«Хромосомная изменчивость и дифференциация близких таксонов мелких млекопитающих на примере представителей родов Cricetulus, Tscherskia и Ochotona ...»

Федеральное государственное бюджетное учреждение наук

и

Биолого-почвенный институт Дальневосточного отделения

Российской академии наук

На правах рукописи

Вакурин Алексей Александрович

Хромосомная изменчивость и дифференциация близких

таксонов мелких млекопитающих на примере представителей

родов Cricetulus, Tscherskia и Ochotona

03.02.04 – зоология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

д.б.н., с.н.с. Картавцева Ирина Васильевна Владивосток – 2014 2 Оглавление Оглавление

Введение

Глава 1. Структура кариотипа в фокусе проблем таксономии

1.1. Краткая характеристика объектов исследования

1.1.1. Сведения по биологии серых хомячков надвидового комплекса Cricetulus barabensis

1.1.2. Сведения по биологии крысовидных хомячков рода Tscherskia...... 1.1.3. Сведения по биологии пищух рода Ochotona

1.2. Цитогенетические характеристики в изучении мелких млекопитающих

1.2.1. Кариологическая изученность хомячков Cricetulus barabensis и C.

pseudogriseus

1.2.2. Структура кариотипа и замечания по систематике Tscherskia triton

1.2.3. Внутриродовая структура и цитогенетическая характеристика рода Ochotona

1.3. Гетерохроматин: структура, функции и роль в изменчивости кариотипа

1.3.1. Свойства, структура и функции гетерохроматина

1.3.2. Содержание гетерохроматина как цитогенетический признак и его значение в эволюции кариотипа

1.4. Методы цитогенетических исследований

Глава 2. Материал и методы исследования

2.1. Материал исследования

2.2. Методы цитогенетического анализа

2.2.1. Приготовление хромосомных препаратов из клеток красного костного мозга

2.2.2. Рутинное окрашивание

2.2.3. Дифференциальное C-окрашивание

2.2.4. Ag-NOR-окрашивание ядрышкообразующих районов

2.2.5. Дополнительные методы, использованные в работе

Глава 3. Результаты и обсуждение

3.1. Степень цитогенетических различий и уровень дивергенции молодых видов на примере хомячков Cricetulus barabensis и C. pseudogriseus ............. 3.1.1. Рутинное окрашивание хромосом C. barabensis

3.1.2. С-окрашивание хромосом C. barabensis

3.1.3. Рутинное окрашивание хромосом C. pseudogriseus

3.1.4. С-окрашивание хромосом C. pseudogriseus и сравнительный анализ кариотипов C. barabensis и C. pseudogriseus

3.2. Единообразие кариотипов у подвидов Tscherskia triton из изученных локалитетов Приморского края

3.3. Кариологические особенности пищух и дополнение внутриродовой системы рода Ochotona

3.3.1. Первоописание кариотипа O. huangensis и уточнение цитогенетических границ между подродами Pika и Ochotona

3.3.1.1. Цитогенетическое описание пищухи O. huangensis

3.3.1.2. Сравнительный анализ кариотипов O. huangensis и O. alpina... 3.3.1.3. Сравнительный анализ кариотипов O. huangensis и O. dauurica

3.3.2. Диагностика пищух O. hyperborea государственного заповедника «Бастак» с использованием цитогенетических методов

Заключение

Выводы

Список литературы

Введение Актуальность исследования. Большинство таксонов описаны и выделены по морфологическим признакам, но с развитием биохимических и генетических методов анализа появились новые параметры для характеристики и сравнения видов. В зоологии это породило множество новых вопросов и идей о видообразовании, филогенетических связях, неравномерности эволюционных процессов на различных уровнях организации и соответственно видовых критериях (Воронцов, 1999, 2004; Лашин и др., 2012). Для обоснованного решения в популяционной зоологии применяют комплексный подход к зоогеографическим исследованиям, пониманию широкой изменчивости видов и разработке систематики. Нередко происходит пересмотр родственных отношений и ревизия таксономии многих групп животных. При формировании новых взглядов на систематику и эволюционные преобразования, возникает вопрос о сопоставлении результатов полученных морфологическими, генетическими, палеонтологическими, экологическими и другими методами. На этом фоне кариологические исследования остаются актуальными, так как рассматривают организм на своем особом уровне. Специфическая организация генетической информации в виде хромосом и существование кариотипа как цельной структуры, с его изменчивостью и эволюционными преобразованиями, характерны для каждого организма. Поэтому кариологические характеристики являются хорошим диагностическим признаком для многих видов животных. Исследование хромосом как таксономического признака, фактора наследственности или структур, изменение состава и числа которых часто приводит к генетической изоляции, является частью комплексного подхода в изучении любого вида.

Методы кариологического анализа применяют для распознавания близкородственных видов и видов-двойников, выявления сходства и родства видов внутри рода, а также оценки эволюции кариотипа и изучения путей расселения видов (Matthey, 1973). Более тонкие методы FISH-анализа хромосом позволяют обнаруживать гомологичные участки и проводить построение предкового кариотипа при сравнении даже высших таксонов (Dobigny, Yang, 2008; Graphodatsky et al., 2008).

В некоторых группах млекопитающих, с высокими темпами эволюции, значительную роль может играть хромосомное видообразование. Темпы видообразования часто коррелируют с изменениями хромосом (Воронцов, 1999).

Одной из важных форм преобразования хромосом являются перестройки гетерохроматиновых участков. Их изменения существенны в эволюции хромосом и, следовательно, могут приводить к поэтапному расхождению и изоляции близких форм (Ларкин, 2007). Изучение меж- и внутривидовой хромосомной изменчивости позволяет проследить процесс генетической дифференциации на последовательных этапах процесса видообразования (Лухтанов, Кузнецова, 2009;

White, 1973; Zima, 2000).

В связи с этим, нами выбраны несколько групп мелких млекопитающих, проблематика которых сочетает таксономические и цитогенетические аспекты.

Эти группы активно исследуются морфологическими и молекулярногенетическими методами, что позволяет нам провести актуальное исследование, методами кариосистематики, в рамках комплексного подхода. Представители изученных нами родов Cricetulus, Tscherskia и Ochotona имеют обширные ареалы, в том числе, на Дальнем Востоке России, где они малочисленны и недостаточно изучены в плане границ распространения, внутривидового разнообразия и цитогенетической изменчивости. Рассмотренные нами виды являются носителями опасных инфекционных заболеваний человека. Поэтому изучение хромосомной изменчивости необходимо для выяснения внутривидовой структуры, которая может быть связана с природной циркуляцией различных штаммов патогеннов.

Степень разработанности темы. Хомячки надвида Cricetulus barabensis являются интересным объектом для изучения дивергенции близких форм.

Морфологически слабо дифференцирующиеся хомячки имеют различную структуру кариотипов, что позволило выделить четыре вида (кариоформы): C.

barabensis (2n=20, NF=38), C. griseus (2n=22, NF=38), C. pseudogriseus (2n=24, NF=38), C. sokolovi (2n=20, NF=40) (Орлов, Малыгин, 1988; Громов, Ербаева, 1995; Картавцева, 2002а). Однако их таксономический статус остается дискуссионным. Продолжаются исследования по поиску дифференцирующих признаков, изолирующих факторов и гибридных зон в этой группе. Результаты краниометрии показали самостоятельность только C. sokolovi, остальные кариоформы были отнесены к C. barabensis на уровне подвидов (Лебедев, Лисовский, 2008). По молекулярно-генетическим данным кариоформы соответствовали либо подвидам, либо близким видам, однозначно показать их таксономический статус также не удалось (Поплавская и др., 2012а,б). Нами решено, более детально проанализировать кариотипические различия хомячков C.

barabensis и C. pseudogriseus, сформировать заключение об эволюционных преобразованиях их кариотипов и получить новую информацию для решения вопроса о таксономическом статусе форм надвида Cricetulus barabensis.

Крысовидный хомячок Tscherskia triton de Winton, 1899 – одно из немногих животных, в кариотипе которого отмечено присутствие В-хромосом (Борисов, 1980, дальневосточного вида, сведения о кариологической изменчивости и внутривидовом разнообразии малочисленны. На территории Приморского края описаны два подвида (Костенко, 1984; Картавцева, Алексеева, 1987): T. t. albipes и T. t. nestor, которого сближают с крысовидными хомячками Китая и Корейского полуострова. Нами предпринята попытка установить цитогенетические различия подвидов. А также зафиксировать присутствие В-хромосом в их кариотипах.

Виды пищух рода Ochotona Link, 1795 хорошо дифференцируются по кариотипическим характеристикам. В настоящее время активно ведется разработка внутриродовой систематики этой группы. Исследования пищух морфологическими, молекулярно-генетическими и биоакустическими методами дают достаточно сопоставимые результаты (Лисовский, 2005; Hoffmann, Smith, 2005; Формозов и др., 2006; Lissovsky et al., 2007; Lanier, Olson, 2009). Но филогенетические отношения отдельных таксонов недостаточно ясны. В том числе это связано с недостатком информации по центрально-азиатским видам внутривидового разнообразия и изменчивости таких широкоареальных видов как цитогенетические характеристики этого вида известны из Магаданской области России (Иваницкая, 1991) и о-ва Хоккайдо Японии (Hayata, Shimba, 1969). Наша работа направлена на получение новых данных по кариологии и изменчивости пищух, и их использование для дополнения внутриродовой системы.

Цели и задачи исследования. Цель настоящего исследования – изучить хромосомную изменчивость и цитогенетическую дифференциацию близких таксонов представителей родов Cricetulus, Tscherskia и Ochotona.

Для достижения цели поставлены следующие задачи:

Исследовать кариотипы подвидов C. barabensis и вида C. pseudogriseus для выявления внутривидовой изменчивости;

Установить дополнительные дифференцирующие критерии видов C.

гетерохроматина в хромосомах;

Проанализировать кариотипы и выявить цитогенетические различия подвидов T. triton из Приморского края;

Описать кариотип O. huangensis, провести сравнительный анализ с кариотипами представителей подродов Pika и Ochotona, и использовать эти данные для дополнения внутриродовой системы пищух с уточнением границ по хромосомным числам;

Провести цитогенетический анализ пищух Забайкальского края и юга Дальнего Востока России для обнаружения хромосомной изменчивости.

подтверждающие обитание C. barabensis в Новосибирской и Еврейской Автономной областях (Картавцева, Вакурин, Высочина, 2013; Вакурин и др., 2014). В результате С-окрашивания хромосом C. barabensis из различных частей ареала, впервые выявлена изменчивость окрашивания гетерохроматиновых блоков (С-блоков) на двух парах аутосом, без выраженной дифференциации между подвидами (Vakurin et al., 2011; Вакурин и др., 2014). Показана стабильность хромосомных характеристик C. pseudogriseus из 10 локалитетов Забайкальского края. Для C. barabensis и C. pseudogriseus установлены дифференцирующие критерии кариотипов по С-исчерченности хромосом.

акроцентрических аутосом, происходит потеря гетерохроматинового материала (Вакурин и др., 2014).

Впервые установлены цитогенетические характеристики и распределение Сблоков O. huangensis – циньлинской пищухи (2n=42, NF=84), выявлен гетероморфизм локализации С-блоков на 8-й паре аутосом (Vakurin et al., 2012).

Впервые проведен сравнительный анализ кариотипа O. huangensis с кариотипами пищух из подродов Pika и Ochotona. Диплоидное число (42) O. huangensis расширяет значения хромосомных чисел для видов подрода Ochotona (2n=46–50, 68), что нарушает разграничение по этому показателю с подродом Pika (2n=38–42, 68). В сравнении с литературными данными, обнаружены различия в Сисчерченности хромосом изученной нами O. dauurica из окр. с. Цаган-Олуй (Забайкальский край) (Vakurin et al., 2012). Впервые определена таксономическая принадлежность пищух Еврейской Автономной области (из заповедника «Бастак») к виду O. hyperborea – северная пищуха (Фрисман и др., 2013; Vakurin et al., 2013). Выявлена изменчивость кариотипа O. hyperborea из Амурской области по морфологии Х-хромосомы, соотношению мелких пар метасубметацентрических и субтело-акроцентрических аутосом. Впервые в семействе Пищуховых Ochotonidae Thomas, 1897 выявлена изменчивость числа половых хромосом (у самки O. mantchurica из Забайкальского края обнаружен кариотип Х0 – с одной половой хромосомой).

