«СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ И МУКОЗАЛЬНЫХ СЕКРЕТОВ У ЗДОРОВЫХ МУЖЧИН И ЖЕНЩИН ...»

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего

профессионального образования «Южно-Уральский государственный

медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской

Федерации

На правах рукописи

Маркова Виталия Александровна

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ

НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ

И МУКОЗАЛЬНЫХ СЕКРЕТОВ У ЗДОРОВЫХ МУЖЧИН И

ЖЕНЩИН

14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

Долгушин Илья Ильич Заслуженный деятель науки РФ, член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Челябинск -

СОДЕРЖАНИЕ

Введение

Глава 1 Нейтрофильные гранулоциты – клетки врожденного иммунитета (обзор литературы)

1.1 Нейтрофильные гранулоциты и гетерогенность их популяции................. Современные методы оценки функциональной активности 1. нейтрофильных гранулоцитов

Внеклеточные ловушки как новый механизм внеклеточной 1.2. бактерицидности нейтрофильных гранулоцитов

Проточная цитофлюориметрия как современный метод 1.2. иммунодиагностики

Глава 2 Материалы и методы исследования

2.1 Характеристика обследуемых лиц

2.2 Материал для исследования

2.3 Получение лейкоцитарной взвеси

2.4 Выделение нейтрофилов из периферической венозной крови................. 2.5 Метод забора материала из вагинального и цервикального секрета репродуктивного тракта женщин

2.6 Метод забора слюны

2.7 Активация нейтрофильных гранулоцитов иммуностимуляторами........... 2.8 Методы обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек ................ Метод обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек в 2.8. фиксированных препаратах цельной крови

Метод обнаружения внеклеточных ловушек, образованных 2.8. нейтрофильными гранулоцитами, выделенными из периферической крови

2.8.3 Метод обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек в мукозальных секретах

Исследование функциональной активности нейтрофильных 2. гранулоцитов

2.9.1 Метод определения фагоцитарной активности нейтрофильных гранулоцитов мукозальных секретов с помощью световой микроскопии..... Определение фагоцитарной активности нейтрофильных 2.9. гранулоцитов периферической крови методом проточной цитофлюориметрии

2.9.3 Метод оценки внутриклеточного кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов мукозальных секретов с помощью НСТ-теста

2.9.4 Определение внутриклеточного кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов периферической крови методом проточной цитофлюориметрии

2.9.5 Метод определения лизосомальной активности нейтрофильных гранулоцитов мукозальных секретов

2.10 Определение рецепторов CD11b и CD95 на нейтрофильных гранулоцитах методом проточной цитофлюориметрии

2.11 Методы статистической обработки материала

Глава 3 Особенности функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов слюны, вагинального и цервикального секретов......... Оценка соотношения морфологических форм интактных 3. нейтрофильных гранулоцитов и количества нейтрофильных внеклеточных ловушек в слюне, вагинальном и цервикальном секретах. 3.2 Оценка лизосомальной активности интактных нейтрофильных гранулоцитов в различных мукозальных секретах

3. гранулоцитов в различных мукозальных секретах

3. интактных нейтрофильных гранулоцитов в различных мукозальных секретах

Глава 4 Функциональный ответ нейтрофильных гранулоцитов слюны, вагинального и цервикального секретов на стимуляцию пирогеналом и форбол-12-миристат-13-ацетатом

4.1 Влияние пирогенала и ФМА на соотношение морфологических форм нейтрофильных гранулоцитов и количества нейтрофильных внеклеточных ловушек в слюне, вагинальном и цервикальном секретах.. 4.2 Оценка лизосомальной активности нейтрофилов мукозальных секретов после активации пирогеналом и ФМА

4. различных мукозальных секретов в ответ на стимуляцию пирогеналом и ФМА

4.4 Оценка показателей НСТ-теста нейтрофилов слюны, вагинального и цервикального секретов в ответ на стимуляцию пирогеналом и ФМА...... Глава 5 Особенности функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов цельной крови, лейкоцитарной взвеси и чистой фракции до и после активации у здоровых женщин и мужчин............... 5.1 Оценка количества внеклеточных ловушек, присутствующих в цельной крови, лейкоцитарной взвеси и чистой фракции нейтрофилов, до и после активации пирогеналом и ФМА

5.2 Оценка функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов методом проточной цитофлюориметрии

5.3 Изменение экспрессии рецепторов CD11b и CD95 на нейтрофильных гранулоцитов периферичемкой крови до и после активации ФМА............... Заключение

Выводы

Список наиболее часто используемых сокращений

Список литературы

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования и степень ее разработаности врожденной иммунной системы и выполняют основные функции – уничтожение патогенных микроорганизмов, таких как бактерии, грибы и паразиты, а так же предотвращение их распространения в организме [163, 169]. Это профессиональные охотники за микробами, обладающие самой высокой подвижностью среди всех клеток организма [85].

Более века исследователи всего мира изучают строение и физиологию нейтрофильных гранулоцитов, биохимический состав их гранул, структуру синтезируемых ими метаболитов и роль этих клеток в регуляции иммунного ответа [41, 76, 70, 73].

Нейтрофил оснащен богатым набором рецепторов, которые позволяют чутко и дифференцированно реагировать на малейшие изменения окружающей среды [28, 63, 137]. Они первые приходят в очаг воспаления, где проявляют разнообразные виды активности [85]. Подготовленный нейтрофил может оказывать свое действие на объект, вызвавший его активацию, различными способами: фагоцитировать и уничтожать его в фаголизосомах или выделять наружу бактерицидные продукты, которые представляют собой содержимое гранул [15].

Нейтрофильные гранулоциты являются самыми многочисленными из лейкоцитов. Их количество в периферической крови поддерживается на постоянном уровне благодаря притоку из костного мозга [163]. Основная часть морфологически зрелых нейтрофилов остается в костном мозге, лишь небольшая доля поступает в кровоток [27, 41, 85, 92]. Большая часть нейтрофильных гранулоцитов функционируют в тканевых депо и в секретах слизистых оболочек: цервикальной и вагинальной слизи, бронхоальвеолярном секрете, слюне, слизи, покрывающей кишечный эпителий [17, 93]. При этом на поверхности слизистых оболочек встречается большое количество жизнеспособных и функционально активных нейтрофильных гранулоцитов [18, 67, 60].

комплексом факторов иммунной защиты, являясь надежным барьером на продуцируют различные биологически активные вещества (цитокины, ферменты, свободные радикалы и др.) и осуществляют неспецифическую защиту слизистых оболочек [56].

врожденного иммунитета, безусловно, явилось началом нового этапа в понимании жизненного цикла и функции нейтрофильных гранулоцитов [106, 62].

Нейтрофильные внеклеточные ловушки связывают микроорганизмы, предотвращая их распространение, при этом они создают высокую уничтожить патогенны [106].

Формирование внеклеточных ловушек может осуществляться только активированными нейтрофилами. Эффект антимикробных веществ во внеклеточном пространстве усиливается в структурах внеклеточных ловушек [107].

гранулоцитов и нейтрофильных внеклеточных ловушек, многие вопросы остаются не раскрытыми и по сегодняшний день. До конца не исследована способность нейтрофилов, присутствующих в различных мукозальных секретах, цельной крови и лейкоцитарной взвеси, к экструзии ДНК, неясно, как изменится морфологический состав и функциональная активность популяции нейтрофилов слизистых оболочек после воздействия экзогенных факторов микробной и немикробной природы. Остается также открытым вопрос о гетерогенности популяции нейтрофильных гранулоцитов цельной крови и распределению рецепторов в субпопуляциях нейтрофилов в зависимости от содержания в них гранул.

Изучить показатели функциональной активности интактных и активированных нейтрофильных гранулоцитов цельной периферической крови и мукозальных секретов у здоровых мужчин и женщин.

1. Определить соотношение морфологических форм нейтрофильных гранулоцитов и количество внеклеточных ловушек, входящих в состав слюны, цервикального и вагинального секретов.

2. Оценить функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов слюны, цервикального и вагинального секретов.

3. Изучить влияние экзогенных факторов микробной и немикробной природы на соотношение морфологических форм и функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов слюны, цервикального и вагинального секретов.

4. Определить количество внеклеточных ловушек, содержащихся в цельной крови, лейкоцитарной взвеси и чистой фракции нейтрофилов, у здоровых мужчин и женщин до и после воздействия активаторов микробной и немикробной природы.

5. Исследовать экспрессию рецепторов CD11b и CD95 в различных периферической крови у здоровых мужчин и женщин.

В исследовании принимали участие 30 практически здоровых мужчин и 30 практически здоровых небеременных женщин в первую и вторую фазы менструального цикла, чей возраст варьировался от 18 до 35 года. У всех обследуемых забиралась периферическая венозная кровь и слюна, у женщин дополнительно происходил забор цервикального и вагинального секретов на 7-10 и 21-23 дни менструального цикла.

Для определения количества внеклеточных ловушек до и после активации применялся метод обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек в фиксированных препаратах цельной крови при окрашивании по Романовскому-Гимзе, при окрашивании акридиновым оранжевым, а также метод обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек в мукозальных секретах с использованием красителей синьки Эванса и Sytox Green. Для неактивированных нейтрофильных гранулоцитов мукозальных секретов кислородзависимый метаболизм и лизосомальную активность.

гепаринизированной венозной крови были определены фагоцитарная активность и внутриклеточный кислородзависимый метаболизм нейтрофильных гранулоцитов. По показателям прямого и бокового светорассеивания вся популяция нейтрофилов была разделена на две субпопуляции, в каждой из которой была посчитана экспрессия рецепторов CD11b и CD95.

Степень достоверности, апробация результатов, личное участие Объем фактического материала, арсенал использованных методов исследования, статистическая обработка полученных результатов адекватны поставленной цели и решаемым задачам. Исследования выполнены на сертифицированном лабораторном оборудовании, а обработка данных проведена с использованием пакета прикладных программ Statistica for Windows (v. 8.0; Statsoft Inc.), что подтверждает достоверность полученных результатов.

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на II международной (IX итоговой) научно-практической конференции молодых ученых (Челябинск, 2011); IX Российской конференции иммунологов Урала, посвященной памяти профессора Л.Я. Эберта (Челябинск, 2011); на I Всероссийской с международным участием школы-конференции молодых ученых «Современные проблемы микробиологии, иммунологии и биотехнологии» (Пермь, 2011); на VII Международной Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых (Москва, 2012); на III международной (X итоговой) научно-практической конференции молодых ученых (Челябинск, 2012); на Х Российской конференции иммунологов Урала (Тюмень, 2012); на Региональной научно-технической конференции «Молодежь. Наука. Инновации - 2012» (Челябинск, 2012); на Всероссийской научно-практической конференции «Разработки Российской Федерации по приоритетным направлениям развития науки, технологий и техники»

(Челябинск, 2013).

Личный вклад автора состоит в участии на всех этапах выполнения работы: в планировании исследования, самостоятельном проведении всех лабораторных исследований, статистической обработке и анализе полученных данных, их систематизации и интерпретации, подготовке публикаций и докладов, подготовке работы к защите.

1. Соотношение морфологических форм нейтрофильных гранулоцитов слюны зависит от пола донора. Жизнеспособные нейтрофильные гранулоциты слюны, цервикального и вагинального секретов обладают способностью образовывать внеклеточные ловушки. У женщин в мукозальных секретах наблюдается рост количества внеклеточных ловушек во вторую фазу менструального цикла. Активация нейтрофилов мукозальных секретов пирогеналом и ФМА приводит к увеличению количества нейтрофильных внеклеточных ловушек.

