«МЕТОД КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ И ФАРМАКОКИНЕТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА НОВОГО ПРОИЗВОДНОГО АДЕНИНА, ОБЛАДАЮЩЕГО ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТЬЮ ...»

На стадии биотрансформации с лекарственными средствами происходят различные химические превращения под действием соответствующих ферментов.

Как правило, это сложные многостадийные процессы с последовательным задействованием различных ферментов биотрансформации. Все это направлено на изменение фармакологической активности и скорейшее выведение из организма (то есть снижение липофильности и увеличение гидрофильности) [88, 89, 116, 188]. Изменение активности лекарственных средств протекает в трех основных направлениях:

o Лекарственное средство теряет активность.

o Образуется метаболит, сохраняющий активность исходного вещества или приобретающий другой вид фармакологической активности.

o Неактивное лекарственное средство приобретает в результате превращений в организме активность (пролекарства).

Учитывая возможность образования фармакологически активных метаболитов, необходимо оценивать возможные пути метаболизма и изучать фармакокинетику не только исходного вещества, но и активных метаболитов [41, 138, 163, 189, 201].

Основной орган, отвечающий за процессы биотрансформации, это печень.

Выделяют две группы лекарственных средств, метаболизирующихся в печени – вещества с высоким печеночным клиренсом и с низким. Градация веществ зависит от активности ферментных систем и от скорости печеночного кровотока в зависимости от преобладания одного из этих факторов препарат и относят к одной из этих групп. Для веществ с высоким печеночным клиренсом характерен ярко выраженный эффект «первого прохождения» через печень. Помимо печени в процессах биотрансформации играют довольно значимую роль ферментные системы, локализованные в кишечнике, легких и почках [39, 112, 144, 147, 168, 154].

Экскреция – это завершающая часть многоэтапного процесса удаления ксенобиотиков из организма. Лекарственные вещества элиминируются из организма через все органы и ткани, но основная роль принадлежит печени и почкам. Через почки наиболее просто элиминируются гидрофильные лекарственные средства или метаболиты. В экскреции через почки липофильных веществ активную роль играют различные транспортные системы. В печени лекарственные вещества экскретируются с желчью при активном участии различных транспортных систем, в зависимости от их липофильности и молекулярной массы. При таком пути выведения может иметь место гепатодуоденальная циркуляция препарата, когда экскретированное лекарственное средство повторно всасывается в кишечнике, что удлиняет время нахождения его в организме и, соответственно, длительность эффекта [86, 98, 123, 165, 169, 170, 192, 197, 199].

1.2. Значение биофармацевтических исследований при создании новых Клиническую эффективность фармакотерапии распространенных заболеваний человека можно повысить за счет создания принципиально новых лекарственных форм даже хорошо известных, всесторонне изученных и апробированных лекарственных средств. Активная работа в данном направлении диктуется потребностью современной медицины в эффективных и безопасных препаратах, сочетающих специфичность действия при определенных заболеваниях с широким терапевтическим спектром, позволяющими одним и тем же лекарственным средством осуществлять фармакотерапию различных патологических состояний. Помимо этого к важнейшим характеристикам пролонгированность действия, возможность индивидуального подхода к дозированию [16, 57].

фармацевтической науки, предметом исследования которой являются взаимодействия лекарственных веществ в лекарственных формах, обусловленные их физико-химическими свойствами; взаимосвязи самих лекарственных форм и терапевтического действия. В связи с тем, что фармакотерапевтическая эффективность препаратов определяется процессами их абсорбции (всасывания), распределения и элиминации (выведения) из макроорганизма, биофармация уделяет особое внимание изучению этих процессов, как и влиянию на них физико-химических свойств лекарственных форм [93, 96].

лекарственных веществ и сведение к минимуму возможных нежелательных побочных реакций [80]. Соответственно, в фармацевтический комплекс знаний, где ранее единственными критериями качества лекарств служили их физикохимические константы, вводятся новые положения, имеющие биологическое, медицинское обоснование. Согласно современным биофармацевтическим представлениям, процессы получения (выделения) лекарственных веществ, способы их очистки, сушки, измельчения, получение лекарственных форм, методы введения в организм и т. д. могут существенным образом повлиять на терапевтический эффект. Строгое и подробное изучение всех аспектов получения и назначения лекарственных средств и составляет основное содержание биофармацевтического исследования. Исходя из вышесказанного, биофармацию фармацевтических факторов на терапевтическую эффективность лекарственных препаратов.

терапевтической эффективности лекарственных средств от следующих групп фармацевтических факторов.

1. Химические свойства лекарственных веществ.

2. Физическое состояние лекарственных веществ.

3. Природа и количество вспомогательных веществ.

4. Вид лекарственной формы и путь введения препарата в организм.

5. Технологические операции, проводимые при получении лекарственных средств.

Первая группа факторов учитывается в случаях внесения некоторых незначительных корректировок в основную химическую структуру препарата, при отсутствии значительных изменений последней, что может изменить фармакотерапевтическое действие препарата. Соответственно, следует с особым вниманием относится к возможным, даже незначительным, изменениям в химической структуре молекулы лекарственного вещества, что иногда выглядит перспективно по технологическими или экономическими показателям [81].

Факторы второй группы - физическое состояние лекарственных веществ.

Наиболее существенными по влиянию из них являются степень измельчения и полиморфизм.

Степень измельченности частиц лекарственного вещества имеет не только технологическое значение. От размера частиц во многом зависят скорость и полнота всасывания лекарственного вещества при любых способах введения, исключая внутривенный, а также его концентрация в крови.

Полиморфизм – способность одного и того же вещества давать разные по форме кристаллы. Полиморфные модификации образуют многие химические, в том числе и лекарственные вещества. При этом в случае образования полиморфных модификаций одно и то же в химическом отношении вещество обладает различными физическими свойствами. Многие лекарственные вещества имеют три - пять и более полиморфных модификаций, которые характеризуются отличающимися значениями константы стабильности, температуры фазового перехода, растворимости и прочее, что в конечном итоге определяет как сохранность самого препарата, так и его фармакологическую активность. При этом особое значение имеет факт различной растворимости, так как абсорбция лекарственных веществ сильно зависит от данного параметра [11, 12, 45].

Полиморфные превращения лекарственных веществ возможны как при их получении (выделении), очистке и сушке, так и при изготовлении лекарственных форм. Также это может происходить в процессе хранения и в таком случае полиморфные превращения зависят от условий и сроков хранения, от вида применяемых при изготовлении лекарственных форм вспомогательных веществ.

Явления полиморфизма может быть использовано и с пользой, что невозможно без знания полиморфных превращений различныхфармакологически активных соединений [13].

Огромную роль в технологии лекарственных форм играет правильный выбор вспомогательных веществ. Ни один фармацевтический фактор не оказывает столь значительного и сложного влияния на действие препарата.

Вспомогательные вещества – это большая группа веществ природного и синтетического происхождения, помогающих получить определенные лекарственные формы с необходимыми физико-химическими и терапевтическими свойствами [48, 108].

Вспомогательные вещества являясь основой действующих веществ, в свою очередь обладают определенными физико-химическими свойствами, которые в зависимости от природы лекарственного вещества и технологических процессов получения лекарственной формы способны вступать в многообразные сложные взаимодействия, как с препаратами, так и с факторами внешней среды.

Вспомогательные вещества не являются полостью индифферентными и практически во всех случаях их применения, так или иначе, оказывают воздействие на систему фармакологическое средство – макроорганизм. В зависимости от фармакотерапевтического случая и состава лекарственного средства они даже могут играть роль действующего веществ и, наоборот [94, 103, 105].

При использовании вспомогательных веществ требуется основываться на знании их возможного влияния не только на физико-химические свойства лекарственных форм, но и на терапевтическую эффективность лекарственных средств [30, 95].

Еще одной из важнейших задач биофармации является теоретическое обоснование лекарственной формы, выяснение ее роли и места в фармакотерапии.

Максимальная эффективность любого препарата достигается только назначением его в рациональной, научно обоснованной лекарственной форме. Ее выбор определяет путь введения лекарственного средства в организм. От этого будет зависеть, промежуточные этапы препарата до того как попадет в кровь и его эффективность [31, 37, 109].

Процессы всасывания и выведения препаратов из организма в весьма значительной степени зависят от вида используемой лекарственной формы. На основании результатов современных биофармацевтических исследований доказано, что лекарственная форма оказывает ощутимое, измеримое количественно влияние на вышеуказанные процессы [22, 57].

