П.Ф. Забродский, С.В. Балашов

Иммунопатология острой интоксикации

тетрахлорметаном (четыреххлористым

углеродом). Фармакологическая коррекция

МОНОГРАФИЯ

© П.Ф. Забродский, 2012

© В.А. Балашов, 2012

ISBN 978–5 –91272-254-70

УДК 612.014.46:616–045 ББК 52.84+52.54+52.8 Я 21 З–123 САРАТОВ – 2012 2

ОГЛАВЛЕНИЕ

Перечень сокращений………………………………………………………. 5 Введение…………………………………………………………………… 6 Глава 1. Токсикологические свойства тетрахлорметанаю. Нарушения физиологической регуляции иммуногенеза Глава 2. Материал и методы итсследований………………… 2.1. Объект исследования и применяемые препараты………………….. 2.1.1. Сывороточная активность лизоцима………………………………... 2.1.2. Тромбоцитарный катионный белок сыворотки крови……………..

2.1.3. Определение фагоцитарно-метаболической активности нейтрофилов……………………………………………………………… 2.1.4. Определение содержания лимфоцитов в органах системы иммунитета и циркулирующей крови……………………………………….. 2.1.5. Исследование гуморального звена иммунного ответа……………... 2.1.6. Оценка кооперации т- и в- лимфоцитов ex vivo и in vitro………… 2.1.7. Исследование функции th1- лимфоцитов…………………………..

2.1.8. Изучение антителозависимой клеточной цитотоксичности………. 2.1.9. Оценка активности естественных клетоккиллеров……………….

2.1.10. Исследование функции надпочечников, активности эстераз т- клеток, моноцитов, макрофагов и перекисного окисления липидов…….. 2.3. Методы статистической обработки результатов исследований … Глава 3. Влияние тетрахлорметана на физиологические механизмы регуляции доиммунных механизмов защиты от инфекций……………………………… 3.1. Сывороточная активность лизоцима при остром действии тхм….

3.2. Активность тромбоцитарного катионного белка в сыворотке крови 3.3. Фагоцитарная активность нейтрофилов……………………………...

Резюме………………………………………………………………… Глава 4. Влияние тетрахлорметана на физиологические механизмы регуляции системы иммунитета……………………………………………………………….. 4.1. Изменение содержания лимфоцитов в органах системы иммунитета…………………………………………………………………… 4.2. Влияние тхм на тимусзависимый гуморальный иммунный ответ...

4.2.1. Оценка воздействия тетрахлорметана на антителообразование к тимусзависимому антигену в динамике по титру антител в крови………... 4.2.2. Исследование действия острого отравления тхм на число антите лообразующих клеток в селезенке…………………………………………... 4.2.3. Оценка влияния острого отравления тхм на число антителообра- зующих клеток в селезенке, синтезирующих Ig…………………………... 4.2.4. Нарушение кооперации Т- и В- клеток в формировании антителооразования ex vivo и in vitro…………………………………………………. 4.3. Влияние ТХМ на тимуснезависимый гуморальный иммунный ответ……………………………………………………………………………...

4.4. Оценка влияния тхм на клеточный иммунный ответ……………... 4.4.1. Изучение функции Th1клеток……………………………………….

4.4.2. Изучение антителозависимой клеточной цитотоксичности………… 4.4.3. Воздействие острой интоксикации ТХМ на функцию естественных клеток- киллеров………………………………………………………….. Резюме ………………………….

Глава 5. Механизмы нарушения физиологической регуляции иммунного гомеостаза при отравлении тетрахлорметаном……………………………………………………...

5.1. Исследование редукции функции тh1- th2-лимфоцитов и продуцируемых ими цитокинов в супрессии иммунных реакций………………... 5.2. Роль кортикостероидов и ПОЛ в супрессии иммунного ответа При отравлении тетрахлорметаном…………………………………………...

5.3. Оценка действия тетрахлорметана на активность ацетилхолинэс- теразы Т-клеток……………..

Резюме……………………………………………………………………… Глава 6. Коррекция нарушений физиологической регуляции иммунного гомеостаза при остром отравлении 6.1. Влияние антидотов, индукторов и ингибиторов р-450-зависимых монооксигеназ при отравлении тетрахлорметаном на фагоцитарно- метаболическую активность нейтрофилов и параметры системы 6.2. Исследование действие ингибитора р-450-зависимых моноокси- геназ 2-диэтиламиноэтил-2,2-дифенилпропилацетата (SKF-525а) при остром отравлении тетрахлорметаном на фагоцитарно-метаболическую активность нейтрофилов и иммунный ответ…………………………………..

6.3. Обоснование иммунокоррекции нарушений физиологической регуляции иммунного гомеостаза после острого отравления тетрахлорметаном 6.4. Влияние имунофана и полиоксидония на фагоцитарно-метаболическую активность нейтрофилов и показатели иммунного ответа при острой интоксикации тетрахлорметаном с применением антидотов………..

Резюме……………………………………………………………………… Заключение………………………………………………………………..

Выводы……………………………………………………………………… Практические рекомендации……………………………………… Литература…………………………………………………………………

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ

АЗКЦ - антителозависимая клеточная цитотоксичность АХЭ - ацетилхолинэстераза АОК - антителообразующие клетки АОС – антиоксидантная система ГГАС – гипоталамо-гипофизарно-адреналовая система ГЗТ - гиперчувствительность замедленного типа ЕКК - естественные клетки-киллеры ЕЦ - естественная цитотоксичность ИКК - иммунокомпетентные клетки ИЛ-1 (2 и т.д.) - интерлейкин-1 (2 и т.д.) ИФН- – - интерферон К-клетки - клетки-киллеры (лимфоциты, определяющие АЗКЦ) КС - кортикостерон МАН – малоновый диальдегид МС – микросомальная система ОДЛТА – отрицательный двоичный логарифм титра антител ПОЛ - перекисное окисление липидов СПР – суммарная продукция радикалов ТКБ – тромбоцитарный катионный белок ТХМ - тетрахлорметан Тh1-(Тh2)-лимфоциты - Т-лимфоциты-хелперы типа 1 и ФМАН – фагоцитарно-метаболическая активность нейтрофилов ЭК – эритроциты кур ЭБ - эритроциты барана LD50 (ЛД50) - средняя смертельная доза, вызывающая смертельный исход у 50% отравленных Vi-антиген (Vi-Ag) - тимуснезависимый Vi-антиген брюшнотифозной

ВВЕДЕНИЕ

Исследование острого действия ксенобиотиков на доиммунные факторы защиты организма от инфекций (неспецифическую резистентность организма) и систему иммунитета и возможностей коррекции его нарушений при помощи перспективных иммуностимуляторов является одной из наиболее актуальных проблем физиологии, токсикологии и иммунологии [Забродский П.Ф. и соавт., 2007]. Это определяется применением в Вооруженных Силах Российской Федерации разнообразных токсикантов, террористических актов с применением высокотоксичных соединений, возрастанием интоксикаций различными соединениями, вызывающих постинтоксикационные иммунодефицитные состояния, различные инфекционные заболевания [Забродский П.Ф. и соавт., 1998, 2002, 2007;

Агапов В.И. и соавт., 2004; Miller K., 1985; Descotes J., 1986; Luster M. J. et al., 1987; Sullivan J. B., 1989; Kimber I., 1996; Manibusan M.K., et al., 2007].

Тетрахлорметан (ТХМ) широко используется в промышленности как растворитель масел, жиров, каучука, битумов и смол; для экстрагирования жиров и алкалоидов из костей и семян; при производстве фреонов; для чистки и обезжиривания одежды в быту и производственных условиях [Тиунов Л.А., 1990; Wernke M.J., Schell J.D., 2004]. В последние годы частота острых интоксикаций хлорированными углеводородами, и, в частности ТХМ и показатель смертельных исходов от отравлений не уменьшаются [Забродский П.Ф. и соавт., 2007; Rusinski P., Kolasinski Z., 2003]. Несмотря на относительно небольшую частоту острых интоксикаций данными соединениями (до 5%), они характеризуются весьма высокой смертностью отравленных (20-96%) [Курашов О.В., Троцевич В.А, 1992;

Лужников Е.А., Костомарова Л.Г., 2000]. Пациенты с отравлениями ТХМ составляют до 60% всех больных с токсическим поражением печени [Голиков С.Н. и соавт., 1986; Венгеровский А.И., Седых И.М., Саратиков А.С., 1993]. Особую опасность ТХМ может представлять при аварийных ситуациях на химических объектах, в частности, в процессе уничтожения химического оружия, когда в силу его высокой летучести ингаляционным отравлениям может подвергаться большое количество людей. Продукты термической деструкции ТХМ (данное соединение может быть использован для пожаротушения) образуют наряду с многочисленными токсикантами отравляющее вещество фосген. Нельзя исключить употребление ТХМ в качестве суррогата алкоголя или с суицидальными целями [Курашов О.В., Троцевич В.А., 1992; Лужников Е.А., Костомарова Л.Г., 2000; Забродский П.Ф.и соавт., 2007].

Одной из причин высокой смертности после острого отравления ТХМ [Кожемякин Л.А. и соавт., 1992] могут являться инфекционные осложнения и заболевания, связанные с формированием вторичного иммунодефицита. При этом влияние ТХМ на систему иммунитета нуждается в дальнейшем изучении [Забродский П.Ф.и соавт., 2002, 2007; Descotes J., 1986; Luster M.I.

et al., 1987; Streets K.L., Wustefeld T., 2001; Louis H. et al., 2003].

