МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

имени М. В. Ломоносова

_

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

УДК 547.992.2

Гречищева Наталья Юрьевна

Взаимодействие гумусовых кислот с полиядерными

ароматическими углеводородами: химические и токсикологические аспекты 02.00.03 –Органическая химия 11.00.11 –Охрана окружающей среды и рациональное использование природных ресурсов Научные руководители:

кандидат химических наук

И. В. Перминова доктор химических наук, профессор В. С. Петросян

Научный консультант:

доктор биологических наук Д. Н. Маторин Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва-

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ……

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.

Характеристика структуры и физико-химических свойств гумусовых 1.1.

кислот

Структура и физико-химические свойства ПАУ

1.2.

Взаимодействие гумусовых кислот с ПАУ

1.3.

1.3.1. Количественная характеристика взаимодействия гумусовых кислот с ПАУ

1.3.2. Зависимость реакционной способности гумусовых кислот от свойств ПАУ и ГФК

1.3.3. Взаимосвязь структуры и реакционной способности гумусовых кислот по отношению к ПАУ

1.3.3.1. Гипотезы о механизме взаимодействия гумусовых кислот с ПАУ..... 1.3.4.. Влияние рН и ионной силы на связывание ПАУ гумусовыми кислотами

Влияние ГФК на биологическую активность ПАУ

1.4.

1.4.1. Влияние ГФК на биоаккумуляцию ПАУ водными организмами........ 1.4.2. Количественная оценка влияния ГФК на биоаккумуляцию ПАУ....... 1.4.3. Влияние ГФК на токсичность ПАУ

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

2.

Характеристика объекта исследования

2.1.

Изучение cвязывающей способности ГФК по отношению к ПАУ...... 2.2.

2.2.1. Определение констант связывания ПАУ гумусовыми кислотами....... 2.2.2. Установление количественной взаимосвязи между структурой и константами связывания ПАУ гумусовыми кислотами

2.2.3. Изучение связывающей способности гидролизованных препаратов гумусовых кислот по отношению к пирену

2.2.3.1. Общая характеристика гидролизованных препаратов гумусовых кислот

2.2.3.2. Изучение связывающей способности гидролизованных препаратов ГК по отношению к пирену

2.2.4. Исследование механизма взаимодействия гумусовых кислот с ПАУ

2.2.5. Исследование влияния рН и ионной силы среды на связывание ПАУ гумусовыми кислотами

Исследование детоксицирующей способности ГФК по отношению к 2.3.

ПАУ

2.3.1. Установление диапазонов токсичности модельных ПАУ................. 2.3.2. Количественная оценка детоксицирующей способности ГФК по отношению к ПАУ

2.3.2.1. Исследование влияния ГФК на хроническую токсичность ПАУ...... 2.3.3. Установление взаимосвязи между структурой и детоксицирующей способностью ГФК по отношению к ПАУ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.

Материалы и оборудование

3.1.

Техника эксперимента

3.2.

3.2.1. Анализ препаратов гумусовых кислот

Методика определения констант связывания ПАУ гумусовыми 3.2. кислотами с помощью метода тушения флуоресценции

3.2.3. Методика определения констант связывания ПАУ модельными кислотами с помощью метода тушения флуоресценции

3.2.4. Методики исследования способности гумусовых кислот образовывать комплексы с переносом заряда

3.2.5. Методики токсикологических экспериментов

3.2.5.1 Методика альгологического биотестирования

3.2.5.2 Методика эксперимента с использованием тест-объекта Daphnia Magna

3.2.6. Приготовление тест-растворов, содержащих ПАУ

ВЫВОДЫ

ВЫРАЖЕНИЕ ПРИЗНАТЕЛЬНОСТИ

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

Гумусовые кислоты представляют собой наиболее обширный класс природных соединений, входящих в состав органического вещества почв, природных вод и твердых горючих ископаемых. Наличие в молекулах гумусовых кислот ароматического каркаса, замещенного карбоксильными, гидроксильными и карбонильными группами, обеспечивает их высокое сродство к полиядерным ароматическим углеводородам (ПАУ). В связи с этим взаимодействие с гумусовыми кислотами является важнейшим фактором, контролирующим концентрацию свободной формы ПАУ в водных экосистемах. Учитывая, что именно свободная форма обладает максимальной токсичностью, гумусовые кислоты можно рассматривать как детоксиканты по отношению к ПАУ. Необходимость создания адекватных моделей биогеохимических циклов и прогноза развития токсикологической ситуации в загрязненных экосистемах определяет важность и актуальность изучения связывающей способности гумусовых кислот по отношению к ПАУ и установления количественных соотношений между строением, связывающей способностью и детоксицирующими свойствами гумусовых кислот. Указанные проблемы определили постановку целей и задач настояшей работы.

Целью работы являлось изучение связывающей способности и детоксицирующих свойств гумусовых кислот по отношению к ПАУ и установление их взаимосвязи со строением гумусовых кислот.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• определить константы связывания ПАУ гумусовыми кислотами различного происхождения и фракционного состава;

• установить корреляционные соотношения между константами связывания и структурными параметрами гумусовых кислот;

• количественно охарактеризовать детоксицирующие свойства гумусовых кислот по отношению к ПАУ;

• установить взаимосвязь детоксицирующих свойств со структурными параметрами и связывающей способностью гумусовых кислот по отношению к ПАУ.

1.1. Характеристика структуры и физико-химических Гумусовые кислоты (от латинского “humus” – земля, почва) представляют собой наиболее реакционноспособную часть обширного класса природных соединений, объединяемых под названием гуминовые органического вещества водных и почвенных сред [1-4].

Образование ГВ в природных средах происходит в результате химического и биологического разложения растительных и животных остатков [1, 2, 6]. В основе данного процесса лежит отбор устойчивых к биодеградации структур. В отличие от синтеза биополимеров, протекающего по заданному генетическому коду, образование гуминовых веществ - чисто стохастический процесс [7-9]. По этой причине ГВ представляют собой смесь макромолекул переменного состава и нерегулярного строения [10, 11].

Общепринятая классификация ГВ [9, 10, 12] основана на различии в растворимости в кислотах и щелочах. Согласно этой классификации ГВ подразделяют на три основные составляющие: гумин – неизвлекаемый остаток, нерастворимый ни в щелочах, ни в кислотах; гуминовые кислоты (ГК) – фракция ГВ, растворимая в щелочах и нерастворимая в кислотах;

фульвокислоты (ФК) – фракция ГВ, растворимая в щелочах и кислотах.

Под термином "гумусовые кислоты" понимают сумму гуминовых и фульвокислот. В нашей работе для сокращенного обозначения гумусовых кислот используется аббревиатура ГФК.

Макроэлементами, образующими молекулы ГФК, являются углерод, водород и кислород. Азот и сера содержатся в ГФК на уровне 1-3 %, обязательной составной частью ГФК являются микроэлементы и вода [2, 13]. Молекулярные массы ГФК, по разным данным, составляют от 700 до 200000 Дальтон [6, 14], причем молекулярные массы ГК заметно больше, чем ФК.

Средний элементный состав ГФК, рассчитанный авторами [15] на основании статистической обработки имеющихся литературных данных, приведен в Табл. 1.1.

Средний элементный состав ГФК различного происхождения (n - число препаратов)[15] 57.4±2.5 5.0±0.8 34.5±2.7 2.9±1.0 0.3±0.1 0.46±0.06 1.06±0. 54.1±4.3 4.9±1.1 38.8±3.7 2.2±0.5 0.6±0.2 0.54±0.09 1.04±0. 51.7±3 4.7±0.6 40.8±3.8 2.1±1.6 1.1±0.3 0.6±0.08 1.12±0. 46.2±4.3 4.3±0.7 46.8±5.1 1.8±1.1 1.0±0.7 0.76±0.14 1.1±0. 56.4±6.6 5.5±1.4 32.1±7.8 3.7±1.5 2.6±1.4 0.43±0.18 1.2±0. Как видно из Табл. 1.1, содержание углерода в ГК варьирует от 50 до 60%, кислорода – от 30 до 40%. ФК, наоборот, характеризуются более низким содержанием углерода и более высоким - кислорода. Атомные соотношения H/C и О/С, рассчитываемые из данных элементного анализа, ненасыщенных фрагментов и кислородсодержащих функциональных групп. Так, при соотношении Н/С1.4, то структура ГФК носит преимущественно алифатический характер [6]. По этим критериям можно говорить, что ГК обогащены ароматическими фрагментами и обеднены функциональными группами по сравнению с ФК.

Для ГК соотношение Н/С изменяется в ряду: морские воды > пресные воды > торф почвы.

Относительно большие значения стандартного отклонения для данных по содержанию N и S авторы обзора [15] объясняют большими ошибками в определении этих элементов. Кроме того, возможно, что содержание этих элементов в ГФК в значительной степени случайно.

высокомолекулярные ароматические оксикарбоновые кислоты. В силу нерегулярности строения ГФК не имеют единой структурной формулы, поэтому можно говорить только о «гипотетических средних» структурах.

Гипотетический структурный фрагмент ГФК почвы приведен на Рис. 1. [15].

HOOC COOH

COOH HO COOH OH

HOOC COOHHO OH

O O O OH O

OH NO OH

Рис. 1.1. Гипотетический структурный фрагмент ГФК почвы [15].

Согласно наиболее общим представлениям [2, 3, 10, 11] (что и структурных блоков, принципиально различающихся по своей химической природе и традиционно определяемых в терминах “ароматический каркас” и “углеводная периферия”. Указанная дифференциация основывается на результатах гидролитического расщепления ГФК, достоверно свидетельствующих о существовании в их составе “негидролизуемой” (каркас) и “гидролизуемой” (периферия) части. Предполагают [16, 17, 18, 19], что гидролитическое расщепление затрагивает только периферическую часть молекул ГФК, расщепляя гликозидные, сложноэфирные и пептидные связи и вызывая разрушение полисахаридно-пептидного комплекса.

Согласно [6], при гидролизе 6 M HCl в раствор переходит 30 - 45 % массы ГК почв и 60 - 75 % ФК. Гидролизуемость ГК торфов и бурых углей несколько ниже. Основной частью гидролизатов ГК и ФК почв являются углеводы, массовое содержание которых в ГФК по различным источникам достигает 20-40 %. Более детальное исследование их состава показало, что углеводная часть ГФК представлена в основном гексозами (30 - 60 %, с преобладанием глюкозы), в меньших количествах - метилпентозами и пентозами [6, 20, 21]. Уроновые кислоты составляют обычно 5 - 20 % от суммы сахаров [6]. Высказано предположение, что моно- и полисахариды связаны с каркасной частью ГФК посредством сложноэфирных мостиков [22]. По данным [6], содержание аминокислот в полипептидной периферии в препаратах ГК почв составляет 6 - 10 % от их массы. Содержание аминокислот в соответствующих ФК несколько ниже (5 - 7 %).

Аминокислотный состав характеризуется постоянством при значительном преобладании аспарагиновой и глютаминовой аминокислот, глицина и аланина. На сегодняшний день неясно, входят ли аминокислоты в состав ГФК как индивидуальные остатки, или в составе полипептидных цепей.