Пятая группа фармацевтических факторов включает в себя разнообразные стадии технологических процессов получения лекарственных веществ (очистка, сушка, измельчение, просеивание, смешение, растворение и т. д.), а также применение каких-либо специальных технологических операций при изготовлении частных лекарственных форм. Результаты биофармацевтических исследований подводят строгий научный базис под объяснение влияния технологических процессов, способов получения лекарственных средств на развитие фармакотерапевтического эффекта.

В настоящее время доказано, что способ получения лекарственных форм во многом определяет стабильность препарата, скорость его высвобождения из лекарственной формы, интенсивность всасывания и его терапевтическую эффективность [31].

рациональных, научно обоснованных методов получения лекарственных средств с учетом положений биофармации о возможном влиянии самих технологических процессов на активность препаратов [22, 23].

проведение исследований биоэквивалентности генерических препаратов.

Изучение которых проводится в сравнении с оригинальным лекарственным средством. Лекарственные средства считаются биоэквивалентными, если являются фармацевтическими эквивалентами и обладают одинаковыми значениями биодоступности при введении в одной дозировке [7, 9, 34, 68, 97].

Объектами исследований биоэквивалентности являются воспроизведенные лекарственные средства, предназначенные для приема внутрь, накожной аппликации, ректального введения при условии, что их действие опосредовано появлением действующего вещества в системном кровотоке. Оценка пролонгированного действия; форм, обеспечивающих немедленное высвобождение лекарственного средства при приеме внутрь (таблетки, капсулы, суспензии и др., за исключением растворов); трансдермальных терапевтических систем; ректальных и вагинальных суппозиториев, а также комбинированных лекарственных препаратов основным компонентам). Исследования биоэквивалентности не проводятся для лекарственных средств, предназначенных для введения путем ингаляции [20, 32, 65, 70, 113, 125, 126].

Исследования биоэквивалентности позволяют сделать обоснованные заключения о качестве сравниваемых препаратов по значительно меньшему объему первичной информации и в более сжатые сроки, чем при проведении полномасштабных клинических испытаний. Соответственно, значительно ниже и стоимость подобных исследований [63, 87, 106, 129, 161, 191].

исключением случаев, когда возможно развитие тяжелых нежелательных побочных эффектов при однократном приеме) проводится на здоровых добровольцах [114, 142, 145].

1.3. Аналитические методы количественного определения, применяемые при проведении фармакокинетических и биофармацевтических исследований – разработка методов идентификации и количественного определения лекарственных веществ и их метаболитов в различном биологическом материале [42, 174].

исследований:

1. Изучаемые вещества обладают сложной химической структурой с рядом возможных метаболитов и аналогов, близких по строению, что подразумевает высокие требования к селективности.

2. Концентрации аналитов невысоки, чаще всего требуется определение микро- и нанограммовых количеств.

3. Исследуемые лекарственные вещества и их метаболиты, как правило, необходимо определять в биологическом материале.

биологической матрицы в значительной степени зависит от биологического материала, подвергаемого исследованию.

Биологический материал – очень сложный объект для исследования.

Помимо аналита/аналитов содержит значительное количество прочих веществ, количество которых в значительной мере зависит от типа биологического материала, методов подготовки проб и количественного определения [75]. Еще одой характерной особенностью работы с биоматрицами является их высокая динамичность, зависящая от временных/календарных периодов, режима питания, нагрузок, патологических состояний и многого другого. Изучаемые лекарственные средства, попадая в организм, могут давать в результате реакций биотрансформации от нескольких до нескольких десятков метаболитов [76].

Таким образом, выделение нужного вещества из сложной смеси, его корректная идентификация и количественное определение является очень сложной аналитической задачей [156, 166, 180, 187].

нанограммовые количества) обуславливают необходимость высокой чувствительности аналитических методов, применяемых для проведения данных исследований [148, 194].

Наличие значительного количества примесей в объектах исследования и необходимость четко идентифицировать исследуемое лекарственное вещества обуславливает высокие требования к селективности методов количественного определения и возможность разделения исследуемых аналитов и эндогенного фона биологического материала [38, 133].

Существует большое число самых разнообразных методов определения микробиологические, спектрофотометрические, поляриметрические, иммунологические (радиоиммунные, иммуноэнзимные и др.), радиоизотопные, хроматографические методы [14, 141, 151].

иммунологические методы за счет простоты и скорости проведения анализа.

Данные методы основаны на взаимодействии специфических белковых антител с изучаемым соединением, выступающим в роли антигена. От концентрации аналита напрямую зависит количество образующегося в результате реакции комплекса антиген-антитело [27]. Для количественной оценки используют два основных способа: гетерогенные методы (с отделением комплекса) и гомогенные методы (без отделения комплекса). В том и другом случае определяется, сколько изучаемого вещества (антигена) оказалось связанным с антителом. Для этого пробу биологической жидкости с неизвестной концентрацией анализируемого вещества добавляют к сыворотке, в которой белок-антитело связан в комплекс с маркером (меченый аналог аналита). Аналит вытесняет из комплекса маркер в количествах, соответственных его концентрации в пробе. Определив сколько меченого аналога оказалось вытеснено, можно рассчитать искомый уровень вещества в пробе. Иммунологические методы различаются по видам метки в маркере: флуоресцентная метка, радиоактивная метка, свободно-радикальная метка, ферментная и т.п. [28, 130, 182, 193].

Явными преимуществами иммунологических методов является высокая чувствительность определения, хорошая селективность, простота проведения анализа, относительно малый объем образца крови для проведения анализа, экспрессность. К недостаткам этих методов можно отнести следующее:

относительно высокую стоимость определения, необходимость специфического оборудования. Кроме того, иммунологические методы малоприменимы именно при изучении фармакокинетических свойств новых биологически активных веществ, т.е. в области экспериментальной фармакокинетики. Для новых, ранее не изучавшихся соединений отсутствуют готовые наборы реактивов для проведения анализа. Поэтому иммунологические методы наиболее распространены в области исследований биоэквивалентности, где изучаются уже известные лекарственные вещества, для которых разработаны схемы проведения анализа и подобраны метки и специфические антитела [190].

Также вышеуказанным требованиям к проведению количественного определения лекарственных веществ в биологическом материале в полной мере соответствует метод высокоэффективной жидкостной хроматографии, что обуславливает его стремительное развитие в последние десятилетия. Метод основан на неравномерном распределении различных веществ в слое сорбента, в зависимости от их физико-химических свойств [21, 33, 90, 104].

Хроматография – это комплексная научно-техническая дисциплина, включающая в себя:

взаимодействиям сорбат-сорбент;

• Методологические и прикладные исследования, направленные на создание общих подходов и конкретных режимов разделения и хроматографии – приборов, сорбентов.

продолжением и развитием классической колоночной хроматографии, в котором могут использоваться самые различные методы сорбции [4]. По сути дела, высокоэффективная жидкостная хроматография является современной формой реализации классической жидкостной колоночной хроматографии, которой свойственны:

продолжительность разделения от нескольких часов и суток до минут;

• Минимальная степень размывания хроматографических зон, что дало различающиеся по константам сорбции;

• Высокая степень механизации и автоматизации разделения и обработки информации, благодаря чему колоночная жидкостная Именно эти ключевые особенности превратили ВЭЖХ в мощнейший из современных методов анализа сложных смесей [91]. Стремительное развитие метода и все более широкое производство оборудования и комплектующих, обуславливает рост числа лабораторий, делая метод достаточно рутинным и доступным в воспроизводстве [49].

Высокоэффективная жидкостная хроматография является универсальным и эффективным аналитическим методом, в связи с чем получила достаточно широкое распространение в самых различных отраслях науки и промышленного производства [2, 18, 66, 71, 99, 111] В соответствии с преобладающим механизмом разделения веществ на аналитической колонке проводят разделение на основные типы, что является достаточно условным, так как обычно мы имеем дело со смешанным механизмом высокоэффективной жидкостной хроматографии: нормально-фазовая, обращеннофазовая, ионообменная хроматография, хроматография на динамически модифицированных сорбентах, ион-парная хроматография, эксклюзионная хроматография [6, 53, 54, 72, 136].

является проведение его валидации. Валидация аналитической методики является процедурой, проводимой для подтверждения ее применимости для проведения данного анализа. Каждая аналитическая методика содержит ряд декларируемых показателей, которые называют валидационными характеристиками. Их типичный набор: специфичность, точность, прецизионность, повторяемость, воспроизводимость, предел количественного определения (чувствительность) и предел обнаружения [3, 15, 64, 69, 121, 175].

