«КЛЕТОЧНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ В ВОССТАНОВИТЕЛЬНОЙ МЕДИЦИНЕ Монография Под редакцией академика АМТН, д.м.н., профессора А.Н. Лищука Тула – 2011 УДК 611-013.11; 616-003.9 Иванов Д.В., Хадарцев А.А. Клеточные технологии в ...»

Вартонов студень, или слизистая соединительная ткань пупочного канатика, содержит в себе СК, которые называются некоторыми авторами СК матрикса пуповины (Weiss M.L. et al., 2006), или периваскулярные клетки пуповины канатика (Sarugaser R. et al., 2005), или стромальные клетки (Karahuseyinoglou S.

et al., 2007). Данные клетки в последние годы были подробно исследованы и получили описательные характеристики (Mitchell K.E. et al., 2003; Wang H.S. et al., 2004; Sarugaser R. et al., 2005; Weiss M.L. et al., 2006; Karahuseyinoglou S. et al., 2007).

Эти клетки представляют собой более насыщенный вид по сравнению с МСК, полученными из костного мозга, или крови пупочного канатика. В частности, эти стромальные клетки были изолированы из слизистой соединительной ткани, которая называется Вартонов студень, окружающей две артерии и одну вену пупочного канатика. Они являются миофибробластными клетками различного пространственного расположения, причём большинство пролиферирующих клеток располагается возле амниотической поверхности, в то время как фибробластоидные клетки (по-другому – периваскулярные СК), располагаются ближе к трём сосудам. Систематическое изучение позволило охарактеризовать различные стадии их роста in vivo в течение 10-ти месячного периода и выделить некоторые исключительные особенности стромальных клеток пуповины (Karahuseyinoglou S. et al., 2007). Из одного образца крови пуповинного канатика может быть получено около 3,6х106 жизнеспособных стромальных клеток, в то время, как общее их количество к месяцам составляет приблизительно 11,5х108 клеток, показывающих стабильную теломеразную активность до 6 пассажа (Karahuseyinoglou S. et al., 2007). В других работах зафиксировано получение около 17х103 клеток на 1 см длины пуповины, разброс составляет от 10х103 до 50х103 клеток на 1 см (Weiss M.L.

et al., 2006). Обнаружено также, что морфологически стромальные клетки Вартонова студня состоят из двух типов популяций клеток. Разделение основано на их особенностях в экспрессии виментиновых и цитокератиновых филаментов, разделяя похожие способности дифференцироваться в несколько линий клеток, исключая нейрональные клетки (Karahuseyinoglou S. et al., 2007). Изолированные стромальные клетки пуповины при культивировании в условиях исключающих остеогенное направление – дают популяцию МСК с гомогенной фибробластной морфологией и высокой степенью пролиферативной активности и дифференцировки в костные узелки. Определено, что данные клетки содержат легко нарастающую субпопуляцию клеток, которые не экспрессируют ни 1, ни 2 класс комплексов гистосовместимости, а это – важная особенность для дальнейшего клинического применения, так как отсутствие комплексов гистосовместимости обеспечивает полное приживление клеточного материала. Более того, около 20% периваскулярных клеток пуповины вообще не экспрессируют антигенов комплексов гистосовместимости. Причём данная популяция способна увеличиваться до 95% после пассажей и криоконсервации (Sarugaser R.

et al., 2005). Однако никаких данных in vivo по этим свойствам не получено, или же они действительно могут поддерживать этот фенотип вследствие дифференцировки. МСК, полученные из Вартонова студня не экспрессируют маркеры гемопоэтических клеток, зато отлично экспрессируют типичные маркеры, свойственные мезенхимальным клеткам, а также могут дифференцироваться в адипоциты, остеогенные и хондрогенные клетки, кардиомиоциты (Wang H.S. et al., 2004), нейроны или глиальные клетки (Mitchell K.E. et al., 2003), и даже, в допаминэргические нейроны, которые могут частично корректировать нарушение обмена амфетаминов на крысиной модели болезни Паркинсона (Fu Y.S. et al., 2006). Более того, как показали последние исследования у человека (Weiss M.L. et al., 2006) и свиньи (Carlin R. et al., 2006), стромальные клетки Вартонова студня экспрессируют дополнительные ЭСК маркеры, такие как Oct-4, Sox-2, Rex-1, Nanog.

Были успешно оценены поведенческие эффекты человеческих стромальных клеток пуповины на крысиной модeли болезни Паркинсона (Weiss M.L. et al., 2006). Важно заметить, что это исследование зафиксировало отсутствие туморогенных формирований в течение 12 недельного периода наблюдения.

Однако, необходимо проводить дальнейшие исследования, подтверждающие безопасность этих клеток в более поздние сроки.

Уже было несколько попыток оценки дифференцировки in vivo стромальных клеток Вартонова студня для клеточной терапии.

В частности, была проведена успешная работа на мышах по регенерации мышц после тяжёлого повреждения мышечной ткани (Conconi M.T. et al., 2006).

Совсем недавно выяснилось, что амниотическая оболочка, или просто – амнион, может представлять собой новый и альтернативный источник получения популяции фетальных СК.

Особенность амниона в том, что он состоит из трёх слоёв клеток и после 8 дня развития в нем не существует сосудистой сети. Три слоя включают в себя: внутренний эпителиальный слой, который состоит из эпителиальных клеток и у них есть название амниотические эпителиальные клетки; промежуточной основной мембраны, которая вообще не имеет клеточных элементов и, наконец, наружный слой, который тесно соединён с хорионом и состоящий из мезенхимальных клеток, называющихся амниотическими мезенхимальными или мезенхимальными стромальными клетками амниотической оболочки. Так как эти амниотические клетки часто называются СК из амниона, происходящие из эпибластных клеток, считается, что они могут отражать некоторые особенности СК в течение всего периода гестации и ассоциируются с клетками, которые экспрессируют незначительное количество HLA-антигена. Первичные эпителиальные клетки амниона содержат антигены главного комплекса гистосовместимости 1А и 2 класса, согласующиеся с низким риском тканевого отторжения. Однако, вследствие дифференцировки в клетки поджелудочной железы или в печени, но не в кардиогенном направлении, статистически значимый процент клеток начинает экспрессировать антигены класса 1А главного комплекса гистосовместимости, но не 2 класса (Ilancheran S. et al., 2007). Следовательно, необходимо проводить дополнительные исследования для лучшего понимания механизмов антигенной экспрессии до того момента как данные клетки попадут в клинику. Недавно проведенные исследования амниона выявили среди эпителиальных клеток около 10% клеток, которые экспрессировали маркеры СК, в частности SSEA-4, Tra1-60, Tra1- (Miki T. et al., 2007), домен POU, Nanog, гены SRY-box (Ilancheran S.

et al., 2007). Причём именно в эпителиальных, а не в мезенхимальных клетках амниона. Необходимо заметить, что клеточная гетерогенность в распределении маркеров СК в данном фетальном материале говорит о том, что популяция СК человеческого амниона представлена в разных местах во время развития и дифференцировки организма, т.е. она перемещается из одного участка в другой. У эпителиальных клеток амниона была обнаружена способность дифференцироваться во всех клетках трёх зародышевых листков (Miki T., Strom S.C., 2006). Эти особенности эпителиальных клеток можно связать с тем фактом, что они напрямую происходят из эпибласта и таким образом могут сохранять в себе пластичность прегаструляции ЭСК. Однако, важно отметить что эти СК амниона, в отличие от ЭСК, не образуют тератому in vivo, как минимум в течение 10 недель после введения (Ilancheran S. et al., 2007). Пластичность СК, полученных из амниона, была проверена на клональном уровне, где были зафиксированы способность к мультидифференцировке и многократному самообновлению популяции (Marcus A.J. et al., 2008). Пролиферативная частота мезенхимальных клеток амниона составила приблизительно 300 кратное увеличение за день, прибавка составляла 2,9х106 клеток (Alviano F. et al., 2007).

Необходимо отметить, что наружный слой амниона представляет собой богатый источник МСК со способностью этих клеток дифференцироваться в эндотелиальные клетки in vitro (Alviano F.

et al., 2007), а кардиомиоциты и гепатоциты как in vitro, так и in vivo (Tamagawa T. et al., 2007). Другой важной особенностью мезенхимальных клеток амниона является их способность проявлять контактный и дозозависимый иммуномодуляторный эффект на мононуклеары в периферической крови (Wolbank S. et al., 2007). Эти свойства отражают общую способность МСК или стромальных клеток, полученных из разных источников, высвобождать оксид азота в ответ на появление провоспалительных цитокинов из активированных Т-клеток (Keating A., 2008).

Эти новые разъяснения механизмов иммуномодулирующего эффекта МСК обеспечивают возможность действительно использовать эти мультипотентные СК в качестве альтернативного источника клеток для применения в тканевой инженерии, как аллогенный материал.

Плацента представляет собой важнейший источник для получения СК с разнообразной потенцией. Развивается плацента из трофоэктодермы, состоящей из трофобластных компонентов, включающих цитотрофобласт и синцитотрофобласт. Чистая популяция СК из тканей человеческой плаценты (Hemberger M. et al., 2008) состоит из хориональных мезенхимальных стромальных клеток и хориональных трофобластных клеток. Обе популяции проявляют изменчивую пластичность (Parolini O. et al., 2008). Находиться в недифференцированном состоянии трофобластным СК удаётся благодаря воздействию транскрипционного гена Ets2 (Wen F. et al., 2007). Благодаря экспрессии специфических маркеров (FZD9 или CD349) мезенхимальными клетками плаценты, их легко селективно выделить (Battula V.L.

et al., 2008). Недавно была выделена из материнской части (париетальная оболочка) популяция СК плаценты, равномерно экспрессирующая маркеры плюрипотентности (SSEA-4, SSEA-1, Oct-4, Stro-1, Tra 1-81), наряду с мезенхимальными и гемопоэтическими маркерами (Strakova Z. et al., 2008). Мезенхимальные клетки, полученные из плаценты, более эффективны, чем МСК из костного мозга, в поддержке клеток, как фидерный слой и позволяют дольше размножаться человеческим ЭСК (Kim S.I.

et al., 2007). Однако не обнаружено достоверных различий в количестве необходимых клеток и скорости роста между МСК из костного мозга и МСК из плаценты (Miao Z. et al., 2006). Характеристики СК, полученных из плаценты, такие же как и у МСК по иммуномодуляторным свойствам (Li C. et al., 2007; Jones B.J.

et al., 2007; Li D. et al., 2007) с дополнительно индуцированной экспрессией плюрипотентных маркеров SSEA-4, Nanog 3, Oct- (Battula V.L. et al., 2007) и Rex-1 (Fukuchi Y. et al., 2004). Они также проявляют типично широкий спектр дифференцировочной способности МСК (Fukuchi Y. et al., 2004; In't Anker P.S. et al., 2004; Portmann-Lanz C.B. et al., 2006; Battula V.L. et al., 2007; Parolini O. et al., 2008), включая дифференцировку в нейрональные и глиальные клетки in vitro (Yen B.L. et al., 2008), инсулинпозитивные клетки как in vivo, так и in vitro (Chang C.M. et al., 2007), гепатоциты (Chien C.C. et al., 2006) и даже создание клапанных структур сердца на биодеградируемом каркасе (Schmidt D. et al., 2006). Примечательно, что недавно было обнаружено свойство маркера плюрипотентности Oct-4 снижать свои эпигенетические способности через процессы метилирования в плаценте, что может быть важным в понимании патогенеза возникновения болезни трофобласта во время беременности (Zhang H.J. et al., 2008). Недавно было также обнаружена способность СК, полученных из плаценты, дифференцироваться в эндотелиальные клетки (Wu C.C. et al., 2008). Интересно отметить, что были обнаружены различия между эндотелиальными клетками полученными из артерий и вен плаценты (Lang I. et al., 2008). Фенотипические, генотипические и функциональные особенности, включая пластичность, тесно связаны с высокопластичным фенотипом венозных клеток, а не с более зрелым фенотипом артериальных клеток, что поддерживает теорию о роли эндотелиальных прогениторов, оставшихся в тканях во время эмбрионального развития, для их формирования (Lang I.