Изучение действия ТХМ на доиммунные факторы защиты организма и систему иммунитета имеют как теоретическое значение, раскрывая неизвестные механизмы регуляции неспецифической резистентности организма и иммуногенеза, так и практическое, позволяя проводить научно обоснованные профилактику и лечение возникающих при отравлениях данным токсикантом инфекционных, аллергических, аутоиммунных, онкологических и других заболеваний [Хаитов Р. М. и соавт., 1995; Ратькин А.В. и соавт., 2005; Забродский П.Ф., 1993, 2002, 2007; Loose L.D., 1985;

Miller K.,,1985; Descotes J., 1986; Luster M. I. et al., 1987; Georgiev V. S, Yamaguuchi H., 1993; Kimber I., 1996; Popp W.,1996; Gobba F. et al., 1997; Plaa G.L., 2000; Sell S., 2000; Luster M.I., Simeonova P.P., 2001; Weber L.W. et al., 2003; Wernke M.J., Schell J.D., 2004; Rosenberg Y.J., 2005; Masuda Y., 2006].

Следует отметить, что вопрос о медикаментозной коррекции нарушений иммунного гомеостаза под влиянием ТХМ в постинтоксикационном периоде до сих пор изучен недостаточно [Забродский П.Ф. и соавт., 2007].

Таким образом, учитывая достаточно широкое распространение и использование в промышленности, технике и быту ТХМ, высокую летальность при отравлении им, недостаточно изученные особенности его действия на физиологические механизмы регуляции системы иммунитета, следует заключить, что проблема изучения нарушения иммунного гомеостаза при остром отравлении ТХМ, обоснование фармакологической коррекции его нарушений в постинтоксикационный период важна как в теоретическом, так и в практическом отношении.

резистентности организма и иммунного статуса при отравлении тетрахлорметаном и разработать обоснованные направления фармалогической коррекции выявленных нарушений.

ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ТЕТРАХЛОРМЕТАНА.

НАРУШЕНИЯ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЙ РЕГУЛЯЦИИ

ИММУНОГЕНЕЗА (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

Четыреххлористый углерод (тетрахлорметан, ТХМ, перхлорметан, фреон–10, хладон–10) относится к хлорпроизводным метана. Это бесцветная жидкость с ароматическим запахом (сходным с хлороформом).

Не воспламеняется. При соприкосновении с пламенем или накаленными предметами разлагается, образуя фосген. Молекулярная масса 153,84, температура кипения 76,80С, температура плавления –230С, хорошо растворим в жирах. Коэффициент растворимости паров в воде 1,04 (200С), 0,73 (300С). Химическая формула: ССl4 [Тиунов А.Л., 1990]. Смешивается с большинством органических растворителей. ТХМ практически нерастворим в воде. Хорошо растворяет жиры и масла, канифоль, многие натуральные и синтетические смолы, а также серу, желтый фосфор и галогены. В отсутствии влаги не действует на металлы. При нагревании выше 10000С образуется тетрахлорэтилен и хлор, при неполном гидролизе водяным паром – фосген: ССl4 + Н2О = СОСl2 + 2НСl [Тиунов А.Л., 1990].

ТХМ широко используется в промышленности как растворитель масел, жиров, каучука, битумов и смол; для экстрагирования жиров и алкалоидов из костей и семян; при производстве фреонов; благодаря трудной воспламеняемости и высокой плотности используется в огнетушителях в тех случаях, когда неприменимо тушение водой (при пожарах нефтепродуктов, на электроустановках и т.д.), тушение огня ТХМ в закрытом помещении представляет опасность ввиду токсичности его паров и образующихся газов;

для чистки и обезжиривания одежды в быту и производственных условиях. В медицине применялся в качестве противоглистного средства, т.к. он эффективен при заражении анкилостомами, аскаридами, острицами, ленточными глистами [Тиунов А.Л., 1990].

В настоящее время ТХМ исключен из номенклатуры лекарственных средств в связи с тем, что появились более безопасные и обладающие большей противоглистной активностью [Машковский М.Д., 2001].

Первый случай ингаляционного отравления ТХМ отмечен во Франции в 1938 году. Долгие годы наблюдались преимущественно производственные ингаляционные отравления. Описано много профессиональных отравлений, среди них немало смертельных. Часто наблюдаются отравления на мелких предприятиях, при дегельминтизации животных. Причиной пероральных отравлений часто бывает употребление этого препарата с целью опьянения.

Ингаляционные отравления возникают на производстве при несоблюдении правил техники безопасности, в быту при чистке одежды в небольших, плохо проветриваемых помещениях. Возможны отравления при длительном контакте ТХМ с кожей. Случай массового отравления с 20 смертельными исходами описан при употреблении внутрь средства для мытья волос, содержащего 1,4% ТХМ (остальное спирт). ТХМ - один из самых сильных гепатотропных ядов [Тиунов Л.А., 1990; Rusinski P., Kolasinski Z., 2003].

Для мышей при двухчасовой экспозиции тетрахлометана CL составляет 34500 ±7100 мг/м3, для крыс при шестичасовой - 46 000 мг/м [Тиунов Л.А., 1990]. Летальные дозы при внутрижелудочном введении введении составляют для крыс и мышей соответственно 7700-11000 и 6000– 8500 мг/кг, для морских свинок и кроликов от 5760 до 7564 мг/кг [Тиунов Л.А., 1990; Manibusan M.K. et al., 2007; Weiler-Normann C. et al., 2007].

Интоксикация ТХМ оказывает наркотическое действие, поражает центральную нервную систему, печень, почки, обладает местным раздражающим действием. ТХМ вызывает мутагенные, канцерогенные, эмбриотропные и гонадотропные эффекты [Tomenson J.A. et al., 1995;

Zimmerman H.J. Lewis J.H., 1995; Calabrese E.J., Mehendale H.M., 1996; Laskin D.L., 1996; Lynge E. et al., 1997; Masuda Y., 2006]. Высококумулятивное соединение [Тиунов Л.А., 1990]. Вызывает фиброз в тканях печени [PereiraFilho G. et al., 2008; Salazar-Montes A. et al., 2008]. Ингаляционное воздействие ТХМ на крыс при экспозициях 1, 2, 3 и 6 ч в концентрациях 1350, 2500, 3400 и поражением печени [Тиунов Л.А., 1990; Farkas D., Tannenbaum S.R., 2005].

У кроликов наркоз не развивается даже при ингаляции смертельных концентраций. Сгибательный рефлекс замедляется при действии 1500 мг/м3.

Для крыс пороговая концентация по интегральным показателям при 4-ч воздействии составляет 1200 мг/м3. У мышей при действии 134 300 мг/м3 в течение 90 с тормозится выработка условной реакции пассивного избегания [Чиркова В.М., 1983; Тиунов Л.А., 1990].

глутаматоксалатоацетаттрансаминазы возрастала, достигая максимума через 24 ч после воздействия, затем постепенно снижалась. Однократная ингаляция 6300 мг/м3 при экспозиции 15 мин вызывала у кошек патологические изменения в печени, появление в ней жира, увеличение относительной массы органа [Тиунов Л.А., 1990; Farkas D., Tannenbaum S.R.., 2005].

У мышей, крыс, морских свинок и кроликов при ингаляции ТХМ снижение содержания белка и нарушение соотношений белковых фракций в крови, увеличение активности в сыворотке аминофераз, альдолазы, аргиназы, ксантиноксидазы, глутаминазы, как следствие нарушения клеточных мембран гепатоцитов [Tomenson J.A. et al., 1995; Sell S., 2000]. В митохондриях печени крыс усиливается перекисное окисление липидов меняется хемилюминесценция ткани печени [Spoo W., 2001; Weber L.W. et al., 2003; Salazar-Montes A. et al., 2008; Botsoglou N.A. et al., 2008].

При однократном внутрижелудочном введении ТХМ в дозе 2 мл/кг у крыс на протяжении последующих 14 сут развивались фазовые изменения окислительного фосфорилирования в митохондриях печени [Тиунов Л.А., 1990]. При дозе 3 мл/кг структурные нарушения в печени и торможение репаративных реакций были сильнее выражены. Доза 0,15 мл/кг вызвала развитие изменений уровня гистонов в ядрах клеток печени. При 0,5-3, фибринолитической активности крови [Gobba F. et al., 1997; Sell S., 2000].

При подкожном введении ТХМ крысам в дозе 2,5 мл/кг увеличивалась активность аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы в сыворотке крови. У морских свинок подкожное введение 1 мл/кг ТХМ вызывало в различные сроки после воздействия (через 6 ч, 1,3, 5, 7, 10, 15 сут) снижение содержания общего и восстановленного глутатиона, аскорбиновой кислоты, активности карбоангидразы в крови и печени [Тиунов Л.А., 1990]. Аналогичные данные получены при иследовании крыс, получавших ТХМ внутрибрюшинно. Так, доза ТХМ, составляющая 0,2 мл/кг, через 24 и 72 ч после введения повышала активность аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы в плазме крови, увеличивала содержание в печени малонового диальдегида, снижала уровень глютатиона-SН и активности глютатиона-SН-пероксидазы и глютатиона глютатиона-Sтрансферазы. Максимальный эффект регистрировался через 24 ч после воздействия [Botsoglou N.A. et al., 2008; Tasduq S.A. et al., 2008; Mehmeicic G. et al., 2008].

У мышей и крыс внутрибрюшинное введение ТХМ в дозах 200, 500, 1000, 2000 мг/кг через 48 ч изменяло митотический индекс тимуса, его массу, общее число клеток тимуса и пахового лимфатического узла [Тиунов Л.А., 1990; Лим В.Г., 2006; Забродский П.Ф., Мандыч В.Г., 2007].