идентифицировать и оценить анализируемое вещество в присутствии прочих количественном определении [134].

Точность аналитической методики это степень близости между значением, которое принято либо как традиционно правильное, либо как абсолютное стандартное, и найденным в ходе измерений значением, выраженная в процентах.

Данный параметр оценивается минимум по четырем концентрационным точкам с 5 параллельными образцами для каждой. Измеряемые значения не должны отклоняться от номинала более чем на 15% (20% для предела количественного определения) [134].

Прецизионность аналитической методики выражает степень близости (степень разброса) между сериями измерений, полученных на многих пробах одного и того же гомогенного образца в указанных условиях. Прецизионность исследуют, используя гомогенные, подлинные образцы. Оценка проводится для тех же количеств образцов, что и в случае с оценкой точности. Данный параметр выражается в виде коэффициента вариации, который не должен превышать 15% (20% для предела количественного определения) [134].

Повторяемость является выражением точности измерения в одних и тех же условиях в течение определенного, небольшого промежутка времени (внутридневные колебания). Рассчитывается параллельно с точностью и прецизионностью по аналогичному набору стандартных образцов. Данный параметр не должен выходить за пределы 15% [69].

Воспроизводимость это степень сходимости результатов, полученных анализом одних и тех же образцов при различных нормальных условиях. Разные лаборатории, операторы оборудования, инструменты, партии реактивов, температура окружающей среды, различное время проведения анализов и т.п. В условиях одной лаборатории, как правило, оценивается в течении трех дней (междневные колебания). Данный параметр не должен выходить за пределы 15% [69].

Предел обнаружения – минимальная концентрация аналита в образце, которая может быть обнаружена, но не определена количественно в условиях анализа. Этот предел оценивается анализом образцов с известными концентрациями аналита и установлением минимального уровня исследуемого вещества, при котором оно может быть достоверно обнаружено [134].

Предел количественного определения (чувствительность) – наименьшая концентрация анализируемого вещества в образце, которую можно количественно определить с необходимой точностью и прецизионностью. Значение данного параметра устанавливается анализом серии образцов, начиная от предела обнаружения, с дальнейшим расчетом прочих валидационных характеристик [134].

Проведение валидации является завершающей стадией разработки любого аналитического метода и после подтверждения, что валидационные характеристики находятся в пределах нормы, он может быть использован для дальнейшей исследовательской работы [25, 67, 77, 117, 143, 176, 184].

1.4. Противовирусные средства – перспективные направления поиска Рост числа заболеваний вирусной природы, а также высокая изменчивость вирусов под влиянием факторов среды, обуславливающая вероятность появления различных осложнений и развития резистентности, ставят задачу поиска и внедрения в практику новых эффективных противовирусных средств. Это одна из актуальнейших проблем современной медицины. Противовирусный препарат должен обладать высокой избирательностью действия, подавляя репликацию вирусов, но не оказывая негативного побочного действия на организм человека [47, 152].

Для решения этой задачи проводится как направленный синтез аналогов уже существующих биологически активных веществ с противовирусным действием, так и групповой синтез потенциально активных соединений с проведением последующих скриннинговых исследований. Большое значение при работе по данной проблематике имеет изучение уже имеющихся данных о зависимости активности и избирательности действия от структуры соединения, а так же сведения о возможных негативных побочных эффектах и путях их нейтрализации [24, 115].

В свете необходимости избирательного действия и сведения к минимуму нежелательных побочных реакций противовирусных средств значительное развитие получила группа нуклеотид/нуклеозидных аналогов. Действие этой группы препаратов опосредовано через угнетение специфических вирусных ферментов, в меньшей степени затрагивая функционирование аналогичных энзимов клеток макроорганизма. В результате наблюдается подавление репликации вируса, без значительного воздействия на человека.

Учитывая накопленную информацию, на сегодняшний день весьма перспективно выглядит поиск новых противовирусных средств ненуклеозидной природы, которые в отличи от своих нуклеозидных аналогов не требуют метаболической активации и способны к прямому взаимодействию со специфическими вирусными ферментами [43]. Из ненуклеозидных производных аденина высокую противовирусную активность в сочетании с довольно высоким спектром действия продемонстрировали 9-производные аденина. На основе анализа полученных данных, а также учитывая уже имеющуюся информацию о противовирусной активности в том числе и нуклеозидных/нуклеотидных аналогов аденина, например аденин-арабинозид-5-монофосфат, использовавшийся в 90-х гг ХХ века [155] или более современный препарат адефовир дипивоксил [135], были проведены скрининговые исследования ряда серий 9-производных аденина.

Результаты скриннинговых исследований показали, что 9-производные аденина содержащие ароматическую группу [58] представляют большой интерес в качестве потенциальных высокоэффективных противовирусных соединений [167].

Очень высокая противовирусную активность in vitro была выявлена для раз более активен, чем ганцикловир. Однако, соединение обладало относительно высокой цитотоксичностью. Введение различных заместителей (H, алкил, алкоксил, Ph, CN, NO2, CF3, Ac, галоген) оказывало более или менее выраженное влияние на противовирусную активность. Так, например, введение метильной группы в мета-положение мало влияло на ингибиторные свойства, тогда как ортозамещение заметно их ухудшало. В случае же пара-замещения у 9-[2-(4метилфенокси)этил]аденина антицитомегаловирусная активность возросла на порядок и селективность противовирусного действия достигла 1000. При увеличении размеров алкильного заместителя вплоть до изопропильного наблюдался рост антицитомегаловирусной активности. Дальнейшее увеличение размеров заместителя вело к ухудшению противовирусных свойств.

Высокоактивными оказались также соединения, содержащие в пара-положении атомы хлора, брома и NO2-группу [62].

Рисунок 1. Общая структурная формула 9-(2-феноксиэтил) производных аденина.

На основании проведенных исследований противовирусной активности и токсичности вышеуказанных соединений было принято решение о дальнейшем 9-[2-(4-изопропилфенокси)-этил]аденина, продемонстрировало высокие показатели противовирусной активности, но и обладает низкой токсичностью, подтвержденной при различных путях введения [59]. Таким образом, именно данное вещество было признано целесообразным направить на дальнейшее изучение. В результате соединение VMA-99-82 перешло на стадию доклинических испытаний в рамках государственного контракта № 11411.1008700.13.077 с Минпромторгом России.

Глава 2. Разработка и валидация метода количественного определения Поиск и внедрение в практику новых биологически активных соединений является одной из актуальных проблем современной медицины. Одним из важнейших этапов при работе по данной проблематике является проведение фармакокинетических исследований. Их проведение позволяет определить эффективные концентрации препарата в крови, обуславливающие терапевтический эффект, провести оценку эффективности различных путей введения и лекарственных форм, изучить основные фармакокинетические параметры [157, 172].

Для проведения фармакокинетических исследований необходим адекватный метод количественного определения исследуемых соединений в биологическом материале. Он должен быть высокочувствительным, селективным, надежным, воспроизводимым и универсальным. Данным требованиям отвечает высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), являющаяся одним из основных аналитических методов при проведении фармакокинетических исследований [133, 174].

Обязательным условием разработки любого аналитического метода является проведение его адекватной валидации. Корректная оценка определенных аналитических характеристик является подтверждением работоспособности и воспроизводимости метода и соответственно правильности полученных его посредством результатов. Помимо этого, проведение валидации в ряде случаев может способствовать устранению недостатков и недоработок валидизируемого метода количественного определения [69, 175].

синтезированной в лаборатории синтеза противовирусных средств НИИ фармакологии Волгоградского государственного медицинского университета*.

Рисунок 2. Структурная формула соединения VMA-99-82.

жидкостном хроматографе Shimadzu LC-10 (Япония) следующей комплектации:

• Контроллер SCL-10Avp • Диодноматричный ультрафиолетовый детектор SPD-M10Avp • Термостат CTO-10ASvp • 2 насоса высокого давления LC-10ADvp Выражаем благодарность профессору Озерову А.А. и сотрудникам лаборатории синтеза противовирусных средств НИИ фармакологии Волгоградского государственного медицинского университета • Аналитическая колонка SUPELCOSIL LC-18 (октадецильная привитая фаза) 10 см*4,6 мм, размер частиц сорбента - 5 мкм (США) В качестве мобильной фазы использовали смесь ацетонитрила (Россия) и буферной системы, состоящей из однозамещенного фосфата калия 50 mМоль, pH 5,65 (Россия) в соотношении 40%:60% v/v.