et al., 2008). По взаимодействию с другими типами СК клетки из плаценты проявляют более выраженные свойства по приживлению, чем, например, СК полученные из костного мозга, и все это благодаря более эффективному использованию VL-4 опосредованным связям (Brooke G. et al., 2008). Специфические производные из культивированных МСК плаценты обозначают как PLX-I, также имеют усиленное приживление по сравнению с ГСК (Prather W.R. et al., 2008). Циркулирующие фетальные фиброциты, которые обнаруживаются после первой открутки клеток из сосудов пуповины и плаценты, представляют собой важное хранилище для ключевых клеточных популяций плаценты (Kim J.S. et al., 2008). Более важный момент заключается в том, что мигрирующие фетальные фиброциты были обнаружены в изменённом виде в недоразвитой матке, что даёт возможность определить их роль в развитии этой патологии. Удалось выяснить вероятный механизм перемещения клеток между матерью и плодом, приводящий в результате к материнскому микрохимеризму, с помощью циркулирующих материнских мультипотентных МСК. С помощью VEGF-A и интегрин зависимый путь, они проникают через гемохориальную часть плаценты в плод, где и были обнаружены у фетуса (Chen C.P. et al., 2008). Более того, недавние экспериментальные исследования представили неопровержимые доказательства того, что ткани плаценты за жёлтым мешком и дорсальной и желточной аортой также являются подлинными и самостоятельными местами регенерации ГСК, развивающимися до стадии фетальной колонизации (Rhodes K.E. et al., 2008). Циркулирующие в плаценте CD34+ гемопоэтические прогениторные клетки и CD31+ и СD133+ эндотелиальные клетки плаценты – окружают кровеносные сосуды плаценты и экспрессируют модулярный белок ACBD6. В настоящее время считается, что данный белок находится в гемангиогенных СК, которые являются предшественниками клеток крови и сосудов (Soupene E. et al., 2008). Не решённый на данный момент вопрос о происхождении раковых СК может быть решён с помощью модели хориокарциномы, которая является новообразованием из цитотрофобласта и синцитотрофобласта. Иммуногистохимические исследования выявили, что она компонуется в большей степени из синцитотрофобласта и интермедии трофобласта и совсем в малого процента клеток цитотрофобласта (Mao J.L.

et al., 2007). Часть из небольшого процента клеток, которые экспрессируют ядерный -катенин, представляют собой чисто раковые СК, которые дают две популяции малигнизирующих опухолей (Mao J.L. et al., 2007).

В течении последних 20 лет пуповинная кровь (ПК) преподносится как насыщенный источник гемопоэтических и прогениторных СК с установленным терапевтическим эффектом в лечении нарушенного гемопоэза (Broxmeyer H.F. et al., 2006). Данные методики лечения гематологических больных принесли неоспоримые доказательства успеха клеточных технологий. Около 1% мононуклеаров ПК экспрессирует CD34+ антиген, который является основным маркером ГСК. Способность CD34+ клеток к самообновлению и дифференцировке в несколько клеточных линий была неоднократно доказана как in vitro, так и in vivo, включая оценку репопуляции гемопоэтических клеток у иммунодефицитных мышей (Broxmeyer H.E., 2005). Репопулирующие клетки у мышей экспрессировали высокий уровень CD34+. Количество клеток с высоким уровнем экспрессии CD34+ в ПК намного выше по сравнению с материалом, полученным из костного мозга или периферической крови после мобилизации цитокинами. Эффект приживляемости у ГСК в место трансплантации опосредован через специфическую кратковременную репопуляцию (Mazurier F. et al., 2003). Хотя ГСК из ПК успешно увеличиваются в количестве до трансплантации, чтобы улучшить свою способность для хоуминга и приживляемости, они начинают проявлять свойства утраты долговременного приживления (McNiece I.K. et al., 2002). Эти результаты косвенно подтверждают, что помимо цитокиновых эффектов, необходимы клеточные и молекулярные факторы для хорошего приживления и хоуминга. Поэтому кажется правильным направление в настоящее время на модификацию главных компонентов клеточной мембраны, вовлечённых в основные тропы трансдукции сигналов, таких как Notch и Wnt3a (Stier S. et al., 2002). Дополнительные работы по изучению профиля экспресси ГСК ПК, подразумевают в будущем понимание механизмов воздействия на самообновление, способность к росту и увеличение потенциала приживляемости этих клеток.

В настоящее время сделан важный прогресс в понимании роли МСК в поддержании и росте популяции ГСК in vivo. Важно отметить, что ГСК из ПК экспрессируют нейрональные белки и могут дифференцироваться в глиальные или подобные нейронам клетки (McGuckin C.P., 2004). Основываясь на вышеназванных свойствах клеток ПК, выполненные исследования на экспериментальных моделях нейродегенеративных заболеваний, подтвердили, что клетки ПК экспрессируют нейрональные маркеры, способны образовывать нейрон-подобные клетки, что приводит к улучшению неврологической симптоматики. Механизмов, которые предположительно задействованы в улучшении неврологической симптоматики, – несколько. Во-первых – высвобождение ростовых факторов и цитокинов клетками ПК; вовторых – неоваскуляризация ишемической зоны; в-третьих – стимуляция регенерации скелетной мускулатуры прогениторными клетками ПК без эффекта длительного приживления (Koponen J.K., 2007).

МСК ПК представляют собой вторую главную популяцию и обладают фенотипом, который наиболее всего похож на ЭСК.

Кроме типичных для МСК маркеров таких как CD105(SH2), CD73(SH3), CD44, они ещё экспрессируют маркеры ЭСК, такие как Oct-4, которые необходим для ингибирования тканеспецифичных генов, и таким образом поддерживает свойство самообновления и плюрипотентности (Greco S.J., 2007). Костный мозг (КМ) и клетки ПК традиционно считаются двумя основными источниками получения МСК и действительно содержат большинство клеточных популяций мультипотентных предшественников, пригодных не только для научного изучения, но и для клинического применения. Недавно впервые продемонстрировали увеличение количества МСК из пуповинной крови для клинического применения, при культивировании которой не использовалась бычья сыворотка (Reinisch A. et al., 2008). Использование фетальной бычей сыворотки при культуральных работах – основная проблема для дальнейшего клинического применения из-за наличия ксеногенных белков для пациента, особенно при повторных применениях.

Работы по изучению дифференцировочной способности МСК из двух источников – КМ и ПК показали, что МСК из ПК проявляют больший остеогенный потенциал, но меньший адипогенный потенциал по сравнению с МСК из КМ (Chang Y.J. et al., 2006). Оба типа клеток отвечают на воздействие лептина, регуляторного белка, стимулирующего остеогенез, но блокирующего адипогенез, а также модулируются другими важными медиаторами Cbfa1 и PPAR2, соответственно. Более того, недавно теми же исследовательскими группами проведены работы с использованием метода ограниченного разведения, в результате которых обнаружены две популяции МСК в ПК с различиями в морфологическом фенотипе, но имеющие одинаковые поверхностные маркеры и одинаковый дифференцировочный потенциал, исключающий адипогенез (Chang Y.J. et al., 2006). Факт, что большинство клеток, имеющие фенотип CD90 – теряют способность подвергаться адипогенезу, может объяснить уменьшение потенциала МСК из ПК дифференцироваться в адипоциты (Chang Y.J. et al., 2006).

Потенциальные терапевтические свойства фетальных СК из разнообразных фетальных источников постепенно переходят на клинический уровень через создание комплексного международного руководства по клиническому применению СК и их производных (Daley G.Q. et al., 2008). СК, полученные из этих фетальных, не затрагивающих фетуса тканей, в большинстве своём имеют мезенхимальный тип и преимущество в виде быстрого наращивания общего количества клеток при культивировании, что необходимо при клиническом использовании. Помимо этого, они ничтожно иммунодефицитны, не обладают признаками формирования тератом и не вызывают этических проблем.

В ближайшем будущем эти особенности позволят провести клинические испытания клонально полученных МСК для лечения различных заболеваний. Ввиду того, что совсем недавно были получены производные ЭСК, которые называются сейчас индуцированные плюрипотентные клетки, предполагается, что имеются как минимум 2 разных статуса плюрипотентных клеток: или как эпибластные прогениторы, или как плюрипотентные прогениторы поздних стадий гаструляции эмбриона (Rossant J., 2008). Индуцированные плюрипотентные клетки получают благодаря репрограммированию взрослых клеток, типа фибробластов (Jaenisch R., Young R., 2008). Однако, недавние исследования разнообразных типов фетальных СК, подтвердили, что они представляют собой новый класс СК, располагающихся по развитию и деятельности между ЭСК и взрослыми СК, сочетающими в себе особенности плюрипотентности и мультипотентности без выводов о том, что они могут создать любую ткань (Gilbert S.F. et al., 2005; Gilbert S.F., 2006; Emanuel P., 2007). Однако, выделение исключительного статуса для данных клеток, как источника получения плюрипотентных клеток, в ближайшем будущем необходимо для того, чтобы лучше понимать разнообразные механизмы репрограммирования как фетальных, так и взрослых дифференцированных клеток.

Обобщая полученные сведения, выделим несколько особенностей фетальных СК:

1. Разнообразные типы фетальных СК – фетальные СК научились изолировать из нескольких тканей (амниотическая жидкость, Вартонов студень, амнион, плацента, пупочный канатик);

– они получаются непосредственно из фетуса или структур окружающих фетус;

– они представляют идеальный источник клеток для восстановительной медицины, потому что их легко получить, они имеют высокий пролиферативный потенциал, не формируют тератом и не имеют проблем связанных с ЭСК;

– их функциональной особенностью является то, что они представляют собой популяцию клеток между ЭСК и взрослыми СК.

2. СК из амниотической жидкости – представляют собой гетерогенную популяцию происходящую из всех трёх зародышевых слоёв;

– клонально нарощенные МСК, полученные из амниотической жидкости экспрессируют маркеры СК (Oct-4, Nanog, SSEA-4);

– имеют широкий спектр дифференцировочного потенциала;

– клетки CD117+ из популяции СК in vivo проявили свойства плюрипотентных СК.

3. Клетки из Вартонова студня – недавно выделены и охарактеризованы;

– экспрессируют маркеры ЭСК (Oct-4, Nanog, SSEA-4) без маркеров МСК;

– исследования на животных показали их способность восстанавливать поражённые мышечные ткани.

4. СК из амниотической оболочки – амниотическая оболочка происходит из эпибласта после дня развития и состоит из 3 слоёв;

– СК, полученные как из внутреннего слоя (амниотические эпителиальные клетки), так и наружного слоя (МСК амниотической оболочки) проявляют разнообразную степень дифференцировочного потенциала;

– как эпителиальные, так и МСК амниотической оболочки имеют дозозависимый и контактзависимый иммуномодуляторный эффекты, что крайне важно при аллогенной тканевой инженерии.