2. Нейтрофилы цервикального секрета активнее, чем нейтрофилы слюны и вагинального секрета, проявляют свою лизосомальную активность, в большем количестве и интенсивнее участвуют в процессе фагоцитоза, а также имеют более высокий кислородзависимый потенциал. Пирогенал и форбол-миристат-ацетат усиливают фагоцитарную, лизосомальную и внутриклеточную кислородзависимую бактерицидную активность нейтрофильных гранулоцитов мукозальных секретов.

3. В популяции нейтрофильных гранулоцитов периферической крови можно выделить две субпопуляции клеток с высокими и низкими показателями прямого светорассеивания. Данные субпопуляции нейтрофилов различаются по экспрессии на своей поверхности рецепторов СD11b и CD95.

В работе впервые определено количество внеклеточных ловушек, присутствующее у здоровых мужчин и женщин в составе слюны, а также у женщин в первую и вторую фазы менструального цикла в вагинальном и цервикальном секретах. Установлено, что при сравнении мукозальных секретов между собой наибольшее количество внеклеточных ловушек содержится в слюне у женщин во вторую фазу менструального цикла.

Количество внеклеточных ловушек в мукозальных секретах репродуктивного тракта у женщин зависит от фазы менструального цикла. Показано, что пирогенал и форбол-миристат-ацетат индуцируют образование нейтрофильных внеклеточных ловушек в слюне, цервикальном секрете, вагинальном секрете и у нейтрофилов, выделенных из периферической крови на двойном градиенте фиколл-верографина. Установлено, что нейтрофилы цельной крови и лейкоцитарной взвеси не формируют внеклеточные ловушки даже после воздействия экзогенных факторов микробной и немикробной природы.

В работе показано, что факторы микробной и немикробной природы влияют на морфологический состав популяции нейтрофильных гранулоцитов мукозальных секретов, а так же увеличивают функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов слизистых оболочек независимо от пола обследуемых лиц и фазы менструального цикла у женщин.

Показано, что с помощью метода проточной цитофлюориметрии возможно определение фагоцитарной активности и внутриклеточного кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов периферической крови.

Впервые проведено разделение популяции нейтрофильных гранулоцитов периферической крови на субпопуляции по показателям объема и массы, а так же определена экспрессия рецепторов CD11b и CD на нейтрофилах в различных субпопуляциях.

Теоретическая и практическая значимость работы Проведенные исследования позволяют расширить представление о роли нейтрофильных гранулоцитов в антимикробной защите слизистых оболочек, в частности их способности к фагоцитозу и образованию внеклеточных ловушек. Результаты исследования расширяют знание о физиологии нейтрофилов, их функциональных возможностях, рецепторном аппарате и гетерогенности популяции.

Полученные данные вносят существенный вклад в понимание роли внеклеточных ловушек в противомикробных реакциях врожденного иммунитета.

Внедрение результатов исследования в практику Результаты исследования внедрены в лабораторную диагностику НИИ иммунологии ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации и используются в учебном процессе на кафедре микробиологии, вирусологии, иммунологии и клинической лабораторной диагностики ГБОУ ВПО «ЮжноУральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

По теме диссертации опубликовано 33 печатные работы, в том числе в изданиях, входящих в рекомендованный ВАК РФ перечень.

диссертационного исследования победила на областном конкурсе научноисследовательских работ студентов, аспирантов и молодых ученых высших учебных заведений, расположенных на территории Челябинской области.

Диссертант является одним из соисполнителей гранта Президента Российской Федерации МД-2246.2012.7 «Разработка и внедрение методов обнаружения нейтрофильных ловушек и определение биологической роли внеклеточной ДНК гранулоцитов» (грантополучатель – Шишкова Ю.С.).

Диссертация изложена на 136 страницах машинописного текста, иллюстрирована 24 таблицами, 6 рисунками и содержит введение, обзор литературы, главу с описанием материалов и методов исследования, три главы собственных исследований, заключение, выводы, список литературы.

Указатель литературы включает 88 отечественных и 115 зарубежных источников.

Глава 1 Нейтрофильные гранулоциты – клетки врожденного 1.1 Нейтрофильные гранулоциты и гетерогенность их популяции Нейтрофильные гранулоциты являются первой линией клеточной защиты. Это профессиональные охотники за микробами, обладающие самой высокой подвижностью среди всех клеток организма [85]. Нейтрофильные гранулоциты являются самыми многочисленными из лейкоцитов. Они имеют короткую продолжительность жизни, их количество в периферической крови поддерживается на постоянном уровне. Нейтрофилы играют важную роль в антимикробных реакциях врожденного иммунитета [163]. Нейтрофильные гранулоциты, выходящие в кровоток, полностью дифференцированы, обладают широким спектром противомикробных факторов и готовы быстро реагировать на внедрение патогенного агента [15].

Нейтрофил оснащен богатым набором рецепторов, которые позволяют чутко и дифференцированно реагировать на малейшие изменения окружающей среды [28, 63, 137]. Они первые приходят в очаг воспаления, где проявляют разнообразные виды активности [85]. Подготовленный нейтрофил может оказывать свое действие на объект, вызвавший его активацию, различными способами: фагоцитировать и уничтожать его в фаголизосомах или выделять наружу бактерицидные продукты, которые представляют собой содержимое гранул [15].

Жизненный цикл нейтрофила составляет приблизительно две недели [85] и последовательно протекает в костном мозге, крови, тканях и на поверхности слизистых оболочек [15]. Образование нейтрофилов начинается с дифференцировки стволовых клеток в миелобласт. Уже на следующей стадии (промиелоцит) происходит процесс формирования первичных (аурофильных) гранул [85]. Эти гранулы содержат бактерицидные ферменты (лизоцим, миелопероксидазу, эласстазу), антибактериальные катионные протеины (БПИ, дефенсины), богатый набор кислых гидролаз (Nацетилглюкуронидазу, катепсин B и D). Эти вещества обладают выраженной антимикробной активностью, участвуют в кислороднезависимом и кислородзависимом иммунном ответе [197, 73]. Позднее, на стадии миелоцита, появляются специфические гранулы, несущие лактоферрин, лизоцим, гистаминазу, активаторы комплемента ингибитор протеинкиназы С. Они получили название вторичные [1, 17, 85]. Мембрана специфических гранул нейтрофилов является источником протеинов, которые включаются в плазматическую мембрану клетки при ее стимуляции, вследствие чего увеличивается число рецепторов и различных белков. Эти элементы вовлечены в процесс адгезии нейтрофилов [1, 44, 114]. Третичные (желатинозные) гранулы содержат запас желатиназы, цитохром b, пул рецепторов к IgG и щелочную фосфотазу [41, 54, 103, 202], которая участвует в разрушении убитых бактерицидными веществами микроорганизмов [15].

Активированный нейтрофил частично или полностью утрачивает свои гранулы, подвергаясь дегрануляции. Дегрануляция, при которой гранулы целиком выталкиваются из клетки, называется экзоцитозом. Также выделяют секреторную (внутрифагосомную или экстрацеллюлярную) дегрануляцию, при которой содержимое гранул выливается либо в фагосому, либо в околоклеточное пространство [15]. Секреторная дегрануляция сопутствует практически всем формам реактивности нейтрофильных гранулоцитов, таких как: респираторному взрыву, адгезии, миграции и фагоцитозу [41, 15, 142].

Эти процессы значительно усиливаются в результате стимуляции нейтрофилов объектами фагоцитоза, хемотаксическими пептидами, медиаторами иммунной системы (ИЛ-1, ИЛ-8, ИФ- и др.) [5, 72, 183, 184, 105]. Быстрее всех высвобождаются третичные, затем специфические и последними подключаются азурофильные гранулы [15].

Основная часть морфологически зрелых нейтрофилов остается в костном мозге, лишь небольшая доля (приблизительно 3%) поступает в кровоток, эти клетки обладают многократно большим фагоцитарным потенциалом. Часть нейтрофилов, циркулирующих в кровотоке, прилипает к эндотелию сосудов и составляет маргинальный пул [27, 41, 85, 92]. В крови содержится малое количество всех нейтрофилов, большая часть функционируют в тканевых депо и на слизистых оболочках: цервикальной и вагинальной слизи, слюне, слизи, покрывающей кишечный эпителий [17, 92].

Причем на поверхности слизистых оболочек встречается большое количество жизнеспособных и функционально активных нейтрофильных гранулоцитов [18, 67, 62].

Именно слизистые оболочки, в силу своего топографического положения, первыми подвергаются атаке патогенов и взаимодействуют с антигеном. Слизистые оболочки обладают комплексом факторов неспецифической и специфической иммунной защиты, обеспечивающих в большинстве случаев надежный барьер на пути проникновения патогенов.

Между местными и системными иммунными факторами организма существуют постоянное равновесие и циркуляция растворимых гуморальных факторов и клеточных элементов (нейтрофильные гранулоциты, макрофаги и др.). В секретах полиморфноядерные нейтрофилы осуществляют неспецифическую реакцию врожденного иммунитета и продуцируют различные биологически активные вещества (цитокины, ферменты, свободные радикалы и др.). Нейтрофильные гранулоциты входят в первую линию защиты слизистых оболочек [56].

врожденной иммунной системы и выполняют основную функцию – уничтожение патогенных микроорганизмов, таких как бактерии, грибы и паразиты, а так же предотвращение их распространения в организме [169, 163].

способности к хемотаксису, адгезии, фагоцитозу, киллингу и перевариванию поглощенных агентов, при этом происходит генерация активных форм кислорода [76, 70, 15, 69, 107].

Известно, что выполняющие одинаковые функции клетки одной популяции могут различаться по степени проявления неспецифической активности, т. е. являются функционально неравнозначными притом, что они морфологически неразличимы [13, 65]. Кроме того, морфологически специфическую функциональную активность, т.е. быть функционально неоднородными [48, 89]. Например, нейтрофилы поглощают разное восстанавливают нитросиний тетразолий [65, 97].

однородной клеточной популяцией. Одним из главных факторов этого заблуждения являлось то, что, условно, нейтрофилы были рассмотрены в качестве коротко живущих клеток, которые быстро прибывают в места инфекции или травмы, активируются и умирают в течение короткого времени [98]. Эта догма была оспорена, и было высказано предположение, что нейтрофилы могут иметь более долгий срок жизни, чем считалось ранее – 4-5 дней в организме человека [171]. Нейтрофильные гранулоциты значительные различия в составе мембран, экспрессии рецепторов для активаторов, стимулировании респираторного взрыва, и некоторых других функций и метаболических возможностей [95].

Недавно все нейтрофилы по способности генерировать активные формы кислорода, взаимодействовать с субстратом и инактивироваться в результате этих событий были разделены на два класса: потенциальные фагоциты – «камикадзе» (убей и погибни), и «самураи» (защити себя сам) [12]. «Камикадзе» активно продуцируют АФК, тогда как «самураи»

поглощают инородные частицы с целью доставки их в компетентные органы, менее активно продуцируют АФК, а их мембраны более проницаемы [14].