систематики является основой описания и понимания биоразнообразия.

Выявление дифференцирующих критериев близких видов направлено на понимание механизмов видообразования. Установление таксономической принадлежности пищух на Дальнем Востоке, необходимо для определения их ареала, что в дальнейшем позволит строить гипотезы о путях распространения, наблюдать условия обитания и адаптации к ним. Тем самым удастся охарактеризовать вид как целостную единицу с широким спектром свойств, формирующим его эволюционный успех.

Исследование видов, широко распространенных в Палеарктике, но малоизученных на территории Дальнего Востока, является неотъемлемой частью сравнительного подхода в изучении видов Восточной Азии, их родства, происхождения и связанных с этим перестроек хромосом. Полученные нами данные указывают на отсутствие цитогенетических границ по диплоидным числам между подродами пищух и могут быть использованы для дальнейшей ревизии. Описание кариотипических характеристик O. huangensis существенно для подтверждения видового статуса и составления диагноза. Новые сведения о хромосомной изменчивости могут быть включены в сводки по млекопитающим дальневосточного региона и атласы хромосом.

Каковы характеристики конкретного вида и чем он отличается от других?

Ответ в полной мере зависит от применения и синтеза различных методов, в том числе и цитогенетических. Решение этих вопросов необходимо при разработке практических мер по охране и восстановлению редких видов (определение мест и условий обитания, взаимосвязь с другими видами). Кариотип как характерный признак является неотъемлемой частью в понимании объема вида (его изменчивость, границы распространения). А также служит критерием вида и маркером идентификации при невозможности определения по другим признакам.

Исследование эндемичных видов, таких как циньлинская пищуха, позволит установить места и условия их обитания, оценить степень антропогенного влияния, формировать охранные зоны, например, при планировании развития сельского хозяйства в этих районах. Результаты нашей работы могут быть включены в курс цитогенетики биологических специальностей вузов.

Личный вклад автора. С участием автора проводили приготовление суспензий метафазных хромосом, забор материала у части крысовидных хомячков Вакурин А.А. осуществил лично. Автор готовил хромосомные препараты (более 250), проводил их окрашивание различными методами.

Самостоятельно выполнил микроскопический анализ, фотографирование метафазных клеток (более 1400), обработку данных и построение кариограмм.

Автором проведен анализ полученных результатов и подготовка публикаций.

Дополнительные данные, полученные молекулярно-генетическими и биоакустическими методами, проанализированы при участии автора.

Апробация работы. Результаты исследования доложены на 6 всероссийских Териологического общества РАН (Международное совещание Териофауна России и сопредельных территорий, Москва, 1-4 февраля 2011 г.), Современные достижения в популяционной, эволюционной и экологической генетике – Modern Achievements in Population, Evolutionary and Ecological Genetics: International Symposium (MAPEEG, Владивосток, 2009, 2011 и 2013 гг.), Конференция конкурс молодых ученых БПИ ДВО РАН (Владивосток, 8-9 ноября 2012 г.) и 10-ая Дальневосточная конференция по заповедному делу (Благовещенск, 25- сентября 2013 г.).

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 10 работ: статьи в ведущих рецензируемых научных журналах; 1 статья в региональном научном журнале; 1 статья в сборнике; 5 работы в материалах научных конференций.

Структура и объём диссертации.

Работа состоит из введения, трех глав, заключения, выводов и списка литературы. Текст диссертации изложен на страницах, содержит 6 таблиц и проиллюстрирован 16 рисунками. Список литературы включает 134 наименования, из них 56 на иностранных языках.

признательность своему научному руководителю – д.б.н. И. В. Картавцевой за неоценимый опыт и наставление в ходе исследования, поддержку, советы и замечания при написании рукописи. Особая благодарность к.б.н. В. П. Кораблёву за введение в цитогенетическую науку и обучение методам. За совместные работу и публикации искренне благодарю коллег и соавторов: доктора Ксю Лонг Цзян (Куньминский институт зоологии, Китай), Т. В. Григорьеву (МГУ, Москва), к.б.н.

А. А. Лисовского (Зоологический музей МГУ, Москва), д.б.н. Л. В. Фрисман и м.н.с. Л. В. Капитонову (ИКАРП ДВО РАН, Биробиджан), Н. П. Высочину (Хабаровская противочумная станция), к.б.н. Н. А. Формозова (МГУ, Москва), вед. инж. В. Ю. Гуськова (БПИ ДВО РАН, Владивосток), м.н.с. Е. В. Кумакшеву (НИИЭМ имени Г.П. Сомова СО РАМН, Владивосток), А. А. Аверина (государственный заповедник «Бастак», Биробиджан). Благодарю своих коллег:

д.б.н. И. В. Картавцеву, к.б.н. В. П. Кораблёва, к.б.н. М. В. Павленко, к.б.н. И. Н.

Шереметьеву, к.б.н. А. А. Лисовского – за отлов животных и любезно предоставленный материал для исследования. Также благодарю всех сотрудников лаборатории эволюционной зоологии и генетики Биолого-почвенного института ДВО РАН – за рабочую атмосферу, поддержку и советы при подготовке диссертационной работы.

Гранты РФФИ и ДВО. Работа выполнена при финансовой поддержке грантов: РФФИ №: 06-04-39015, 06-04-48969а, 12-04-00662а; ДВО РАН №: 09-IIСО-06-007, и гранта «Комплексные экспедиционные исследования природной среды бассейна р. Амур в 2004-2007 гг.».

Глава 1. Структура кариотипа в фокусе проблем таксономии 1.1. Краткая характеристика объектов исследования 1.1.1. Сведения по биологии серых хомячков надвидового комплекса Хомячки имеют средние размеры, длина тела от 8 до 13 см, хвоста – 2-3,5 см.

Ушные раковины двухцветные, в основании темные, по краю уха идет отчетливая белая кайма. Шерсть барабинского (даурского) хомячка Cricetulus barabensis Pallas, 1773 коричневая с ржавыми тонами. Окраска брюшка серая. По лбу и вдоль хребта проходит черная полоса, иногда размытая. Зимний мех более светлый и тусклый, а полоса может практически отсутствовать. Подошвы на лапах густо опушены. Череп с узким, удлиненным носовым отделом (Громов, Ербаева, 1995; Павлинов и др., 2002).

морфологически практически не отличим от C. barabensis. Но окраска шерсти С.

pseudogriseus может быть светлее и серее, чем у барабинского хомячка, с примесью песочных тонов. Темная полоса по хребту узкая, нечеткая или расплывчатая (Громов, Ербаева, 1995). Кроме того, забайкальский хомячок отличается от барабинского более узкой формой бакулюма; головка сперматозоидов С. pseudogriseus длиннее и уже в области шейки, чем у C.

barabensis (Орлов, Исхакова, 1975).

Экологически оба вида очень близки. Обитают преимущественно в степной и лесостепной зонах, по долинам рек и в полупустынной местности. Хомячки хорошо преодолевают многие географические преграды. Предпочитают устраивать норы на опушках леса и окраинах полей, в кустарнике, а в песчаных степях их излюбленным местом являются заросли караганы (Громов, Ербаева, 1995). Также находят убежище в домах, стогах и норах других животных. Зверьки питаются семенами и зеленью растений, поедают насекомых, делают запасы. В спячку впадают не на всю зиму, периодически засыпая на несколько дней, но в периоды бодрствования норку почти не покидают (Павлинов и др., 2002). Ущерб, наносимый хомячками сельскому хозяйству, не велик. Могут являться носителями патогенных возбудителей, в частности чумы. Используются как лабораторные животные (Громов, Ербаева, 1995).

По имеющимся данным хомячки надвидового комплекса Cricetulus barabensis имеют аллопатрические ареалы. C. barabensis распространен на северовостоке Казахстана, в Центральном Забайкалье, алтайских и тувинских степях, на большей части Амурской и Еврейской Автономной областей, в юго-западной части Приморья, северо-западной части Монголии, северной части полуострова Корея и севере Китая (Малыгин и др., 1992; Громов, Ербаева, 1995; Лебедев, Лисовский, 2008). С. pseudogriseus обитает в зоне более сухих степей на юге Забайкалья, центральной и восточной Монголии, и частично на северо-востоке Китая (Орлов, Исхакова, 1975). Гобийский хомячок C. sokolovi Orlov et Malygin, 1988 – в гобийской части Монголии, в зоне опустыненных степей (Орлов, Малыгин, 1988). Китайский хомячок C. griseus Milne-Edwards, 1867 – к юговостоку, на территории Китая, в менее аридных степях (Малыгин и др., 1992;

Лебедев, Лисовский, 2008).

1.1.2. Сведения по биологии крысовидных хомячков рода Tscherskia В составе рода Tscherskia Ognev, 1914 всего один вид – Tscherskia triton de Winton, 1899 – крысовидный хомячок. Данные хомячки близки к серым хомячкам и раньше включались в род Cricetulus Milne-Edwards, 1867. Размеры тела более крупные до 23 см, хвост длинный до 10 см, с характерным кончиком белого цвета (Громов, Ербаева, 1995). Морда немного вытянута с относительно удлиненными ушами, что придает хомячку несколько крысиный облик. Окраска шерсти темная, серо-бурая; цвет спины однотонный, на боках светлее, брюхо пепельное, часто на груди расположено белое пятно. Уши и хвост покрыты короткой, редкой шерстью (Павлинов и др., 2002; Лебедев, 2012). Череп с постепенно расходящимися в заднем направлении скуловыми дугами. Слуховые барабаны довольно крупные, выпуклые (Громов, Ербаева, 1995).

Крысовидные хомячки обитают на возвышенной местности по долинам рек, на лугах и заболоченных участках в зарослях кустарника. Могут заходить в прилежащие области лесов, селиться вдоль сельхоз полей и около жилых построек. Зверьки роют норы и в зимнее время их не покидают. Основной вид их пищи – семена растений, делают зимние запасы (Лебедев, 2012). Приносят потомство до 3 раз в год (Павлинов и др., 2002). Вред, наносимый сельскому хозяйству, не велик; хомячки являются носителями возбудителей природноочаговых инфекций, могут использоваться как лабораторные животные (Громов, Ербаева, 1995).

Этот вид распространен в северо-восточном Китае, на Корейском полуострове, на Дальнем Востоке России в южном Приморье: Приханкайская низменность, средняя часть хребта Сихотэ-Алинь (Громов, Ербаева, 1995;

Лебедев, 2012).

1.1.3. Сведения по биологии пищух рода Ochotona Пищухи рода Ochotona Link, 1795 – мелкие (в длину 12–28 см) млекопитающие отряда зайцеобразные Lagomorpha Brandt, 1855. Имеют относительно короткие конечности, задние по длине почти равны передним или немного превышают их. Хвост снаружи незаметен. Уши округлые короткие, лишь у некоторых видов длиннее середины головы. Мех густой, мягкий и высокий.

Окраска шерсти разнообразна от красноватой до серой, на брюшной стороне обычно светлее. Линька может происходить несколько раз в год (Громов, Ербаева, 1995). Летний мех более яркий, чем зимний (обычно серый разных оттенков). На мордочке расположены длинные вибриссы, у некоторых видов более трети длины тела. Кожные подушечки пальцев голые. Специфическая, для некоторых видов, кожная апокриновая железа располагается в заднем отделе щек и служит для мечения территории (Соколов и др., 1994).