5. СК из плаценты – охарактеризовано несколько популяций СК из плаценты;

– они экспрессируют маркеры плюрипотентности (SSEA-4, Oct-4, Stro-1, Tra1-81), типичные маркеры МСК и имеют широкий спектр дифференцировки;

– способны in vivo дифференцироваться в нейрональные и глиальные клетки, инсулин-позитивные клетки и гепатоциты, а также создавать клапанные структуры на носителях.

6. СК из пуповинной крови – становятся основной клеточной популяцией мультипотентных СК для терапевтического применения;

– большинство исследований сфокусировано на МСК и CD34+ гемопоэтических СК;

– представляют собой две популяции МСК, имеющих похожие маркеры, но разный потенциал дифференцировки.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнялась в рамках государственного контракта и была направлена на получение альтернативного источника СК для использования в последующем в восстановительной и реабилитационной медицине, в частности, у больных с хроническим повреждением миокарда. Мы выполняли работу со стволовыми клетками, полученными из менструальной крови (МенСК). Учитывая выраженную инвазивность способов и методов получения МенСК в настоящее время, нами было спроектирован и создан опытный образец устройства для сбора клеточных фракций из менструальной крови. В результате был получен патент № 93268 от 27 апреля 2010. Данное устройство позволяет неинвазивно получить клеточный материал для выделения в последующем при культуральных работах эндометриальных СК.

Работа была проведена на добровольных донорах. Доноры:

женщины от 20 до 30 лет, здоровые (без хронических заболеваний сердца, печени, почек и поджелудочной железы). Общее количество доноров составило 9 человек. Перед получением биологического материала кровь доноров проверяли на наличие антител к HIV-1, HIV-2, гепатиту В, гепатиту С, VDRL, вирусу папилломы и трипаносомам.

Анализ образцов проводили при помощи проточного цитометра FACScalibur (BD Biosciences) с программным обеспечением CellQuest.

Фенотип популяции СКЭ не изменился в процессе культивирования после 2,4 и 8 пассажей и оставался стабильным на всех пассажах. Фенотип популяции СКЭ был определён как CD11b-, CD14-, CD34-, CD45-, CD44+, CD79+, CD90+, CD105+.

В результате работ были получены убедительные данные о выраженной дифференцировке СК эндометрия в адипогенном, остеогенном, миогенном и, в частности, кардиомиогенном направлении. Эти данные свидетельствуют о высоком дифференцировочном потенциале СК эндометрия.

Используя методику иммуноцитохимического окрашивания с использованием антител, определяли наличие нестина, виментина, гладкомышечного альфа-актина в колониях СК эндометрия до 8 пассажа. Полученные результаты говорят о высокой экспрессии данных белков, что свидетельствует о направленной дифференцировке СК эндометрия в кардиомиогенном направлении и сохранении потенциала клеток.

В активно пролиферирующих культурах клеток есть риск возникновения анеуплоидий хромосом (изменения числа копий последовательностей ДНК). Это может привести к развитию мутации в клеточной популяции или трансформации клеток с нормальным фенотипом в раковые клетки. Наличие анеуплоидий проверяли методом сравнительной геномной гибридизации. Результаты компьютерного анализа реакции гибридизации тестируемой и контрольной ДНК с хромосомами метафазной пластинки периферийных лимфоцитов исключили возникновение числового нарушения хромосом в исследуемом образце.

Для подтверждения результатов исследования были выполнены работы на лабораторных животных. Цель исследования заключалась в оценке эффективности клеточного трансплантата СК эндометрия, индуцированных в кардиогенном направлении (СКЭ-К) при однократном введении в сердце через 30 суток после перенесённого острого инфаркта миокарда у самцов крыс CD для экспериментального обоснования применения этих клеток при восстановительном лечении травматических и дегенеративных заболеваний миокарда в клинической практике.

Смертность животных была одинаковой в группах после введения физиологического раствора или СКЭ-К (4 животных из 16 и 3 животных из 15, соответственно). Проявление внешних клинических признаков боли и дистресса у инфарктных животных отмечалось в меньшем количестве случаев ко 2-ой неделе после введения СКЭ-К по сравнению с контрольной группой (24% и 50%, соответственно). Значения массы тела и толерантность к физической нагрузке животных контрольной и опытной групп в ходе исследования достоверно не отличались.

После введения СКЭ-К клеток по сравнению с контрольной группой был отмечен более высокий уровень среднего АД (через 2 недели, 88 мм рт.ст и 79 мм рт.ст, соответственно) и ЧСС (через 4 недели, 265 уд/мин и 216 уд/мин), а также более высокое значение максимального давления в левом желудочке (136 мм рт.ст.

относительно 116 мм рт.ст.). Значения индексов контрактильности миокарда между группами, получавшими физиологический раствор или СКЭ-К, достоверно не отличались. Однако, скорость прироста давления в левом желудочке (+dp/dt) увеличивалась только после введения СКЭ-К по сравнению со значением до введения на 30-й день после инфаркта, что является косвенным фактом восстановления инотропной функции сердца.

Анализ ЭКГ показал, что через 2 недели после введения СКЭ-К по сравнению с контрольной группой увеличивалась амплитуда зубца Р, что связано, вероятно, с развитием лёгочной гипертензии, а через 4 недели наблюдалось уменьшение продолжительности зубца Т, что расценивалось как уменьшение зоны ишемии.

Флюоресцентно меченые СКЭ-К выявлялись в 49% в миокарде, в 47% – в селезёнке, в 3% – в печени, 1% – в лёгких. Через 2 и 4 недели после трансплантации отмечали одинаковое распределение клеток в органах. В селезёнке, печени и лёгких СКЭ-К выявляли равномерно по всем органам, в сердце клетки локализовались только в области рубцовой ткани, не входили в состав стенок кровеносных сосудов, соединительной ткани, и обнаруживались в непосредственной близости от кардиомиоцитов перифокальной зоны или нормального миокарда. Трансплантация клеток не приводила к уменьшению размера рубца, не изменяла скорость и степень ремоделирования левого желудочка, но приводила к утолщению стенки сердца в области рубца (48,9% относительно 37,2% через 2 недели и 29,5% относительно 27,0% через 4 недели после введения).

В печени, легких и селезёнке были выявлены умеренные морфологические признаки застойной сердечной недостаточности, которые можно рассматривать как реактивные, в рамках постинфарктного кардиосклероза. Других патологических признаков, очагов воспаления, очагов фиброза, образования оссификатов или опухолевых образований в исследованных органах выявлено не было.

Можно утверждать, что трансплантированные СКЭ-К мигрировали и выживали в исследуемых органах в течение одного месяца, не дифференцировались в клетки кровеносных сосудов и, предположительно, дифференцировались в кардиомиоциты и фибробласты, и участвуя в формировании рубца.

Таким образом, результаты данного исследования с использованием крысиной модели постинфарктного кардиосклероза демонстрируют, что метод трансвентрикулярной интракоронарной трансплантации СК эндометрия, индуцированных в кардиогенном направлении является эффективным, обеспечивает доставку клеток в область повреждения. Трансплантированные клетки предположительно дифференцируются в кардиомиоциты, фибробласты и участвуют в формировании рубца в зоне инфарктного повреждения миокарда; при этом наблюдается улучшение функциональных показателей сердечно-сосудистой системы. Однократное интракоронарное введение СКЭ-К клеток крысам CD в дозе 25 млн. кл/кг не вызывает патологических изменений гистоструктуры печени, легких и селезёнки.

В результате работы разработан пошаговый протокол криоконсервации полученных культур СК эндометрия. Разработан оптимальный алгоритм криоконсервации, позволяющий максимально сохранить жизнеспособность клеток.

Произведена оценка свойств СКЭ после реконсервации по разработанному протоколу криоконсервации. Было получены результаты сохранения жизнеспособности выше 95%, что говорит о качественном алгоритме криоконсервации культур клеток.

На основании полученных данных была произведена разработка технологического регламента по культивированию и получению клеток направленной дифференцировки из СКЭ. Пошаговый протокол позволяет воспроизвести полученные результаты в направленной дифференцировке СК эндометрия.

Данная работа была выполнена в рамках государственного контракта № 02.512.12.2058 от 22 мая 2009 года.

КЛЕТОЧНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ ПРИ СЕРДЕЧНОСОСУДИСТЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ

Результаты применения клеточных технологий при кардиомиопатиях. Данная группа пациентов составили 13 человек, из них 9 человек – основная группа и 4 человека – контрольная. Средний возраст пациентов составил 35±9 лет. В основной группе было 7 мужчин и 2 женщины, в контрольной – женщина и 3 мужчин. У всех больных заболевание возникло после вирусной инфекции. Критерии включения:

– связь заболевания с вирусной инфекцией;

– фракция выброса (ФВ) менее 35 по данным Эхо-КГ;

– отсутствие онкологических и аутоиммунных заболеваний;

– добровольное согласие.

В данной группе пациентов под контролем витальных показателей, клетки вводились системно, после установки внутривенного катетера размером 20G в кубитальную вену. Повторное введение клеток выполнялось через 30±3 дней.

Учитывая характер и тяжесть заболевания, мы использовали только фетальные клетки, которые являются более эффективными по сравнению с аутологичными. Достаточно молодой возраст и тяжёлая патология не внушали оптимизма от использования аутологичных клеток, что явилось доводом для применения только фетальных клеток. По причинам тяжести заболевания и повторности выполнения процедуры решено было отказаться от других способов введения клеток: интракоронарного, интрамиокардиального и эндокардиального, остановившись на самом минимально травматичном методе введения. Процедуры, как первичные, так и вторичные, все пациенты, перенесли без особенностей. Осложнений не выявлено. Диагностика проводилась с использованием инструментария и приборов, которые имеются практически во всех стационарах. В частности, на контрольных точках до введения (Р0) через 1(Р1), 3(Р2) и 6(Р3) месяцев выполнялись исследование биохимических показателей крови, общие анализы крови и мочи, Эхо-КГ, нагрузочные пробы, опрос по стандартизированным европейским опросникам.

Достоверно значимых изменений в общих анализах крови и мочи не выявлено. В биохимических показателях отмечено уменьшение белков воспаления, в частности С-реактивного белка. Результаты Эхо-КГ показали достоверное увеличение фракции выброса (ФВ) от 5 до 12 абсолютных единиц, что составило в относительных единицах улучшение сократительной функции сердца до 43%. У некоторых пациентов отмечено уменьшение размеров сердца, оцениваемое по Эхо-КГ, хотя об этом говорить с достоверностью из-за небольшого количества наблюдений мы не можем. Те не менее, остаётся факт, что тонус сердечной мышцы, за счёт которого увеличивается ФВ, возрастает. К 3-ем месяцам увеличилась устойчивость к физической нагрузке и её продолжительности. К 6 месяцу ни у одного из пациентов основной группы ухудшения состояния не зафиксировано. Дополнительных госпитализаций не потребовалось. Результаты опросников представлены в табл. 1.

Результаты показателей обследования основной группы Показатели Р0 37,52/38,85 0,401/40 34,37/59,32 0,508/ Р1 44,04/60,10 0,437/45 34,37/59,32 0,508/ Р2 47,58/69,60 0,508/56 34,37/59,32 0,508/ Р3 46,77/66,08 0,508/55 34,37/59,32 0,508/ Примечание: Здесь и далее SF36 – опросник; EQ-5 – опросник; РН-оценка физического компонента здоровья; МН-оценка психологического компонента здоровья. Контрольные точки Р0-до введения клеток, Р1-через месяц после введения клеток, Р2-через 3 месяца, Р3-через 6 месяцев после введения клеток.

Механизмы коррекции патофизиологических нарушений при кардиомиопатиях при помощи клеточных технологий вытекают из особенностей повреждения миокарда. В частности, вирусная инфекция приводит к тяжёлым поражениям сердца.