В работе использовались аналитические весы Adventurer (США).

Смешивание растворов проводили на магнитной мешалке LT 30 (Германия).

Контроль рН осуществляли на рН-метре Hanna (Германия).

Детектирование соединения VMA-99-82 проводили при длине волны 205 нм.

Скорость подачи мобильной фазы в хроматографическую систему составила мл/мин. Температура проведения разделения на аналитической колонке – 40оС.

Для извлечения соединения VMA-99-82 из биологического материала применяли смесь ацетонитрила (Россия) и этилового спирта (Россия) в соотношении 50%:50% v/v. Для проведения экстракции и преципитации белков использовали горизонтальный шейкер и ультразвуковую ванну «Сапфир»

(Россия). Супернатант получали на центрифуге СМ-50 (Россия).

гомогенизаторе Silent Crusher (Германия). Гомогенат откручивали на центрифуге Eppendorf (Германия).

посредством ручного инжектора Rheodyne (США) с объемом петли 20 мкл при помощи хроматографического шприца Hamilton на 100 мкл.

Идентификацию исследуемого вещества и расчет концентрации проводили по методу абсолютных стандартов. Зависимость площадей пиков от концентрации соединения VMA-99-82 анализировалась методом регрессионного анализа.

Валидация метода ВЭЖХ количественного определения соединения VMAосуществлялась в соответствии с ГОСТ 5725-1-2002 и Guidline on bioanalytical method validation EMEA 2012.

Для валидации проводились калибровки по стандартным растворам соединения VMA-99-82 и по биологическому материалу (плазма крови крыс) с построением калибровочных кривых.

Калибровку строили, готовя из матричного раствора концентрацией мкг/мл серию последовательных разведений до получения следующих концентраций – 0,5; 1; 5; 25 и 50 мкг/мл.

Матричный раствор соединения VMA-99-82 – навеску субстанции в 1мг растворяли в 1 мл смеси ацетонитрил : этанол 96% (50%:50% v/v).

Калибровка по биологическому материалу осуществлялась по пяти параллельным сериям в течение трех дней.

На основании полученных результатов измерений рассчитывались площадь хроматографического пика по следующей формуле:

l – длина основания пика Затем рассчитывались: среднее значение площади хроматографического пика для параллельных измерений, стандартное отклонение от среднего значения, средняя ошибка.

Определялись внутридневные процентные колебания (повторяемость метода) и междневные процентные колебания (воспроизводимость метода).

Повторяемость рассчитывали по формуле:

(Сд-Сн)/Сн*100%, где Сд – действительная концентрация соединения VMA-99-82, рассчитанная по калибровочному графику;

Сн – номинальная концентрация соединения VMA-99-82, добавленная к биологическому материалу.

Воспроизводимость бралась как среднее отклонение в процентах по всем трем дням измерений.

Также рассчитывали показатели прецизионности и точности.

Прецизионность рассчитывали по формуле:

Со/СрЗ*100%, где Со – стандартное отклонение серии параллельных измерений.

СрЗ – Среднее значение серии параллельных измерений.

Точность рассчитывалась по формуле:

Сд/Сн*100%, где Сд – действительная концентрация соединения VMA-99-82, рассчитанная по калибровочному графику;

Сн – номинальная концентрация соединения VMA-99-82, добавленная к биологическому материалу.

Статистическая обработка данных проводилась при помощи компьютерной программы Microsoft Excel.

2.2. Разработка хроматографических условий метода количественного Соединение VMA-99-82 хорошо растворимо в диметилсульфоксиде. Но данный растворитель в силу его физико-химических свойств невозможно ввести в хроматографическую систему.

В ходе предварительных экспериментов было установлено, что соединение VMA-99-82 малорастворимо в большинстве применяемых в хроматографии растворителей. Таким образом, первой аналитической проблемой при разработке метода количественного определения соединения VMA-99-82 стал подбор подходящего сольвента.

После ряда испытаний в качестве растворителя для субстанции соединения VMA-99-82 была выбрана смесь ацетонитрил : спирт этиловый (50%:50% v/v).

Данная смесь позволила получить истинный раствор изучаемого вещества необходимой концентрации и ее можно вводить в хроматографическую систему.

Еще одним преимуществом данной смеси в качестве сольвента явилось то, что в дальнейшем ей также проводилась экстракция соединения VMA-99-82 из биологического материала, так как это позволяло одновременно очищать пробу от примесей и проводить экстракцию аналита.

В ходе разработки метода ВЭЖХ подбор хроматографических условий количественного определения осуществлялся по следующим ключевым параметрам:

1. Параметры детекции.

Определение соединения VMA-99-82 проводилось с использованием ультрафиолетового детектора на основе диодной матрицы.

Для изучаемого вещества был определен оптимум условий детекции – на длине волны 205 нм (Рисунок 3).

2. Характеристики мобильной фазы При разработке метода количественного определения соединения VMA-99было изучено влияние следующих буферных систем со значением рН от 3 до с шагом в 0,5 единиц:

а) 0,05 М и 0,1 М растворы однозамещенного фосфата калия;

б) 0,05 М и 0,1 М растворы двузамещенного фосфата калия в) смесь 0,2 М растворов ацетата натрия и уксусной кислоты;

г) смесь 0,05 М растворов одно- и двузамещенного фосфата калия.

При использовании ацетатной буферной системы пик определяемого вещества был несимметричным, кроме того, наблюдалась нестабильность времени удерживания. Буферная система из двузамещенного фосфата калия в данных условиях продемонстрировала крайне длительные периоды стабилизации аналитической колонки при смене мобильной фазы, что значительно удлиняло время проведения исследования. Р-р однозамещенного фосфата калия и смесь одно- и двузамещенного фосфата калия давали сопоставимые результаты, обеспечивая необходимые селективность и чувствительность. В итоге была выбрана буферная система из 50 мМ р-ра однозамещенного фосфата калия как более стабильная при хранении и простая в изготовлении.

Рисунок 3. Спектр поглощения соединения VMA-99- Выбор был сделан в пользу именно 0,05 М фосфатного буфера, так как дальнейшее увеличение молярности до 0,1 М и 0,2 М не дало значимого улучшения, при этом сокращая срок нормального функционирования аналитической колонки.

Изучение влияние рН буферной системы, входящей в состав мобильной фазы, на время удерживания соединения VMA-99-82 дало следующие результаты.

Сдвиг рН в кислую сторону вызывал увеличение времени удерживания и некоторое искажение формы хроматографического пика. Начиная со значения 4,5, наблюдалось незначительное снижение времени удерживания и отсутствие деформации пика. В результате было выбрано значение рН=5,65, при котором достигалась достаточная селективность без значимых потерь в чувствительности.

В ходе исследования влияния доли органической фазы в составе элюента на хроматографические характеристики соединения VMA-99-82 были опробованы количества ацетонитрила в диапазоне от 30% до 60%:

Увеличение доли органической фазы свыше 50 % вызывало снижение времени удерживания до 5 минут и менее, что приводило к высокой вероятности интерференции эндогенными пиками биоматериала. Значения ниже 40% демонстрировали значительное снижение чувствительности и увеличение времени анализа. Окончательно, в качестве оптимального соотношения было выбрано значение 40%.

Таким образом, оптимальными хроматографическими условиями метода количественного определения соединения VMA-99-82 являются следующие:

аналитическая колонка SUPELCOSIL LC-18 (октадецильная привитая фаза) см*4,6 мм, размер частиц 5 мкм. Мобильная фаза, состоящая из 50 мМ р-ра однозамещенного фосфата калия (рН 5,65) и ацетонитрила в соотношении хроматографирования 40 оС. Длинна волны детекции 205 нм. При данных хроматографических условиях время удерживания составило около 7,0-7,5 мин.

С использованием данных условий получены хроматограммы стандартных растворов соединения VMA-99-82 (Рисунок 4).

2.3. Разработка метода количественного извлечения соединения VMAиз биологического материала Так как метод количественного определения соединения VMA-99- разрабатывался для проведения полного фармакокинетического исследования, то стояла задача определения изучаемого вещества в различных типах биологического материала – крови, экскретах, гомогенате органов и тканей.

