«РАЗРАБОТКА СОСТАВА, ТЕХНОЛОГИИ И НОРМ КАЧЕСТВА ФИТОГЕЛЯ РЕПАРАТИВНОГО ДЕЙСТВИЯ ...»

Для проведения анализа на линию старта хроматографической бумаги наносили в достаточном количестве анализируемое извлечение. Бумагу помещали в камеру, насыщенную БУВ, и хроматографировали около 6 часов.

После высушивания бумагу просматривали в УФ – свете, отмечая пятна и их цвета, затем опрыскивали спиртовым раствором алюминия хлорида, высушивали и снова просматривали в УФ – свете, отмечая пятна и изменение их окраски [13].

Также нами была изучена хроматографическая подвижность стандартных образцов некоторых фенольных соединений производства «Сигмабиосинтез»

(дигидрокверцитин, рутин, кверцетин, галловая кислота, феруловая кислота) в данной системе растворителей.

По значениям Rf и окраске пятен в исследуемых образцах нами были идентифицированы дигидрокверцетин, рутин и галловая кислота.

Качественное обнаружение дигидрокверцетина в фитогелях 1 и Качественное обнаружение дигидрокверцетина в фитогелях проводили методом ТСХ (рисунок 17).

Для этого на линию старта хроматографической пластинки Сорбфил ПТСХАФ-В наносили около 2 мкл спиртового раствора стандарта дигидрокверцетина и спиртового извлечения из фитогеля. Хроматограмму помещали в камеру, предварительно насыщенную системой растворителей – бутанол : кислота уксусная : вода (4:1:2) и хроматографировали восходящим способом. После высушивания пластинку просматривали в УФ-свете. На уровне Rf =0,96-0,97 в обоих образцах обнаружили темно-коричневое пятно (дигидрокверцетин).

Рисунок 17 – Внешний вид хроматограммы стандарта дигидрокверцетина (1), фитогеля 1 (2) и фитогеля 2 (3) на пластинке Сорбфил ПТСХ-АФ-В в системе растворителей бутанол-кислота уксуснаявода (4:1:2) 4.2. Количественное определение флавоноидов и хлорофиллов в При использовании спектрофотометрического метода, основанного на реакции комплексообразования с алюминия хлоридом, происходит батохромный сдвиг полосы поглощения флавоноидов с 290-360 нм до 370-420 нм.

Рисунок 18 – УФ-спектр поглощения этанольного извлечения из - исходный раствор - - - - - - раствор после взаимодействия с раствором алюминия хлорида Количественное определение суммы флавоноидов в фитогеле проводили по методике ГФ XI [30]. Для этого к 0,5 г фитогеля (точная навеска) прибавляли мл спирта этилового 96% и интенсивно перемешивали в течение 10 минут, полученный раствор отфильтровывали в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводили объем раствора спиртом этиловым 96% до метки (раствор А).

1 мл раствора А помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, добавляли 1 мл спиртового раствора алюминия хлорида и доводили объем раствора спиртом этиловым 96% до метки. В результате комплексообразования исследуемый раствор окрашивался в ярко-желтый цвет. Через 40 минут снимали оптическую плотность раствора на спектрофотометре СФ 2000 при длине волны 390 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Для приготовления раствора сравнения в мерную колбу вместимостью 25 мл прибавляли 1 мл раствора А, 1 каплю кислоты уксусной разведенной и доводили спиртом этиловым 96% до метки.

Параллельно измеряли оптическую плотность раствора стандартного образца (СО) дигидрокверцетина в тех же условиях.

дигидрокверцетин) вычисляли по формуле:

Ах, Аст – соответственно оптическая плотность анализируемого раствора и раствора СО дигидрокверцетина;

аст–масса дигидрокверцетина, взятая для приготовления раствора СО, г;

ах – масса фитогеля, взятая на анализ, г;

Дифференциальный спектр поглощения суммы флавоноидов фитогеля представлен на рисунке 19.

Рисунок 19 - Дифференциальный УФ-спектр поглощения суммы количественного определения суммы флавоноидов в фитогеле дигидрокверцетин в фитогелях 1 и 2 практически не различалось составило 0,72±0,04% и 0,70±0,03% соответственно (таблица 21).

Валидация методики количественного определения суммы флавоноидов в фитогеле 1 проводили по линейности, сходимости и правильности [83].

Определение линейности проводили на 5 уровнях концентраций от ожидаемого содержания суммы флавоноидов в пересчете на дигидрокверцетин в фитогеле. Растворы готовили путем разбавления аликвоты и увеличения аликвоты для измерения количественного содержания суммы флавоноидов. Далее строили градуировочный график зависимости оптической плотности от массы фитогеля (таблица 22, рисунок 20). Критерием приемлемости методики является коэффициент корреляции, величина которого должна быть не ниже 0,99 [83].

