспалительных заболеваний нижнего отдела половых органов, прогнозирование и профилактика их осложнений у беременных (клинико-иммунологическое исследование :

дис. … д-ра мед. наук / В.Ф. Долгушина. – Харьков, 1991. – 439 с.

19.Ермоленко, Д.К. Урогенитальный трихомониаз: пособие для врачей / Д.К. Ермоленко, В.А. Исаков, С.Б. Рыбалкин [и др.]. – Санкт-Петербург ; Великий Новгород : Б.и., 2007. - 96 с.

20.Жижина, Г.П. Роль апоптоза в нормальном онтогенезе, патогенезе и старении / Г.П. Жижина // Клинич. геронтология. - 2002. - Т. 8, № 4. С. 310.

21.Зеленин, А.В. Взаимодействие аминопроизводных акридина с клеткой / А.В. Зеленин. – Москва : Наука, 1971. – 231 с.

22.Зурочка, A.B. Изменение представлений об оценке иммунного статуса человека, новые проблемы и подходы к их решению / A.B. Зурочка, C.B. Хайдуков // Мед. иммунология. - 2007. - Т. 9, № 2-3. - С. 339-340.

23.Зяблицев, С.В. Гормонодиагностика патологии репродуктивной системы / С.В. Зяблицев, О.В. Синяченко, Е.А. Бочарова, П.А.

Чернобровцев. – Д. : Каштан, 2009. - 375 с.

24.Исачкова, Л.М. К развитию представлений об антиинфекционной резистентности / Л.М. Исачкова, Н.Г. Плехова // Эпидемиология и инфекционные болезни. – 2002. - №1. – С. 11-15.

25.Карпищенко, А.И. Медицинские и лабораторные технологии / А.И.

Карпищенко. – Санкт –Петербург : Интермедика, 1998. – 350 с.

26.Кафарская, Л.И. Микробная экология влагалища / Л.И. Кафарская, О.В.

эпидемиологии и иммунобиологии. - 2002. - № 6. – С. 91-99.

27.Кислюк, Н.С. клетки крови у детей в норме и патологии / Н.С. Кислюк, Р.В. Ленская. – Москва : Медицина, 1978. – 256 с.

28.Ковальчук, Л.В. Врожденные компоненты иммунитета: Toll-подобные рецепторы в норме и при иммунопатологии / Л.В. Ковальчук, М.В.

Хорева, А.С. Варивода // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2005. - № 4. – С. 96-104.

29.Козлов, И.Г. Рецепторы контактного взаимодействия / И.Г. Козлов, Н.К. Горлина, А.Н. Чередеев // Иммунология. – 1995. – № 4. – С. 14-24.

30.Коршунов, В.М. Изучение бифидофлоры влагалища у женщин репродуктивного возраста / В.М. Коршунов, З.А. Гудиева, Б.А. Ефимов [и др.] // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. С. 74-78.

31.Костюк, О.П. Физиологические и терапевтические свойства лактобактерий / О.П. Костюк, Л.И. Чернышова, А.П. Волохова // Педиатрия. - 1998. - № 1. - С. 71-76.

32.Кравцов, А.Л. Проточно-цитофлуориметрический мониторинг за развитием азурофильной дегрануляции нейтрофилов в цельной крови человека в ответ на эндотоксин Yersinia pestis / А.Л. Кравцов, Т.П.

Гребенюкова, Т.М. Тараненко, О.С. Кузнецов // Пробл. особо опасных инфекций. – 1999. - № 79. – С. 81-89.

33.Кравцов, А.Л. Секреторная дегрануляция нейтрофилов как триггер воспаления и регулятор иммунного ответа : роль сериновых лейкоцитарных протеаз и протеолитически активируемых рецепторов / вакцинопрофилактика. - 2011. - № 1. - С. 79-87.

34.Кравцов, А.Л. Формирование внеклеточных ловушек – эффективный механизм защиты организма от патогена / А.Л. Кравцов // Пробл.