Интенсивность изменений по мере увеличения дозы приближалась к экспоненте. Внутрибрюшинное введение крысам ТХМ в дозе 0,25 мл/кг вызывало жировое перерождение печени, переходящее в фиброз, изменения в центральных лобулярных областях, снижение скорости синтеза белка, увеличение уровня триглицеридов и кальция в крови [Тиунов Л.А., 1990; Lieber C.S., 1999; Moyer E.S. et al., 2001]. ТХМ при внутрибрюшинном введении в дозах 0,1; 0,3 и 1 мл/кг усиливал у крыс процессы перекисного окисления липидов и стимулировал выделение этана с выдыхаемым с воздухом на протяжении б ч с 15 нмоль/кг до 30, и 110 нмоль/кг соответственно [Huang X. et al., 2008].

При дозе ТХМ, составляющей 1 мл/кг нарушалась микроциркуляция в печени, активизировались процессы гемолимфодинамики в начальный период интоксикации и ингибировались в поздние сроки [Plaa G.L., 2000].

У цыплят после внутрибрюшинного введения ТХМ (5 мл/кг через 1, 3, 6 и 24 ч) в печени снижалось содержание цитохрома Р-450 и угнеталась активность аминопирин-N-деметилазы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы [Wasser S., Tan C.E., 1999].

Подкожное введение мышам ТХМ в дозе 0,2 мл в 40 % растворе персикового масла вызывало дистрофические изменения гепатоцитов. Через 12-14 ч уменьшалось содержание гликогена, развиваются мутное набухание и жировая дистрофия печеночных клеток. Затем появляются участки некроза с локализацией в центральных отделах долек. В сохранившихся клетках — вакуольная, ацидофильная жировая дистрофия различной степени выраженности. Угнетается синтез РНК в гепатоцитах, но не в эндотелии. При электронной микроскопии: набухание митохондрий, просветление их матриц, дезорганизация крипт, расширение канальцев эндоплазматического ретикулума, уменьшение числа рибосом. Через 48 ч наблюдалось усиление синтеза ДНК в ядре, развитие компенсаторных реакций. При дозе 2 мл/кг у мышей усиливается способность печени реагировать повышением митотической активности в ответ на частичную гепатэктомию. Изменения интенсивности митотической реакции в ответ на гепатэктомию сохраняются в течение 1,5 мес. В перипортальных прослойках появлялись инфильтраты из лимфоцитарных клеток и гистиоцитов. Дистрофические изменения исчезали к 7 дню после интоксикации [Тиунов Л.А., 1990]. Аналогичные данные получены J.A.

Tomenson et al. (1995), A. Dalu, H.M. Mehendale (1996), K. Neubauer, S.T.

Eichhrost (1998), N. Brautbar, J. Williams 2nd (2002).

Ежедневное ингаляционное воздействие на морских свинок ТХМ в концентрации 7300 мг/м3 при 7-ч экспозиции вызывало гибель всех животных в течение 6 дней, при 300 мг/м3 развивались цирротические изменения в печени, дегенеративные изменения в надпочечниках, зрительном нерве [Brautbar N., Williams J. 2nd, 2002]. При 14, 41, 460 мг/м по 4 ч ежедневно в течение 8 дней наблюдались нарушения функции нервной системы после нагрузки этанолом, изменения количества холевой кислоты в печени, угнетение функции щитовидной железы, увеличение адренокортикотропной активности гипофиза, изменение длительности движения сперматозоидов [Saracyn M., 2002].

У мышей при подкожном введении 0,2 мл 40 % раствора ТХМ (1, или 3 раза в неделю в течение 6 недель) через 14-21 день отмечались выраженные дистрофические и некротические изменения в печени, особенно после первых 2—3 введений. Повторные введения сопровождались интенсификацией репаративной регенерации. Митотический индекс не увеличивался. Четырехкратное подкожное введение ТХМ через день кроликам в дозе 0,5 мг/кг вызвало увеличение белка в сыворотке крови, изменение альбуминов и глобулинов. Включение метионина, меченного по сере, в глобулины увеличивалось, а в альбумины уменьшалось. Введение внутрижелудочно мышам по 200 мг/кг в течение 8 дней нарушало лимфопоэз [Тиунов Л.А., 1990].

В настоящее время существенную роль в патогенезе поражения печени ТХМ придают изопростанам. Печень являлась самым важным в нашем понимании физиологии и биологии источником F2-изопростанов. Открытие F2-изопростанов существенно изменило понимание развития поражения печени при интоксикациях [Moore K., 2003; Basu S., 2003].

При хроническом отравлении у крыс при ингаляции ТХМ в концентрациях, составляющих 300, 1250, 2500 мг/м3 по 8 ч в день 5 раз в неделю в течение 15 мес. отмечалась дегенерация нервных волокон, некротический нефроз. Доза 600 мг/м3 вызывала цирротические изменения в печени. Максимальная концентрация вызывала гибель части животных через 20 недель. При концентрациях 21-26 мг/м3 по 5 ч в день на протяжении мес. у крыс отмечалось изменение гексеналовой пробы (актикация Р-450завимиых монооксигеназ), явления белковой дистрофии иечени, отставание в приросте массы тела, фазовые колебания уровня артериального давления, изменение синтеза белка [Тиунов Л.А., 1990; Moore K., 2003; Mehendale H.M., 2005; Roskams T., Cassiman D., 2004].

При круглосуточной ингаляции ТХМ в концентрациях 300, 100, мг/м3 и сроках от 24 до 219 сут у крыс развиваются морфофункциональные изменения печени, прогрессирующие при увеличении срока ингаляции [Тиунов Л.А., 1990].

Ингаляция крысами ТХМ в монотонном и интермиттирующем режимах в течение 1 мес. при одинаковой средневзвешенной концентрации 210 мг/м3 вызывала изменения функции печени, почек, надпочечников, нервной системы, лимфоидной ткани, которые были более выражены в случае прерывистого воздействия. Иные данные получены при непрерывной ингаляции (500 мг/м3) в течение 10 сут и интермиттирующем действии в течение 40 дней. Скорость развития и выраженность интоксикации по критериям активности щелочной фосфатазы, холинэстеразы, аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, содержанию уробилина, -липопротеидов, тиоловых групп в сыворотке крови и выведению гиппуровой кислоты с мочой была в 4 раза выше при непрерывном воздействии яда. Однако по критерию полиплоидизации гепатоцитов разница между группами отсутствовала. Развитие полиплоидизации гепатоцитов зависело не столько от режима интоксикации, сколько от суммарной дозы ТХМ, полученной крысами за время опыта [Farkas D., Tannenbaum S.R., 2005].

У крыс, подвергавшихся воздействию ТХМ в концентрации 20 мг/м3 в течение 6 месяцев, на 2, 4, 12 день опыта отмечено повышение содержания катехоламинов, ускорение превращения ДОФА в дофамин, активация симпатоадреналовой системы. Кролики при ингаляции 8600 мг/м3 8 ч в день гибли после 1-3 затравок, при 4600 мг/м3 погибала лишь часть животных, при 63 мг/м2 по 7 ч в день в течение 6 месяцев, не было зарегистрировано признаков интоксикации. У кроликов, которые 6 месяцев по 2 ч ежедневно вдыхали 400 мг/м3 ТХМ, в начальной стадии хронической интоксикации наряду с жировой инфильтрацией печени и лейкоцитозом обнаруживались резкое угнетение агглютининообразования, изменения активности холинэстеразы и уровня ацетилхолина [Тиунов Л.А., 1990].

Морские свинки переносят без существенных изменений ингаляцию ТХМ в концентрации 32 мг/м3 в течение 6 месяцев по 7 ч в день. У обезьян, подвергавшихся воздействию ТХМ в концентрациях 300 и 1250 мг/м3 по 8 ч в день 5 раз в неделю в течение 1,5 месяцев, отмечены слабые признаки жировой инфильтрации печени. При действии большей концентрации обнаружены явные дегенеративные изменения в зрительном и седалищном нервах. Ежедневное в течение 6 мес. семичасовое вдыхание ТХМ в концентрации 160 мг/м3 переносилось без проявления токсического действия [Тиунов Л.А., 1990; Masuda Y., 2006].

Введение ТХМ подкожно крысам каждые 2 недели в течение 40 недель в дозе 0,25 мл приводило к развитию цирроза печени на 15 неделе опыта.

Внутрижелудочное введение крысам в дозе 150 мг/кг ежедневно приводило через 6 мес. к изменениям морфологического состава крови, содержания тиоловых групп, мочевины, протромбинового времени, копропорфирина в моче. Нарушалась функция печени. Изменялась взаимосвязь процессов возбуждения и торможения в коре больших полушарий головного мозга.

При уменьшении дозы в 10 раз (15 мг/м3) признаки поражения не развивались. Введение кроликам ТХМ в дозе 100 мг/кг в течение 8 мес.

вызывало на 1-2 месяце увеличение экскреции 17-кетостероидов с мочой на 59 %, на 5 месяце эти изменения нормализовались, а затем экскреция гормонов вновь возрастала. Хроническая интоксикация кроликов ТХМ сопровождается повышением уровня возбудимости лобной доли коры, гипокампа, ретикулярной формации среднего мозга [Тиунов Л.А., 1990;

Tomenson J.A. et al., 1995; Roskams T., Cassiman D., 2004; Weiler-Normann C.

et al., 2007].

При хроническом отравлении (внутрижелудочное и внутрибрюшинное введение) у крыс и мышей развивались опухоли печени. При подкожном введении появлялись опухоли молочных желез у крыс [Lieber C.S., 1997;

Popp W., 1996; Luster M.I., Simeonova P.P., 2000; 2001].