Нейтрофилы приблизительно в равном соотношении распределены на циркулирующий и маргинальный пул. Клетки первого - свободно переносятся кровью, в то время как второго - прикреплены к сосудистому эндотелию [13]. Часть циркулирующих нейтрофилов, например, вследствие активации компонентами комплемента, может переходить в маргинальный пул и усиливать продукцию АФК [110], которая коррелирует с количеством клеток маргинального пула [198] и с их адгезивной способностью [90].

Следовательно, клетки маргинального пула, а также часть клеток циркулирующего пула могут быть потенциальными фагоцитами, контакт которых с субстратом является необходимым условием осуществления функции фагоцитоза [13].

Существенно, что фагоцитами могут быть исключительно зрелые гранулоциты [182].

Очевидно, функциональная неоднородность нейтрофилов определяется разной степенью экспрессии одинаковых рецепторов или наличием у клеток разных рецепторов [89]. Активность нейтрофилов определяется рецепторами, число которых изменяется при патологии и коррелирует со способностью клеток к взаимодействию, восстановлению НСТ и фагоцитарной активности [162].

С учетом функциональной неоднородности нейтрофилов, возникает вопрос об их созревании в процессе кроветворения. Теоретически «камикадзе», и «самураи» могут дифференцироваться по альтернативному пути, либо взаимно превращаться. Исходя из положения о том, что чем более дифференцирована клетка, тем сильнее выражены у нее адгезивные свойства [80], то скорее «камикадзе» могут дифференцироваться из «самураев», чем наоборот, так как клетки могут исключительно утрачивать способность к контакту, а не приобретать его [12, 167, 200].

Из функциональной неоднородности нейтрофилов следует еще одно предположение, основанное на том, что нейтрофилы подвергаются апоптозу (физиологическая, генетически запрограммированная гибель клеток), вследствие лишения их контакта с субстратом [88]. Поскольку этим требованиям могут отвечать только «камикадзе», а не «самураи», которые вообще не прикрепляются, то, вероятно, из нейтрофилов лишь «камикадзе»

погибают путем апоптоза. Следовательно, «камикадзе» могут быть теми нейтрофилами, которые только и способны в обычных условиях к апоптозу.

Поскольку «камикадзе» имеют больший филогенетический возраст по сравнению с «самураями», и апоптоз, очевидно, более молодой путь гибели клеток по сравнению с некрозом, то представляется вероятным, что «камикадзе» [13]. «Самураи» могут вступить на путь апоптоза при изменении условий среды. При стимуляции нейтрофильных гранулоцитов антибиотиками или бактериями доля апоптозных клеток увеличивается [176].

без которых невозможны необходимые для фагоцитоза прикрепление и активация нейтрофилов [14].

Увеличения числа нейтрофилов, погибающих путем апоптоза при стимуляции, указывает на то, что стимуляторы либо индуцируют апоптоз «самураев», либо приводят к увеличению доли «камикадзе» за счет их перехода из маргинального пула в циркулирующий. Однако ни в одной из работ не найдено близкого к 100 % числа апоптозных нейтрофилов, т.е.

стимулировать все нейтрофилы к апоптозу достаточно трудно [181].

Функциями нейтрофилов являются хемотаксис, адгезия и агрегация, образование гранул и дегрануляция, активация продукции АФК, фагоцитоз и уничтожение бактерий [101]. Собственно, фагоцитоз включает в себя все перечисленные явления. Уже адгезия нейтрофилов сопровождается выделением ферментов из лизосом и усилением продукции АФК [195, 196].

взаимодействия с субстратом, могут модулировать структуру, функцию и выживание нейтрофилов [140], что и наблюдается при восстановлении ими НСТ или апоптозе. Однако, способность к фагоцитозу, с одной стороны, и адгезия или продукция АФК, с другой, не обязательно коррелируют между собой [13], что объясняется функциональной неоднородностью нейтрофилов.

Можно учесть, что нейтрофилы среди маргинального («камикадзе») и циркулирующего пулов («камикадзе»+ «самураи») распределены примерно поровну и что доля «камикадзе» в циркулирующем пуле около 65 % [14].

Тогда доля «камикадзе» среди всех нейтрофилов оказывается примерно 80%.

Соответственно, в нормальных условиях, процент нейтрофилов, предположительно осуществляющих транспортную функцию («самураи»), не превышает 20. Не исключено, что помимо «камикадзе» (киллеров) и «самураев» (кейджеров), в организме могут иметь место и функционально другие нейтрофилы, а внутри обеих субпопуляций, несомненно, существует функциональная неравнозначность [12].

фагоцитирующих клеток заключается в их способности к хемотаксису, адгезии, фагоцитозу, дегрануляции, киллингу и перевариванию поглощенных бактерицидный механизм врожденного иммунитета, осуществляемый нейтрофильными гранулоцитами путем формирования внеклеточных ловушек.

1.2 Современные методы оценки функциональной активности 1.2.1 Внеклеточные ловушки как новый механизм внеклеточной бактерицидности нейтрофильных гранулоцитов Нейтрофилы являются одной из самых многочисленных клеточных популяций в организме, и в крови человека доля этих клеток врожденного иммунитета составляет более 90 %. Нейтрофильные гранулоциты как важнейшие клетки врожденного иммунитета обеспечивают наиболее быстрые защитные реакции в ответ на проникновение в организм микробных патогенов [41, 163]. Нейтрофильные гранулоциты выполняют функцию киллинга патогенных микроорганизмов с помощью нейтрофильных внеклеточных ловушек и фагоцитоза, а также функцию регуляции иммунного ответа организма хозяина путем модуляции экспрессии клеточных рецепторов и активности провоспалительных цитокинов [17, 33].

зарегистрированы с использованием электронной микроскопии в 2004г.

учеными Института инфекционной биологии имени Макса Планка (Берлин, микроорганизмы, предотвращая их распространение, и создают высокую концентрацию антимикробных веществ, чтобы уничтожить микроорганизмы [106]. Когда патогенные микроорганизмы попадают в организм, макрофаги испускают «сигнал бедствия», который привлекает большое количество нейтрофильных гранулоцитов в очаг инфекции. Достигнув очага инфекции, нейтрофилы активируются, претерпевая характерные морфологические изменения. В течение нескольких минут происходит деконденсация ядерного хроматина и дезинтеграция ядерной оболочки с одновременным нарушением целостности мембран лизосомальных гранул, что следует за обязательной предварительной стимуляцией в клетках «респираторного взрыва» с высвобождением реактивных форм кислорода. Активированный нейтрофил еще сохраняет свою жизнеспособность, когда в нем происходит смешивание ядерного хроматина с содержимым бактерицидных гранул. Позже цитоплазма разрывается для выпуска хроматина в межклеточное пространство. Высвобожденный хроматин представляет собой протяженные нити, которые переплетаются и связываются между собой, формируя сетевидные структуры, в которых задерживаются микроорганизмы. При высвобождении данной структуры активированный («поврежденный») нейтрофил погибает. Поскольку распад ядерной оболочки совпадает с выходом содержимого нейтрофильных гранул в цитоплазму, нити ДНК ассоциируются с множеством бактериальных продуктов, пагубно влияющих на попавшие во внеклеточные ловушки патогенные микроорганизмы [107, 17].

Формирование нейтрофилами внеклеточных ловушек является важным механизмом врожденного иммунитета, когда, погибая, нейтрофил защищает организм от инфекционных патогенов [127, 194]. Морфологически этот процесс, названный «NETosis», отличается от других классических процессов клеточной гибели – апоптоза и некроза, прежде всего, деконденсацией хроматина и дезинтеграцией ядерной оболочки, исчезновением цитоплазматических гранул и смешиванием ядерного содержимого с материалом цитоплазмы. Молекула ДНК высвобождается из клетки без фрагментации ее эндонуклеазами [127]. При некрозе разрушение клетки происходит путем ее лизиса. Когда ядро растворяется, вязкий базофильный хроматин часто отделяется от жидкого оксифильного [165]. При некрозе нарушается целостность самой клетки, она лизируется, но без развития изменений в гранулах и ядерной мембране [127]. Внутриклеточные события в нейтрофиле проявляются в ее набухании вследствие разрушения мембран и переполнения клетки водой. Наряду с компактными фаголизасомами, отмечается появление огромного количества больших пузырькообразных фаголизосом, в них обычно находятся микроорганизмы. При разрушении мембран, содержимое фаголизасом высвобождается в околоклеточное пространство, вызывая значительное повреждение окружающих тканей [3, 87, 20].

Апоптоз – физиологическое, генетически запрограммированное отмирание клеток. Апоптоз является активным процессом самоликвидации, вызванным внутренними или внешними сигналами, требующий затрат энергии [124, 154, 132]. При апоптозе происходят характерные для этого процесса изменения, принципиально отличающиеся от некроза [145, 91]. При апоптозе сохраняется целостность мембран и органелл, клетка сжимается и округляется [79, 4], хроматин конденсируется и происходит его фрагментация без нарушения целостности ядерной оболочки. Сетеподобная структура, состоящая из молекулы ДНК и содержимого цитоплазматических гранул, при некрозе и апоптозе не образуется [127].

трансмиссионной электронной микроскопии показало, что фибриллы (структуры из компонентов ярда и гранул) мембраной не окружены.

Фибриллы в ловушках весьма ломки, и их лабораторное выявление требует аккуратной отмывки и фиксации препаратов с целью сохранить НВЛ [53].

Так как обработка дезоксирибонуклеазой приводит к разрушению нейтрофильных внеклеточных ловушек, в противоположность протеазам, которые оставляют ловушку интактной, поэтому молекула ДНК считается основным структурным элементом внеклеточных ловушек, формируемых нейтрофильными гранулоцитами. Нити ДНК в составе внеклеточных ловушек имеют диаметр 15–17 нм, а в комплексе с локализованными на них белками – от 25 до 50 нм. Катионные белки внеклеточных ловушек (сериновые лейкоцитарные протеазы, гистоны и антибактериальные пептиды – АБП) определяют способность данных структур к эффективному киллингу патогенных бактерий [148, 192].

лейкоцитарная эластаза (ЛЭ) [148], расщепляющая при дегрануляции ядерные гистоны (Н1, Н4) и запускающая, таким образом, процесс деконденсации хроматина активированных нейтрофилов, необходимый для формирования НВЛ [168]. ЛЭ является протеазой, ответственной за избирательное расщепление бактериальных факторов вирулентности [197], за деградацию микробных антигенов, обладающих провоспалительными и иммуностимулирующими свойствами [151], а также за образование АБП из лизосомальных (небактерицидных) белков предшественников [115]. Этот катионный белок играет решающую роль в обезвреживании некоторых грамотрицательных микроорганизмов (нaпример Pseudomonas aeruginosa [135], Escherichia coli [122]) и считается ключевым белком врожденной антибактериальной защиты [197]. За счет адсорбции на молекуле ДНК достигается высокая концентрация ЛЭ в месте внедрения инфекционного агента. С другой стороны, адсорбция предотвращает повреждающий эффект этой самой опасной лейкоцитарной протеазы на белки плазмы крови и других тканей организма хозяина [148].

Кроме лейкоцитарной эластазы, в состав нейтрофильных внеклеточных миелопероксидаза и катепсин G, а из содержимого вторичных и третичных гранул лактоферрин и желатиназа. Кроме этого, также в состав внеклеточной ловушки входят гуморальный паттернраспознающий рецептор пентраксин и белки, распознающие пептидогликан [191].