Характерной особенностью многих северных видов пищух является развитая звуковая сигнализация – крик громкий, некоторые звуки напоминают свист. Эти обитатели предгорий и высокогорья могут встречаться на высоте 6000 м и выше над уровнем моря. Селятся поодиночке или колониями, предпочитают каменные россыпи или открытые равнины, но встречаются также полупустынные и степные виды (Павлинов и др., 2002). Убежище находят в расщелинах между камнями, либо роют норы. Многие виды пищух обладают сильной привязанностью к местам их обитания, что связано, прежде всего, с хорошо обжитыми многолетними убежищами (Соколов и др., 1994; Hoffmann, Smith, 2005). Зверьки ведут, в основном, дневной образ жизни. В поисках пищи далеко от своих убежищ не отходят. Основой рациона является травянистая растительность, а также мягкая кора деревьев и кустарников. Характерно запасание на зиму кормов, в виде своеобразных стожков сена. Размножаются 2-3 раза в год. Период размножения растянут и не совпадает у различных видов и в различных местах обитания (Павлинов и др., 2002). Длительность беременности около 30 дней.

Детеныши разных видов рождаются либо голыми, либо густо покрытыми волосами (Соколов и др., 1994; Громов, Ербаева, 1995).

В ряде мест пищухи являются вредителями сельского хозяйства, повреждают всходы и подрост ценных (кедр) и фруктовых пород деревьев. Представители семейства пищуховых, могут являться как основными, так и второстепенными носителями чумы (Громов, Ербаева, 1995).

Для многих изученных видов рода Ochotona установлены морфологические критерии видовой диагностики и границы ареалов. В настоящее время ареалы многих видов пищух разорваны (Воронцов, Иваницкая, 1973). Распространены в Северной Америке, Юго-Восточной Европе, в Азии от Арктического побережья до северных районов Ирана, Афганистана, Пакистана, Индии и Бирмы, от Полярного Урала на западе и до тихоокеанского побережья на востоке, включая Чукотку, Камчатку и остров Хоккайдо, а также на территории Северной Кореи (Соколов и др., 1994; Hoffmann, Smith, 2005).

Пищухи одна из наиболее древних групп плацентарных млекопитающих (Гуреев, 1964; Иваницкая, 1989; Лопатин, Аверьянов, 2008; Rose et al., 2008).

палеонтологической летописи просматривается два периода расцвета пищух:

середина олигоцена – начало миоцена и конец миоцена – плейстоцена. Далее последовало резкое вымирание и сокращение ареалов, в том числе и рода Ochotona в голоцене (Иваницкая, 1989).

1.2. Цитогенетические характеристики в изучении мелких млекопитающих 1.2.1. Кариологическая изученность хомячков Cricetulus barabensis и C.

Первые же работы по сравнительной кариологии показали, что кариотип может являться видовым диагностическим признаком. Большинство видов животных отличаются по числу, размерам и форме хромосом. Существуют видыдвойники, морфологический анализ которых затруднён. Для таких случаев адекватным диагностическим методом является цитогенетический анализ. С другой стороны описаны группы видов с одинаковыми числами (2n) и морфологией хромосом, а также обнаружены виды (хромосомно-полиморфные), в популяциях которых число и морфология хромосом изменчивы. Внутри- и межпопуляционный хромосомный полиморфизм обнаружен у 4% видов млекопитающих (Ляпунова, Картавцева, 1976). Поэтому сравнительная кариология имеет большое значение при сравнении разных популяций, географически замещающих друг друга форм неясного таксономического ранга или групп близких видов на уровне подрода (Орлов, 1974). Проблема множественных хромосомных рас, их гибридизация и явление робертсоновского веера ставит всё новые задачи перед цитогенетикой. В 70-х годах ХХ века начали активно развиваться методы дифференциального окрашивания хромосом, но и они не всегда могли разрешить спорные вопросы. В дальнейшем они стали дополняться молекулярными данными.

Род Cricetulus Milne-Edwards, 1867 – серые хомячки, включает 8-10 видов (Smith et al., 2010), изучение хромосомных наборов ряда видов показало, что различия в структуре кариотипов обусловлены перестройками Робертсоновского типа (Раджабли, Крюкова, 1973; Gamperl et al., 1976; Kral et al., 1984). Среди хомячков этого рода выделяют надвидовой комплекс Cricetulus barabensis с несколькими полиморфными видами, населяющими разнообразные ландшафты от Западной Сибири до Приморья и низовий р. Янцзы в Китае (Лебедев, Лисовский, 2008). Для хомячков этого комплекса кариотип по-прежнему остаётся надёжным диагностическим признаком. Надвидовой комплекс Cricetulus barabensis включает четыре вида: C. barabensis Pallas, 1773 sensu stricto – барабинский хомячок, C. griseus Milne-Edwards, 1867 – китайский хомячок, C.

pseudogriseus Orlov et Iskhakova, 1975 – забайкальский хомячок, C. sokolovi Orlov et Malygin, 1988 – гобийский хомячок, которые иногда рассматриваются как хромосомные формы. На примере данной группы можно проследить, как генетическая дифференциация опередила морфологическую и экологическую.

Такая дифференциация вполне может служить основой для дальнейшей морфологической дивергенции близких форм или подвидов, так как при генетической изоляции мутации в отдельных популяциях будут накапливаться очень быстро. В итоге этот процесс может привести к формированию нового вида (Воронцов, 1960, 2004). В настоящее время один из актуальных вопросов – это какова таксономическая структура форм, входящих в состав надвидового комплекса Cricetulus barabensis.

Как таковые существуют две точки зрения на таксономию данной группы.

Одна из них предполагает существование в пределах одного вида C. barabensis нескольких подвидов и их возможную гибридизацию в зонах контакта популяций.

Для барабинского и забайкальского хомячков такие зоны могут быть обнаружены в центральной Монголии и на юге Бурятии (Поплавская и др., 2011, 2012а), а также в юго-восточной части Забайкальского края, где границы их распространения проходят по рекам Онон, Унда и Газимур (Кораблёв и др., 2010, 2013). Первоначально новые формы хомячков описывались как подвиды в основном по окраске шерсти: от темно-серой до рыжей (Лебедев, Лисовский, 2008). C. b. griseus отличается от C. b. barabensis более светлой окраской шерсти и размытой полосой на спине, кроме того у второго подвида по всему ареалу также наблюдается изменчивость окраски шерсти (Воронцов, 1960). У забайкальского хомячка C. b. pseudogriseus окраска светлее и серее, чем у C. b. barabensis, полоса вдоль хребта расплывчатая и нечеткая, местами исчезает. Основной окрас меха спины ореховый со значительной примесью темно-песочного и песочного тонов.

Окраска верха молодых зверьков менее рыжая, чем у взрослых (Орлов, Исхакова, 1975). Гобийский хомячок C. sokolovi отличается более светлой и тусклой окраской, полоса вдоль хребта лишь слегка заметна, либо отсутствует полностью (Орлов, Малыгин, 1988).

Согласно другой точки зрения, в эту группу хомячков входят четыре аллопатрических вида (Малыгин и др., 1992; Громов, Ербаева, 1995; Картавцева, 2002а). Данные виды были выделены на основании цитогенетических различий (кариоформы): C. barabensis (2n=20, NF=38), C. griseus (2n=22, NF=38), C.

pseudogriseus (2n=24, NF=38), C. sokolovi (2n=20, NF=40). По географическому распространению эти четыре вида (кариоформы) имеют аллопатрические ареалы.

Предполагают, что центр происхождения видов группы “barabensis” мог находиться в относительно древних сухих степях центральной и восточной Монголии, где встречается С. pseudogriseus – вид с наиболее архаичным кариотипом (Малыгин и др., 1992), от которого в результате хромосомных перестроек произошли и другие виды (кариоформы) этой группы хомячков.

В дальнейшем, данные краниометрического анализа показали существование пяти групп у вида C. barabensis, которые частично соответствуют кариоформам, и вида C. sokolovi (Лебедев, Лисовский, 2008):

1. C. b. barabensis Pallas, 1773 – обитает на Алтае, в Новосибирской области;

2. C. b. tuvinicus Iskhakova, Lebedev et Lissovsky, 2008 – распространён в Туве, Бурятии, северо-западной Монголии и хребте Хангай;

3. Кластер трёх дальневосточных подвидов: C. barabensis ssp. – центральная часть Забайкальского края; C. b. xinganensis Wang, 1980 – Амурская область; C. b.

ferrugineus Argyropulo, 1940 – Приморский край.

Эти подвиды соответствуют популяциям в составе одной хромосомной формы (вида) – C. barabensis (2n=20).

4. C. b. pseudogriseus – ареал включает юг Забайкальского края, юг Бурятии, восточную и центральную Монголию, частично северо-восточную область Китая, аналогичная хромосомная форма (вид) C. pseudogriseus (2n=24);

5. C. b. griseus – типичное местообитание территория Китая, ранее описан в статусе вида (кариоформы) C. griseus (2n=22);

6. C. sokolovi – по морфологическим данным подтверждается видовой статус этой наиболее обособленной группы из Долины Озер (Монголия), центральной и восточной части пустыни Гоби (2n=20, отличается от кариотипа C. barabensis иной морфологией хромосом).

Однако мы придерживаемся точки зрения существования большего числа видов, которые соответствуют хромосомным формам. В таблице 1 нами представлена кариологическая изученность двух видов: C. barabensis с пятью подвидами, и C. pseudogriseus.

Cricetulus barabensis – барабинский хомячок имеет кариотип 2n=20, NF=38.

Аутосомы распределены в три группы. Первая группа включает две пары крупных и три пары средних метацентрических хромосом. Вторая группа представлена только одной парой акроцентрических хромосом средних размеров.

В третью группу объединены три пары мелких метацентрических хромосом. Xхромосома – субмета-субтелоцентрическая, средних размеров. Y-хромосома – субметацентрическая, несколько меньших размеров. Различий по числу хромосом и хромосомных плеч между подвидами C. barabensis из 30 локалитетов (1 в Алтайском крае, 6 в Туве, 6 в Бурятии, 10 в Забайкальском крае, 1 в Амурской области, 1 в Приморском крае и 5 в Монголии) не описано (табл. 1).

C. pseudogriseus – забайкальский хомячок имеет кариотип 2n=24, NF=38. В первой группе три пары метацентрических хромосом: две крупные и одна средняя. Вторая группа состоит из пяти акроцентрических пар средних размеров.

Третью группу составляют три пары мелких метацентриков. X-хромосома – средних размеров мета-субметацентрик. Y-хромосома более мелкая субметацентрическая. Географической изменчивости кариотипов у хомячков данного вида из 31 локалитета (4 в Бурятии, 16 в Забайкальском крае и 11 в Монголии) обнаружено не было (табл. 1).

Хромосомы барабинских хомячков были исследованы с помощью трех методов окрашивания: G, NOR и FISH. При сравнении G-окраски хромосом барабинского (C. barabensis из Тувы) и китайского (C. griseus – лабораторная линия) хомячков С. И. Раджабли и Е. П. Крюкова (1973) установили, что плечи аутосом и Y-хромосомы этих видов полностью гомологичны. Также эти авторы высказали предположение, что различие Х-хромосом связано с перицентрической инверсией. Б. Крал с соавторами (Kral et al., 1984) проведя сравнение G-полос хромосом хомячков трех видов (барабинского, китайского и забайкальского – C.

barabensis, C. griseus, C. pseudogriseus, гомологичность плеч аутосом и показали, что изменчивость числа хромосом связана с робертсоновскими перестройками, а морфология X-хромосом барабинского хомячка отличается от таковой двух других видов из-за перицентрической инверсии. Эти выводы были подтверждены и FISH анализом (Romanenko et al., 2007). Таким образом, в эволюции кариотипов хомячков принимали участие центрические слияния аутосом по Робертсоновскому типу (две пары метацентрических хромосом C. barabensis образовались из четырёх пар диплоидного числа хромосом с 24 до 20 с сохранением NF=38), а также перицентическая инверсия в X-хромосоме.