Таблица 22 - Определение линейности методики количественного определения суммы флавоноидов в фитогеле Рисунок 20 - Градуировочный график зависимости оптической экспериментальные точки находятся вблизи линии тренда. Уравнение линейной регрессии имеет вид:

Значение коэффициента корреляции, вычисленное при помощи программы Microsoft Excel, составило 0,9939.

Сходимость методики определяли на образце фитогеля в 6 повторностях.

Критерий приемлемости выражался величиной относительного стандартного отклонения, которое составляло 5,0 % (таблица 23).

Таблица 23 - Определение сходимости методики количественного определения суммы флавоноидов в фитогеле Повторность Содержание суммы флавоноидов в фитогеле,% Относительное стандартное отклонение (RSD, %) Правильность методики устанавливали путем измерения количественного содержания суммы флавоноидов в пересчете на дигидрокверцетин в растворах, полученных путем добавления определенного количества стандарта к исследуемому раствору. Критерием приемлемости является средний процент восстановления при использовании растворов заданных концентраций, скорректированный на 100%, средняя величина которого должна находиться в пределах 100±5%.

Результаты установления правильности спектрофотометрической методики определения суммы флавоноидов в фитогеле представлены в таблице 24.

Таблица 24 - Результаты установления правильности методики количественного определения суммы флавоноидов в фитогеле 1 методом добавок Содержание дигидрокверцетин, В разработанной нами методике процент восстановления находился в пределах от 98,76% до 101,11%, его средняя величина составила 100,06%.

Таким образом, правильность методики количественного определения суммы флавоноидов в фитогеле соответствует предъявляемым требованиям [83].

Определение содержания хлорофиллов в фитогелях 1 и Для определения суммы хлорофиллов использовали метод ХольмаВеттштейна. Известно, что хлорофиллы а и b имеют абсорбционные максимумы в ацетоне при 428 и 452 нм и при 664 и 644 нм соответственно.

При выполнении методики использование стандартов не предусмотрено.

Для количественного определения суммы хлорофиллов к точной навеске исследуемого образца прибавляли 20 мл ацетона, перемешивали. Полученный раствор отфильтровывали в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводили объем раствора до метки ацетоном. Оптическую плотность полученного раствора измеряли на спектрофотометре в кювете с толщиной слоя 10 мм при 644 и 664 нм.

В качестве раствора сравнения использовали ацетон [82].Содержание суммы хлорофиллов в фитогеле (Ххл) в мг % рассчитывали по формуле:

А664 – - оптическая плотность раствора, измеренная при 664 нм;

А644 – оптическая плотность раствора, измеренная при 644 нм;

а – навеска образца, взятая на анализ, г;

0,5134 и 2,0436 – информационные коэффициенты.

Рисунок 21 – Спектр поглощения ацетонового извлечения фитогеля Рисунок 22 – Спектр поглощения ацетонового извлечения фитогеля количественного определения хлорофиллов в исследуемых образцах Таким образом, содержание хлорофилла в фитогелях 1 и 2 составило 1,74±0,06 мг% и 1,75 ±0,06 мг% соответственно (таблица 25).

4.3. Определение стабильности разработанного фитогеля в процессе Одним из важных показателей фитогелей является способность сохранять свои свойства в процессе хранения, сохранять микробиологическую чистоту и не взаимодействовать с упаковочным материалом.

Установление сроков годности проводили на 5 опытных сериях по следующим критериям: внешний вид, цвет, запах, микробиологическая чистота, качественный и количественный анализ (таблицы 26, 27). Хранили фитогели в плотно укупоренных банках оранжевого стекла при температуре не выше +150С.

Как видно из данных, приведенных в таблицах 26 и 27, срок годности фитогеля 1 и фитогеля 2 при хранении в условиях не выше +150C составил месяцев, так как при хранении, более указанного срока, препарат не соответствует норме по показателю «Микробиологическая чистота».

Таблица 26 – Результаты определения сроков годности фитогеля Описание Однородная масса мягкой Водородный показатель (рН) определение 0,68% Микробиоло- ГФ ХII, кат. Примечание: (-) – не соответствует, (+) – соответствует.

Таблица 27 – Результаты определения сроков годности фитогеля Водородный показатель (рН) Микробиологическая ГФ ХII, кат. Примечание: (-) – не соответствует, (+) – соответствует.

4.4. Нормы качества разработанных фитогелей На основании ОСТ 91500.05.001-00 «Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения» и результатов проведенных исследований были установлены нормы качества разработанного геля репаративного действия с фитокомпонентами (содержащего густые экстракты чабреца, солодки, крапивы, каштана, масляный экстракт зверобоя, сок алоэ и дигидрокверцетин), представленные в таблице 28.

Таблица 28 – Нормы качества разработанного геля репаративного действия с фитокомпонентами Подлинность Качественная реакция Красно-фиолетовое показатель (рН) определение чистота Количественное УФ-спектрофотометрия Флавоноидов не менее 0,68% 1. Проведен качественный анализ разработанных составов фитогеля с использованием реакций на фенольные соединения, флавоноиды и дигидрокверцетин.