особо опасных инфекций. – 2012. - Вып. 112. - С. 69-74.

35.Луговская, С.А. Иммунофенотипирование в диагностике гемобластозов / С.А. Луговская, М.Е. Почтарь, Н.Н. Тупицын. – Москва ; Тверь : Триада, 2005. – 168 с.

36.Мазуров, Д.В. Оценка внутриклеточного килинга стафилококка фагоцитами периферической крови с помощью проточной цитометрии / Д.В. Мазуров, С.В. Дамбаева, Б.В. Пинегин // Иммунология. – 2000. С. 57-59.

иммунодиагностике / Д.В. Мазуров, С.В. Дамбаева, С.В. Климова [и др.] // Мед. иммунология. – 2002. - Т. 4, № 4-5. – С. 507-514.

38.Махрова, Т.В. Факторы и условия, влияющие на фагоцитарную адгезивную активность Candida albicans в системах с букальными эпителиоцитами : дис. … канд. мед. наук / Т.В. Махрова. – Нижний Новгород, 2004. – 132 с.

39.Маянский, А.Н. Способ оценки функциональной активности нейтрофилов человека по реакции восстановления нитросинего тетрозолия : метод. рекомендации / А.Н. Маянский, М.К. Виксман. – Казань, 1979. – 11 с.

40.Маянский, А.Н. Реактивность нейтрофила / А.Н. Маянский, А.Н.

Галиуллин. – Казань : Изд-во Казан, ун-та, 1984. - 158 с.

41.Маянский, А.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге / А.Н. Маянский, Д.Н. Маянский. – Новосибирск : Наука, 1989. - 254 с.

42.Маянский, А.Н. Апоптоз: начало будущего / А.Н. Маянский, Н.А.

Маянский, М.А. Абаджидия [и др.] // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1997. - № 2. - С. 88 -94.

43.Маянский, А.Н. НАДФН оксидаза нейтрофилов: активация и регуляция / А.Н. Маянский // Цитокины и воспаление. - 2007. - Т. 6, № 3. - С. 3-13.

44.Меньщикова, Е.Б. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты / В.З. Ланкин, Н.К. Зенков, И.А. Бондарь, Н.Ф.

Круговых, В.А. Труфакин – Москва : Слово, 2006. - 556 с.

45.Нестеров, И.М. Иммунокорригирующая терапия инфекционновоспалительных заболеваний женской половой сферы / И.М.Нестеров, А.А.Тотолян ; под ред. Э.К. Айламазяна. – Санкт- Петербург, 2007. - 46.Нестерова, И.В. Современные представления о роли системы нейтрофильных грагулоцитов / И.В. Нестерова, Н.В. Колесникова // Russ. J. Immunol. – 1999. – Vol. 4, № 1. – Р. 22-28. – Тезисы 11 съезда иммунологов России.

47.Нестерова, И.В. Иммуномодулирующая терапия Вифероном в коррекции нарушений мембранного потенциала нейтрофильных гранулоцитов при осложненной язвенной болезни двенадцатиперстной кишки / И.В. Нестерова, В.А. Роменская, Н.П. Капранова [и др.] // Цитокины и воспаление. – 2005. – Т. 4, № 1. – С. 47-51.

48.Новицкий, В.В. Гемопоэз, гормоны, эволюция / В.В. Новицкий, Ю.А.

Козлов, В.С. Лаврова [и др.]. - Новосибирск : Наука, 1997. - 432 с 49.Олиферук, Н.С. Нормативные параметры фагоцитарной системы человека, определенные с помощью проточной цитофлуориметрии :

пособие для врачей клинической лабораторной диагностики / Н.С.

Олиферук, С.С. Аршинова, А.И. Мартынов, Б.В. Пинегин - Москва, 2008. - 44 с.

50.Оценка функциональной активности фагоцитарной системы человека в норме и при патологии : пособие для врачей клинич. лаб. диагностики.