Соответственно, необходимо было разработать простой и эффективный способ количественного извлечения аналита, обеспечивающий высокую степень экстракции и достаточный уровень чистоты проб.

биологического материала в качестве экстрагентов были опробованы:

• смесь ацетонитрил : спирт этиловый (50%:50% v/v) • концентрированная соляная кислота • 10% раствор трихлоруксусной кислоты К образцам добавляли экстрагент в соотношении 1:1 затем встряхивали в течение десяти минут в ультразвуковой ванне для преципитации белков и центрифугировали в течение 15 минут при 3000 об/мин, после чего надосадочную жидкость вводили в хроматографическую систему.

экстракционных агентов (Рисунок 5).

Рисунок 4. Хроматограмма стандартного раствора соединения VMA-99-82 (растворитель - смесь ацетонитрил :

этанол 96% в соотношении50%:50% v/v).

Рисунок 5. Степени экстракции соединения VMA-99-82 из биологического материала различными экстрагентами.

Обозначения: А – спирт этиловый, B – ацетонитрил, C – смесь спирт этиловый : ацетонитрил (50%:50% v/v), D – На основании проведенных экспериментов и данных, полученных ранее в ходе разработки метода количественного определения соединения VMA-99-82 в качестве экстрагента была выбрана смесь спирт этиловый : ацетонитрил (50%:50% v/v), обеспечивающая высокий уровень извлечения аналита из биоматериала, а также достаточный уровень очистки пробы. Степень экстракции соединения VMA-99-82 составила не менее 90%.

Проводилось извлечение соединения VMA-99-82 из плазмы, сыворотки и цельной крови и степень экстракции из плазмы и сыворотки составила в среднем около 20 %, в то время как для цельной крови данное значение составило в среднем 90% (Рисунок 6). Таким образом, при определении изучаемого вещества в крови необходимо проводить экстракцию из цельной крови.

Используя разработанный метод количественного извлечения соединения VMA-99- хроматографические условия, были получены хроматограммы изучаемого вещества в биологическом материале (Рисунок 7).

% экстракции Рисунок 6. Степени экстракции соединения VMA-99-82 из различного биологического материала.

Рисунок 7. Хроматограмма соединения VMA-99-82 в биологическом материале (цельная кровь).

2.4. Валидация метода количественного определения соединения VMA-99- Для количественного определения изучаемого соединения использовали метод абсолютной калибровки. Зависимость площадей пиков от концентрации VMA-99-82 анализировалась методом регрессионного анализа.

Была проведена калибровка по стандартным растворам соединения VMAизвестной концентрации. Для построения калибровки взяли пять точек – концентрации 0,5 мкг/мл, 1 мкг/мл, 5 мкг/мл, 25 мкг/мл и 50 мкг/мл. Для каждой точки были проведены пять параллельных измерений. На основании полученных результатов рассчитывались площадь хроматографического пика, среднее значение площади хроматографического пика для пяти параллельных измерений, стандартное отклонение от среднего значения, средняя ошибка измерения (Таблица 1).

По полученным данным построили калибровочную кривую. В результате было установлено, что она носит линейный характер, с коэффициентом аппроксимации (R2) равным 0,9996 (Рисунок 8).

После подтверждения линейной зависимости между концентрацией соединения VMA-99-82 и площадью под хроматографическим пиком и определения диапазона линейной зависимости была проведена калибровка по биологическому материалу (плазме крови) в течение трех дней. На основании полученных данных рассчитывались площадь хроматографического пика, среднее значение площади хроматографического пика для пяти параллельных измерений, стандартное отклонение от среднего значения, средняя ошибка измерения (Таблица 2, 4, 6).

По полученным данным построили калибровочные кривые. В результате было установлено, что они носят линейный характер, с коэффициентом аппроксимации (R2) равным 0,9983; 0,9992 и 0,9999 (Рисунок 9, 10, 11).

Используя построенный график, по уравнению регрессии были рассчитаны материале.

На основании полученных данных рассчитывались среднее значение концентраций для пяти параллельных измерений, стандартное отклонение от среднего значения, средняя ошибка измерения (Таблица 3, 5, 7).

После проведения измерений в течение трех дней, на основании полученных данных были определены внутридневные процентные колебания (повторяемость (воспроизводимость метода) (Таблица 8).

По полученным результатам измерений были рассчитаны точность и прецизионность. Данные представлены в таблице 9.

В результате проведенных исследований было установлено, что концентрация 0,5 мкг/мл выходит за пределы линейности. Таким образом, чувствительность метода количественного определения соединения VMA-99- составляет 1мкг/мл. Предел обнаружения – 200 нг/мл.

При повторном проведении анализа, после 72 часов хранения стандартных растворов соединения при комнатной температуре, средние абсолютные процентные колебания находились в тех же пределах, показывая стабильность исследуемого вещества. При изучении влияния процессов замораживания и таяния, было обнаружено, что средние абсолютные процентные колебания для VMA-99-82 находились в тех же пределах, что определяет стабильность вещества под влиянием данных факторов.

Таким образом, в результате проведенной валидации подтверждено соответствие аналитических характеристик метода ВЭЖХ количественного аналитические характеристики метода представлены в таблице 10.

Данные измерений калибровки по стандартным растворам соединения VMA-99- 0, 0, 0, 0, 0, Рисунок 8. Зависимость площади под хроматографическим пиком от концентрации соединения VMA-99-82.

Стандартный раствор.

Обозначения: по оси ординат – площадь под хроматографическим пиком, mAU*мин.; по оси абсцисс – концентрация соединения VMA-99-82, мкг/мл.

Данные измерений 1 дня калибровки по биологическому материалу (плазма крови) 0, 0, 0, 0, 0, Рисунок 9. Зависимость площади под хроматографическим пиком от концентрации соединения VMA-99-82.

Биологический материал (плазма крови).

Обозначения: по оси ординат – площадь под хроматографическим пиком, mAU*мин.; по оси абсцисс – концентрация соединения VMA-99-82, мкг/мл.

Расчетные данные первого дня калибровки по биологическому Концентрация Данные измерений 2 дня калибровки по биологическому материалу (плазма крови).

0, 0, 0, 0, 0, Рисунок 10. Зависимость площади под хроматографическим пиком от концентрации соединения VMA-99-82.

Биологический материал (плазма крови).

Обозначения: по оси ординат – площадь под хроматографическим пиком, mAU*мин.; по оси абсцисс – концентрация соединения VMA-99-82, мкг/мл.

Расчетные данные второго дня калибровки по биологическому материалу Концентрация Данные измерений 3 дня калибровки по биологическому материалу (плазма крови) 0, 0, 0, 0, 0, Рисунок 11. Зависимость площади под хроматографическим пиком от концентрации соединения VMA-99-82.

Биологический материал (плазма крови).

Обозначения: по оси ординат – площадь под хроматографическим пиком, mAU*мин.; по оси абсцисс – концентрация соединения VMA-99-82, мкг/мл.

Расчетные данные третьего дня калибровки по биологическому материалу Концентрация Показатели воспроизводимости и повторяемости метода количественного определения соединения VMA-99-82 в диапазоне линейной зависимости площади хроматографического пика от концентрации растворов (M±m) Концентрация, мкг/мл Валидационные характеристики метода ВЭЖХ количественного определения соединения VMA-99- Основные аналитические параметры метода ВЭЖХ количественного определения соединения VMA-99-82.

(воспроизводимость) В результате проведенных исследований разработаны следующие хроматографические условия метода количественного определения соединения привитая фаза) 15 см*4,6 мм, размер частиц 5 мкм. Мобильная фаза, состоящая из 50 мМ р-ра однозамещенного фосфата калия (рН 5,65) и ацетонитрила в соотношении 60%:40% v/v. Скорость потока элюента 1 мл/мин. Температура хроматографирования 40 оС. Длинна волны детекции 205 нм. Условия подобраны оптимально и обеспечивают достаточные чувствительность и селективность [85].

Детекция изучаемого соединения осуществляется ультрафиолетовым детектором на основе диодной матрицы. Чувствительность метода, обеспечиваемая ультрафиолетовым детектором, вполне отвечает поставленным задачам, что позволяет использовать этот наиболее распространенный и доступный вид детектора. Преимущество диодноматричных детекторов заключается в возможности сканирования широкого диапазона длин волн за один анализ, что обеспечивает значительное сокращение времени подбора оптимальной длины волны детекции. Еще одним плюсом детекторов на основе диодной матрицы является возможность идентификации веществ по их спектральным характеристикам.

