МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОЙ ЗАЩИТЫ

РЕСПУБЛИКИ МОЛДОВА

МСПУ ИНСТИТУТ ОНКОЛОГИИ МОЛДОВЫ

На правах рукописи

УДК: 618.146-006.5-02

Ирена ДИГОЛ

ФАКТОРЫ РИСКА ИНФИЦИРОВАНИЯ ШЕЙКИ МАТКИ

ОНКОГЕННЫМИ ТИПАМИ ВИРУСА ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА

14.00.14 – Онкология и радиотерапия Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук

КИШИНЕВ – 2005 Содержание Введение………………………………………………………………………..….. 4 Глава I. Возбудители инфекций, передаваемых половым путем, и их роль в онкогенезе (Обзор литературы)…………………………………………………… Глава 1.1. Роль вирусной инфекции в этиологии рака шейки матки…..…….... 1.1.1. Роль вируса простого герпеса в онкогенезе…………….….... 1.1.2. Факторы риска инфицирования ВПЧ и их роль в развитии фоновых процессов, дисплазии и рака шейки матки…………...…. Глава 1.2. Возбудители других инфекций передаваемых половым путем и их роль в развитии предрака и рака шейки матки……..………...……………….… Глава 1.3. Вопросы этиологии и патогенеза рака шейки матки………...……... Глава 1.4. Скрининг предрака и рака шейки матки……………………...……... 1.4.1. Эффективность цитологического скрининга предраковых и раковых заболеваний шейки матки………………………….. 1.4.2. Эффективность кольпоскопического исследования………... 1.4.3. Роль ВПЧ-типирования в селективном скрининге предрака и рака шейки матки……………………………………………... Глава 1.5. Вопросы терапии ВПЧ-инфекции…………………………………..... Глава II. Oбъекты, материалы и методы исследования…………..…………... Глава III. Характеристика обследованных групп…………………………...… Глава IV. Распространенность ВПЧ среди женщин репродуктивного возраста на территории Республики Молдова…………………...……………………….. 4.1. Эпидемиология папилломавирусной инфекции…………..……… 4.2. Распространенность папилломавирусной инфекции у женщин с различными гинекологическими заболеваниями ……..………….. 4.3. Характеристика кольпоскопических и морфологических изменений шейки матки при папилломавирусной инфекции ……………….... 4.4. Результаты контрольного исследования на онкогенные типы ВПЧ………………………………………………………………...…. Глава V. Прогнозирование возможности инфицирования женщин онкогенными типами вирусов папилломы человека ………………..……....…. Заключение …………………………………………………………………..…. Выводы ……………………….…………………………………………………. Практические рекомендации …………………………………….…………… Библиография ………………………………………………………………….. Резюме ……………………………………………………………………………. Список используемых сокращений...……………………………………….. Приложения …………………………………………………………………….. Введение Во многих странах, в том числе и в Молдове (по данным Канцер Регистра), отмечается рост онкологической заболеваемости [244]. Так в 1999 г.

в Молдове регистрировали 5226 случаев, в 2001 г. – 5952, в 2003 г. – новых случаев злокачественных новообразований. Рак шейки матки (РШМ) и сегодня остается одной из самых актуальных проблем в онкогинекологии, занимая одно из ведущих мест в структуре онкологической заболеваемости женского населения планеты [119].

По данным ВОЗ, ежегодно в мире впервые выявляется более больных РШМ [217]. РШМ занимает ведущее место (45,8%) в структуре онкогинекологической патологии в Республике Молдова (2004 г.); при этом за последние годы наблюдается рост этой патологии с 13,6 на 100 000 женского населения – в 1999 году до 16,1 – в 2004 году. Согласно данным Канцер Регистра произошли существенные изменения в возрастной структуре заболеваемости за последние 13 лет, выразившиеся в ее снижение в старших возрастных группах (в возрастной группе 30-59 лет - на 2,2%, и старше 60 лет – на 55,5%) и повышение у женщин до 30 лет (на 373,7%).

Современные представления об этиологии РШМ говорят о важной роли экзогенных факторов, в первую очередь инфекционных агентов, передаваемых половым путем. РШМ является первым выявленным типом рака у женщин, вызываемым вирусом [176]. Многочисленные исследования свидетельствуют о главенствующей роли в индукции опухолевого роста вирусов папилломы человека (ВПЧ), особенно типов 16,18 [241]. Установлено, что онкогенные типы ВПЧ занимают ведущее место в этиологии неоплазий шейки матки:

цервикальная интраэпителиальная неоплазия (ЦИН) I, ЦИН II, ЦИН III, микроинвазивный рак [214]. Bosh et al. (1995) установили, в 93% раковых опухолей шейки матки наблюдается положительная реакция на ВПЧ [214].

Согласно данным литературы встречаемость ВПЧ существенно разнится в различных этнико-географических регионах [241] и разноречивы данные относительно факторов риска инфицирования ВПЧ [120].

Вместе с тем, до настоящего времени отсутствуют сведения о распространенности разных типов (высокого и низкого онкогенного риска) ВПЧ среди женщин Республики Молдова, о частоте инфицирования онкогенными типами ВПЧ женщин с патологией дистальных отделов репродуктивной системы (вульвы, влагалища и шейки матки), оценке характера клинических, кольпоскопических и морфологических проявлений при ВПЧинфекции высокого и низкого онкогенного риска в Республике Молдова.

Не решенным остается роль различных факторов риска и степень их выраженности, позволяющие прогнозировать инфицирование ВПЧ высокого онкогенного риска (ВПЧ в.о.р.).

Отсутствие этих данных не позволяет обоснованно проводить профилактику инфицирования ВПЧ в целях снижения риска онкологической патологии шейки матки, что в комплексе и определило необходимость проведения настоящей работы.

онкогенными типами ВПЧ шейки матки женщин репродуктивного возраста и научно обосновать практические рекомендации по профилактике инфицирования ВПЧ высокого онкогенного риска.

Задачи исследования:

1. Определить частоту инфицирования ВПЧ, в том числе высокого онкогенного риска, у женщин репродуктивного возраста в женской популяции Республики Молдова.

2. Изучить частоту ВПЧ у женщин с моно - и смешанными инфекциями гениталий, передаваемыми половым путем (ИППП) (хламидии, вирус простого герпеса (ВПГ), трихомонады, гонорея, 3. Установить инфицированность онкогенными типами ВПЧ женщин с патологией вульвы, влагалища и шейки матки (фоновые процессы, ЦИН-I, ЦИН-II, ЦИН-III, микроинвазивный рак).

4. Выявить особенности клинических, кольпоскопических, морфологических изменений у женщин при наличии ВПЧинфекции.

5. Оценить роль различных факторов риска инфицирования женщин онкогенными типами ВПЧ и создать математическую модель индивидуального прогнозирования ВПЧ высокого онкогенного риска для разработки адекватных мер профилактики.

Научная новизна полученных результатов:

- Впервые установлена распространенность ВПЧ среди женщин репродуктивного возраста с ИППП, патологией дистальных отделов репродуктивной системы, проживающих на территории Республики Молдова.

- Выявлены особенности клинических, кольпоскопических и морфологических изменений при папилломавирусной инфекции среди изученного контингента.

- Подтверждена взаимосвязь инфицирования эпителия шейки матки онкогенными типами ВПЧ и неопластическими процессами: ЦИН-I, ЦИН-II, ЦИН-III, микроинвазивным раком шейки матки – среди женщин репродуктивного возраста Республики Молдова.

- Показана возможность персистенции онкогенных типов исследуемого вируса в эпителии шейки матки у женщин после проведенного лечения.

папилломавирусной инфекции, позволяет выявить ВПЧ при отсутствии клинических и морфологических его проявлений.

- Определена роль различных факторов риска инфицирования онкогенными типами папилломавирусов и создана математическая модель прогнозирования вероятности инфицирования ВПЧ в.о.р.

женщин репродуктивного возраста.

Теоретическая значимость и практическая ценность работы:

папилломавирусной инфекции у женщин репродуктивного возраста - Разработаны количественные критерии для индивидуального папилломавирусов.

- Обоснована система профилактических мероприятий для женщин репродуктивного возраста с различным уровнем вероятности риска инфицирования онкогенными типами ВПЧ.

- Показана необходимость длительного диспансерного наблюдения женщин с ВПЧ в.о.р. путем проведения повторных обследований на ВПЧ в сочетании с кольпоскопическим и цитологическим Апробация работы. Основные результаты докторской диссертации были представлены и обсуждены на ежегодных научных конференциях Государственного Университета Медицины и Фармакологии “Н. Тестимицану” (Кишинев, 2002, 2003, 2004), Юбилейной конференции Муниципальной клинической больницы №1 мун. Кишинева (2002), Национальном конгрессе по акушерству и гинекологии с международным участием (Бухарест, Румыния, 2002), III съезде онкологов и радиологов СНГ (г. Минск, Белоруссия, 2004), Республиканском научно-практическом семинаре “Современные возможности клинической онкологии” (г. Алматы, Казахстан, 2004), Национальном конгрессе онкологии с международным участием (Бухарест, Румыния, 2005).