– Москва, 2008 – 56 с.

51.Пат. № 2384844 Рос. Федерации Способ обнаружения нейтрофильных ловушек / И.И. Долгушин, Ю.С. Андреева (Российская Федерация). заявл. 01.04.2008; опубл. 20.03.2010, Бюл. № 8. – 7 с.

52.Пат. № 2463349 Способ обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек в мукозальных секретах / И.И. Долгушин, Ю.С. Андреева, А.Ю. Савочкина (Российская Федерация). - заявл. 26.01.2009; опубл.

10.10.2012, Бюл. № 28. – 6 с.

53.Перова, М.Д. открытие нейтрофильных внеклеточных ловушек – новый этап в изучении морфогенеза и функций нейтрофилов / М.Д.

Перова, М.Г. Шубич // Морфология.. - 2011. - Т. 139, № 3. - С. 89-96.

54.Пигаревский, В.Е. О секреторной активности полиморфноядерных лейкоцитов / В.Е. Пигаревский // Арх. патологии. - 1982. - Т. 44, № 5. С. 3-12.

55.Пинегин, Б.В. Нейтрофилы: структура и функция / Б.В. Пинегин, А.Н.

Маянский // Иммунология. - 2007. - Т. 28, № 6. - С. 374-382.

56.Плужников, М.С. Иммунология хронического тонзиллита / М.С.

Плужников, Г.В. Лавренова. – Санкт-Петербург : Диалог, 2004. – 59 с.

57.Полетаев, А.И. Проточная цитометрия и сортировка в цитологии, молекулярной биологии, биотехнологии и медицине / А.И. Полетаев. – Москва, 1989. – Т. 12. – 88 с. - Серия «Общие проблемы физикохимической биологии».

58.Ройт, А. Иммунология : пер. с англ. / А. Ройт, Дж. Бростофф, Д. Мейл.

–Москва : Мир, 2000. – 581 с.

59.Рыжкова, А.И. Влияние микробных и немикробных факторов на формирование внеклеточных ловушек нейтрофилами периферической крови : дис. … канд. мед. наук / А.И. Рыжкова. – Челябинск, 2010. – 143 с.

60.Савочкина, А.Ю. Иммунологические показатели в диагностике хронического цервицита и при его сочетании с хроническим эндометритом : дис. … канд. мед. наук / А.Ю. Савочкина. – Челябинск, 2006. – 148 с.

61.Савочкина, А.Ю. Нейтрофильные внеклеточные ловушки : механизмы образования, методы обнаружения, биологическая роль: автореф. дис.

… д-ра мед. наук / А.Ю. Савочкина. – Челябинск, 2012. – 42 с.

62.Савочкина, А.Ю. Нейтрофильные внеклеточные ловушки: механизмы образования, методы обнаружения, биологическая роль : дис. … д-ра мед. наук / А.Ю. Савочкина. – Челябинск, 2012. - 221 с.

63.Семенов, Б.Ф. Концепция создания быстрой иммунологической защиты от патогенов / Б.Ф. Семенов, В.В. Зверев // Журн.

микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2007. - № 4. – С.

93-100.

64.Смирнова, Т.Г. Влияние женских половых стероидных гормонов на механизм внутри- и внеклеточной бактерицидности фагоцитирующих клеток : автореф. дис. … канд. биол. наук / Т.Г. Смирнова. – Челябинск, 2013. – 22 с.

65.Стасенко, А.А. Особенности функциональной активности нейтрофилов крови и желчи у больных гнойным холангитом / А.А Стасенко, В.П.

Чернышов // Клин. лаб. диагн. - 1997. - № 12. - С. 22-33.

66.Телешева, Л.Ф. Иммунологические факторы секретов репродуктивного тракта женщин : дис. … д-ра мед. наук / Л.Ф. Телешева. – Челябинск, 2000. - 324 с.