Отрицательно заряженная молекула ДНК служит также основой для адсорбции участвующих в коагуляции плазменных сериновых протеаз, которые вместе c высокомолекулярным кининогеном входят в контактную систему.

контактную систему, что приводит к резкому повышению уровня секреции антибактериальных пептидов и к усилению врожденного иммунного ответа [166].

иллюстрируют, что НВЛ – это основа для адгезии тромбоцитов и эритроцитов, ранее неизвестное связующее звено между инфекцией, воспалением и тромбозом. Важно, что внеклеточные ловушки стимулируют тромбообразованию гепарин предотвращает формирование внеклеточных ловушек в образцах крови человека и животных [128].

На сегодняшний день известно, что нейтрофильные внеклеточные ловушки связывают грамотрицательные и грамположительные бактерии, грибы и некоторые вирусы [189]. Однако и микроорганизмы имеют в своем вооружении факторы патогенности, такие как ферменты, деградирующие нуклеиновые кислоты [188, 96, 141].

Анализ литературных данных показал, что внеклеточные ловушки формируют активированные нейтрофилы крови человека [166]. Запускать этот процесс могут различные провоспалительные стимулы, включая перекись водорода (Н2О2), бактериальный липополисахарид (ЛПС), форболмиристат-13-ацетат (ФМА) и интерлейкин-8 (ИЛ-8). Стимулировать процесс образования НВЛ может также продукт расщепления 5-го компонента комплемента во время его активации в сыворотке крови (С5а), но только после премирования зрелых нейтрофилов интерферонами или фактором, стимулирующим образование колоний гранулоцитов и макрофагов (ГМ-КСФ) [156].

Нейтрофильные гранулоциты уничтожают патогены посредством кислородзависимых и кислороднезависимых механизмов. Исследования ряда авторов показали, что формирование внеклеточных ловушек зависит от образования активных форм кислорода (АФК) и протекает с участием НАДФН-оксидазы фагосомальной мембраны [126, 127, 123]. Нейтрофильные гранулоциты, полученные от пациентов с хронической гранулематозной болезнью (мутация кодирования генов НАДФН-оксидазы), не образуют внеклеточных ловушек даже после стимуляции микроорганизмами или ФМА [99]. В эксперименте было так же показано, что нейтрофилы линий мышей, генетически дефицитных по НАДФН-оксидазе, лишенной субъединицы gp91, не продуцируют АФК и при стимуляции не формируют НВЛ.

Стимулированные нейтрофильные гранулоциты различных линий мышей образуют неодинаковое количество внеклеточных ловушек, коррелирующее с интенсивностью продукции АФК [123]. При этом авторами было отмечено, что образование реактивных форм кислорода недостаточно для формирования нейтрофильных внеклеточных ловушек у лиц, у которых нет дефицита НАДФН-оксидазы [203].

В ответ на последовательную стимуляцию in vitro компонентом комплемента (С5а) различных по степени дифференцировки нейтрофильных гранулоцитов человека было показано, что лишь сегментоядерные клетки принимают участие в образовании НВЛ [164, 156].

Сравнительные исследования, показали, что эффективность захвата и киллинга бактерий нейтрофильными внеклеточными ловушками выше, чем при фагоцитозе. От данного механизма киллинга бактерий во многом зависит антибактериальная защита слизистых оболочек [17] и эффективность реализации нейтрофилами своего мощного бактерицидного потенциала в крови, обсемененной патогенными бактериями [134]. При бактериемии ЛПС активирует тромбоциты через TLR-4 на клеточной поверхности, что приводит к секреции этими клетками цитокинов. Цитокины индуцируют формирование стимулированными нейтрофилами внеклеточных ловушек, которые захватывают и убивают бактерии в кровеносных сосудах [112, 155].

На добавление ЛПС чумного микроба в цельную кровь человека нейтрофилы уже через 30 мин отвечают интенсивной азурофильной дегрануляцией [32] и формируют внеклеточные ловушки, подобно тому, как это происходит в ответ на препарат «пирогенал» при 30-минутной экспозиции в условиях in vitro [83]. Для запуска образования нейтрофильных внеклеточных ловушек может быть достаточен контакт с другими очищенными антигенами патогенных бактерий, например такими, как белок M1 Streptococcus pyogenes [147, 166] или поверхностный липофосфогликан Leishmania amazonensis [129].

микроорганизмами оказывает более выраженный эффект на процесс образования НВЛ [106, 127]. Особо активны представители нормальной микрофлоры (Bifidobacterium spp., Lacto bacterium spp.), которые обитают в организме человека, постоянно активируют клетки врожденного иммунитета и, возможно, именно поэтому не проявляют свои патогенные свойства [17].

Время, необходимое для формирования внеклеточных ловушек, составляет в зависимости от стимула от 10 мин до 4 ч [192]. На примере клеток Staphylococcus aureus в условиях in vitro было установлено, что нестимулированные нейтрофилы обезвреживают бактерии сначала c помощью фагоцитоза, а затем путем образования внеклеточных ловушек.

Однако если нейтрофилы стимулировать ФМА или ЛПС, запустив процесс формирования НВЛ, то киллинг бактерий за счет фагоцитоза будет минимальным и они будут погибать в основном во внеклеточных ловушках.

Спустя 3-4 ч после стимуляции, когда процесс образования ловушек завершается, киллерная активность нейтрофильных гранулоцитов по функционированием внеклеточных ловушек [127].

Механизм внеклеточной бактерицидности, лежащий в основе не фагоцитарного типа тканевой резистентности [24], играет важную роль в киллинге грамположительных и грамотрицательных бактерий, микобактерий, грибов и паразитов, вопрос о способности внеклеточных ловушек захватывать и убивать вирусы остается открытым [157, 192].

Имеются сообщения о формировании внеклеточных ловушек в условиях in vivo при различных заболеваниях, включая аппендицит [106], бактериальный вагиноз [17], экспериментальные модели шигеллеза [106], малярию [93], кожный лейшманиоз [129], системную красную волчанку [130], пневмонию [159, 193] и инвазивный бронхолегочный аспергиллез [100].

внеклеточные ловушки приводит к сепсису и другим инфекционным осложнениям, что, в частности, характерно для всех новорожденных, обладающих в сравнении с взрослыми повышенной чувствительностью к инфекционным заболеваниям, вызываемым условно-патогенной микрофлорой [203]. При нарушении регуляции формирования и удаления НВЛ образуются аутоантитела к ДНК, гистонам, эластазе и другим белкам нейтрофилов крови [130], но роль внеклеточных ловушек при аутоиммунных заболеваниях до конца неясна и в настоящее время является объектом изучения [148, 93, 130].

установлено, что патогенные бактерии могут использовать для распространения в организме хозяина процесс разрушения НВЛ нуклеазами.

Штаммы S. pyogenes, лишенные продукции кодируемой бактериофагом ДНКазы Sda1, обладают повышенной чувствительностью к киллингу внеклеточных ловушек и пониженной степенью вирулентности, в то время как гетерологичная экспрессия Sda1 у других бактериальных штаммов приводит к неспособности нейтрофилов убивать микробные клетки вследствие разрушения НВЛ нуклеазой [108]. Такие микроорганизмы, как Salmonella typhi, Shigella flexneri, Staphylicoccus aureus, задерживаются и уничтожаются в ловушках [106]. Однако некоторые резистентные штаммы бактерий не подвержены действию внеклеточных ловушек благодаря продукции эндогенной ДНКазы [186], которая экспрессируется грамположительными патогенными микроорганизмами [172], но роль ее в резистентности микробов была непонятна, пока не было установлено, что поверхностная эндонуклеаза А штамма Streptococcus pneumoniae увеличивает резистентность этой бактерии посредством разрушения остова ДНК внеклеточной ловушки [96]. Было установлено, что ДНКаза ингибирует позднюю стадию продукции АФК в нейтрофилах [161].

От бактерицидного эффекта нейтрофильных внеклеточных ловушек микробную популяцию также защищает образование биопленок [138].

В целом, приведенные данные свидетельствуют о том, что белки гранул нейтрофилов и компоненты их хроматина совместно образуют внеклеточные структуры, которые, обеспечивая высокую локальную концентрацию антибактериальных, противопаразитарных и фунгицидных веществ, усиливают эффективность защитной функции нейтрофильных гранулоцитов [17, 53].

1.2.2 Проточная цитофлюориметрия как современный метод Разработка и внедрение в лабораторную практику новых методов иммунодиагностики тесно связано с развитием материально-технической базы лаборатории, а именно, наличием современного оборудования.

Имеющиеся диагностические системы позволяют идентифицировать практически все параметры иммунитета. Можно выделить три основные группы методов, используемых в клинической иммунологии: проточная цитофлюориметрия, иммуноферментный анализ и полимеразная цепная реакция [36].

мультипараметрический анализ живых и мертвых клеток, которая получила широкое распространение в таких областях медицины, как иммунология, фармакология, цитология, онкология, гематология, генетика, инфекционные болезни [10]. Проточная цитофлюориметрия как современная технология быстрого измерения характеристик клеток, появилась в результате естественного развития традиционных гистохимических и цитохимических методов анализа. Созданная для ускорения анализа в клинической цитологии, эта технология постепенно развилась в эффективный подход к решению многих важных задач биологии клетки, иммунологии, клеточной инженерии и т.д. [57]. Проточная цитофлюориметрия базируется на всем арсенале современных цитохимических флуоресцентных методов анализа структурных компонентов клеток их антигенов и внутриклеточных процессов, ее главной отличительной особенностью является высокая производительность. Исследуются выборки от нескольких тысяч до нескольких миллионов клеток, что гарантирует статистическую достоверность результатов [119], так же возможность анализировать не усредненные молекулярные характеристики по всей популяции, а индивидуальные параметры для каждой из клеток [177].

поглощения света и обратного светорассеивания клетками. Источником света в проточных цитофлюориметрах служат лазеры, обычно аргоновый, реже гелий-неоновый и криптоновый [118]. Основной принцип проточной цитофлюориметрии заключается в том, что через проточную ячейку движется постоянный ток изотонического раствора под определенным давлением. Внутри проточной ячейки находится зонд, из которого подается образец, содержащий клетки [180]. Суспензия клеток под давлением через фильтр подается в концентрически протекающую жидкость со скоростью 30км/ час. Благодаря гидродинамической фокусировке создаются условия ламинарного потока без перемешивания суспензии клеток: клетки идут одна за другой и пересекают лазерный пучок, рассеивая его. Далее, через систему оптических линз, фильтров, зеркал трансформированный лазерный пучок преобразуется в фотоумножителе в электрические сигналы, которые обрабатываются и выдаются как характеристики клеток в виде цитограмм и гистограмм [118].

Существенные особенности проточной цитофлюориметрии делают этот метод особенно ценным для клинической практики. Этот метод позволяет охарактеризовать гетерогенные клеточные популяции по фенотипу, а при использовании ДНК-цитометрии [86] – и генотипу входящих в них клеток. Анализы такого рода служат для выявления отклонений, происходящих в процессе онкогенеза [35]. Вторая особенность это способность обнаружить и охарактеризовать редкие события, т.е.

встречающиеся с частотой 10-5-10-7, что возможно благодаря его огромной производительности [119].