Практическое внедрение. Полученные результаты внедрены в практическую деятельность кабинетов профилактического осмотра и гинекологических кабинетов Института Онкологии Молдовы, гинекологического отделения Муниципальной Клинической Больницы №1 мун.

Кишинэу, Центра Здоровья Женщины «Далила».

Публикации по теме работы: На основе полученных данных было опубликовано 13 научных работ, из которых 8 статей, в том числе самостоятельных. Было разработано и внедрено 1 рационализаторское предложение.

Объем и структура докторской диссертации: Диссертация написана на русском языке, редактирована на компьютере и состоит из: введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 3 глав собственных исследований с 4 подглавами, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы с 249 библиографическими источниками.

Работа изложена на 156 страницах, включает 39 таблиц, 19 рисунков и приложений.

Ключевые слова: папилломавирусная инфекция, полимеразно-цепная реакция, факторы риска, цервикальная интраэпителиальная неоплазия, инфекции, предаваемые половым путем.

Возбудители инфекций, передаваемых половым путем, и их роль в 1.1. Роль вирусной инфекции в этиологии рака шейки матки РШМ, несмотря на успехи в ранней диагностике и лечении, продолжает входить в число наиболее часто встречающихся злокачественных новообразований, что определяет необходимость изучения причин возникновения и факторов, способствующих его формированию [176]. Частота РШМ составляет 18,8 на 100.000 женского населения в мире. [188]. По распространенности РШМ занимает 1-ое место среди злокачественных новообразований женских половых органов [217]. Также РШМ занимает первое место среди причин женской смертности от рака [182]. Каждый год в мире диагностируется приблизительно 370000 новых случаев инвазивного РШМ [217], что составляет около 12% первичного рака среди женщин, ежегодно от него умирают около 200 000 женщин [124]. В целом по Европе смертность от РШМ составляет примерно 4 на 100000 женщин [147].

По данным Канцер Регистра Республики Молдова за 2004 г., РШМ занимает 1-е место в структуре онкогинекологической патологии (45,8%). При этом за последние годы зарегистрирован рост этой патологии с 13,6 на женского населения – в 1999 году до 16,1 – в 2004 году. Одновременно выявлены существенные изменения в возрастной структуре заболеваемости за последние 13 лет, выразившиеся в резком увеличении (в 3,7 раза) доли лиц в возрастной группе до 30 лет и снижении более чем в 2 раза удельного значения женщин старше 60 лет.

Современные представления об этиологии РШМ говорят о важной роли экзогенных факторов, а именно ИППП, в возникновении этого заболевания [6;

72]. Показана роль вирусной инфекции, передаваемой половым путем, в этиологии РШМ [209; 229]. С РШМ ассоциируются члены двух отдельных вирусных групп - это вирус простого герпеса второго серотипа (ВПГ-2) и определенные типы ВПЧ [3; 87; 105; 111; 161; 168].

1.1.1. Роль вируса простого герпеса в онкогенезе Роль ВПГ-2 в онкогенезе изучалась в 70-80-е годы. Считалось, что ВПГ-2, возможно, может выступать в ассоциации с бактериями и простейшими, в качестве кофактора канцерогенеза, инициируя развитие дисплазии шейки матки [231].

Ранее считалось, что генитальный герпес возникает при инфицировании ВПГ-2; однако в последнее время в Англии, США и Японии отмечается рост генитального герпеса, вызванного ВПГ первого серотипа (ВПГ-1), доходящего до 32% случаев [209], по данным других авторов в некоторых странах более половины всех новых случаев этого заболевания, особенно у женщин, вызывается ВПГ-1 [160].

В 1-15% случаев генитальный герпес протекает как клинически выраженные формы, однако у большинства людей, инфицированных генитальным герпесом он существует в виде атипичной бессимптомной формы [209]. У практически здоровых женщин присутствие антигена ВПГ в эпителиоцитах генитального тракта установлено в 24,3% случаев, а у больных эндоцервицитами, цервицитами, аднекситами этот антиген выявлен в 1,9 раз чаще, чем у здоровых. У женщин с хроническими воспалительными заболеваниями гениталий эти показатели еще выше - 42,8% [191; 202].

Применение типоспецифических серологических тестов помогло установить, что инфекция ВПГ-2 более распространена, чем считалось ранее [21; 44; 88; 134]. На распространенность ВПГ влияют такие факторы, как семейное положение, уровень образования, урбанизация, а также раса и пол [192; 194].

Большинство лиц, у которых обнаружены антитела к ВПГ-2 (60-70%), не имеют симптомов генитального герпеса. Эти люди, возможно, являются основным источником передачи возбудителя [104].

Показано существование явной связи РШМ и латентного герпеса женских половых органов. Ряд авторов обнаруживают среди женщин, страдавших герпетическим кольпитом и цервицитом, Ca in situ шейки матки в 7-21,1% случаев [212; 231].

Последовательности, гомологичные ДНК ВПГ были обнаружены примерно в 10-20% случаев РШМ при использовании методики ДНКгибридизации по одним данным [103] и у 35-67% больных РШМ согласно другим литературным источникам [209]. Они также найдены при неоплазиях вульвы [103]. Эти исследования подтверждают участие ВПГ второго серотипа в идентифицированы геномы вирусов герпеса, обладающие трансформирующей активностью. В геноме ВПГ-1 идентифицирован один трансформирующий участок, а в геноме ВПГ-2 – два [208].

В исследованиях J.R. Daling, M.M. Madeleine, B. McKnight et al. (1996) обнаружено достоверное повышение риска развития РШМ, связанного с ВПГ- среди женщин без ВПЧ, что показывает возможную роль ВПГ-2 в генезе 5-10% случаев РШМ, когда роль ВПЧ не установлена. По другим данным инфицированность ВПГ-2 влияет на развитие дисплазии шейки матки и препятствует её регрессии, но не влияет на прогрессию дисплазии в пре - и инвазивный РШМ [198].

Повышение частоты плоскоклеточной Ca in situ вульвы и временная взаимосвязь между неоплазией вульвы и генитальным герпесом подтверждают вирусные факторы канцерогенеза вульвы, влагалища и шейки матки [103].

1.1.2. Факторы риска инфицирования ВПЧ и их роль в развитии фоновых Папилломавирусы являются представителями семейства паповавирусов.

Они содержат капсидные белки трех типов, и комплексы замкнутой кольцевидной ДНК с клеточными гистонами, которые конденсированы в нуклеосомы и окружены икосаэдральными капсидами. Папилломавирусы инфицируют различные виды млекопитающих и позвоночных, они имеют несколько типов и подтипов у разных видов.

ВПЧ является центральным этиологическим фактором плоскоклеточного рака [228; 43; 181] и предраковых изменений шейки матки. Исследования, проведенные на основании технологии ПЦР, показали, что в 95% случаев инвазивного плоскоклеточного рака в тканях имеются маркеры ВПЧ. Это, главным образом, ДНК ВПЧ (более 95%), а также антитела к ВПЧ при отсутствии вирусной ДНК [11; 235; 242; 243].

ВПЧ различных типов были обнаружены в 93% случаев при РШМ, с незначительными отклонениями от этой цифры в различных странах. При этом чаще всего выявляли ВПЧ -16 (50%), ВПЧ-18 (12%), ВПЧ-45 (8%) и ВПЧ- (5%). ВПЧ-16 был преобладающим типом во всех странах [172], кроме Индонезии, где более распространенным оказался ВПЧ-18. Распространенность ВПЧ-45 была очевидна в Западной Африке, а в Центральной и Южной Америке – ВПЧ -39 и ВПЧ -59 [209; 11]. Распространенность ВПЧ-58 была очевидна в Китае [17; 18]. ВПЧ-16 был чаще обнаружен в сквамозных клетках карциномы, а ВПЧ-18 преобладал в аденокарциномах [11; 59]. Международные биологические исследования РШМ показывают, что различные типы ВПЧ географически распространены неодинаково. Если предположить, что распределение типов ВПЧ среди исследованных случаев отражает их распространенность в общей популяции, это должно быть показателем географически различного распространения РШМ [49; 85; 140; 111; 116; 133;

37; 162; 129; 57; 80; 99]. Согласно эпидемиологическим сведениям M.H.