67.Телешева, Л.Ф. Иммунологические факторы секретов репродуктивного тракта женщин : автореф. дис. … д-ра мед. наук / Л.Ф. Телешева. Челябинск, 2000. – 41 с.

68.Теплова, С.Н. Новые технологии исследования фагоцитирующих клеток / С.Н. Теплова, Е.А. Чухарева, Л.И. Крюкова [и др.] // Новые технологии в медицине : труды науч. конф. - Трехгорный, 1996. - С. 84Теплова, С.Н. Секреторный иммунитет / С.Н. Теплова, Д.А. Алексеев. Челябинск, 2002. – 200 с.

70.Тотолян, А.А. Клетки иммунной системы / А.А. Тотолян, И.С.

Фрейдлин. – Москва : Наука, 2000. – 231 с.

71.Тотолян А.А. Молекулярно-генетические технологии в диагностике социально значимых заболеваний / А.А. Тотолян, А.Б. Чухловин, Н.А.

Яицкий // Мед. академический журн. - 2006. - Т. 6, № 1. - С. 39-46.

72.Третьякова, И.Е. Регуляторная функция нейтрофилов в норме и в условиях механической травмы : дис. … канд. мед. наук / И.Е.

Третьякова. - Челябинск, 1991. – 147 с.

73.Федотова, Г.Г. Морфофункциональное исследование нейтрофилов в условиях эндотоксикоза : автореф. дис. … д-ра биол. наук / Г.Г.

Федотова. - Саранск, 2007. – 39 с.

74.Фрейдлин, И.С. Система мононуклеарных фагоцитов / И.С. Фрейдлин.

– Москва : Медицина, 1984. – 271 с.

75.Фрейдлин, И.С. Иммунная система и ее дефекты: руководство для врачей / И.С.Фрейдлин. – Санкт-Петербург : Полисан, 1998. – 113 с.

76.Хаитов, P.M. Современные подходы к оценке основных этапов фагоцитарного процесса / Р.М. Хаитов, Б.В. Пинегин // Иммунология. С. 3-8.

77.Хайдуков, С.В. Проточная цитометрия как современный метод анализа в биологии и медицине / С.В. Хайдуков, А.В. Зурочка // Мед.

иммунология. – 2007. - Т. 9, № 4-5. – С. 373-378.

78.Хайдуков, С.В. Вопросы современной проточной цитометрии.

Клиническое применение / С.В. Хайдуков, А.В. Зурочка. - Челябинск, 2008. – 195 с.

79.Чередеев, А.Н. Развитие патогенетического принципа оценки иммунной системы человека / А.Н. Чередеев, Л.В. Ковальчук // Журн.

микробиологии. – 1997. - № 6. – С. 89-92.

80.Чертков, И.Л. Клеточные основы кроветворения / И.Л. Чертков, А.Я.

Фриденштейн. - Москва, 1977. – 272 с.

81.Ширшев, С.В. Механизмы иммунноэндокринного контроля процессов репродукции / С.В. Ширшев. – Екатеринбург : УрО РАН, 2002. - Т. 2. – 557 с.

82.Шиффман, Ф.Дж. Патофизиология крови / Ф.Дж. Шиффман. – СанктПетербург : Невский диалект, 2000. – 448 с.

83.Шишкова, Ю.С. Влияние перпарата «Пирогенал» на образование нейтрофильных внеклеточных ловушек / Ю.С. Шишкова, А.Ю.

Савочкина, А.И. Рыжкова, Е.А. Мезенцева // Мед. наука и образование Урала. - 2009. - Т. 10. № 3. - С. 23-24.

84.Шишкова, Ю.С. Роль нейтрофилов в формировании колонизационной резистентности слизистых оболочек : дис. … д-ра мед. наук / Ю.С.

Шишкова. – Челябинск, 2010. – 265 с.

85.Шмагель, К.В. Клетки врожденного иммунитета / К.В. Шмагель, В.А.

Черешнев. - Пермь, 2011. – 241 с.