Окрашивание хромосомных препаратов хомячков C. barabensis и C.

pseudogriseus на наличие районов ядрышкового организатора показало, что NOR участки локализуются на 6 парах (№№ 3, 4, 5, 6, 7 и 8) хромосом (Kral et al., 1984).

При этом на препаратах C. barabensis максимально было обнаружено ядрышкообразующих районов. Между индивидуальными особями разных видов не было найдено различий в положении районов ядрышкового организатора, и показано, что при хромосомных перестройках, указанных выше, локализация NOR блоков в хромосомах не изменилась.

Сведения по окрашиванию на структурный гетерохроматин хромосом C.

barabensis и C. pseudogriseus представлены только в Atlas of mammalian chromosomes (2006) по неопубликованным данным С. И. Раджабли с соавторами.

К сожалению, локалитеты, откуда изучены экземпляры хомячков, не указаны. Из представленных рисунков распределение гетерохроматина у хомячков можно охарактеризовать следующим образом. На первой самой крупной паре аутосом C.

barabensis видны два интеркалярных блока на длинном и коротком плечах. На второй паре аутосом имеется три блока гетерохроматина: два расположены по обе стороны от центромеры, и один крупный ближе к теломерному концу длинного плеча. Лишь одна из трех пар средних мета-субметацентриков имеет прицентромерный блок гетерохроматина. У единственной акроцентрической метацентрических аутосом также имеет гетерохроматиновый блок в области центромеры. Нижние плечи ещё одной мелкой пары метацентриков полностью состоят из гетерохроматина. Последняя пара метацентрических аутосом, полностью состоит из гетерохроматина. X-хромосома C. barabensis имеет полностью гетерохроматиновое короткое плечо и примерно половину длинного.

На Y-хромосоме гетерохроматин занимает только половину длинного плеча.

Первая пара аутосом C. pseudogriseus имеет такую же локализацию гетерохроматина как и у C. barabensis, если учесть что на одном из рисунков хромосомы оказались перевернуты. У второй пары аутосом заметен только теломерный блок гетерохроматина. На третьей паре средних метасубметацентриков гетерохроматин локализуется в прицентромерном участке. На трех из пяти акроцентрических парах аутосом видны прицентромерные блоки гетерохроматина. Две пары мелких метацентриков имеют прицентромерные гетерохроматиновые блоки. Последняя мелкая пара метацентриков почти гетерохроматиновое длинное плечо. Длинное плечо Y-хромосомы также состоит из гетерохроматина, короткое плечо окрашено менее ярко, но возможно тоже представлено гетерохроматином.

Таблица 1. Кариологическая изученность хомячков двух видов: C. barabensis и C. pseudogriseus.

X Y C G NOR

C. b. barabensis C. b. tuvinicus Там же, окр. Гусиноозерска Там же, Джидинский и Селенгинский р-н Там же, хр. Тарбагатай, перевал Солонгот Там же, Хангайский хр.

X Y C G NOR

C. barabensis ssp.

Забайкальский край, Кыринский р-н, Там же, Читинский р-н, окр. оз.

Там же, Читинский р-н, п. Антипиха (окр.

Там же, Дульдургинский р-н, окр. с.

C. b. xinganensis Амурская обл., окр. г. Благовещенск C. b. ferrugineus Забайкальский край, Борзинский р-н, окр.

Продолжение таблицы 1.

X Y C G NOR

Там же, Приаргунский р-н, окр. с. УстьКораблёв и др., 2006, Там же, Оловяннинский р-н, окр. с.

Там же, Балейский р-н, окр. с. УндиноКораблёв и др., 2010, Там же, Краснокаменский р-н, падь Там же, Краснокаменский р-н, окр. г.

Там же, Нерчинско-Заводский р-н, окр. с.

Республика Бурятия, Кяхтинский р-н, окр.

Там же, Кяхтинский р-н (без указания Там же, Увэр-Хангайский аймак, у горы Там же, Хэнтейский аймак, окр. сомона Продолжение таблицы 1.

X Y C G NOR

Там же, Хэнтейский аймак, окр. сомона Там же, Восточный аймак, долина р. Улдзи Там же, Восточный аймак, пески у горы Там же, Селенгинский аймак, окр. сомона Там же, Селенгинский аймак, окр. сомона Там же, Селенгинский аймак, у монастыря Там же, Сухэбаторский аймак, окр. оз.

Sm(St) – субмета(субтело)центрик, A – акроцентрик, X, Y – половые хромосомы, C – C-окраска, G – G-окраска, NOR – AgNOR-окраска, “+” – есть данные, “-” – нет данных.

Попытка охарактеризовать уровень генетического разнообразия и прояснить таксономический статус хомячков C. barabensis и C. pseudogriseus, с помощью методов молекулярного анализа, не дала однозначных результатов. Н. С.

Поплавская с соавторами (2012а) провели сбор и анализ материала из двух возможных зон контакта: центральной Монголии и южной Бурятии, где ареалы двух кариоформ разделены р. Чикой и расстояние между ними составляет около км. Анализ гена цитохрома b мтДНК и гена DBY1 Y-хромосомы показал наличие “pseudogriseus”. Различия между кластерами по р-дистанции были на уровне 2,3подобные различия могут характеризовать как подвиды, так и близкие молодые виды-двойники (Bradlеу, Baker, 2001; Картавцев, Ли, 2006). В этот анализ были включены два самца из центральной Монголии с нестандартными кариотипами (2n=21), которые могут соответствовать гибридам второго и последующих поколений (Поплавская и др., 2011). Но по молекулярным данным, признаки гибридизации не были обнаружены, эти особи вошли в кластер C.

barabensis. Тест Таджимы на стабильность численности популяций показал, что исследованные зоны контакта сформировались достаточно давно и, следовательно, причиной отсутствия потока генов не может быть недавнее их формирование (Поплавская и др., 2012а). При экспериментальной гибридизации барабинских и забайкальских хомячков были получены плодовитые гибриды обоих полов (Поплавская и др., 2011, 2012б). Однако, по представленным в статье данным видно, что в контроле число выводков равно примерно половине от числа спариваний, в то время как при гибридном спаривании C. barabensis и C.

pseudogriseus число выводков равно лишь одной трети. Кроме того, при возвратном скрещивании гибридов с этими же видами потомство не получено.

Имеются только выводки от скрещивания, в различных вариантах, гибридов и C.

griseus. Это может свидетельствовать о пониженной плодовитости при гибридизации. Данные авторы рассматривают хомячков надвида Cricetulus barabensis как кариоформы одного вида. Рассматривая возможные причины репродуктивной изоляции, авторы пришли к выводу: кариоформы представляют собой “независимо развивающиеся эволюционные линии” (Поплавская и др., 2012а).

Таким образом, краниометрические характеристики указывают на подвидовой статус C. barabensis, C. pseudogriseus и C. griseus, хотя определение единичных экземпляров очень затруднено (Лебедев, Лисовский, 2008). По данным молекулярного анализа генов цитохрома b и DBY1 C. barabensis и C.

pseudogriseus могут рассматриваться и как подвиды, и как близкие виды (Поплавская и др., 2011, 2012а). Хромосомные наборы всех трех кариоформ хорошо различаются и, хотя не имеют критических изменений генетической структуры в результате центрических слияний, в совокупности с относительно стабильным аллопатрическим распространением, могут свидетельствовать об эволюционной молодости этих видов-двойников.

1.2.2. Структура кариотипа и замечания по систематике Tscherskia triton Первоописание кариотипа Tscherskia triton de Winton, 1899 было проведено из корейской популяции, диплоидное число хромосом оказалось равным (Makino, 1951). В дальнейшем стало известно, что кариотип крысовидного хомячка может содержать добавочные хромосомы (В-хромосомы) и первоописание сделано для кариотипа с двумя В-хромосомами. Нормальный кариотип этого вида имеет 2n=28: 11 пар акроцентрических и 2 пары метасубметацентрических аутосом, субтелоцентрическую X-хромосому и метасубметацентрическую Y-хромосому (Борисов, Кораблёв, 1978). Хромосомные наборы T. triton изучены на небольшой части ареала: из трех провинций Китая – Шаньдун, Цзилинь и Шэньси (Wang et al., 1999), на Корейском полуострове (Makino, 1951; Tsuchiya, Won, 1976), в Приморском крае России из окрестностей г. Уссурийска и пос. Пограничный (Борисов, 1978, 1980, 2012; Борисов, Кораблёв, 1978; Картавцева и др., 1980).

Кариотип крысовидного хомячка исследован методами дифференциального C-, G-, Q-, NOR-окрашивания. С помощью С-окрашивания у этого вида показано довольно высокое содержание гетерохроматина – 28% от размера генома (Борисов, Кораблёв, 1978). Крупные, прицентромерные С-блоки выявляются на всех акроцентрических парах аутосом, на мелких мета-субметацентрических парах центромерные С-блоки меньшего размера. Половые хромосомы также имеют прицентромерные блоки гетерохроматина, на Y-хромосоме этот участок занимает и часть короткого плеча (Борисов, Кораблёв, 1978). Такое большое количество гетерохроматинового материала делает T. triton удобным объектом для изучения структуры и свойств гетерохроматина. По ряду методов окраски хромосом был продемонстрирован различный характер С-блоков у крысовидного хомячка. Прицентромерные С-блоки акроцентрических аутосом разделяются на два участка. Первый участок не проявляется при рутинной и кратковременной Сокраске, но флуоресцирует при Q-окраске и прокрашивается при нормальных условиях С-окрашивания. Второй участок заметен как более темный уже при рутинной окраске; при С-окраске, вместе с первым участком, он выявляется как крупный блок гетерохроматина, но не флуоресцирует при Q-окраске. При Gокрашивании первый участок прицентромерного гетерохроматина интенсивно окрашивается и наиболее устойчив к трипсину, второй участок не окрашивается.

Всего на 3-й паре хромосом крысовидного хомячка прокрашивается до 12 Gполос; G-окраска практически совпадает с Q-окраской и противоположна Сокраске, исключение проявляется в тусклом свечении первого участка гетерохроматина при окрашивании акрихином (Борисов, 1978; Борисов, Кораблёв, 1978). Таким образом, было показано, что прицентромерные С-блоки содержат гетерохроматин двух типов. Сравнение кариотипов T. triton и других видов хомяков выявило корреляцию содержания высокоповторенной ДНК и гетерохроматина. Следовательно, различие гетерохроматина обусловлено не столько первичной последовательностью нуклеотидов, сколько плотностью его упаковки. На молекулярном уровне такая упаковка связана с функциональными особенностями гетерохроматина, ДНК-белковым взаимодействием и их общей структурной организацией. Различие Q-окраски также может зависеть от обогащенности ГЦ-основаниями (Борисов, 1978).

акроцентрических В-хромосом. Добавочные хромосомы встречаются у малого числа особей и лишь в небольшом количестве клеток. Так на 21 изученную особь были обнаружены: одна В-хромосома у 3 хомячков в 20-40% исследованных клеток; две В-хромосомы у 1 хомячка в 5% клеток (Борисов, 1980). Показана конъюгация В-хромосом в мейозе и их более высокая частота встречаемости в герминативных клетках, по сравнению с клетками соматических тканей. Однако при отсутствии добавочных хромосом в соматических клетках, в герминативных клетках они также отсутствуют. В связи с этим было выдвинуто предположение, что В-хромосомы образуются de novo в репродуктивной ткани, а затем элиминируют в соматической из-за их отрицательного воздействия (Борисов, 2012). По С-окраске В-хромосомы почти полностью состоят из гетерохроматина, с менее интенсивно окрашенными прицентромерными и теломерными участками.

