При повреждении стенки сосуда запускается каскад процессов, ведущих к образованию тромба из тромбоцитов и фибрина, для остановки кровотечения из поврежденного сосуда (рис. 2). Процесс агрегации тромбоцитов и образования тромба включает две основные стадии. Первой стадией является адгезия (прилипание) тромбоцитов к субэндотелиальному матриксу или активированному эндотелию. При этом из эндотелиальных клеток в кровь высвобождается содержимое телец Вейбла-Палада, которые представляют собой мультимеры фактора фон Виллибранда (ФВ) и Р-селектина [Michelson A.D., 2004]. ФВ обеспечивает связь между тромбоцитами и сосудистой стенкой (адгезия тромбоцитов) и тромбоцитами (агрегация тромбоцитов). Р-селектин обеспечивает агрегацию лейкоцитов к месту повреждения кровеносного сосуда.

ФВ служит мостиком между коллагеном и тромбоцитами и необходим для адгезии тромбоцитов к коллагену при высокой скорости тока крови [Cosemans M. E, 2011]. Данная связь является достаточно слабой, однако приводит к замедлению движения тромбоцита через тромбогенную поверхность, богатую коллагеном, что делает возможным взаимодействие с ним других рецепторов тромбоцитов [Baruch D., 2006; Krotz F., 2008].

Также в процессе адгезии тромбоцитов принимают участие различные рецепторы и адгезивные молекулы. К ним относятся рецепторы коллагена (GPIa/IIa (интегрин 2/1)) и GPVI. Комплекс GPIa/IIa главным образом поддерживает связь тромбоцита с коллагеном, а рецептор GPVI проводит сигнал через мембрану внутрь клетки с целью дальнейшей активации тромбоцита [Tucker K.L., 2008; Margarucci L., 2011]. Данный сигнал служит началом следующей стадии процесса тромбообразования, а именно агрегации тромбоцитов. При этом множество тромбоцитов связываются между собой с помощью фибриногена или ФВ через активированные рецепторы тромбоцитов GPIIb-IIIa. Эта стадия является общей для большинства путей активации тромбоцитов. Следовательно, независимо от начального сигнала процесс агрегации завершается конформационным изменением, испытываемым комплексом поверхностного гликопротеина GPIIb-IIIa, который преобразует его в рецептор для фибриногена. После этого фибриноген играет роль мостика между прилегающими тромбоцитами (рис.2).

Рис. 2. Адгезия и агрегация тромбоцитов при повреждении сосудистой стенки При активации тромбоцитов происходит изменение их структуры – появляется большое количество выростов, благодаря которым площадь поверхности мембраны тромбоцита увеличивается в несколько раз.

Рецепторы мембраны тромбоцитов. На мембране тромбоцита экспрессируется большое количество рецепторов. Они, в основном, относятся к семейству интегринов. Интегрины-это гетеродимерные молекулы, образованные - и -субъединицами, различные комбинации которых формируют рецепторы, специфичные для разных типов лигандов. Основные мембранные рецепторы тромбоцитов представлены в таблице 1.

PAR-1, PAR-3, PAR- связывающимся с большим числом лигандов, и осуществляет связь тромбоцитов друг с другом через фибриногеновые мостики. Также гликопротеид IIb/IIIa вступает во взаимодействие с ФВ, витронектином и фибронектином, которые представляют семейство интегринов. При стимуляции красных кровяных пластинок активируется от 60 000 до 80 000 GPIIb-IIIa рецепторов на одну клетку [Brass L. F., 2008].

Гликопротеидный комплекс Ib/V/IX. Его главная функция–это адгезия и активация тромбоцитов. В интактных тромбоцитах связывание этого комплекса с ФВ незначительно. При повреждении эндотелия происходит контакт ФВ с базальной мембраной субэндотелия. При высокой скорости кровотока это может привести к конформационным изменениям в молекуле ФВ и увеличению его сродства к данному гликопротеиду[Baruch D., 2006].

Рецепторы тромбина. Тромбин является представителем семейства протеиназ трипсина и гликопротеидом, который катализирует расщепление пептидных связей аминокислот [Lenoci L., 2011]. В молекуле тромбина имеется помимо активного центра связывания с рецептором – дополнительный, что субстратов. Этот дополнительный центр играет важную роль в связывании тромбина с фибриногеном и мембранными рецепторами, активируемыми взаимодействуя с двумя типами трансмембранных рецепторов PAR-1 и PAR- (от англ. «Protease Activated Receptors). При этом PAR-1 является основным рецептором, так как обладает большим сродством к тромбину. Активация этого рецептора приводит к высвобождению биологически активных веществ из - и -гранул. В случае блокады рецептора PAR-1 сохраняется реакция тромбоцитов на высокие дозы тромбина за счет способности связывания с рецептором PARАктивация последнего вызывает высвобождение кальция из эндоплазматического ретикулума и дегрануляцию -гранул. Угнетение тромбоцитарных рецепторов PAR-1 является перспективным направлением для создания новых антитромботических препаратов. Также, необходимо отментить, что агрегация тромбоцитов, индуцированная тромбином возникает только при патологическом тромбозе, в отличие от активации тромбоцитов под физиологических условиях, и при развитии патологического тромбоза.

Рецепторы АДФ, адреналина, серотонина. Данные физиологические индукторы относятся к слабым стимуляторам агрегации тромбоцитов, в трансмембранными пептидными структурами и связаны с G –белками, которые через систему вторичных посредников приводят к изменению уровня кальция в тромбоцитах.

Из семейства пуриновых рецепторов наиболее хорошо изученными являются Р2Х1, Р2Y1 и Р2Y12 [Mahaut-Smith M.P., 2011]. Р2Х1 - это ионные каналы, являющиеся медиаторами быстрого захвата кальция, что приводит к изменению формы тромбоцитов и агрегации [Gachet C., 2006]. Р2Y1 -это рецептор, сопряженный с Gq-протеином. Посредством этой связи происходит активация фосфолипазы С, что приводит к образованию инозитол-1,4,5трифосфата (ИФ3) и вызывает последующую мобилизацию внутриклеточного кальция [Guidetti G.F., 2008].

Р2Y12 рецептор имеется только на мембране тромбоцитов и играет ключевую роль в агрегации тромбоцитов и высовобождении тромбоксана А [Nagy B. Jr., 2011; Nawarskas J.J., 2011]. При его стимуляции активируется фосфоинозитид-3-киназа, которая усиливает проагрегационные сигналы, что ведет к угнетению аденилатциклазы и уменьшению уровня цАМФ. Последний вызывает секрецию тромбоцитами медиаторов агрегации тромбоцитов [Garcia A., 2010]. Одновременно происходит активация фосфолипазы А2, под действием которой высвобождается арахидоновая кислота и образуется TXА2.

Связавшись со специфическими рецепторами на мембране тромбоцита, АДФ создает благоприятные условия для рецепции фибриногена на поверхности тромбоцитов, что приводит к активации гликопротеиновых рецепторов IIb/IIIa [Kim S., 2011].

Адреналин активирует процесс агрегации тромбоцитов, вызывая стимуляцию 2–адренорецепторов. При этом происходит угнетение аденилатциклазы, уменьшение уровня цАМФ и изменение содержания внутриклеточного Са2+. Также адреналин способствует активации других агонистов, в результате чего, может приводить к внутрисосудистой агрегации тромбоцитов [Moscard A., 2011].

серотонина, относящиеся к подтипу 5-НТ2А рецепторов, сопряженные с G – белком. Механизм агрегации тромбоцитов индуцированный серотонином связан с регуляцией цАМФ-зависимых путей. Данный агонист стимулирует фосфатидилинозитоловый цикл с образованием фосфатидной кислоты, которая в свою очередь является кальциевым ионофором [Holinstat M., 2007]. Через активацию G-белков, серотонин активирует фосфолипазу С, в результате чего образуется фосфатидная кислота, являющаяся кальциевым ионофором. Она высвобождает кальций из внутриклеточных депо, и присоединяет его к своим фосфатным группам. Ионы Са2+ активируют работу белков актина и миозина микрофиламентов и в результате гранулы тромбоцитов подходят к системе открытых канальцев, происходит реакция высвобождения и усиливается собственный ответ клетки, что ведет к активации других тромбоцитов [Duerschmied D., 2010].