Естественно, что самостоятельно вирус вызвать поражение миокарда может в редких случаях, как правило, при совокупности многих факторов, среди которых можно выделить генетические особенности. В развёрнутых стадиях сердечная недостаточность приводит к ухудшению качества жизни пациента с тяжёлыми ограничениями ежедневной активности пациента и высокими затратами на лечение. Патофизиологическая основа сердечной недостаточности – гибель кардиомиоцитов, которая приводит к недостаточной насосной функции сердца. В терминальных стадиях сердечной недостаточности обычно требуется более радикальное лечение – трансплантация сердца, которая в настоящее время в России сведена практически к нулю по многим причинам, в частности законодательной и экономической. При такой ситуации клеточные технологии (КТ) являются обнадёживающей возможностью продления и, самое важное, изменения качества жизни пациентов.

Преимуществом вводимых нами клеток являлась их гетерогенность, т.е. в своём составе они содержали не только гемопоэтические прогениторы, но также и мезенхимальные. Таким образом, нам удалось одномоментно воздействовать практически на все звенья восстановления сократительной способности миокарда. Поступление в кровь реципиента большого количества «свежих» цитокинов запускает целый каскад реакций, что приводит к увеличению выживаемости кардиомиоцитов реципиента и, соответственно, к улучшению сократительной функции миокарда. Каскад реакций заключается в а) уменьшении оксидативного стресса, б) увеличении экспрессии паракринных факторов в) увеличении экспрессии антиапоптозных факторов и г) ангиогенных факторов.

4.2. Направления клеточной терапии в кардиологии В последние десятилетия концепция восстановления миокарда очень быстро перешла от лабораторных разработок и научных изысканий в клинику для проведения клинических исследований. Проведённый анализ данных исследований подтверждает, что применение КТ приводит к улучшению фракции выброса левого желудочка (Иванов Д.В., 2009; Abdel-Latif A. et al., 2007; Lipinski M.J. et al., 2007). Первичная цель всех исследований при использовании стволовых и прогениторных клеток была в улучшении функций миокарда и уменьшение повреждённой, рубцово-изменённой ткани миокарда жизнеспособными кардиомиоцитами. Наиболее вероятно, что успех клеточной терапии при ишемизированном миокарде связан с паракринными и проангиогенными эффектами введённых клеток (Wollert K.C., Drexler H., 2005; Dimmeler S. et al., 2008). Продолжается поиск оптимального пути введения клеток, дозировки, отбор пациентов для применения клеточных технологий, а также идентификация новых более эффективных клеточных популяций. Рассмотрим возможные направления дальнейших исследований.

Несколькими независимыми группами исследователей было обнаружено присутствие небольшого кластера клеток Sca-1+, c-Kit+ и клеток SP (side population)+ в предсердии и верхушке сердца. Данную группу сердца назвали собственные СК сердца (ССКС), и они наиболее часто обнаруживаются во время первых двух недель постнатального периода, который исчисляется сразу после родов. Доказано, что асимметричное деление ССКС приводит к появлению новых кардиомиоцитов (Messina E. et al., 2004). ССКС обладают свойством самообновления. У взрослого человека данная группа клеток находится в состоянии покоя в своих нишах. При возникновении ишемии ткани миокарда ССКС активируются благодаря паракринным эффектам и начинают делиться. Как правило, в повседневной жизни объем повреждений при инфаркте миокарда и скорость повреждений таковы, что не удаётся компенсировать дефекты благодаря делению собственных СК сердца (Oh H. et al., 2003).

Экспериментальными работами доказано, что ССКС могут быть эффективно изолированы из миокарда с помощью чрескожной биопсии и благодаря культуральным работам размножены до количества необходимого для восстановления миокарда (Messina E. et al., 2004). Работы на экспериментальных животных показали улучшение сократимости, уменьшение размеров инфарктной зоны. В настоящее время имеется несколько клинических исследований, в которых оценили безопасность и эффективность использования ССКС у больных с ишемической кардиомиопатией (www.clinicaltrials.gov; NCT00474461, NCT00981006).

Данный вид клеток может быть введён интракоронарно в инфарктную зону или произведено непосредственное обкалывание СК малофункциональной, но жизнеспособной области миокарда (Smith R.R. et al., 2007).

4.2.2. Генетически обработанные прогениторные клетки Большое количество клинических исследований выполняется с использованием аутологичных клеток, полученных из костного мозга пациента. Данные исследования выполняются с использованием гетерогенной популяции клеток. Как правило, мононуклеарные клетки, полученные из костного мозга с помощью центрифугирования, содержат коммитированные клетки, небольшое количество прогениторных клеток и даже незначительное количество СК. Степень улучшения сократимости миокарда и улучшение перфузии поражённой области чрезвычайно разнообразно и скорее всего клинические эффекты, полученные в исследованиях с использованием аутологичных костномозговых клеток зависят от функциональной способности и количества прогениторных и СК, которые удаётся получить от пациента (Wollert K.C., Drexler H., 2005; Wojakowski W. et al., 2007;

Dimmeler S. et al., 2008; Ratajczak M.Z. et al., 2008). Большая вариабельность результатов зависит от возраста пациента, длительности заболевания, тяжести болезни и многих других факторов. Многочисленными работами показано, что у пациентов с диабетом эндотелиальные прогениторы, полученные из их костного мозга, имеют более низкую функциональную способность по сравнению с клетками от пациентов без сахарного диабета. У пациентов с сахарным диабетом отмечено также незначительное количество циркулирующих плюрипотентных клеток. У пациентов с ишемической кардиомиопатией в костном мозге мало эндотелиальных прогениторных клеток и их миграционная способность резко ухудшена (Kissel C.K. et al., 2007; Wojakowski W.

et al., 2009). В других работах продемонстрировано укорочение теломер в прогениторных клетках, полученных из костного мозга и периферической крови у пациентов с поражением коронарных артерий (Spyridopoulos I. et al., 2008, 2009). В последнее время мнение, что введённые клетки вносят непосредственный вклад в восстановление миокарда, было изменено. Сейчас считается, что функциональное улучшение, полученное в клинических исследованиях, обусловлено косвенными паракринными эффектами введённых клеток. Возможность генетической обработки клеток представляется теперь наиболее возможной и может улучшить функциональные способности вводимых клеток, включая высвобождение клетками вазоактивных и протективных субстанций. Другое направление для генетической инженерии – усиление сигнальных путей, приводящее к улучшению клеточной выживаемости, хоуминга и приживаемости клеток (Penn M.S., Mangi A.A., 2008).

Одним из важных факторов для мобилизации прогениторных клеток и получения эффекта клеточной терапии является эндотелиальная синтаза оксида азота (eNOS), которая увеличивает миграционную способность клеток. Повышенная выработка или усиление eNOS улучшает миграцию СК, вызванную SCDF-1, который является основным хемокином, регулирующим мобилизацию клеток, хоуминг и приживление. Данная тактика усилила ангиогенез на лабораторных животных (Sasaki K.

et al., 2006; Kupatt C. et al., 2007). В клинике эта методика была апробирована в исследовании ENACT-AMI (расширенная ангиогенная клеточная терапия острого инфаркта миокарда), когда использовались эндотелиальные прогениторные клетки с повышенной выработкой eNOS. Клетки были выделены с помощью афереза и трансфецированны человеческим eNOS-геном. Были получены положительные результаты у пациентов с использованием генетически модифицированных клеток в виде улучшения фракции выброса левого желудочка после 6 месяцев (www.clinicaltrials.gov; NCT00936819).

4.2.3. Аллогенные костномозговые клетки К аллогенным клеткам относятся и фетальные клетки и клетки пуповинной крови. В данном разделе мы остановимся именно на аллогенных клетках из костного мозга донора. Функциональная недостаточность аутологичных клеток, полученных у пациентов с хронической сердечной недостаточностью может резко ограничить получение положительного результата, а генетическая модификация таких клеток не всегда возможна, поэтому необходим поиск способов решения. Одним из них является использование аллогенных клеток от здоровых доноров, содержащих МСК. В данном случае они являются лучшими, потому что они иммунопривилегированы и не отторгаются из-за высвобождения иммуномодулирующих факторов и ингибирования Тклеточной пролиферации. МСК составляют малую часть клеток костного мозга (0,001–0,01% клеток), однако они могут быть получены из жировой ткани. Самое важное, что они могут быть размножены in vitro и криоконсервированы (Pittenger M.F., Martin B.J., 2004; Pittenger M.F., 2008). Таким образом, у пациентов с острым повреждением миокарда или левожелудочковой недостаточностью появляется возможность дополнительного способа лечения, не дожидаясь результатов культивирования собственных клеток. На рынке даже появились клеточные продукты типа «Prochymal», которые проходят клинические испытания у пациентов с сердечной недостаточностью (www.clinicaltrials.gov;

NCT00877903). Потенциал мезенхимальных стромальных клеток, предифференцированных в кардиомиоцитарном направлении, продолжает исследоваться. Благодаря биоинженерии, МСК могут быть преобразованы для повышенной экспрессии факторов, которые увеличивают дифференцировку и приживаемость (Cheng Z. et al., 2008). Ещё одно направление потенциального интереса для аллогенной трансплантации – взрослые мультипотентные прогениторные клетки (MAPC) (Van’t Hof W. et al., 2007).

В костном мозге взрослого человека содержатся популяции клеток, которые могут вносить свой вклад в восстановление миокарда и эндотелия. Так же в костном мозге находиться небольшая популяция негемопоэтических клеток, которые демонстрируют морфологические и функциональные свойства эмбриональных плюрипотентных СК (PSC). Маленький размер (3m), наличие PSC маркеров, чёткие морфологические признаки (открытый хроматин, большое ядро, узкая оправа цитоплазмой с множественными митохондриями) и способность дифференцироваться в 3 зародышевых листка – позволило назвать данные клетки «очень маленькими эмбрионально-подобными стволовыми клетками» (VSELs-клетки) (Kucia M. et al., 2006, 2008; Wojakowski W. et al., 2007). Предполагается, что VSELsклетки происходят из СК эпибласта и формируют пул покоящихся PSC, находящихся в костном мозге, сердце и других органах во время раннего органогенеза (Ratajczak M.Z. et al., 2007).

Присутствие VSELs-клеток было обнаружено в пуповинной крови и периферической крови взрослых (Ratajczak M.Z. et al., 2008, 2009). Во время острого инфаркта миокарда и экспериментального инфаркта миокарда у мышей отмечается быстрая мобилизация VSELs-клеток из костного мозга в периферическую кровь.

На циркулирующих VSELs-клетках найдены плюрипотентные маркеры, такие как ранний кардиальный и эндотелиальный транскрипционный факторы (Wojakowski W. et al., 2009). Эти находки подтверждают, что циркулирующие VSELs-клетки из костного мозга могут быть важным механизмом в восстановлении миокарда. На экспериментальных моделях острого инфаркта миокарда у мышей прямое интрамиокардиальное введение VSELs-клеток улучшило общую и региональную сократимость левого желудочка и уменьшило гипертрофию миокарда, причем удалось это сделать небольшим количеством клеток (Dawn B. et al., 2008).

4.2.5. Преднаправленные мезенхимальные Плюрипотентные и мультипотентные клетки могут дифференцироваться в различные клеточные линии. Данная предпосылка обусловила идею подготовки клеток факторами, которые имеют характеристики раннего эмбрионального развития сердца для направления их дифференцировочного потенциала в кардиальном направлении. Эти сигнальные факторы были идентифицированы с помощью сравнительного геномного и протеомического анализа, осуществлённого на эндодермальном секретоме, который в паракринной манере управлял унипотентными кардиомиоцитами коммитированными из ЭСК (Faustino R.S. et al., 2008;

Behfar A. et al., 2008; Arrell D.K. et al., 2008). Это новое направление в настоящее время проходит клиническое испытание на и 3 фазах. В исследование включены 240 пациентов со 2–3 классом сердечной недостаточности по NYHA, с фракцией выброса, сниженной до 15–40% и наличием в анамнезе инфаркта миокарда.