Проведен подбор условий экстракции изучаемого соединения из различных видов биологического материала. Опробован ряд экстрагентов и, в итоге, была выбрана смесь спирт этиловый : ацетонитрил (50%:50% v/v), обеспечивающая одновременно высокий уровень извлечения аналита из биоматериала и достаточный уровень очистки пробы. Степень экстракции соединения VMA-99- составила не менее 90%. В ходе экспериментов по извлечению соединения VMAиз различного биологического материала было установлено, что при определении изучаемого вещества в крови необходимо проводить экстракцию из цельной крови. Извлечение аналита из гомогенатов органов и тканей, а также экскретов проводилось аналогичным образом и давало сопоставимые результаты по степени экстракции.

Таким образом, способ количественного извлечения соединения VMA-99- из биологического материала подобран оптимально и практически не влияет на среднюю ошибку измерения хроматографического метода.

После подбора хроматографических условий и способа извлечения из биологического материала проведена валидация разработанного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии количественного определения соединения VMA-99-82. На основании серии измерений были построены калибровочные кривые зависимости площади под хроматографическим пиком от концентрации изучаемого соединения, в результате установлено, что они носят линейный характер. Далее провели расчет валидационных характеристик метода.

Повторяемость (внутридневные колебания) в среднем 14%, воспроизводимость (междневные колебания) – 10%. Показатель точности – 97,8%. Прецизионность – 4,55. На основании измерения серии разведений были определены предел обнаружения (200 нг/мл) и предел количественного определения (1мкг/мл).

Аналитические характеристики метода не выходят за границы установленных нормативов, что подтверждает его воспроизводимость и эффективность.

Также была оценена стабильность. При повторном проведении анализа, после 72 часов хранения стандартных растворов соединения при комнатной температуре, а также после заморозки/таяния средние абсолютные процентные колебания находились в тех же пределах, что свидетельствует о стабильности вещества под влиянием данных факторов.

Таким образом, разработанный метод количественного определения является высокоселективным и высокочувствительным, что позволяет использовать его для проведения фармакокинетических и биофармацевтических исследований соединения VMA-99-82.

Глава 3. Фармакокинетические свойства нового производного аденина Важнейшим этапом в создании новых лекарственных средств являются доклинические испытания, включающие в себя также и изучение экспериментальной фармакокинетики. Данные исследования позволяют изучить процессы всасывания, распределения, метаболизма и выведения лекарственных веществ. Знание фармакокинетических свойств позволяет обосновать выбор путей и методов их введения, выявить ткани, в которые они проникают наиболее интенсивно и/или в которых удерживаются наиболее длительно, установить основные пути элиминации фармакологического средства [173].

Создание новых лекарственных препаратов, доклинические испытания, первая фаза клинических испытаний не возможны без серьёзных фармакокинетических исследований. Разработка новых и совершенствование апробированных лекарственных средств, требует всестороннего изучения фармакокинетики, так как без сведений о многообразном спектре поведения лекарственного вещества в организме невозможно успешное применение препарата в практической медицине [19].

Фармакокинетические данные необходимы для установления зависимости «концентрация – эффект», которая характеризуется меньшими видовыми различиями, чем «доза – эффект» и поэтому может быть использована для прогнозирования действия фармакологического средства у человека. Кроме того, по результатам экспериментального изучения фармакокинетики возможно предсказать концентрацию препарата в крови (плазме) или, по меньшей мере, скорость её снижения у человека и, таким образом, выбрать ориентировочную схему дозирования, которая может быть уточнена в ходе клинических испытаний [8].

фармакологического средства является оптимизация выбора его лекарственной формы.

Эксперименты выполнены на 100 белых беспородных крысах – самцах массой 180-220 г, которые содержались в условиях вивария на стандартной диете с соблюдением всех правил и Международных рекомендаций Европейской экспериментальных исследованиях. Животные были здоровыми, изменений поведения, аппетита, режима сна и бодрствования обнаружено не было. За двенадцать часов до проведения экспериментов животных лишали доступа к пище без ограничения потребления воды.

Внутривенное введение лекарственного вещества в изотоническом растворе, производилось с помощью шприца в хвостовую вену крыс. Пероральное введение осуществлялось с помощью зонда. Контрольной группе животных вводили изотонический раствор в аналогичном объёме.

Распределение соединения в организме крыс изучали в тканях с сильной васкуляризацией сердце, мозге, легких и селезенке; с умеренной васкуляризацией – мышце (musculus quadriceps femoris) и слабой васкуляризацией - сальнике, а также в органах, обеспечивающих элиминацию - печени и почках.

Содержание изучаемого соединения определяли также в моче и кале. Сбор проб мочи и кала осуществляли в метаболических камерах «Термопласт»

(Италия).

Кровь стабилизировали 5% раствором натрия цитрата. Зависимость концентрации соединения от времени изучалась в цельной крови. Из органов и кала готовили 20% гомогенаты в дистиллированной воде.

Соединение VMA-99-82 вводили крысам внутривенно в дозе 50 мг/кг. Забор проб крови и органов производился через 0,08; 0,25; 0,5; 1; 2; 4; 8; 12 часов после введения и через 5 минут в контрольной группе животных.

Для изучения абсолютной биодоступности субстанцию VMA-99-82 вводили крысами интрагастрально в дозе 50 мг/кг. Забор проб крови у животных производи через 0,5; 1; 2; 4; 8; 12 часов и через 5 минут в контрольной группе животных.

рассчитывали ряд параметров:

• Площадь под фармакокинетической кривой “концентрация – время” (AUC) является основным фармакокинетическим параметром и характеризует биологическую доступность лекарственного средства. Данный параметр рассчитывали модельно – независимым методом статистических моментов в программе Microsoft Excel.

освобождения от препарата единицы объёма биожидкости, как отношение дозы (D) к AUC:

фармакокинетической кривой:

где Cmax и Tmax – максимальная концентрация и время ее достижения, Cпосл и Tпосл – последнее значение концентрации и время её определения.

• Общий (кажущийся) объём распределения (Vd), под которым понимают такой объём, при распределении в котором, препарат имел бы ту же концентрацию, что и в плазме крови, как отношение клиренса (cl) к константе элиминации (Kel):

• Период полувыведения (T1/2), отражающий время, в течении которого концентрация ЛВ в крови снижается вдвое:

пребывания в организме молекулы препарата (MRT):

AUMC – площадь под кривой “произведение времени на концентрацию лекарственного вещества-время”.

использовалось вычисление тканевой доступности (ft), определяемой отношением значения AUC в ткани к соответствующей величине AUC в крови.

Абсолютная биодоступность рассчитывалась как отношение AUC при пероральном введении к AUC при внутривенном введении лекарственного вещества крысам. Экспериментальные данные обсчитывались с помощью tкритерия Стьюдента. Статистическая обработка данных проводилась при помощи компьютерной программы Microsoft Excel.

Расчет предполагаемых схем метаболизма соединения VMA-99-82 и физико-химических свойств возможных метаболитов проводился при помощи компьютерной программы PALLAS.

3.2. Фармакокинетика VMA-99-82 при внутривенном введении В результате проведенного исследования были получены усредненные фармакокинетические профили зависимости концентрации вещества в плазме крови крыс от времени (Рисунок 12). Как видно из представленных данных, максимальная концентрация соединения VMA-99-82 (5,71 мкг/мл) наблюдается на пятой минуте после введения. После этого концентрация снижается, причем снижение носит биэкспоненциальный характер, предполагая быструю первую фазу распределения, сменяющуюся более медленной фазой элиминации. Первая фаза элиминации заканчивается к 2 часам и начинается вторая «медленная» фаза до 12 часов исследования.

Основные фармакокинетические параметры, рассчитанные по зависимости концентрации соединения в плазме крыс от времени (Таблица 11) показывают высокие значения периода полувыведения (Т1/2 = 11,03 часа) и среднего времени удерживания в организме одной молекулы препарата (MRT = 9,55 часа). Площадь под фармакокинетической кривой составляет AUC = 74,96 мкг*час/мл.

Показатель системного клиренса не слишком высок (Сl = 0,67 л/час*кг). Величина общего объема распределения (Vd = 10,61 л/кг) в 15,8 раза превышает общий объем жидкости в организме крысы - 0,67 л/кг, что свидетельствует о выраженной способности препарата интенсивно проникать в органы и ткани животных.