Гепатотоксичность некоторых из растворителей признана [Brautbar N.

et al., 2002]. Исследовалось действие ТХМ на печень крыс Вистар различного возраста в течение 1-1,5 лет. У крысят жировая дистрофия развивалась уже в течение первых 20 дней, очаговые некрозы через 3- дня после начала воздействия. Цирротические изменения возникали на 70день. Регенерация протекала интенсивно, изменения в печени прецирротические изменения развивались на 3—4 мес., а цирроз на 9— мес. Цирротические изменения исчезали через 1—1,5 года. У старых крыс дегенеративные процессы в печени развивались медленно, регенерация протекала вяло и нормализации структуры не наступало [Тиунов Л.А., 1990].

ТХМ поступает в организм через легкие, внутрижелудочно, через кожу (как в виде жидкости, так и в парообразном состоянии). После 30-мин контакта кожи рук с ТХМ он выделяется с выдыхаемым воздухом (0,693—100, мг/м3) в течение 5 ч [Тиунов Л.А., 1990; Wasser S., Tan C.E., 1999].

При ингаляционном поступлении у животных и человека абсорбируется 20—35 % от вдыхаемого количества. В течение 3 ч ингаляции ТХМ абсорбция у кроликов с 35 % упала до 5 % [Weiler-Normann C. et al., 2007]. При приеме внутрь в течение первого часа в желудке человека всасывается 30 % ТХМ, остальное всасывается в тонкой кишке. Всасывание ускоряется при приеме ТХМ с алкоголем и жирами. При введении ТХМ внутрибрюшинно или подкожно кроликам в дозах 0,2—2 мг/кг максимальное накопление яда в печени отмечается через 24—48 ч после интоксикации. Сохраняется в печени в течение 12 дней после введения.

Максимальная концентрация в крови ТХМ отмечается в течение 2-4 ч после приема. Через 6 ч большая часть яда переходит в жировую ткань, печень, мозг. Жировая ткань играет роль временного депо; содержание в ней ТХМ в 8-20 раз больше, чем в крови. При проникновении через кожные покровы («выстриженная кожа») обезьян паров ТХМ в концентрации 3000 и мг/м3 содержание его в крови через 4 ч составляла соответственно 0,012 мг% и 0,03 мг%. В организме распределялся неравномерно. У обезьян после 300мин ингаляции меченного по углероду ТХМ в концентрации 300 мг/м основная масса яда содержалась в жировой ткани, затем (по степени убывания) в печени, костном мозге, крови, головном мозге, почках, сердце, селезенке, мышцах, легких, костной ткани. При введении подкожно крысам ТХМ также в максимальной степени концентрировался в жировой ткани. В крови концентарция токсиканта составляла 0,005— 0,01 % от введенной дозы. В эритроцитах уровень ТХМ в 2,5 раза выше, чем в плазме [Тиунов Л.А., 1990; Plaa G.L., 2000].

Таким образом, в виду выраженной липотропности ТХМ быстро всасывается в кровь. В экспериментах на животных наибольшая концентрация яда наблюдается в жировой ткани (примерно в 8 раз больше, чем в крови). Наиболее высокая концентрация ТХМ в крови достигается в течение 2-4 часов, а через 6 часов его большая часть переходит в жировую ткань, печень, мозг. При ингаляционных отравлениях токсикокинетические процессы протекают в 2-3 раза быстрее.

В организме ТХМ частично очень медленно разрушается, выделяется в течение длительного времени (до 70 дней) через дыхательные пути, в неизмененном виде (до 50-60%) - через почки и кишечник. В почках не концентрируется. На первой стадии биотрансформации ТХМ подвергается одноэлектронному восстановлению в системе цитохрома Р-450 до С1иона и радикала СС13. ТХМ подвергается метаболическому разложению в мембранах эндоплазматического ретикулума печени при участии Р–450завимых монооксигеназ. ТХМ активируется цитохромами 2E1, CYP2B1 или CYP2B2, и возможно CYP3A [Weber L.W. et al., 2003]. В результате происходит образование свободных радикалов (ССl+3; O-O-CCl; HO-OCCCl3;

HO-CCl3), из которых высокую активность имеет ССl+3. Этот радикал занимает центральное место в метаболизме ТХМ. Его превращение идет по трем путям: через одноэлектронное восстановление при участии цитохрома Р-450 до радикала СС12, который под действием Н2О переходит в НС1 и СО; через окислительные превращения с образованием радикала восстановленным глутатионом и дает НО—СС13, переходящий в фосген;

через восстановление до хлороформа. Хлороформ подвергается биотрансформации до СО2, НСl и 2-оксотиазолидин-4-карбамата. [Weber L.W. et al., 2003].

Свободные радикалы действуют на функциональные группы белков, внутриклеточных мембран и ферментов, выполняют роль инициаторов реакции перекисного окисления ненасыщенных жирных кислот в мембранах, ингибируют биосинтез белка, вызывают диссоциацию полисом, рибосом, взаимодействие с эндогенными липидами, в первую очередь биомембран, давая цепь реакций перекисного окисления. В процессе метаболизма фосген превращаются в диоксид углерода, оксид углерода, хлористый водород и воду. Метаболизму подвергается 20% от введенной дозы ТХМ [Weber L.W.

et al., 2003; Fu Q.S., 2008].

ТХМ выделяется через легкие (50-60%), почки и кишечник. Через легкие в течение 1 ч выводится 33% от дозы. В дальнейшем выделение продолжается на более низком уровне. При введении крысам подкожно ТХМ в дозе 40-1000 мг до 90 % от дозы выделяется за 73-98 ч. В первые 8 ч выделялось 44,2 % от выдыхаемого количества. Выделение происходило по экспоненциальной кривой. У обезьян через легкие выделялось 50 % от биотрансформации: СО2 и хлороформ. Выделение СО2 за 18 ч составило биотрансформации ТХМ обнаруживается также в моче и кале [McGregor D., Lang M., 1996; Plaa G.L., 2000].

У человека минимально ощутимая по запаху концентрация для наиболее чувствительных людей составляет 11,5 мг/м3, максимально неощутимая - 9,3 мг/м3; минимально действующая концентрация на световую чувствительность глаз - 8 мг/м3, максимально недействующая - мг/м3; минимальная концентрация, оказывающая рефлекторное воздействие, определяемое методом ЭЭГ по выработке условного электрокортикального рефлекса, для наиболее чувствительных лиц — не действующая на выработку рефлекса - 1990].

В клинической токсикологии отравления ТХМ встречаются довольно часто, пациенты с данной патологией составляют до 60% всех больных с токсическим поражением печени [Голиков С.Н. и соавт., 1986; Венгеровский А.И., Седых И.М., Саратиков А.С., 1993]. Летальность при пероральных отравлениях составляет 30%, при ингаляционных – 15 – 20%. Летальная доза при пероральном поступлении для человека составляет 20 – 40 мл. Вдыхание паров ТХМ в концентрации 15 мг/л через 10 минут, а в концентрации 2 мг/л – через 30 минут приводит к появлению головной боли, тошноты, рвоты, учащению пульса. У рабочих при 8 часовом воздействии ТХМ в концентрации, составляющей 1,2 мг/л, наблюдалается усталость, сонливость. Смертельная концентрация ТХМ для человека равна 50 мг/л при вдыхании в течение 1 ч. Для появления симптомов отравления достаточно приема внутрь 2 – 4 мл токсиканта [Лужников Е.А., Костомарова Л.Г., 1989].

течение 1 ч составляет 50 000 мг/м3. При внутрижелудочном поступлении ТХМ смертельная доза для человека составляет от 20-40 мл. Минимальная доза, вызывающая поражение печеночных клеток составляет 5-10 мл, 30- мл вызывают тяжелую и смертельную интоксикацию. Однако известны случаи выздоровления после приема 100 мл [Тиунов Л.А., 1990]. В то же время смертельными дозами могут быть для взрослого человека 2-4 мл.

При ингаляционных отравлениях средней и тяжелой степени клинические признаки появляются после скрытого периода, который может составлять 1-2 сут. Развивается недомогание, озноб, повышение температуры тела до 37-39°С. Позже присоединяются желудочно-кишечные расстройства, тошнота, рвота. На 2-5 сут после отравления ТХМ формируется токсическая гепатопатия, к 3-7 сут - нефротоксическое действие. При легких отравлениях возникает головная боль, головокружение, спутанность сознания, сонливость, тошнота, рвота, раздражение верхних дыхательных путей. При крайне тяжелых отравлениях - потеря сознания и смерть. Отравление может протекать с явлениями возбуждения, с развитием эпилептиформных судорог. Описаны клинические формы отравления в виде энцефаломиелита, мозжечковой дегенерации, периферических невритов, невритов зрительного нерва, кровоизлияний и жировой эмболии мозга. К числу ранних признаков отравления относится изменение активности ряда ферментов крови: в первые часы после воздействия изменяется активность аспартатаминотрансферазы (АСТ), аланинаминотрансферазы (АЛТ), лактатдегидрогеназы в плазме крови, меняется изоферментный спектр этих энзимов. Степень гиперферментемии зависит от тяжести отравления [Тиунов Л.А., 1990].

гепатомегалии, в нарушении синтетической функции (страдает синтез глюкуронидов, билирубина, белков сыворотки крови). Снижается уровень протромбина в крови, развивается геморрагический синдром.

Нефротоксическое действие проявляется в олигурии, а в тяжелых случаях - в анурии. В крови повышается уровень небелкового азота, метаболический ацидоз. В моче появляется белок, кровь, цилиндры.

благоприятных случаях после анурии - обильный диурез, нормализация Костомарова Л.Г., 1989, 2000; Савлуков А.И. и соавт., 2004; Spoo W., 2001;

Brautbar N., Williams J. 2nd, 2002; Saracyn M., 2002].