2. Разработана и валидирована методика количественного определения содержания суммы флавоноидов в пересчете на дигидрокверцетин в составах фитогеля. Установлено содержание суммы флавоноидов не менее 0,68%.

3. Разработана методика количественного определения содержания хлорофиллов в составах фитогеля. Установлено содержание суммы хлорофилла не менее 1,5 мг%.

4. На основании проведенных исследований и ОСТ 91500.05.001- выбраны нормы качества для разработанного фитогеля: описание, подлинность, водородный показатель, микробиологическая чистота, количественное определение.

5. Установлен срок годности разработанного фитогеля репаративного действия. При температуре не выше +150C он составляет 18 месяцев, что вполне допустимо для геля на базе фитокомпозиции.

ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ

ФИТОГЕЛЯ РЕПАРАТИВНОГО ДЕЙСТВИЯ

Изучение фармакологической активности разработанного фитогеля проводили на двух биологических моделях – одноклеточных животных (культура клеток Parametium caudatum) и лабораторных животных (самцы белых крыс).

5.1. Изучение фармакологической активности фитогеля на культуре При изучении фармакологической активности составов фитогеля в тестах на парамециях в качестве препаратов сравнения использовали гелевую основу, мазь репаративного действия с фитокомпонентами на гидрофобной основе «Цикадерма»

«Левомеколь».

Для исследуемых образцов предварительно готовили базовые 1%-е растворы, рН которых находился в пределах от 6,2 до 7,8.

Анализ результатов хронического опыта свидетельствует, что базовые растворы гелевой основы, разработанных фитогелей, мази «Цикадерма» и мази «Левомеколь»

биологической модели. Клетки парамеций в опытных группах по размеру и форме не отличались от клеток контрольной группы. Инфузории в среде, содержащей 1%-й базовые растворы разработанных фитогеля 1 и фитогеля 2, отличались значительно более высокой подвижностью, чем в контроле (таблица 29).

Parametium caudatum (хронический опыт) Объект исследования основы фитогеля фитогеля фитогеля «Левомеколь»

Примечание: (-) – отсутствие биологической активности, инфузории совершают хаотичные броуновские движения; БА – движения инфузорий изменены.

В остром опыте установлено, что исследуемые базовые растворы удлиняли клеточных ядов (14%-й раствор спирта этилового и 1%-й раствор пероксида водорода). Результаты проведенных исследований представлены в таблице 30.

Таблица 30 – Влияние экспериментальных базовых мазевых растворов на продолжительность сохранения двигательной активности парамеций после добавления клеточных ядов (острый опыт) Базовый раствор основы фитогеля Базовый раствор фитогеля Базовый раствор фитогеля Базовый раствор «Левомеколь»

Базовый раствор «Цикадерма»

Таким образом, результаты острого опыта показали, что наиболее благоприятным для используемой биологической модели является базовый 1%-й раствор разработанного фитогеля Он оказывали максимальный мембраностабилизирующий и антиоксидантный эффекты. Данные показатели проявлялись удлинением в 2 раза времени остановки парамеций (6 мин и 12 мин соответственно для базового раствора основы и базового раствора фитогеля 1) и наступления лизиса (7 минут для раствора основы и 14 минут для раствора фитогеля 1) под воздействием спирта этилового. Под воздействием пероксида водорода время остановки движения Parametium caudatum увеличивалось в 2 раза (от 3 мин до 6 мин), а время лизиса - в 2,5 раза (от 4 минут для базового раствора основы до 10 минут для базового раствора фитогеля 1).

Поскольку в ходе сравнительного изучения базовых растворов мази «Цикадерма» и «Левомеколь» существенных различий не выявлено, для дальнейших исследований in vivo нами была выбрана мазь «Левомеколь», как мазь имеющая основу, по физико-химическим свойствам родственную основе разработанного фитогеля и обладающую комплексным действием.

5.2. Изучение репаративной активности фитогеля В качестве биологических объектов для изучения репаративной активности разработанных составов фитогеля использовали белых крыс линии Вистар.

Все животные были разделены на четыре группы: контрольная группа (без лечения), опытная группа (лечение фитогелем 1), опытная группа (лечение фитогелем 2) и группа сравнения (лечение мазью «левомеколь»). Фитогели и препарат сравнения наносили на рану 1 раз в день ежедневно в течение 20 дней.

Оценку ранозаживляющего действия проводили по характеру клинического течения (наличия нагноения, времени полного отторжения струпа, времени и динамике полного срастания краев раны) на 4, 8, 12, 16, 20 дни наблюдения.

Визуальные наблюдения показали, что заживление линейной раны было более интенсивным в группе животных, подвергавшихся лечению фитогелем (таблица 31). Уже на 12 послеоперационные сутки происходило значительное уменьшение раневой поверхности и отечности у опытных животных, по сравнению с контрольной группой, не подвергавшейся никакому воздействию.