Schiffman (1994), L. Koutsky (1997), E.L. Franco et al. (1999) встречаемость ВПЧинфекции среди женщин различных этнико-географических регионов, варьирует от 5% до 40%. Минимальная зарегистрированная частота инфицированности ВПЧ (5%) наблюдается в Испании - стране с «низким риском» РШМ [111]. Этот показатель выше на Филиппинах (9,2%). В Мексике, Бразилии, Марокко и Парагвае - странах с высокой заболеваемостью РШМздоровых женщин соответственно являются носительницами ВПЧ - инфекции [111; 116; 133]. B Аргентине и Гондурасе зараженность генитальными папилломавирусами достигает рекордных цифр и приближается к 40% [40; 162]. Несмотря на высокий социально-экономический и образовательный уровень, частота выявления ВПЧ у здоровых женщин США составляет 26%, а у жительниц Канады-21,8% [129]. Эти показатели в 1,5- раза превышают уровень ВПЧ-инфицированности, отмечаемый в развитых европейских странах, таких как Швеция (12,8%) Дания (10,7%) [58; 80; 100].

В.П. Казаченко и др. (1996) обследовали группу женщин с фоновыми процессами, предраковыми заболеваниями, а также с морфологически верифицированным диагнозом РШМ. Среди женщин с доброкачественной патологией методом ПЦР ВПЧ-16 был выявлен у 40% больных, ВПЧ- обнаружен не был. У всех больных РШМ обнаружены ВПЧ (16 и 18 типы) [205]. Наличие антител к ВПЧ-16 повышает риск развития РШМ в 10-20 раз, а риск развития цервикальной интраэпителиальной неоплазии (ЦИН) III – в раз по сравнению с неинфицированными женщинами [136]. Ряд проспективных исследований показал, что у женщин, инфицированных онкогенными типами ВПЧ, повышается риск прогрессии в ЦИН-II-III [175; 197; 199; 219; 221]. По мнению некоторых авторов ЦИН II-III является наиболее общим и ранним проявлением инфицирования онкогенными ВПЧ, причем большинство ЦИН IIIII возникают в течение 6 месяцев и не позднее чем через 24 месяца после инфекции ВПЧ в.о.р. [216].

Каждый год регистрируется почти 30 млн. новых случаев генитальной папилломавирусной инфекции. [117]. У 50% сексуально-активных подростков был диагностирован вирус папилломы, тем не менее, у большинства инфекция протекала транзиторно и спонтанно разрешилась [85]. Состояние персистенции возникает только в 1 из 30 случаев ВПЧ-инфекции [240]. Z. Trizna, Т. Evans, S.

Bruce et al. (1998) показали, что ВПЧ-инфекция носит временный характер и при первичной инфекции самоизлечение может наступить через 6-8 месяцев, по другим данным в 60% случаев ВПЧ-инфекция элиминируется из организма женщины в течение 1 года, и в 85% случаев - в течение 4 лет, антитела перестают определяться через 1-1,5 года у 70-80% инфицированных женщин [113]. Частота обнаружения антител к ВПЧ в.о.р. в группах женщин старше лет составляет менее 2%, в то время как антитела к другим типам ВПЧ выявляются чаще [240]. Период реконвалесценции затягивается при повторных заражениях ВПЧ в.о.р., при инфицировании несколькими типами папилломавирусов, а также при увеличении возраста пациентки.

трансформирующих белков считается необходимым этапом в патогенезе РШМ [26]. Предполагают, что в таких случаях проходит 3,5-4,5 года до появления тяжелой дисплазии и более 10 лет до появления инвазивного РШМ.

По другим данным время появления признаков предраковых изменений у женщин с положительным ВПЧ - тестом на фоне нормального цервикального эпителия измеряется всего несколькими годами или даже месяцами [30; 49;

154; 240].

Мало изучены факторы, способствующие персистенции ВПЧ-инфекции.

Возраст старше 30 лет, короткий интервал времени между обнаружением онкогенных типов ВПЧ в клетках экзоцервикса, были независимыми показателями персистенции [62]. Высокая концентрация вируса также является показателем персистенции ВПЧ [65]. При определении вирусной нагрузки в клетке методом ПЦР выявлено, что среднее число вирусных копий в клетке, характерное для транзиторной инфекции, равно 8,3, а для персистирующей инфекции число копий значительно выше – 111,5. Транзиторная и персистирующая инфекции ассоциированы с маркерами сексуальной активности (возраст начала половой жизни, число партнеров, частота сексуальных контактов, частота анальных контактов, сексуальная активность после родов и генитальные заболевания). Одним из важных факторов риска для персистенции ВПЧ было число сексуальных партнеров за последние 5 лет [15].

ВПЧ-инфекция повышает риск развития также аногенитального рака, в особенности рака вульвы, влагалища и анального рака [205]. Лица, имеющие антитела к ВПЧ-16, входят в группу повышенного риска развития также рака пищевода [31]. ВПЧ может быть этиологическим агентом интраэпителиальной неоплазии влагалища [156]. ДНК ВПЧ-16 и 18 были обнаружены при дистрофии вульвы, ассоциированной и не ассоциированной с плоскоклеточной карциномой вульвы в 16% и в 55% случаев, соответственно [138].

Плоскоклеточная карцинома вульвы в 60% случаев ассоциируется с выявлением ДНК ВПЧ [210]. K.T. Mai, H.M. Yazdi, M.A. Bertrand et al. (1996) предполагали, что у пациенток среднего возраста с ЦИН существует причинная связь ВПЧ-инфекции и развития первичной плоскоклеточной карциномы яичников.

На сегодня ясно, что клиническая и субклиническая ВПЧ-инфекция относится к частым ИППП [76]. В большинстве случаев папилломавирусная инфекция протекает бессимптомно или субклинически, примерно у 1% сексуально активных людей встречаются явные клинические проявления в виде остроконечных кондилом [217; 209]. Была выявлена 100%-ная корреляция между наличием остроконечных кондилом и обнаружением ДНК ВПЧ 6 или типов [135], которые редко ассоциируются со злокачественными новообразованиями [165; 126]. Генитальные бородавки передаются половым путем и встречаются, главным образом, у молодых сексуально-активных людей. Пациенты с генитальными бородавками чаще других сообщают о наличии у них многочисленных сексуальных партнеров [189, 24, 151]. В США с 1966 г. число пациентов с впервые выявленными генитальными бородавками увеличилось в 5 раз [46]. Самозаражение также возможно, особенно среди людей со сниженным иммунитетом. Пациенты с аллотрансплантацией почек и ВИЧ-инфекцией имеют повышенный риск развития кондилом [37; 146].

Методы определения субклинической ВПЧ-инфекции шейки матки стремительно развивались в последние 15 лет. Ранние молекулярноэпидемиологические исследования роли ВПЧ в патогенезе РШМ использовали метод гибридизации in situ для определения ДНК вируса. Они показали, что цервикальная ВПЧ-инфекция не связана с сексуальной активностью [80; 170].

Парадоксальность этих выводов зависела от использования недостаточно точной и чувствительной методики [47]. Внедрение других молекулярнобиологических методов, в частности, ПЦР, основанной на так называемых консенсусных праймерах, снизило ошибки определения ВПЧ [97; 167].

Данные литературы относительно факторов риска папилломавирусной инфекции носят разноречивый характер. Среди фактров риска ВПЧ наиболее часто отмечают особенности репродуктивного поведения [84; 140; 169].

Эпидемиологические исследования с использованием ПЦР подтвердили половой путь передачи ВПЧ-инфекции [91; 240], однако обнаружение ВПЧ в смывах с гинекологических кресел позволило предположить также и контактнобытовой путь передачи [240]. Это подтверждает выявление ВПЧ у 4% девственниц в Швеции [209].

Ряд авторов отмечают раннее начало половой жизни как фактор риска ВПЧ. Так женщины, вступившие в половые контакты до 16 лет, имели 2-кратно увеличенный риск ВПЧ, по сравнению с теми, чей сексуальный опыт начался после 20 лет [140].

Подобная закономерность демонстрируется не всеми авторами [75; 162].

Неодинаковый результат показали исследования, произведенные в различных популяциях, с использованием метода ПЦР. Связь между сексуальной активностью и распространенностью ВПЧ может быть выраженной [5; 175], умеренной [61; 132] и слабой [78]. Такие неоднозначные результаты могут быть следствием популяционных различий в распространенности типов ВПЧ с более высокой и более низкой способностью передаваться половым путем. В Швеции частота выявления антител к ВПЧ- прямо пропорциональна количеству половых партнеров на протяжении жизни и возрастает приблизительно на 4% с каждым новым партнером [242]. Наличие корреляции между числом половых партнеров и ВПЧ – инфекцией была показана рядом исследователей для шведских женщин, американских студенток [75].

Существует несколько мнений о влиянии на возникновение ВПЧинфекции применения оральных контрацептивов и курения. Согласно одним данным литературы курение и использование оральных контрацептивов повышают риск ВПЧ-инфекции [5]. J. Monsonego et al. (1993) также считает, что гормональные контрацептивы могут быть фактором риска ВПЧ-инфекции, в геноме ВПЧ содержится гормон-распознаваемый сегмент, благодаря которому осуществляется взаимодействие гормональных контрацептивов и ВПЧ. По сведениям E. Diakomanolis, A. Elscheikh et al. (2001) они не влияют на частоту инфицирования ВПЧ.