Последствиями острого ингаляционного отравления ТХМ могут быть:

язва двенадцатиперстной кишки, некроз поджелудочной железы, анемия, лимфопения, изменения в миокарде, острый психоз. Возможна желтая атрофия печени, ее цирроз. Смертность при острых ингаляционных отравлениях ТХМ составляет 15-20 % [Лужников Е.А., Костомарова Л.Г., 1989, 2000; Маркова И.В. и соавт., 1998; Савлуков А.И. и соавт., 2004;

Brautbar N., Williams J. 2nd, 2002; Saracyn M., 2002].

Ранними признаками интоксикации при пероральном отравлении схваткообразными болями в животе, частым жидким стулом. На 2-3 сут отмечается желтушность склер и кожных покровов, увеличение печени, печеночная колика, геморрагический синдром с кровоизлияниями под Токсическая гепатопатия может закончиться острой печеночной недостаточностью. В крови значительно повышается активность билирубина. В 85 % случаев присоединяется почечная недостаточность с олигурией, азотемией, гипергидратацией, повышением артериального Повышается уровень креатинина, снижается клубочковая фильтрация и почечный плазмоток, угнетается канальцевая реабсорбция. При благоприятном исходе концентрационный индекс креатинина и канальцевая реабсорбция воды может не восстанавливаться в течение нескольких месяцев. Отравление может сопровождаться энцефалопатией и нервнопсихическими нарушениями. К последствиям перенесенной интоксикации, которые могут проявляться на протяжении 9 месяцев после отравления, относят, помимо возможных нарушений функций желудочно-кишечного тракта и центральной нервной системы, импотенцию со снижением либидо [Лужников Е.А., Костомарова Л.Г., 2000; Маркова И.В. и соавт., 1998;

Савлуков А.И. и соавт., 2004; Spoo W., 2001; Brautbar N., Williams J. 2nd, 2002; Saracyn M., 2002; Rusinski P., Kolasinski Z., 2003].

Описаны случаи опухолей печени у людей с циррозом печени, развившимся под воздействием ТХМ. У рабочих предприятий химчистки, где используется ТХМ отмечается повышенное число случаев рака дыхательной системы, шейки матки, лейкозов. По степени канцерогенности ТХМ относится к группе 2Б—возможный канцероген для человека [Тиунов Л.А., 1990]. В настоящее время выраженная канцерогенность ТХМ для животных и человека доказана [Wernke M.J., Schell J.D., 2004].

ТХМ вызывает дерматиты, экземы, крапивницу. Эритема возникает после 30-мин контакта кожи руки с ТХМ. В этом случае местные явления проходят через 1-2 ч. Постоянный контакт с кожей ТХМ может вызвать полиневрит. Ежедневная аппликация 0,1 мл на эпилированную кожу кроликов в течение 10 сут увеличивала толщину кожной складки на 217 %.

Тормозился прирост массы тела. У человека такое 10-дневное нанесение на кожу ТХМ не вызывало признаков интоксикации [Yodaiken R.E., Babcock J.R., 1973; Spoo W., 2001; Brautbar N., Williams J. 2nd, 2002; Saracyn M., 2002].

При патоморфологическом исследовании обнаруживают тяжелые повреждения печени в виде массивных центролобулярных некрозов и пигментного цирроза, при ингаляционном отравлении некротические изменения менее выражены. Считают, что изменения в печени максимальны в ранние сроки отравления. При более поздней гибели в ткани печени регистрируются регенеративные процессы. Изменения в почках проявляются картиной выделительного нефроза, гидропической дистрофией эпителия извитых канальцев. При ранней гибели эти изменения менее выражены.

Характерны множественные кровоизлияния под эпикардом, эндокардом, плеврой, слизистой оболочкой желудочно-кишечного тракта. В случаях быстрой смерти на вскрытии отмечается только кровоизлияния и отек мозга.

При гистологическом исследовании – признаки энцефаломиелита, дегенеративные изменения нервных клеток, периферические невриты, неврит зрительного нерва, кровоизлияния, жировая эмболия мозга [Тиунов Л.А., 1990; Лужников Е.А., Костомарова Л.Г., 1989, 2000;].

В тканях трупа ТХМ может сохраняться до 17-20 дней после отравления [Тиунов Л.А., 1990].

Таким образом, при отравлении ТХМ поражается центральная нервная система, желудочно-кишечный тракт, печень и почки, свертывающая система крови, сердечно-сосудистая и дыхательная системы. При действии на кожу ТХМ вызывает дерматиты, иногда экзему, крапивницу. Основная причина смерти больных - острая печеночно-почечная недостаточность и ее осложнения (массивные кровотечения, пневмония). Прием алкоголя способствует более тяжелому течению ингаляционных отравлений [Тиунов Л.А., 1990; Маркова И.В. и соавт., 1998; Лужников Е.А., Костомарова Л.Г., 2000; Куценко С.А. и соавт., 2004].

Описано, что под влиянием острого отравления ТХМ in vitro при концентрации 3 мМ происходит подавление гуморального иммунного ответа на эритроциты барана (ЭБ), динитрофиколл и липополисахарид [Kaminski N. E., Stevens W.D.,1992]. Отмечается снижение активности Влимфоцитов и угнетение супрессорной функции Т-лимфоцитов [Брызгина Т.М., 1990]. Под влиянием ТХМ наблюдают угнетение функции В-клеток, особенно в ранние сроки после поражения, вследствие чего снижается их способность к кооперации с Т-клетками. Это приводит к снижению иммунного ответа на тимусзависимый антиген ЭБ [Ильичевич Н.В. и соавт. 1984; Брызгина Т.М., 1989]. Аналогичные данные (снижение в несколько раз числа АОК в селезенке мышей) получены при остром токсическом гепатите, вызванном введением животным ТХМ [Хабибуллаев Б.Б., 2005].

Изменение гуморального иммунитета на тимусзависимый антиген ЭБ у кроликов и мышей в условиях острого поражения печени ТХМ в значительной степени обусловлено активностью иммунорегуляторных клеток - антигеннеспецифических хелперов и супрессоров. В настоящее время доказано, что клетками-супрессорами могут являться CD4+ Тлимфоциты или Тh3-клетки (хелперы 3-го типа), Th2-клетки (хелперы 2-го типа) или CD4+/ CD8+ лимфоциты, продуцирующие интерлейкины, ингибирующие рецепторы Т-лимфоцитов (CTLA-4), особые Т-лимфоцитыкиллеры и В-клетки [Хаитов Р.М. и соавт., 2002].

Активность клеток-супрессоров проявляется вследствие того, что они вырабатывают супрессорный фактор, который неспецифически подавляет тимусзависимый иммунный ответ [Конопля А.И. и соавт., 1985;, Прокопенко Л.Г., 1985; Смахтин М.Ю. и соавт., 1994; 1995].

При остром отравлении ТХМ усиление хелперной активности характерно для периодов большего повреждения печени и менее выраженной регенерации, а усиление супрессорной - для периодов интенсивной регенерации и меньшего повреждения печени [Прокопенко Л.Г. и соавт., 1987; Мартынова Т.В. и соавт, 1991]. По всей вероятности, поражение печени, с одной стороны, создает предпосылки для активации иммунного ответа на различные антигены, с другой - активация иммунного ответа может свидетельствовать о запуске аутоиммунных механизмов повреждения печени. У потомства крыс с хроническим аутоиммунным повреждением печени отмечалось повышение иммунологической реактивности, о чем свидетельствовало увеличение в их селезенках Ig M, продуцируемого антителообразующими клетками [Прокопенко Л.Г. и соавт., 1982; Прокопенко Л.Г., Кедровская Н.Н., 1983; Брюхин Г.В., Михайлова Г.И., 1989].

При хроническом действии ТХМ нарушение функции иммунной системы связывают с изменениями содержания фосфолипидов, гликолипидов в тканях печени и органах системы иммунитета, при этом регистрировалось изменение фракций фосфолипидов и гликолипидов на мембранах гепатоцитов, клеток селезенки, тимуса и костного мозга [Холмухамедова Н.М. и соавт., 1991]. Введение крысам ТХМ вызывало снижение функциональной активности Т-лимфоцитов крови в реакции бласттрансформации в ответ на фитогемоагглютинин, особенно в ранние сроки исследования [Брызгина Т.М., Мартынова Т.В., 1985]. Аналогичные результаты получены в более поздних исследованиях, где показано, что содержание Т-лимфоцитов в селезенке и лимфоузлах (после введения ТХМ крысам) уменьшалось, а содержание В-лимфоцитов не изменялось [Брызгина Т.М. и соавт., 1990]. Дальнейшие исследования показали, что под влиянием ТХМ наблюдалось увеличение активности как Т-хелперов, так и Т-супрессоров, причем активность последних была выше [Брызгина Т.М. и соавт., 1992]. Показано снижение ГЗТ под влиянием ТХМ [Брюхин Г.В., Михайлов Г.И., 1990]. Потомство крыс с хроническим поражением печени ТХМ характеризовалось депрессией клеточного иммунитета, проявлявшейся уменьшением количества Т-клеток ГЗТ, а также редукцией антителообразования и снижением интенсивности Fc-зависимого фагоцитоза перитониальных макрофагов и моноцитов крови [Брюхин Г.В., Михайлов Г.И., 1989; Брюхин Г.В., Грачев А.Ю., 1991; Брызгина Т.М. и соавт., 1992].

Кратковременное действие ТХМ оказывало стимулирующий эффект на фагоцитоз лейкоцитов и активацию естественных клеток-киллеров, тогда как продолжительное введение обусловливало противоположное действие [Halaskova M. et al., 1993].