При активации тромбоцитов также повышается активность фосфолипазы А2 тромбоцитарных мембран, что начало реакциям арахидонового каскада, приводящих к образованию мощного проагреганта тромбоксана А2 (ТхА2).

После его попадания в кровоток происходит стимуляция тромбоксановых рецепторов, в результате чего высвобождаются ионы Са2+ из кальциевых депо тромбоцитов. Кроме того, ТхА2 вызывает увеличение концентрации Са2+ в эндотелиальных клетках, что ведет к вазоконстрикции. Повышение уровня гликопротеиновых рецепторов IIb/IIIа в мембране тромбоцитов и они приобретают способность связывать фибриноген. Нарушения равновесия в продукции простациклина и уменьшает биодоступность окиси азота (NO) и, как следствие, ухудшению эндотелий-зависимой гиперполяризации, что способствует дисфункции эндотелия [Тюренков И.Н., 2011].

взаимодействие тромбоцитов с лейкоцитами. В данном взаимодействии принимает участие молекула CD40L [Emomoto Y., 2010]. Эта молекула туморнекротических факторов, экспрессируемых Т-, B-лимфоцитами, мастоцитами, эозинофилами, базофилами, эндотелием и активированными тромбоцитами [May A.E., 2008]. CD40L стимулирует эндотелиальные клетки к секреции различных хемокинов, кторые и притягивают лейкоциты.

Возрастание уровня этого белка в плазме крови связано с повышенным риском сердечно-сосудистых случаев.

Таким образом, исходя из выше изложенного, можно заключить, что в настоящее время известны и хорошо изучены различные патогенетические звенья, приводящие к повышению функциональной активности тромбоцитов, которые могут являться потенциальными мишенями для создания новых антиагрегантных препаратов.

1.2. Фармакологическая регуляция процессов агрегации тромбоцитов.

патогенезе осложнений сердечно–сосудистых заболеваний, антиагрегационная терапия является патогенетически обоснованной [Adewall S., 2011]. Однако арсенал препаратов блокирующих агрегацию тромбоцитов является весьма ограниченным.

препаратов, в основе разделения которых лежат принципы доказательной медицины, включающие эффективность и наличие побочных эффектов. Первая группа антитромбоцитарных препаратов – это лекарственные средства применение которых не рекомендуется для практической кардиологии, так как для них отсутствуют доказательные основы преимуществ перед ацетилсалициловой кислотой (АСК), неэффективности и потенциальной опасности: блокаторы синтетазы тромбоксана А2, антагонисты рецепторов тромбоксана А2, сульфинпиразон, дипиридамол, простациклин, ингибиторы IIIa/IIb рецепторов тромбоцитов для приема внутрь. Вторая группа препаратов составляет основу современной антитромбоцитарной терапии. К ней относятся:

гликопротеиновых (ГП) рецепторов IIIa/IIb для внутривенного применения (абсиксимаб, эптифибатид и тирофибан).

АСК в настоящее время признана стандартом антитромботической терапии и является самым известным и наиболее востребованным антиагрегантным средством [Недогода С.В., 2010; Толпыгина С.Н., 2011].

Механизм антиагрегантного действия АСК состоит в необратимом ингибировании ЦОГ тромбоцитов, ацетилировании гидроксильной группы остатка серина в положении 529 молекулы фермента. Это приводит к неспецифическому стерическому угнетению его взаимодействия с субстратом – арахидоновой кислотой и блокированию синтеза ТХА2 [Бубнова М.Г., 2010].

Однако угнетение ацетилсалициловой кислотой ЦОГ 1 приводит к снижению результате этого одним из побочных эффектов АСК являются гастропатии, т.е.

желудочно-кишечные осложнения – эрозии слизистой оболочки, боли в эпигастральной области, изжога и кровотечения [Morini S., 2010].

В настоящее время созданы формы АСК, которые имеют защитную кишечнорастворимую оболочку (Тромбо-АСС, Аспинат-Кардио, Аспифат) [Козловский В.И., 2012]. Другим способом, который может уменьшить гастротоксичность, является комбинирование АСК с антацидным средством [Lanas А., 2006; Скотников А.С., 2011]. Перспективным представителем данной комбинации является препарат кардиомагнил.

Также ограничивает применение АСК наличие у некоторых больных аспиринорезистентности и снижение антитромботического эффекта [Postula М., 2010; Фролова Н.С., 2011; Грицан Г.В., 2013]. Согласно данным литературы от 10 до 15% больных с клиническими формами атеросклероза полностью не чувствительны к АСК [Patrono С., 2003]. Кроме того, описаны случаи вторичной аспиринорезистентности, развитие которой сложно вовремя диагностировать. В целях избежания последствий устойчивости больных к аспирину необходим регулярный контроль уровня агрегационной активности тромбоцитов.

АСК имеет хороший фармакоэкономический показатель и доказательство преобладания пользы над возможным риском. [Dragani А., 2010]. Поэтому, учитывая применение АСК для продолжительного лечения и профилактики осложнений сердечно-сосудистых заболеваний, вопросы о безопасности терапии этим препаратом очень актуальны.

Важной группой антиагрегантных средств являются производные тиенопиридина, представленные тиклопидином, клопидогрелем и празугрелем (препарат третьей генерации), а также нетиенопиридиновые производные тикагрелор и кангрелор [Bernlochner I., 2012].

Препарат первой генерации - тиклопидин аналогичен по эффекту АСК, 1989]. Однако для этого препарата характерны выраженные [Hass W.K., побочные эффекты в виде диспепсии, кровотечения, нейтропении, агранулоцитоза и повышения содержания липопротеидов низкой и очень низкой плотности [Парфенов В.А., 2006].

Наиболее перспективным препаратом из этого класса является заключается в селективном ингибировании связывания АДФ с рецепторами на тромбоците и стимуляции гликопротеиновых рецепторов IIb/IIIa под действием АДФ [Добровольский А.В., 2009]. Таким образом, клопидогрел действует на конечный этап, который является общим для всех путей агрегации, блокируя образование фибриновых мостиков между тромбоцитами [Парфенов В.А., 2006].

Следовательно, клопидогрел отличается по механизму действия от ацетилсалициловой кислоты, которая ингибирует только вторую фазу агрегации тромбоцитов, индуцированную АДФ, а тиенопиридины угнетают обе фазы – агрегацию и адгезию, не затрагивая метаболизм арахидоновой кислоты.

Всасываясь в желудочно-кишечном тракте, клопидогрел полностью метаболизируется в печени с участием цитоxрома P-450 и его изоферментов, превращаясь в активный метаболит - SR26443 [Ma T.K., 2010]. Антиагрегатный эффект препарата максимально проявляется через 3-7 дней. Однако у копидогреля также наблюдаются побочные эффеты [Sikka P., 2010]. К ним относятся изъязвления в желудочно-кишечном тракте, кровотечения из верхних отделов ЖКТ, развитие тромбоцитопенической пурпуры, которая проявляется расстройствами [Zakarija A., 2009]. На сегодняшний день также описаны механизмы резистентности к клопидогрелю [Фролова Н.С., 2010; Cattaneo М., 2011].

Необходимо отметить, что клопидогрел имеет менее благоприятный фармакоэкономический показатель в сравнении с АСК.

тромбоцитов-прасугрель также является производным тиенопиридинов. Для него характерна более выраженная антитромбоцитарная активность, в сравнении с клопидогрелем и он метаболизируется в печени без участия цитоxрома P-450 [Nishiya Y., 2009]. Однако его механизм действия, также носит необратимый характер блокирования функциональной активности тромбоцитов, что может приводить к кровотечениям [Udell J.A., 2014]. В настоящее время созданы и внедрены в клиническую практику ингибиторы Р2Y12 рецепторов с обратимым действием. К ним относятся препараты тикагрелор и кангрелор, которые являются нетиенопридиновыми производными [Lombo B., 2011; Marino M., 2014].

