Микроскоп состоит из следующих основных узлов: электронной пушки 1...3, эмитирующей электроны; электронно-оптической системы 4...10, формирующей электронный зонд и обеспечивающей его сканирование на поверхности образца 12; системы, формирующей изображение 11,13..15.

РЭМ имеет вакуумную камеру, которая необходима для создания разряжения (~10-3 Па) в рабочем объеме электронной пушки и электронно-оптической системы. Составными частями микроскопа являются механические узлы (гониометрический стол и т.д.), обеспечивающие установку и перемещение образца.

Рис. 3. Схема электронного микроскопа: 1- катод, 2 – модулятор, 3 – анод, – ограничивающая диафрагма, 5 – первая конденсаторная линза, 6 – вторая конденсаторная линза, 7 –катушка двойного отклонения, 8 – стигматор, 9 – конечная линза, 10 – диафрагма, ограничивающая размер пучка, 11 – генераторы развертки, 12 – образец, 13 – детектор вторичных электронов, 14 – усилитель фотоумножителя, 15 – электронно-лучевая трубка (Гоулдстейн и др., 1984).

Сканирование образца осуществляется с помощью двух отклоняющих катушек, каждая из которых служит для отклонения соответственно в Х- и Yнаправлениях. Пучок перемещается через последовательные положения, зондируя поверхность образца в контролируемой последовательности точек (Гоулдстейн, 1981). В результате взаимодействия пучка с исследуемым образцом возникает вторичная электронная эмиссия, несущая информацию о морфологии изучаемой поверхности (Мельник, 1981). Измеряя величину этих сигналов с помощью соответствующего детектора, можно определить локальную топографию исследуемого образца (рис. 4).

Область сканирования на образце Рис. 4. Принцип отображения информации при сканировании по площади или по изображению, устанавливает соответствие между набором положение на образце и на ЭЛТ.

В результате синхронного сканирования по образцу и электронно – лучевой трубке микроскопа (ЭЛТ) создается однозначное соответствие между последовательностью точек в «пространстве объекта» и на экране ЭЛТ или в пространстве изображения. Для отображения информации о взаимодействии электронов с объектом используется яркостная модуляция, т.е. интенсивность сигнала с выхода детектора S, используемая для управления яркостного пятна на экране ЭЛТ (Гоулдстейн, 1981).

Таким образом, растровый электронный микроскоп производит прямое отображение точек пространства микрообъекта в точки пространства ЭЛТ, повторяя точную форму объекта за счет синхронности разверстки. Линейное увеличение на изображении РЭМ определяется отношением длины разверстки ЭЛТ – L к длине отрезка l в пространстве объекта: M= L/l. Так как длина разверстки L на экране ЭЛТ фиксированная величина (например, для использованного в данной работе микроскопа Philips SEM 505M длина разверстки равна 10 см), то возрастание увеличения достигается за счет уменьшения длины сторон площадки, по которой происходит сканирование на образце. Расчет области сканирования на образце в зависимости от увеличения приведен в таблице 1 при размерах ЭЛТ 10 х 10 см.

Таблица 1. Зависимость области сканирования на образце от увеличения.

Для проведения аналогии с классической связкой проектирующих лучей аэрофотокамеры, производится замена последовательного отображения одновременным отображением с помощью ряда элементарных пучков (рис.

5). Изображение, создаваемое осями пучков, подобно исходному, синхронно выдерживается постоянство скорости разверстки и одинаковое число строк на обоих растрах.

При съемке в микроскопии оптимальное положение центра проекции в пространстве предметов совпадает с центром входного зрачка S оптической системы формирующей изображение (Финковский, Мельник 1978).

Отображающий электронный пучок в растровом микроскопе, в отличие от оптического микроскопа, не расходящийся, а почти параллельный. При небольших увеличениях линии сканирования соизмеримы с проекционным расстоянием и конусность отображающей лучевой связки значительна. Если увеличение больше 1000х отклонение периферийных лучей весьма незначительное и происходит почти параллельное проектирование. С ростом увеличения центр проекции удаляется к бесконечности, и отображение осуществляется из несобственного центра S.