По G-окраске добавочные хромосомы окрашиваются слабо, кроме небольшого прицентромерного участка; флуоресценция при Q-окраске также тусклая. Данные отличия окраски гетерохроматина В-хромосом от С-блоков аутосом позволили предположить наличие 3-его типа гетерохроматина у T. triton. В кариотипах хомячков с 2n=29 (28+1В) и 2n=30 (28+2В) не обнаружено перестроек по сравнению с нормальным 2n=28. Было выдвинуто три гипотезы происхождения В-хромосом. По первой гипотезе, они являются остаточными тельцами при центрических слияниях хромосом. Вторая состоит в том, что В-хромосомы образуются в результате дупликации гетерохроматинового материала или других элементов аутосом. По третьей гипотезе, В-хромосомы – это дупликация участков половых хромосом. У крысовидного хомячка показано сходство размеров, морфологии и дифференциальных C-, G-, Q-окрасок В-хромосом и короткого плеча Y-хромосомы, что возможно указывает на происхождение добавочных хромосом путем дупликации этого участка Y-хромосомы (Борисов, 1980, 2012).

Ранее относимый к серым хомячкам Cricetulus nestor Thomas, 1907 был описан из северокорейской популяции (район Порт-Артура). С. И. Огнев отнес крысовидного хомячка к отдельному роду с описанием Tscherskia albipes Ognev, 1914 из Приморского края. Впервые кариотип T. triton с 2n=30, C. t. nestor по сводке Эллермана и Моррисона-Скотта (1951), был исследован из корейской популяции (Makino, 1951). Позднее для хомячков из окр. Уссурийска (Приморский край) Н. Н. Воронцов и С. И. Раджабли (1969) описали кариотип с 2n=28, что дало основание отнести их к самостоятельному виду T. albipes.

Дальнейшие исследования кариотипов крысовидных хомячков из популяций Кореи (Tsuchiya, Won, 1976), Китая (Wang et al., 1999) и Приморского края (Борисов, 1978; Борисов, Кораблёв, 1978; Картавцева и др., 1980), и обнаружение у этого вида В-хромосом (Борисов, 1980) показало конспецифичность T. nestor и T. albipes. Таким образом, был утвержден только один вид крысовидного хомячка – T. triton (Картавцева и др., 1980; Борисов, 2012). На территории Китая выделяют до пяти подвидов крысовидного хомячка: T. triton triton, T. t. fuscipes, T. t. collinus, T. t. incanus и T. t. canus (Wang et al., 1999). У одного из подвидов T. t. canus была преобладанием двуплечих хромосом. Данный подвид обитает в изолированных популяциях горных лесов на территории провинций Ганьсу, Нинся, Шэньси и Сычуань (Smith et al., 2010). На основании кариологических различий подвид T. t.

canus был выделен в самостоятельный вид Cansumys canus Allen, 1928 (Yang et al., 2003). Однако по морфологическим признакам и данным молекулярного анализа D-петли мтДНК его рассматривают как подвид (Liao et al., 2007).

На территории Приморского края России выделено два подвида: T. t. albipes Ognev, 1914 и T. t. nestor Thomas, 1907 (Костенко, 1984; Картавцева, Алексеева, 1987). Добавочные хромосомы обнаружены в кариотипах крысовидных хомячков только из популяций T. t. albipes. Нами предпринята попытка установить связаны ли подвидовые различия с изменчивостью кариотипов и В-хромосом.

1.2.3. Внутриродовая структура и цитогенетическая характеристика рода Цитогенетические характеристики являются существенным диагностическим признаком и важны в установлении филогенетических связей. Зоогеографическая реконструкция возможна только на основе представления о четкой структуре родственных отношений (Иваницкая, 1989). При этом эффективность кариологического анализа увеличивается при увеличении числа исследуемых видов и с применением методов дифференциального окрашивания, что дает возможность выявить хромосомные перестройки и соответственно проследить пути и закономерности эволюции кариотипов.

К середине XX века систематика голарктического рода Ochotona, как и многих других таксонов млекопитающих, оставалась мало разработанной.

Несмотря на достаточное количество морфологических различий и такой специфический признак как характер звуковой сигнализации, взгляды систематиков на структуру внутриродовых филогенетических отношений пищух были различны. Построение надвидовой системы проводилось разными авторами по различным морфологическим и морфо-экологическим признакам. Некоторые авторы признавали деление на подроды, другие выделяли лишь группы видов, так как отсутствовали четкие морфологические критерии, которые позволили бы определить родственные связи и уровень дивергенции (Иваницкая, 1991).

Кариологические данные к этому времени все еще оставались разрозненными.

В дальнейшем за четыре десятилетия исследований систематика пищух северной Палеарктики и Северной Америки была разработана довольно хорошо.

Система подродов и надвидовых групп периодически пересматривалась на основе расширения числа морфологических признаков, с увеличением числа корректировалась многочисленными молекулярными данными (Yu et al., 2000;

Niu et al., 2004; Формозов и др., 2006; Lissovsky et al., 2007; Lanier, Olson, 2009).

В настоящее время выделяют до 30 видов пищух, объединяемых в три подрода: Pika Lacepede, 1799, Ochotona Link, 1795 и Conothoa Lyon, (Hoffmann, Smith, 2005). Описаны кариотипы, по крайней мере, 19 видов пищух (табл. 2) (Воронцов, Иваницкая, 1969, 1973; Hayata, Shimba, 1969; Nadler et al., 1969; Adams, 1971; Rausch, Ritter, 1973; Stock, 1976; Kimura et al., 1983; Tan, Bai, 1987; Capanna et al., 1991; Формозов, Баклушинская, 1999, 2011; Формозов и др., 1999, 2003, 2004; Ye et al., 2011). Это, в основном, виды северных и умеренных широт. В фауну России включены 7 видов пищух: O. alpina, O. dauurica, O.

hoffmanni, O. hyperborea, O. mantchurica, O. pallasi и O. pusilla (Соколов и др., 1994; Формозов, Баклушинская, 1999, 2011; Lissovsky et al., 2007, 2008). Для этих видов определены хромосомные числа и проведено дифференциальное G- и Cокрашивание хромосом (табл. 2). Для сравнения, в Китае обитает 24 вида пищух (Wang, 2003), но для этой территории описаны кариотипы только пяти видов: O.

curzoniae Hodgson, 1858 (Tan, Bai, 1987), O. ladacensis Gunther, 1875, O. nubrica Thomas, 1922 (Формозов и др., 2003), O. argentata Howell, 1928 (Формозов и др., 2004), O. forresti Thomas, 1923 (Ye et al., 2011).

Таблица 2. Внутриродовая система рода Ochotona и видовая изменчивость диплоидных чисел хромосом (2n) пищух. NF – общее число плеч хромосом.

кариотипов по числу хромосом (2n=38, 40, 42, 46, 48, 50, 54, 60, 62, 68) или по числу хромосомных плеч при сходном диплоидном числе. Такая специфика помогает в решении спорных таксономических вопросов. По цитогенетическим различиям доказана видовая самостоятельность O. alpina и O. hyperborea (Воронцов, Иваницкая, 1973), O. dauurica и O. curzoniae (Воронцов, Иваницкая, 1969, 1973; Tan, Bai, 1987). Было показано цитогенетическое сходство между палеарктическим видом O. pusilla и неарктическими O. princeps и O. collaris (Воронцов, Иваницкая, 1973; Rausch, Ritter, 1973). Наиболее сходные кариотипы имеют O. macrotis и O. rutila (табл. 2). Для большинства исследованных видов пищух характерны сходные по морфологии и размерам половые хромосомы: Xхромосома субметацентрическая с двумя G-полосами (по одной на коротком и длинном плече), Y-хромосома мелкая акроцентрическая практически полностью состоящая из гетерохроматина. Аутосомные различия у пищух довольно значительны, в том числе и по содержанию гетерохроматина (Иваницкая, 1991).

Внутривидовая изменчивость кариотипов пищух до недавнего времени была неизвестна (Иваницкая, 1989). Между изолятами таких видов как O. dauurica (алтайский и забайкальский), O. hyperborea (североуральский, магаданский и хоккайдский), O. pallasi (= O. pricei) (центральноказахстанский, алтайский и монгольский) цитогенетических различий выявлено не было (Воронцов, Иваницкая, 1973). Однако у пищух из группы O. alpina обнаружены две хромосомные формы неясного таксономического ранга (Формозов и др., 2006).

Информация по дифференциальному G-, NOR-окрашиванию хромосом гетерохроматина известно для 9 видов пищух, 7 из которых распространены на территории России (табл. 3). Наибольшее количество гетерохроматина выявлено у O. dauurica – 35,1%, что больше чем среднее значение для млекопитающих – 20% (Иваницкая, 1991). У этого вида все блоки гетерохроматина окрашиваются более интенсивно, чем у других видов. Также, по сравнению с другими видами, даурская пищуха имеет самый крупный блок гетерохроматина (1/3 нижнего плеча) на Х-хромосоме (табл. 3). Такие виды как O. alpina, O. argentata, O.

hyperborea, O. pallasi и O. rufescens не имеют гетерохроматина на Х-хромосомах.

У многих исследованных видов пищух Y-хромосома полностью состоит из гетерохроматина (Иваницкая, 1991).

Таблица 3. Распределение количества (%) гетерохроматина на хромосомах пищух.

Примечание: 2n – диплоидное число хромосом, Nпц – количество пар аутосом с прицентромерным гетерохроматином, X, Y – половые хромосомы, с – прицентромерный гетерохроматин, q – длинное плечо, “+” – хромосомы, полностью состоящие из гетерохроматина, “-” – отсутствие гетерохроматина.

Межвидовые различия по количеству и распределению гетерохроматина указывают на его значительную роль в эволюции кариотипов пищух. Так, например, 3 пары мета-субметацентриков и крупные субтелоцентрики O. rutila, O.

rufescens и O. dauurica, имеющие идентичную G-исчерченность, различны по количеству гетерохроматина. Это свидетельствует о переходе части прицентромерного эухроматина в гетерохроматиновое состояние.

Предполагается, что в этом случае происходит гетерохроматизация, а не амплификация гетерохроматина, так как длина сходных G-участков хромосом остается неизменной (Иваницкая, 1991).

В эволюции кариотипов пищух определенную роль играли робертсоновские слияния, а также перицентрические инверсии и фрагментации отдельных хромосом. Наиболее примитивными считают кариотипы с большим числом хромосом у O. pusilla и O. princeps – 2n=68 (Воронцов, Иваницкая, 1973).

Структурные перестройки происходили с потерей части гетерохроматинового материала. Таким образом, для пищух характерна общая эволюционная тенденция в увеличении двуплечих пар аутосом и уменьшении количества гетерохроматина с уменьшением диплоидного числа хромосом. Также была возможна потеря отдельных мелких хромосом, как это наблюдается у O. dauurica (2n=50) и O.

curzoniae (2n=46), кариотипы которых отличаются на 2 пары мелких аутосом (Иваницкая, 1991).

Сравнительный анализ G-исчерчености хромосом пищух показал высокую степень сходства между кариотипами ряда видов: O. alpina – O. pallasi, O. pusilla – O. princeps, O. rutila – O. rufescens (Иваницкая, 1991). Наибольшая степень сходства наблюдается у O. alpina и O. pallasi, кариотипы которых имеют по 4 и уникальные пары аутосом соответственно. В кариотипах O. pusilla и O. princeps по 7 уникальных пар аутосом. У O. rutila, O. rufescens и O. dauurica уникальны 7, 2 и 5 пар аутосом соответственно. Для этих видов полностью сходны только пар аутосом, остальные имеют лишь частичное сходство. В сравнении с хромосомными видами, эти виды имеют только 4 идентичные пары, у оставшихся пар аутосом сходны лишь отдельные участки. Сравнение кариотипов O. alpina (2n=42), O. pallasi (2n=38) и видов с 68 хромосомами показало сходный рисунок G-полос только на половых хромосомах. Все виды пищух, проанализированные Иваницкой (1991) имели идентичные G-окрашенные половые хромосомы. Ххромосома пищух имеет две темные G-полосы, называемые основными А и В полосами Х-хромосом млекопитающих.