M.L. Shew, R. McGlennen et al. (2002) считают, что женщины, у которых обнаружен более высокий уровень цервикальных эстрогеновых рецепторов, в большей степени подвержены инфицированию папилломавирусной инфекцией.

Использование экзогенных гормонов как контрацептивов может по-разному влиять на присутствующую ВПЧ-инфекцию. Von Krogh (1997) считает, что стеройдные гормоны взаимодействуют с клеточным геномом, вовлекаясь в регуляцию клеточного цикла и апоптоз, и они могут ингибировать индуцированные ВПЧ повреждения шейки матки. Другие авторы [155] считают, что длительное использование КОК у женщин с папилломавирусной инфекцией повышает риск развития РШМ. N. Moodley et al. (2003) считают, что стеройдные гормоны повышают экспрессию онкопротеинов Е6 и Е7 ВПЧ 16.

количества родов и риска ВПЧ в.о.р.: наблюдалось как увеличение риска ВПЧ с увеличением числа родов [61], так и снижение или отсутствие таковой.

Важным фактором риска ВПЧ-инфекции является возраст [157]. Пик ВПЧ приходится на возраст 18-25 лет, распространенность ВПЧ-инфекции снижается после 30 лет [141]. Ряд исследователей считают, что это не зависит от сексуальной активности [5; 174]. Вероятно, молодые женщины более восприимчивы к ВПЧ-инфекции, подобная закономерность отчасти связана с отсутствием специфического иммунитета [241]. В странах Латинской Америки наиболее часто встречались типы ВПЧ в.о.р. у молодых женщин до 20 лет, второй пик папилломавирусной инфекции был описан среди женщин в возрасте 55 лет и старше с преобладанием ВПЧ н.р. [23]. Это объяснялось реактивацией латентной инфекции, связанной с ослаблением иммунного ответа из-за уменьшения циркуляции зрелых Т-клеток, а также – из-за гормональных изменений, связанных со снижением функции яичников.

Исследования, проведенные в Испании и Колумбии, показывают более высокую частоту обнаружения ДНК ВПЧ среди женщин из низких социальных слоев, объясняя это тем, что они проходят обследование реже, чем женщины с более высоким социальным уровнем [28].

Многие эпидемиологические исследования, касающиеся ВПЧ-инфекции и РШМ, проводятся с учетом меняющихся со временем факторов риска, персистенции и транзиторности вируса, начала формирования антител против ВПЧ, прогрессии и регрессии поражений шейки матки. Понимание роли неоднократных исследованиях факторов риска, выявлении ВПЧ и динамическом наблюдении за различными заболеваниями шейки матки [65;

141]. Использование вирусологических, иммунологических и цитоморфологических методов исследования должно способствовать началу нового этапа в уточнении эпидемиологии ВПЧ-инфекции и РШМ.

Обзор данных литературы показывает, что связь между определенными типами ВПЧ и РШМ логична, так как в лабораторных исследованиях были получены эпидемиологические доказательства канцерогенной активности типов ВПЧ, выявленных при цервикальной неоплазии, которой нередко предшествовала инфекция определенными типами ВПЧ. Вместе с тем, на территории Молдовы такого рода исследования до настоящего времени не проводились.

1.2. Возбудители других инфекций, передаваемых половым путем и их В связи с общностью путей передачи папилломавирусной инфекции и возбудителей других венерических заболеваний возможно нередкое их сочетание. По данным ВОЗ ежегодно в мире регистрируется более 300 млн.

случаев урогенитальных инфекций [188]. В литературе приводятся противоречивые данные, посвященные изучению возбудителей инфекций, передаваемых половым путем, при наличии папилломавирусной инфекции.

M.И. Багирова и др. (1995), М.С. Афанасьев и др. (2004), показали, что наличие ВПЧ в.о.р. обязательная, но недостаточная причина малигнизации.

Существуют определенные факторы, способствующие персистенции ВПЧинфекции, среди которых определенное место занимают ИППП, например, иммунофлюоресцентная микроскопия на хламидии с использованием моноклональных антител показала высокую частоту их обнаружения и наличие хламидийных цервицитов у 44% больных с ВПЧ-инфекцией шейки матки [218;

219]. Исследования, проведенные в Германии подтверждают, что ИППП, такие как гонорея и сифилис, являются факторами риска развития ЦИН и РШМ [82].

Распространенность ВПЧ-инфекции у женщин, посещающих клинику ИППП, выше в группе женщин, имеющих ИППП, причем частота обнаружения ВПЧ высокого и среднего онкогенного риска была достоверно выше, чем в контрольной группе - 47,5% и 5,3% соответственно. Это подтверждает необходимость обследования на ВПЧ пациенток клиник ИППП в связи с риском развития у них ЦИН [86].

При обследовании беременных женщин в Руанде также выявлено, что среди пациенток с ЦИН заболеваемость ИППП выше, чем среди женщин без патологии шейки матки, однако эти данные статистически недостоверны [90].

Эпидемиологические исследования в Гондурасе, где изучалась возможная связь между различными ИППП (цитомегаловирусной инфекцией, генитальным герпесом, ВИЧ-инфекцией, хламидиозом, сифилисом и ВПЧинфекцией) и РШМ, показали, что наличие антител к возбудителям ИППП, кроме ВПЧ, не ассоциировалась с риском развития ЦИН, и перенесенные ИППП не имели очевидной связи с цервикальным канцерогенезом. Лишь наличие антител к определенным типам ВПЧ связано с риском развития РШМ [39]. Исследования, проведенные в Коста-Рика, не показали связи между наличием ИППП у обследованных женщин, кроме ВПЧ, и риском развития ПИН высокой степени и РШМ [63]. По данным A. Parashari (1995), Г.Н.

Минкина (2001), М.С. Афанасьев (2004) ИППП, способствующие воспалительным изменениям шейки матки, могут повышать риск развития пренеопластических и неопластических цервикальных изменений. V. Singh, M.M.

Gupta, L. Satyanarayana et al. (1995) считают, что хламидиоз был ассоциирован с 8кратным увеличением риска патологии шейки матки и 4-кратным повышением риска цервикальной неоплазии, бактериальный вагиноз способствовал 9,3-кратному риску развития цервикальной эктопии, а ВПЧ имели 60,3-кратный риск развития эктопии шейки матки, по сравнению с женщинами, инфицированными возбудителями других ИППП.

В США, установлено, что к факторам риска развития PШM относятся также трихомоноз и инфекция ВПГ-2 [154]. Повышенный риск развития РШМ достоверно ассоциировался с хроническими цервицитами, повышенным титром антител к Сhlamydia trachomatis, цитомегаловирусу и ВПГ-2 [68]. В Великобритании, показано, что наличие антител к ВПГ-1, ВПГ-2, Сhlamydia trachomatis и другим инфекционным, агентам было связано с риском развития РШМ, однако при сравнении с контрольной группой эта связь оказалась недостоверной.

Имеются данные, как подтверждающие, так и опровергающие положение, что Сhlamydia trachomatis действует как ко-фактор в развитии карциномы не только шейки матки, но и яичников [125].

У женщин с цервицитами и наличием признаков воспалительных изменений в мазках из цервикального канала, выявлена высокая частота обнаружения Сhlamydia trachomatis. Это характерно для 75,2% женщин с цервикальными кондиломами и 82,6% женщин с ЦИН [35].

В Скандинавских странах установлена связь наличия антител к Сhlamydia trachomatis с повышением риска развития инвазивной плоскоклеточной карциномы шейки матки. Эта связь прослеживалась как у женщин с ВПЧ-16, так и без ВПЧ-16 [84]. Хроническая хламидийная инфекция часто ассоциируется с цервикальной неоплазией [1; 72; 98].

Смешанная инфекция, вызванная ВПЧ и Сhlamydia trachomatis, не такая частая, как ожидалось [180]. В Голландии показано, что ВПЧ и Сhlamydia trachomatis - независимо встречающиеся возбудители ИППП [18]. В Мексике, напротив, выявлена определенная связь между Сhlamydia trachomatis и ВПЧ [53]. В Китае отмечена подчеркнутая синергичная роль Сhlamydia trachomatis и ВПЧ в этиологии РШМ. Инфекция Сhlamydia trachomatis была выявлена у достоверно большего числа женщин с РШМ (61,5%) и с дисплазией шейки матки (83,3%), чем в контрольной группе (39,5%).