Рис. 5. Упрощенная схема процесса отображения в РЭМ в виде ряда элементарных пучков.

Из литературных источников известно, что формируемое РЭМизображение – перспективно-аффинное, а стереомодель формируется последовательно из множества центров проекции, соответствующих отображаемому множеству точек (Мельник и др., 1987). Этой точки зрения придерживается большинство исследователей, однако в работах (Соколов, 1996; Stampfl и др., 1996; Hemmleb, 2002) было отмечено, что при малых увеличениях (до 500 раз) РЭМ-изображение необходимо рассматривать как центральную проекцию с виртуальным центром. В то же время в работе (Калантаров, Сагандыкова, 1983) рассматривается предположение о невозможности получения параллельной проекции при очень больших увеличениях. Таким образом, среди исследователей до сих пор нет единого мнения о виде проекции и априорном математическом описании процесса формирования изображения в РЭМ.

Необходимо отметить, что при фотографировании с использованием РЭМ точка объекта, перспективный центр и соответствующая точка изображения лежат на одной линии. Это условие известно как условие коллинеарности, при котором множество точек исходного пространства объекта однозначно обратимо множеству точек изображения. Полученные соответствии, при котором одноименные лучи, пересекаясь, воссоздают существование перспективного центра отображения и фокусного расстояния камеры микроскопа. В работе (Трубиной, 2002) фокусное расстояние при = 1 = 2, где - угол наклона образца, вычисляется по следующий формуле:

где V – увеличение, D – расстояние между объектом и плоскостью изображения.

В работе (Финковского, 1977) фокусное расстояние рассчитывается по формуле:

где М – увеличение, D – расстояние до предмета.

параметрами для расчета пространственных координат.

Формулы расчета пространственных координат для РЭМ-стереопар по классической фотограмметрии (с использованием условия коллинеарности для описания геометрии РЭМ-изображений):

где Ni,j – скаляры, I,j – соответственно положительный и отрицательный наклон гониометрического устройства, Xs,Ys, Zs – координаты центра проектирования.

Не менее важным этапом в построении цифровой матрицы рельефа является этап калибровки и учета деформаций снимков, полученных с помощью РЭМ. При получении РЭМ–изображения предполагается, что точки объекта отображаются прямыми лучами, проходящими через центр проекции. Однако, это предполагаемое условие не всегда соответствует действительности. Результаты измерений, выполняемые на РЭМизображениях, могут быть искаженными, поскольку процесс захвата изображения обусловлен взаимодействием большого числа различных факторов. При этом одни искажения носят систематический характер, другие – случайный. Теория калибровки аэрофотоснимков, применяемая в классической фотограмметрии, не обеспечивает выявление и коррекцию всех возникающих искажений рассмотрены в работах (Maune,1976; Соколов, и др., 1996; Hemmleb, 1997; Wes Bethela, 2001 и др.) электронной микроскопии являются: нестрогость математической модели процесса формирования изображения; дисторсионные искажения, обусловленные несовершенным процессом сканирования, неточностями юстировки отклоняющихся катушек, оптической дисторсией фотоприставки;

ошибки угловых параметров стереосъемки (вследствие гистерезиса механических движений объектного столика); случайные ошибки, изменяющиеся от снимка к снимку и зависящие от точности измерения и отождествления одноименных точек на снимках стереопары, случайных ошибок определения параметров съемки, наличие шума, который может повлиять на всех участках прохождения видеосигнала от образца к ЭЛТ и т.п. Калибровка РЭМ производится с помощью тест-объектов с известными линейными размерами (дифракционная решетка, сетка с известной ценой деления и др.). Сравнение координат точек пересечения с координатами соответствующих точек изображения позволяет найти величины дисторсионных искажений. В работе (Финковский, Мельник, 1977) используется высокоточная тестовая сетка, изготовленная на слое алюминия, нанесенном на стеклянную основу путем испарения в вакууме.