экспериментальных исследований, являются вещества, блокирующие активацию тромбоцитов, вызванную P2Y1 рецепторами. Механизм их действия связан с ингибированием взаимодействия АДФ с ионным каналом, влиянием на фосфолипазу С, в результате чего, возникает препятствие активации и изменению формы тромбоцитов [Maloney S.F., 2010].

На сегодняшний день привлекает внимание двойная антитромбоцитарная ацетилсалициловой кислоты. Интерес к такой терапии состоит в том, что агрегацию тромбоцитов, позволяя таким образом достичь более выраженного исследования CURE (1999-2001), CLARITY (2003-2004), COMMIT (1999-2005), одновременного назначения аспирина и клопидогреля.

Самой молодой группой антиагрегантных средств являются ингибиторы IIb/IIIa-гликопротеиновых рецепторов тромбоцитов [Arora R.R., 2009] для внутривенного введения. Механизм действия препаратов этой группы заключается в блокировании последнего этапа агрегации тромбоцитов, а образования мостиков между активированными тромбоцитами из молекул фибриногена [De Luca G., 2009].

Представитель группы - препарат абциксимаб является моноклональным антителом и обладает высоким сродством к IIb/IIIa гликопротеиновым рецепторам тромбоцитов [Kastrati A., 2007].

Другие представители данной группы эптифибатид и тирофибан, в отличие от абциксимаба, относятся к конкурентным ингибиторам связывания фибриногена [Valgimigli M., 2008]. Для того чтобы эффективно подавить активность GP IIb/IIIa на поверхности циркулирующих тромбоцитов, необходимо постоянное присутствие в крови этих препаратов в высоких концентрациях.

выраженные побочные эффекты в виде кровотечений, АВ-блокады, гипотензии, брадикардии, диспепсии, спутанности сознания, тромбоцитопении, анафилактического шока и лейкоцитоза [De Luca G., 2009].

Также представителем антиагреганых средств является дипиридамол (курантил, персантин) - производное пиримидопиримидинов. Механизм антитромбоцитарного действия дипиридамола связан с повышением уровня фосфодиэстеразы цАМФ, а также за счет ингибирования входа аденозина [Jensen B.O., 2011].

Другие антиагрегантные средства, к которым относятся ингибиторы тромбоксансинтетазы (дазоксибен) и рецепторов ТХА2 (сулотробан), аналоги простациклина (эпопростенол), стимуляторы аденилатциклазы (илопрост) продемонстрировали хорошие результаты в эксперименте. Однако эти препараты не имеют доказательную основу эффективности и поэтому не внедрены широко в клиническую практику [Kuo H.L., 2010].

Также в настоящее время разработан новый обратимый ингибитор тромбина – дабигатран [Bassand J.P., 2014]. Другие антагонисты PARs проходят клинические испытания с целью применения для лечения сердечнососудистых заболеваний, осложненных тромбозами [Coccheri S., 2010].

Следовательно, ингибирование агрегации тромбоцитов является важным звеном для предотвращения тромботических состояний. Однако опасным побочным эффектом всех антиагргатных средств являются кровотечения [Kilickiran, 2008]. К сожалению, на сегодняшний день не существует антиагрегантного препарата, который бы селективно блокировал тромбоциты, участвующие в образовании тромба и не затрагивал нормально функционирующие тромбоциты. Поэтому поиск, изучение и создание новых антиагрегантных средств с наименьшими побочными эффектами является важной задачей в решении проблемы предотвращения состояний, cвязанных с повышением тромбогенного потенциала крови.

1.3. Производные индола как потенциально активные вещества в процессе регуляции функциональной активности тромбоцитов.

Химические соединения, имеющие в своей основе гетероциклические азотосодержащие структуры, обладают широким спектром биологической активности [Cпасов А.А., 2006; Sawy-El R.E., 2010; Nofal Z.M., 2011]. Среди них вызывают интерес производные индола, являющиеся чрезвычайно активными веществами, находящие широкое применение в медицинской практике как эффективные препараты с разнообразной фармакологической активностью. В настоящее время описано несколько тысяч представителей этого класса, оказывающих различное биологическое действие [Mehta D.S., 2005; Dubey P.K., 2006; Gudipati R., 2011; Biswal S., 2012]. Лекарственные средства и соединения, относящиеся к данному классу проявляют противовоспалительную, анальгетическую, противосудорожную, антибактериальную, противомалярийную, противогрибковую, противовирусную, антигипертензивную, антиоксидантную и противоопухолевую активности [Bell M.R., 1967; Hiari-Al Y., 2006; Frederich М., 2008; Sharma P.P., 2009; Prakasam T., 2010; Gupta A.K., 2012; Tunbridge G.

A., 2013]. К ним относятся такие препараты, как индометацин, резерпин, ондансетрон, арбидол, карбидин, серотонина адипинат и др.

Кроме того, среди производных индола имеются препараты и высокоактивные вещества, проявляющие антиагрегантную активность [Mashayekhi V., 2013; Laube M., 2013].

Антиагрегантная активность препарата индобуфен, содержащего в своей структуре индольное кольцо, связана со способностью подавлять активность циклооксигеназы и тромбоксансинтетазы тромбоцитов, уменьшая, таким образом, их функциональную активность [Bhana N., 2001].

Также показана анитромботическая активность производных индола, и продемонстрирована способность ингибировать гликопротеиновые рецепторы IIb/IIIa и уменьшать синтез ТХА2 [Mashayekhi V., 2013].

Известны вещества с доказанной антиагрегантной активностью, также как и индолы, относящиеся к классу гетероциклических соединений. К таким соединениям относятся ингибитор тромбоксансинтетазы дазоксибен [Sincholle, 1986].

Эти данные говорят о том, что для проявления веществами высокой антиагрегантной активности необходимо, чтобы в их химической структуре присутствовал ароматический, насыщенный и/или ненасыщенный гетероцикл с одним или несколькими атомами азота. Класс производных индола отвечает данному условию, что делает его перспективным для направленного поиска новых соединений с высокой антиагрегантной активностью.

Определением выбора химического класса производных индола, среди которых проводился поиск антиагрегантных соединений, явилось наличие отработанной схемы синтеза данной гуппы веществ [Sengpracha W., 2005] и возможность их достаточного получения для первичного скрининга (вещества были синтезированы на кафедре химии природных и высокомолекулярных соединений химического факультета Южного Федерального Университета (к.х.н. К.Ф. Суздалевым)). Кроме того, на основе рекомендаций, разработанных по результатам проводимых исследований, в перспективе появится возможность синтезировать новые соединения с желаемыми фармакологическими и фармакодинамическими свойствами.

Все вышеизложенное послужило причиной для начала изучения новых потенциальных антиагрегантных препаратов на основе производных индола.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Данные соединения синтезированы на кафедре химии природных и Федерального университета к.х.н. К.Ф.Суздалевым.1 Структурные формулы изученных соединений представлены в таблице 2.1.

следующие вещества: динатриевая соль аденозин-5-дифосфорной кислоты адреналин («Sigma», США), U46619 (агонист тромбоксановых рецепторов) («Sigma», CША), тромбин («Sigma», CША), коллаген (НПО «Ренам», Россия).

Патологические состояния на животных воспроизводили при помощи динатриевой соли аденозин-5-дифосфорной кислоты (АДФ) (Reanal, Венгрия), хлоралгидрата (Органика, Россия), хлорида железа (III) (ч., «Мосреактив»

Россия), аллоксана (Меrck, США).