Опыт применения ферментативного гидролиза позволяет предполагать, что значительная часть аминокислот образует пептидные цепи [23]. Кроме того, имеются данные [6,12] о наличии в составе гидролизатов ГК фенолов (до 5 %) и ФК-подобных соединений (10 - 15 %).

Для изучения негидролизуемого каркаса молекул используют в основном методы жесткой (окислительной и пиролитической) деструкции [6]. При окислении ядра ГФК происходит образование главным образом ароматических карбоновых кислот, что подверждает наличие в структуре ГФК высокозамещенных ароматических фрагментов. Выход ароматических кислот колеблется от 2 - 5 % (для ФК) до 15 - 20% (для ГК) [6]. Однако в результате деструкции получаются видоизмененные, по сравнению с состоянием в молекулах гумусовых кислот, осколки молекул, что существенно затрудняет интерпретацию получаемых данных. Поэтому в последнее время все большее распространение получает недеструктивный физический метод спектроскопия ЯМР 13С.

Содержание ароматического углерода в молекулах ГФК различного происхождения, определенного методом спектроскопии ЯМР С, по данным [24] может изменяться в диапазоне 26 - 53 % для ГК почв, 16 для ФК почв, 20 - 27 % для ФК природных вод, 30 - 47 % для ГК угля.

Анализ данных спектроскопии ЯМР С дает возможность установить различия в структуре ГК и ФК различных природных источников.

Так, согласно данным С ЯМР-исследования, ГК дерновоподзолитых и серых лесных почв содержат примерно в два раза больше ароматических фрагментов по сравнению с соответствующими ФК [25, 26].

В работах [27, 28] отмечалось, что ФК почв по сравнению с ГК характеризуются более высоким содержанием СООН групп, в то время как содержание алифатических фрагментов в них несколько ниже. Согласно большей части опубликованных данных [26, 27, 28], содержание карбогидратных фрагментов в ФК почв превышает таковое для ГК в 1.5- раза, однако исследователями [29, 30, 31] отмечается их одинаковое содержание.

Cодержание углеводных структур в ФК природных вод находится на уровне такового в ГК или несколько ниже [32-34]. В то же время прочие закономерности, обнаруженные для ГК и ФК почв, сохраняются для ГК и ФК природных вод. Так, содержание СООН групп в ФК природных вод выше, чем в ГК, а содержание ароматических фрагментов - ниже. Согласно [32, 34], ФК содержат больше алкильных фрагментов, однако данные некоторых исследователей [33, 35] находятся в противоречии с этим выводом.

Следует отметить, что для оценки содержания ароматического используют косвенные методы анализа, а именно УФ-спектроскопию и элементный анализ [6, 36, 37]. Данные методы позволяют оценить вклад показателям, как молярное поглощение растворов при 280 нм и атомное соотношение Н/С. Так, в работе [37] найдена тесная корреляция между процентным содержанием ароматического углерода, определенным методом спектроскопией ЯМР С, молярным поглощением растворов ГФК при 280 нм (ABS280) и средневесовыми значениями молекулярных масс для десяти препаратов ГФК, выделенных из природных вод, и стандартного препарата ГК фирмы Aldrich. Тесные корреляции (r = 0.94) между содержанием CAr и значениями ABS280 были получены для девяти сопоставлении значений ABS280 и H/C был сделан вывод о более высоком вкладе ароматических фрагментов в структуру ГК и ФК почв и болотных вод по сравнению с ГК и ФК поверхностных и грунтовых вод.

Наблюдаемые различия в структурах ГФК разных природных сред связаны со спецификой соответствующих источников гумусообразования [4, 6].

предшественниками ГФК являются продукты разложения лигнина, полифенолы и производные фенолов, синтезируемые микроорганизмами, то есть вещества, обогащенные ароматическими фрагментами [39, 40].

ГФК морских вод и донных отложений образуются, преимущественно, из остатков водорослей и планктона, главными компонентами которых являются липиды, полисахариды и пигменты - соединения алифатического и алициклического рядов [41].

Наличие в структуре ГФК гидрофобных ароматических фрагментов, замещенных полярными функциональными группами, определяет их гидрофобные и поверхностно-активные свойства.

Согласно работам [42-46] поверхностная активность ГФК во многом определяется их происхождением, условиями среды, концентрацией ГФК в растворе, их молекулярными массами, элементным составом. Показано [42, 43], что для ГФК с низким содержанием углерода, высоким содержанием кислорода и кислотных групп поверхностная активность выражена более сильно. В работах [44, 45] отмечено уменьшение поверхностного натяжения растворов гуминовых и фульвокислот с увеличением их концентрации. При этом большее уменьшение поверхностного натяжения (до 31 дин/см) наблюдалось в случае ФК, что говорит о более высокой поверхностной активности ФК по сравнению с ГК. Так, ФК снижали поверхностное натяжение воды от 72.0 до 46. дин/см при рН 7, в то время как соответствующие ГК только до 69. дин/см. Аналогичные данные получены исследователями [46]. Однако при увеличении рН до 12, поверхностное натяжение уменьшалось до 43.2 и 44.2 дин/см для ФК и ГК, соответственно [45]. В работе [44] наблюдали увеличение поверхностного натяжения растворов ГК и ФК на 0-5 дин/см с возрастанием температуры от 5 до 250 С.

Авторами [42, 43] было отмечено, что величины поверхностного натяжения растворов ГФК, при которых происходит мицеллообразование данных молекул, составляют в среднем 31.3-34.3 дин/см, в случае ФК, и 37.0-51.5 дин/см, для ГК. В среднем концентрация, при которой наблюдается мицеллообразование, выше для ФК, чем для ГК, что указывает на меньшую тенденцию ФК к агрегированию. Полученные результаты авторы связывают с большей гидрофобностью молекул ГК по сравнению с ФК. Согласно [44] концентрация мицеллообразовния молекул ГК уменьшалась от 10 до 1.3 г/л с возрастанием молекулярных масс от 10000 до 300000 Дальтон. Причем данные значения не зависели от температуры.

Гидрофобные свойства ГФК различного происхождения были исследованы авторами [47-51] посредством разделения данных молекул на гидрофобные и гидрофильные фракции с помощью обратно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ). Так, для алифатических, ароматических структур и сопряженных алифатических кетонов. Гидрофильные фракции характеризовались, в основном, обогащенностью функциональными группами кислотного характера, углеводными фрагментами и присутствием уроновых кислот [47-49]. Для ФК природных вод было показано, что при общем выходе 70% гидрофильная фракция составляла 40% от общего содержания образца, в то время как гидрофобная фракция - 30%. Неполноту выхода (70%) авторы объясняют необратимой адсорбцией молекул ФК на неподвижой фазе колонки, а также механическими потерями при проведении эксперимента.

происхождения с помощью ОФ-ВЭЖХ на октил-сефарозе CL-4B была отмечена более высокая гидрофобность ГК донных отложений по происхождения, гидрофобность ГК оказалась выше по сравнению с гидрофобностью ФК. Так, количество несорбированных препаратов ФК почв и донных отложений составило 87 и 64 %, для соответствующих ГК и 8 %. Увеличение гидрофобности с возрастанием молекулярной массы от 10000 до 300000 Дальтон было отмечено в работе [51] для ГК морских донных отложений. Однако для ФК была продемонстрирована обратная зависимость: увеличение гидрофильности ФК с увеличением молекулярной массы от 10000 до 300000 Дальтон.

В работе [52] были измерены коэффициенты распределения в системе октанол-вода, являющиеся количественной характеристикой гидрофобности молекул, для ГК фирмы Fluka и водных ГФК. Полученные значения были практически одинаковыми и составили 0.084 при рН 6.5.

коэффициентов на 5000 % и 140 % для ГК Fluka и водных ГФК, соответственно, что, по-видимому, обусловлено увеличением их гидрофобности в результате протонирования ионогенных групп. Различия в значениях полученных коэффициентов могут быть обусловлены различиями в структуре данных препаратов.

Вышеописанные свойства ГФК, обусловленные спецификой их строения определяют способность ГФК связывать как гидрофобные органические экотоксиканты, так и тяжелые металлы. Так, ГФК способны образовывать водородные связи, активно участвовать в сорбционных процессах, вступать в гидрофобные, ионные и донорно-акцепторные взаимодействия с различными классами органических соединений [53, 54].

Следует отметить, что присутствие в молекулах ГФК как электронодонорных, так и электроно-акцепторных функциональных групп обуславливает их способность выступать, соответственно, как акцепторами, так и донорами по отношению к различным соединениям. В Табл. 2.2 приведены потенциалы ионизации ряда соединений, при взаимодействии с которыми ГФК могут проявлять донорно-акцепторные свойства.

Соединения выступающие донорами или акцепторами по отношению к ГФК [54] фенилендиамин Как видно из таблицы, ГФК проявляют акцепторные свойства по отношению к соединениям со значением потенциала ионизации в диапазоне 6.5 - 8 эВ. Донорные свойства ГФК проявляют к соединениям со значением потенциала ионизации выше 9 эВ.

Таким образом, имеющиеся литературные данные по составу и строению ГФК показывают, что последние обладают рядом свойств, которые должны способствовать их связыванию с органическими закономерностей взаимодействия ГФК с ПАУ весьма важным является специфика химических свойств ПАУ, рассмотрению которых будет посвящен следующий раздел.

1.2. Структура и физико-химические свойства ПАУ Полиядерные ароматические углеводороды (ПАУ) образуют класс химических соединений, обладающих токсическими, мутагенными и канцерогенными свойствами. Молекулы ПАУ состоят из бензольных колец, сконденсированных при помощи двух или более общих соседних углеродных атомов. Если центры колец в формуле ПАУ расположены на одной прямой, то такие ПАУ являются линейными; если же они могут быть соединены только ломаной линией, то данные ПАУ являются ангулярными [55]. Примеры линейного и ангулярного ПАУ приведены на Рис. 1.2.

Рис. 1.2. Линейный и ангулярный ПАУ.

Как видно из рисунка, антрацен относится к линейным ПАУ, фенантрен - к ангулярным. Соединение бензольных колец в ортоположении называют анеллированием. Антрацен является линейно анеллированным ПАУ. Фенантрен ангулярно анеллированным.

конденсированных колец называются аценами. Углеводороды, содержащие 9,10 - связь аналогично фенантрену называют фенами.

Наличие сопряженных -электронных систем в молекулах ПАУ во многом определяет их высокую стабильность. Такая стабильность обусловлена размещением -электронов на связывающих молекулярных орбиталях молекул ПАУ. При этом антисвязывающие орбитали остаются вакантными. Одним из наиболее важных показателей устойчивости ПАУ является количество ароматических секстетов, образуемых данной молекулой [57]. Примером может служить сравнение стабильности молекул антрацена и фенантрена. Как видно из Рис. 1.2 антрацен имеет только один секстет. В случае же фенантрена возможно образование двух секстетов, что повышает стабильность молекулы в целом. Следует реакционноспособной как для фенантрена, так и антрацена, ввиду того, что дополнительного секстета и не сопровождается потерей резонансной стабилизации молекулы [57].

