«Алексеевич Влияние иммунных факторов на воспроизводительную функцию коров ...»

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ

УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«МОСКОВСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ ВЕТЕРИНАРНОЙ

МЕДИЦИНЫ И БИОТЕХНОЛОГИИ ИМЕНИ К.И. СКРЯБИНА»

На правах рукописи

.

Петров Михаил Алексеевич

Влияние иммунных факторов на воспроизводительную функцию коров 06.02.06 – ветеринарное акушерство и биотехника репродукции животных.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Научный руководитель:

академик РАСХН, доктор биологических наук, профессор В.П. Дегтярев Москва – Оглавление Введение……………………………………………….........……………... 1. Обзор литературы………..……………………….......…….…...……… 1.1. Иммунная система………………………………................……………... 1.2. Элементы Иммунной системы……………………

1.3. Антигены тканевой совместимости………………….......…..………….. 1.4. Клеточный иммунитет ………………………………….............……….. 1.5. Гуморальный иммунитет…………………………….................………... 1.6. Антитела к спермиям………………………………….........…………..… 1.7. Антигены прозрачной зоны…………………………..................………... 1.8. Пути повышения резистентности животных…………….……................ 2. Собственные исследования…………..…..............……………….......... 2.1. Материалы и методы исследований………….......……………..………. 2.2. Методы исследования иммунитета…………...……………….………… 2.2.1. Определение Т- и В-лимфоцитов……………………….……….….…… 2.2.2. Определение фагоцитарной активности нейтрофилов крови…..….….. 2.3. Определение уровня иммуноглобулинов в маточной слизи коров…………………….......……………………………..……..… 2.4. Определение фагоцитарной активности нейтрофилов в маточной слизи коров…….......………………………………..…….… 2.5. Диагностика иммунного бесплодия коров……………..……..….……... 2.6. Характеристика иммуномодулятора Миелопид……………..……....…. 3. Результаты собственных исследований………………………............ 3.1. Результаты акушерско-гинекологической диспансеризации коров в учебно-опытном хозяйстве «Бессоново»………......……….…. 3.2. Динамика показателей иммунитета у коров черно-пестрой породы……….......………………………………………………...…….. 3.2.1. Значение иммунных факторов в нарушениях репродуктивной функции у коров…………………......…………...….. 3.3 Значение иммунных факторов в регуляции репродуктивной функции коров………........……………………….…. 3.3.1. Содержание иммуноглобулинов в цервикальной слизи и сыворотке крови коров в стадию возбуждения полового цикла........………………………………………………….… 3.3.2. Содержание лейкоцитов в крови подопытных коров………..…......... 3.3.3. Фагоцитарная активность нейтрофилов в цервикальной слизи у коров в стадию возбуждения полового цикла…….........….... 3.3.4. Содержание Т-лимфоцитов в крови коров…………….…….….......... 3.3.5. Содержание Т-хэлперов в крови коров………………….….……........ 3.3.6. Содержание Т-супрессоров в крови коров………………….........…… 3.3.7. Содержание В-лимфоцитов в крови коров……………….…..........….. 3.3.8. Результаты воспроизводства коров…………………………..…........... 3.3.9. Определение экономического ущерба от бесплодия коров….............. 4. Обсуждение результатов исследований……………..……..….......... 5. Выводы………………………………...…………………….…........… 6. Практическое использование полученных научных результатов…………………………..………………….…..……........ 7. Рекомендации по использованию научных выводов………......... 8. Библиографический список…………………………....…......…….. 9. Приложения Актуальность темы. Плодовитость коров – это их способность ежегодно приносить потомство, поэтому в системе мероприятий по увеличению воспроизводства животноводческой продукции и улучшения показателей воспроизводства стада в сельскохозяйственных предприятиях страны большое значение имеет интенсификация воспроизводства крупного рогатого скота (А.П. Студенцов, 1961; А.В. Бесхлебнов, 1967; А.Г. Нежданов, 1973; И.И. Родин, 1976; Н.А. Флегматов, 1977; Н.И. Полянцев, 1978; В.С.