В настоящее время отсутствует информация по кариотипам многих центрально-азиатских видов пищух, что затрудняет построение предкового кариотипа и оценку филогенетических связей. Предполагают, что предковый кариотип состоял из большого числа акроцентрических аутосом и содержал относительно большое количество гетерохроматина. В дальнейшем произошло разделение пищух на две филетические линии: с высоким и низким диплоидным числом (2n), эволюция которых шла достаточно независимо. Возможно, группа с высоким 2n имеет кариотипы близкие к предковому. В группе с низким 2n произошли более значительные перестройки, и эти виды обладают более продвинутыми кариотипами (Иваницкая, 1991).

Надвидовая система рода Ochotona до сих пор окончательно не разработана.

Первая надвидовая структура, основанная на цитогенетическом сходстве пищух (в основном на диплоидных числах), была предложена Воронцовым и Иваницкой (1969, 1973). В ней авторы разделили виды на четыре группы: 1) O. pusilla (2n=68), O. princeps (2n=68); 2) O. rutila (2n=62), O. macrotis (2n=62); 3) O.

rufescens (2n=60), O. dauurica (2n=50); 4) O. alpina (2n=42), O. hyperborea (2n=40), O. pallasi (2n=38). При этом O. pusilla, O. dauurica и O. pallasi – равнинно-степные виды относятся к трем разным группам, что по предположению самих авторов свидетельствует о неоднократном заселении сходных биотопов и разновозрастности групп.

В следующих работах на основе кариологических данных, по методу количественной кладистики, было выделено только два подрода (Иваницкая, 1985, 1989). Подрод Ochotona: O. pusilla, O. princeps, O. collaris, O. rutila, O.

macrotis, O. rufescens, O. dauurica. Виды этого подрода имеют аллопатрические ареалы, кроме O. rutila, O. macrotis. Подрод Pika: O. alpina, O. hyperborea, O.

pallasi. В Палеарктике обитают представители обоих подродов. Перекрытие ареалов между видами разных подродов указывает на давнее обособление и значительную адаптивную дивергенцию (Иваницкая, 1989).

Более поздний анализ обобщенных кариологических дистанций также показал деление пищух на две группы, которые соответствуют уровню подродов.

Оценку частных цитогенетических дистанций проводили по следующим относительная длина участков со сходной картиной G-исчерченности, количество гетерохроматина (Иваницкая, 1991). Первая группа (подрод) Ochotona включала четыре палеарктических вида: O. pusilla, O. rutila, O. rufescens, O. dauurica и один неарктический вид O. princeps. Во вторую группу (подрод) Pika были отнесены два палеарктических вида: O. alpina и O. pallasi. На момент проведения этого анализа не было данных по дифференциальной окраске O. collaris и O. macrotis, качество окрашенных хромосом O. curzoniae (Tan, Bai, 1987) не позволяло провести анализ, а для O. hyperborea было изучено только распределение гетерохроматина (Иваницкая, 1991). Тем не менее, в своей работе Иваницкая указывает, что корреляция частных кариологических дистанций (число и морфология хромосом, количество гетерохроматина) вполне отражает степень сходства между видами. На основании этого O. collaris, O. macrotis и O. curzoniae были отнесены к подроду Ochotona как сестринские виды для O. princeps, O. rutila и O. dauurica соответственно. Кариотип O. hyperborea по своим характеристикам занимал промежуточное положение между O. alpina и O. pallasi, такие характеристики соответствовали показателям видов подрода Pika (Иваницкая, 1991).

Интересным случаем относительной стабильности, но несомненного взаимодействия, являются зоны симпатрии разных видов. На примере пищух это явление было рассмотрено в области плато Путорана. По классическим представлениям, пищух этого плато рассматривали как O. hyperborea. Но для них была характерна широкая морфологическая изменчивость. С помощью математических методов было показано совместное обитание здесь двух форм:

крупной и мелкой. Проведенный Иваницкой с соавторами (устное сообщение) анализ промеров черепов показал, что крупная форма пищух классифицируется как O. alpina. Исследование Формозова (1991) подтвердило симпатрию мелкой и крупной форм пищух на плато Путорана, которые различались по размерам, окраске шерсти и характеру звуковых сигналов. Но обе эти формы были сходны с северными пищухами из разных локалитетов. Мелкая форма, по морфологии и звуковым сигналам, была близка O. hyperborea с Урала и Чукотки. Крупная форма размерами и окраской была похожа на северных пищух юга Сибири, а своими криками на пищух Забайкалья и Восточного Саяна. На тот момент автор отнес крупную форму к виду O. hyperborea и объяснил ее существование гибридизацией двух других форм северной пищухи.

В дальнейшем для проверки этой гипотезы был применен кариологический анализ (Формозов и др., 1999). Оказалось, что мелкая форма пищух имеет кариотип с 2n=40, не отличающийся по морфологии аутосом от кариотипа других северных пищух из Восточной Сибири (Магаданская обл.), Урала (Воронцов, Иваницкая, 1973; Иваницкая, 1991), Центральной Сибири (окр. г. Талнах в Красноярском крае), Забайкалья (окр. г. Чита), Якутии (Формозов и др., 1999) и Японии (о-в Хоккайдо) (Hayata, Shimba, 1969).

У крупной формы пищух с плато Путорана был выявлен кариотип с 2n=42, на уровне морфологии и C-исчерчености аутосом он не отличался от кариотипа алтайских пищух O. alpina (Воронцов, Иваницкая, 1973; Иваницкая, 1991). Кроме ранее выявляемых спутников на двух парах мелких субтело-акроцентриков (Иваницкая, 1985), при AgNOR окрашивании спутники были обнаружены ещё на одной паре мелких метацентриков (Формозов и др., 1999).

Дифференциальное C- и G-окрашивание не выявило различий между мелкими пищухами Центральной Сибири (плато Путорана и окр. Талнах) и Забайкалья (окр. Читы) (Формозов и др., 1999). Но по сравнению с данными Сокрашивания пищух Магаданской обл. (Иваницкая, 1991), эти пищухи имели прицентромерный гетерохроматин на первой самой крупной паре метацентрических аутосом. Зверьки мелкой формы, а также из окр. Талнах и Читы, отличались от O. hyperborea из Магаданской обл. по характеру AgNOR окрашивания и имели ядрышкообразующие (NOR) районы на двух парах мелких метацентриков, одной паре средних субметацентриков и одной паре средних субтелоцентриков (Формозов и др., 1999). У северных пищух Магаданской обл.

NOR районы были выявлены на двух парах мелких субтелоцентриков (Иваницкая, 1985).

Таким образом, по сходству общей структуры и дифференциального окрашивания кариотипов мелкая форма пищух была отнесена к виду O.

hyperborea, а крупная форма к виду O. alpina (Формозов и др., 1999). Это подтвердило предположение Иваницкой, сделанное по результатам промеров черепов. Гипотеза же о гибридном происхождении крупной формы пищух с плато Путорана не была подтверждена (Формозов, 1991). Удалось определить общность O. hyperborea (мелкой формы) с плато Путорана и O. hyperborea из северных частей ареала (Магадана и Урала) по звуковым сигналам, но различающихся по количеству блоков гетерохроматина и NOR участков на хромосомах. В то время как северные пищухи Забайкалья характеризовались специфическими звуковыми сигналами, они не отличались от O. hyperborea плато Путорана по Cисчерчености и AgNOR (Формозов и др., 1999). Другой аспект – сходство звуковых сигналов O. alpina (крупной формы с плато Путорана) и некоторых подвидов O. hyperborea – авторы объяснили параллелизмом в изменчивости частотных характеристик предупреждающих сигналов и указали на подобные случаи для других видов рода Ochotona (Формозов, 1991).

Исследования звуковых сигналов O. hyperborea показали разделение северных пищух на три географические расы: северная (Чукотский полуостров, Магаданская обл.), южная (Республика Бурятия, Забайкальский край) и восточная (Еврейская Автономная обл., Приморский край, о-ва Сахалин и Хоккайдо).

Пищухи Дальнего Востока вошли в северную и восточную расы (Лисовский, 2005, 2012; Lissovsky, 2007).

Вопрос о филогенетических отношениях O. pusilla и O. princeps. Исходя из близости ареалов и некоторых морфологических признаков, первоначально существовало предположение о родстве O. hyperborea, O. princeps и O. collaris, которые ранее даже рассматривались как подвиды O. alpina (Гуреев, 1964). Но подобные экологические и адаптационные сходства, вероятно, являются результатом конвергенции. До исследования кариотипов предполагалась плейстоценовая миграция вида родственного O. hyperborea, который сближался с североамериканскими видами (Иваницкая, 1989). Но сравнение кариотипов палеарктических и неарктических пищух опровергло эту гипотезу (Воронцов, Иваницкая, 1973). O. hyperborea и американские виды были отнесены к разным подродам. Предположительно проникновение общих предков O. pusilla и O.

princeps в Северную Америку должно было произойти до заселения O. hyperborea на северо-востоке Азии в эуплейстоцене около 30 000 лет назад (Воронцов, Иваницкая, 1973; Иваницкая, 1989). По уточненным данным миграция в Новый Свет происходила в одном направлении и однократно не позднее конца плиоцена (Формозов и др., 1999). Так как «самостоятельное развитие O. pusilla прослеживается, начиная с позднего плиоцена», а «формирование O. princeps и O.

collaris произошло на территории Северной Америки не позднее раннего плейстоцена» (Ербаева, 1988, стр. 204). В прошлом O. pusilla был широко распространена от Британских островов, во Франции, Крыму, на Среднем и Северном Урале. Сейчас ареал этого вида на западе доходит до Среднего Заволжья, не проходя за правый берег Волги. Сокращение ареала было связано с увлажнением климата на территории Европы в голоцене. К востоку от нынешней границы ареала, по предгорьям Алтая, ископаемые останки O. pusilla не найдены (Иваницкая, 1989; Соколов и др., 1994).

С привлечением молекулярно-генетических методов систематика пищух получила новое развитие. Первоначально проводился лишь сравнительный анализ структуры цитохрома b (Yu et al., 2000; Niu et al., 2004). Молекулярные исследования (Yu et al., 2000; Формозов и др., 2003) показали разделение современных пищух рода Ochotona на три надвидовые группы, которые соответствуют подродам (Hoffmann, Smith, 2005): 1. Pika – североазиатские и американские петрофилы, и монгольская пищуха; 2. Ochotona – пищухи-норники, за исключением монгольской, ладакской и пищухи Козлова; 3. Conothoa – южные петрофилы вместе с ладакской и пищухой Козлова. Н. А. Формозов с соавторами (2003) предположили существование характерного уровня варьирования диплоидного числа хромосом для каждого подрода. Виды подрода Pika имеют кариотипы с 2n=38-42. В подроде Ochotona кариотипы пищух содержат 2n=46-50.

Хромосомные наборы у представителей подрода Conothoa имеют 2n=60-62. При этом в каждом подроде присутствуют виды с 2n=68, такой кариотип рассматривается как плезиоморфный. Судя по характеру кариотипических различий, разделение на подроды произошло ещё в плиоцене, притом, что именно в этот период происходит интенсивное освоение пищухами различных ландшафтов. Этот процесс сопровождался значительными перестройками хромосомных наборов, также предполагают, что часть промежуточных форм вымерло во время плейстоценовых оледенений (Иваницкая, 1989).