У женщин с хламидиозом встречаемость ВПЧ, РШМ и дисплазии шейки матки была значительно выше, чем у женщин без хламидиоза - в 60,0% и 10,0% случаев соответственно [69]. Была прослежена связь между ВПЧинфекцией гениталий и хламидиозом у пациенток с ЦИН и нормальными результатами цитологического исследования шейки матки. Выявлено, что частота обнаружения Сhlamydia trachomatis у пациенток с ВПЧ-инфекцией была выше, чем у женщин без ВПЧ - 10,3% и 1,7% соответственно. Частота распространенности Сhlamydia trachomatis была выше у женщин с ВПЧ в.о.р.

и цитологическими изменениями в цервикальных мазках, чем у женщин с ВПЧ в.о.р. и нормальными данными цитологического исследования. Пациентки с ЦИН без ВПЧ имели достоверно более высокую частоту обнаружения Сhlamydia trachomatis, чем женщины без цитологических изменений. Эти исследования показали очевидную связь между ВПЧ-инфекцйей гениталий и цервикальным хламидиозом. Было выявлено, что перенесенная инфекция Сhlamydia trachomatis ассоциирована с обнаружением у женщин ВПЧ в.о.р. [236; 111] и развитием у них ЦИН-I и ЦИН-II [129]. Предполагается, что возбудители хламидиоза могут являться кофактором бактериальной природы, способствующим прогрессированию неопластических процессов [213]. Таким образом, перенесенные ИППП могут быть маркерами наличия ВПЧ в шейке матки [74].

Различия в распространенности Сhlamydia trachomatis у пациенток с ЦИН и без цервикальной патологии в ряде исследований оказались недостоверными, т.е. инфекция Сhlamydia trachomatis не способствует развитию ЦИН [158].

Различия встречаемости Сhlamydia trachomatis у больных с ЦИН-I и ЦИН-II, также как и для ЦИН-I и ЦИН-III, ЦИН-II и ЦИН-III были незначительны [159].

В Швеции, однако, у лиц с низким уровнем антител к Сhlamydia trachomatis риск развития РШМ, связанный с наличием ВГТЧ-16, был очень высок, и, наоборот, у лиц с высоким уровнем антител к Сhlamydia trachomatis повышенного риска не было найдено. Сделан вывод, что перенесенная инфекция ВПЧ-16 повышает риск развития инвазивного РШМ и наиболее явно эта тенденция прослеживается в популяциях с низким уровнем распространенности ИППП [15; 32; 89]. Как показал J.T. Nunez-Troconis (1995) в Венесуэлле среди пациенток с ЦИН низкая встречаемость Сhlamydia trachomatis не означает, что Сhlamydia trachomatis не играет никакой роли в возникновении и развитии цервикальной патологии.

1.3. Вопросы этиологии и патогенеза рака шейки матки.

Большинство случаев РШМ (78%) встречается в развивающихся странах, где он составляет 15% от всех раков у женщин и является 2-ой наиболее частой причиной смерти от рака, тогда как в развитых странах он составляет только 4,4% от новых случаев рака. Тем не менее, РШМ остается серьезной проблемой и для индустриально развитых стран. Так, например, в Англии выявляется 13, случаев РШМ на 100 000 женщин, причем 5 из них заканчиваются смертельным исходом. В США заболеваемость РШМ составляет 8,3 на 100 000, что составляет 14 000 новых случаев, 5 000 смертей в год [73].

цитомегаловирусной, папилломавирусной) и патологическим состоянием шейки матки установлено в ряде исследований [9; 199; 207; 209; 234; 246; 248].

Впервые предположение о возможном участии ВПЧ в патогенезе РШМ в 1974гг. высказал Zur Hauzen [216]. Обширные эпидемиологические наблюдения, проведенные в 22 регионах мира, подтвердили, что ВПЧ в.о.р.

является первым и наиболее значимым фактором возникновения РШМ [216].

Ведущая роль в канцерогенном процессе принадлежит вирусным белкам Е1, Е2, Е6 и Е7 [208; 139]. Инициирующим фактором выступают мутации в различных участках гена Е1, который в норме отвечает за эписомальный статус ВПЧ-ДНК. В результате его повреждения происходит интеграция генома ВПЧ в хромосомы клетки хозяина. Процесс встраивания генома ВПЧ сопровождается иннактивацией еще одного вирусного гена Е2. В результате потери функциональной активности гена Е2, увеличивается экспрессия генов Е6 и Е7, которые непосредственно запускают процессы опухолевой трансформации. Онкогенные свойства Е6 и Е7 обусловлены их способностью образовывать комплексы с негативными регуляторами клеточного роста белками Р53 (для Е6) и Rb (для Е7). Р53 и Rb – отвечают в норме за дифференцировку и рост клеток, которые в результате мутации или повреждения превращаются в онкогены, вызывающие бесконтрольную пролиферацию. Белки Е6 и Е7, взаимодействуя с белками Р53 и Rb, вызывают предотвращению апоптоза, подавляется выработка интерферона, удлиняется продолжительность жизни клеток за счет активации теломеразы, усиливается клеточная пролиферация, нарушаются защитные регуляторные механизмы, обеспечивающие репарацию ДНК, что способствует дестабилизации генома, индуцирует хромосомные мутации и абберации генов хозяина [216], что является эндогенным фактором опухолевой прогрессии [240]. Об активной экспрессии вирусного онкогена Е7 свидетельствует выраженная гиперэкспрессиия ингибитора циклинзависимой киназы Р161NK4a-биомаркера, который регулярно наблюдается в злокачественных поражениях, вызванных ВПЧ в.о.р. Использование биомаркеров – пролиферации может помочь снизить частоту ложноположительных и – отрицательных результатов традиционных методов диагностики РШМ [26].

Длительное время интеграция вирусной ДНК рассматривалась как необходимое условие прогрессии цервикальной дисплазии в РШМ. Однако эписомальная вирусная ДНК выявляется в значительном проценте случаев РШМ (до 40%) [216]. Ряд авторов [121] продемонстрировали связь между ВПЧ инфицированием и повышенным образованием в клетках генитального тракта 16-альфа-гидроксиэстрона, который является фактором риска канцерогенеза в ряде эстроген-зависимых тканей. В некоторых странах, в том числе и в развивающихся, выявлена зависимость заболеваемости РШМ от уровня образования и дохода [121].

Кроме различий в уровне социально-экономического развития на заболеваемость РШМ влияют и другие факторы, например, модели преобладающего сексуального поведения и эффективность местных скрининговых программ. Некоторые из факторов риска РШМ хорошо известны, другие, а именно ВПЧ и различия в распространенности тех или иных типов, недостаточно исследованы и требуют дальнейшего изучения.

1.4.1. Эффективность цитологического скрининга предраковых Первая статья Papancolaou и Traut "Исследование вагинальных мазков в диагностике рака шейки матки" [117] легла в основу концепции массового скрининга предраковых состояний шейки матки. Впервые цитологический скрининг РШМ стал проводиться в канадской провинции Британская Колумбия (1949 г.) Некоторые особенности РШМ делают его идеальным заболеванием для организации скрининговых программ: длительная и надежно распознаваемая преклиническая фаза; высокий уровень возможной ранней диагностики – скрининг-тест; в случае проведения лечения предраковых форм, заболеваемость и смертность от инвазивных форм может быть радикально снижена [29]. Популяция женщин, прошедших скрининг, относится к «низкому риску» развития РШМ; вероятность выявления рака у них в 5 раз меньше, чем у недообследованных, а смертность – в 10 раз меньше.

Исследование не леченых случаев Са in situ показало, что в течение 3- лет в 10-15% случаев ожидается прогрессирование процесса в инвазивный рак [122]. Риск прогрессии легкой дисплазии в тяжелую и далее составлял – 1% в год, умеренной дисплазии в тяжелую и далее был 16% в течение 2-х лет и 25% в течение 5 лет [67].

Своевременные и глобальные скрининговые программы привели к значительному снижению смертности от РШМ в частности в Швеции, Шотландии Венгрии, Австрии – на 50-69% [149]. Более половины женщин, у которых был диагностирован РШМ в США не подвергались скринингу на протяжении последних 3 лет [177].

Географически различная встречаемость РШМ связана не только с различиями в скрининговых программах, а также с преобладающим действием тех или иных факторов риска. Так в некоторых областях Китая и Испании, где не существует скининговая программа частота РШМ низкая, возможно из-за преобладания консервативных форм сексуального поведения [119].

L.Gustafsson, P. Sparen, M. Gustafson et al. (1995) проанализировали изменения в распространенности РШМ в 17 популяциях до и после внедрения скрининговых программ. В 11 из них после проведения скрининга распространенность РШМ была снижена на 25%. В регионах, где скрининг не проводился (например, Бомбей) изменений с течением времени не отмечено [57].