Шиплов, 1986; И.А. Порфирьев, 2006; И.А. Порфирьев, А.М. Петров, 2009).

Оптимальный уровень воспроизводства, позволяющим получать сдерживается из – за различных расстройств в функционировании их иммунной системы (Е.С. Воронин, А.М. Петров, М.М. Серых, Д.А.

Девришов, 2002).

имплантация эмбриона в эндометрий матки, его дальнейшее развитие в организме матери отмечен активными иммунологическими процессами (М.М. Серых, В.В. Зайцев, Н.А. Кленова и др., 2004).

В.И. Говалло (1987) считает, что сперма, как продукт белковой природы, является антигеном, поэтому на каждое поступление спермы в гениталии самок в их организме образуются антиспермальные антитела.

Попытки связать иммунологическую регуляцию фертильности с продукцией в организме самки антител к спермиям предпринимались уже давно, но окончательной ясности в этом вопросе нет до сих пор (И.И.

Мечников, С.И. Метальников, 1900; Р.Д. Чантуридзе, 1975, И.И.

Соколовская, В.К. Милованов, 1981, В.И. Говалло, 1987, А.М. Петров 2007, В.И. Трухачев, В.Я Никитин, В.М. Михайлюк и др., 2008).

Предполагается, что оплодотворяемость коров во многом снижается из – за различных нарушении воспроизводительной функции у производителей.

В.И. Говалло (1987) считает, что сперма производителей содержит более различных антигенов, и при определенных условиях они способны индуцировать образование антиспермальных антител в организме самки и вызвать их бесплодие.

Воспроизводство и молочная продуктивность у самок — это тесно взаимосвязанные между собой физиологические процессы, в которых участвуют не только половые органы и молочная железа, ну и весь организм.

При нарушении взаимосогласованности регулирующих центров органов размножения, связанном с повышенной функцией молочной железы, воспроизводительная деятельность у коров резко снижается, появляется бесплодие.

При высокой молочной продуктивности, свыше 5000 кг молока в год от каждой коровы, главная причина бесплодия — неправильная система раздоя коров после родов.

При несбалансированном кормлении и обильной лактации отдельные весьма важные для жизнедеятельности вещества могут выделяться в количествах, значительно превышающих поступление в их организм с кормом.

Одна из главных причин бесплодия, особенно у первоотелов, удлиненная лактация.

функциональный антагонизм между молочной железой и органами размножения. Это возникает вследствие неправильной системы раздоя с разносторонним кормлением, активизирующим обменные процессы.

Нарушается функциональное равновесие в гипотоламо — гипофизарной системы организма, и прежде всего между регулирующими центрами половой функции и молочной железы.

При проведении мероприятий по профилактике и ликвидации бесплодия особое внимание необходимо обращать на рациональное полноценное кормление. Для этого всех животных в хозяйстве следует обязательно содержать группами с учетом их физиологического состояния и продуктивности.

Мероприятия по профилактике бесплодия у коров при раздое осуществляются с таким расчетом, что бы получить от животных максимальную молочную продуктивность и оплодотворить их в течение — 42 дней после родов. В связи с этим раздой коров ведут за счет увеличения в рационе грубых и сочных кормов, а объем концентрированных кормов не должен превышать 200 г/кг молока.

Цель и задачи исследований Целью наших исследований является изучение основных причин бесплодия коров, связанных с функционированием их иммунной системы.

Для достижения поставленной цели нами были поставлены следующие задачи:

- установить титры сывороточных спермиоагглютининов в цервикальной слизи и в сыворотке крови у коров с нормальным течением послеродового периода, оплодотворение которых наступило после 2х кратного осеменения в первую половую охоту после родов;

- установить титры сывороточных спермиоагглютининов в цервикальной слизи и в сыворотке крови коров с нормальным течением послеродового периода, оплодотворение которых не наступило после многократных их осеменений;

иммунитета у бесплодных коров;

- установить основные факторы иммунной системы, которые вызывают стойкую инфертильность коров;

разработать рекомендации производству по профилактике и терапии иммунного бесплодия коров.