Для того чтобы оценить искажения по высоте, необходима проверка системы с использованием объемных тест-объектов. Трехмерная реконструкция нескольких таких образцов на разных увеличениях и сравнение полученной 3-D модели с истинной высотой объекта помогает построить корректную фотограмметрическую модель растрового электронного микроскопа. Однако изготовление такого тестового объекта для калибровки РЭМ – снимков задача сама по себе очень трудоемкая. В работе (Sinram, и др., 1999) для калибровки микроскопа применяется специально изготовленная пирамида с ассиметрично распределенными по ее поверхности наномаркерами (рис. 6).

Рис. 6. РЭМ-изображение пирамиды калибровки (6м х 3м), с нанесенными 38 контрольными пунктами.

Часто для корректуры модели используются латексы небольшого диаметра. Сравнение истинных диаметров латексов D с диаметрами Dx, Dy, Dz, определенными из фотограмметрических построений в трех координатных плоскостях, выступают свободными членами в уравнениях поправок. В результате решения уравнений, уточняются элементы углового внешнего ориентирования модели, ее масштаб и коэффициенты деформации по оси Z, и вновь вычисляются пространственные координаты (Трубина, 2002).

В работах (Калантаров, Сагандыкова, 1983; Калантаров, 1986) для исправления искажений, возникающих в ходе формировании ЦМР микрообъекта, при обработке неметрических снимков использовались алгоритмы проективных преобразований.

Таким образом, проведенные исследования показали значимость и перспективность использования фотограмметрических методов в микроскопии, которые позволяют восстанавливать пространственный образ (стереомодель) микрообъекта по РЭМ-стереопаре, не искажая его реальной структуры.

ГЛАВА 2. ПРОЕКТИРОВАНИЕ ИНФОРМАЦИОННОЙ

СИСТЕМЫ ФОТОГРАММЕТРИЧЕСКОГО

МОДЕЛИРОВАНИЯ МИКРООБЪЕКТОВ ДЛЯ

БИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ. НАБОР МЕТОДОВ

ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПАРАМЕТРОВ ДЛЯ

ФОТОГРАММЕТРИЧЕСКОЙ ОБРАБОТКИ РЭМСТЕРЕОПАРЫ.

приготовленных проб (глава 1) показал отсутствие комплексного решения при работе с первичным биологическим материалом. Была предложена модель информационной системы фотограмметрического моделирования микрообъектов, предназначенная для получения, анализа и хранения цифровых трехмерных моделей биологических микрообъектов. Данная модель была создана с учетом всех требований, перечисленных в первой главе.

1. Модель должна обеспечивать возможность получения, хранения и анализа микрообъектов. На рисунке 7 приведена модель информационных процессов системы фотограмметрического моделирования микрообъектов. Структурно процесс работы по созданию и анализу цифровой трехмерной модели микрообъекта был разделен на два этапа. Первый этап заключался в микрообъекта: подготовка препарата; исследование препарата на РЭМ;

получение РЭМ - стереопары объекта исследования; определение входных фотограмметрическая обработка стереопары и получения 3-D модели микрообъекта. Второй этап связан с визуализацией 3-D модели и ее анализом. Для первого этапа был разработан и унифицирован ряд методов, информации БД снимков I этап информация о форме, рельефе поверхности ACSII и пространственных параметрах биологического микрообъекта Рис. 7. Модель информационных процессов системы фотограмметрического моделирования микрообъектов.

обеспечивающих адаптацию фотограмметрических методов классической аэрофотосъемки к созданию цифровой 3-D модели микрообъекта по стереопаре полученной на растровом электронном микроскопе (п. 2.2., 2. Глава 2).