В работе посвященной молекулярной систематике подрода Pika (Формозов и др., 2006) был использован более вариабильный ген контрольного региона (Срегион) мтДНК. При рассмотрении структуры подрода Pika и внутривидовой изменчивости входящих в него видов, в анализ были включены и несколько видов из подрода Ochotona. Это позволило авторам сделать ряд предположений относительно соотношения двух подродов и спорного положения степной пищухи O. pusilla. Исследование показало, что O. pusilla сближается с подродом Ochotona притом что O. princeps и O. collaris являются базальной группой в составе подрода Pika. Такое положение O. pusilla согласуется с кариологическими данными (Иваницкая, 1991) и не противоречит данным анализа генов цитохрома b и ND4 мтДНК (Yu et al., 2000). Также было подтверждено отнесение O. pallasi к подроду Pika как по молекулярно-генетическим данным (Yu et al., 2000; Niu et al., 2004), так и по цитогенетическому сходству с северной и алтайской пищухами (Воронцов, Иваницкая, 1973; Иваницкая, 1991). В один кластер с монгольской пищухой была объединена алашанская пищуха O. argentata (Формозов и др., 2006) ранее считавшаяся подвидом O. alpina.

На основе молекулярного анализа Н. А. Формозов с соавторами (2006) сделали попытку прояснить таксономический статус ряда малоизученных форм подрода Pika. Предположительно еще неописанная форма Ochotona sp., из Центральной Якутии, оказалась в одном кластере с O. pallasi и O. argentata. По окраске шерсти эта форма близка северной пищухе, но черепа не похожи ни на один известный вид. По С-региону мтДНК Ochotona sp. крайне сходна с монгольской пищухой из Тувы, однако экология этих двух видов совершенно различна. Монгольская пищуха обитает в сухих центрально-азиатских горных степях, а типичным местообитанием Ochotona sp. являются завалы плавника на островах р. Лена, из которых эта форма исчезла с начала 80-х гг. (Формозов и др., 2006). Хромосомный набор этой формы не исследован. Единый кластер с O.

hoffmanni образовала еще одна форма O. alpina scorodumovi, обитающая в междуречье Шилки и Аргуни. Обе эти пищухи имеют близкие ареалы. Окраской и размерами O. alpina scorodumovi сходна с алтайской пищухой, но по характеру звуковых сигналов ее положение неоднозначно (Формозов, 1991). К югу на хр.

Большой Хинган обитает форма O. hyperborea mantchurica, и авторы предположили, что эти две формы могут быть конспецифичны (Формозов и др., 2006). Также была исследована крупная форма O. alpina turuchanensis с плато Путорана в зоне симпатрии с O. hyperborea. Результаты анализа С-региона мтДНК показали, что эти пищухи конспецифичны O. alpina. В этот же кластер вошла и другая форма из Якутии (окр. пос. Едяй) Ochotona alpina ssp., у которой описан кариотип 2n=40 (Формозов и др., 1999). Звуковые сигналы этих пищух идентичны таковым у O. alpina turuchanensis (Формозов и др., 2006). Вопрос о хромосомном полиморфизме O. alpina или гибридном происхождении мтДНК в популяции O. hyperborea с плато Путорана остается открытым.

Последние данные по цитогенетике пищух еще раз демонстрируют необходимость комплексного подхода к выяснению систематического положения исследуемого объекта и к проблеме вида в целом. Для маньчжурской пищухи O.

mantchurica из междуречья Шилки и Аргуни был восстановлен видовой статус (Формозов, Баклушинская, 2011). Это крупные, относительно темноокрашенные пищухи, которых рассматривали как подвид O. alpina scorodumovi (Соколов и др., 1994; Hoffmann, Smith, 2005). Позднее по результатам анализа С-региона мтДНК было выяснено, что O. alpina scorodumovi образует единый кластер с O. hoffmanni – базальный для O. hyperborea (Формозов и др., 2006) и, следовательно, не является O. alpina. Маньчжурская пищуха хорошо отличалась от O. hoffmanni по размерам, окраске и предупреждающим об опасности сигналам (Формозов, Баклушинская, 1999). Как уже отмечалось систематическое положение O. alpina scorodumovi зависело от статуса другой формы – O. hyperborea mantchurica (Формозов и др., 2006; Формозов, Баклушинская, 2011). Эти формы оказались конспецифичны, и для них было принято название O. mantchurica scorodumovi (Григорьева и др., 2007; Lissovsky et al., 2007). Дальнейшее расширенное изучение утвердило независимость этого таксона. К нему были отнесены пищухи из междуречья Шилки и Аргуни, и северной Манчжурии, образующие гомогенную группу по генетическим данным анализа цитохрома b мтДНК. Уровень отличий от других видов, по краниометрическим признакам, соответствовал уровню межвидовых различий в группе “alpina – hyperborea”. Также указывалась достаточная степень специфичности вокализации (Lissovsky et al., 2007, 2008).

Тогда возникла необходимость восполнить пробел кариологических данных.

Было показано, что река Шилка на протяжении 250 км является границей ареалов O. mantchurica и O. hyperborea, симпатрия этих видов не была подтверждена (Формозов, Баклушинская, 2011). Цитогенетически были изучены только O.

mantchurica расследования левый берег должна была занимать O. hyperborea. Кариотип маньчжурской пищухи с 2n=40 оказался идентичен кариотипу северной и еще одной формы O. alpina turuchanensis из Якутии, окр. пос. Едяй (Формозов, Баклушинская, 2011). Тем самым очевидно, что маньчжурская пищуха не относится ни к виду O. alpina (2n=42), ни к O. hoffmanni (2n=38). При этом пока невозможно установить независимо ли O. mantchurica и O. hyperborea приобрели одинаковое диплоидное число хромосом или это их плезиоморфный признак. Но появление 40 хромосом, у формы из окр. пос. Едяй, в кладе O. alpina можно считать независимым (Формозов, Баклушинская, 2011). В итоге было показано, что в междуречье Шилки и Аргуни обитает предположительно два подвида O.

mantchurica mantchurica и O. m. scorodumovi (Формозов, Баклушинская, 2011).

Также этот вид распространен на хр. Большой Хинган и возможно проникает на хр. Малый Хинган на северо-востоке Китая, часть отрогов которого заходит на юг Дальнего Востока России (Yu et al., 2000; Lissovsky et al., 2008).

Как и в случае с O. pallasi и O. argentata, крупной формой O. alpina с плато Путорана и O. alpina turuchanensis из окр. пос. Едяй, возникает вопрос самостоятельного вида. Окраской и размерами O. mantchurica сходна с O. alpina (Соколов и др., 1994; Hoffmann, Smith, 2005), по звуковым сигналам устойчиво отличается от северных пищух (Формозов, 1991). Но низкое генетическое разнообразие O. mantchurica (Формозов и др., 2006), обнаружение интрогрессии ядерной ДНК (Григорьева и др., 2010) и идентичность кариотипов северной и маньчжурской пищух, указывает на возможность гибридизации этих видов (Формозов, Баклушинская, 2011).

На Дальнем Востоке России обитает один вид пищух – северная пищуха O.

hyperborea. На данной территории ареал этого вида простирается от Чукотского полуострова до южных отрогов хр. Сихотэ-Алинь в Приморском крае, включает о-ва Сахалин и Хоккайдо (Япония) (Соколов и др., 1994; Лисовский, 2012).

Таксономический статус и изменчивость пищух, на дальневосточной части ареала, изучены слабо. В плане молекулярно-генетического изучения, митохондриальный ген цитохрома b достаточно консервативен и не всегда пригоден для изучения внутривидовой изменчивости. Особенно это касается северной пищухи O. hyperborea – вида с самым большим ареалом, на котором выделяют от 5 до 12 подвидов (Формозов и др., 2006) и 3 – 4 «биоакустические»

формы (Формозов, 1991; Lissovsky et al., 2007). Проникновение другого вида O.

mantchurica в горные массивы Малого Хингана в России не исследовано.

1.3. Гетерохроматин: структура, функции и роль в изменчивости кариотипа В начале ХХ века, ещё до открытия ДНК, при изучении клеточных ядер исследователи наблюдали в них более темноокрашенные включения. Эти участки хроматина интерфазных ядер были названы хромоцентрами. Тоже было отмечено и для некоторых фрагментов хромосом во время клеточного деления – интенсивно окрашенные и конденсированные участки по сравнению со слабоокрашенными. Такие участки становились заметны в начале профазы, при конденсации хромосом, затем различия в интенсивности окраски постепенно снижались и исчезали в конце метафазы (Жимулёв, 2000). Эмиль Хайц проанализировал соотношение интенсивно окрашенных участков при митозе хромосом и хромоцентров, обнаруживаемых в интерфазе, и пришёл к выводу, что это одни и те же структуры, которые не подвергаются деконденсации в телофазе.

В 1928 г. Э. Хайц предложил термины «эухроматин» для участков хромосом, претерпевающих процесс компактизации-декомпактизации в процессе митоза и «гетерохроматин» для участков, постоянно остающихся в компактизованном состоянии (Жимулёв, 1993). Первоначально понятие гетерохроматина имело только морфологическое значение, так как на цитологических препаратах нельзя установить может ли данный участок конденсированного хроматина перейти в эухроматическое состояние или нет. В дальнейшем было отмечено, что уровень конденсированного хроматина в интерфазных ядрах может быть различным.

Термины, предложенные Э. Хайцем, стали применяться при изучении конденсации, коррелирующей с ней активности хроматина и постоянства гетерохроматина, оказавшегося чрезвычайно сложным элементом с разнообразной структурой, свойствами и функциями.

Таким образом, гетерохроматин – это участки хроматина, находящиеся в конденсированном (плотно упакованном) состоянии практически в течение всего клеточного цикла. Эти участки интенсивно окрашиваются ядерными красителями и хорошо видны при световой микроскопии даже во время интерфазы.

Дальнейшие исследования тонкой организации и функционирования гетерохроматина, как и многих других проблем в генетике, проводили на плодовой мушке – дрозофиле. Основная масса генов дрозофилы локализована в эухроматине, который доступен для визуального анализа благодаря наличию политенных хромосом.

1.3.1. Свойства, структура и функции гетерохроматина Гетерохроматин обнаружен в геноме всех изученных эукариот, и его количество у каждого вида довольно велико. Так в геноме дрозофилы около 30% гетерохроматина (Коряков, Жимулёв, 2009). Доля гетерохроматина у человека около 16% генома. У других млекопитающих на него приходится 10-15% генома.

А у некоторых амфибий до 60% (обзор Энглевский, 2010). Гетерохроматиновые районы могут локализоваться в любой части хромосом, но чаще всего конденсированными оказываются центромерные и теломерные участки. Кроме того, на некоторых участках плеч хромосом может выявляться вставочный или интеркалярный гетерохроматин. У многих видов X-хромосомы имеют большие участки гетерохроматина, а Y-хромосомы полностью гетерохроматизованы (Прокофьева-Бельговская, 1986). В цитологии был разработан специфический метод дифференциального окрашивания хромосом – С-окраска (C-staining), с помощью которого можно выявить отдельные блоки конститутивного гетерохроматина.

Для гетерохроматина характерны особые свойства, отличающие его от эухроматина (Жимулёв, 2000; Коряков, Жимулёв, 2009):

1. Гетерохроматиновые районы хромосом, как правило, реплицируются позже эухроматиновых и этот процесс идет дольше.

2. Эухроматин отличается от гетерохроматина менее плотной упаковкой, находиться в конденсированном состоянии только при митотическом или мейотическом делении. В интерфазе эухроматин декомпактизуется, гетерохроматин находиться в компактизованном состоянии в течение всего клеточного цикла.

3. Основная часть гетерохроматина представлена высокоповторенными последовательностями ДНК и имеет небольшое число активных генов.

гетерохроматине находятся, в основном, белки инактивации транскрипции и большое количество негистоновых белков.

5. Гетерохроматин способен компактизовать рядом расположенные участки эухроматина и инактивировать гены, проявляя тем самым «эффект положения».

6. Участки гетерохроматина способны объединяться, образуя хромоцентры.

Гетерохроматиновые районы чаще участвуют в хромосомных перестройках, но имеют пониженную частоту мейотической рекомбинации.