Научная новизна Впервые изучены основные причины иммунного бесплодия коров в условиях Московской области. Определены параметры клеточного и гуморального иммунитета у коров с нормальным течением послеродового периода, оплодотворение которых наступало при искусственном осеменении в первую половую охоту после родов.

Изучено содержание иммуноглобулинов в цервикальной слизи и сыворотке крови коров с нормальным течением послеродового периода, оплодотворение которых наступало в первую половую охоту после родов и у коров многократно осемененных, но остающихся бесплодными. Изучена фагоцитарная активность нейтрофилов в цервикальной слизи и крови коров с нормальной плодовитостью и у бесплодных животных.

Впервые были изучены показатели клеточного и гуморального иммунитета и их взаимосвязь у коров с нормальной плодовитостью и многократно осеменяемых, но длительный период остающихся бесплодными. Впервые установлены основные причины бесплодия коров, вызванные иммунными факторами, разработаны практические рекомендации по их устранению.

Впервые изучено содержание Т – лимфоцитов и их субпопуляций: Т – лимфоцитов – супрессоров, Т – хэлперов и Т – киллеров, а также IgG, IgM, Влимфоцитов и нейтрофилов в цервикальной слизи и крови коров с нормальной плодовитостью и у бесплодных коров.

Установлены титры спермиоагглютининов в крови коров, которые вызывают стойкую их инфертильность. Впервые нами было установлено, что высокие титры антиспермальных антител в цервикальной слизи и крови бесплодных коров объясняются более высоким содержанием в их крови IgG, IgM, В-лимфоцитов, нейтрофилов (микрофагов), что указывает на активизацию их гуморального иммунитета. Также у бесплодных коров выявлено угнетение основных параметров клеточного звена иммунитета – Тлимфоцитов, Т-хэлперов, Т-супрессоров.

Рекомендованы мероприятия по устранению основных факторов, иммуномодулирующей терапии и профилактики.

Основные положения диссертационной работы, выносимые на 1. Анализ репродуктивной функции у коров черно – пестрой 2. Определение титров спермиоагглютининов в цервикальной слизи и крови коров с нормальным течением послеродового периода и оплодотворившихся при их искусственном осеменении в первую половую охоту после родов и у коров, гуморального иммунитета у бесплодных коров.

4. Показатели фагоцитарной активности нейтрофилов в цервикальной слизи и крови у коров с нормальной плодовитостью и у бесплодных коров.

стойкую инфертильность у коров.

6. Рекомендации производству по устранению иммунных факторов, негативно влияющих на воспроизводительную функцию коров с использованием иммуномодулирующей Основные положения диссертационной работы доложены, обсуждены и одобрены на конференциях профессорско – преподавательского состава, государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии им.

К.И. Скрябина (2007-2011); Международной научно – практической гинекологии и биотехники размножения животных» (Ставропольский ГАУ, 15-18 мая 2007); Международной научно – практической конференции «Проблемы увеличения производства продуктов животноводства и пути их решения» (ВИЖ, Дубровицы, 21-23 октября 2008); Международной научно – воспроизводства животных» (ВИЖ, Дубровицы, 25-26 октября 2007);

государственной академии ветеринарной медицины «Новые аспекты биотехнологии репродукции животных» (Санкт – Петербургская ГАВМ, 29октября 2008); на Всероссийском семинаре «Опыт создания и работы сервисных центров по воспроизводству сельскохозяйственных животных в рамках реализации Государственной программы развития сельского хозяйства» (ВИЖ, Дубровицы, 22-24 сентября 2009); Международной научно – практической конференции: «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения» (РАМЖ, Быково, 16- июня 2010).