Пациентам вводились аутологичные МСК из костного мозга, обработанные с помощью сигнальных факторов в виде «кардиомиогенного коктейля». Введение осуществлялось в дисфункциональный, но жизнеспособный миокард с использованием NOGA системы. Исследование продолжается. (www.clinicaltrials.gov; NCT00810238).

4.2.6. Индуцированные плюрипотентные СК Индуцированные плюрипотентные СК (iPS) это плюрипотентные клетки, полученные с помощью преобразования взрослых соматических клеток, например фибробластов, с помощью повышенной экспрессии репрограмированных факторов, которые связаны с генами СК, таких как Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc (Yamanaka S., 2007). Такое эпигенетическое репрограммирование приводит к изменению фенотипа взрослых клеток, что делает их схожими с эмбриональными СК, в частности по присутствию раннего эмбрионального маркера (SSEA-1) и способностью генерировать клетки из всех зародышевых листков у химерных животных после введения при ранней стадии эмбриогенеза. В отличие от ЭСК, использование индуцированных плюрипотентных клеток не несёт этических проблем, так как они генетически идентичны донору (Yamanaka S., 2007). Исследования показали, что iPS клетки эффективно дифференцируются в линии клеток сердца, что проявляется в экспрессии ранних кардиальных маркеров. Экспрессия маркеров возникает из-за кардиальной структуры протеинов, которая приводит к формированию спонтанно сокращающихся кардиомиоцитов, связывающих разорванные между кардиомиоцитами связи. По некоторым физиологическим характеристикам кардиомиоциты, полученные из iPS клеток не отличаются от кардиомиоцитов, полученных из ЭСК, но имеются некоторые различия в электрофизиологических характеристиках (Martinez-Fernandez A. et al., 2009). Уже проведены работы по использованию iPS клеток для регенерации миокарда на мышиных моделях острого инфаркта миокарда. При введении интрамиокардиально 2х105 iPS клеток они стабильно прижились и не отторгались в течении месяца в миокарде иммунокомпетентных реципиентов. Отмечено достоверное улучшение сократимости левого желудочка и увеличение толщины стенки желудочка. Гистологические данные подтвердили, что iPS клетки участвовали в регенерации миокарда, эндотелия и уменьшали фиброз (Nelson T.J. et al., 2009). Можно смело говорить, что создание индуцированных плюрипотентных клеток открыло новый виток научных исследований в изучении регенерации миокарда. Сейчас исследования направлены на изучение способности iPS клеток формировать клетки предсердий, желудочка и проводящей системы (Gersh B.J. et al., 2009). До прихода этих идей в клинику достаточно далеко, потому что необходимо изучить отдалённые результаты на лабораторных животных.

Отражённые в данной главе новые направления в развитии клеточных популяций, которые будут стремиться в клинику, докажут свою эффективность и жизнеспособность со временем.

В настоящее время в клинике продолжают совершенствоваться и отрабатываться уже апробированные методы и способы. Выводы о жизнеспособности того или иного вида клеточной популяции будет делать каждый специалист, основываясь на своём опыте или полученных знаниях.

КЛЕТОЧНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ ПРИ

ПОРАЖЕНИИ ПЕЧЕНИ

5.1. Клеточные технологии при вирусном поражении печени Мы акцентировали своё внимание на применении КТ у больных вирусным гепатитом В и С. Специально выбраны именно эти две формы, так как вирус гепатит А очень редко (менее 2% случаев) переходит в хроническую форму и вызывает цирротические изменения в печени. Вирус гепатита Д, как правило, идёт совместно с ХГБ. Встречаемость вируса гепатита Е в настоящее время крайне мала. Учитывая, что вирусы гепатита имеют внепеченочные источники локализации, мы не использовали у пациентов аутологичные клетки и применяли только аллогенные клетки. В качестве аллогенных клеток использовались фетальные клетки. Материалом для получения клеток служила фетальная печень 2-го триместра гестации. Весь клеточный материал проходил проверку для исключения вирусной, бактериологической и микологической контаминации. В дальнейшем клеточный материал криоконсервировался. Непосредственно перед введением клетки размораживали и проверяли жизнеспособность, которая составляла не менее 92%. В исследование были включены пациенты, которые не могли пройти полностью курс лечения пегилированными интерферонами и прервали его из-за осложнений (депрессии, лейкопении, диспепсии, аритмии).

В группе было 25 человек, из которых 5 человек (2 женщины и 3 мужчины) – контрольная группа, и 20 человек, из которых 18 мужчин и 2 женщины, – основная. Распределение пациентов по группам представлено в табл. 2.

Возраст в основной группе составил 43,2±5,6 лет. В анамнезе у каждого из основной группы было не менее 2 попыток проведения курса лечения пегилированными интерферонами.

Большинство пациентов (n=15) с хроническим гепатитом С (ХГС). Большинство пациентов вируса гепатита С было с подтипом 3b, 5 пациентов – с подтипом вируса 1а.

Распределение пациентов по группам Примечание: 1a – генотип вируса С; 3b- генотип вируса С Клетки вводили системно после установки внутривенного катетера размером 20G. Во время процедуры введения проводился постоянный мониторинг витальных функций. Осложнений во время введения и в периоде наблюдения не выявлено.

Все пациенты процедуры перенесли без особенностей. Перед введением клетки реконсервировались и в асептических условиях подготавливались. Клетки вводились минимум за месяц до начала курса противовирусной терапии.

Результаты оценивали ежемесячно. Данные представлены в табл. 3.

Результаты выполнения биопсии печени представлены в табл. 4. Оценка результатов проводилась по методике Knodell.

Количество пациентов, которые дали согласие на проведение биопсии – 7 человек.

Все пациенты смогли пройти курс противовирусной терапии. Отмены препаратов не понадобилось. Пациентами отмечено, что курс противовирусной терапии перенесли намного лучше, чем попытки предыдущих курсов. У пациентов с вирусом гепатита С 3b после завершения курса противовирусной терапии в периферической крови при повторных исследованиях вирус не обнаруживался, что позволило считать их излечившимися. Данные по обнаружению вирусов в крови пациентов представлены в табл. 5.

Динамика изменения лабораторных показателей у больных с показатели АлАТ 123±23,5 126±13,5 83±3,5 86,3±6,5 102±21,1 96,9±3,5 87,1±6,5 102,7±13, АсАТ 148±13,4 159±14,8 82±23,5 110±22,1 106±17,3 125,7±13,7 100±3,6 109±3, Эритроциты 4,5±0,5 4,2±0,4 4,2±1,1 4,5±0,9 4,1±0,3 4,1±0,1 4,2±0,3 4,5±0, Лейкоциты 4,1±0,4 4,5±0,5 5,9±3,5 3,2±0,2 5±1,3 2,9±0,2 3,9±0,3 3,8±0, Тромбоциты 170±22,6 173±23,7 147±22,2 152±16,6 126±19,3 120±11,5 115±9,9 121±7, МНО 1,2±0,1 1,3±23,5 1,2±23,5 1,4±23,5 1,5±23,5 1,5±23,5 1,4±23,5 1,4±0, Примечание: Р0 – до введения клеток; Р1 – начало противовирусной терапии, через месяц после введения клеток; Р2 – 2 месяца; Р3 – 3 месяца; Р4 – 4 месяца; Р5 – 5 месяцев;

Р6 – 6месяцев; Р7 – через месяц после завершения курса противовирусной терапии.

Результаты исследования биоптатов у больных с гепатитом В Примечание: * – оценка результатов проводилась по методике Knodell. Р – до введения клеток и начала терапии; Р1 – после завершения противовирусной терапии Динамика обнаружение маркеров гепатитов В и С Примечание: C1a, C3b – разновидности гепатита С. Р0 – до введения клеток; Р1 – через месяц после завершения курса противовирусной терапии.

У больных с вирусным гепатитом С генотип 1а – положительного результата удалось достигнуть у 50%. В ситуации с гепатитом В, который, как правило, протекал совместно с гепатитом Д излечения не достигнуто. Однако отмечено выраженное уменьшение синдрома цитолиза.

5.2. Клеточные технологии при невирусном Определена группа пациентов с токсическим поражением печени вследствие злоупотребления алкоголем. Наследственные поражения, поражения тяжёлыми металлами или лекарственными препаратами – исключились.

В данной группе исследовались 15 человек, из которых 12 – основная группа, и 3 – контрольная группа (табл. 6). У всех обследуемых отмечалось хроническое поражение печени после длительного злоупотребления алкоголем (стаж не менее 3 лет).

Возраст пациентов 52,3±4,1 года. Основное требование по включению в группу – прекращение употребления алкоголя.

Противопоказаний для проведения лечения с применением КТ не выявлено.

Распределение пациентов по группам Пациентам основной группы проводилось однократное введение аллогенных (фетальных) клеток в дозе 100 млн. Введение проводилось системное (внутривенное) под контролем основных витальных функций.

Все обследуемые основной и контрольной группы проходили стандартное обследование на контрольных точках: до введения (Р0), через 1(Р1), 3(Р2) и 6(Р3) месяцев после введения клеток. Все пациенты основной группы дали письменное согласие на проведение клеточных технологий. На биопсию печени дали согласие только 2 пациента (1 – контрольной и 1 – основной группы). Основные показатели которые контролировались на контрольных точках: АсАТ, АлАТ, ГГТП, ХЭ, билирубин, общий анализ крови, УЗИ печени (Р0 и через 6 месяцев), опросники (SF-36, EQ-5). Динамика изменений лабораторных показателей представлена в табл. 7. Изменения в оценке качества жизни по результатам опросников представлены в табл. 8.

Динамика изменения лабораторных показателей у пациентов основной и контрольной групп Примечание: Осн-основная группа; Кон-контрольная группа.

Динамика изменений по опросникам SF-36, EQ- Группа опросник SF36(РН/МН) 40,53/47,16 46,34/72,08 56,77/67,51 56,77/67, Основная Контроль- SF36(РН/МН) 40,53/47,16 45,83/49,20 46,35/56,86 46,35/56, Все пациенты получали стандартное лечение, включающее элиминацию этиологического фактора, высокоэнергетическую диету с большим содержанием белка, эссенциальные фосфолипиды, витамины группы В. На препаратах, полученных при биопсии – гистологические изменения, соответствующие воспалению в отсутствие признаков цирротической трансформации.

При анализе лабораторных и инструментальных данных, а также данных контрольных осмотров и опросников, мы выяснили, что не все пациенты прекратили потребление алкоголя. Наиболее чётко это проявлялось в контрольной группе.

Использование клеточных технологий в комплексном лечении пациентов с вирусным поражением печени обусловлено следующими механизмами:

1. Восстановление гепатоцитов. Длительно существующее инфицирование вирусом гепатоцитов неминуемо приводит их к гибели и выходу вируса в кровь и внедрение в новые клетки. Повреждённые клетки заменяются новыми или соединительной тканью. Вводимая суспензия аллогенных (фетальных) клеток содержит печёночные прогениторы, которые стимулируют образование и дифференциацию клеток от овальных через гепатоциты 1 порядка ко 2-ому и полностью дифференцированным гепатоцитам 3-го порядка.