Влияние ТХМ на факторы доиммунной зашиты организма от инфекций практически не изучено.

Показано, что при действии ТХМ и высокой внешней температуры (40оС по 40 мин ежедневно в течение 3 сут) отмечается выраженное снижение Т-зависимого иммунного ответа [Конопля Е.Н., Прокопенко Л.Г., 1994]. Комбинированное действие этанола и ТХМ вызывало суммацию иммуносупрессивных эффектов ядов [Смахтин М.Ю. и соат., 1994].

Интересно отметить, что витамин С предохраняет от действия ТХМ [Ademuyiva O. et al., 1994], а витамин А вызывает усиление его токсического эффекта [Elsisi A.E. et al., 1986]. Однако имеются данные, вызывающие сомнение в таком выводе. Так, экстракт из моркови обладает гепатопротективными свойствами при окислительном стрессе, вызванном ТХМ [Bishayee A., Chatterjee M., 1993]. Вероятно, у -каротина и витамина А при поражении ТХМ реализуются противоположные эффекты. При иммуностимулирующее действие лейкинферона [Кузнецов В.П. и соавт., 1992].

Существуют основания считать, что в супрессии иммуногенеза при отравлении ТХМ определенную роль играет нарушение продукции адренокортикотропного гармона гипофизом, приводящее к увеличению массы надпочечников.

свидетельствуют о снижении числа лимфоцитов в тимусе, увеличении их в селезенке, активации гуморального иммунного ответа, оцениваемого по числу АОК в селезенке крыс и содержанию в крови IgM и IgG под влиянием ТХМ, который вводили внутрижелудочно крысам в дозе 2 мг/кг (приблизительно 1/3 ЛД50) 2 раза в неделю в течение 1 месяца. На наш взгляд, активация антителообразования при столь высоких дозах ТХМ маловероятна и противоречит данным, полученным другими исследователями.

Исследования последних лет показали существенную роль цитокинов, особенно TNF, ИЛ-6 и ИЛ-10 в формировании цирроза печени и аутоиммунных реакциях [Schumann J., Tiegs G., 1999; Luster M.I., Simeonova P.P., 2000, 2001; Roberts R.A. et al., 2001; Streets K.L., Wustefeld T., 2001;

Weber L.W. et al., 2003; Louis H. et al., 2003], а также, уже упомянутых изопростанов [Moore K., 2003] и остеопонтина [Ramaiah S.K., Ritting S., 2008].

иммунотоксические свойства ТХМ свидетельствуют о том, что он способен изменять физиологическую регуляцию иммуногенеза. Анализ имеющихся данных показывает, что в танатогенезе после острого отравления ТХМ существенную роль играют нарушения регуляции иммунного гомеостаза.

Острое и хроническое отравление ТХМ вызывает снижение показателей антителообразования под влиянием ТХМ противоречивы, практически не исследованы роль Т- и В-клеток, состояние ПОЛ, ГГАС, эстеразная активность Т-лимфоцитов в формировании иммунодефицита после действия ТХМ, а также действие токсиканта на показатели доиммунных факторов защиты организма от инфекции. Уточнение результатов изучения иммунотоксичности ТХМ и получение новых данных о влиянии его на иммунный гомеостаз позволит разработать и патогенетически обосновать оптимальную медикаментозную коррекцию нарушений механизмов его регуляции для профилактики постинтоксикационных инфекционных осложнений, заболеваний и смертельных исходов.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Объект исследования и применяемые препараты Исследования проводили на 712 беспородных крысах, крысах Вистар и на 68 беспородных белых мышах и мышах линии СВА обоего пола. Масса крыс и мышей составляла соответственно 180-240 и 18-22 г.

ТХМ вводили внутрь в растворе оливкового масла в дозах 0,25, 0,50 и 0,75 LD50. Для оценки эффективности средств специфической терапии и иммуностимуляторов токсикант применяли в дозах 1,0 LD50.

Среднелетальная доза ТХМ для мышей и крыс составляла соответственно 8,3+0,7 и 6,5+0,6 г/кг. ТХМ применяли в дозе 1/4 DL50 в течение 4 сут и 1/ DL50 в течение 13 сут для оценки соответственно функции Th1- и Th2лимфоцитов.

Концентрацию цитокина ИФН- исследовали плазме крови крыс через 4 сут после первой инъекции ТХМ, а интерлейкин ИЛ-4 – через 13 сут после первого введения ТХМ методом ферментного иммуносорбентного анализа (ELISA) [Ройт А. и соавт., 2000], используя наборы (ELISA Kits) фирмы BioSource Int. Сроки определения цитокинов в крови соответствовали особенностям иммуногенеза при иммунизации эритроцитами барана (ЭБ).

При изучении влияния специфической терапии унитиолом [Лужников Е.А., Костомарова Л.Г., 2000] при остром отравлении ТХМ на показатели иммунной системы препарат вводили крысам внутримышечно по общепринятой схеме: в первые сутки – 15 мг/кг 3 раза с интервалом 6 ч, во вторые сутки – по 15 мг/кг 2 раза с интервалом 8 ч; в последующие 3 сут - по 15 мг/кг 2 раза в сут. Токоферола ацетат вводили крысам внутримышечно по 2 мл 30% раствора 4 раза в сутки в течение 4-х дней. Первую дозу антидотного средства животные получали через 10 мин после введения ТХМ в дозе 1,0 DL50. Обратимый ингибитор цитохрома Р-450, участвующего в биотрансформации ТХМ, 2-диэтиламиноэтил-2,2-дифенилпропилацетат (SKF-525A) вводили внутриперитонеально в дозе 50 мг/кг за 1 сут до применения ТХМ. Кроме того, в течение трех суток до острой интоксикации ТХМ крысам внутрижелудочно вводили индукторы цитохрома Р- фенобарбитал в дозе 50 мг/кг, а также 2,4,6-трифенил-4Н-селенопирана в растворе оливкового масла в дозе 0,8 мг/кг.

В качестве иммуностимуляторов использовали в эквитерапевтических дозах имунофан (20 мкг/кг) и полиоксидоний (700 мкг/кг), которые применяли в течение 4-х суток. Первую дозу вводили через 5-30 мин после применения ТХМ. Дозы иммуностимуляторов для животных обоснованы данными литературы [Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., 2005] и расчетными методами [Рыболовлев Ю.Р., 1982].

Для определения роли кортикостерона в формировании иммунных реакций его применяли подкожно в дозе соответствующей его увеличению в крови после интоксикации ТХМ (3,0 и 1,5 мг/кг соответственно с интервалом 6 ч в изотоническом растворе хлорида натрия) [Dhabhar F. S. et al., 1996].

Эксперименты проводили в светлое время суток (с 9.00. до 15.00 ч), характеризующееся минимальным содержанием кортикостерона (КС) в плазме крови крыс [Dhabhar F.S. et al, 1996].

Кровь для исследования титра антител получали из подъязычной вены животных. Лимфоидные органы извлекали у животных после цервикальной дислокации в различные сроки после интоксикации.

Эксперименты на животных проводили в соответствии с требованиями Женевской конвенции "International Guiding Principles for Biomedical Research Inroling Animals" (Geneva, 1990).

свидетельствует о высокой чувствительности данного теста [Сидельникова Н.М., 2004; Забродский П. Ф., Мандыч В.Г., 2007]. Как правило, химические соединения вызывают снижение лизоцимной активности сыворотки крови [Агапов В.И. и соавт., 2004; Василенко О.А., 2004; Забродский П.Ф., 2002;

2007]. Однако свидетельством отрицательного воздействия ксенобиотиков на организм может являться также и повышение содержания лизоцима в крови.

О. В. Бухарина (1971) [Ремезов П.И., Башмаков Г.А., 1976], основанным на способности лизоцима растворять индикаторный микрококк (Micrococcus lysodeicticus), измеряя при этом оптическую плотность опытной и контрольной суспензии микроорганизмов. Взвесь суточной агаровой стандартизировали по левому барабану ФЭК до оптической плотности О,66.

В опытную пробирку вносили 0,4 мл фосфатного буфера, 0,1 мл исследуемой сыворотки и 2 мл стандартной взвеси микрококка. Смесь выдерживали при 370С 30 мин, после чего измеряли ее оптическую плотность на ФЭК по количественной характеристики лизоцима в исследуемой сыворотке с использованием кристаллического лизоцима строили калибровочную кривую, исходя из активности фермента 2, 4, 6, 8, 10, 20, 40, 50 мкг в пробе.

Во все пробирки с различным содержанием лизоцима вносили с интервалом 30 с по 2 мл стандартизованной суспензии микрококка. Смесь инкубировали при 370С 30 мин и в каждой пробирке, начиная с первой, измеряли оптическую плотность. Каждое последующее измерение выполняли через с после предыдущего. С помощью калибровочной кривой находили количества лизоцима в исследуемой сыворотке, выраженное в абсолютных единицах. Для удобства расчетов зависимость между оптической плотностью микробной взвеси в опыте и контроле, а также содержанием лизоцима в исследуемой сыворотке использовали таблицу [Ремезов П.И, Башмаков Г.А., 1976].

2.2.2. Тромбоцитарный катионный белок сыворотки крови Метод определения активности тромбоцитарного катионного белка основан на избирательной чувствительности к его бактерицидному действию индикаторной культуры - B. subticis. Тромбоцитарный катионный белок сыворотки крови (-лизин) определяли фотонефелометрическим ускоренным методом по О.В. Бухарину, Б.А. Фролову и А.П. Луда (1972) [Ремезов П.И., Башмаков Г. А., 1976], учитывая изменение оптической плотности раствора сахарозы при росте в ней индикаторной культуры. Учет результатов проводили по формуле:

Д1 - оптическая плотность опытных проб до инкубации;

Д2 - оптическая плотность опытных проб после инкубации.