следующие параметры. Во-первых, это рассеивание света под малыми углами (1-10°). Этот параметр используется для определения размеров клеток. Во-вторых, рассеивание света под углом 90°. Использование этого параметра позволяет судить о соотношении размеров ядра и цитоплазмы, а также о неоднородности или гранулярности цитоплазмы. Третий параметр – это измерение интенсивности флуоресценции изучаемого объекта. Именно способность анализировать интенсивность флуоресценции сделала метод проточной цитофлюориметрии высокоинформативным и широко применяемым [78]. Проточная цитофлюориметрия позволяет практически одновременно получать данные о самых разных характеристиках клетки и клеточных популяций [150], хотя для получения параметров светорассеяния никакой предварительной окраски флюоресцентными антителами не требуется [94]. Теоретические возможности проточной цитофлюориметрии на сегодняшний день поддержаны многопрофильным программным обеспечением проточных цитометров и диапазон ее применения может быть ограничен только фантазией исследователя [117].

В связи с возможностями приборов области применения проточной цитометрии стали весьма разнообразны. Сначала интенсивно развивались способы количественного анализа внутриклеточных компонентов, таких как ДНК и РНК [180].

Работа в данном направлении привела исследователей к разработке различных методик анализа параметров клеточного цикла. В свою очередь, это послужило фундаментом для разработки методик диагностирования делящихся клеток и клеток с аномальным содержанием ДНК [88].

Информация, извлекаемая из сигналов светорассеяния и измерения времени пролета клеток через зону анализа, позволила судить о морфологических характеристиках клеток (размере, отношении размеров ядра и цитоплазмы, гранулярности цитоплазмы, степени асимметрии клеток). Примером может служить одновременное измерение рассеяния света клетками под малыми углами (1-100) и под углом 900. Данный подход позволяет разделить и расположить в виде гистограммы лейкоциты на три группы клеток: лимфоциты, моноциты и гранулоциты [104].

исследователей появился в руках такой инструмент, как моноклональные антитела [153]. Моноклональные антитела предоставили возможность типировать клетки не только благодаря их морфологическим различиям, но и за счет набора поверхностных антигенов и рецепторов, характерных для строго определенных клеток и их функционального состояния [179, 78]. В начале 80х годов было созвано международное рабочее совещание по моноклональные антитела в группы или кластеры исходя из того, какую антигенную структуру на клеточной поверхности они распознают. Таким образом, первоначальный смысл понятия "кластер дифференцировки" (Cluster of Differentiation, CD) – это набор моноклональных антител, которые распознают одну и ту же структуру на клеточной поверхности независимо от эпитопной специфичности [153].

Использование моноклональных антител революционизировало подходы к типированию клеток, и в настоящее время большинство клинических применений проточной цитометрии выполняется именно с их помощью. Меченые флуорохромами моноклональные антитела позволяют проводить как качественный, так и количественный анализ [77].

Моноклональные антитела на сегодняшний день используются для иммунодефицитных заболеваний, исследования активации Т-клеток, Вклеток, натуральных киллеров, моноцитов, макрофагов и др. Кроме этого, последние достижения в области флуоресцентных красителей позволяют значительно повысить информативность получаемых результатов. Так, использование нескольких моноклональных антител, меченых различными флуоресцентными красителями, позволяет в одном эксперименте получать информацию сразу о нескольких антигенах на поверхности клеток и, как субпопуляционном составе клеток и наличии различных аномалий, а также об активности клеток внутри одной субпопуляции [78].

Все большее количество определяемых параметров позволяет изучать все более сложные фенотипы нормальных и злокачественных лейкоцитов, и, следовательно, все более тонкие аберрации, выделяющие опухолевую клетку в присутствии нормальных клеточных компонентов крови и костного мозга.

Эти возможности и превратили проточную цитометрию в метод выбора при определении линейной принадлежности и уровня созревания злокачественных клеток при острых лейкозах и лимфомах [152].

В настоящее время для регистрации апоптоза лейкоцитов все шире применяется метод проточной цитометрии. Например, с помощью меченного флюорохромом аннексина V, который связывается с фосфатидилсерином, появляющимся на мембране клеток, подвергающихся апопотозу [37]. С помощью флюоресцентного красителя PI можно выявлять гиподиплоидные клетки вследствие потери части ДНК. Этот метод чаще всего используется для изучения активационного апоптоза лимфоцитов [133].

Цитофлуоримертические подходы к исследованию функционального состояния фагоцитов в настоящее время открывает широкие возможности для исследования этих клеток и имеет ряд преимуществ, в первую очередь связанных с возможностью исследования метаболизма отдельно взятого фагоцита, анализа большого числа клеток, а также с относительной простотой, быстротой и точностью метода [55, 175]. Для оценки активных форм кислорода, генерируемых во время респираторного «взрыва»

применяют внутриклеточные индикаторы в виде химически связанных заблокированными флуоресцирующими свойствами (дихлорофлуоресцеин диацетат, дигидрородамин 123) [121, 37, 55]. Проточная цитофлюориметрия дает возможность оценки практически всех параметров фагоцитарного звена иммунной системы [36] таких как активность, интенсивность, фагоцитарное число, индекс завершенности фагоцитоза [55].

Все новые и новые достижения в различных областях молекулярной биологии, биохимии и медицины позволяют изучать при помощи проточной цитометрии различные аспекты биологии клетки, такие как содержание секретируемых цитокинов в сыворотке при помощи мультиплексного анализа [177], локализацию антигенспецифических клонов клеток при помощи тетрамеров [201], исследование таких физиологических параметров, как внутриклеточный рН, концентрация свободных ионов кальция, уровень окислительных процессов, активация митохондрий, потенциал наружной мембраны клеток, процессы апоптоза [37, 10] и многое другое.

Таким образом, несмотря на значительное количество исследований о роли нейтрофильных гранулоцитов в защите организма, до настоящего времени остается открытым вопрос о функциональной активности нейтрофилов в мукозальных секретах, а так же неоднородности популяции нейтрофилов периферической крови. Открытие нейтрофильных внеклеточных ловушек стало новым шагом в понимании бактерицидной функции нейтрофильных гранулоцитов. Однако в доступной литературе мы не встретили сведеней о роли внеклеточных ловушек в защите слизистых оболочек и распределении рецепторов в различных субпопуляциях нейтрофилов.

Для достижения поставленной цели за период с 2010 по 2012 год на базе Научно-исследовательского института иммунологии ЮУГМУ было проведено обследование 30 практически здоровых мужчин и 30 практически здоровых небеременных женщин в первую и вторую фазы менструального цикла, чей возраст варьировался от 18 до 35 года. Критериями включения в исследование являлись добровольное согласие на обследование, оформленное в письменном виде, отсутствие хронических заболеваний, приема гормональных препаратов и перенесенных вирусных заболеваний в течение последних трех месяцев.

Материалом для исследования являлись периферическая венозная гепаринизированная кровь, лейкоцитарная взвесь, чистая фракция нейтрофильных гранулоцитов, цервикальный секрет, вагинальный секрет и слюна.

Для получения лейкоцитарной взвеси использовали кровь, взятую из локтевой вены в вакуумную пробирку с гепарином в качестве антикоагулянта (12–30 МЕ гепарина на 1мл крови), оставляли при комнатной температуре на 30 минут. После седиментации эритроцитов, обогащенную лейкоцитами плазму крови (лейкоцитарную взвесь), собирали стерильным наконечником в чистые стерильные пробирки.

2.4 Выделение нейтрофилов из периферической венозной крови Для получения чистой фракции нейтрофилов использовали кровь, взятую из локтевой вены в вакуумную пробирку с гепарином в качестве физиологического раствора, полученную смесь наслаивали на градиент плотности растворов фиколла-верографина (Pharmacia, Sweden; Spofa, CSSR). Плотность верхнего слоя составляла 1,075-1,077, нижнего – 1,093Объем каждого слоя градиента составлял 2 мл. После центрифугирования в течение 40 мин при 1500 оборотах в минуту на границе градиентов образовывалось кольцо гранулоцитов с чистотой 98мононуклеары составляли 2% или отсутствовали. Кольцо нейтрофилов аккуратно собирали стерильной пипеткой и переносили в стерильную пробирку. Клетки дважды отмывали от градиента стерильным физиологическим раствором хлорида натрия центрифугированием при 1500 оборотов в минуту в течение 7 минут. Затем клетки доводили до концентрации 5х106 клеток/мл и использовали в исследовании [15].

2.5 Метод забора материала из вагинального и цервикального секрета Забор цервикальной и вагинальной слизи осуществляли с помощью специальной градуированной пипетки на 7-10 и 21-23 дни менструального цикла. Полученный материал помещали в 1,0 мл раствора Хенкса и тщательно суспензировали. Материал доставляли в лабораторию в течение 2-х часов с момента забора.

Забор слюны проводили через 1 час после еды (после предварительного полоскания полости рта физиологическим раствором) в одноразовые пробирки в объеме 3 мл, с добавлением 1 мл физиологического раствора в течение 5 минут. После этого материал в течение 1 часа доставляли в лабораторию.

2.7 Активация нейтрофильных гранулоцитов иммуностимуляторами Для оценки влияния различных иммуностимуляторов исследуемый материал инкубировали в течение 30 минут при температуре 370С в присутствии растворов активаторов. Для контроля исследуемый материал инкубировали в тех же условиях, но без активатора.

В качестве иммуностимулятора микробной природы применяли лекарственный препарат пирогенал (Филиал «Медгамал» ГУ НИИЭМ им.

Н.Ф. Гамалеи РАМН, г. Москва, Россия). Данный препарат использовали в концентрации, соответствующей разовой терапевтической дозе для человека в перерасчете на 1 мл взвеси нейтрофилов.

В качестве иммуностимулятора немикробной природы применяли препарат форбол-12-миристат-13-ацетат (Fluka, США) в концентрации 7, М/мл.

2.8 Методы обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек Изучение образования нейтрофильных внеклеточных ловушек проводили как в нативном материале, так и после активации нейтрофильных гранулоцитов факторами микробной и немикробной природы.

2.8.1 Метод обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек в фиксированных препаратах цельной крови Определение количества нейтрофильных внеклеточных ловушек, содержащихся в цельной крови доноров, проводили следующим образом. На сухое обезжиренное предметное стекло наносили каплю цельной гепаринизированной венозной крови, затем с помощью чистого шлифовального стекла распределяли кровь по поверхности предметного стекла. Мазки высушивали на воздухе, фиксировали 96% этиловым спиртом и окрашивали по Романовскому-Гимзе. Результаты оценивали при помощи световой микроскопии, в мазках подсчитывали процентное содержание внеклеточных ловушек от общего числа нейтрофильных гранулоцитов [62].

2.8.2 Метод обнаружения внеклеточных ловушек, образованных нейтрофильными гранулоцитами, выделенными из периферической Нейтрофильные гранулоциты, выделенные из периферической крови на двойном градиенте фиколл-верографина, интактные и активированные пирогеналом и ФМА, наносили на чистое обезжиренное предметное стекло и добавляли каплю 0,04% раствора акридинового оранжевого, накрывали сверху покровным стеклом и удаляли избытки жидкости фильтровальной бумагой. Учет проводили с помощью люминесцентного микроскопа Nikon eclipse 50i, используя фильтры, обеспечивающие возбуждающий свет с длиной волны не более 490 нм. В препаратах оценивали процентное содержание нейтрофилов с сегментированным ядром, нейтрофилов с недифференцированным ядром и нейтрофильных внеклеточных ловушек.

Подсчет проводили на 100 клетках [51].