2. Усиление выработки интерферонов. Интерфероны вырабатываются при повреждении клетки вирусом. Это защитный механизм. Подразделяются на,, . Интерферон- ключевой компонент среди семейства интерферонов в клеточной защите против ХГС, и также благодаря паракринному эффекту ограничивает распространение вируса от клетки к клетке (Gale Jr. M., Foy E.M., 2005), начинает определяться через 2 недели после инфицирования и держится в течение 2 месяцев после появления (Lazaro С.А. et al., 2007).

3. Стимуляция иммунной системы. Происходит через опосредованные эффекты. В гетерогенной суспензии находятся гемопоэтические СК. Известно, что печень на данных сроках развития выполняет кроветворную и иммунную функцию. Данные клетки стимулируют активизацию внутренних макрофагов печени. Важную роль в данном процессе играют «натуральные киллеры» (НК), особенно против гепатотропного вируса С. Эти клетки запускают цитолитическую функцию вирус-специфичных Т-клеток благодаря продукции интерферона, однако могут также напрямую вызывать апоптоз в инфицированных гепатоцитах. НК вызывают супрессию рибонуклеиновой кислоты вируса гепатита С, содержащегося в гепатоцитах. Уже имеются подтверждения, что персистенция вируса гепатита С может быть связана именно с неадекватным ответом НК на вирус гепатита С как в крови, так и в самой печени. В данном случае успех после применения интерферонов у больных с хроническим гепатитом С связывается с активизацией НК.

4. Депонирование в нишах СК. Сохранение в нишах прогениторных клеток, присутствующих в суспензии, позволяет пациентам перенести курс тяжёлой противовирусной терапии. Повидимому, клетки постепенно выходят в кроветворное русло и запускаются в работу.

5. Каскад ауто и паракринных эффектов. При запуске данного механизма идёт активная борьба между отложением нитей фибрина и резорбцией нитей коллагена. В данном механизме активное участие принимают клетки Ито (звездчатые), а также матриксные металлопротеиназы. Активно участвуют цитокины и ростовые факторы.

При токсическом поражении печени, в частности, алкоголем, проводимая лекарственная терапия принесла свой положительный эффект и, возможно, важным фактором в восстановлении основных функций печени была элиминация токсического агента. Однако достоверно отмечено, что скорость наступления положительных эффектов и их выраженность превалировала именно в основной группе, где вводились ФК. По нашему мнению, данный эффект связан со стимуляцией процессов восстановления печени цитокинами и ростовыми факторами, которые в большом количестве присутствуют в клеточной суспензии, полученной из фетальной печени. Наибольшую роль в данной процессе играют несколько ростовых факторов, в частности фактор роста гепатоцитов (HGF), преобразовывающий фактор роста альфа (TGF), гепарин связывающий эпидермальный фактор роста (HB-EGF). HGF и TGF являются стимуляторами роста гепатоцитов в культуре, HGF продуцируется непаренхиматозными клетками в печени и воздействует на гепатоциты с помощью паракринных и эндокринных механизмов (Peddiaditakis P. et al., 2001). TGF и HB-EGF относятся к семейству эпидермальных ростовых факторов и воздействуют через рецепторы на окислительное фосфорилирование, что приводит к репликации ДНК. TGF продуцируется гепатоцитами и осуществляет функционирование через аутокринный механизм, так как гепатоциты продуцируют лиганды и содержат подходящие рецепторы для связывания (Mead J.E., Fausto N., 1989). HB-EGF связывает начало и прогрессию регенерации печени (Mitchell C.

et al., 2004). Получается, что эти три фактора роста оказывают уникальное воздействие на репликацию и выживаемость гепатоцитов, а также необходимы для оптимальной регенерации.

На фоне восстановления функциональных свойств клеток печени снижается токсическое действие аммиака, меркаптанов и ароматических аминокислот. На фоне снижения интоксикации улучшается психоэмоциональный фон, повышается физическая активность, что отражается на самостоятельной оценке пациентов своего здоровья выполненной с помощью специализированных опросников.

КЛЕТОЧНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ И ПОВРЕЖДЕНИЕ

НЕРВНОЙ ТКАНИ

Результатом повреждения спинного мозга является разрушение нервной ткани и, как следствие, утеря моторной и сенсорной функции. В настоящее время не имеется абсолютных методов восстановления повреждённой нервной ткани и сохранение функций зависит от степени ее повреждения. Надежды, возлагаемые на СК и прогениторные клетки, связаны со свойством данных клеток поддерживать восстановление повреждённой нервной ткани. Это подтверждено на экспериментальных моделях с повреждением спинного мозга. Разрабатываются технологии по направленной дифференцировке СК и прогениторных клеток в нейрональном и глиальном направлениях для последующего замещения повреждённой ткани. Опосредованный косвенный эффект на восстановление нервной ткани связывают с нейропротективным и аксонрегенерирующим действием трансплантированных клеток.

Во время эмбриогенеза СК пролиферируют, мигрируют и формируют организм. Во взрослом организме СК присутствуют во многих местах, и нервной системе, в частности (Altman J., 1962; The Boulder Committee, 1970; Graziadei P.P., Monti Graziadei G.A., 1980; Rakic P., 1985; McKay J.S. et al., 1997). Находясь в нервной ткани, они могут дифференцироваться в нейроны (Eriksson P.S. et al., 1998). С момента идентификации и характеристики СК их потенциал стал чрезвычайно перспективен для исследования возможности лечения повреждений спинного и головного мозга, а также дегенеративных поражений головного мозга (Snyder E.Y., 1992; Fisher L.J., Gage F.H., 1993; Snyder E.Y., Macklis J.D., 1995; Brstle O., 1999; Polak J.M., Bishop A.E., 2006).

Итак, СК определяются, благодаря их способности самообновляться и тотипотентности. Самообновление характеризуется способностью подвергаться асимметричному делению, в результате которого одна клетка остаётся стволовой, причём без признаков «старения», а вторая клетка начинает дифференцироваться в одном из направлений развития зародышевых листков.

Отметим, что СК долгое время могут находиться в «покоящемся» состоянии. Направление дифференцировки следующее: тоти–плюри–мульти–унипотентные клетки, что соответствует уменьшению дифференцировочного потенциала клеток. Плюрипотентные клетки дифференцируются в мультипотентные клетки 3 зародышевых листков. Это эктодермальный слой, из которого происходит нервная ткань, мезодермальный слой (соединительная ткань, мышцы, кости, клетки крови) и эндодермальный слой (желудочно-кишечный тракт и внутренние железистые органы).

После повреждения спинного мозга включаются эндогенные процессы восстановления, свидетельствующие о том, что нервная ткань предпринимает попытки самостоятельной репарации. Шванновские клетки, отвечающие за миелинизацию и регенерацию в периферической нервной системе, начинают мигрировать из корешков спинного мозга в повреждённую ткань и обеспечивать процессы миелинизации аксонов спинного мозга (Franklin R.J., Blakemore W.F., 1993; Takami T. et al., 2002).

В повреждённых нейронах увеличивается экспрессия генов связанных с регенерацией (Martens D.J. et al., 2002; Gardiner P. et al., 2005). Сразу же местно проявляется залповый выброс пролиферирующих взрослых стволовых и прогениторных клеток (Martens D.J. et al., 2002; Mothe A.J., Tator C.H., 2005; Ke Y. et al., 2006). Однако, рост аксонов ограничен ингибиторами роста, находящимися в олигоденроцитном миелиновом дебрисе и клетках, которые участвуют в формировании рубцовой ткани (Silver J., Millet J.H., 2004; Galtrey C.M. et al., 2007; Tian D.S. et al., 2007).

Вновь появившиеся СК и прогениторные клетки функционально не интегрируются в повреждённую ткань спинного мозга. Таким образом, эндогенные регенераторные силы, которые проявляются сразу после повреждения, не достаточны для восстановления повреждённого спинного мозга. Улучшение функционального исхода после повреждения спинного мозга может быть активировано с помощью нейропротективных мероприятий, которые будут ограничивать вторичные потери нервной ткани и, таким образом, уменьшать потерю функциональных свойств. Как альтернатива, функциональное восстановление может быть активировано методами ускоряющими рост аксонов, которые в результате приводят к репарации повреждённых и/или формированию новых аксоновых связей, которые в свою очередь становятся вовлечёнными в передачу сигналов и соответственно восстановлению функциональных свойств. Хотя имеется некоторая неопределённость в отношении того, что стволовые и нейрональные прогениторные клетки могут стать неоценимым компонентом в стратегии восстановления повреждённого спинного мозга. Эти клетки могут становиться нервными клетками, которые уже в свою очередь могут поддерживать анатомическое или функциональное восстановление. Как вариант, они могут секретировать ростовые факторы, которые поддерживают нейропротективное действие и/или регенерацию аксонов. Потенциал СК или прогениторных клеток в восстановлении повреждённого спинного мозга сейчас активно изучается (Teng Y.D. et al., 2006; Coutts M., Keirstead H.S., 2008; Hardy S.A. et al., 2008). Стали понятны также и недостатки СК и прогениторных клеток (Chen C.P. et al., 2007; Zietlow R. et al., 2008). В последнее десятилетие СК изучались без включения чётких критериев СК как таковых, т.е. их чёткой идентификации. Следовательно, терапевтический потенциал истинных стволовых/прогениторных клеток все ещё не ясен. Другие аспекты, связанные с использованием стволовых/прогениторных клеток для восстановления повреждённого спинного мозга, необходимо решить до начала широкого клинического применения в практике. Это вопросы получения клеток. Как клетки могут быть получены? Действительно так ли уж необходимо их дифференцировать в лабораторных условиях до введения пациенту? Как могут выжить пересаженные стволовые/прогениторные клетки? Каким образом избежать неконтролируемого деления и дифференцировки (Keirstead H.S. et al., 2005)? Вопросы улучшения функциональной интеграции трансплантированных клеток также остаются открытыми.

6.1. Механизмы воздействия на повреждённую 1. Замещение погибших клеток в повреждённом спинном мозге.

Принимая во внимание способность СК становиться любой клеткой организма, идея использовать их потенциал для стратегии замещения погибших клеток в повреждённом спинном мозге продолжает оставаться крайне интересной. В соответствующей комбинацией ростовых факторов («индукционный коктейль») ЭСК могут быть использованы для получения нейронов и глиальных клеток (Liu S. et al., 2000; Billon N. et al., 2006).

Данное утверждение было подтверждено на лабораторных моделях, когда нейроны, полученные из ЭСК, выживали и интегрировались после введения в повреждённый спинной мозг крыс (Deshpande D.M. et al., 2006). Было показано, что миелинизированные аксоны, полученные из мышиных ЭСК, приживались у породы миелин-дефицитных крыс (Brstle O., 1999). Имеются и другие работы, подтверждающие верность указанных выше предположений. В частности, у крыс с повреждённым нормальным (без генетических дефектов) спинным мозгом пересаженные мышиные клетки, полученные из ЭСК мышей, улучшали функциональное восстановление (McDonald J.W. et al., 1999).