Примерами более высокой реакционной способности антрацена, по сравнение с фенантреном, могут служить реакции синхронного фотодимеризоваться и образовывать эндопероксиды под действием УФоблучения в присутствии кислорода. Для фенантрена вышеупомянутые реакции протекают в более жестких условиях.

По мере увеличения количества колец в линейном ПАУ наблюдается “размазывание” стабильности системы, увеличению реакционноспособности и склонности ПАУ вступать в реакции присоединения по центральным циклам (типа 9,10-положения в молекуле антрацена). При переходе к ангулярным ПАУ реакционноспособность центров в пара-положениях снижается. Для ангулярных ПАУ, содержащих 9,10-связь фенантрена, тенденция к повышению реакционноспособности орто-положения с увеличением степени аннелирования выражена в меньшей степени [77-79].

Принципы построения аценов и фенов повторяются в более конденсированных циклических системах и могут комбинироваться между собой [56, 57]. Так, в результате линейного аннелирования молекулы пирена возрастает реакционная способность образующихся ПАУ.

Ангулярное аннелирование приводит к возникновению новых секстетов и повышению устойчивости молекулы. Некоторые физико-химические свойства ПАУ приведены в Табл. 1.3.

Физико-химические свойства некоторых ПАУ (по данным [58-61]) антрацен антрацен пирен перилен флуорантен температурами плавления и кипения, низкой растворимостью в воде и высокими значениями коэффициентов распределения в системе октанолвода (lg Kow), что свидетельствует о высокой гидрофобности данных молекул. Данные свойства являются следствием высокой стабильности молекул ПАУ. В работах [62-64] между водной растворимостью ПАУ и lg Kow найдены линейные корреляционные зависимости.

Cогласно авторам работ [65-67], при условии введения температуры плавления ПАУ как корректирующего фактора, угловой коэффициент выше упомянутых зависимостей близок к -1:

где S - водная растворимость ПАУ; Тпл - температура плавления ПАУ; a, b, и с - эмпирические коэффициенты.

Следует отметить большой разброс данных по опубликованным величинам водной растворимости ПАУ [68-75]. Так, согласно [76], при уменьшении водной растворимости ПАУ от 1 г/л до 1 мкг/л разброс данных увеличивается от 3% до 70%, соответственно. По-видимому, вероятной причиной этому могут служить погрешности в приготовлении истинных растворов ПАУ ввиду их низкой растворимости в воде.

Как видно из Табл. 1.3, для молекул ПАУ характерны достаточно низкие значениями потенциалов ионизации, что является следствием нахождение -электронов данных молекул на высокоэнергетических связывающих орбиталях. Данный факт обуславливает возможность молекул ПАУ выступать в качестве доноров (Д) электронов при образовании комплексов с переносом заряда (КПЗ) с различными n-акцепторами (А). Подтверждением вышесказанному могут служить данные авторов [56, 80-82], свидетельствующие об образовании КПЗ молекулами ПАУ с такими акцепторами, как полинитроароматические соединения, хлоранил, нитрилы, хиноны, тетрацианоэтилен, пиромеллитовый ангидрид, N,N-диметилпиромеллитовый имид и др. Для большинства случаев необходимым условием образования КПЗ является присутствие реагентов в мольных соотношениях 1:1 [80]. Однако для пикриновой кислоты и 2,4,7-тринитрофлуорен-9-она мольные соотношения соответственно [56]. В большинстве случаев образующиеся комплексы весьма нестабильны. Хотя имеются сведения об использовании производных некоторых ПАУ, например тетрахалькогенотетраценов, в синтезе катион-радикальных солей, обладающих высокой проводимостью [83].

персистентность и распределение в водных экосистемах. Способность ПАУ к гидрофобным взаимодействиям в водных растворах и образованию комплексов с переносом заряда, где молекулы ПАУ могут выступать донорами электронов, могут в существенной степени способствовать их взаимодействию с ГФК.

1.3. Взаимодействие гумусовых кислот с ПАУ При попадании в водную среду в зависимости от физико-химических свойств (водная растворимость, гидрофобность, летучесть паров и др.) ПАУ могут существовать в различных формах: истинно-растворенной, аккумулированной биотой и др.

конденсированных ароматических кольца, в основном сорбируются на взвешенном веществе, тогда как низкомолекулярные ПАУ существуют преимущественно в растворенной форме и составляют 2-16% от адсорбированного ПАУ.

На формы существования ПАУ в водных средах большое влияние оказывает присутствие растворенного органического вещества (РОВ), которое на 60-80% представлено ГФК [53]. Связывание ПАУ гумусовыми растворенного состояния, что может приводить к изменению равновесия, устанавливающегося между взвешенной и растворенной формами ПАУ [87-98], сопровождаться увеличением их растворимости в воде [99, 100], уменьшением летучести [101] и биоаккумуляции [7, 9, 96, 102], ускорением фотолиза ПАУ [102-108]. В связи с этим, для прогноза состояния ПАУ в водных экосистемах необходимо получение количественных характеристик их взаимодействия с ГФК.

1.3.1. Количественная характеристика взаимодействия гумусовых кислот с ПАУ с помощью константы связывания Связывание ПАУ гумусовыми кислотами можно упрощенно описать следующим уравнением реакции [111, 119]:

Количественной характеристикой такого взаимодействия является константа связывания, записываемая как:

где [ПАУ-ГФК] - равновесная концентрация молекулярного комплекса ПАУ-ГФК; [ГФК] и [ПАУ] - равновесные концентрации свободно растворенных ГФК и ПАУ, соответственно.

высокомолекулярные соединения нерегулярного строения, реакция (1.2) не отражает истинной стехиометрии взаимодействия ГФК с ПАУ. Весьма вероятно, что одна макромолекула ГФК содержит несколько реакционных центров, способных связывать молекулы ПАУ. Поэтому уравнение (1.3) описывает, скорее, взаимодействие одной молекулы ПАУ с одним реакционным центром ГФК. В связи с тем, что количество реакционных центров, приходящееся на единицу массы ГФК неизвестно, то обычно для расчета константы связывания используют не молярную, а массовую концентрацию ГФК, выраженную в кг органического углерода (кг С) на литр раствора. В этом случае процесс (1.2) можно рассматривать как сорбцию ПАУ гумусовыми кислотами. Такую константу обозначают с помощью подстрочного индекса ОС (Кос), при этом ее размерность - л/кг С, обстоятельство позволяет записать Кос как константу сорбции. Как правило, в природных средах общая концентрация ГФК (СГФК) намного больше таковой для ПАУ (СПАУ). Поэтому равновесную концентрацию ГФК можно принять равной общей концентрации ГФК: [ГФК] СГФК.

Тогда выражение для константы связывания преобразуется к следующему виду:

где Кос -константа связывания ПАУ гумусовыми кислотами в расчете на массовую концентрацию ГФК, выраженную в кг органического углерода (кг С) на л, - доля свободного ПАУ, которую рассчитывали по формуле:

Как видно из уравнения (1.4), для определения Кос необходимо осуществить измерение концентрации ПАУ, несвязанного ГФК. Для этой цели в литературе описано применение следующих методов: гельхроматографии [96, 112], ультрафильтрации [96, 113], тонкослойной хроматографии [96], обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ) [114-115], диализа [116-117], жидкостной экстракции [118-120], тушения [121-122] и поляризации флуоресценции [123], а также методов, основанных на регистрации изменения водной растворимости [124] и биоусвояемости [125, 126] ПАУ в присутствии ГФК, изменении концентрации углеводородов в газовой фазе над раствором предполагает разделение свободной и связанной форм ПАУ как стадию, предшествующую определению, что может вносить существенные погрешности в получаемые значения Кос.

Так, применение ОФ-ВЭЖХ позволяет разделить свободную и связанную с ГФК формы ПАУ с помощью адсорбции на колонке с сорбируется, в то время как ПАУ, связанный с ГФК, проходит через колонку, не сорбируясь. В получаемые результаты могут вносить погрешности такие факторы, как десорбция некоторого количества ПАУ из комплекса ГФК-ПАУ вследствие взаимодействия ПАУ с адсорбентом или же недостаточно полная сорбция свободной формы ПАУ. Кроме того, агрегирование их молекул и частичную сорбцию на колонке. Как следствие, возможно занижение определяемых значений Кос.

свободную и связанную формы ПАУ с помощью мембран. Однако, высокогидрофобных ПАУ (с высокими значениями коэффициентов распределения октанол-вода) вследствие потенциальной сорбции на мембранах. Это может приводить к завышению значений определяемых Кос [96]. Несмотря на указанные погрешности методов, авторами [114] была найдена хорошая корреляция между значениями Кос антрацена для ГК Aldrich и водных ГФК, определенных с помощью диализа и ОФ-ВЭЖХ.

Соответствующие коэффициенты корреляции (r2) составили 0.70 и 0.68.

Одним из наиболее распространенных методов, позволяющим определять концентрацию свободного и связанного с гумусовыми кислотами ПАУ без их предварительного разделения, является метод тушения флуоресценции. Использование данного метода исключает появление артефактов, вызываемых смещением равновесия в системе ПАУ-ГФК. Кроме того, использование данного метода не требует определения точной концентрации ПАУ в растворе. В связи с тем, что метод тушения флуоресценции был использован в нашей работе для определения констант связывания ПАУ гумусовыми кислотами, остановимся более подробно на этом методе.

Метод тушения флуоресценции основан на измерении уменьшения интенсивности флуоресценции флуорофора (ПАУ) в присутствии тушителя (ГФК). При этом механизм тушения флуоресценции может быть динамическим или статическим. Динамическое тушение обусловлено столкновением тушителя и флуорофора в результате диффузии в течение времени жизни возбужденного состояния. Вследствие контакта флуорофор возвращается в основное состояние без излучения фотона. В случае статического тушения между флуорофором и тушителем в основном состоянии образуется комплекс, который не флуоресцирует [129].

Информация о типе тушения позволяет сделать предположение о механизме взаимодействия между тушителем и флуорофором. Для идентификации механизма тушения изучают зависимость тушения флуоресценции от температуры и вязкости растворов, изменение спектров поглощения флуорофора и времени затухания флуоресценции в отсутствие ( и в присутствии ( тушителя. Так, в случае статического тушения, флуоресценция обусловлена только несвязанными в комплекс флуорофорами, и, следовательно, 0/ = 1. Для динамического тушения наблюдается пропорциональное уменьшение интенсивности (F) и времени затухания флуоресценции 0/ = F0/F [129].

Исследованию механизмов тушения ПАУ гумусовыми кислотами посвящен целый ряд работ [122, 124, 130-133]. Однако ввиду сложности изучаемой системы их выводы зачастую противоречивы. Так, в работе [131] была исследована температурная зависимость процессов тушения флуоресценции флуорантена ГК почв. Увеличение температуры от 283 до 313 К оказывало незначительный эффект на степень тушения (F0/F) ПАУ гуминовыми кислотами. В работах [124, 131] отмечена неизменность времен затухания флуоресценции (0/) некоторых ПАУ в присутствии и отсутствие различных концентраций ГФК. Авторы [131] наблюдали незначительное уменьшение времени жизни пирена (0/ = 1.2) в присутствии 50 мг/л ГК Aldrich. Однако измерение интенсивности флуоресценции пирена в присутствии и отсутствие данных ГК не показало аналогичного уменьшения. Описанные результаты позволили авторам вышеуказанных работ предположить преобладание статического механизма тушения ПАУ гумусовыми кислотами над динамическим.