следующие реактивы: цитрат натрия (ч.д.а., Реахим, Россия), натрия хлорид (х.ч.), натриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) («ICN», США), трис-(оксиметил)-аминометана гидрохлорид (х.ч.), кальция хлорид (этиленгликоль-бис-(-аминоэтиловый эфир тетрауксусной кислоты)) («Sigma», CША), калия хлорид (х.ч.), гидрокарбонат натрия (х.ч.), магния хлорид (х.ч.), Выражаем искреннюю благодарность к.х.н., К.Ф.Суздалеву за любезно предоставленные субстанции веществ.

Химическое строение изученных производных индола соединения 1. Гидрохлориды N-[(1-RR1-амино)карбонил-2-(1-R2-1H-индол-3-ил)винил]-R3-амидов п/п 2. Гидрохлориды 1-R1R2-амино-3-(3-R2-1H-индол-1-ил)-2-пропанолов глюкоза (х.ч.) (ч.д.а., Реахим, Россия), бычий альбумин, тиобарбитуровую кислоту (ДИА-М, Германия), флуоресцентный зонд Fura-2/АМ (Sigma, США) и кальций-чувствительный флуоресцентный зонд хлортетрациклина (Sigma, США), Тромбо-тест, АПТВ, ТЕХ-фибриноген тест, техпластин-тест (ООО «Технология стандарт», Россия), XIIа зависимый фибринолиз (НПО «Ренам», Россия), набор «Глюкоза ФКД» (Россия).

ацетилсалициловую кислоту («Sigma», CША), тиклопидин (Тиклид, "Sanofisyntelabo", Франция), пентоксифиллин (Aventis, Германия), гликлазид (Servier, Франция), верапамил (ЗАО «Северная звезда», Россия), вещества - Reactive blue 2 (Basilen blue) («Sigma», CША) и PPADS («Sigma», США). В качестве растворителя веществ использовали дистиллированную воду.

Опыты проводили на 14 кроликах породы «Шиншилла» весом 3-4 кг, белых нелиненйных крысах обоего пола массой 250-350 г. и 215 белых нелинейных мышах обоего пола массой 20-32 г. Эксперименты выполнялись согласно методическим руководствам и нормативным документам (ГОСТ З 51000.3-96 51000.4-96;

Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997); правила лабораторной практики (GLP) в Российской Федерации, утвержденные приказом Минздрава РФ от июня 2003 г. № 267). Забой животных проводили с соблюдением требований, изложенных в «Международных рекомендациях по проведению медикобиологических исследований с использованием животных» (1997). В течение 24 часов до начала экспериментов все животные находились в условиях полной пищевой депривации со свободным доступом к воде. На момент выполнения исследований животные были здоровыми, без изменений поведения, режима сна и бодрствования, аппетита.

Острую токсичность соединений изучали в соответствии с требованиями и инструкциями Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития [Миронов А.Н., 2012]. Протокол экспериментальной [Введите текст] части исследования согласован с Региональным этическим комитетом (Протокол № 154 -2012).

2.2. Методы исследований Метод исследования функциональной активности тромбоцитов in vitro. Изучение влияния веществ на функциональную активность тромбоцитов in vitro проводили согласно методу Born G. в модификации Габбасова В.А.

(1989) на двухканальном лазерном анализаторе агрегации тромбоцитов НПФ «Биола» 220LA (Россия). Исследования выполняли на богатой тромбоцитами плазме кроликов по способу, описанному Люсовым В.А., Белоусовым Ю.Б.

(1971). Для этого венозную кровь, забранную из ушной краевой вены кролика, стабилизировали 3,8 % раствором цитрата натрия в соотношении 9:1 и центрифугировали в течение 12 мин при 1500 об/мин на центрифуге MultiCentrifuge CM 6M (Elmi, Латвия). Для получения бедной тромбоцитами плазмы, необходимой для калибровки, обогащенную тромбоцитами плазму центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 минут.

светопропускания плазмы, богатой тромбоцитами, при добавлении к последней веществ, индуцирующих агрегацию (в условиях постоянного перемешивания), а также на анализе флюктуаций светопропускания образца суспензии, вызванных случайным изменением числа частиц в оптическом канале прибора.

Необходимым условием возникновения агрегации является механическое перемешивание плазмы, которое проводилось с помощью магнитной мешалки, прилагаемой к агрегометру.

Предварительно проводили калибровку прибора по двум точкам с использованием ЭДТА. При этом светопропускание бедной тромбоцитами плазмы принималось за 0%, а светопропускание богатой тромбоцитами плазмы за 100%. Для получения контроля агрегации тромбоцитов в ходе эксперимента в кювету агрегометра последовательно вносили 300 мкл богатой тромбоцитами [Введите текст] плазмы и 10 мкл индуктора агрегации тромбоцитов аденозин-5-дифосфорной кислоты (АДФ) («Sigma» США), в конечной концентрации 5 мкМ. При изучении антиагрегантой активности соединений в кювету с 300 мкл богатой тромбоцитами плазмой добавляем 10 мкл раствора исследуемого соединения в концентрации 1х10-4 М. Пробы инкубировали в термостатируемых ячейках агрегометра при 37 С0 в течение 5 минут. После включения записи агрегатограммы, на 10 секунде регистрации процесса, в кювету добавляли индуктор агрегации. В качестве препарата сравнения использовали ацетилсалициловую кислоту, широко используемую в клинике как антиагрегантное средство.

При регистрации процесса агрегации тромбоцитов в течение 5 минут получали кривые, отражающие падение оптической плотности богатой тромбоцитами плазмы. Степень агрегации оценивали по величине максимальной амплитуды агрегатограммы. Расчт ингибирующего влияния на агрегацию тромбоцитов (ИнАТ) изучаемых соединений проводили по формуле:

А-степень агрегации тромбоцитов крови кроликов без изучаемых соединений, В-степень агрегации тромбоцитов после инкубации плазмы богатой тромбоцитами с изучаемыми соединениями.

Новые производные индола и препарат сравнения ацетилсалициловую кислоту изучали в диапазоне концентраций 1 х 10 -3 – 1 х 10-6 М. Для соединений, проявивших высокую антиагрегантную активность, и препарата сравнения рассчитывали величину (концентрация, ингибирующая активацию тромбоцитов на 50 %).

Моделирование внутрисосудистой агрегации тромбоцитов выполняли согласно методу J. F. Pinon (1984). Опыты провдили на белых беспородных крысах, наркотизированных хлоралгидратом (400 мг/кг внутрибрюшинно).

Влияние соединений на внутрисосудистую агрегацию кровяных пластинок оценивали через 1,5 часа после перорального введения вещества. в дозе [Введите текст] мг/кг. Стимулятор агрегации АДФ вводили внутривенно в дозе 1 мг/кг.

Наиболее активные соединения были изучены в дозах 10, 25 и 50 мг/кг. В качестве препарата сравнения использовали ацетилсалициловую кислоту в дозах 125, 250 и 350 мг/кг.

Для оценки активности соединений определяли % ингибирования функциональной активности тромбоцитов. Расчет ED50 (эффективная доза, использованием метода регрессионного анализа.

Метод проведения анализа зависимости между антиагрегантной активностью и химической структурой производных индола. При анализе зависимости антиагрегантной активности от химической структуры производных индола все изученные вещества были разделены на классы с различным уровнем активности. В целях определения границ класса соединений с высокой антиагрегантной активностью был выполнен кластерный анализ данных по показателю % (10-4). Кластеризацию проводили вероятностным методом гистограмм [Мандель И. Д., 1988].

По результатам анализа были выявлены следующие классы производных индола с антиагрегантной активностью:

1) высокоактивные – (10-4) 50 % 2) умеренно активные – (10-4) 25 % 4) неактивные – (10-4) = 0 (условно);

Методы исследования антитромботических свойств соединений.

Эксперименты были выполнены на белых нелинейных крысах-самцах массой 350-400 г и беспородных мышах. Изучено новое производное индола под ацетилсалициловая кислота (Sigma, CША). Вещество растворяли в ацетилсалициловой кислоте (20 мг/кг), которая составила для соединения SbtВведите текст] 828– 47,5 мг/кг и вводилось перорально за 2 часа до моделирования тромбозов, что соответствует времени достижения максимальной концентрации ацетилсалициловой кислоты в крови. Контрольные группы животных получали растворитель в эквивалентном объеме.