проточноцитометрического анализа крови / Д.А. Шмаров, Г.И.

Козинец. – Москва : МИА, 2004. – 128 с.

87.Ярилин, А.А. Апоптоз и его место в иммунных процессах / А.А.

Ярилин // Иммунология. - 1996. - № 6. - С. 10-23.

88.Ярилин, А.А. Симбиотические взаимоотношения клеток иммунной системы / А.А. Ярилин // Иммунология. - 2001. - № 4. - С. 16-20.

89.Abramson, J.S. The natural immune system : the neutrophil / J.S. Abramson, J.G. Wheeler. - Oxford, 1993. – Р. 109-137.

90.Anderson, D.P. Neutrophil, glass-adherent, nitroblue tetrazolium assay gives early indication of immunization effectiveness in rainbow trout / D.P.

Anderson, T. Moritomo, R. de Grooth // Vet. Immunol. Immunopathol. Vol. 30, № 4. - P. 419-429.

91.Arends, M.J. Apoptosis: Mechanisms and roles in patology / M.J. Arends, A.H. Wyllie // Int. Arch. Patol. - 1992. - Vol. 32. - P. 223-226.

92.Bainton, D.F. Morphology of neutrophils, eosinophils and basophils / D.F.

Bainton // Williams Hematology. - 5th ed. - 1995. - P. 753-765.

93.Baker, V.S. Cytokine-associated neutrophil extracellular traps and antinuclear antibodies in Plasmodium falciparum infected children under six years of age / V.S. Baker, G.E. Imade, N.B. Molta [et al.] // Malar. J. – 2008.

94.Banker, D.E. Measurement of spontaneous and therapeutic agent-induced apoptosis with BCL-2 protein expression in acute myeloid leukemia / D.E.

Banker, M. Groudine, T. Norwood [et al.] // Blood. – 1997. – Vol. 89, № 1.

– P. 243-255.

95.Bao, Y. Revisiting the protective and pathogenic roles of neutrophils: Ly-6G is key! / Y. Bao, X. Cao // Eur. J. Immunol. - 2011. – Vol. 41. – P. 2535– 2538.

96.Beiter, K. An endonuclease allows Streptococcus pneumoniae to escape from neutrophil extracellular traps / K. Beiter, F. Wartha, B. Albiger [et al.] // Curr. Biol. - 2006. - Vol. 16. - P. 401-407.

97.Bellingan, G. Inflammatory cell activation in sepsis / G. Bellingan // Br.

Med Bull. - 1999. – Vol. 55. – P. 18-23.

98.Beyrau, M. Neutrophil heterogeneity in health and disease: a revitalized avenue in inflammation and immunity / M. Beyrau, J.V. Bodkin, S.

Nourshargh // Open Biol. – 2012. – Vol. 2, № 11. – P. 120-134.

99.Bianchi, M. Restoration of NET formation by gene therapy in CGD controls aspergillosis / M. Bianchi, A. Hakkim, V. Brinkmann [et al.] // Blood. – 2009. – Р. 2619-2622.

100. Bianchi, M. Restoration of NET formation by gene therapy in CGD controls aspergillosis / M. Bianchi, A. Hakkim, V. Brinkmann [et al.] // Blood. - 2009. - Vol. 114, № 13. - P. 2619-2622.

101. Bogomolski-Yahalom V. Disorders of neutrophil function / V.

Bogomolski-Yahalom, Y. Matzner // Blood Rev. - 1995. - Vol. 9, № 3. - P.

183-190.

102. Bohnsack, J.F. Human neutrophil adherence to laminin in vitro.

Evidence for a distinct neutrophil integrin receptor for laminin / J.F.

Bohnsack, S.K. Akiyama, C.H. Damsky [et al.] // J. Exp. Med. – 1990. – Vol. 171. – P. 1221–1237.

polymorphonuclear leukocyte / N. Borregaard, J. Cowland // Blood. - 1997.

- Vol. 89, № 10. - P. 3503-3521.