Аналогичные выводы были сделаны авторами [121, 122, 131, 132] на основании расчетов бимолекулярных констант тушения флуоресценции в предположении диффузно-контролируемой реакции, а также исходя из постоянства анизотропии флуоресценции ПАУ в присутствии ГФК.

Для количественной оценки константы связывания ПАУ гумусовыми кислотами в предположении образования нефлуоресцирующего комплекса ПАУ-ГФК используют уравнение Штерна-Фольмера. Вывод данного уравнения основан на предположении, что интенсивность флуоресценции ПАУ в присутствии ГФК пропорциональна концентрации его свободной формы ([ПАУ]). Тогда уравнение (1.5) можно представить в следующем виде:

где F0 и F - интенсивности флуоресценции ПАУ в отсутствие и в присутствии ГФК, соответственно. Уравнение (1.3), в свою очередь, преобразуется к выражению (1.6), известному как уравнение ШтернаФольмера [121, 129]:

Согласно [133, 135] уравнение Штерна-Фольмера (1.7) применимо при следующих приближениях: (1) в растворе присутствует только один вид тушителя, (2) за время эксперимента не происходит адсорбции ПАУ на стенках кюветы, (3) квантовый выход флуоресценции комплекса ПАУ-ГФК равен нулю ( = 0). Второе приближение необходимо принимать во внимание при рассмотрении взаимодействия высокогидрофобных ПАУ с ГФК. В этом случае возможно уменьшение интенсивности флуоресценции молекул ПАУ не только за счет их тушения ГФК, но и за счет сорбции на стенках кюветы. В связи с этми, во избежание возможных погрешностей при расчете констант связывания необходимо вводить поправки в кинетики взаимодействия антрацена, пирена и перилена с ГФК методом тушения флуоресценции, авторами [135] было показано, что равновесие между молекулами ПАУ и ГФК устанавливается в течение 3-4 минут. На основании полученных результатов было высказано предположение, что взаимодействие ПАУ с ГФК происходит за более короткий промежуток времени, чем адсорбция ПАУ на стенках кюветы. Исследования авторов [121, 132-135] показали, что условие = 0 выполняется для широкого круга ГФК.

В случае динамического тушения ПАУ гумусовыми кислотами константа связывания представляет собой произведение бимолекулярной константы скорости тушения флуоресценции ПАУ в присутствии (kq) и времени затухания флуоресценции ПАУ в отсутствие ГФК [129].

В случае комбинации двух типов тушения - статического и динамического уравнение Штерна-Фольмера приобретает вид уравнения второго порядка относительно СГФК [129]:

= (1+КдинСГФК) (1+КстатСГФК) = (1+КкажСГФК) (1.8) где Ккаж - кажущаяся константа Штерна-Фольмера для комбинации динамического и статического тушения; Кдин - динамическая константа Штерна-Фольмера в случае динамического механизма тушения ПАУ гумусовыми кислотами.

гумусовыми кислотами, определенные различными методами.

Константы связывания ПАУ гумусовыми кислотами, определенные различными методами происхождения ГФК происхождения ГФК происхождения ГФК происхождения ГФК существенно различаются в зависимости от используемого метода используемыми методами являются диализ, тушение флуоресценции и ОФ-ВЭЖХ. На Рис. 1.3 приведены Кос некоторых ПАУ для РОВ поверхностных вод и ГК Aldrich, полученные разными методами (по данным Табл. 1.4).

Как видно из рисунка, более высокие значения Кос дает метод тушения флуоресценции и диализ. Константы связывания, полученные с помощью ОФ-ВЭЖХ имеют более низкие значения. Так, диапазон значений Кос антрацена, определенных с помощью метода тушения флуоресценции, составил (0.2 - 0.8)105; с помощью ОФ-ВЭЖХ - (0.07 диализа - (0.2 - 5)105 л/кг С.

Сравнение значений Кос, полученных разными методами, проведено также в работах [114, 121, 128]. Авторы [121] при сравнении Кос антрацена, определенных методом тушения флуоресценции и ОФ-ВЭЖХ, не обнаружили существенной разницы в значениях констант.

К осx10, л/кг С Косx10, л/кг С К осx10, л/кг С Рис. 1.3. Константы связывания некоторых ПАУ РОВ поверхностных вод и ГК Aldrich, определенные различными методами.

Аналогичные данные были получены в работе [145] при сравнении констант связывания фенантрена различными по происхождению ГФК, определенных методами тушения флуоресценции, ОФ-ВЭЖХ и диализа.

Однако авторами [114] с помощью диализа были получены более высокие значения Кос некоторых ПАУ по сравнению со значениями констант, определенных для тех же гумусовых кислот и ПАУ с использованием картриджей SepPak (ОФ-ВЭЖХ). Подобная зависимость была отмечена в работе [136] при исследовании взаимодействия ГК Aldrich с периленом и фенантреном методом диализа и ОФ-ВЭЖХ.

Таким образом, как видно из представленного материала существует достаточно большое разнообразие методов, применяемых для количественной оценки степени связывания ПАУ гумусовыми кислотами.

Однако сравнение полученных констант, определенных различными методами, не всегда корректно, ввиду наличия погрешностей при использовании того или иного метода. Поэтому при сравнении сродства ГФК к ПАУ необходимо принимать во внимание используемый метод определения Кос. Кроме того, необходимо применять методы, не нарушающие равновесия в системе ПАУ-ГФК, что снижает погрешности и дает более достоверные оценки.

1.3.2. Зависимость констант связывания от свойств ПАУ и Согласно многочисленным исследованиям, реакционная способность ГФК по отношению к ПАУ во многом определяется как гидрофобностью ПАУ (lg Kow), так и источником происхождения ГФК. Исследование влияния гидрофобности ПАУ на их сродство к ГФК проводилось авторами [115, 136, 137, 145]. Отмечено возрастание констант связывания с увеличением гидрофобности ПАУ. Так, диапазон определяемых значений констант связывания наиболее гидрофобных углеводородов - перилена и бенз(а)пирена (lg Kow 6.0) ГФК различного происхождения составил (0.2 л/кг С. Для менее гидрофобных ПАУ - антрацена и фенантрена (lg Kow 4.4) наблюдались существенно более низкие Кос. Диапазон значений Кос данных ПАУ - (0.03 - 1.7)105 л/кг С.

На Рис. 1.5 приведены зависимости констант связывания ряда ПАУ, полученных для ГК Aldrich и ГФК природных вод, от величины lg Kow, характерной для ПАУ [136].

Рис. 1.5. Зависимость констант связывания ПАУ гумусовыми кислотами от гидрофобности ПАУ (lg Kow): s - ГК Aldrich; n - ГФК природных вод [136].

Как видно из рисунка, Кос возрастают с увеличением гидрофобности ПАУ. При этом обращает на себя внимание тот факт, что значения Кос существенно различаются для разных ГФК вне зависимости от ПАУ. Так, в случае связывания ПАУ гуминовыми кислотами Aldrich Кос значительно выше, чем в случае взаимодействия ПАУ с ГФК природных вод.

Как видно из данных, приведенных в Табл. 1.4 предыдущего раздела, в значениях Кос, определенных одним и тем же методом для ГФК, выделенных из различных источников, наблюдаются существенные изменения. При этом влияние источника происхождения на величины Кос прослеживается для всех ПАУ, вне зависимости от величины lg Kow. Так, в случае взаимодействия фенантрена с РОВ различных поверхностных вод диапазон значений Кос, определенных методом тушения флуоресценции, колеблется от 0.4105 до 1.7105 л/кг С. В случае связывания перилена РОВ поверхностных вод диапазон значений Кос составляет (0.4-11) л/кг С. Кос характеризующие взаимодействие антрацена с ГК различных почв, изменяются от 0.4105 до 0.8105 л/кг С. Увеличение константы связывания бенз(а)пирена РОВ природных вод на порядок, по сравнению с константой связывания бенз(а)пирена ГК Aldrich наблюдали авторы [115].Увеличение степени связывания ПАУ гумусовыми кислотами различных природных вод в ряду: ГФК болотных вод > ГФК речных вод > ГФК морских вод было отмечено в работе [148]. При этом содержание ГФК в природных водах различного происхождения изменялось незначительно.

На Рис. 1.6 приведены Кос пирена и антрацена, полученные в ряде работ для ГФК различного происхождения, определенные методом тушения флуоресценции.

Как видно из представленных данных, стабильно высокие значения Кос характерны для ГК Aldrich и ГК почв. Более низкие величины Кос характерны для ФК почв, вод и ГК вод.

Таким образом, сродство ГФК к ПАУ во многом определяется источником происхождения ГФК. По-видимому, это связано с различиями в структуре ГФК, выделенных из различных источников. В связи с этим, выявление структурных параметров ГФК, ответственных за степень связывания их с ПАУ, необходимо для установления взаимосвязи между структурой и реакционной способностью ГФК по отношению к ПАУ.

К осx10, л/кг С Косx10, л/кг С 1. 1. 0. Рис. 1.6. Константы связывания антрацена и пирена ГФК различного происхождения, определенные методом тушения флуоресценции.

1.3.3. Взаимосвязь структуры и реакционной способности гумусовых кислот по отношению к ПАУ применяют метод корреляционных соотношений. Данный метод основан на проведении корреляционно-регрессионного анализа между блоком параметров, описывающих структуру исследуемых соединения (так называемых структурных дескрипторов), и физико-химическими параметрами, характеризующими прогнозируемое свойство. Для этих молекулярные массы), химико-топографические (количества, длины и углы поляризуемость и др.), электростатические и др. дескрипторы [146].

Однако существует достаточно ограниченное количество публикаций, посвященных установлению взаимосвязи между структурой и реакционной способностью ГФК по отношению к ПАУ. Нерегулярность строения и нестехиометричность состава ГФК делает невозможным расчет химикотопографических и квантово-химических дескрипторов, обладающих максимальной прогностической способностью. Данное обстоятельство накладывает существенные ограничения на использование метода количественных соотношений для определения зависимости «структура реакционная способность ГФК» по отношению к ПАУ. Как показал обзор работ, посвященных установлению данной взаимосвязи, для численного описания структуры ГФК используют только дескрипторы состава. При дескрипторов, как атомные соотношения, молекулярная масса, коэффициенты молярного поглощения и содержание ароматического углерода. В качестве численной характеристики реакционной способности ГФК используют величины Кос.