микрообъектов, поскольку биологические образцы очень чувствительны к тактильной обработке. Фотограмметрические методы, положенные в основу построения модели микрообъекта, обеспечивают неразрушающую реконструкцию биологического образца. В данной работе для сохранения тканевой структуры микрообъекта максимально соответствующей исходному состоянию, промежуток времени, затрачиваемый на получение цифровой трехмерной модели, был минимальным. Образцы биологического материала фиксировались с помощью стандартных методик (п. 2.2.1 Глава 2).

3. Информационная система должна быть ориентирована на пользователя, не имеющего навыков работы в области информационных технологий. Как фотограмметрические системы позволяют моделировать практически все процессы, выполняемые в классической фотограмметрии. Это значительно расширило сферы их применения во многих областях: археологии, строительстве, биологии, медицине, и дало возможность пространственно (Кадничанский, Хмелевский, 1999). Системы стали обладать понятным и специального образования.

На этапе проектирования информационной системы был проведен анализ наиболее известных ЦФС и принято решение использовать систему ZSpace 1.2, в которой реализованы основные стадии получения цифровой матрицы рельефа земной поверхности, и данная система оказалась наиболее приемлемой по соотношению цена–качество. Поскольку параметры 3-D модели, формируемой по РЭМ-стереопаре, существенно отличаются от реализованных в Z-Space 1.2, потребовались решить ряд методических и теоретических задач обеспечивающих адаптацию фотограмметрических методов классической аэрофотосъемки к созданию цифровой 3-D модели микрообъекта по стереопаре, полученной на РЭМ.

4. Информация о трехмерной модели микрообъекта должна храниться в удобном формате данных, поддерживаемом большинством программных систем обработки и моделирования 3-D объектов. В данной работе информация о 3-D модели исследуемого микрообъекта хранится в виде стандартного текстового файла (п. 3.3. Глава 3).

5. Коллекции цифровых 3-D моделей микрообъектов должны храниться в базе данных исследователя, с возможностью их восстановления, визуализации и анализа; при необходимости должна осуществляться оперативная передача информации об объекте или его трехмерной форме другим пользователям. Хранение информационных ресурсов осуществляется с помощью базы данных РЭМ-снимков микрообъектов, базы данных проектов фотограмметрического восстановления 3-D цифровых матриц микрообъектов и базы данных исследователя, ведущего работу с биологическим материалом (п. 2.3. Глава 2, п. 3.3. Глава 3, Глава 4).

Базовым условием для построения цифровой модели микрорельефа стало определение корректных входных данных – стереопары высокого разрешения, получить которую возможно только с помощью РЭМ. Это сохраняющим тождественность масштаба и уровня контрастности на предварительной обработки сигнала.

2.2. Технология получения стереопары на растровом электронном микроскопе (с увеличением до 500х).

2.2.1. Подготовка образцов исследования Как уже было отмечено, важным условием корректного проведения количественного анализа микрообъекта является правильная подготовка образца исследования, не допускающая искажения его реальной микроструктуры.

Размеры образцов исследования определялись габаритами камеры микроскопа. Для обеспечения хорошего электрического контакта с предметным столиком и для фиксации образцов при наклоне столика, были использованы специальные токопроводящие клеи. При исследовании непроводящих ток материалов на их поверхности наносилась напылением тонкая пленка электропроводников (золото). При работе с органическими материалами, образцы были тщательно очищены, во избежание образования газообразных продуктов, затрудняющих получение требуемого вакуума и загрязняющих колонну микроскопа. Для очищения поверхности чешуи рыбы от кожного эпителия образец отмывался в 5% растворе нашатырного спирта, затем в водопроводной воде. На столик для РЭМ дополнительно приклеивалось стекло, сверху которого на специальный токопроводящий клей крепилась чешуйка.