Изменение распространенности РШМ среди женщин в возрасте 30-59 лет в различных областях Дании была связана с проведением скрининга. С увеличением охвата населения скринингом наблюдалось значительное снижение распространенности РШМ [94]. Скрининг необходим для более раннего выявления бессимптомного инвазивного рака, особенно в молодом возрасте.

Ошибки цитологического скрининга, проявившиеся развитием инвазивного РШМ у обследованных женщин, только недавно стали предметом дискуссий. Известно много причин неэффективности цитологического скрининга (неправильное взятие мазка, плохая техника приготовления мазка, неправильное исследование мазков, неадекватный контроль качества исследования, неправильная интерпретация цитологических результатов, неверная клиническая тактика и др.) [206; 210; 46; 107]. Любой из этих факторов может привести к ошибке в диагностике. По данным различных исследователей цитологический скрининг характеризуется высокой специфичностью и более низкой чувствительностью (66% до 83%), при этом частота ложноположительных и ложноотрицательных результатов может достигать 20% [26]. В 70-90% случаев причиной ложноотрицательных ответов является плохой забор материалов для цитологического исследования и лишь в 10-30% – ошибочная интерпретация цитологических данных [14].

У значительной части женщин (12%) после отрицательных результатов цитологических исследований мазков с поверхности экто- и эндоцервикса в течение короткого периода времени (24 месяца) развилась тяжелая дисплазия шейки матки. В связи с этим определение клеточных изменений, связанных с ВПЧ-инфекцией, поможет выявить женщин, у которых впоследствии могут развиться тяжелые поражения шейки матки [183; 164].

Диагностика интраэпителиальных поражений шейки матки представляет специфическую проблему. Гистологические признаки ВПЧ-инфекции часто переплетаются с признаками пренеопластических поражений, и не может быть проведено чёткой границы между вирусной инфекцией и предраковыми состояниями. Более того, морфологическая идентификация ВПЧ-поражений и предраковых состояний представляется трудной из-за того, что некоторые физиологические модификации эпителия шейки матки, например, сквамозная метаплазия, могут кольпоскопически и гистологически имитировать изменения, связанные с ВПЧ-инфекцией. Существует проблема низкой специфичности диагностических процедур для идентификации ВПЧ-ассоциированных поражений шейки матки.

Идентификация незначительных интраэпителиальных поражений представляет значительные трудности, так как различные физиологические условия могут имитировать присутствие ВПЧ-ассоциированных поражений.

Поэтому были предложены и другие диагностические методы (кольпоскопия, типирование вирусов), как дополнительные к цитологическому исследованию, для того, чтобы выявить женщин, нуждающихся в углубленном обследовании [130; 26].

1.4.2. Эффективность кольпоскопического исследования Кольпоскопия всегда предлагалась наряду с цитологическим исследованием, чтобы увеличить чувствительность скрининга [221; 14; 64; 147]. Но кольпоскопия мало помогает в разграничении метаплазии и интраэпителиальных поражений.

Если кольпоскопию использовать как скрининговый метод, то риск гипердиагностики высок и, как следствие, часто неправильное лечение этих состояний.

Кольпоскопические признаки нормальной зоны трансформации хорошо известны. При метапластическом процессе кольпоскопистом определяются метаплазированного участка происходит быстро, что позволяет легко провести его кольпоскопическую идентификацию. Метапластическая ткань прогрессивно теряет белую реакцию при обработке шейки матки уксусной кислотой и становится йод-позитивной при обработке раствором Люголя. В некоторых случаях созревание метаплазированного участка не такое быстрое, как это описано выше. В этом случае большие участки, и даже вся метапластическая ткань остаются незрелыми достаточно долго, что обнаруживается цитологом или кольпоскопистом [4].

Большинство ЦИН появляются во время метапластического процесса в интраэпителиальные поражения проявляются как патологическая зона трансформации. Выявлено, что у пациенток с ВПЧ-инфекцией неравномерное поглощение йодного раствора Люголя эпителием шейки матки встречается в 84,7% случаев, а при предраковых изменениях - в 13,2% и практически не наблюдается при наличии доброкачественного метаплазированного эпителия.

Отмечено, что определенное значение в кольпоскопической диагностике ВПЧинфекции имеет характер границ йод-негативного эпителия. В доброкачественной зоне трансформации они могут быть расплывчатыми.

Особенно часто нечеткий контур йод-негативного эпителия встречается у женщин с ВПЧ-инфекцией шейки матки. Важным диагностическим признаком ВПЧ-инфекции является также обширная площадь атипичного эпителия, при этом переход на своды как при обширных поражениях, так и небольших по площади (в виде сектора) в 94% случаев подтверждает диагноз ВПЧ-инфекции [225].

По данным кольпоскопии А.Н. Иванян и др. (2004) наиболее часто инфицированию высокоонкогенными типами ВПЧ соответствовала пунктация и мозаика, а для инфицирования ВПЧ низкого риска йод-негативная зона и ацетобелый эпителий.

При анализе первичной кольпоскопии и гистологического исследования 3420 пациенток, выявлено, что у 1395 женщин при расширенной кольпоскопии на шейке матки обнаружен атипичный эпителий. Гистологическое исследование показало, что в структуре атипичного эпителия преобладают проявления ВПЧ-инфекции – кондиломы (67,6%, в том числе атипичные ЦИН обнаружена у 618 (43,3%), у 183 (13,1%) из них в сочетании с незначительного числа пациенток (0,9%) обнаружена лейкоплакия шейки матки как изолированное проявление процесса. Отмечено, что лейкоплакия чаще сочетается с признаками ЦИН, а в подавляющем большинстве случаев сопутствует ВПЧ-инфекции шейки матки [226].

Незрелая метаплазия, нетипичная метаплазия и ЦИН определяются кольпоскопистом как патологическая зона трансформации, и трудно при этом провести дифференциальную диагностику без биопсии. Это и есть основная причина низкой специфичности кольпоскопии, не позволяющая использовать ее как скрининговый метод.

1.4.3. Роль ВПЧ-типирования в селективном скрининге Методы определения ВПЧ в цервикальных клетках развивались от простых цитологических признаков ВПЧ-инфекции до иммунохимических приёмов окраски, методов гибридизации нуклеиновых кислот и ПЦР.

Современные ПЦР-исследования, основанные на консенсусных праймерах, являются предпочтительными методами в последние годы, так как они высокочувствительны и специфичны, пригодны для эпидемиологических исследований [97; 167]. Использование ПЦР сводит к минимуму ошибки в определении ВПЧ-статуса. При тщательном тестировании методом ПЦР частота ВПЧ-позитивных случаев при карциноме шейки матки составляет более 95% [11].

Использование метода ПЦР и систематическое исследование множества образцов первичной опухоли повышает выявляемость ВПЧ до 100%. Это говорит в пользу признания ВПЧ-инфекции первопричиной РШМ [45; 172].

Тестирование на ВПЧ-инфекцию является более чувствительным однако, менее специфичным, чем цитологический метод в оценке патологии шейки матки [177]. Чувствительность комбинации цитологического исследования с выявлением ВПЧ более высокая (составляет 95%), чем чувствительность цитологического метода (78%) и ВПЧ-теста (66,3%), выполненных отдельно [38].

ВПЧ-типирование может быть широко использовано в диагностике ЦИН-III, когда цитологического исследования оказывается недостаточно [23].

Проведение программ скрининга показало, что в цервикальных мазках без цитологических аномалий у 4% женщин в возрасте от 30 до 60 лет обнаруживаются ВПЧ в.о.р., а через 3 года у 8% этих женщин были выявлены ЦИН-Ш. Наличие ВПЧ в.о.р. в цервикальных мазках с нормальной цитоморфологией повышает риск развития ЦИН-Ш в 116 раз. Состояние персистенции ВПЧ-инфекции оценивается проведением повторных исследований ДНК-ВПЧ или цитологических исследований и создает опасность неопластической прогрессии [148]. ВПЧ обнаруживается как до появления, так и после исчезновения цитологических изменений в шейке матки, то есть ДНК ВПЧ диагностируется продолжительнее цитологических изменений [143].

Около 5% мазков без цитологических аномалий содержат ВПЧ в.о.р. [101].

Диагностическая значимость выявления ДНК ВПЧ, как прогностического маркера развития ЦИН-II и ЦИН-III у пациенток с персистирующими слабовыраженными цервикальными цитологическими аномалиями, состоит в том, что доказанная ассоциация ДНК ВПЧ с ЦИН высокой степени тяжести и возрастом пациенток делает оправданным дальнейшее углубленное обследование, включая биопсию [60; 123].

В ходе электронно-микроскопических исследований, проведенных И.А.

Яковлевой, А.П. Черным (2004), была показана высокая частота встречаемости фоновых процессов шейки матки при папилломавирусной инфекции. Однако на территории Республики Молдова исследований с позиции факторов риска инфицирования папилломавирусной инфекцией, а также типирования диагностируемых ВПЧ не проводилось.