2.8.3 Метод обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек в Для оценки количества внеклеточных ловушек в мукозальных секретах полученную суспензию в равном объеме смешивали со сложным красителем, который готовили ex temporo: 1 мл синьки Эванса в концентрации 1:8000 для окрашивания слизи и жизнеспособных клеток в оранжевый цвет и 1 мл красителя Sytox Green в концентрации 1:500 для окрашивания внеклеточных волокон ДНК и мертвых клеток в зеленый цвет. Полученный раствор инкубировали в течение 5 минут в темноте. Из окрашенного материала готовили препарат «раздавленная капля». Учет проводили с помощью люминесцентного микроскопа Nikon eclipse 50i, используя фильтры, обеспечивающие возбуждающий свет с длиной волны не более 490 нм и эмиссию с длиной волны 520 нм. Все структуры разделили на 4 группы по дифференцированному окрашиванию: 1 группа объединила жизнеспособные клетки ярко-оранжевого цвета; 2 группа – клетки с зеленым ядром и яркооранжевой цитоплазмой, т.е. клетки, вероятно подвергшиеся апоптозу; группа – погибшие клетки зеленого цвета; 4 группа – свободнолежащие ярко-зеленые волокна, представляющие собой нити ДНК нейтрофила (нейтрофильные внеклеточные ловушки). Проводили подсчет 100 структур разных групп и определяли процентное содержание каждой морфологической единицы [52].

2.9 Исследование функциональной активности нейтрофильных 2.9.1 Метод определения фагоцитарной активности нейтрофильных гранулоцитов мукозальных секретов с помощью световой микроскопии Изучение способности нейтрофилов к захвату частиц проводили по методу Фрейдлин [74]. Для оценки фагоцитарной функции смешивали в одной пробирке 0,1 мл суспензии клеток с 0,02 мл взвеси частиц полистирольного латекса в концентрации 108 частиц/мл, диаметром 1,7 мкм.

После 30-минутной инкубации при температуре 37оС из клеток готовили препараты, которые высушивали на воздухе, фиксировали 96 0 этиловым спиртом и окрашивали по Романовскому-Гимзе. С помощью световой иммерсионной микроскопии (Zeiss Primo Star) при увеличении 90х10х1, оценивали активность фагоцитоза – процент нейтрофилов, захвативших частицы латекса, интенсивность фагоцитоза – число поглощенных микросфер латекса в 100 подсчитанных нейтрофилах и фагоцитарное число число поглощенных микросфер латекса в среднем приходящееся на один фагоцит.

2.9.2 Определение фагоцитарной активности нейтрофильных гранулоцитов периферической крови методом проточной Для определения фагоцитарной активности нейтрофилов методом проточной цитофлюориметрии, суточные культуры St. aureus, культивируемые на скошенном агаре, смывали изотоническим раствором хлорида натрия, убивали нагреванием 96-98°С в течение 40 минут и осаждали путем центрифугирования в течение 25 минут при 1000 оборотах в минуту.

После этого дважды отмывали в 10 мл фосфатно-солевого буфера (ФСБ, рН 7,4). По стандарту мутности концентрацию бактерий доводили до млн/мл карбонатно-бикарбонатным буфером (рН 9,5). К взвеси бактерий добавляли флуоресцеин изотиоцианат (ФИТЦ) (Sigma, США) в конечной концентрации для убитых бактерий 0,1мг/мл, инкубировали при +4°С в течение 12 часов. Затем несвязавшийся ФИТЦ удаляли путем трехкратной отмывки ФСБ, в течение 25 минут при 1000 оборотах в минуту.

Концентрацию бактерий доводили до 500 млн/мл по стандарту мутности.

Взвесь бактерий аликвотировали и хранили при -60°С до 6 месяцев [49].

Для постановки реакции использовали цельную гепаринизированную венозную кровь и взвесь ФИТЦ-меченых микроорганизмов в соотношении 1:10. Пробы инкубировали при температуре 37°С в течение 30 минут [17].

По окончании инкубации проводили лизис эритроцитов и фиксацию лейкоцитов с использованием лизирующего комплекта реагентов ImmunoPrepтм (в состав набора входит реагент А – лизирующий эритроциты, реагент В – стабилизирующий и реагент С – фиксирующий реагент) на автоматической станции пробоподготовки Q-Prepтм. Анализ образцов проводили на проточном цитофлуориметре Cytomics FC500 фирмы BeckamCoulter, США.

В окне Dot Plot по показаниям прямого и бокового светорассеивания однопараметрическая гистограмма по FL1 для нейтрофилов. Процент флуоресцирующих (фагоцитировавших) нейтрофилов высчитывался автоматически, что отражалось в соответствующих гистограммах таблицах статистики. Количество собираемых событий по нейтрофилам не менее 3000.

Также оценивали и такой показатель как Х Mean, который являлся средней геометрической интенсивности свечения клеток и позволял судить о количестве частиц, захваченных клетками.

2.9.3 Метод оценки внутриклеточного кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов мукозальных секретов с Исследование внутриклеточного кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов осуществляли при помощи НСТ-теста. Метод основан на учете интенсивности восстановления клетками нитросинего тетразолия (НСТ) в его нерастворимую форму – диформазан. Этот процесс происходит в результате резкого усиления окислительного метаболизма в активированных фагоцитах (респираторный взрыв), следствием чего является образование целого ряда первичных (супероксидный анион, перекись водорода, гидроксильный радикал, синглетный кислород) и вторичных (гипохлорная кислота, хлорамин, продукты перекисного окисления липидов) метаболитов, обладающих мощной бактерицидной активностью. При этом темные гранулы диформазана выпадают внутри способности нейтрофилов к восстановлению НСТ отражает дефекты кислородзависимых механизмов бактерицидности и может служить гранулоцитов [39].

индуцированном (стимулированном) [25]. Показатели спонтанного НСТтеста указывают на степень активации кислородзависимых механизмов индуцированного теста дают представление о способности нейтрофильных гранулоцитов к активации in vitro под воздействием стимуляторов. В качестве стимулятора был выбран полистирольный латекс в концентрации 108 частиц/мл, диаметром частиц 1,7 мкм [38].

Постановку метода осуществляли в модификации А. Н. Маянского и М. Е. Виксмана (1979). В пробирки с 0,1 мл взвеси клеток добавляли 0, мл 0,2% раствора НСТ. После 30-минутной инкубации при температуре +370С. Из полученной суспензии готовили мазки, высушивали на воздухе, фиксировали 960 этиловым спиртом и окрашивали 0,1% водным раствором сафранина в течение 5 минут.

Учет реакции проводили с помощью световой иммерсионной микроскопии (Zeiss Primo Star) при увеличении 90х10х1,5.

Параллельно с помощью НСТ-теста определяли способность нейтрофильных гранулоцитов крови и мукозальных секретов отвечать повышением метаболической активности на стимуляцию частицами латекса.

Для этого в пробирку с исследуемым материалом (0,1 мл) и НСТ (0,05 мл) добавляли 0,02 мл монодисперсного полистирольного латекса с диаметром частиц 1,7 мкм в концентрации 1х108 частиц/мл (суспензии микросфер латекса получены из ВНИИСК г. Санкт-Петербурга).

При учете реакции определяли процент клеток, восстанавливающих НСТ (активность НСТ-теста), и интенсивность реакции восстановления НСТ.

Для этого НСТ-позитивные клетки делили на 3 группы: А – клетки с единичными гранулами диформазана в цитоплазме (+), B – клетки с цитоплазмой, наполовину заполненной гранулами диформазана (++), C клетки с цитоплазмой, полностью заполненной диформазаном (+++).

Интенсивность реакции рассчитывали по формуле:

Кроме того, рассчитывали функциональный резерв нейтрофилов (ФР), который определяли как соотношение между коэффициентами интенсивности реакции НСТ-индуцированного и НСТ- спонтанного тестов.

2.9.4 Определение внутриклеточного кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов периферической крови методом Для определения внутриклеточного кислородзависимого метаболизма нейтрофилов периферической крови методом проточной цитофлюориметрии дихлорофлуоресцеина диацетат (ДХФ-ДА). ДХФ-ДА пассивно проникая внутрь клетки, обрабатывается эстеразами, в результате чего отщепляются две ацетильные группы. Таким образом, дихлорофлуоресцеин становится полярным соединением, неспособным диффундировать обратно из клетки.

Краситель, главным образом, после реакции с перекисью водорода, флуоресцирующее соединение (область зеленого спектра), что позволило анализировать клетки по интенсивности свечения красителя с помощью проточной цитометрии. Для индукции кислородного «взрыва», оцениваемого с помощью этого метода, использовали классический стимулятор - форбол 12миристат 13-ацетат, активатор протеинкиназы С [160].

С помощью проточной цитофлуориметрии оценивали интенсивность (стимулированная флуоресценция) в относительных единицах и рассчитывали индекс стимуляции [50].

Для приготовления маточного раствора дихлорофлуоресцеин диацетата (Sigma) 4,87 мг порошка ДХФ-ДА растворяли в 1 мл диметилсульфоксида (ДМСО) (Sigma). Для приготовления маточного раствора форбол миристат ацетат (Sigma) 0,662 мг порошка растворяли в 1 мл ДМСО. Приготовление рабочих растворов осуществляли в день постановки (все растворы не подлежат хранению) по следующей схеме: рабочий раствор ДХФ-ДА готовили путем добавления к 1 мкл маточного раствора ДХФ-ДА (10мМ) мкл фосфатно-солевого буфера; рабочий раствор форбол миристат ацетата – 1 мкл маточного раствора ФМА (1,5мМ) разводили 200 мкл фосфатносолевого буфера.

гепаринизированной (10-15 ЕД/мл гепарина) периферической венозной крови смешивали со 100 мкл фосфатно-солевого буфера. К полученной смеси добавляли 20 мкл рабочего раствора ДХФ-ДА и инкубировали при температуре +370С в течение 30 минут. После инкубации раствор лизировали в течение 15 минут путем добавления 250 мкл лизирующего раствора. В пробирку добавляли 350 мкл фосфатно-солевого буфера.

гепаринизированной (10-15 ЕД/мл гепарина) периферической венозной крови лизировали путем добавления 250 мкл лизирующего раствора в течение минут. По истечению указанного времени клетки отмывали в фосфатносолевом буфере путем центрифугирования при 1500 об/мин в течение минут, надосадок сливали. Клетки в пробирке смешивали со 100 мкл фосфатно-солевого буфера, к раствору добавляли 20 мкл рабочего раствора ДХФ-ДА и 5 мкл рабочего раствора ФМА. Раствор инкубировали при температуре +370С в течение 30 минут. В пробирку добавляли 350 мкл фосфатно-солевого буфера [17].

Анализ образцов проводили на проточном цитофлуориметре Cytomics FC500 (BeckamCoulter, США) в течение часа после постановки. По показателям прямого и бокового светорассеивания в окне Dot Plot гейтировалась популяция нейтрофилов. В гистограмме FL1 отражалась интенсивность флуоресценции нейтрофилов в зеленой области спектра, а в соответствующем им окне статистики отражались показатели среднегеометрической интенсивности свечения меченых клеток (Х Mean).

Количество собираемых событий по нейтрофилам не менее 2000. В стимулированной флуоресценции, а также рассчитывали индекс стимуляции фагоцитарных клеток. Индекс стимуляции фагоцитарных клеток – частное от деления процента клеток со свечением дихлорофлуоресцеина диацетата после стимуляции форбол миристат ацетатом на процент клеток со спонтанным свечением дихлорофлуоресцеина диацетата.