104. Bossuyt, X. Comparative analysis of whole blood lysis methods for flow cytometry / X. Bossuyt, G.E. Marti, T.A. Fleisher // Cytometry. – 1997.

– Vol. 30. – P. 124-133.

105. Botha, A.J. Postinjury neutrophil priming and activation: an early vulnerable window / A.J. Botha, F.A. Moore, E.E. Moore [et al.] // Surgery.

– 1995. – Vol. 118, № 2. – P. 358-364.

106. Brinkmann, V. Neutrophil extracelllulartraps kill bacteria / V.

Brinkmann, U. Rechard, C. Goosmann [et al.] // Science. - 2004. - Vol. 303.

- P. 1532-1535.

107. Brinkmann, V. Beneficial suicide: why neutrophils die to, make NETs / V. Brinkmann, A. Zychlinsky // Nature Rev. - 2007. - Vol. 5. - P. 577-582.

108. Buchanan, J.T. Dnase expression allows the pathogen group A Streptococcus to escape killing in neutrophil extracellular traps / J.T.

Buchanan, A.J. Simpson, R.K. Aziz [et al.] // Curr. Biol. – 2006. – Р. 396Byrd, A.S. An extracellular matrix-based mechanism of rapid neutrophil extracellular trap formation in response to Candida albicans / A.S. Byrd, X.M. O'Brien, C.M. Johnson [et al.] // J. Immunol. – 2013. – Vol. 190, № 8. – P. 4136-4148.

110. Chello, M. Complement and neutrophil activation during cardiopulmonary bypass: a randomized comparison of hypothermic and normothermic circulation / M. Chello, P. Mastroroberto, R. Romano [et al.] // Eur. J. Cardiothorac. Surg. - 1997. - Vol. 11, № 1. - P. 162-168.

111. Ciocca, D.R. Estrogen receptors in human nontarget tissues:

biological and clinical implications / D.R. Ciocca, L.M. Roig // Endocr Rev.

– 1995. – Vol. 16. – P. 35-62.

112. Clark, S.R. Platelet TLR4 activates neutrophil extracellular traps to ensnare bacteria in septic blood / S.R. Clark, A.C. Ma, S.A. Tavener [et al.] // Nature Medicine. – 2007. – Vol. 13, № 4. – P. 463-469.

113. Claude, L. Enumeration of peripheral lymphocytes subsets using 6 vs.

4 color staining: a clinical evaluation of a new flowcytometer / L. Claude, L.

Lobagiu, C. Genin // Cytometry Part B. - 2005. - Vol. 130, № 3. - P. 388Cohen, M.S. Fagocytes, 02 reduction and hydroxyl radical / M.S.

Cohen, B.E. Britigan, D.J. Hasselt [et al.] // Rev. Infect. Dis. - 1988. - Vol.

10. - P. 1088.

115. Cole, A.M. Inhibition of neutrophil elastase prevents cathelicidin activation and impairs clearance of bacteria from wounds / A.M. Cole, J.

Shi, A. Ceccarelli [et al.] // Blood. – 2001. – Vol. 97, № 1. – P. 297–304.

Condensate // Cytometry. – 2006. – Vol. 69, Iss. 3. – P. 169-172.

116.

117. Corver, W.E. Software compensation improves the analysis of heterogeneous tumor samples stained for multiparameter DNA flow cytometry / W.E. Corver, G.J. Fleuren, C.J.Cornelisse // J Immunol Methods. – 2002. – Р. 97-107.

118. Darzynkiewicz, Z. Assays of cell viability: discrimination of cells dying by apoptosis / Z. Darzynkiewicz, X. Li, J. Gong // Methods Cell Biol.

– 1994. – Vol. 41. – P. 15–38.

119. Di Nicola, M. Quantization of CD34+ peripheral blood hematopoietic progenitors for autografting in cancer patients / M. Di Nicola, S. Siena, M.