Авторами одной из первых работ [149], посвященной данной проблеме, была показана высокая предсказывающая способность трех параметров ГФК - процентного содержания ароматического углерода (СAr), атомного соотношения Н/С и поглощения при 280 нм (ABS280) и величиной Koc пирена. При этом самый высокий коэффициент корреляции (r = 0.99) был получен для СAr. Коэффициенты корреляции для ABS280 и Н/С составили 0.97 и 0.97, соответственно. Следует отметить, однако, что приведенные коэффициенты корреляции были получены только для четырех препаратов ГФК и не могут свидетельствовать об общей тенденции. Увеличение размера выборки препаратов до 14 сопровождалось снижением r до 0.47 и 0.91 для ABS280 и Н/С, соответственно. Аналогичные корреляционные зависимости между параметрами СAr и ABS280 и Koc пирена для пяти препаратов ГФК были получены в работе [150]. Следует отметить, что более часто (по сравнению с СAr) для оценки реакционной способности ГФК к ПАУ используют соотношение Н/С и ABS280. Это связано со сложностью определения СAr с помощью спектроскопии ЯМР В работе [116] отмечено наличие тесной корреляции между lg Koc бенз(а)пирена и ABS280 и молярным объемом для 12 препаратов РОВ различного происхождения. Соответствующие квадраты коэффициента корреляции (r2) составили 0.90 и 0.58, соответственно. Авторами [139] при исследовании взаимодействия бенз(а)пирена с 19 препаратами РОВ были найдены хорошие корреляции между lg Koc и ABS280 и отношением H/C.

Соответствующие r2 составили 0.76 и 0.58.

В то же время в работах [150, 151] не было отмечено какой-либо значимой зависимости между lg Koc бенз(а)пирена и отношением Н/С для семи препаратов ГК и ФК. Для установления взаимосвязи «структурасвойство» данными авторами было предложено использовать соотношения (O+N)/C и H/O, как параметров, характеризующих полярность и степень окисленности молекул ГФК, соответственно. Соответствующие r составили 0.79 и -0.81. Уменьшение степени связывания бенз(а)пирена РОВ с возрастанием отношения О/С наблюдали авторы [99, 100]. Однако, в работе [116] отмечается обратная закономерность, а именно, увеличение степени связывания бенз(а)пирена РОВ с увеличением содержания кислорода в последних. Полученные результаты авторы объясняют тем, “разворачиванию” молекул гумусовых кислот и тем самым облегчать доступ гидрофобного ПАУ к внутренним гидрофобным областям молекул ГФК. Однако с такой интерпретацией трудно согласиться, так как увеличение заряда макромолекулы приводит, скорее, к обратному эффекту, а именно, уменьшению ее гидрофобности и, как следствие, должно сопровождаться снижением сродства ПАУ к ГФК.

С целью исследования зависимости сродства ГФК к ПАУ от структурны и физико-химических свойств ГФК авторами [116, 152, 153] было предпринято фракционирование РОВ природных вод по степени их гидрофобности на макроситовых смолах (XAD-8) и оценка способности полученных фракций взаимодействовать с бенз(а)пиреном. Наибольшее связывание наблюдали для гидрофобных кислотных фракций РОВ, характеризующихся высоким содержанием ароматических структур и высокими молекулярными массами. Для гидрофобных нейтральных фракций, с высоким вкладом алифатических структур, сродство к ПАУ было намного ниже. Незначительное взаимодействие наблюдали в случае гидрофильных фракций РОВ, обогащенных гидроксильными и карбоксильными функциональными группами.

Зависимость степени связывания ГФК с ПАУ от молекулярных масс (ММ) ГФК рассмотрена в работах [116, 148, 150, 154-156]. Большинством авторов отмечается увеличение Koc по мере возрастания молекулярных масс ГФК. Так, уменьшение значений Koc некоторых ПАУ с РОВ на 45% было отмечено при удалении 10% РОВ с ММ 100 КДальтон, очень низкие Koc наблюдали для фракции РОВ с ММ 5 КДальтон [157]. По данным увеличение размеров ГФК может способствовать образованию гидрофобных микрополостей в мицеллоподобных внутримолекулярных структурах ГФК и, следовательно, повышать сродство к ПАУ. Авторы [150, 158] на основании полученной прямой зависимости между ММ и содержанием ароматических фрагментов в структуре ГФК природных вод предположили, что возрастание сродства высокомолекулярных ГФК к ПАУ, по сравнению с низкомолекулярными, обусловлено большим вкладом ароматических фрагментов в структуру высокомолекулярных ГФК. Однако известно, что в силу нерегулярности строения и переменного состава, макромолекулы ГФК с различными ММ могут отличаться по содержанию основных структурных фрагментов.

Данный эффект становится более выраженным для ГФК, различающихся по происхождению. В связи с этим, отмеченную тенденцию - возрастание Koc с увеличением ММ гумусовых кислот, вследствие увеличения вклада ароматических фрагментов, нецелесообразно распространять на все ГФК в целом. Полученная зависимость может нарушаться при переходе от одного типа ГФК к другому. Так, известно [6], что в случае ГК почв увеличение степени гумификации ГК сопровождается уменьшением их ММ, в связи с отщеплением углеводного комплекса. Данное обстоятельство приводит к возрастанию обогащенности ГК ароматическими фрагментами. В этом случае должна наблюдаться обратная тенденция, а именно, увеличение степени связывания ПАУ данными ГК с уменьшением их ММ.

Таким образом, как видно из вышеприведенного материала, выбор дескрипторов, используемых различными авторами для установления взаимосвязи «структура - реакционная способность ГФК» по отношению к ПАУ достаточно ограничен. Наиболее тесные корреляционные зависимости наблюдаются для прямых (СAr) и косвенных показателей содержания ароматических фрагментов в структуре ГФК. При этом прогностическая способность данных дескрипторов существенно различается. По-видимому, причина такого различия связана с тем, что авторами используются в основном выборки из ограниченного количества препаратов ГФК. Так, наибольшая выборка исследуемых ГФК включала в себя 19 препаратов [121], в то время как наименьшая - только четыре [150].

В связи с этим, для увеличения статистической значимости получаемых зависимостей необходимо использовать большую выборку препаратов ГФК. Кроме того, необходимо разрабатывать новые способы описания структуры ГФК в целях получения новых дескрипторов, обладающих большей прогностической способностью.

Установленные корреляционные взаимосвязи между структурными параметрми ГФК и их связующей способностью по отношению к ПАУ позволили высказать некоторые предположению относительно механизма взаимодействия ГФК и ПАУ. Большинство авторов придерживается мнения об осуществлении гидрофобного связывания между ГФК и ПАУ, включающего в себя Ван-дер-Ваальсово взаимодействие. Согласно [160наличие данного взаимодействия в системе вода - ПАУ - ГФК обусловлено действием энтропийного фактора, а именно, стремлением воды “вытолкнуть” молекулы ПАУ, искажающие пространственную сетку водородных связей и тем самым снижающие энтропию системы. под воздействием термодинамического градиента, способствующего «выталкиванию» молекул ПАУ из водной среды. Основанием для такой интерпретации, как правило, служит наличие положительной корреляции между Кос и величиной lg Kow соответствующего ПАУ [136, 145] и характеристиками гидрофобности ГФК, к которым относят молекулярную массу, отношение Н/С и др. [116, 149, 150]. Предположение об осуществлении гидрофобного взаимодействия было выдвинуто авторами [149] на основании полученных тесных корреляционных зависимостей между параметрами ароматичности ГФК и их сродством к ПАУ.

В противоположность вышеприведенным гипотезам, авторы [163рассматривают связывание ПАУ гумусовыми кислотами как 167] распределение ПАУ между водной фазой и мицеллоподобными структурами, образуемыми молекулами ГФК. При этом предполагают, что ГФК способны образовывать как меж-, так и внутримолекулярные мицеллоподобные структуры. Согласно [159, 168, 169], в предположении осуществления такого рода механизма полярность (О/С), размер и гибкость молекул ГФК являются наиболее важными параметрами, ответственными за степень связывания ПАУ. Повышенное же содержание ароматических структур в молекулах ГФК, по мнению данных авторов, способствует уменьшению гибкости молекул и предотвращает возможность образования ими внутримолекулярных мицелл. Однако последнее обстоятельство должно приводить к уменьшению степени связывания ПАУ гумусовыми действительности не наблюдается. Кроме того, в предположении отмеченного выше механизма, ФК, как более полярные молекулы, должны проявлять большее сродство к взаимодействию с ПАУ, по сравнению с ГК.

Однако в действительности наблюдается обратная тенденция. Авторы полагают, что, по-видимому, в данном случае необходимо рассматривать возможность протекания двух типов механизмов: распределение ПАУ между гидрофобными полостями мицеллоподобных внутримолекулярных структур молекул ГФК и дальнейшее взаимодействие внутри таких взаимодействия.

Уменьшение степени сродства метилированных ГФК к связыванию с некоторыми ПАУ по сравнению с неметилированными позволило авторам [118] выдвинуть гипотезу о существенном вкладе водородных связей в процессы взаимодействия ГФК с ПАУ.

Согласно [134], связывание ПАУ гумусовыми кислотами можно трактовать в терминах “гость-хозяин” по аналогии взаимодействия ПАУ и их производных с синтетическими водорастворимыми макроциклами, имеющими в своем составе гидрофобные полости [170-174]. Следует однако, отметить, что гидрофобные полости в молекулах ГФК были обнаружены только в сухих образцах, полученных вымораживанием водных растворов ГФК [166]. Кроме того, маловероятно, чтобы в разбавленных растворах ГФК с концентрациями, приближающимися к содержанию их в водных экосистемах (0.1-100 мг/л), ГФК находились бы в агрегированном состоянии.

водорастворимых ГФК с некоторыми ПАУ наблюдали появление фосфоресценции молекул ГФК при их совместном присутствии с ПАУ.

Эксперименты проводились в диметилформамиде, при использовании низких температур. Данный факт позволил авторам предположить находящимися в триплетном состоянии. Аналогичные выводы были сделаны в работе [176] при исследовании взаимодействия некоторых ПАУ с водорастворимыми ГФК. Образование -комплексов между молекулами ГФК и ПАУ было подтверждено методом УФ-спектроскопии. К сожалению, в том и другом случае, эксперименты проводились в неводной среде и только для двух препаратов ГФК.

Таким образом, как показывает анализ литературных данных, кислотами не существует. В целом можно сказать, что взаимодействие в системе ГФК-ПАУ может включать комплекс процессов с преобладанием одного или нескольких в зависимости от особенностей строения ГФК и характеристик водной среды, в которой осуществляется связывание.

1.3.4. Влияние рН и ионной силы на связывание ПАУ Несмотря на достаточно большое количество публикаций, посвященных изучению влияния рН и ионной силы среды на величину константы связывания ПАУ гумусовыми кислотами, имеющиеся сведения весьма противоречивы.

Большинство авторов отмечают уменьшение степени связывания ПАУ гумусовыми кислотами при увеличении рН. Так, изменение Кос бенз(а)пирена в диапазоне от 18104 до 8.4104 кг С/л при увеличении рН от 3.5 до 8.5 наблюдали исследователи [177]. Аналогичные данные были получены в работах [121, 178]. Уменьшение констант связывания антрацена, пирена и перилена ГК почв при возрастании рН от 4 до отмечено в работе [134]. При этом наиболее существенное уменьшение наблюдалось для перилена - от 11.3105 до 5.1105 кг С/л, тогда как для антрацена Кос практически не изменялись. Значения Кос пирена уменьшались от 3.15104 до 2.14104 кг С/л. В случае связывания данных ПАУ ФК соответствующих почв наблюдались в целом подобные тенденции в изменениях величин Кос. При этом наиболее существенное уменьшение Кос наблюдалось при увеличении рН от 4 до 7. Для перилена при рН 7 не было зарегистрировано какого-либо связывания с ФК.