2.9.5 Метод определения лизосомальной активности нейтрофильных Число лизосом в цитоплазме фагоцитов представляет собой показатель, отражающий их функциональную активность и способность к реагированию на внешние воздействия. Прижизненное исследование интенсивности люминесценции лизосом в цитоплазме фагоцитов, окрашенных акридиновым оранжевым, является одним из методов оценки состояния лизосомального аппарата клеток [21, 75].

Окрашивание нейтрофильных гранулоцитов проводили в суспензии клеток. Для этого 0,2 мл суспензии соединяли с 0,02 мл раствора акридинового оранжевого в концентрации 2 мкг/мл. Клетки инкубировали 30 минут при температуре 37 0С. Каплю осадка помещали на предметное стекло, накрывали покровным стеклом и микроскопировали под масляной иммерсией в потоке сине-фиолетового света люминесцентного микроскопа Nikon eclipse 50i.

Подсчет лизосом в нейтрофилах проводили полуколичественно в «крестах» [74]. При заполнении лизосомами всей цитоплазмы нейтрофила клетку считали на три креста (+++), если лизосомы занимали половину поверхности цитоплазмы, клетку считали на два креста (++), наличие в цитоплазме единичных лизосом оценивали на один крест (+), при отсутствии флюоресцирующих гранул в цитоплазме нейтрофилов клетку считали нулевой.

По формуле перерассчитывали индекс суммарной люминесценции лизосом (ИСЛЛ), выраженный в условных единицах:

где – A, B, C, D – количество клеток с заполнением цитоплазмы лизосомальными гранулами на +, ++, +++ или, соответственно, с их отсутствием.

2.10 Определение рецепторов CD11b и CD95 на нейтрофильных гранулоцитах методом проточной цитофлюориметрии Определение популяционного состава нейтрофилов проводили методом проточной цитофлюориметрии, уникальность которого заключается в возможности исследовать целевую клеточную популяцию в среде гетерогенного образца [35, 22, 155]. Тест основан на способности специфических моноклональных антител связываться с дискретными антигенными детерминантами, экспрессированными на поверхности нейтрофилов. В процессе инкубации образца с реагентом происходит специфическое окрашивание. После этого эритроциты удаляются путем лизирования, а клетки белой крови анализируются на проточном цитофлуориметре с использованием гейта нейтрофилов.

Антиген CD95 это трансмембранный гликопротеин с молекулярной массой 40 – 50 кДа. Он входит в суперсемейство рецептора фактора роста нервов / фактора некроза опухолей (NGFR / TNF) и содержит три повтора, богатых цистеином [139]. CD95 антиген принадлежит к так называемому семейству рецепторов клеточной гибели и высоко экспрессируется на активированных лейкоцитах [146, 143], уровень экспрессии на гранулоцитах и моноцитах может сильно варьироваться [158]. CD95 антиген исследователи в основном связывают с индукцией лейкоцитами апоптоза [190].

CD11b является альфа-цепью интегнина CR3. CD11b экспрессируется на гранулоцитах, моноцитах, естественных киллерах, а также различных субпопуляциях лимфоцитах [120]. Играет роль в миграции макрофагов из кровяного русла в очаг воспаления в процессе иммунного ответа [170], является молекулой межклеточной адгезии [185, 102]. CD11b-рецептор, участвует в процессах распознавания фагоцитами объектов фагоцитоза [9].

Непосредственно для окрашивания были использованы одноцветные реагенты: CD11b-FITC и CD95-PE (BeckamCoulter, США).

Окрашивание моноклональными антителами проводили в цельной крови. С этой целью, после 8-ми кратного осторожного переворачивания вакуумной пробирки, по 100 мкл крови помещали в пробирку размером 12х75 мм и добавляли в нее по 10 мкл антител CD11b-FITC и CD95-PE. Для учета изменения рецепторного аппарата нейтрофила после активации мкл крови смешивали с 5 мкл раствора ФМА (1,5мМ) и инкубировали при 370С в течение 30 минут. Затем в пробирку добавляли по 10 мкл антител CD11b-FITC и CD95-PE. Пробирки инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 25 минут. По окончании инкубации проводили лизис эритроцитов и фиксацию лейкоцитов с использованием лизирующего комплекта реагентов Immuno-Prepтм (в состав набора входили реагент А – лизирующий эритроциты, реагент В – стабилизирующий и реагент С – фиксирующий) на автоматической станции пробоподготовки Q-Prepтм.

Готовый образец анализировали на лазерном проточном цитофлюориметре Cytomics FC500 (BeckamCoulter, США), с использованием гомогенного гейтирования по показателям светорассеяния.

2.11 Методы статистической обработки материала Полученные результаты исследования были подвергнуты статистической обработке на ПК под управлением операционной систем Windows Vista с использованием пакета прикладных компьютерных программ Statistica for Windows (v. 8.0). Полученные данные обработали общепринятыми методами вариационной статистики и представили в виде средней арифметической и ее стандартной ошибки (M ± m), n – количество наблюдений в выборке. О достоверности межгрупповых различий судили с помощью непараметрических критериев Манна-Уитни и ВальдаВольфовица. Проверка статистических гипотез осуществляли при критическом уровне значимости р 0,05. Представленные цифровые данные были округлены до второго десятичного знака.

Глава 3 Особенности функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов слюны, вагинального и цервикального секретов 3.1 Оценка соотношения морфологических форм интактных нейтрофильных гранулоцитов и количества нейтрофильных внеклеточных ловушек в слюне, вагинальном и цервикальном Известно, что нейтрофильные гранулоциты, выходя на поверхность слизистых оболочек и встречаясь с представителями нормальной микрофлоры и другими компонентами секрета, активируются и погибают. В этой связи, одной из задач нашего исследования была сравнительная оценка процентного соотношения морфологических форм нейтрофильных гранулоцитов, входящих в состав различных биологических секретов, между собой, а также определение количества нейтрофильных внеклеточных ловушек, содержащихся в мукозальных секретах.

Использование в работе сложного метода окрашивания с применением двух красителей: синьки Эванса и Sytox Green, позволило не только выявить процентное содержание нейтрофильных внеклеточных ловушек в мукозальных секретах, но и определить соотношение различных морфологических форм нейтрофилов в них.

При сравнении показателей количества нейтрофильных внеклеточных ловушек, присутствующих в слюне у мужчин и у женщин в разные фазы менструального цикла, было обнаружено, что у мужчин в слюне достоверно выше количество НВЛ по сравнению с этим показателем у женщин в первую фазу и значимо ниже по отношению к женщинам во вторую фазу менструального цикла (таблица 3.1.1).

У женщин во всех биологических секретах во вторую фазу менструального цикла наблюдалось достоверное увеличение количества нейтрофильных внеклеточных ловушек по сравнению с этим показателем в первую фазу.

Таблица 3.1.1 – Сравнительный анализ содержания нейтрофильных внеклеточных ловушек в различных мукозальных секретах у здоровых мужчин и женщин, % (M ± m) # - достоверность отличий между показателями у мужчин и женщин в I фазу м.ц.

## - достоверность отличий между показателями у мужчин и женщин во II фазу м.ц.

* - достоверность отличий между показателями у женщин в I и II фазу м.ц.

** - достоверность отличий между показателями в слюне и вагинальном секрете *** - достоверность отличий между показателями в слюне и цервикальном секрете **** - достоверность отличий между показателями в вагинальном и цервикальном секрете м.ц. – менструальный цикл При изучении количества нейтрофильных внеклеточных ловушек, присутствующих в различных биологических секретах, установлено, что максимальное количество внеклеточной ДНК входит в состав секрета слюны.

Во вторую фазу менструального цикла у женщин в цервикальном секрете было выявлено достоверно более высокое количество внеклеточных менструального цикла у женщин количество нейтрофильных внеклеточных ловушек в секретах урогенитального тракта примерно одинаковое.

У мужчин в слюне значимо выше содержание жизнеспособных нейтрофилов по сравнению с этим показателем у женщин как в первую, так и во вторую фазы менструального цикла (таблица 3.1.2).

Таблица 3.1.2 – Сравнительный анализ содержания жизнеспособных клеток в популяции нейтрофильных гранулоцитов в различных мукозальных секретах у здоровых мужчин и женщин, % (M ± m) нейтрофильных гранулоцитов, присутствующих в различных биологических секретах, между женщинами в первую и женщинами во вторую фазы менструального цикла выявлено не было ни в одном из исследуемых материалов.

Проведенное исследование установило, что наибольшее количество жизнеспособных клеток входит в состав цервикального секрета независимо от фазы менструального цикла.

В ходе выполения исследования было выявлено, что в слюне у мужчин достоверно ниже содержание нейтрофильных гранулоцитов в состоянии апоптоза по сравнению с этим показателем у женщин, как в первую, так и во вторую фазу менструального цикла (таблица 3.1.3). У женщин количество нейтрофильных гранулоцитов в состоянии апоптоза во вторую фазу менструального цикла было ниже, чем в первую во всех исследованных мукозальных секретах.

Таблица 3.1.3 – Сравнительный анализ содержания нейтрофилов в состоянии апоптоза в популяции нейтрофильных гранулоцитов в различных мукозальных секретах у здоровых мужчин и женщин, % (M ± m) состоянии апоптоза в различных биологических секретах, было установлено, что минимальное значение данный показатель принимал у нейтрофильных гранулоцитов цервикального секрета, а максимальное у нейтрофилов слюны.

Из данных приведенных в таблице 3.1.4 видно, что в слюне у мужчин содержалось достоверно большее количество мертвых нейтрофильных гранулоцитов по сравнению с этим показателем у женщин, как в первую, так и во вторую фазы менструального цикла.

Ни в одном из исследуемых мукозальных секретов значимых отличий между показателями количества мертвых клеток, входящих в их состав у женщин в разные фазы менструального цикла, выявлено не было.

У женщин в состав цервикального и вагинального секретов входит достоверно большее количество мертвых клеток при сравнении со слюной.

Таблица 3.1.4 – Сравнительный анализ содержания мертвых клеток в популяции нейтрофильных гранулоцитов в различных мукозальных секретах у здоровых мужчин и женщин, % (M ± m) Вагинальный секрет 11,8±1,12** 12,6±1,28** Цервикальный секрет 13,8±1,12*** 13,4±1,20*** Таким образом, при изучении секрета слюны было установлено, что процентное соотношение морфологических форм нейтрофильных гранулоцитов зависит от пола донора и фазы менструального цикла у женщин.

У женщин во вторую фазу менструального цикла во всех исследуемых мукозальных секретах происходит достоверное увеличение количества нейтрофильных внеклеточных ловушек и снижается количество нейтрофильных гранулоцитов в состоянии апоптоза.

При сравнении морфологических форм нейтрофильных гранулоцитов слюны, цервикального и вагинального секретов у женщин было установлено, что наибольшее количество нейтрофильных внеклеточных ловушек и апоптозных клеток входит в состав секрета слюны, при этом в цервикальном секрете достоверно выше количество жизнеспособных клеток относительно двух других секретов.