Bregni [et al.] // Int. J. Artif. Organs. – 1993. – Vol. 5. – P. 8082. - Suppl.

120. Ding, Z.M. Relative contribution of LFA-1 and Mac-1 to neutrophil adhesion and migration / Z.M. Ding, J.E. Babensee, S.I. Simon [et al.] // J.

Immunol. – 1999. – Vol 163. – P. 5029–5038.

121. Eeden, S.F. The use of flow cytometry to measure neutrophil function / S.F. Eeden, M.E. Klut, B.A. Walker [et al.] // J. of Immun. Meth. – 1999. Vol. 232. - P. 23-43.

122. Eggers, C.T. The periplasmic serine protease inhibitor ecotin protects bacteria against neutrophil elastase / C.T. Eggers, I.A. Murray, V.A. Delmar [et al.] // Biochem. J. – 2004. – Vol. 379, Pt.1. – P. 107–118.

123. Ermert, D. Mouse neutrophil extracellular traps in microbial infections / D. Ermert, C.F. Urban, B. Laube [et al.] // J. Innate Immun. - 2009. - № 1. P. l81-193.

124. Fadeel, B. Involvement of caspases in neutrophil apoptosis: regulation by reactive oxygen species / B. Fadeel, A. Ahlin, J.I. Henter [et al. ]// Blood.

- 1998. - Vol. 92. - P. 4808-4818.

125. Fadeel, B. Babies born without safety NET / B. Fadeel // Blood. Vol. 13. - P. 6270-6271.

126. Fang, F.C. Antimicrobial reactive oxygen and nitrogen species:

concepts and controversies / F.C. Fang // Nat. Rev. Microbiol. - 2004. - Vol.

2, № 10. - P. 820-832.

127. Fuchs, T. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps / T. Fuchs, U. Abed, C. Goosmann [et al.] // J. of Cell Biology. – 2007. - Vol. 176, № 2. – P. 231-241.

128. Fuchs, T.A. Extracellular DNA traps promote trombosis / T.A. Fuchs, A. Brill, D. Duerschmied, D. Schatzberg, M. Monestier, D.D. Myers Jr, S.K.

Wrobleski, T.W. Wakefield, J.H. Hartwig, D.D. Wagner // Proc. Natl Acad.

Sci. USA. – 2010. – Vol. 107, № 36. – P. 15880-15885.

129. Guimaraes-Costa, A.B. Leishmania amazonensis promastigotes induce and are killed by neutrophil extracellular traps / A.B. GuimaraesCosta, M.T. Nascimento, G.S. Froment, R.P. Soares, F.N. Morgado, F.

Conceio-Silva, E.M. Saraiva // Proc. Natl Acad. Sci. USA. – 2009. – Р.

6748-6753.

130. Hakkim, A. Impairment of neutrophil extracellular trap degradation is associated with lupus nephritis / A. Hakkim, B.G. Furnrohr, K. Amann, B.

Laube, U.A. Abed, V. Brinkmann, M. Herrmann, R.E. Voll, A. Zychlinsky // Proc. Natl Acad. Sci. USA. – 2010. – Р. 9813-9818.

131. Hamaguchi, S. Identification of neutrophil extracellular traps in the blood of patients with systemic inflammatory response syndrome / S.

Hamaguchi, T. Hirose, Y. Akeda [et al.] 41, № 1. – P. 162-168.

132. Hampton, M.B. Oxidant-mediated phosphatidylserine exposure and macrophage uptake of activated neutrophils: possible impairment in chronic granulomatous disease / M.B. Hampton, M.C. Vissers, J.I. Keenan [et al.] // J. Leukoc. Biol. – 2002 – Vol. 71, № 5. – P. 775-781.

Handbook of fluorescent probes and research chemicals. – 6-th ed. / 133.

ed. by R.P. Haugland. – London, 1996.

134. Hickey, M.J. Intravascular immunity: the hostpathogen encounter in blood vessels / M.J. Hickey, P. Kubes // Nature Rev. Immunology. – 2009. – Р. 364-375.