Модель артериального тромбоза, индуцированного аппликацией хлорида железа. Антитромботическую активность соединений изучали, используя модель артериального тромбоза сонной артерии у крыс, вызванного поверхностной аппликацией 50% раствора хлорида железа (III) согласно методу [Kurz K.D., 1990], который осуществляли спустя 2 часа после введения соединений. Крыс интраперитониально наркотизировали хлоралгидратом ( мг/кг), затем послойно вскрывали кожу и ткани, отпрепаровывали сонную артерию на 3 см в длину. На участок длиной около 1 см укладывали ватный диск размером 2 мм х 8 мм, смоченный 50% раствором хлорида железа (III) (0,025 мл), и пленку Parafilm с целью изоляции окружающих тканей. Для исследования использовали ультразвуковой допплерограф «МинимаксДопплер–К» (Санкт-Петербург). Ультразвуковой датчик аппарата устанавливался на расстоянии 1 см от ватного диска, наложенного на сонную артерию (рис.2.1.). Регистрацию кровотока проводили до полной окклюзии сосуда.

В зависимости от проявленного антитромботического эффекта с целью определения ED50, (доза, в которой изученные соединения увеличивают время окклюзии сосуда тромбом по отношению к контролю на 50%) дозы веществ и препарата сравнения либо увеличивались, либо уменьшались. Они составили для Sbt 828- 12 и 23,5 мг/кг, а для ацетилсалициловой кислоты – 125 и мг/кг.

Модель артериального тромбоза, индуцированного электрическим током была поставлена согласно методу Guglielmi G. et al (1991) на нелинейных крысах – самцах массой 350-400. На данной модели в механизм тромбообразования вовлечена АТФ. В результате повреждения эндотелия сосудистой стенки воздействием постоянного электрического тока [Введите текст] активируется его выработка, что приводит к инициации процессов активации и агрегации тромбоцитов с формированием, в конечном итоге, тромбиновых сгустков крови.

Рис. 2.1 - Моделирование артериального тромбоза, индуцированного хлоридом железа (III).

Примечание: 1 – сонная артерия, 2 - пленка Parafilm, 3 - ватный диск, смоченный 50% раствором хлорида железа (III), 4 - ультразвуковой датчик.

наркотизированных хлоралгидратом (400 мг/кг, внутрибрюшинно) животных.

отпрепаровывали сонную артерию на 3 см в длину. На участок сосуда длиной [Введите текст] около 1 см были наложены титановые электроды, на места их контакта с артерией наносился акустический гель. Окружающие ткани изолировались пленкой Parafilm. На расстоянии 2 см от данного участка устанавливался датчик аппарата с рабочей частотой ультразвукового зондирования 25 МГц.

электрическим током напряжением 12 В, сила тока при этом соответствовала мА. Воздействие на сосуд выполнялось до момента полной окклюзии.

Регистрация артериального кровотока проводилась с помощью ультразвукового допплерографа «Минимакс-Допплер-К («СП Минимакс», Cанкт-Петербург, антитромботические свойства исследуемых веществ, использовался интервал времени от момента начала стимуляции до полной окклюзии каротидной артерии.

Исходя из проявленного антитромботического действия с целью определения ED50, доза вещества Sbt-828 была уменьшена до 23 и 12 мг/кг, а препарата сравнения ацетилсалициловой кислоты увеличена до 60 и 125 мг/кг.

Модель генерализованного адреналин-коллагенового тромбоза на мышах.

Данная модель была поставлена в соответствии с методикой [Di Minno G., 1983]. Генерализованный тромбоз позволяет проводить оценку влияния соединений на процесс системной агрегации тромбоцитов. В качестве агента, вызывающего тромбоз использовали смесь растворов двух растворов:

коллагена - в дозе 0,5 мг/кг и адреналина - в дозе 0,06 мг/кг. В качестве критерия эффективности исследуемых веществ фиксировали количество выживших животных по сравнению с жиотными контрольной группы и наличие тромбов в сосудах легких.

За выжившими животными наблюдали в течение суток. Умершие и выжившие мыши (для эфтаназии применялся эфирный наркоз) подвергались контрольной группы также проводили гистологическую оценку печени, сердца, почек, головного мозга. Гистологические препараты фиксировали с [Введите текст] использованием цифровой камерой Olympus (Japan, 4.0 мегапикселей) на базе микроскопа Micros (Austria) c использованием объектива х10, х40 и окуляра х10.

Рис. 2.2. - Моделирование артериального тромбоза, индуцированного электрическим током.

Примечание: 1 – сонная артерия, 2 - пленка Parafilm, 3 – титановые электроды, 4 ультразвуковой датчик.

При проведении морфологического исследования выявляли и оценивали признаки тромбообразования в стенке артериальных сосудов мышечного типа.

Для определения времени свертывания крови была использована воспроизведения данной модели у мыши отсекали 5 мм с кончика хвоста.

Хвост помещали в пробирку с физиологическим раствором на водяной бане [Введите текст] (370С) и регистрировали время от момента отсекания кончика хвоста до момента прекращения вытекания крови из сосудов хвоста. По действию на данный параметр соединение и препарат сравнения ацетилсалициловая кислота были изучены в дозах равных ED50, которые были полученны на модели внутрисосудистой агрегации тромбоцитов при пероральном введении дистиллированной воде и вводилось перорально. Контрольные животные получали эквивалентный объем 0,9% раствора натрия хлорида.

Экспериментальный сахарный диабет вызывали свежеприготовленным на 0,01М ацетатном буфере раствором аллоксана при внутрибрюшинном введении в дозе 150 мг/кг [Chougale A., 2007]. Эксперименты проводили через два месяца на животных с тяжелой формой сахарного диабета, у которых была выявлена стойкая гипергликемия с содержанием глюкозы более 17 ммоль/л.

Уровень глюкозы в крови определяли глюкозооксидазным методом. Перед началом экспериментальных исследований осуществляли ежедневное пероральное введение соединения Sbt-828 и препарата сравнения в течение недели.

экспериментальным диабетом «ex vivo» изучали на двухканальном лазерном анализаторе агрегации (модель 220 LA) научно-производственной фирмы «Биола» (г. Москва). Эксперименты выполнены на белых нелинейных крысах обоего пола массой 250-300 г. Определение агрегации тромбоцитов проводили по методу Born G. (1962) в модификации Габбасова З.А. и др. (1989). Для исследования пробы крови забирали из брюшного отдела аорты крыс, находящихся под наркозом, вызванным хлоралгидратом (400 мг/кг внутрибрюшинно). В качестве препарата сравнения использовали гликлазид в дозе 20 мг/кг (ЕD50 гипогликемической активности при пероральном введении крысам с экспериментальным стрептозотоциновым диабетом) [Дудченко Г.П., 1989]. Степень агрегации тромбоцитов оценивали по величине максимальной амплитуды агрегатограммы. Вещество растворялось в дистиллированной воде [Введите текст] и вводилось перорально животным в дозе равной ED50, полученной на модели внутрисосудистой агрегации тромбоцитов ежедневно в течение 7 дней.

эквивалентный объем 0,9% раствора натрия хлорида.

аллоксановым диабетом. Вязкость крови исследовали, используя вискозиметр ротационный типа-анализатора крови реологического (АКР-2), проводя измерения при шести скоростях сдвига (10с-1, 20с-1, 50c-1,100c-1, 200с-1, 300c-1).

Данные скорости сдвига моделируют различную интенсивность кровотока в сосудах [Добровольский Н.А., 1998]. Величины вязкости кровии в области малых скоростей сдвига характеризуют агрегацию эритроцитов, а в области более высоких скоростей сдвига – их деформируемость.

Действие соединения на агрегацию эритроцитов оценивали по индексу агрегации эритроцитов (ИАЭ), который рассчитывали как отношение вязкости крови стандартизированном гематокрите -40%.