Важно отметить, что клетки, полученные из ЭСК, были обнаружены в повреждённом спинном мозге и не погибли, подтверждая, что таким способом можно получить хорошие отдалённые результаты (Jendelova P. et al., 2004). Человеческие ЭСК могут быть направлены в мультипотентные нервные предшественники (Carpenter M.K. et al., 2001), моторные нейроны (Li X.J. et al., 2005; Lee H. et al., 2007) и олигоденроцитные прогениторные клетки (Keirstead H.S. et al., 2005; Nistor G.I. et al., 2005). Сейчас уже получены результаты дифференцировки в зрелые олигоденроциты in vitro и in vivо (Nistor G.I. et al., 2005). Более того, эти клетки способны миелинизировать аксоны после введения в спинной мозг у миелин-дефицитных (shiverer) мышей и взрослых крыс (Keirstead H.S. et al., 2005). Нейральные прогениторные клетки (т.е. мультипотентные клетки, из которых развивается центральная нервная система) очень часто агрегируют в нейросферы. Продемонстрировано, как нейральные прогениторные клетки, введённые в повреждённый спинной мозг у крыс, предпочтительно дифференцируются в астроциты. Эти результаты говорят о необходимости разработки дифференцировочного протокола до введения клеток (Cao Q.L. et al., 2002).

Интересно, что генетически модифицированные фетальные нервные предшественники активно экспрессируют белок noggin, который является антагонистом белка ВМР, дифференцируются предпочтительно в нейроны и олигодендроциты. Введение таких клеток в повреждённый спинной мозг мышей приводил в исходе к улучшению функционального исхода (Setoguchi T. et al., 2004). Однако, этот результат тем же самым методом не удалось воспроизвести другим исследователям (Enzmann G.U. et al., 2005). Человеческие нейральные прогениторные клетки, как правило, получают из эмбриона на стадии бластоцисты и затем в лабораторных условиях получают функциональные нейроны и глию (Nunes M.C. et al., 2003). После того как человеческие нейральные прогениторные клетки были введены в повреждённый спинной мозг крыс, некоторые из них были найдены дифференцированными в олигодендроциты. Более того, данные находки сопровождались улучшением функционального исхода (Cummings B.J., 2005, 2006).

МСК, полученные из костного мозга, также могут служить для терапевтических целей при восстановлении повреждённого спинного мозга (Nandoe Tewarie R.D., 2006; Parr A.M., 2007).

Хотя продолжаются дискуссии (Castro R.F., 2002), показано, что определённые группы взрослых СК легко дифференцируются в костные, жировые клетки, а также клетки сухожилий и хрящей (Pittenger M.F. et al., 1999). Уже давно опубликовано, что эти клетки спокойно могут трансдифференцироваться in vitro в клетки печени (Petersen B.E., 1999), клетки скелетной мускулатуры (Wakitani S., 1995; Ferrari G. et al., 1995), кардиомиоциты (Makino S., Fukuda K. et al., 1999; Orlic D. et al., 2001) и клетки центральной нервной системы (Brazelton T.R. et al., 2000; Mezey E.

et al., 2000; Sanchez-Ramos J. et al., 2000; Kohyama J. et al., 2001;

Saito T. et al., 2003). Все эти факты делают МСК, полученные из костного мозга, перспективными для применения в методиках восстановления повреждённого спинного мозга. Из многих направлений медицины, где используются МСК, можно привести большое количество примеров, но наиболее часто – при восстановлении миокарда после различного рода повреждений – инфаркта, миопатии (Иванов Д.В., 2009; Saito T. et al., 2003; Eisenberg C.A.

et al., 2006), нарушении мозгового кровообращения (Bang O.Y.

et al., 2005), нейродегенеративных заболеваний (Lee J. et al., 2003; Sugaya K., 2005).

2. Стратегия нейропротекции в лечении повреждений спинного мозга должна стоять на первых рубежах по предотвращению увеличения объёма дефекта нервной ткани для того, чтобы в последующем иметь оптимальный исход лечения поражений спинного мозга. Показано, что нейральные прогениторные клетки могут защищать от эндотоксинов (Lu P. et al., 2003;

Llado J. et al., 2004). Они также секретируют разнообразные молекулы, которые могут защитить клетки от механизмов апоптоза, которые усиливаются экзо и эндотоксинами (Lu P. et al., 2003). Таким образом, получается, что введение означенных клеток в повреждённый спинной мозг в действительности оказывает нейропротективный эффект. Костномозговые стромальные клетки показали усиление нейропротективного эффекта при введении в повреждённый спинной мозг у взрослых крыс за счёт выделения большого количества ростовых факторов (Labouyrie E. et al., 1999; Garca R. et al., 2004; Mahmood A. et al., 2004; Ye M. et al., 2005).

3. Ускорение регенерации аксонов вносит значительный вклад в восстановлении функций после повреждения спинного мозга. Способность нейральных прогениторных клеток секретировать разнообразные нейротрофические факторы свидетельствует о том, что они могут ускорять рост повреждённых аксонов (Lu P. et al., 2003; Llado J. et al., 2004). Взрослые нейральные прогениторы имеют свойства выделять субстраты для кортикоспинальной регенерации аксонов после повреждения спинного мозга (Pfeifer K. et al., 2004). У клеток, напоминающих стволовые, которые были получены из оболочек обонятельного нерва, есть способность предохранять аксоны от распознавания ингибирующими рост факторами, что позволяет аксонам расти в область, где нет ингибирующих факторов (Ramon-Cueto A., 2000;

Raisman G., Li Y., 2007).

В настоящее время идёт процесс перехода лабораторных разработок в клинику. Способствует данному процессу тот факт, что СК, полученные из костного мозга пациента, т.е. аутологичные, не имеет этических конфликтов? в отличие от использования СК, полученных из эмбриона. Напомним, что ЭСК отличаются от ФК сроком развития и, соответственно, получения. Тем не менее, по некоторым причинам, использование ЭСК очень часто предпочтительнее, чем использование собственных (аутологичных) клеток в лечении заболеваний. В США использование человеческих ЭСК для восстановления повреждений спинного мозга было предложено биотехнологической компанией Geron из штата Калифорния. Надо отметить, что это самый прогрессивный штат в легализации исследований в области развития КТ. Сейчас применение собственных СК для лечения повреждения спинного мозга происходит во многих странах мира (Mathews D.J. et al., 2008). К примеру, в Эквадоре выполнены исследования по трансплантации аутологичных СК, полученных из костного мозга у 25 пациентов с поражением спинного мозга.

Инвестором исследования выступала американская биотехнологическая компания из штата Калифорния PrimeCell Therapeutics.

По результатам проведённой работы были получены обнадёживающие данные, в частности, у пациентов отмечено улучшение ходьбы и чувственное восприятие. Этот результат внушает оптимизм, что преодоление этических барьеров в скором времени может быть успешным для клинического применения ЭСК (Baptiste D.C., Fehlings M.G., 2007).

Потенциал ЭСК чрезвычайно велик, так как они могут дифференцироваться более чем в 200 видов различных клеток нашего организма (Sell S., 2008) и, при определённых обстоятельствах, даже в целый организм (Nagy A. et al., 1993). Человеческие ЭСК получают из эмбриона на стадии бластоцисты (Thomson J.A. et al., 1998), а также с помощью трансфера соматического ядра (Bakken A.M., 2006; Ballen K.K. et al., 2006) или партеногенетической активации яйцеклетки (Cibelli J.B. et al., 2002; Vrana K.E. et al., 2003). Полученные ЭСК не подвергаются старению и сохраняют высокую теломеразную активность и нормальный клеточный сигнальный цикл, что и объясняет их высокую скорость пролиферации в культуре (Murry C.E., Keller G., 2008; Park Y.B. et al., 2008). Эти пластические характеристики делают ЭСК применимыми для стратегии восстановления повреждённого спинного мозга и нервной ткани. Однако, трансплантация ЭСК может вызывать тератомы из-за неконтролируемого роста, о чем уже имеются публикации (Ray S. et al., 2006; Nussbaum J. et al., 2007; Shiras A. et al., 2007). Также надо помнить, что ЭСК при культивировании могут подвергаться генным и эпигенетическим изменениям, ведущим к трансформации клеточной культуры, хотя последнее может быть предотвращено технологическими протоколами культивирования (Shiras A. et al., 2007). После введения ЭСК во взрослые ткани для предотвращения их отторжения может потребоваться иммуносупрессивная терапия (Nussbaum J. et al., 2007). Эти факторы резко ограничивают энтузиазм по широкому внедрению в клиническую практику использования ЭСК в лечении повреждения спинного мозга и нервной ткани, несмотря на тот факт, что ЭСК обладают самым могучим потенциалом и могли бы широко применяться в репаративных клеточных технологиях. Альтернативой ЭСК служат СК, полученные из тканей сразу после рождения. Например, нейральные прогениторные клетки, полученные из взрослого головного мозга (Lois C., Alvarez-Buylla A., 1993; Uchida N. et al., 2000) и спинного мозга (Mayer-Proschel M.

et al., 1997). Однако, надо заметить, что в данном способе получения большое количество нерешённых юридических и этических вопросов и, помимо этого, взрослые СК являются менее пластичными, чем ЭСК а скорость и частота их деления в культуре намного ниже по сравнению с ЭСК (Doetsch F. et al., 1999).

Также определено, что их дифференцировочный потенциал уменьшается во времени (Wright L.S. et al., 2006). Эти параметры делают их возможным, но крайне ограниченным альтернативным источником для ЭСК в лечении поражения спинного мозга и нервной ткани. Конечно, если посмотреть с другой стороны, то у данных клеток есть свои преимущества – они могут быть трансплантированы без иммуносупрессии и культура не будет иметь генетических отклонений. При введении взрослых СК полученных от пациента не возникает иммунного отторжения (Gorin N.C. et al., 2002). Также при культивировании у взрослых СК, как правило, не возникает генетических отклонений, т.е. они имеют высокую степень геномной стабильности (Vats A. et al., 2005) и после введения не проявляют туморогенную активность (Foroni C. et al., 2007). Ну и, наконец, имеется лишь незначительный круг морально-этических вопросов в отношении применения взрослых СК, так как они получатся от самого пациента. Это и является решающим моментом в использовании взрослых СК, нежели ЭСК, в восстановлении центральной нервной системы. Это в определённой степени верная стратегия если удастся решить проблемы с низкой пластичностью и пролиферативным потенциалом взрослых СК по сравнению с ЭСК.

Один из краеугольных вопросов, стоящих как непреодолимая стена в отношении использования ЭСК, – это «Где та временная точка когда эмбрион считается человеком?» (Goldenring J.M., 1985; Peterfy A., 1995; Robertson J.A., 1999). В соответствии с Романской Католической Церковью и другими религиозными институтами эмбрион «должен лечиться как живой человек»

(Roman Catholic Church, 1994). С этой точки зрения подразумевается, что бластоциста не может использоваться как источник клеток. Другие считают, что эмбрион является человеком только после 20 недели гестации (Goldenring J.M., 1985; Peterfy A., 1995), таким образом подразумевая, что клетки можно получать из бластоцисты. При данном взгляде подразумевается, что клетки могут быть получены из эмбриона, который был создан для искусственной фертилизации in vitro, но не использовался для поставленных целей. Другими словами он должен пройти процесс утилизации. Дискуссии на тему «жизнь», и когда «жизнь начинается», очень часто эксплуатируются для решения политических и религиозных вопросов. Продолжать дискутировать на эти темы могут только те люди, которые не встречались в своей семье с тяжёлыми болезнями, и не видели своих близких в неизлечимом состоянии. Нам, врачам, приходиться постоянно сталкиваться с вопросами жизни и смерти, и помощи пациентам. Поэтому, с нашей точки зрения долг врача помогать пациенту излечиваться от болезней или по крайней мере облегчать его страдания. Этот постулат не является призывом к неконтролируемым исследованиям. Наоборот, это призыв к врачам, чтобы они больше думали над тем, как помочь своему пациенту, и не поддаваться демагогическим сентенциям дилетантов от медицины.