135. Hirche, T.O. Netrophil elastase mediates innate host protection against Pseudomonas aeruginosa / T.O. Hirche, R. Benabid, G. Delslee [et al.] // J.

Immunology. – 2008. – Vol. 181. – P. 4945–4954.

136. Hoffmann, J.A. Phylogenetic perspectives in innate immunity / J.A.

Hoffmann, F.C. Kafatos, C.A. Janeway [et al.] // Science. - 1999. - Vol.

284. - P. 1313-1318.

137. Hoffmann, J.A. The immune response of Drosophila / J.A. Hoffmann // Nature. - 2003. - Vol. 426. - P. 33-38.

138. Hong, W. Survival bacterial biofilms within neutrophil extracellular traps promotes nontypeable Haemophilus influenzae persistence in the chinchilla model otitis media / W. Hong, R.A. Juneau, B. Pang [et al.] // J.

Innate Immun. – 2009. – Р. 215-224.

139. Itoh, N. The polypeptide encoded by the cDNA for human cell surface antigen Fas can mediate apoptosis / N. Itoh, S. Yonehara, A. Ishii [et al.] // Cell. – 1991. – Vol. 66. – P. 233-243.

140. Jaber, B.L. Modulation of neutrophil apoptosis by uremic plasma during hemodialysis / B.L. Jaber, V.S. Balakrishnan, M.N. Cendoroglo [et al.] // Blood Purif. - 1998. - Vol. 16, № 6. - P. 325-335.

141. Jann, N.J. Neutrophil antimicrobial defense against Staphylococcus aureus is mediated by phagolysosomal but not extracellular trap-associated cathelicidin / N.J. Jann, M. Schmaler, S.A. Kristian, K.A. Radek, R.L.

Gallo, V. Nizet, A. Peschel, R. Landmann // J. Leukoc Biol. – 2009. – Vol.

86, № 5. – P. 1159-1169.

142. Johansson, A. Different subcellular localization of cytochrome band the dormant NADPH-oxidase in neutrophils and macrophages: effect on the production of reactive oxygen during phagocytosis / A. Johansson, A.J.

Jesaitis, H. Lundqvist [et al.] // Cellular Immunol. – 1995. – Vol. 161, № 1.

– P. 61-71.

143. Kabelitz, D. Rapid modulation of T lymphocyte surface antigens induced by Fas (CD95, APO-1) ligation / D. Kabelitz, S. Marx, M.J.

Robertson [et al.] // Cell. Immunol. – 1996. – Vol. 1, № 173. – P. 108-115.

144. Kanthack, A. The morphology and distribution of the wandering cells of mammalian / A. Kanthack, W.B. Hardy // J. Physiol. - 1995. - Vol. 17, № 80. - P. l-119.

145. Kerr, J. Schrinkage necrosis: A distinct mode of cellular death/ J. Kerr // J. Pathol. - 1971. - Vol. 105. - P. 13-18.

146. Klas, C. Activation interferes with the APO-1 pathway in mature human T cells / C. Klas, K.M. Debatin, R.R. Jonker [et al.] // Int Immunol.

– 1993. – Vol. 5. – P. 625–630.

147. Lauth, X. M1 protein allows group A streptococcal survival in phagocyte extracellular traps through cathelicidin inhibition / X. Lauth, M.

Zinkernagel, B. Beall, P. Ghosh, R.L. Gallo, V. Nizet // J. Innate Immun. – 2009. – Vol. 3. – Р. 202-214.

148. Lee, W.L. The tangled webs that neutrophils weave / W.L. Lee, S.

Grinstain // Science. – 2004. – Vol. 303. – P. 1477–1478.

Lgters, T. The clinical value of neutrophil extracellular traps / T.

149.

Lgters, S. Margraf, J. Altrichter [et al.] // Med Microbiol Immunol. – 2009. – Vol. 198. – P. 211-219.