Последние исследования показали преимущества определения ДНК ВПЧ при клиническом использовании [213; 22; 23; 93; 178]. Тесты для определения ДНК ВПЧ могут помочь в обнаружении неопластических изменений, упущенных при цитологическом исследовании [22; 23; 38; 127; 178]. При латентной вирусной инфекции, когда поражения не определяются традиционными методами, в большинстве случаев в течение 3-4 лет развивается плоскоклеточная интраэпителиальная неоплазия [94].

Все методы обнаружения ВПЧ основаны на способности ДНК к гибридизации [192]. Все методы специфичны, но отличаются по чувствительности. Неамплификационные методы фиксируют нахождение ДНК либо прямо в препарате (гибридизация in situ), или на фильтре и определяются с помощью соответствующих методик (радио- или биотин-метки), или в осадке реагирующей смеси (ДОТ-блот гибридизация). Более чувствительными являются амплификационные методы. В амплификационных методах (ПЦР, ЛЦР) происходит многократное накопление ампликонов, что обусловливает высокую чувствительность реакций, но требует высокой чистоты в проведении анализов, в частности, разобщения в пространстве разных этапов анализа (предамплификационных и послеамплификационных). Новая система амплификационных методов предусматривает амплификацию не участка ДНК, а сигнала, в частности, с помощью высокоспецифической иммунной реакции с регистрацией испускаемого светового потока. Такой является система гибридной ловушки Hybrid Capture System [93; 142]. Понимание того, что определенные типы ВПЧ ассоциированы более чем в 90% случаев с РШМ, имеет большое значение для поиска путей первичной и вторичной профилактики РШМ.

Определение ДНК-ВПЧ [48], а также антител к капсидному белку L типа ВПЧ-инфекции может играть важную роль в оценке прогноза для жизни пациентов с инвазивным раком шейки матки.

Большая часть рецидивов ЦИН, вероятно, обусловлена персистируюшей бессимптомной ВПЧ-инфекцией, которая не элиминируется полностью при хирургических вмешательствах. Определение ВПЧ может также оказаться полезным при контроле эффективности лечения ЦИН и РШМ [20].

Таким образом, анализ данных показал, что цитологический метод и кольпоскопическое исследование недостаточны для диагностики патологии шейки матки, качество которой повышается при сочетанном использовании ВПЧ-диагностики.

отработаны. Сейчас разрабатываются профилактические и лечебные вакцины [51; 109; 202; 228].

Целесообразность всестороннего изучения ВПЧ-инфекции в аспекте возможностей профилактики и лечения РШМ впервые была рассмотрена на конференции, организованной Международным агенством по исследованию рака (IARC), 12-14 декабря 1994 года.

Течение аногенитальной ВПЧ-инфекции определяется, в основном, состоянием иммунной системы человека. Ключевую роль в контроле ВПЧинфекции, сопровождающейся образованием кондилом, играет, по-видимому, не гуморальное, а клеточное звено иммунитета. Антиген-специфичные Тклетки узнают ранние белки ВПЧ, определяющие вирусную репликацию (El и Е2) и пролиферацию тканей (Е6 и Е7). При естественном течении ВПЧинфекции иммунный ответ на эти антигены, как правило, оказывается недостаточным для излечения, что, возможно, обусловлено недостаточной презентацией антигенов вируса. ВПЧ-инфекция не имеет литического характера, что приводит к низкой концентрации свободных вирусных антигенов. Кроме того, отсутствует продукция цитокинов воспаления и не наблюдается местной воспалительной реакции. Поэтому по мнению I.H. Frazer (1998) оптимальная стратегия лечения аногенитальной ВПЧ-инфекции могла бы включать и потенцирование вирус-специфического иммунного ответа путем усиления местного воспаления и продукции соответствующих цитокинов. Не ослабевает интерес многих исследователей к разработке вакцин для профилактики и лечения ВПЧ-инфекции [54]. Разрабатываемые профилактические вакцины против ВПЧ основываются на иммунизации женщин вирусоподобными частицами (VLPs) для стимулирования выработки вирус-нейтрализующих антител.

VLPs не содержат вирусной ДНК и не обладают инфекционностью и онкогенностью. Предварительные результаты I и II фаз клинических испытаний VLPs показали, что наблюдается выраженное повышение гуморального иммунитета на нее [241]. Однако неясно, обеспечивает ли концентрация антител, которая регистрируется в половых путях, подавление ВПЧ-инфекции, и предотвращает ли вообще повышение титра антител вирусную инфекцию [24].

Необходима также разработка терапевтической вакцины, которая могла бы использоваться для лечения инфицированных лиц. По-видимому, антигенный состав терапевтической и профилактической вакцин должен быть различным [42]. В случае создания терапевтических вакцин, основное внимание уделяют их способности активировать клеточный иммунитет, развивающийся в виде реакции ГЗТ СD4+-зависимых клеток, нарушение которого, очевидно играет важную роль в патогенезе ВПЧ-индуцированных поражений эпителия шейки матки. Известно, что ВПЧ-онкобелки Е6 и Е экспрессируются фактически во всех клетках РШМ, следовательно они представляют удобную мишень для клеточной иммунной системы [24].

папилломавирусной инфекции. Большую роль в противовирусной защите играет интерфероновая система. Интерфероны являются эндогенными цитокинами, обладающими иммуномодулирующими, антипролиферативными, противовирусными свойствами. Установлено, что при их применении образуется антивирусный белок, блокирующий репликацию вируса [239].

Интерферон можно применять местно или системно: человеческий лейкоцитарный интерферон, лейкинферон, циклоферон и др. Было выявлено, что препараты интерферонового ряда можно считать эффективным дополнением к физикохирургическим методам [56]: криотерапии, лазерной вапоризации, диатермоэлектрокоагуляции и конизации [239; 81]. У больных с ВПЧ-инфекцией имеются значительные нарушения микробиоценоза, в частности, избыточный рост условно-патогенной микрофлоры, выраженные изменения иммунитета. Это указывает на необходимость проведения коррекции микробиоценоза влагалища биопрепаратами и применение иммунокорректоров (интерферон-интерлейкин, ликопид, солкотриховак) для их лечения на фоне этиотропной терапии [222].

Систематизация, обобщение и анализ данных литературы позволяет заключить, что большинство исследователей признают важность папилломавирусной инфекции в возникновении и развитии рака шейки матки.

заболеваемости РШМ, и он продолжает занимать ведущее место в структуре онкогинекологической патологии (2004 г.), также отмечаются существенные изменения в возрастной структуре заболеваемости, выразившиеся в ее повышении среди молодых женщин. Вместе с тем, в Республике Молдова сведения о распространенности разных типов (высокого и низкого онкогенного риска) ВПЧ среди женщин, частоте инфицирования онкогенными типами ВПЧ женщин с патологией дистальных отделов репродуктивной системы (вульвы, влагалища и шейки матки), об оценке характера клинических, кольпоскопических и морфологических проявлений при ВПЧ-инфекции высокого и низкого онкогенного риска, о различных факторов риска и степени их выраженности, позволяющих прогнозировать инфицирование ВПЧ в.о.р., недостаточно изучены.

профилактику инфицирования ВПЧ в целях снижения риска онкологической патологии шейки матки. В связи с этим представлялось целесообразным посвятить настоящее исследование изучению перечисленных вопросов.

Глава II. Объекты, материалы и методы исследования Для решения поставленных в работе задач объектом исследования были выбраны 355 женщин, проживающих в разных регионах республики, в возрасте от 15 до 49 лет, которые на протяжении 1999-2002 гг. обращались для профилактического осмотра или с целью прохождения лечения на базе поликлиники МСПУ Института Онкологии Молдовы, Территориального Медицинского Объединения «Ботаника», Центра Здоровья Женщины «Далила»

и гинекологических отделений Муниципальной Клинической Больницы №1.

В зависимости от наличия у обследуемых женщин ИППП для наблюдения были сформированы две группы. В I группу вошли 250 пациенток, страдающих ИППП, во II группу – 105 женщин без ИППП.

Материалами исследования служили данные анкетирования обследуемых женщин; биологический субстрат – кровь, отделяемое уретры, влагалища и цервикального канала; соскоб эпителиальных клеток с поверхности и из канала шейки матки; фрагменты тканей шейки матки, полученные при биопсии.

В работе использованы клинические, инструментальные, лабораторные методы (микроскопические, микробиологические, морфологические, серологические, молекулярно-биолологический), методы статистической обработки полученных данных, математического анализа и прогнозирования.