Рисунок 12. Содержание соединения VMA-99-82 в крови крыс при внутривенном введении в дозе 50 мг/кг.

Обозначения: по оси абсцисс – время (часы), по оси ординат – концентрация (мкг/мл).

Фармакокинетические параметры соединения VMA-99-82 в крови крыс при внутривенном введении в дозе 50 мг/кг прослеживается значительная неоднородность. Соединение небольших количествах проникает через гематоэнцефалический барьер в головной мозг, достигая максимальной концентрации (6,52 мкг/г) на 15 минуте после введения и оставаясь выше порога обнаружения в течение 12 часов (Рисунок 13). Тканевая доступность составила 0,43 (Таблица 12).

В сердце максимум концентрации (25,07 мкг/г) достигается несколько позже (Рисунок 14),затем постепенно снижается и остается выше порога обнаружения в течение 12 часов. Тканевая доступность равна 1,16 (Таблица 12).

В мышечной и жировой ткани содержание VMA-99-82 также не велико.

Достигая максимума на 30 минуте, концентрация соединения остается выше порога обнаружения в течение 12 часов (Рисунок 17, 20). Тканевая доступность составила 0,51 и 0,5 соответственно (Таблица 12).

В почках наблюдается сходная картина распределения, содержание вещества не слишком высоко, максимум концентрации составляет 10,87 мкг/г на 30 минут после введения (Рисунок 18). Тканевая доступность составила 0, (Таблица 12).

Большую тропность VMA-99-82 проявляет к печени и селезенке.

Максимальная концентрация в печени (56,83 мкг/г) и селезенке (71,51 мкг/г) достигается к 30 минуте (Рисунок 15, 19). Фармакокинетический профиль соединения аналогичен таковым в других органах и тканях, а также плазме.

Тканевая доступность составила 1,54 и 3,63 (Таблица 12).

Наиболее велико содержание VMA-99-82 в легких, достигая на максимуме через 1 час после введения 24693,5 мкг/г. Тканевая доступность составляет 1111,18. (Таблица 12).

Фармакокинетические параметры распределения препарата VMA-99-82 в органах и тканях при внутривенном введении крысам в дозе 50 мг/кг Рисунок 13. Содержание соединения VMA-99-82 в мозге крыс при внутривенном введении в дозе 50 мг/кг.

Обозначения: по оси абсцисс – время (часы), по оси ординат – концентрация (мкг/мл).

Рисунок 14. Содержание соединения VMA-99-82 в сердце крыс при внутривенном введении в дозе 50 мг/кг.

Обозначения: по оси абсцисс – время (часы), по оси ординат – концентрация (мкг/мл).

Рисунок 15. Содержание соединения VMA-99-82 в селезенке крыс при внутривенном введении в дозе 50 мг/кг.

Обозначения: по оси абсцисс – время (часы), по оси ординат – концентрация (мкг/мл).

Рисунок 16. Содержание соединения VMA-99-82 в легких крыс при внутривенном введении в дозе 50 мг/кг.

Обозначения: по оси абсцисс – время (часы), по оси ординат – концентрация (мкг/мл).

Рисунок 17. Содержание соединения VMA-99-82 в мышце крыс при внутривенном введении в дозе 50 мг/кг.

Обозначения: по оси абсцисс – время (часы), по оси ординат – концентрация (мкг/мл).

Рисунок 18. Содержание соединения VMA-99-82 в почках крыс при внутривенном введении в дозе 50 мг/кг.

Обозначения: по оси абсцисс – время (часы), по оси ординат – концентрация (мкг/мл).

Рисунок 19. Содержание соединения VMA-99-82 в печени крыс при внутривенном введении в дозе 50 мг/кг.

Обозначения: по оси абсцисс – время (часы), по оси ординат – концентрация (мкг/мл).

Рисунок 20. Содержание соединения VMA-99-82 в сальнике крыс при внутривенном введении в дозе 50 мг/кг.

Обозначения: по оси абсцисс – время (часы), по оси ординат – концентрация (мкг/мл).

При изучении экскреции препарата было выявлено, что VMA-99- определяется в моче в течение не менее 72 часов исследования. При этом максимум выведения приходится на 2 сутки после введения (Рисунок 21). С мочой выделилось менее 1% неизмененной субстанции от общего количества введенного препарата. Почечный клиренс составляет 0,936 мл/час, внепочечный – 666,04 мл/час, то есть значительно превышает ренальный, что коррелирует с полученными ранее данными о характере распределения в органах.

При исследовании экскреции VMA-99-82 с содержимым кишечника было обнаружено, что максимальное выделение препарата приходится на 2 сутки (Рисунок 22). Соединение определяется не менее 72 часов. Суммарная экскреция неизмененной субстанции в 5 раз ниже таковой в моче, что свидетельствует о низкой степени участия данного пути выведения в процессах элиминации препарата в организме крыс.

Малые количества неизмененной субстанции, выводимые с мочой и калом, могут свидетельствовать о выраженной способности вещества подвергаться процессам биотрансформации в организме крыс.

Рисунок 21. Содержание препарата VMA-99-82 в моче крыс при внутривенном введении в дозе 50 мг/кг.

Обозначения: по оси абсцисс – время (сутки), по оси ординат – количество вещества (мкг).

С, мкг/г Рисунок 22. Содержание препарата VMA-99-82 в кале крыс при внутривенном введении в дозе 50 мг/кг.

Обозначения: по оси абсцисс – время (сутки), по оси ординат – концентрация (мкг/г).

3.3. Фармакокинетические свойства соединения VMA-99-82 при Фармакокинетический профиль соединения VMA-99-82 в плазме крови при пероральном введении у крыс (Рисунок 23) имеет фазу повышения концентрации или фазу всасывания, в течение которой происходит достижение максимальной концентрации в плазме крови. Вторая часть фармакокинетической кривой, характеризующая элиминацию препарата из плазмы крови (фаза снижения концентрации препарата), носит биэкспоненциальный характер. Первая «быстрая» фаза элиминации заканчивается к 1 часу и начинается вторая «медленная», продолжающаяся до 12 часов исследования. Соединение VMA-99очень быстро всасывается из ЖКТ - максимальная концентрация соединения (9,3 мкг/мл) достигается к 30 минутам после введения.

Основные фармакокинетические параметры (Таблица 13) показывают высокие значения периода полувыведения (Т1/2 = 6,11 часа) и среднего времени удерживания в организме одной молекулы препарата (MRT = 8,52 часа), что согласуется с данными, рассчитанными при внутривенном введении. Площадь под фармакокинетической кривой составляет AUC = 49,43 мкг*час/мл. Величина общего объема распределения (Vd = 8,91 л/кг) в 13,3 раза превышает общий объем жидкости в организме крысы –(0,67 л/кг), что свидетельствует о выраженной способности препарата интенсивно проникать в органы и ткани животных. Показатель системного клиренса не слишком высок (Сl = 1, л/час*кг), но превосходит таковой при внутривенном введении Величина абсолютной биодоступности составила 65,94 %.

Рисунок 23. Содержание соединения VMA-99-82 в крови крыс при пероральном введении в дозе 50 мг/кг.

Таблица 13.

Фармакокинетические параметры соединения VMA-99-82 в крови крыс при пероральном введении в дозе 50 мг/кг Соединение VMA-99-82 интенсивно распределяется в органы и ткани, концентрация в которых соответствует или превышает его содержание в плазме крови. Следует отметить, что характер распределения соответствует таковому при внутривенном введении.

гематоэнцефалический барьер, достигая максимума (1,13 мкг/г) через 4 часа после введения и оставаясь выше порога обнаружения в течение 8 часов (Рисунок 24). Тканевая доступность составила 0,28 (Таблица 14).

В сердце соединение VMA-99-82 также определяется в небольших количествах. Максимум концентрации (2,17 мкг/г) достигается к 4 часу (Рисунок 25), затем снижается, оставаясь выше порога обнаружения в течение 8 часов.

Тканевая доступность 0,34 (Таблица 14).

В мышечной ткани содержание VMA-99-82 достигает максимума через час после введения, концентрация соединения остается выше порога обнаружения в течение 12 часов (Рисунок 28). Тканевая доступность составила 0,65 (Таблица 14).

В почках наблюдается сходная картина распределения и также содержание вещества не слишком высоко, максимум концентрации составляет 1.33 мкг/г через 2 часа после введения (Рисунок 29). Тканевая доступность составила 0, (Таблица 14). Низкие значения концентрации соединения VMA-99-82 в ткани почек коррелируют с данными по элиминации.