Уменьшение эффективности тушения флуоресценции антрацена и пирена ГК Aldrich в три раза при изменении рН раствора от 2 до 12 описано в работе [132].

Согласно предположению авторов [134, 135] уменьшение константы связывания ПАУ гумусовыми кислотами по мере возрастания рН может быть обусловлено увеличением заряда макромолекулы, что приводит к их разворачиванию.

В противоположность вышеописанным тенденциям, в работе [140] описывается незначительное изменение константы связывания бенз(а)пирена РОВ различного происхождения при возрастании рН от 5 до 8. Неизменность Кос перилена ФК в водно-глицериновых растворах при рН 2, 7 и 11 отмечается и в [123]. Кроме того, авторами [144] не было обнаружено какого-либо изменения Кос нафталина с РОВ при изменении рН. Данный эффект связывают с незначительной степенью взаимодействия РОВ с данным ПАУ.

Таким образом, в литературе имеются достаточно противоречивые сведения о влиянии рН на константу связывания ПАУ гумусовыми кислотами. Большинство авторов отмечают существенное ослабление сродства ГФК к ПАУ с возрастанием рН. Причем степень уменьшения в существенной степени зависит как от источника происхождения ГФК, так и от гидрофобности ПАУ.

Изучению влияния ионной силы на процессы связывания ПАУ гумусовыми кислотами посвящены работы [121, 134, 135, 179, 180].

Авторы [121] сообщают об изменении значений констант связывания пирена почвенными ГК в два раза с возрастанием ионной силы от 10-4 до 0.5 М. Характер изменения существенно зависел от состава используемого электролита: при использовании хлорида натрия значения Кос увеличивались, в то время как в ацетатном буфере - уменьшались.

Незначительное увеличение Кос бенз(а)пирена и фенантрена для РОВ отмечено авторами работы [180] при увеличении солености от 0 до 35 0 /00.

изменения ионной силы и рН раствора на связывание некоторых ПАУ гумусовыми кислотами почв. Полученные данные приведены в Табл. 1.5.

Как видно из таблицы, увеличение ионной силы от 0.001 до 0.1 М NaCl при фиксированном значении рН приводило к уменьшению Кос перилена и пирена на 20 - 85 % и 30 - 40 %, соответственно. Наибольшее уменьшение Кос наблюдалось при рН 10. В случае антрацена при рН наблюдали противоположный эффект увеличение ионной силы Увеличение рН от 4 до 10 при фиксированной ионной силе также приводило к уменьшению Кос на 40 - 95 % в случае взаимодействия пирена и перилена с ГК почв и на 20 - 40 % в случае антрацена. Причем наиболее существенное изменение Кос наблюдалось при ионной силе 0.1 М. Для ФК также были отмечены подобные тенденции, однако значения Кос были на порядок ниже, чем для ГК.

Зависимость констант связывания ПАУ гумусовыми кислотами почв (л/кг С) от рН и ионной силы раствора [134]

ГК ФК ГК ФК ГК ФК

Подобные зависимости Кос от влияния рН и ионной силы были получены авторами [135] при исследовании взаимодействия перилена с ГФК, адсорбированными на поверхности минеральных частиц (Al2O3).

Увеличение ионной силы при рН 4 уменьшало на 30 % Кос перилена. При рН 7 и 10 не было отмечено какого-либо связывания ПАУ.

Авторы [134] полагают, что изменение рН и ионной силы растворов влияет как на состояние ГФК, так и ПАУ, присутствующих в данных системах. Так, увеличение ионной силы раствора при фиксированном значении рН может приводить, с одной стороны, к электростатическому сжатию макромолекул ГФК и затруднению проникновения молекул ПАУ в их гидрофобные полости. В этом случае должно наблюдаться уменьшение значений Кос. С другой стороны, увеличение концентрации электролита в растворе может облегчать подход гидрофобного ПАУ к гидрофобным обстоятельство может приводить к увеличению значений Кос в среднем на 20% при изменении концентрации NaCl от 0.001 до 0.1 М. Однако по мнению авторов, первый фактор играет более существенную роль при изменении ионной силы раствора в процессах взаимодействия ГФК с ПАУ, в результате чего наблюдается уменьшение Кос с увеличением ионной силы.

способствует депротонированию молекул ГФК и увеличению их полярности и оказывает незначительный эффект на поведение ПАУ. В результате наблюдается уменьшение Кос с увеличением рН среды.

Аномальное поведение антрацена, а также независимость степени связывания нафталина с ГФК от рН и ионной силы, отмеченное в работе [144], авторы [134] объясняют небольшими размерами данных молекул по сравнению с другими ПАУ и более свободным проникновением их во внутреннюю полость молекул ГФК.

В работах [127, 134, 178] было отмечено увеличение константы связывания ПАУ гумусовыми кислотами в присутствии 110-3 М ионов Са2+ при фиксированной ионной силе. Эффект усиливался с ростом рН и был более выражен в случае взаимодействия ФК, чем ГК с ПАУ. Вероятно, ионы Са2+ нейтрализуют заряд молекул ГФК при увеличении рН, что способствует увеличению гидрофобности ГФК и, следовательно, возрастанию их сродства к ПАУ.

Таким образом, вышеприведенные результаты указывают на то, что условия эксперимента существенно влияют на величину определяемой константы связывания ПАУ гумусовыми кислотами. Однако имеющиеся данные на этот счет достаточно противоречивы и не позволяют сделать однозначных заключений по поводу влияния водной химии среды на связующую способность ПАУ гумусовыми кислотами. В связи с этим необходимы дополнительные исследования в этом направлении, предусматривающие использование больших выборок препаратов ГФК различного происхождения с целью получения более достоверных результатов.

1.4. Влияние гумусовых кислот на биологическую 1.4.1. Влияние гумусовых кислот на биоаккумуляцию ПАУ Широко известно [55, 56, 182], что ПАУ обладают токсическими, мутагенными, тератогенными и канцерогенными свойствами. Воздействие ПАУ на организмы усугубляется их способностью накапливаться в тканях гидробионтов [56, 183, 184].

Для количественной оценки процессов накопления ПАУ живыми организмами используют коэффициент биоаккумуляции (BCF). Данный параметр рассчитывают как отношение равновесных концентраций ПАУ в тканях гидробионтов и в водной среде или же как соотношение скоростей потребления и элиминирования ПАУ водными организмами [183, 185].

гидрофобностью ПАУ: чем выше гидрофобность, тем больше BCF [183, 184, 186, 187]. Однако от данной зависимости возможны отклонения, обусловленные процессами биотрансформации и деградации ПАУ под действием различных физико-химических факторов, а также присутствием РОВ в водной среде [184, 188-191]. В Табл. 1.6 приведены численные значения коэффициентов биоаккумуляции некоторых ПАУ дафниями (Daphnia magna).

Как видно из таблицы, высокие BCF характерны для наиболее гидрофобных бенз(а)пирена и хризена с lg Kow 6. Минимальным значением BCF характеризуется нафталин, для которого lg Kow 3.4.

коэффициент биоаккумуляции увеличивается с возрастанием гиброфобности соответствующего ПАУ.

являются ракообразные, полихеты и, в меньшей степени, рыбы. Такую закономерность авторы [188] объясняют увеличением метаболизма ПАУ по мере возрастания трофического уровня организма. Однако скорость выведения образующихся метаболитов из организма намного медленнее, чем нетрансформированных ПАУ.

Коэффициенты биоаккумуляции ПАУ Daphnia magna.

Взаимодействие ГФК с ПАУ является одним из основных факторов, влияющих на биоаккумуляцию ПАУ водными организмами. Это связано с тем, что образование комплексов ГФК-ПАУ в значительной степени снижает долю ПАУ, находящихся в свободно растворенном состоянии и уменьшает их биодоступность [178].

Так, авторы [193, 195] наблюдали уменьшение аккумуляции некоторых ПАУ дафниями от 25 до 95% в присутствии ГК Aldrich.

Аналогичные данные были получены авторами [117, 194, 196] в присутствии РОВ природных вод. Однако в работе [178] не было отмечено значительного снижения степени аккумуляции фенантрена моллюсками в присутствии РОВ морских вод. О снижении накопления ПАУ амфиподами в присутствии ГФК различного происхождения сообщается в работах [125, 126]. Авторы [197] сообщают об уменьшении BCF флуорантена рыбами от 33 до 70% в присутствии различных концентраций РОВ (0.5 - 5.0 мг С/л).

биоаккумуляции ПАУ в присутствии ГФК наблюдается лишь для углеводородов с lg Kow выше 4. В случае менее гидрофобных ПАУ для заметного снижения BCF необходимы более высокие концентрации ГФК.

На Рис. 1.7 показана зависимость снижения BCF в присутствии ГФК в зависимости от типа ПАУ.

Рис. 1.7. Коэффициенты биоаккумуляции некоторых ПАУ в присутствии ГК Aldrich (тест-объект - дафнии): n - бенз(а)пирен, u - бензантрацен, l антрацен, l - нафталин; o - бенз(а)пирен в присутствии РОВ торфяных болот. По данным [117, 192].

Как видно из рисунка, коэффициент биоаккумуляции уменьшается по мере увеличения концентрации ГФК. При этом степень воздействия ГФК на накопление ПАУ тем выше, чем больше гидрофобность исследуемого ПАУ. Для наименее гидрофобных нафталина и антрацена не наблюдается изменения BCF в присутствии ГК Aldrich во всем диапазоне концентраций ГК.

Обращает на себя внимание тот факт, что присутствие ГК Aldrich вызывает в три раза большее уменьшение BCF бенз(а)пирена по сравнению с РОВ болотных вод. Авторы [126, 117] также отмечали снижение аккумуляции нафталина дафниями всего на 2-6 % в присутствии 15, 30 и мг С/л ГК Aldrich, тогда как для бенз(а)пирена эффект составлял 97 % при 20 мг С/л ГК.

На Рис. 1.8 приведены зависимости, демонстрирующие эффект уменьшения биоаккумуляции бенз(а)пирена в присутствии ГФК различного происхождения.

Рис. 1.8. Коэффициенты биоаккумуляции бенз(а)пирена в присутствии ГФК различного происхождения (тест-объект - нематоды): n - РОВ marsh, u - РОВ swamp, * - РОВ point pelee, l - ГК природных вод, O - ФК подземных вод. По данным [192].

Как видно из рисунка, снижение BCF бенз(а)пирена существенно зависит от источника происхождения ГФК. Так, присутствие ГК природных вод и РОВ marh вызывает более существенное уменьшение BCF по сравнению с ФК подземных вод и РОВ болотных вод. При этом наиболее существенное уменьшение наблюдается в диапазоне низких концентраций ГФК (0.5-5 мг С/л). Подобные зависимости снижения BCF от источника происхождения ГФК были получены авторами [117]:

присутствие ГК Aldrich (0.15 мг С/л) вызывало уменьшение BCF бенз(а)пирена на 20% для дафний, в то время как добавление РОВ природных вод практически не влияло на накопление ПАУ.