гинекологическое обследования; при сборе анамнеза особое внимание уделено возрасту, уровню образования, социальному статусу, семейному положению, жалобам, половой функции (возраст начала половой жизни, количество половых партнеров), особенностям репродуктивной функции (течению и исходам предыдущих беременностей), используемым методам контрацепции, вредным привычкам (курению, употреблению алкоголя) и др. Всем женщинам проводилось кольпоскопическое обследование. Молекулярно-биологическое исследование с целью диагностики вирусов папилломы человека проводилось в лаборатории микробиологии НИИ АГ им. Д.О. Отта РАМН (г. СанктПетербург, РФ). Цитологические и гистологические методы исследования – соответственно в лаборатории цитологии и гистологии МСПУ Института Онкологии Республики Молдова. Микроскопические, микробиологические, серологические исследования проводили на базе клинических лабораторий ТМО “Ботаника”, Центра Здоровья Женщины “Далила” и Муниципальной Клинической Больницы №1; бактериологических лабораторий Муниципальной Клинической Больницы №1 и Республиканской клинической больницы;

микробилогической лаборатории республиканского дерматовенерологического вирусологической лаборатории вирусологического центра CNSPMP, лаборатории диагностического центра.

2.1. Лабораторно-инструментальные методы исследования 2.1.1. Исследование на гонококки и трихомонады Бактериоскопические исследования включали изучение мазков из уретры, цервикального канала и влагалища, окрашенных по Граму и метиленовой синью (1% водный раствор). В ряде случаев для выявления гонококков и трихомонад проводили посев на элективную питательную среду гонококкагар с добавлением асцитической жидкости и на среду Джонсона-Трасселя (согласно методикам, изложенным в приказах МЗ МССР № 936 от 12 июля 1985г. и №1570 от 4 декабря 1986 г.).

Вирусы папилломы человека определяли с помощью современного молекулярно-биологического метода – полимеразной цепной реакции (ПЦР), разработанного Kary Mullis в 1983 году. Данный метод основан на способности нуклеиновой кислоты к гибридизации. ДНК под воздействием нагревания или химических веществ из двухнитевой спирали переходит в одонитевую, но сохраняет способность достраивать вторую нить, комплиментарную к существующей при наличии в реагирующей среде праймеров, которые определяют направление достройки второй нити, и химических веществ – нуклеотидов – для построения ДНК.

Постановка ПЦР проводилась согласно методике с использованием диагностических наборов («Авиценна», Москва, Россия). Набор реагентов «Авиценна – HPV-ПЦР» предназначался для качественного выявления ДНК ВПЧ в.о.р. (16, 18, 31, 33, 35, 45, 52, 56, 58), а также для выявления ДНК ВПЧ н.р. (6, 11, 42, 43, 44). Взятый у пациенток исследуемый материал (соскоб эпителиальных клеток шейки матки) с помощью одноразовых стерильных зондов переносили в пробирки с реактивом из набора ДНК-ЭКСПРЕСС (НПФ “Литех” Россия), приготовленные таким образом пробы замораживали при температуре -20°С и в течение двух суток транспортировали в лабораторию микробиологии НИИ АГ им. Д.О. Отта РАМН Санкт-Петербурга. Из транспортной среды отбирали по 100 мкл инфекционного материала, проводили выделение ДНК и амплификацию на амплификаторе «Термоцик»

(ДНК Технология, Москва, Россия). Далее проводили горизонтальный электрофорез в агарозном геле и учет результатов на трансиллюминаторе в проходящем ультрафиолетовом свете. Наличие ярко-оранжевых светящихся полос на определенном уровне, т.е. на уровне положительного контроля, считалось положительным результатом реакции.

Производили микрореакцию с кардиолипиновым антигеном и реакцию Вассермана.

2.1.4. Диагностика вируса простого герпеса второго типа Метод прямой иммунофлюоресценции (ПИФ) мазков-соскобов из уретры и цервикального канала или содержимого пузырьков с места поражения с использованием иммунофлюоресцирующих сывороток к вирусу простого герпеса 2 типа производства института Гамалея (Россия, Москва). При наличии вируса простого герпеса в эпителиальных клетках выявляли ярко-зеленую флюоресценцию цитоплазмы и ядра.

Серологический метод выявления антител к вирусу простого герпеса.

Антитела (IgG и IgM) к вирусу простого герпеса (ВПГ-2) определяли методом иммуноферментного анализа на линии ELYSA с использованием тест-систем фирмы DIA PRO и DIA SORIN (Милан, Италия). С помощью этих тест-систем реакцию производили на полистироловых планшетах с плоским дном, сорбированных вирусом простого герпеса 2 типа. Сыворотку больного в разведении 1:100 вносили по 100 мкл в опытные лунки, а в контрольные лунки добавляли заведомо положительные или заведомо отрицательные сыворотки.

После 60 минутной инкубации при 37°С производили отмывку специальным раствором согласно инструкции. Далее в каждую лунку вносили по 100 мкл коньюгата и инкубировали 60 минут при температуре 37°С с последующей отмывкой. Затем вносили хромоген-субстрат, содержащий перекись водорода.

Реакцию останавливали добавлением 100 мкл серной кислоты. Учет результатов производили при помощи спектрофотометра на линии ELYSA при длине волны 450 и 620-639 нм.

Оценка результатов производилась после расчета средней оптической плотности (cut-off). Реакция считалась положительной, если результат был равен и (или) больше средней оптической плотности.

2.1.5. Методы диагностики генитального хламидиоза Метод прямой иммунофлюоресценции (ПИФ) мазков-соскобов из уретры и цервикального канала поражения с использованием иммунофлюорисцирующих сывороток к Chlamydia trachomatis института Гамалея (Россия, г. Москва) или института Кантакузино (Румыния).

использованием иммерсии (х1000) и при наличии 10 и более элементарных телец в препарате, флюоресцирующих ярко-зеленым цветом, результат считали положительным.

Серологический метод выявления антител к Chlamydia trachomatis.

Антитела (IgA, IgМ, IgG) к Chlamydia trachomatis определяли методом иммуноферментного анализа на линии ELYSAс использованием тест-систем:

фирмы Вектор Бест(Россия), Sanofi Pasteur (Франция) и Nova TeC (Германия).

Реакцию производили на полистироловых планшетах с плоским дном, сорбированных антигенами Chlamydia trachomatis. Сыворотку больного разводили 1:100 специальным разбавителем в зависимости от определения класса иммуноглобулинов, и вносили в опытные лунки, а в контрольные лунки добавляли заведомо положительные или заведомо отрицательные сыворотки.

После 60 минутной инкубации при 37°С производили отмывку специальным раствором согласно инструкции. Далее в каждую лунку вносили по 100 мкл коньюгата и инкубировали 60 минут при температуре 37°С с последующей отмывкой специальным раствором согласно инструкции. Затем вносили по мкл коньюгата и инкубировали 30 минут при комнатной температуре. Затем промывали и добавляли 100 мкл ТМВ раствора субстрата. Реакцию останавливали через 15 минут добавлением 100 мкл серной кислоты. Учет результатов производили не позднее 30 минут при помощи спектрофотометра линии ELYSA при длине волны 450/620 нм. Оценка результатов производилась после расчета средней оптической плотности (cut-off). Реакция считалась положительной, если результат был равен и (или) больше средней оптической плотности.

2.1.6. Кольпоскопический метод исследования Применяли простую и расширенную кольпоскопию шейки матки с использованием пробы с 3% уксусной кислотой и обработкой 3% раствором Люголя (проба Шиллера).

2.1.7. Морфологические методы исследования Цитологический метод. При осмотре влагалища и шейки матки с помощью зеркал шпателем, ложечкой Фолькмана или специальной щеточкой «Cervicsbruslf» производился соскоб с влагалищной поверхности шейки матки, из цервикального канала, а также с других подозрительных участков. Материал наносили на предварительно обезжиренное стекло. Затем производили окраску по Романовскому-Гимзе и последующую микроскопию.

Гистологический метод. На гистологическое исследование направляли фрагменты тканей, полученных при диагностической биопсии.

После тщательной дезинфекции наружных половых органов, влагалища и шейки матки, обработки места предполагаемой биопсии спиртом, влагалищная часть шейки захватывалась двумя пулевыми щипцами, наложенными у краев участка, подлежащего удалению. Йоднегативный участок или участки слизистой клиновидно иссекались скальпелем или конхотомом. Участок шейки матки, где был взят материал для биопсии, обрабатывался 5% раствором йода.

При биопсии брали кусочки тканей не менее 0,5-1 см в ширину. Затем во влагалище на несколько часов вводили стерильный марлевый тампон.

Фрагменты тканей, взятых для гистологического исследования, фиксировались в формалине, срезы окрашивались гематоксилин – эозином.

2.2. Методы математического анализа и статистической обработки Статистическая обработка полученных результатов произведена с использованием общепринятых методов параметрической статистики, корреляции, многофакторного анализа и прогнозирования на IBM PC P-II-400 с помощью табличного процессора «Excel» v. 7.0. Достоверность нулевой статистической гипотезы оценивали по t критерию Стьюдента на уровне 95%