Величину гематокрита определяли при помощи центрифугирования капилляров с образцами крови на Hematocrit Centrifuge GM-70 (Elmi, Латвия) (8000 об/мин, 3 минуты) как отношение протяженности в центрифужном капилляре столбика эритроцитов к столбику плазмы. В качестве препарата сравнения был изучен пентоксифиллин в дозе 4 мг/кг [Elenga A.,2002].

Вещество растворялось в дистиллированной воде и вводилось перорально ежедневно в течение 7 дней в дозе равной ED50, полученной на модели внутрисосудистой агрегации тромбоцитов. Контрольные животные получали эквивалентный объем 0,9% раствора натрия хлорида.

Модель артериального тромбоза, индуцированного электрическим током была поставлена согласно вышеописанному методу Guglielmi G. et al [Введите текст] экспериментальным сахарным диабетом. В качестве препарата сравнения использовался гликлазид.

Изучение влияния соединения Sbt-828 на агрегацию тромбоцитов, вызванную различными индукторами, проводили по вышеописанному методу Born G, в модификации Габбасова В.А. (1989). Исследования выполняли как на богатой тромбоцитами плазме кроликов по способу, описанному Люсовым В.А., Белоусовым Ю.Б. (1971), так и на отмытых тромбоцитах.

При отмывании тромбоцитов богатую тромбоцитами плазму дважды центрифугировали с отмывочным буфером (140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 12 mM NaHCO3, 0.4 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 5 mM глюкозы and ресуспендировали в буфере с вышеуказанным составом, но с pH 7.35.

индуцированной различными агонистами, изучали в диапазоне концентраций 1 х 10-3 – 1 х 10-7 М. Исследуемое вещество добавляли за 5 минут до внесения индукторов в плазму крови кроликов. Концентрации индукторов составляли:

для АДФ и адреналина – 5 мкМ, арахидоновой кислоты - 50 мкМ, тромбина ед/мл, коллагена - 20 мкг/мл, U46619 (агонист тромбоксановых рецепторов) - 3 мкМ, Для оценки активности соединения определяли максимальную амплитуду агрегации, % ингибирования функциональной активности тромбоцитов и EC50 в молях.

Влияние соединения Sbt-828 на пуриновые P2Y1 и P2Y12-рецепторы тромбоцитов изучали методом малоуглового светорассеяния [Сакаев М.Р., 2000]. Данный метод делает возможным оценку всех стадий трансформации тромбоцитов. Регистрацию проводили на приборе «Лайт-Скан» (НПФ «Люмекс», Россия) в термостатируемой кюветной камере. Гомогенность гидродинамического турбулентного режима обеспечивалась специальной конструкцией мешалки. На кювету, содержащую 5 мл среды и 106- клеток/мл плазмы, обогащенной тромбоцитами, под углом 90 направлялся свет [Введите текст] от лазерного источника. Регистрация интенсивности светорассеяния осуществлялась фотодиодами в диапазоне углов 2-14 градусов (с шагом в градуса), сигналы с которых через первичный блок преобразования поступали в регистрирующее устройство. Быстрое увеличение интенсивности светорассеяния в углах 10 и 12 градусов при внесении агониста агрегации отражает сферизацию тромбоцитов, которая вызывается повышением уровня внутиклеточного кальция, с полезной величиной сигнала 30-60%. Дальнейшая инвертация сигнала вызвана образованием псевдоподий и развитием агрегации.

Динамика интенсивности светорассеяния в углу 2 градуса отражает только агрегационные процессы.

Исследования проводились на богатой тромбоцитами плазме кроликов.

Активацию тромбоцитарных P2Y1-рецепторов проводили в безкальциевой среде, с добавлением 5 мМ ЭДТА. В качестве индуктора активации данных рецепторов использовали АДФ в концентрации 70 нМ. Эксперименты по оценке влияния соединений на P2Y12-рецепторы проводились в среде, содержащей 1 мМ кальция хлорида, индуцированной АДФ, в концентрации 200 нМ. Тестируемое вещество исследовали в дозе 1 х 10-6 М и вносили в кювету за 2 минуты до начала исследования.

Активность соединения по влиянию на пуриновые рецепторы тромбоцитов оценивали по ингибированию процессов активации и агрегации тромбоцитов. В качестве препарата сравнения использовали вещество PPADS.

Исследования по изучению воздействия на синтез ТХА2 проводили по методу J.B. Smith (1976). Для изучения влияния вещества на биосинтез ТХА использовали тест определения уровня малонового диальдегида (МДА).

Эксперименты выполнены на белых нелинейных крысах обоего пола массой 250-300 г. Изучение действия вещества на уровень ТХА2 производили в дозе ED50, полученной на модели внутрисосудистой агрегации тромбоцитов.

Соединение вводилось перорально за 2 часа до исследования. Группе контрольных животных вводился растворитель в эквивалентном количестве. У наркотизированных хлоралгидратом (400 мг/кг внтрибрюшинно) животных [Введите текст] забирали кровь из брюшной аорты и получали суспензию тромбоцитов путем многократного отмывания по вышеописанному методу. Определение МДА ыполняли при концентрации тромбоцитов, равной 3 х 108 клеток/мл. В качестве препарата сравнения была выбрана ацетилсалициловая кислота.

Для проведения исследования агрегацию тромбоцитов индуцировали тромбином в концентрации 25 ед/мл. Контроль агрегации тромбоцитов под действием тромбина проводили на двухканальном лазерном анализаторе агрегации тромбоцитов (модель 230 LA). Определение МДА в тромбоцитах проводили с помощью тиобарбитуровой кислоты по методу В.Б Гаврилова (1987). Измерение выполняли на спектрофотометре АPEL PD-303 UV (Япония) (длина волны - 532 нм). Концентрацию МДА рассчитывали с использованием коэффициента молярной экстинции равного 1,56 х 10-5 М.

Антиагрегационную активность сосудистой стенки исследовали согласно методу D. E. MacIntyre (1978), в модификации В.П. Балуды (1980), который основан на способности кусочка сосудистой стенки, помещенного в богатую тромбоцитами плазму, выделять простациклин и ингибировать агрегацию кровяных пластинок, вызванную различными индукторами.

Эксперименты проводили на белых беспородных крысах массой 250- г. Плазму, обогащенную тромбоцитами, получали по вышеописанному способу. В качестве индуктора агрегации тромбоцитов использовали АДФ в концентрации 5 мкМ. Изучение влияния вещества на антиагрегационную активность сосудистой стенки производили в дозе, соответствующей ED50, полученной на модели внутрисосудистой агрегации тромбоцитов.

На первом этапе исследований изучали влияние соединения на антиагрегационные свойства сосудистой стенки интактных животных. Для этого животным, внутривенно за 30 минут до наступления наркоза, вводили изучаемое вещество, после чего извлекали участок брюшной аорты и проводили определение ее антиагрегационной функции.

Во второй серии экспериментов исследовали способность вещества восстанавливать снижение антиагрегационной способности стенки сосудов, [Введите текст] вызываемое внутривенным введением адреналина в дозе 0,02 мг/кг.

Исследуемое вещество вводили через 15 минут после инъекции адреналина, а еще через 15 минут проводили оценку способности сосудистой стенки аорты ингибировать агрегацию тромбоцитов. Для оценки активности соединений определяли максимальную амплитуду агрегации и % ингибирования функциональной активности тромбоцитов.

Влияние соединения на уровень внутриклеточного кальция в тромбоцитах проводили по методу Cho М. et al (2006). Для этого отмытые тромбоциты (108/мл) кролика были проинкубированы с 5 мкМ Fura-2/АМ в течение 30 минут при t-37°С в присутствии или отсутствии хлорида кальция ( mM). В качестве препаратов сравнения были выбраны антагонист ионов кальция верапамил и ацетилсалициловая кислота. Для стимуляции выхода интрацеллюлярного кальция из внутриклеточных депо был использован тромбин в концентрации 0,5 ед/мл.