В селезенке пик концентрации изучаемого соединения наблюдается через часа после введения и составляет 4,67 мкг/г. Падение ниже порога определения наступает через 8 часов после введения (Рисунок 26). Тканевая доступность 0, (Таблица 14).

Большую тропность VMA-99-82 проявляет к печени. Максимальная концентрация в печени (3,21 мкг/г) достигается к 8 часу после введения (Рисунок 30). Тканевая доступность составила 1,34 (Таблица 14).

При пероральном введении содержание изучаемого соединения в жировой ткани также невелико, как и при внутривенном пути введения. Максимум ( мкг/г) достигается через 30 минут после введения и после достаточно резкого падения концентрация остается выше порога обнаружения в течение 8 часов (Рисунок 31). Тканевая доступность – 0,52 (Таблица 14).

Наиболее велико содержание VMA-99-82 в легких, достигая максимума 744,64 мкг/г уже через 30 минут после введения (Рисунок 27). Тканевая доступность составила 8,14. (Таблица 14). Высокое содержание аналита в легочной ткани аналогично таковому при внутривенном пути введения. Данный факт также подтверждается полученными при изучении экскреции соединения VMA-99-82 данными о превосходстве внеренального пути выведения.

При изучении экскреции препарата было выявлено, что VMA-99- определяется в моче в течение не менее 72 часов исследования. При этом максимум выведения приходится на 1 сутки после введения (Рисунок 32).

Почечный клиренс составляет 1,8 мл/час, внепочечный – 1009,72 мл/час.

При исследовании экскреции VMA-99-82 с содержимым кишечника было обнаружено, что максимальное выделение препарата также приходится на 1 сутки исследования (Рисунок 33). Соединение определяется в течение 48 часов.

Картина экскреции несколько отличается от таковой при внутривенном пути введения и основная часть выведения происходит в первые сутки исследования, но количество неизмененной субстанции, выделяемой с мочой и предположение о выраженной способности вещества подвергаться процессам биотрансформации в организме крыс.

Фармакокинетические параметры распределения соединения VMA-99-82 в органах и тканях при пероральном введении крысам в дозе 50 мг/кг Рисунок 24. Содержание соединения VMA-99-82 в мозге крыс при пероральном введении в дозе 50 мг/кг.

Обозначения: По оси абсцисс – время (часы), по оси ординат – концентрация (мкг/мл).

Рисунок 25. Содержание соединения VMA-99-82 в сердце крыс при пероральном введении в дозе 50 мг/кг.

Обозначения: По оси абсцисс – время (часы), по оси ординат – концентрация (мкг/мл).

Рисунок 26. Содержание соединения VMA-99-82 в селезенке крыс при пероральном введении в дозе 50 мг/кг.

Обозначения: По оси абсцисс – время (часы), по оси ординат – концентрация (мкг/мл).

Рисунок 27. Содержание соединения VMA-99-82 в легких крыс при пероральном введении в дозе 50 мг/кг.

Обозначения: По оси абсцисс – время (часы), по оси ординат – концентрация (мкг/мл).

Рисунок 28. Содержание соединения VMA-99-82 в мышце крыс при пероральном введении в дозе 50 мг/кг.

Обозначения: По оси абсцисс – время (часы), по оси ординат – концентрация (мкг/мл).

Рисунок 29. Содержание соединения VMA-99-82 в почках крыс при пероральном введении в дозе 50 мг/кг.

Обозначения: По оси абсцисс – время (часы), по оси ординат – концентрация (мкг/мл).

Рисунок 30. Содержание соединения VMA-99-82 в печени крыс при пероральном введении в дозе 50 мг/кг.

Обозначения: По оси абсцисс – время (часы), по оси ординат – концентрация (мкг/мл).

Рисунок 31. Содержание соединения VMA-99-82 в сальнике крыс при пероральном введении в дозе 50 мг/кг.

Обозначения: По оси абсцисс – время (часы), по оси ординат – концентрация (мкг/мл) Рисунок 32. Содержание препарата VMA-99-82 в моче крыс при пероральном введении в дозе 50 мг/кг.

Обозначения: по оси абсцисс – время (сутки), по оси ординат – количество вещества (мкг).

Рисунок 33. Содержание препарата VMA-99-82 в кале крыс при пероральном введении в дозе 50 мг/кг.

Обозначения: по оси абсцисс – время (сутки), по оси ординат – концентрация (мкг/г).

3.4. Оценка возможных путей метаболизма соединения VMA-99-82 и изменений физико-химических свойств предполагаемых метаболитов с использованием специализированной компьютерной программы PALLAS образующихся метаболитов требует проведения отдельного, достаточно сложного и объемного исследования. Применяются либо методы ядерного магнитного резонанса и хромато-масс-спектрометрии, либо синтез всех возможных метаболитов и последовательная идентификация каждого из них, например, хроматографическим методом. Так же следует учесть, что между начальной структурой и метаболитами часто наблюдается значительные различия в физикохимических свойствах. Поэтому не всегда представляется возможным целесообразно использование методов in silico, позволяющих спрогнозировать основные направления метаболизма и изменения физико-химических свойств метаболитов [158, 162, 171, 200].

Из расчетной схемы (Рисунок 34) видно, что основные направления метаболизма протекают в виде окислительных реакций и реакций деградации.

Окислительные реакции представлены N-гидроксилированием атомов азота структуры аденина и гидроксилированием третичного атома углерода боковой цепи. Реакция деградации протекает в виде разрушения эфирной связи.

Анализ констант липофильности и диссоциации (Таблица 15) позволяет предположить неоднородное изменение физико-химических свойств метаболитов, а соответственно и хроматографических свойств. Наблюдаемое в большинстве случаев увеличение липофильности, а также значительно изменение кислотноосновных свойств, вероятно, потребует внесения изменений в хроматографический метод при дальнейшей идентификации и изучении свойств метаболитов.

Рисунок 34. Прогноз метаболизма соединения VMA-99-82 в программе PALLAS.

Физико-химические свойства соединения VMA-99-82 и его возможных метаболитов.

Выполнено фармакокинетическое исследование нового производного аденина – соединения VMA-99-82. На основании экспериментальных данных получены усредненные фармакокинетические профили аналита и рассчитаны числовые показатели основных фармакокинетических параметров, а также проанализирован характер распределения по органам и тканям. Было проведено исследование процессов экскреции исследуемого соединения с мочой и калом [84].

Фармакокинетические кривые при обоих путях введения достаточно сходны.

внутривенном пути наблюдается через пять минут после введения. При интрагастральном пути – максимальная концентрация аналита (9,3 мкг/мл) достигается через 30 минут, что свидетельствует о том, что соединение VMA-99очень быстро всасывается из ЖКТ. После этого начинается снижение концентрации, носящее биэкспоненциальный характер, предполагая быструю первую фазу распределения, сменяющуюся более медленной фазой элиминации.

Первая фаза элиминации заканчивается к 2 часам и начинается вторая «медленная», продолжающаяся до 12 часов исследования.

По зависимости концентрации соединения в плазме крыс от времени рассчитаны основные фармакокинетические параметры (Таблица 16). Из особенностей следует отметить значительные различия в показателях периода полувыведения (Т1/2 (час) = 11,03 для внутривенного и Т1/2 (час) = 6,11 для перорального пути, соответственно) и системного клиренса (Cl (л/(час*кг) = 0, и 1,01, соответственно). Аналогично разнятся и показатели площади под фармакокинетической кривой (AUC (мкг*час/мл) = 74,96 и 49,43, соответственно).

Фармакокинетические параметры соединения VMA-99-82 в плазме крови крыс при внутривенном и пероральном введении в дозе 50 мг/кг Распределение соединения VMA-99-82 по органам и тканям носит неоднородный характер и осуществляется следующим образом (Таблица 17).

Фармакокинетические параметры распределения препарата VMA-99-82 в органах и тканях при внутривенном и пероральном введении крысам в дозе мг/кг концентрация достигает на максимуме через 1 час после введения 24693,5 мкг/г.

Тканевая доступность составила 1111,18. Пероральный путь введения при более низких абсолютных значениях (744,64 мкг/кг) демонстрирует аналогично высокую, на фоне прочих органов, тропность к легким. Тканевая доступность составила 8,14.

соответствует или превосходит уровень его в крови. Для сердца характерной особенностью является значительное отличие между внутривенным и пероральным путями введения.