В последние годы появился повышенный интерес к индуцированным плюрипотентным СК (на английской аббревиатуре «iPS»). Получают iPS с помощью репрограммирования дифференцированных клеток, таких как фибробласты, используя введения четырёх транскрипционных факторов OCT3/4 (октамерSOX2, KLF4 и MYC (Park I.H. et al., 2008; Takahashi K., Yamanaka S., 2006). Технология была подробно описана японскими учёными Takahashi и Yamanaka для мышиных фибробластов и теперь применяется для других мышиных клеток (Okita K. et al., 2007) и для человеческих соматических клеток (Yu J. et al., 2007). Из описанных выше четырёх транскрипционных факторов MYC и KLF4 могут быть спокойно заменены другими факторами (Yu J. et al., 2007). Механизмы, которые лежат в основе данной методики и приводят к репрограммированию, остаются до конца не изученными и весьма дискутабельными. В настоящее время все ещё не понятно насколько схожи iPS с настоящими ЭСК, и в какой области может быть получен схожий эффект и результат аналогичный применению ЭСК. Сейчас проводится сравнительное изучение генной экспрессии человеческих ЭСК и iPS (Lowry W.E. et al., 2008). Необходимо преодолеть несколько препятствий до того момента как iPS-клетки попадут в клинику.

Это – использование ретровирусного вектора для введения транскрипционного фактора, необходимость селекционных маркеров для идентификации репрограммированных клеток.

Хорошо известны онкогенные свойства MYC и интеграция ретровирусного вектора в геном. Эти необходимые требования для репрограммирования, но они изменяют клеточный геном и клеточную форму, что создаёт препятствие для терапевтического использования. Тем не менее, очевидно, что технологии с использованием iPS-клеток являются многообещающими с широкими перспективами в клинике без как либо моральноэтических проблем, которые сопровождают использование ЭСК.

СК содержат в себе колоссальный потенциал для восстановления повреждений спинного мозга и нервной системы, в частности, но понять широту это потенциала в настоящее время не представляется возможным. В тоже время КТ в лечении повреждений нервной системы сейчас находятся только на самом начальном этапе своего развития и, конечно, невозможно чисто гипотетически и теоретически оценить как отрицательные моменты в виде осложнений, так и положительные моменты в виде исцелений. Когда пациент становится инвалидом, или болезнь угрожает его жизни, то все сложившиеся морально-этические барьеры не должны стоять непреодолимой стеной перед врачами для помощи конкретному пациенту. Однако, надо понимать, что нельзя постоянно перешагивать через устоявшиеся морально-этические взгляды и грубо отрицать их. Необходимо, чтобы исследования и научные данные в области КТ шли намного быстрее и опережали демагогические дебаты на этические темы.

Следовательно, для продолжения дальнейших исследований в области использования СК и КТ для терапевтических целей в лечении больных с поражением спинного мозга и нервной системы, все вопросы, связанные с данным направлением, надо решать уже сейчас.

КЛЕТОЧНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ И ПОВРЕЖДЕНИЯ КОЖИ

Развитие тканевой инженерии кожи необходимо для дальнейшего широкого клинического применения в лечении кожных и системных заболеваний. В этом разделе мы рассматриваем использование эпидермальных СК как источника клеток для создания кожных трансплантатов. Применение СК, как основного материала для создания биокожи, имеет огромный потенциал, который позволит улучшить исходы болезней и лечение обширных раневых дефектов.

Проблемы в использование биокожи появилась после неудовлетворительных результатов лечения аутотрансплантатами, даже после успешного первоначального приживления (Meuli M., Raghunath М., 1997). Исследования показали, что успех создании биокожи зависит от выбора подходящей клеточной культуры, чтобы получить у пациента постоянную и функционирующую кожную ткань (Bianco P., Robey P.G., 2001). Долгосрочное функционирование пересаженной биокожи ограничено отсуствием достаточного количества эпидермальных СК, которые утрачиваются в результате культуральных работ. Решение вопроса о потере популяции СК во время культивирования матерала для биокожи – первостепенная задача для решения. Несколько исследований продемонстрировали преимущество прогениторных клеток над более дифференцированными кератиноцитами в создании биокожи кожи (Dunnwald M. et al., 2001; Pellegrini G. et al., 1999). Кератиноциты, выделяются благодаря специальной метке BrdU, от популяций СК и амплифицированных клеток, которые вместе с СК и в комбинации с I типом коллагена используются в создании биокожи. Обе популяции формируют эпидерму, но после 2 месяцев – только полученная из СК биокожа поддерживала нормальную эпидерму, в то время как эпидерма, сформированная из амплифицированных клеток, полностью дифференцировалась (Dunnwald M. et al., 2001).

Изучаются относительные вклады фолликулярных и межфолликулярных СК в поддержке эпидермиса и восстановлении раневой поверхности. Недавние исследования (Langton A.K. et al., 2008) направлены на изучение роли СК полученных из луковицы волосяного фолликула в заживлении раны кожи. В этих исследованиях была использована модель животных, у которых полностью отсутствует луковица волосяного фолликула и не формируется первичная волосяная плакода. На этой модели была получена задержка в реэпителизации раны по сравнению с контрольной группой здоровых животных, и расширенная область межфолликулярной эпидермы, как компенсаторная мера, чтобы достичь закрытия и преобразования эпидермального барьера, что доказало важную роль фолликулярных и межфолликулярных СК в репарации раны (Langton A.K. et al., 2008). Было проведено изучение роли кератиноцитов в репарации кожных ран, в результате которого установлено, что фолликулярный эпителий способствует начальному закрытию раны, и фолликулярные клетки остаются в базальном слое эпидермы несколько месяцев спустя (Levy V. et al., 2007). Эти независимые исследовании показали, СК фолликула волосяной луковицы отвечают первыми и быстро на эпидермальное повреждение и способствуют восстановлению эпидермиса вместе с межфолликулярным кератиноцитами. Доказано, что для адекватных культуральных работ по сохранению в биокоже СК необходимо использовать аутографты, покрытые фибрином (Pellegrini G. et al., 1999). Тогда культуры поддерживают высокую клонногенность, темп роста для быстрого увеличения объёма биоткани. Дальнейшая проблема с разработкой биокожи – не естественное проявление биокожи, даже если она успешно прижилась. Кожа состоит из многих типов клеток, помимо кератиноцитов и фибробластов.

Есть нервы, сальные железы, потовые железы, меланоциты, клетки Меркеля, и т.д. Более сложная реконструкция с волосяными фолликулами, меланоцитами, клетками сальных желёз может, очевидно, привести к созданию косметически и функционально нормальной кожи.

Эпидермальные СК представляют многообещающий источник для регенерации кожных покровов. Однако, несмотря на их самообновление и мультипотенцию, необходимо определить маркеры для эффективной изоляции эпидермальных СК. Если в настоящее время существуют специальные маркеры для изоляции ГСК, то для эпидермальных СК они ещё не найдены.

Предложены различные методы, чтобы изолировать эпидермальные СК, в частности – 6-bright/CD71 – выделение кератиноцитов (Li A. et al., 1998; Terunuma A. et al., 2007); – быстрое прилипание клеток к коллагену IV типа (Bickenbach J.R., Chism E., 1998); – DNA метод (Kiel M.J. et al., 2007); и – использование флуоресцентного красителя на Hoechst 33342 (Triel C. et al., 2004). Комбинация в сильной экспрессии белка 6интегрина (6bri) и слабой экспрессии CD71dim является, возможно, наиболее принятыми маркерами эпидермальных СК в настоящее время (Tani H. et al., 2000). Показано, что в человеческой коже 6briCD71dim популяция клеток, содержит маленькие клетки с высоким уровнем ядерно-цитоплазматического отношения, способного к производству большого количества крупных колоний после 10 дней культуры. Проверка регенеративной способности 6briCD71dim кератиноцитов показала, что у эквивалентов кожи, произведённых из этих клеток, была стратифицированная и толстая эпидерма, в то время как эквиваленты кожи от 6briCD71bri клеток воспроизвели тонкий и плохо дифференцированный эпидермис (Kim D.S. et al., 2004).

На генную терапию в настоящее время возлагаются большие надежды по созданию клеток, способных производить большое количество новых клеток. В эпидермисе человека большинство клеток заменяется каждые 26–28 дней, и поэтому любая постоянная генетическая коррекция должно быть нацелена на популяции СК (Bickenbach J.R., Dunnwald M., 2000). Работы по исследованию прямого переноса генов в кожу не привели к постоянной и стабильной экспрессии генов. Прямая передача генов в кожу с помощью вирусных и невирусных векторов приводит к экспрессии генов, но только кратковременно и с низким уровнем (Jensen T.G., 2007). Недавнее исследование сообщило об успехе в долгосрочной человеческой регенерации кожи от одной единственной генетически модифицированной СК. В этой работе человеческие кератиноциты были преобразованы ретровирусным GFP вектором. Далее были отобраны популяции клеток с высокой клонногенностью и темпом роста. Эквиваленты кожи, полученные от этих популяций, показали нормальную эпидермальную архитектуру, подобную родной человеческой коже (Larcher F. et al., 2007). Предполагается, что это может быть приемлемым подходом для создания биокожи.

Недавно стали доступны новые источники мультипотентных СК, которые могут использоваться как в создании эпидермальный компонент биокожи, так и улучшать функциональность кожного компонента.

Один из источников мультипотентных эпидермальных СК – это репрограммированные соматические клетки, или индуцированные плюрипотентные стволовые клетки – iPS. Успешно получены от взрослых человеческих кожных фибробластов трансдукцией Oct3/4, Sox2, Klf4 и c-Myc, клетки со свойствами плюрипотентных. Они были неотличимы от ЭСК в морфологии, быстром увеличении, поверхностных антигенах, экспрессии гена, плюрипотентности и теломеразной активности, и были также способны к производству компетентных зародышевой линией химер (Takahashi K., Yamanaka S., 2006).

Комбинация гемопоэтических и мезенхимальных прогениторов использована у пациентов с незаживающими хроническими язвами (Badiavas E.V., Falanga V., 2003) так же как и МСК, или субпопуляция с сосудисто-эндотелиальным фенотипом. Полученные из костного мозга СК имеют необходимую пластичность и способны к регенерации кровеносных сосудов, скелетного мускулатуры и миокарда (Ferrari G. et al., 1998; Kocher A.A. et al., 2001; Orlic D. et al., 2001). Полученные из костного мозга СК использовались в лечении хронических ран.

Опубликованы клинические результаты использования аутологичных клеток костного мозга, которые непосредственно наносились на трофические язвы у 3 пациентов, которые не отвечали на стандартное традиционное лечение больше 1 года. У всех пациентов отмечено улучшение ран в течение нескольких дней после применения, которое характеризовалось устойчивым полным уменьшением в размере раны, увеличением васкулярности кожи и кожной толщины основания раны (Badiavas E.V., Falanga V., 2003). В то время как новые клетки кожи не окрашивались маркерами для ГСК, некоторыми маркерами для эндотелиальных клеток, и считалось, что клетками, ответственными за эту пластичность, были главным образом МСК. Таким образом, костный мозг может быть важным источником плюрипотентных СК для биокожи.

Наконец, в периферической крови, содержатся клетки, полученные из костного мозга, которые называют фиброциты, которые мигрируют к месту повреждения тканей (Abe R. et al., 2001). Эти, полученные из костного мозга, мезенхимальные прогениторы, систематически обнаруживают в периферической крови больных ожогом (Bellini A., Mattoli S., 2007). Фиброциты и МСК как по отдельности, так и совместно могут потенциально использоваться в создании биокожи.

В заключение надо отметить, что до создания полноценной биокожи как в косметическом, так и функциональном плане необходимо провести ещё много научно-исследовательских работ.