По одной из гипотез отличительные свойства гетерохроматина обусловлены специфическим составом его белковых компонентов. Были найдены гены, при мутации которых усиливается или подавляется инактивация эухроматиновых генов, находящихся в зоне гетерохроматина. Дальнейшие исследования показали, что большое значение имеют посттрансляционные модификации гистонов, такие как гипоацетилирование и метилирование (Жимулёв, 1993; Mattei, Luciani, 2003).

Широкий охват исследования гетерохроматина представлен в монографии А. А.

Прокофьевой-Бельговской «Гетерохроматические районы хромосом» (1986).

Согласно представлениям автора, гетерохроматином является жестко спирализованный хроматин, видимый в интерфазном ядре и конденсированный по внутренней мембране. И этот «щит» образует внутриядерный барьер, где адсорбируются различные вещества и экзогенные вирусы, следующие из цитоплазмы в ядро (Прокофьева-Бельговская, 1986; обзор Энглевский, 2010).

В настоящее время, после многочисленных исследований, гетерохроматин считается особым состоянием, а не структурой (Коряков, Жимулёв, 2009). Тем не менее, для него характерны не только вышеописанные свойства, но и особая гетерохроматин сопровождается модификацией гистонов и усложнением состава за счёт присоединения белка гетерохроматина HP1 (Heterochromatin Protein 1).

Низкая степень ацетилированности гистонов, по лизиновым остаткам, увеличивает их основные свойства и, соответственно, связывание с кислыми фосфатными группами ДНК, что способствует компактизации комплекса. Другой важный процесс, при образовании гетерохроматина, это метилирование 9-го лизинового остатка гистона H3 метилтрансферазой. В результате метилирования гетерохроматина HP1 (Mattei, Luciani, 2003).

Например, гетерохроматин дрозофилы на раннем этапе формируется по механизму интерференции РНК, когда малые РНК воздействуют посредством RITS комплекса на будущие участки гетерохроматина. На следующем этапе происходит замена гистона H2A гистоном H2Av, что запускает процессы ацетилирования H4K12 и деацетилирования H3K9 и H3K14. В дальнейшем 9-й и 14-й лизиновые остатки гистона H3 метилируются. У дрозофил метилтрансфераза Su(var)3-9 функционально ассоциирована с гистондеацетилазой, следовательно, метилированное и ацетилированное состояние лизиновых остатков гистона H взаимоисключают друг друга. Таким образом, действует единый механизм деацетилирования и метилирования гистона H3, ведущий к усилению связывания модифицированному гистону способствует связыванию метилтрансферазы триметилирующей гистон H4K20 (Mattei, Luciani, 2003; Жимулёв и др., 2004).

По степени конденсации различают конститутивный (структурный) и факультативный гетерохроматин. Конденсация факультативного гетерохроматина это временное явление, в то время как конститутивный гетерохроматин остается в конденсированном состоянии всегда. Факультативный гетерохроматин окрашивается в стандартных условиях азур-эозином по Романовскому, конститутивный гетерохроматин выявляется после предобработки, денатурацииренатурации ДНК, в виде специфического рисунка блоков или полос (C-banding) (Жимулёв, 1993; Mattei, Luciani, 2003).

Характерным примером факультативного гетерохроматина служит вторая Ххромосома у женских особей млекопитающих, которая в раннем эмбриогенезе инактивируется путем её необратимой конденсации; такая гетерохроматиновая Xхромосома наблюдается в интерфазе как тельце Барра (Mattei, Luciani, 2003). Но после оплодотворения, в зиготе мужского организма следующего поколения, она снова будет активирована. Клетки мужской особи имеют деконденсированную Xхромосому, она активно транскрибируется и не выявляется морфологически в интерфазе. Кроме того, при гаметогенезе и на ранних стадиях эмбриогенеза обе X-хромосомы самок являются эухроматиновыми и транскрипционно активными.

Факультативный гетерохроматин способен переходить в эухроматиновое состояние и становиться транскрипционно активным, соответственно, происходит экспрессия генов, локализованных в данных районах хромосомы. Вследствие этого на этих участках кодирующая ДНК остается относительно консервативной (Mattei, Luciani, 2003). В дифференцированных клетках тканей активно экспрессируются около 10% генов, остальные гены инактивированны в виде факультативного гетерохроматина. До момента дифференциации факультативный гетерохроматин подавляет и эти тканеспецифичные гены.

Конститутивный (структурный) гетерохроматин чаще содержится в обеих гомологичных хромосомах, преимущественно в центромере, теломере, ядрышковом организаторе. В большей степени генетически не активен, обеднен генами, обогащен сателлитной ДНК (HS1 (Human Satellite 1), HS2, HS3, альфасателлит человека) и подвижными элементами (транспозоны) (Mattei, Luciani, 2003). Так как ДНК конститутивного гетерохроматина преимущественно некодирующая, то она высокополиморфна и проявляет высокую частоту хромосомных аберраций (дупликации, делеции и др.), в том числе и близко расположенных локусов при «эффекте положения».

В общем случае гетерохроматиновые районы определяют поведение хромосом в митозе, мейозе, и их пространственную организацию в неделящемся ядре, активность рядом расположенных генов. Основные направления исследований гетерохроматина: возникновение гетерохроматиновых повторов и их эволюция, молекулярная природа и закономерности инактивации, проявление «эффекта положения гена», функции защиты генома, гомологичность гетерохроматина у разных видов, участие в хромосомных перестройках, эволюции кариотипов и влияние на формирование генетических барьеров.

В составе гетерохроматина обнаруживаются различные типы повторов:

высоко- и умеренноповторенные сателлитные ДНК, а также разные типы подвижных генетических элементов. Предполагается что, подвижные элементы образуют кластеры отражающие процессы эволюции генома. Сателлитная ДНК выявляется, в основном, в районе центромеры (Жимулёв, 2000), но ее необходимость для образования и функционирования этой структуры при расхождении хромосом остается спорной (Подгорная и др., 2009). Специфические фракции сателлитной ДНК в интеркалярном гетерохроматине могут быть сайтами активного связывания белков сайленсинга. Это указывает на то, что сателлиты регулируют концентрацию белков (энхансеров и сайленсеров) и участвуют в эпигенетическом контроле эухроматиновых генов (Жимулёв и др., 2004).

Имеются сведения о присутствии в гетерохроматине генов рибосомных РНК жизненно необходимых для каждой клетки (Жимулёв, 2000). В интерфазном ядре они обнаруживаются в фибриллярном центре ЯОР (ядрышковый организатор).

Такие гены также составляют повторы или копии и образуют связь с ядерным матриксом. Неактивные повторы обладают нуклеосомной организацией, тогда как активные не формируют такой структуры. Единичные мутации отдельных рибосомных генов, в гетерохроматиновых районах, не оказывают существенного влияния из-за их умеренного повторения в геноме.

На сегодняшний день известно, что в гетерохроматине имеются активно экспрессирующиеся гены. Одним из первых был обнаружен кластер генов Stellate в гетерохроматином участке Х-хромосомы дрозофилы. По аминокислотному составу, белок с этих генов близок к регуляторной субъединице протеинкиназы, участвующей в регуляции клеточного деления и конденсации хромосом. Функция белка Stellate до конца не выяснена, однако его изменчивость ограничена сильным давлением отбора, что указывает на его значимость в биохимических процессах (Жимулёв, 2000).

Роль гетерохроматиновых районов в инактивации ДНК пока исследована не столь детально. Явление гетерохроматизации может распространяться на протяженные участки. Гетерохроматизация находящихся в этих районах генов часто сопровождается подавлением транскрипции (Жимулёв и др., 2004). При удалении части повторяющихся генов из кластера, остающиеся гены способны реактивироваться (Mattei, Luciani, 2003). Таким образом, просматривается единый механизм регуляции активности, как гетерохроматиновых повторов, так и взаимной инактивации эухроматиновых повторов генома.

В 1935 г. Н. П. Дубининым и Б. Н. Сидоровым был описан «эффект положения гена». Это наиболее известное свойство гетерохроматина влияющее на генетическую активность соседних эухроматиновых районов. Данный эффект заключается в том, что при хромосомной перестройке ген, расположенный в эухроматине, оказывается вблизи гетерохроматина, и тем самым инактивируется или ведет себя как структурно измененный (Жимулёв, 1993). Например, при инверсии в половой хромосоме дрозофилы перемещение гетерохроматинового участка изменяет действие гена w+ (красные глаза) – у самок дрозофилы появляются глаза с красными и белыми пятнами (Жимулёв, 2000). Действие «эффекта положения гена» может быть обратимо. Была выявлена зависимость инактивации генов от общей массы прилегающего гетерохроматина, от характерной структуры гетерохроматиновых участков и их взаимоположения.

В заключение можно констатировать существенную роль гетерохроматина в функционировании, регуляции и сохранении важных участков генетической информации. Не менее важно наличие гетерохроматиновых генов, их реализация, а также влияние на всю структурную организацию хромосом. Биомедицинские исследования показали, что возникновение функциональных нарушений или структурные изменения гетерохроматина приводят к различным патологиям организма. Повышение содержания гетерохроматина в ядрах клеток мозга наблюдается у людей с заболеванием Альцгеймера, в условиях гипоксии или при воздействии радионуклидов. В этих случаях предполагается участие гетерохроматина в адаптации организма к некоторым экстремальным факторам среды (обзор Энглевский, 2010). Описана связь гетерохроматина с развитием иммунодефицитного генетического синдрома – ICF (Immunodeficiency, Centromeric instability and Facial anomalies). При данном синдроме цитогенетически выявляется нестабильность и образование ветвящихся структур в центромерных гетерохроматиновых районах хромосом №№ 1, 9, 16, реже 2 и 10.

В дальнейшем было обнаружено, что к заболеванию приводит мутация гена в сегменте 20q12, который кодирует ДНК-метилтрансферазу (DNMT3B). В результате происходит нарушение метилирования сателлитной ДНК, локализованной в центромерном гетерохроматине, что и ведет к нестабильности этих участков генома (Mattei, Luciani, 2003).

Биологическое значение гетерохроматина остается в значительной степени не выясненным. На этот счет строится множество предположений, но обладая уже известными важными функциями, его роль не может быть однозначной. Поэтому выявление новых особенностей функционирования этого специфического состояния хроматина является одной из фундаментальных задач молекулярной биологии.

1.3.2. Содержание гетерохроматина как цитогенетический признак и его Основными характеристиками кариотипа являются диплоидное число хромосом (2n), их морфология и общее число хромосомных плеч (NF). Этот набор параметров характерен для каждого вида и поэтому кариотип может быть таксономическим признаком. С другой стороны внутри- и межпопуляционная изменчивость хромосом может увеличивать внутривидовое разнообразие и приводить к генетической изоляции. Явление хромосомного полиморфизма рассматривается как активное проявление эволюционных процессов на уровне хромосомных наборов. Другой важной формой преобразования хромосом в эволюции являются перестройки гетерохроматиновых участков хромосом.

Делеции и дупликации этих участков играют важную роль в хромосомной эволюции.

С появлением методов дифференциального окрашивания хромосом началось интенсивное изучение структурного гетерохроматина. В кариосистематике изменчивость гетерохроматина, его роль в хромосомных перестройках и как диагностического признака видов со сходными кариотипами хорошо известна.

Так в роде Peromyscus – оленьи хомячки, изменчивость числа хромосомных плеч (NF) обусловлена делециями и дупликациями гетерохроматиновых участков (Hsu, Arrighi, 1966, 1971; Duffey, 1972). Виды лесных (Sylvaemus) и полевых (Apodemus) мышей при стабильном числе хромосом основного набора хромосом (2n=46, 48) имеют различное число и локализацию как NOR районов (Боескоров и др., 1995), так и С-блоков (Картавцева, 2002б; Карамышева и др., 2010; Рубцов и др., 2011).