Перед проведением данных исследований была изучена способность соединений связывать ионы кальция. Для этого сравнивали влияние веществ на уровень кальция в интактных тромбоцитах с влиянием хелатора этих ионов ЭГТА. Оценка действия соединений и препаратов сравнения на уровень внутриклеточного кальция проводилась в диапазоне концентраций от 100 до мкМ. Интенсивность флуоресценции была измерена на спктрофлуориметре Hitаchi MPF - 400 (Япония) при длине волны возбуждения 340 nm и 380 nm и длине волны испускания 510 nm в течение 2 минут. Концентрация катионов кальция рассчитывалась с использованием уравнения (Schaeffer and Blaustein, 1989):

[Ca2+]i (нМ)= 224нМ х (F - F min) / (F max – F), 224 нМ – константа диссоциации комплекса Fura-2/АМ и кальция F – интенсивность флуоресценции зонда в пробе (отн.ед.) с тромбином без и с веществами [Введите текст] F min – собственная флуоресценция зонда, свободного от кальция, измеренная после добавления 10 mM ЭГТА F max – флуоресценция зонда, насыщенного кальцием, измеренная после добавления в пробу 10 мкМ 0,1% Тriton X-100.

Для изученных соединений были экспериментально определены величины EC50 (эффективные концентрации, в которых изученные соединения подавляют процесс высвобождения внутриклеточного Са2+ на 50%) Уровень мембраносвязанного кальция в тромбоцитах измеряли с использованием кальций-чувствительного флуоресцентного зонда хлортетрациклина в концентрации 20 мкМ по методу, описанному Gasvell A.H.

и Hutchison J.D (1971). Данный метод основан на увеличении интенсивности флуоресценции хлортетрациклина при связывании его ионами кальция, находящимися в мембранах. Для исследования использовалась богатая тромбоцитами плазма кроликов, содержащая 3 х 10 клеток/мл. Оценка действия соединений на уровень внутриклеточного и мембраносвязанного кальция проводилась в диапазоне концентраций от 100 до 1 мкМ.

Интенсивность флуоресценции была измерена на спектрофлуориметре Hitchi MPF - 400 (Япония) при длине волны возбуждения 400 nm и длине волны испускания 530 nm. В качестве контроля оценивали флуоресценцию хлортетрациклина с обогащенной тромбоцитами плазмой при добавлении физиологического раствора натрия хлорида. Определяли активность вещества в процентах по отношению к контролю.

Влияние исследуемого соединения на показатели коагулограммы крови крыс определяли на гемокоагулометре «SOLAR» (Белоруссия) с использованием наборов реактивов производства «Технология–стандарт»

(Россия), методиками, которые основаны на автоматическом определении клоттингового времени (время свертывания) [Баркаган З.С., 1999]. При патологии результаты коагуляционных тестов проявлялись в виде укорочения или удлинения клоттингового времени. Для калибровки прибора и выплнения тестов использовалась нормальная калибровочная плазма. Все коагуляционные [Введите текст] анализы проводили на бедной тромбоцитами плазме крыс. Методика получения бедной плазмы соответствует выше описанной.

Соединение Sbt-828 было изучено в дозе, соответствующей ED50, полученной на модели внутрисосудистой агрегации тромбоцитов. Вещество растворялось в дистиллированной воде и вводилось перорально. Группы контрольных животных получали эквивалентный объем 0,9% раствора натрия хлорида.

Кровь забирали через два часа с момента введения соединений из брюшной артерии животных после их наркотизации внутрибрюшинной инъекцией хлоралгидрата (400 мг/кг).

Для определения протромбинового времени в кювету коагулометра вносили 100 мкл бедной тромбоцитами плазмы, затем помещали в кюветное отделение и вносили магнитный якорь. С этого момента начинали обратный отсчет времени (120 секунд) – время инкубации плазмы в автоматическом режиме при работающей магнитной мешалке. По окончании инкубационного времени в кювету дозатором вносили 200 мкл тромбопластин-кальциевой смеси со стандартизированной активностью. Время свертывания считывалось с дисплея коагулометра. Использование этого теста позволяет оценивать нарушение факторов акивации внешнего пути свертывания.

Для определения тромбинового времени 100 мкл исследуемой, бедной тромбоцитами плазмы и магнитный якорь вносили в кювету. После инкубации пробы (120 секунд при 37С) в нее добавляли 100 мкл стандартизированного по активности рабочего раствора тромбина. Тромбиновый тест позволяет оценить кинетику конечного этапа свертывания крови - скорость превращения фибриногена в фибрин.

Фибриноген в крови определяли хронометрически на коагулометре «SOLAR» (по Клаусу). 200 мкл разведенной имидазоловым буфером плазмы (1:5) инкубировали в кюветном отделении при работающей мешалке. По окончании времени инкубации в кювету вносили 100 мкл прогретого рабочего [Введите текст] раствора тромбина. Коагулометр автоматически регистрировал время образования первых нитей фибрина.

При определении активированного парциального тромбопластинового времени регистрировали время свертывания рекальцифицированной плазмы в условиях контактной и фосфолипидной активации. Для этого к 100 мкл бедной тромбоцитами плазме добавлялось 100 мкл кефалин-каолиновой суспензии.

После проведения инкубации полученной смеси в кювету вносилось 100 мкл 0,28% раствора хлорида кальция (25 мМ). Использование этого теста позволяет оценить нарушение активности или дефицит факторов активации свертывания внутреннего пути.

Метод определения фибринолитической активности плазмы крови.

Данный метод основан на измерении времени полного лизиса эуглобулиновой фракции, полученной из плазмы крови при осаждении в кислой среде и содержащей факторы свертывания крови и фибринолиза.

Для проведения эксперимента венозную кровь, взятую из ушной краевой вены кролика, стабилизировали 3,8 % раствором цитрата натрия в соотношении 9:1 и центрифугировали в течение 12 мин при 1500 об/мин на центрифуге MultiCentrifuge CM 6M (Elmi, Латвия). Для получения бедной тромбоцитами плазмы пробирки с богатой тромбоцитами плазмой центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 минут. Для изучения фибринолитической активности соединения Sbt-828 и препарата сравнения ацетилсалициловой кислоты, исследуемые вещества инкубировали 5 минут c плазмой бедной тромбоцитами в концентрациях равных ЭК50, полученных при изучении их на моделях АДФиндуцированной агрегации тромбоцитов (см.гл.3). Затем в чистую пробирку добавляли 8 мл дистиллированной воды, 0,2 мл 1% раствора уксусной кислоты, 0,5 мл бедной тромбоцитами плазмы и 0,5% суспензии каолина. После этого полученную смесь перемешивали и инкубировали при t-37 в течение 30 минут.

Затем центрифугировали 6 минут при 1500 об/мин и после этого отбирали надосадочную жидкость. К оставшемуся осадку добавляли 0,5 мл рабочего [Введите текст] буферного раствора, полученного разведением дистиллированной водой концентрированного имидазолового буфера, перемешивали полученную смесь, затем вносили в нее 0,025 М раствор кальция хлорида. Через 30-60 с после образования сгустка включали секундомер и отмечали время полного лизиса сгустка.

Острая токсичность и расчт условного терапевтического индекса.

Острую токсичность определяли на белых неинбредных мышах-самцах массой 20-25 г. при внутрибрюшинном введении. За животными наблюдали в течение двух недель после введения вещества. Для расчета величины токсикологического показателя использовали метод ЛичфилдаLD Вилкоксона в соответствии с требованиями и инструкциями Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития [Миронов А.Н., 2012].

Условный терапевтический индекс соединений определяли как отношение показателя LD50 к EC50. Расчет EC50 проводили методом регрессионного анализа.

многотестовое наблюдение по С. Ирвину [Irwin S., 1964]. Соединение Sbt- вводили внутрибрюшинно однократно лабораторным мышам в возрастающих дозах: 10 мг/кг, 50 мг/кг, 100 мг/кг, 125 мг/кг и 150 мг/кг. В качестве растворителя использовали дистиллированную воду. Контрольная группа животных получала растворитель в аналогичном объеме. Перед введением растворов веществ исследовались исходные показатели тестов. Всего было экспериментальных групп по 5 особей в каждой.