Согласно предположениям некоторых исследователей [157, 178, 192, 198], влияние источника происхождения ГФК на биоаккумуляцию ПАУ различного происхождения, которые обуславливают различное сродство ГФК к ПАУ. Для подтверждения данного факта авторами [153] было предпринято фракционирование РОВ природных вод по степени их гидрофобности на макроситовых смолах (XAD-8) и проведена оценка способности полученных фракций влиять на биоаккумуляцию ПАУ.

Согласно полученным результатам, наиболее существенное уменьшение BCF наблюдалось в присутствии кислотной фракции РОВ, проявляющей наибольшее сродство к ПАУ и характеризующейся высоким содержанием Способность нейтральной фракции уменьшать аккумуляцию ПАУ была незначительной связующей способностью ПАУ и высоким вкладом гидрофобной кислотной фракции РОВ, требовался пятикратный избыток гидрофильной фракции РОВ.

Авторами [152] была исследована зависимость уменьшения BCF некоторых ПАУ в присутствии РОВ различного происхождения от характеризующих ароматичность ГФК: поглощения при 280 нм и соотношения Н/С. Наиболее значительное снижение аккумуляции ПАУ наблюдалось для РОВ, которые характеризовались наибольшим вкладом ароматических фрагментов в их структуру и содержанием гидрофобных фракций. Полученные результаты могут служить подтверждением гипотезы о том, что снижение накопления ПАУ в присутствии ГФК обусловлено связыванием ПАУ гумусовыми кислотами.

Однако, наряду с данными об уменьшении биоаккумуляции ПАУ в присутствии ГФК, в работе [153] сообщается об увеличении накопления нафталина в 2-3 раза под воздействием РОВ в концентрации до 4 мг С/л.

Подобный эффект отмечен и в работе [198] в случае аккумуляции бенз(а)пирена в присутствии 20 мг С/л РОВ различного происхождения.

Предполагают, что полученные результаты могут быть связаны с непосредственным воздействием РОВ на дафнии, хотя специально данный вопрос не изучался.

Для количественной оценки влияния ГФК на степень накопления термодинамическую модели.

Термодинамическая модель. Данная модель позволяет оценить коэффициент аккумуляции ПАУ в гидробионтах в присутствии и в отсутствие ГФК. В основе модели лежит предположение о доступности для биоты только растворенной формы ПАУ [117, 125, 141, 192]. Исходя из коэффициента биоаккумуляции ПАУ в присутствии ГФК (BCFПАУ-ГФК):

где - доля ПАУ, находящегося в растворенном состоянии.

Выражая из уравнения (1.4), и подставляя полученное уравнение в (1.10), получаем:

Таким образом, термодинамическая модель позволяет рассматривать биоаккумуляцию ПАУ в водных организмах в присутствии ГФК как функцию сродства ГФК к ПАУ, концентрации ГФК в системе и гидрофобности ПАУ (ввиду наличия взаимосвязи между BCF и lg Kow).

В Табл. 1.7 приведены рассчитанные по уравнению (1.11) и определенные экспериментальным путем BCF нафталина и бенз(а)пирена дафниями в присутствии различных концентраций РОВ.

Рассчитанные и экспериментальные BCF нафталина и бенз(а)пирена в присутствии различных концентраций РОВ (тест-организм - дафнии) [152] подтверждает вышеприведенную гипотезу о доступности для биоты только свободно растворенной формы ПАУ.

Многокомпонентная кинетическая модель. Данная модель позволяет оценить влияние ГФК на скорость накопления ПАУ водными организмами.

Согласно данной модели общее количество ПАУ в водной среде рассматривается как распределенное между растворенной, связанной с ГФК и аккумулированной биотой формами ПАУ. Потребление и элиминирование ПАУ описываются соответствующими константами скоростей [117, 185]. При этом для оценки степени накопления ПАУ в водных организмах используют следующее выражение:

где Ca - концентрация ПАУ в организме (нг/г); Dw и Sw - количество свободного и связанного с ГФК ПАУ, соответственно (нг/г); ku и ks константы скорости потребления свободного и связанного c ГФК ПАУ, соответственно (ч-1); kd - константа элиминирования ПАУ (ч-1).

Уменьшение скорости потребления различных ПАУ гидробионтами при увеличении концентрации ГФК различного происхождения было отмечено многими исследователями [117, 126, 141, 142, 178, 184]. При этом скорость потребления (ku) и элиминирования ПАУ (kd) в присутствии ГФК во многом определялась как гидрофобностью ПАУ, так и степенью их связывания с ГФК. Особо следует отметить, что для всех исследованных ПАУ, во всем диапазоне концентраций используемых ГФК значения ks были статистически неотличимы от нуля, что может свидетельствовать об отсутствии потребления комплекса ГФК-ПАУ. Незначительное уменьшение скорости потребления антрацена и фенантрена (20 %) амфиподами в присутствии 20 мг/л ГК Aldrich авторы [126] связывают с низкой степенью взаимодействия данных ПАУ с ГК.

гидробионтами накапливается только свободно растворенная форма ПАУ.

Недоступность связанной формы ПАУ можно объяснить тем, что образующийся комплекс ГФК-ПАУ более полярен и имеет размеры, значительно превышающие размеры свободно растворенных ПАУ. Это затрудняет проникновение комплекса через мембраны клеток, а также уменьшает количество свободного ПАУ, взаимодействующего с поверхностью мембран [199]. Данный вывод подтверждается также результатами [125] о наличии обратной корреляции между Кос различных ПАУ и концентрацией ГФК, вызывающей 50 %-ное уменьшение скорости Вследствие низкой водной растворимости ПАУ проявляют, в основном, хроническую токсичность, которая тем выше, чем больше гидрофобность соответствующего ПАУ. При этом острый токсический эффект, вызываемый более гидрофобными ПАУ, наблюдался только в концентрациях, превышающих предел их водной растворимости [55, 56].

Примеры токсического воздействия ПАУ на некоторые водные организмы приводятся ниже.

Авторами работы [55] отмечено стимулирующее действие целого ряда ПАУ на рост водорослей Chlorella vulgaris, Scenedesmus oblignus при концентрации ПАУ 10 - 20 мкг/л. В работе [187] наблюдали увеличение степени ингибирования роста морских красных водорослей по мере возрастания дозы от 10 до 300 мкг/л производных бенз(а)антрацена.

Авторы [56] отмечали резкое подавление роста бактерий Es-chrichia Coli и Serratia marinorubra в присутствии 10-5 - 10-7 М некоторых ПАУ. Причем ингибирующее действие нафталина на рост бактери при концентрации 12.8 мг/л было сопоставимо с действием бенз(а)пирена при концентрации 5 мкг/л. Данными авторами также отмечено ингибирование фотосинтеза различных водорослей в присутствии 1 - 20 мкг/л нафталина на 40 - 90 %.

Зависимость воздействия фенантрена (200 мкг/л) и нафталина (125 мкг/л) на выживаемость крабовых личинок от температуры и солености среды исследована в [56]. О возможном токсическом воздействии некоторых ПАУ на активность питания, скорость фильтрации и потребление кислорода водными организмами сообщалось в работах [56, 142]. Так, бенз(а)пирен в концентрации 0.2 - 1.0 мкг/л вызывал значительное уменьшение скорости фильтрации моллюсков; нафталин и фенантрен замедляли дыхание некоторых гидробионтов в диапазоне мг/л ПАУ.

В литературе описано два основных механизма токсического воздействия ПАУ на гидробионты. Один из них обусловлен высокой растворимостью ПАУ в липидах и непосредственным взаимодействием ПАУ с различными электронодефицитными центрами мембранных поверхностей по механизму переноса заряда. Другой механизм обусловлен взаимодействием метаболитов ПАУ, образующихся в реакциях окисления как кислородом воздуха, так и ферментами клеток, с клеточными ковалентных связей со многими клеточными структурами [181, 182, 201].

В литературе имеются сведения о фототоксичности ПАУ по отношению к различным водным организмам [202-208]. При этом фототоксичность проявляется при концентрациях ПАУ, значительно ниже их водной растворимости. Так, в работе [208] отмечено уменьшение концентрации ПАУ, вызывающей 50 %-ную гибель организмов (LC50), пропорционально времени облучения их водных растворов. Согласно предположению авторов работ [209, 210], фототоксичность могут проявлять лишь те ПАУ, для которых разность энергий между занятой высшей молекулярной орбиталью и низшей незанятой составляет 6.5 - 8. эВ, причем максимальный эффект проявляется для 7.1 ± 0.4 эВ. Кроме того, фототоксичность ПАУ во многом зависит как от длины волны возбуждающего света, так и от времени их облучения [200].

В качестве возможных механизмов в литературе приводятся возбужденной молекулой ПАУ и биомолекулой организма; образование комплекса с переносом заряда между триплетным состоянием ПАУ и основным состоянием кислорода, сопровождающееся образованием синглетного кислорода. Последний способен оказывать токсическое действие на мембранную поверхность клеток. Кроме того, предполагают, что увеличение токсичности некоторых ПАУ при облучении УФ-светом связано с образованием свободных радикалов и пероксидов ПАУ.

При достаточно большом количестве работ, посвященных влиянию ГФК на биоаккумуляцию ПАУ, токсичность ПАУ в присутствии ГФК изучена крайне недостаточно.

Так, авторы работы [208] отмечали уменьшение фототоксичности антрацена для дафний и некоторых видов рыб в присутствии различных концентраций ГФК. При этом эффект проявлялся даже при таких низких концентрациях ГФК как 0.1 - 3 мг С/л. Уменьшение LT50 с увеличением содержания ГК Aldrich от 0.5 до 5 мг С/л было отмечено в работе [197] при исследовании влияния данных ГК на фототоксичность флуорантена для рыб в диапазоне концентраций данного ПАУ от 4.8 до 34 мкг/л.

Согласно предположению, высказанному в работах [197, 199, 208], возможным механизмом воздействия ГФК на фототоксичность ПАУ является их способность поглощать УФ-излучение солнечного света.

Следует отметить, что при оценке токсичности ПАУ в присутствии ГФК исследователи не рассматривают непосредственного влияния самих ГФК на тест-объект. При этом в литературе имеются малочисленные и достаточно противоречивые сведения о физиологической активности ГФК различного происхождения и фракционного состава на водные организмы.

Имеющиеся данные на этот счет посвящены в основном исследованию влияния ГФК на рост дафний и их выживаемость при низких рН. Так, согласно [211-214], низкие концентрации ГФК (0.1 - 10 мг С/л) увеличивали выживаемость дафний при рН 5 на 60 %, в то время как повышение их концентрации до 22 мг С/л приводило к противоположному эффекту. При рН 7 не было отмечено какого-либо влияния ГФК. В работе [215] авторы наблюдали повышение выживаемости дафний рН 6 в присутствии 7 - 20 мг С/л ГФК. Авторами [212] сообщается о токсическом воздействии низкомолекулярных ФК на D. magna. Получение подобной информации о влиянии ГФК на тест-организмы в присутствии ПАУ, возможно, внесло бы определенный вклад в рассмотрение проблемы механизма изменения токсичности ПАУ в присутствии ГФК.