фотоэлектроколориметре.

2.2.3. Определения фагоцитарно-метаболической активности Кислородзависимые антиинфекционные системы фагоцита оценивают чаще всего в НСТ-тесте (тест восстановления нитросинего тетразолия) [Nouragargh S., Holt J.R.S., 1986], а кислороднезависимые микробоцидные системы фагоцита - в лизосомально-катионном тесте [Elsbach P., Weise J., 1985].

диформазан под влиянием супероксиданиона, образующегося в НАДФ-Нокидазной реакции. НСТ-тест, как уже указывалось, интегрально характеризует кислородзависимые антиинфекционные системы фагоцита. В [Забродский П.Ф. и соавт., 2007] без стимуляции зимозаном (спонтанный тест) и с его использованием (индуцированный тест). Учет результатов проводился путем подсчета в каждом мазке 100 нейтрофилов, среди которых определялся процент клеток, содержащих отложения диформазана (НСТ позитивные нейтрофилы). Далее рассчитывался индекс активности нейтрофилов (ИАН) по формуле:

ИАН = ----------------------------------------------, где А - количество клеток, не содержащих диформазоновых отложений или содержащий их в виде пылевидных немногочисленных включений;

диформазана не превышает 1/3 площади ядра;

С - количество клеток, в которых названные отложения занимают от 1/3 до всей величины площади ядра;

D - количество клеток с диформазановыми отложениями, по площади превосходящими площадь ядра.

Кроме того оценку фагоцитарно-метаболической активности нейтрофилов (ФМАН) проводили общепринятыми методами [Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., 1995] по содержанию микробных клеток в нейтрофиле, то есть определяли число поглощенных микробных тел по отношению к общему числу клеток – фагоцитарный показатель, и среднее число поглощенных микрорганизмов фагоцитом – фагоцитарное число.

2.2.4. Определение содержания лимфоцитов в органах системы Содержание лимфоцитов в лимфоидных органах после различных воздействий отражает, во-первых, процесс их перераспределения между органами системы иммунитета вследствие стресс-реакции (активации ГГАС) [Ройт А. и соавт., 2000; Забродский П.Ф. и соавт., 2007], во-вторых, характер их апоптоза (запрограммированной гибели), на который оказывают влияние кортикостероиды и различные химические ксенобиотики [Хаитов Р.М. и соавт., 2000; Мутускина Е.А. и соавт., 2001; Clаman H. N., 1972].

Содержание Т-клеток в тимусе крыс определяли общепринятым методом подсчета ядросодержащих клеток в органе, учитывая то обстоятельство, что лимфоциты в вилочковой железе представлены в основном их Т-популяцией (до 90%) [Ройт А. и соавт., 2000; Хаитов Р.М. и соавт., 2000]. Лимфоциты в селезенке, лимфатических узлах и костном мозге (исследовали клетки костного мозга бедренной кости) подсчитывали, исходя из их относительного содержания в мазках данного органа, окрашенных по Романовскому-Гимзе. Для определения содержания в лимфоидных органах лимфоцитов клеточные суспензии из тимуса, селезенки, костного мозга и паховых лимфоузлов крыс готовили после интоксикации ТХМ через 1, 6 и cут. Содержание лимфоцитов в крови крыс определяли через 1, 3 и 6 сут после воздействия ТХМ, а содержание Т- и В-лимфоцитов в органах системы иммунитета мышей – через 2 и 12 сут общепринятыми методами [Василенко О.А., 2004; Забродский П.Ф., Мандыч В.Г., 2007].

2.2.5. Исследование гуморального звена иммунного ответа Для оценки гуморальных иммунных реакций в качестве антигенов применяли эритроциты барана (ЭБ) и брюшнотифозный Vi-антиген (Vi-Ag).

Использование данных антигенов позволяло сравнить редуцирующее действие ТХМ на тимусзависимый или тимуснезависимый иммунный ответ.

Анализ полученных данных позволяет определить влияние ТХМ на Тхелперы в реализации гуморального звена иммунного ответа [Утешев Б.С., 1984; Descotes J., 1986; Jeurissen A., Bossuyt X., 2004]. Данный подход широко используется для оценки действия химических соединений на систему иммунитета [Забродский П.Ф., Киричук В.Ф., 2000; Германчук В.Г., 2000; Беликов В.Г., 2001; Сидельникова Н.М., 2004].

Исследование показателей тимусзависимого гуморального иммунного ответа проводили на 5, 8, 14 и 20 сут после острой интоксикации ТХМ.

Иммунизацию ЭБ проводили путем их внутрибрюшинного введения в дозе 2·108 клеток в 0,5 мл изотонического раствора хлорида натрия. Титры антител к ЭБ определяли в реакции гемолиза эритроцитов в присутствии комплемента. Все реакции проводились на стерильных пластиковых микропланшетах. Гуморальный иммунный ответ оценивали по отрицательному двоичному логарифму титра антител (ОДЛТА). Данный тест отражает способность органов системы иммунитета синтезировать IgM на сут и IgG на 8 и 14 сут [Ройт А. и соавт., 2000].

Гуморальную иммунную реакцию к тимусзависимому и Т-независимому антигенам оценивали также на 5 сут по числу антителообразующих клеток (АОК) в селезенке [Белокрылов Г.А. и соавт., 1980; Jerne N.K., Nordin A.A., 1963] после воздействия ТХМ с одновременной внутрибрюшинной иммунизацией крыс ЭБ в дозе 2·108 клеток в 0,5 мл изотонического раствора хлорида натрия и Vi-Ag в дозе 8 мкг/кг (использованный тест отражал синтез IgM B-клетками селезенки). АОК, характеризующие продукцию IgG, определяли в селезенке на 14 сутки после иммунизации ЭБ [Ройт А. и соавт., 2000].

Кроме того, при оценке тимусзависимого антителообразования по числу АОК в селезенке животных подвергали воздействию ТХМ через 3 сут после иммунизации. При этом практически одновременная иммунизация ЭБ с действием ТХМ позволяла оценить его влияние на индуктивную фазу гуморального иммунного ответа. Действие ТХМ через 3 сут после иммунизации характеризовало продуктивный период антителогенеза [Ройт А. и соавт., 2000; Сидельникова Н.М., 2004; Забродский П.Ф., Мандыч В.Г., 2007; Deskotes J., 1986; Friedman H. et al., 2003].

2.2.6. Оценка кооперации Т- и В-лимфоцитов ex vivo и in vitro Исследование кооперации Т- и В-лимфоцитов ex vivo проводили на фильтрования селезеночной суспензии через нейлоновую вату («Нитрон») [Ширшев С.В., 1998]. Для выделения В-лимфоцитов применяли реакцию комплемент-зависимого масс-цитолиза. В качестве цитотоксической сыворотки использовали моноклональные антитела против Thy 1.2 антигенов Т-лимфоцитов мыши (Cedarlane Laboratories Limited; London, Canada) [Marshak-Rothstein A. et al., 1979]. Из суспензии спленоцитов макрофаги удаляли методом негативной селекции, используя их способность прилипать к стеклянной поверхности [Ширшев С.В., 1998]. Жизнеспособность клеток оценивали в тесте с трипановым синим (она составляла 95-98%). Инкубируемая по методу J.K. Thomas, T. Imamura (1986) культура содержала 106 и 5· В- и Т-клеток соответственно, 107 эритроцитов барана в 0,15 мл среды Хенкса. Т- и В-лимфоциты с целью обеспечения сингенности клеток для каждого опыта получали из суспензии спленоцитов одной мыши.

Антителообразующие клетки (АОК), число которых характеризует эффект кооперации Т- и В-лимфоцитов, подсчитывали в инкубационных камерах через 4 суток [Thomas J.K., Imamura T., 1986]. Данный тест отражает синтез IgM В-клетками селезенки при участии Тh1-лимфоцитов.

Кооперацию Т- и В-лимфоцитов оценивали ex vivo после извлечения через 1 сут Т- или В-лимфоцитов из селезенки мышей, подвергавшихся действию ТХМ. При этом соответственно В- или Т-клетки для исследования реакции получали от интактных сингенных животных. Использованная экспериментальная модель позволяла сравнить повреждающий эффект ТХМ на Т- или В-клетки.

При изучении кооперации Т- и В-лимфоцитов использовали лимфоциты неинбредных мышей. Проводили оценку функции этих популяций иммуноци-тов in vitro по формированию АОК к ЭБ [Thomas J.K., Imamura T., 1986]. Удельный вес Т- и В-клеток в обеспечении антителопродукции определяли путем сравнения числа АОК после инкубации той или иной популяции лимфоцитов в течение 2 ч с различными концентрациями ТХМ и его метаболитов. Кооперацию Т- и В-лимфоцитов можно рассматривать как механизм на уровне взаимодействия клеток, определяющий антителопродукцию. В модели in vitro роль клеток, представляющих антиген Тлимфоцитам, вместо макрофагов выполняют В-клетки [Ройт и соавт., 2000;

Хаитов Р.М. и соавт., 2002; Забродский П.Ф., Мандыч В.Г., 2007].