За животными наблюдали в течение трех часов после введения соответствующей дозы соединения во временных интервалах – 30, 60, 120 и минут с момента измерения исходных данных. При этом оценивались следующие параметры:

[Введите текст] Интегральные показатели: общее состояние, характер шерстного покрова, состояние слизистых оболочек (окраска, наличие и характер выделений, отечность), оформленность и цвет фекалий.

Изменение эмоционального состояния (вокализации, агрессия и пугливость), нарушения со стороны ЦНС (синдром Штраубера, тремор, парезы, судороги), рефлексы (слуховой, роговичный, ипсилатеральный сгибательный).

двигательная (Ротарод-тест) и мышечная (удержание на проволоке, сетке) координации, поведенческая реакция (реактивность), наличие синдрома «горбатости».

Функциональное состояние вегетативной нервной системы: тест «открытое поле», частота дыхания, цвет кожи, ректальная температура, наличие или отсутствие экзофтальма, птоза.

Реактивность мышей оценивалась по характеру реакции на изменение окружающей обстановки в виде перемещения на открытый стол.

Настороженность определялась ориентировочными рефлексами при использовании стандартного звукового раздражителя (громкий хлопок).

Пугливость животных оценивалась при прикосновении корнцангом.

Тремор, судороги, характер походки, изменения положения тела и конечностей оценивались при визуальном наблюдении.

Для исследования изменения координации двигательной активности проводили «Ротарод тест», при котором регистрировали продолжительность удержания животного на металлической перекладине диаметром 3 см, вращающейся со скоростью 10 оборотов в минуту. Влияние вещества на мышечную координацию оценивали в «тесте удержания на проволоке и сетке».

При этом отмечали количество лапок цепляемых мышью за проволоку и сетку, переводя затем в баллы (1 лапка – 1 балл).

Роговичный и слуховой рефлексы оценивались по реакции отдергивания головы при раздражении роговицы и слухового прохода соответственно.

Ипсилатеральный сгибательный рефлекс измерялся путм сдавливания лапы [Введите текст] зажимом с постоянным уровнем компрессии с оценкой времени возникновения и силы реакции.

Возбудимость мышей определялась в тесте «открытое поле», позволяющем оценивать также ориентировочно-исследовательское поведение и уровень эмоционального реагирования животных (Воронина Т.А., 2005).

Установка «открытое поле» представляла собой квадратную площадку размером 80х80 см с имеющимися 16 отверстиями в полу и разделенной на равных квадратов с выделением центральной зоны поля, с освещенностью площадки 90 Лк. Животное помещалось в центральный квадрат площадки хвостом к экспериментатору. Наблюдение за животными проводили в течение минут и регистрировали следующие показатели: число пересеченных квадратов (горизонтальная двигательная активность), число вставаний на задние лапы (вертикальная двигательная активность) и число заглядываний в отверстия (ориентировочно-исследовательская активность), число выходов в центральную зону, количество фекальных болюсов (эмоциональный фактор) [Буреш Я., 1991].

Регистрация болевой реакции осуществлялась при наложении зажима на основание хвоста. Общий тонус скелетных мышц оценивался по отдергиванию передней лапки при захватывании е.

Термометрия проводилась с помощью электронного термометра («OMRON», Германия) при введении в прямую кишку на глубину 15 мм.

Частота дыхания определялась при подсчте числа дыхательных движений у бодрствующих животных в течение 1 минуты.

О действии соединения, изучаемого в разных дозах, на состояние животных судили по изменению регистрируемых показателей по сравнению с контрольными значениями, а так же проводили сравнение результатов опытных групп между собой.

Статистическую обработку данных проводили с помощью встроенных функций программы Excel из пакета Office XP (Microsoft, США) (среднее арифметическое значение, стандартная ошибка средней арифметической), [Введите текст] программ «Statistica 6.0» (StatSoft, США) и «Graph.Pad.Prism.5.0» (США). Для статистической обработки данных скрининга использовали непараметрический метод сравнения независимых групп с помощью t-критерия Манна-Уитни («Statistica 6.0»). Обсчет результатов испытаний по влиянию соединений на выживаемость мышей при моделировании генерализованного тромбоза проводился с помощью точного критерия Фишера в программе «Statistica 6.0».

Статистическую обработку данных, полученных при гистологических исследованиях, проводили с использованием программы «Видео Тест Морфо-4.

[Введите текст]

ГЛАВА 3. ПОИСК ВЕЩЕСТВ С АНТИАГРЕГАНТНОЙ АКТИВНОСТЬЮ

В РЯДУ НОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ИНДОЛА

Основываясь на вышесказанном, была проведена работа по поиску и индуцированную агрегацию тромбоцитов in vitro в ряду соединений класса индола. В исследованиях выполнен анализ закономерностей между структурой и активностью с выявлением основных заместителей, отвечающих за данный вид активности.

Хорошо известно, что в организме на тромбоциты может оказывать влияние не только АДФ, а самые различные проагрегантные факторы, которыми например, являются - коллаген сосудистой стенки, фактор дислипопротеидемия [Yuhki K., 2010]. Поэтому с целью выделения из наиболее активных веществ соединения-лидера была воспроизведена модель внутрисосудистой агрегации тромбоцитов, которая дает возможность более полно учесть суммарное влияние патологических факторов на процесс агрегации тромбоцитов и также позволяет оценить антиагрегационный эффект изуенных веществ по сравнению с исследованиями in vitro.

[Введите текст] Изучение острой токсичности наиболее активных соединений и расчет условного терапевтического индекса также позволил выявить наиболее активное соединение-лидер.

3.1. Поиск веществ, проявляющих способность ингибировать процессы агрегации тромбоцитов Проведенные исследования, позволили установить, различное ингибирующее влияние на функциональную активность тромбоцитов у изученных соединений в концентрации 1 х 10-4 М. В таблице 3.1 приведены результаты блокирующего влияния на агрегацию тромбоцитов исследованных соединений. Антиагрегантный эффект препарата сравнения ацетилсалициловой кислоты составил 32,75%. Из 29 изученных веществ наиболее активными оказались соединения под шифрами: Sbt-815, Sbt-828, Sbt-820, Sbt-814, Sbt-, Sbt-79, Sbt-130. Так вещества Sbt-815 и Sbt-828 достоверно блокировали агрегацию тромбоцитов кролика на 92,14 и 80,24%, превосходя препарат сравнения в 2,8 и 2,45 раза соответственно. Остальные из вышеперечисленных соединений также достоверно ингибировали функциональную активность тромбоцитов, превосходя ацетилсалициловую кислоту. Антиагрегантная активность новых производных индола под шифрами Sbt – 26, Sbt – 46, Sbt – 708, SS-33 также незначительно, однако, достоверно превосходила препарат сравнения. Соединения под шифром Sbt – 8, Sbt – 140, Sbt – 713, Sbt – 109, Sbt – 178, SS– 31, SS – 41, SS – 43, SS – 46, SS – 56 по проявленной активности были сравнимы с ацетилсалициловой кислотой. А вещества под шифрами Sbt – 25, SS– 32, SS– 36, уступали по антиагрегантной активности препарату сравнения в 3,5; 2,8 и 3,2 раза соответственно (табл.3.1.).

В результате проведенного поиска новых веществ со способностью ингибировать агрегацию тромбоцитов из 29 соединений, было отобрано, для дальнейшего изучения 7 веществ под шифрами: Sbt-815, Sbt-828, Sbt-820, SbtSbt-143, Sbt-79, Sbt-130, проявивших наиболее высокую активность.

[Введите текст] Влияние производных индола на АДФ-индуцированную (5 мкМ) агрегацию тромбоцитов кролика in vitro (М±m) (n=6).

Ацетилсалициловая 30.

Примечание: * -(р0,05) изменения статистически значимы по отношению к контролю, критерий Манна-Уитни