Для образцов коловраток произведена гистологическая обработка по стандартной методике (Миронов, 1994; Сапожникова и др., 2007). Материал фиксировали в 2,5%-ном растворе глютаральдегида на 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,4) 3 часа, затем промывали тем же буфером с добавлением глюкозы и 1%-ного раствора четырехокиси осмия на фосфатном буфере. На тефлоновые фильтры с отобранным атмосферным аэрозолем специальным напылением наносилась тонкая пленка золота.

2.2.2. Условия получения информативной РЭМ-стереопары.

Электронный микроскоп Philips SEM 505M, на котором производилось сканирование микрообъектов, позволяет исследовать до девяти предметных столиков с образцами, расположенными как показано на рис. 8. В результате экспериментальных исследований предложено использовать центральный гониометрического устройства.

электронном микроскопе Philips SEM 505М (Восемь столиков расположены по кругу, девятый – центральный).

Для получения наиболее информативной стереопары при работе на РЭМ было обеспечено выполнение следующих условий:

а) тождественность увеличения на обоих изображениях;

изображений;

в) сохранение рабочего расстояния микроскопа неизменным при съемке левого и правого стереоснимков.

В отличие от снимков, полученных с помощью аэрофотосъемки местности (Приложение 1), методика получения стереопар в РЭМ заключается в съемке микрообъекта, наклоненного под разными углами по отношению к электронному зонду. Изменение угла осуществляется механическим наклоном образца с помощью гониометрического устройства микроскопа. Полученные данным образом РЭМ - изображения имеют Рис. 9. Схема расположения детекторов вторичных электронов в растровом электронном микроскопе Philips SEM 505М.

отличия, вызванные как различной освещенностью участков образца, так и некоторыми смещениями за счет наклона образца при съемке.

Два детектора вторичных электронов микроскопа расположены один напротив другого в вертикальной плоскости, под углом 27° и 20° градусов возможность смещения съемочной системы относительно поверхности образца (рис. 9). Следовательно, технология получения стереопар включает в себя изменение угла наклона предметного столика или поворот его вокруг своей оси. С некоторыми допущениями такой вид съемки можно назвать «псевдоконвергентным»1.

При исследовании образцов в РЭМ было использовано три подхода получения стереопар. Первый подход, предложенный О.В. Глуховым (устное сообщение), включал конвергентный случай съемки с равными углами. На формирующего изображение детектора вторичных электронов, равен 15°Исследуемый образец находится в центральной позиции (предметный В конвергентном случае съемки проекции направлений оптической оси камеры на горизонтальную поверхность пересекаются ( 0).

столик № 9), что обеспечивает его возвращение в исходное положение относительно детектора, во время разворота для получения левого снимка.

Рис. 10. Схема получения правого снимка стереопары (первый подход).

После разворота на 180° в плоскости предметных столиков (при фиксированном угле наклона, равном углу наклона правого снимка), вновь фотографировали образец и получали левый снимок стереопары (рис. 11).

Рис. 11. Схема получения левого снимка стереопары (первый подход).

Второй подход является реализацией классической съемки стереопары в РЭМ (Boyde, 1973;Соколов, и др. 1995) и предполагает создание правого и левого снимков, наклоненных под некоторым углом к электронному зонду.

Третий подход включает получение правого изображения без наклона предметного столика, левый снимок стереопары получается при наклоне предметного столика на угол.

В проведенном исследовании предпочтение отдано второму подходу получения стереопар, поскольку при конвергентном случае съемки выявлено, что рассчитанные ЦФС, элементы взаимного ориентирования не адекватны параметрам стереосъемки. Так, например, при съемке с углами наклона предметного столика равными прав = 17° и лев = - 17°, разница продольных углов наклона снимков, рассчитанная ЦФС на этапе взаимного ориентирования, составила всего 20°. В этом случае определено существенное занижение высот цифровой матрицы рельефа микрообъекта. Помимо этого, при первом подходе формирования стереопары возникают сложности определения центра фотографирования микрообъекта, относительно которого производился поворот. Длина