2.2.7. Исследование функцию Th1-лимфоцитов Для оценки влияния ТХМ на функцию Th1-лимфоцитов исследовали формирование ГЗТ в модели, не использующей перенос сингенных иммуноцитов, в также в адоптивной модели [adopt (англ.) – принимать, усваивать], связанной с введением ИКК животным-реципиентам. ГЗТ оценивали у крыс Вистар после иммунизации внутривенным введением 2· эритроцитов барана (ЭБ) в 0,5 мл изотонического раствора хлорида натрия одновременно с действием ТХМ. Разрешающую (вызывающую реакцию) дозу ЭБ (5·108 в 0,05 мл изотонического раствора хлорида натрия) вводили под апоневроз задней лапы через 4 сут после иммунизации. Оценку реакции осуществляли через 24 часа по приросту массы стопы задней лапы крыс по сравнению с контрольной [Забродский П.Ф. и соавт., 2007].

адоптивной модели осуществлялся перенос им спленоцитов иммунизированных 108 ЭБ сингенных доноров. При этом реципиентов через 1 ч сенсибилизировали внутривенным введением 108 ЭБ. Через 4 сут под апоневроз стопы реципиентов вводили разрешающую дозу ЭБ (5·108) с последующей оценкой реакции через 24 ч. Спленоциты получали через 5 сут после иммунизации доноров. В данном эксперименте формирование ГЗТ отражало влияние ТХМ на вторичный иммунный ответ в модели адоптивной реакции, связанной с переносом иммунных спленоцитов крысамреципиентам. Доноры подвергались воздействию ТХМ через 30 мин после иммунизации [Забродский П.Ф., Мышкина А.К., 1990; Германчук В.Г, 2000].

2.2.8. Изучение антителозависимой клеточной цитотоксичности характеризующую функцию К-клеток [Фримель Х., Брок Й., 1986], определяли по методу Ю.И. Зимина, В.Ф. Ляхова (1985) через 5 сут после иммунизации, осуществляемой через 30 мин после введения ТХМ (оценка действия яда в индуктивной фазе иммуногенеза). Кроме того, ТХМ применяли через 3 сут после иммунизации ЭБ (оценка действия токсиканта в продуктивной фазе иммуногенеза).

Крыс иммунизировали ЭБ (5·108 клеток в 0,5 мл изотонического раствора хлорида натрия), ТХМ применяли через 2 сут после иммунизации.

Через 5 суток извлекали селезенку и тимус, готовили клеточные суспензии в растворе Хенкса, который затем фильтровали через капроновую сетку.

Суспензии клеток дважды отмывали изотоническим раствором хлорида натрия по 10 мин при 400g. Жизнеспособность клеток определяли методом суправитальной окраски 0,1% раствором трипанового синего. В качестве клеток-мишеней использовали трижды отмытые по 10 мин при 400g ЭБ, которые в 2,5% суспензии смешивали с равным объемом гипериммунной антисыворотки кролика в субаглютинирующем разведении (1:5000). Смесь инкубировали 30 мин при 37°С, а затем отмывали 3 раза раствором Хенкса и доводили до необходимой концентрации (1:5000). Используемую антисыворотку предварительно инактивировали в течении 30 мин при 56°С.

Спленоциты (тимоциты) смешивали с ЭБ в соотношении 20 : 1 (абсолютные значения составляли соответственно 20·106 и 1·106) в 2 мл раствора Хенкса без фенолового красного и инкубировали 4 ч при 37°С. После инкубации смесь клеток центрифугировали 20 мин при 200g, собирали супернатант.

Цитопатогенность киллеров оценивали спектрофотометрическим методом по выходу гемоглобина из лизированных эритроцитов. Контролем служили пробы, содержащие эффекторы и интактные ЭБ. Измерения оптической плотности проводили при длине волны 412 нм на спектрофотометре СФ-46.

Уровень АЗКЦ оценивали по индексу цитотоксичности (ИЦ) по формуле:

Е0 – оптическая плотность проб, содержащих эффекторные клетки и сенсибилизированные клетки мишени;

Ек – оптическая плотность супернатантов проб, содержащих эффекторные клетки и интактные эритроциты;

соответствующего числа эритроцитов (гемолиз проводили дистиллированной водой).

2.2.9. Оценка активности естественных клеток-киллеров Оценка естественной цитотоксичности осуществлялась спектрометричеким методом [Гордиенко С.М., 1983], где клетками-эффекторами служили спленоциты белых крыс (in vivo) и мышей (in vitro), а клеткамимишенями – эритроциты кур [Белокрылов Г.А. и соавт., 1980]. Очищенную взвесь лимфоцитов получали, удаляя прилипающие клетки инкубацией в колонках с нейлоновой ватой. Эффекторные клетки взвешивали в концентрации 107 клеток в 1 мл питательной среды следующего состава:

среда № 199 с добавлением до 10% истощенной эритроцитами кур эмбриональной телячьей сыворотки, L-глютамина (300 мкг/мл), стрептомицина (100 мкг/мл) и пенициллина (100 Ед/мл). В ходе опыта обеспечивали соотношение эффектор-мишень 10:1, при этом концентрация клеток-мишеней (эритроциты кур) составляла 106 в 1 мл питательной среды.

Цитотоксический тест ставили в пластиковых камерах «Linbro» (76-013-05) спектрофотометрическому определению концентрации гемоглобина, выделившегося из неразрушенных эритроцитов кур. В опытные лунки добавляли по 0,1 мл взвеси эффекторных клеток и по 0,1 мл взвеси питательной среде без эритроцитов кур; питательная среда; взвесь эритроцитов кур в питательной среде без эффекторов. В конце инкубации центрифугировали 5 мин при 100g. 0,2 мл надосадка переносили в другие свободные ряды микропластины, а к осадку приливали 0,2 мл 0,25% раствора додецилсульфата натрия для лизиса эритроцитов кур, оставшихся неразрушенными в ходе цитотоксической реакции. Оптическую плотность осадков измеряли в специально изготовленных микрокюветах с длиной оптического пути 1 см и объемом 0,1 мл на СФ-46 при длине волны 413 нм.

Определяли количество гемоглобина, выделившегося из неразрушенных ЕКК ЭК, путем лизиса осадка 0,25% ДСН. Индекс цитотоксичности (ИЦ) определяли по формуле:

Ек - оптическая плотность лизированного осадка ЭК контрольной пробы без эффекторов против лизирующего раствора;

Ео - оптическая плотность лизированных оставшихся в осадке опытной пробы неразрушенных ЭК против лизированного осадка эффекторных клеток без ЭК;

Функцию ЕКК оценивали через 1, 3, 6 и 9 cут после интоксикации ТХМ у крыс. In vitro активность ЕКК изучалась на белых мышах при концентрациях ТХМ, составляющих 1; 10 и 50 мМ.

2.2.10. Исследование функции надпочечников, активности эстераз Тклеток, моноцитов, макрофагов и перекисного окисления липидов Оценку уровня кортикостерона в плазме крови крыс после действия ТХМ, характеризующего состояние ГГАС, проводили флюорометрическим методом. Определяли уровень неконъюгированных 11-оксикетостероидов по методу В.В. Давыдова (1970), в частности, кортикостерона (КС) через 1, 6 и 12 ч после интоксикации ТХМ.

Экстракция кортикостерона из анализируемых образцов плазмы крови проводилась четыреххлористым углеродом. Для удаления пигментов плазмы и нестероидных соединений экстракты промывались с помощью 0,1% раствора NaOH и дистиллированной воды. Затем верхний слой, включающий в себя кортикостерон, переносился, выпаривался и повторно экстрагировался 6 мл метиленхлорида или хлороформа. Для образования флюоресцентных комплексов использовалась смесь концентрированной флюоресценции растворы исследовались на флюориметре с использованием интерферентных фильтров: первичного с пропусканием волн длиной 470 нм и вторичного – 540 нм.

лизосомальными ферментами и играют важную роль в реализации киллерной функции Т-лимфоцитов [Ледванов М.Ю., Киричук В.Ф., 1996; Ferluga J. et al., 1972; Li C.G. et al., 1983]. Изменение эстеразной активности в клетках отражает, с одной стороны, функциональную активность иммуноцитов, с циркулирующей крови [Хейхоу Ф.Г.Дж., Кваглино Д., 1983].

Активность ацетилхолинэстеразы в Т-лимфоцитах крысы определяли методом G.M. Ellman et al. (1961), выделяя клетки путем фильтрования селезеночной суспензии через нейлоновую вату («Нитрон») [Ширшев С.В., 1998]. В 1,5 мл суспензии, содержащей 5108 клеток в 1 мл 0,1 молярного фосфатного буфера (рН–8,0), добавляли 20 мкл 0,075 моль ацетилхолиниодида и 50 мкл 0,01 моль дитио-бис-нитробензойной кислоты. После 20 мин инкубации при 250С реакция останавливалась добавлением 100 мкл 1,5дифтор-2,4-динитробензола и регистрировали увеличение оптической плотности спектрофотометрически (420 нм) [Szelenyi J.G. et al., 1982]. За единицу активности ацетилхолинэстеразы принимали мкмоль ацетилхолина, гидролизованного за 1 мин в мл суспензии, содержащей 109 Т-лимфоцитов [Kutty K.M. et al., 1976]. Активность ацетилхолинэстеразы определяли через 4 сут после отравления ТХМ.

Перекисное окисление липидов (ПОЛ) оценивали по суммарной хемилюминесценции, активированной форболовым эфиром (0,156 МКм) [Михальчик Е.В. и соавт., 2004], по активности каталазы и пероксидазы, содержанию малонового диальдегида в крови спектрофотометрически [Коробейникова Э.Н., 1989; Клинцевич А.Д. и соавт., 1994; Валеева И.Х. и соавт., 2002].

2.3. Методы статистической обработки результатов исследований Полученные данные обрабатывались с применением общепринятых статистических методов [Урбах В.Ю., 1975; Гублер Е.В., 1978; Лакин Г.Ф., 1980]. При этом различия между средними значениями в опытной и