следующие выводы:

применяемых для количественной оценки степени связывания ПАУ гумусовыми кислотами. Однако сравнение полученных констант, определенных различными методами, не всегда корректно, ввиду наличия погрешностей при использовании того или иного метода. При этом способы описания реакционной способности ГФК по отношению к ПАУ не позволяют получить характеристик, имеющих явный термодинамический смысл.

достаточно противоречивы и не позволяют сделать однозначных заключений по этому поводу.

Выбор дескрипторов для установления взаимосвязи «структура реакционная способность ГФК» по отношению к ПАУ достаточно ограничен. Прогностическая способность данных дескрипторов существенно различается. При этом для установления взаимосвязи «структура - свойства ГФК» по отношению к ПАУ используются в основном выборки из ограниченного количества препаратов ГФК.

Данные о механизме взаимодействия ГФК с ПАУ достаточно противоречивы.

ГФК могут уменьшать токсичность ПАУ для водных организмов, однако количественная взаимосвязь между реакционной способностью и снижением токсичности ПАУ в присутствии ГФК отсутствует.

исследование влияния гумусовых кислот на поведение ПАУ в водной среде, включающее в себя химические и токсикологические аспекты наблюдаемых эффектов, а также установление природы детоксицирующих свойств гумусовых кислот по отношению к ПАУ

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

2. 1. Характеристика объекта исследования Для проведения экспериментов по исследованию взаимодействия ГФК с ПАУ было использовано 28 препаратов ГФК, имеющихся в распоряжении нашей группы. Выборка образцов охватывала основные источники происхождения ГФК - верховые и низинные торфа, почвы различной зональности (черноземы, дерново-подзолистые (ПД), серые лесные (Л)) и сельско-хозяйственного использования (огородные, пахотные, целинные) и природные воды. Кроме того, в работе использованы два коммерческих препарата угля.

Твердые препараты ГФК почв, торфа и угля представляли собой аморфные порошки от темно-желтого до черного цвета, более светлая окраска была характерна для образцов водного происхождения и ФК почв.

Исследование растворимости препаратов показало, что они практически нерастворимы в бензоле, хлороформе, хлористом метилене, пиридине, ТГФ, эфире, ограниченно растворимы в полярных апротонных растворителях (ДМСО и ДМФА) и дистиллированной воде, но обладают значительной растворимостью в растворах щелочей (до 20 г/л). Препараты не имели фиксированной точки плавления и разлагались при нагревании свыше 150 0С.

Все препараты были охарактеризованы методами элементного анализа, гель-хроматографии, УФ-спектрофотометрии и спектроскопии ЯМР 13С.

Содержание С, Н, N в препаратах определяли методами количественного полумикроанализа. В связи с гигроскопичностью твердых препаратов ГФК и наличием в них несгораемого остатка (зольности), обусловленного присутствием Na, K, Ca, Mg, Fe, SiO2, Al2O3 и др., была проведена корректировка первичных данных элементного анализа на несгораемый остаток и равновесную влажность препаратов. Зольность определяли ручным сожжением при 750 0С, влажность - по обратному набору веса после высушивания образца в вакууме.

В целях корректировки на несгораемый остаток данные элементного анализа пересчитывали на органическое вещество, то есть на беззольную часть препарата.

Содержание кислорода в препаратах ГФК рассчитывали по разности между общей массой органического вещества в препарате и массой остальных элементов: О = 100% – (%С, %Н, %N, %S).

Полученные результаты элементного анализа в пересчете на беззольное безводное вещество приведены в Табл. 2.1.

Как видно из Табл. 2.1, ГФК различного происхождения характеризуются существенно различным элементным составом. Так, содержание углерода возрастает в ряду: ФК почв < ГФК вод ГФК природных вод. При этом максимальное содержание ароматического углерода среди ГК почв (54-55%) наблюдается для ГК черноземов, тогда как в ГК дерново-подзолистых и серых лесных почв оно не превышает 45-47%. Минимальным содержанием углеводных фрагментов характеризуются ГК черноземов (13%) и коммерческие препараты угля (6%). Высокая обратная корреляция между содержанием углеводных и ароматических фрагментов (r = -0.91) свидетельствует о том, что увеличение доли ароматических фрагментов в структуре ГФК в значительной степени обуславливается отщеплением полисахаридов.

Содержание алкильного углерода выше для ГФК природных вод и ГК угля, в то время как их наименьшее количество обнаружено в ГК почв.

Полученная структурная информация хорошо согласуется с известным положением о том, что черноземные ГК представляют собой продукт более глубокой гумификации, которому присуща меньшая химическая гетерогенность [6]. На молекулярном уровне это проявляется в обогащенности черноземных ГК ароматическими фрагментами и уменьшении вклада углеводной периферии в структуру молекулы.

Распределение углерода в структуре ГФК по данным спектроскопии ЯМР 13С Препарат Доля углерода в составе фрагментов, % HBW Согласно литературным данным (разд. 1.1), содержание ароматических фрагментов в структуре ГФК может служить одним из важнейших параметров, определяющих их способность к связыванию с ПАУ. В связи с этим количественная оценка ароматичности ГФК важна для предсказания их связующей способности по отношению к ПАУ.

Традиционным подходом для оценки содержания ароматического углерода в молекулах ГФК является расчет косвенных показателей:

атомного соотношения Н/С и эффективного коэффициента поглощения *280. Нами было проведено сопоставление данных по процентному содержанию ароматического углерода в молекулах ГФК, полученных методом спектроскопии ЯМР 13С, с косвенными параметрами ароматичности. Для этих целей был проведен корреляционный анализ косвенных и прямых параметров ароматичности.

В качестве параметров ароматичности, получаемых обработкой спектра ЯМР 13С, нами были выбраны следующие:

СAr-H(R) - процентное содержание незамещенных или С-замещенных атомов ароматического углерода;

CAr = CAr-O+CAr-H(R) - суммарное содержание ароматического углерода в ГФК;

CAr/CAlk - соотношение суммарного содержания ароматического и алифатического углерода. Показатель CAlk= CAlk-O+CAlk-H,R представляет собой общее содержание алифатического углерода в молекулах ГФК.

Соотношение CAr/CAlk использовали как показатель вклада ароматического каркаса ГФК по сравнению с алифатической периферией в структуру их макромолекул. Данное соотношение может также служить характеристикой гидрофильно-гидрофобного баланса макромолекул ГФК.

В качестве косвенных параметров ароматичности использовали атомное соотношение Н/С и *280 (Табл. 2.1).

Результаты корреляционного анализа косвенных и прямых параметров ароматичности приведены в Табл. 2.3.

Коэффициенты корреляции (r) между прямыми и косвенными параметрами ароматичности ГФК (n = 20) Как видно из Табл. 2.3, наиболее тесная корреляционная взаимосвязь наблюдается между соотношением Н/С и прямыми параметрами ароматичности CAr-H(R), CAr и CAr/CAlk. Соответствующие обратные коэффициенты корреляции составляют -0.75, -0.69 и -0.71, что указывает на статистическую достоверность исследуемых взаимосвязей при P = 0.99.

Это подтверждает адекватность использования Н/С для характеристики обогащенности молекул ГФК ароматическими фрагментами. В то же время взаимосвязь между *280 и CAr-H(R), CAr и CAr/CAlл оказалась гораздо слабее, но также статистически достоверной при P = 0.99:

соответствующие коэффициенты корреляции составляли 0.58, 0.62 и 0.59.

Следовательно, использование соотношения Н/С для характеристики содержания ароматических фрагментов в структуре ГФК более предпочтительно, чем *280.

Адекватность использования Н/С и *280 как косвенных параметров, характеризующих содержание ароматического углерода в органических соединениях, была также проверена на наборе 33 модельных кислородсодержащих ароматических и алифатических кислот. С этой целью в аналогичных условиях были экспериментально определены соответствующие *280, а соотношения Н/С и СAr рассчитаны из соответствующих формул (Приложение 1). Результаты корреляционного анализа полученных данных приведены в Табл. 2.4.

Коэффициенты корреляции (r) между параметрами ароматичности модельных органических кислот (n = 33 ) Как видно из данных Табл. 2.4, для модельных кислот существует хорошая корреляция (r = - 0.8) между соотношением Н/С и содержанием ароматического углерода СAr При этом значимой корреляции между *280 и СAr обнаружено не было. Отсутствие корреляции между *280 и истинным содержанием ароматического углерода (СAr) в случае модельных кислот и наличие ее для ГФК может свидетельствовать о существовании данной взаимосвязи только внутри группы соединений со сходным функциональным составом и характером замещения ароматических колец.

Таким образом, вышеприведенные результаты показывают, что при отсутствии данных спектроскопии ЯМР 13С о содержании ароматического углерода в структуре ГФК, для оценки данного параметра можно использовать как величину соотношения Н/С, так и *280. При этом использование атомного соотношения Н/С - предпочтительнее, так как позволяет получать более достоверные оценки.

2.2. Изучение cвязывающей способности ГФК по отношению 2.2.1. Определение констант связывания ПАУ гумусовыми Изучение связывающей способности ГФК по отношению к ПАУ проводили на примере трех представителей этого класса соединений пирена (Py), флуорантена (Flt) и антрацена (An). Основные физикохимические характеристики используемых ПАУ приведены в Табл. 2.5.

Основные физико-химические характеристики модельных ПАУ по данным [57, 60] Для исследования связывания ПАУ гумусовыми кислотами был использован метод тушения флуоресценции. Данный метод позволяет определять степень связывания ПАУ гумусовыми кислотами путем измерения концентрации свободной и связанной форм ПАУ без их предварительного разделения. Кроме того, использование данного метода не требует определения точной концентрации ПАУ в растворе [134]. Расчет констант связывания ПАУ гумусовыми кислотами (Кос) проводили с помощью уравнения Штерна-Фольмера (1.7), вывод которого приведен в обзоре литературы.

Для определения Кос измеряли интенсивности флуоресценции растворов ПАУ в отсутствие (F0) и в присутствии (F) различных концентраций ГФК. С этой целью готовили концентрационные серии ГФК в присутствии постоянной концентрации ПАУ. Концентрация ПАУ составляла 510-7, 6.410-7 и 1.710-7 М для Py, Flt и An, соответственно.

Концентрации ГФК варьировали от 0.5 до 710-6 кг С/л.

На Рис. 2.1. приведены типичные спектры флуоресценции Py в присутствии различных концентраций ГФК. Типичные концентрационные зависимости тушения флуоресценции ПАУ гумусовыми кислотами различного происхождения приведены на Рис. 2.2.

Рис. 2.1. Спектры флуоресценции Py в присутствии различных концентраций ГФК: 1- 0 мг С/л, 2 - 1 мг С/л, 3 - 3 мг С/л, 4 - 5 мг С/л, 5 - 7 мг С/л.

Рис. 2.2. Тушение флуоресценции Py в присутствии различных концентраций ГФК различного происхождения.

Как видно из данных Рис. 2.2, в исследуемом диапазоне концентраций ГФК полученные зависимости линейны.

Рассчитанные по уравнению Штерна-Фольмера значения констант и их доверительные интервалы приведены в Табл. 2.6.

происхождения Препарат