3.2 Оценка лизосомальной активности интактных нейтрофильных гранулоцитов в различных мукозальных секретах Число лизосом в цитоплазме фагоцитов представляет собой показатель, отражающий их функциональную активность и способность к реагированию на внешние воздействия. Изменение уровня поглощения флюорохрома свидетельствует об увеличении текучести цитоплазматической мембраны и изменении ее поляризации, что, в первую очередь, рассматривается как один из показателей, характеризующих функциональную активность и полноценность фагоцитирующих клеток. Интенсивность люминесценции лизосом нейтрофилов, прижизненно окрашенных акридиновым оранжевым, является одним из методов оценки состояния лизосомального аппарата клеток и их функциональной активности [74, 17].

гранулоцитов, входивших в состав секрета слюны, было установлено, что значения этого показателя у мужчин значимо ниже, чем у женщин не зависимо от фазы менструального цикла (таблица 3.2.1).

Следует отметить, что показатели лизосомальной активности нейтрофильных гранулоцитов в вагинальном и цервикальном секрете у женщин во вторую фазу менструального цикла были достоверно ниже, чем в первую фазу менструального цикла. При этом в слюне хоть и наблюдалось незначительное снижение данного показателя у женщин во вторую фазу менструального цикла, но достоверных отличий от показателей лизосомальной активности нейтрофилов у женщин в первую фазу выявлено не было.

Таблица 3.2.1 – Сравнительный анализ лизосомальной активности нейтрофильных гранулоцитов в различных мукозальных секретах у здоровых мужчин и женщин, у.е. (M ± m) значение лизосомальная активность нейтрофильных гранулоцитов принимала в цервикальном секрете у женщин в первую фазу менструального цикла.

3.3 Оценка фагоцитарной функции интактных нейтрофильных гранулоцитов в различных мукозальных секретах Нейтрофилы, являясь одними из главных клеток врожденного иммунитета, осуществляют первую линию в защите организма от инфекций. В основе защитной функции нейтрофильных гранулоцитов лежит фагоцитарный процесс, заключающийся в их способности распознавать, поглощать, убивать и переваривать микробные клетки [17].

При изучении фагоцитарной функции нейтрофильных гранулоцитов слюны было установлено, что у мужчин показатели активности и интенсивности фагоцитоза, а так же фагоцитарное число достоверно выше, чем данные показатели у женщин, как в первую, так и у женщин во вторую фазу менструального цикла (таблица 3.3.1).

гранулоцитов мукозальных секретов у женщин в первую и во вторую фазы менструального цикла между собой различий в значениях выявлено не было ни в одном из изучаемых секретех.

Таблица 3.3.1 – Сравнительный анализ фагоцитарной функции нейтрофильных гранулоцитов в различных мукозальных секретах у здоровых мужчин и женщин, (M ± m) Примечание для таблицы 3.3.1:

АкФ – активность фагоцитоза ИнФ – интенсивность фагоцитоза ФЧ – фагоцитарное число При анализе фагоцитарной функции нейтрофильных гранулоцитов в различных биологических секретах было установлено, что наибольшее количество нейтрофилов активно фагоцитирующих чужеродные объекты, содержалось в цервикальном секрете у женщин, не зависимо от фазы менструального цикла при сравнении с клетками вагинального секрета и слюны.

Такие показатели фагоцитоза как интенсивность и фагоцитарное число у нейтрофилов слюны были достоверно ниже, чем у нейтрофилов вагинального и цервикального секрета.

3.4 Оценка внутриклеточного кислородзависимого метаболизма интактных нейтрофильных гранулоцитов в различных мукозальных Важное значение в антимикробной активности фагоцитирующих клеток занимает «кислородный взрыв», вследствие чего генерируются активные формы кислорода в системе НАДФН-оксидазы [17]. Оценка «кислородного взрыва» интактных нейтрофильных гранулоцитов слюны, вагинального и цервикального секрета осуществлялась с помощью НСТтеста, результаты представлены в таблице 3.4.1.

В ходе эксперимента было установлено, что показатели НСТ-теста нейтрофильных гранулоцитов вагинального и цервикального секретов у женщин оставались неизменными на протяжении всего менструального цикла. Значения и спонтанного, и индуцированного НСТ-теста нейтрофилов слюны не зависели от пола и фазы менструального цикла обследуемы лиц.

Таблица 3.4.1 – Сравнительный анализ внутриклеточной кислородной бактерицидности интактных нейтрофильных гранулоцитов в различных мукозальных секретах у здоровых мужчин и женщин, (M ± m) Примечание для таблицы 3.4.1:

Акт – активность НСТ-теста Ин – интенсивность НСТ-теста ФР – функциональный резерв При сравнении результатов спонтанного НСТ-теста нейтрофильных гранулоцитов различных биологических секретов между собой было установлено, что в первую фазу менструального цикла у женщин в цервикальном секрете показатели активности и интенсивности НСТ-теста значимо выше, чем эти же показатели у нейтрофилов слюны. Во вторую фазу менструального цикла наблюдалось достоверное увеличение активности и интенсивности спонтанной реакции у нейтрофильных гранулоцитов цервикального секрета по сравнению с аналогичными показателями клеток вагинального секрета и слюны.

Изучение индуцированного НСТ-теста показало, что не зависимо от фазы менструального цикла максимальное значение показатели активности и интенсивности принимали у нейтрофильных гранулоцитов цервикального секрета. При этом следует отметить, что во вторую фазу менструального цикла у женщин показатели индуцированного НСТ-теста нейтрофилов вагинального секрета достоверно выше аналогичных значений у нейтрофильных гранулоцитов слюны и ниже показателей, показанных клетками цервикального секрета.

Таким образом, популяции нейтрофильных гранулоцитов, входившие в состав слюны, вагинального и цервикального секретов, различались между собой не только по морфологическому составу, но и по функциональной активности.

количество жизнеспособных клеток, которые активнее, чем нейтрофилы слюны и вагинального секрета, проявляют свою лизосомальную активность.

Клетки, входившие в состав цервикального секрета, в большем количестве и интенсивнее, чем в других секретах, участвуют в процессе захватывания чужеродных частиц и уничтожения их путем фагоцитоза, а также имют более высокий кислородзависимый потенциал.

Нейтрофилы слюны хоть и обладают более низкой фагоцитарной и лизосомальной активностью по сравнению с клетками цервикального и вагинального секрета, но содержат в своем составе наибольшее количество нейтрофильных внеклеточных ловушек. Нейтрофильные гранулоциты, входившие в состав вагинального секрета, относительно других секретов имеют наименьшие показатели как внутриклеточной, так и внеклеточной бактерицидности.

Из полученных данных можно высказать предположение, что нейтрофильные гранулоциты цервикального секрета выполняют свою бактерицидную функцию в основном за счет фагоцитоза, нейтрофилы же слюны уничтожают чужеродные микроорганизмы путем внеклеточного килинга за счет образования нейтрофильных внеклеточных ловушек.

Следует отметить, что количество внеклеточных ловушек и лизосомальная активность нейтрофилов вагинального и цервикального секретов претерпевает изменения на протяжении менструального цикла. Во вторую фазу менструального цикла наблюдается увеличение количества внеклеточных ловушек и снижение лизосомальной активности нейтрофилов по сравнению с показателями в первую фазу.

Морфологический состав популяции нейтрофилов, а также показатели фагоцитоза и лозосомальная активность в слюне у мужчин и женщин имеют достоверные различия.

Глава 4 Функциональный ответ нейтрофильных гранулоцитов слюны, вагинального и цервикального секретов на стимуляцию пирогеналом и распространение получила иммунoтропная терапия. В связи с этим, функциональный ответ клеток присутствующих в мукозальных секретах.

Иммунотропные препараты, используемые в современной клинической практике, разделены по происхождению действующего вещества на группы [71].

наибольшее влияние оказывают препараты микробного и эндогенного происхождения и препараты, не имеющие аналогов в природе.

Для оценки влияния иммунотропных препаратов на нейтрофильные гранулоциты слюны, цервикального и вагинального секретов было принято решение использовать два препарата микробной и немикробной природы. В качестве микробного активатора был выбран препарат пирогенал, который является иммунотропным липополисахаридом (липополисахарид, выделенный из клеток Salmonella typhi), оказывающим пирогенное и интерфероногенное действие. Пирогенал является иммуномодуляторм широкого спектра действия, оказывает влияние на функцию коры надпочечников, повышая концентрацию кортикостероидов в крови [45].

Основная область использования пирогенала как средства неспецифической стимулирующей терапии – хронические инфекционно-воспалительные заболевания. Действуя на клетки фагоцитарной системы, пирогенал активирует фагоцитоз, увеличивает секрецию кислородных радикалов, синтез ИЛ-1, ИЛ-2, фактор некроза опухоли, интерферона, а так же стимулирует кининовую систему [19].

В качестве активатора немикробной природы был использован форбол-12-миристат-13-ацетат, который относится к группе форболовых эфиров. ФМА легко проникает внутрь клетки, способен активировать протеинкиназу С.

4.1 Влияние пирогенала и ФМА на соотношение морфологических форм нейтрофильных гранулоцитов и количества нейтрофильных внеклеточных ловушек в слюне, вагинальном и цервикальном При изучении влияния препаратов пирогенал и ФМА на процесс формирования внеклеточных ловушек нейтрофильными гранулоцитами слизистых оболочек репродуктивного тракта женщин и слюны было установлено, что оба препарата приводили к увеличению содержания внеклеточных ловушек в мукозальных секретах независимо от фазы менструального цикла и от пола исследуемых лиц (таблица 4.1.1).

Достоверных различий по показателю количества нейтрофильных внеклеточных ловушек в секретах после активации нейтрофильных гранулоцитов пирогеналом и в секретах после активации клеток ФМА выявлено не было.

При сравнении количества внеклеточной ДНК, содержащейся в вагинальном и цервикальном секретах, а так же в слюне у женщин в разные периоды менструального цикла после воздействия пирогеналом значимых различий выявлено не было. Аналогичные результаты получены и после активации ФМА, в отличие от контрольных групп, в которых во вторую фазу менструального цикла было выявлено достоверное увеличение содержания внеклеточных ловушек во всех секретах.

Таблица 4.1.1 – Влияние пирогенала и ФМА на содержание нейтрофильных внеклеточных ловушек в различных мукозальных секретах, % (M ± m) Контроль – мукозальный секрет + физиологический раствор Пирогенал – мукозальный секрет + пирогенал ФМА – мукозальный секрет + ФМА м.ц. – менструальный цикл * - достоверность отличий при сравнении контроля с пирогеналом ** - достоверность отличий при сравнении контроля с ФМА *** - достоверность отличий при сравнении пирогенала с ФМА # - достоверность отличий между показателями у мужчин и женщин в I фазу м.ц.

## - достоверность отличий между показателями у мужчин и женщин во II фазу м.ц.

### - достоверность отличий между показателями у женщин в I и II фазу м.ц.

Количество нейтрофильных внеклеточных ловушек, входивших в состав секрета слюны, у мужчин после активации пирогеналом и ФМА не отличалось от такого же показателя у женщин.

В слюне, после воздействия активаторов микробной и немикробной природы, наблюдали более высокое содержание НВЛ по сравнению с вагинальным секретом и цервикальным секретом, как и в нативных препаратах. При изучении неактивированных мукозальных секретов было показано, что содержание внеклеточных ловушек в составе вагинального секрета немного ниже, чем в цервикальном, однако после воздействия пирогеналом и ФМА разницы обнаружено не было. После активации пирогеналом в секретах репродуктивного тракта женщин количество НВЛ составило около 22% от общей популяции нейтрофилов, после воздействия ФМА данный показатель составил около 24%.