По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, в том числе 2– в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Диссертация изложена на 137 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материала и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, практических предложений, рекомендаций по использованию научных выводов и списка использованной литературы.

Работа иллюстрирована таблицами. Список использованной литературы содержит 233 источника, из них 75 иностранных авторов.

Термин «иммунитет» происходит от латинского слова «immunis» (так в древнем Риме называли гражданина, свободного от определенных государственных повинностей). Первоначально этот термин использовался для обозначения резистентности организма к инфекциям, а иммунология составляла дисциплину, изучающую финомен иммунитета. В настоящее время это определение существенно расширено и касается множества реакций, направленных на элиминацию из организма любого чужеродного материала. К области иммунологии относятся также проблемы патологии, связанные с нарушением нормального хода иммунных реакций. Кроме того, наблюдается активное взаимопроникновение иммунологии в целый ряд ставших смежными дисциплин, таких как генетика, эмбриология, экология и др. (58,64,77,91,102,103,133).

Антигены – вещества, специфически реагирующие с антителами или клеточными рецепторами и способные индуцировать продукцию антител, либо специфические клеточные реакции. Вещества, реагирующие с антителами, но неспособные при введении в организм вызвать продукцию антител, называются гаптенами. (130,131,132,172,183,192).

Антитела – вещества, продукция которых может быть вызвана введением в организм антигенов или гаптенов при условии, что последние химически связаны с носителем. Непременным свойством антител является их способность специфически связываться с антигенами или гаптенами.

(103,104,105,109).

Иммунологическая память – способность организма отвечать на повторное введение антитела иммунной реакцией, характеризующейся большей силой и более быстрым развитием.

Иммунная система, так же как и другие системы высших позвоночных, (нервная, эндокринная), призвана обеспечить наилучшую приспособляемость организма к условиям внешней среды. Если формализовать признаки, характерные для этих основных систем, то окажется, что иммунная система более всего напоминает нервную. Действительно, обе системы могут распознавать «свое» и «чужое», способствуя, таким образом, самоидентификации организма в окружающей среде. Обе системы реагируют на внешние воздействия с исключительно высокой специфичностью. Обе системы обладают свойством памяти. В обоих случаях распространения сигнала внутри системы осуществляется по принципу сетей. Следуют, однако, заметить, что в основе указанного сходства могут лежать совершенно различные механизмы. (160,170,178,193,225).

Помимо сходства, имеются и различия, главным из которых является способность клеток иммунной системы действовать в автономном режиме, что абсолютно исключено для клеток нервной системы.

Уникальность иммунной системы состоит в том, что ее клетки могут одновременно выполнять рецепторные, секреторные и эффекторные функции и, обладая подвижностью, мобильно осуществлять свою сенсорную, регуляторную и защитную роль в то время и в том месте организма, когда, где и с какой интенсивностью это требуется.

Таким образом, нервная и эндокринная системы как бы осуществляют химический и физический мониторинг через «стационарные посты»

(нейроны, специализированные эндокринные клетки и другие структуры) наблюдения за химическими и физическими показателями, а иммунная система осуществляет генетический мониторинг – как через «стационарные посты» (макрофаги и лимфоциты в различных тканях), так и через мобильные группы клеток (моноциты и лимфоциты крови, лимфы, межклеточной жидкости). (28,132,190,212).

биологических показателей гомеостаза, регуляторные системы включают свои механизмы для его поддержания на необходимом для организма уровне.

Нервная, эндокринная и иммунная системы регуляции выступают, с одной стороны как самостоятельные, а с другой – как тесно взаимосвязанные системы, о чем свидетельствует наличие хорошо развитой симпатической и парасимпатической иннервации желез внутренней секреции, центральных и периферических лимфоидных органов, а также обнаружение в них общих гормонов, медиаторов и других биологических регуляторов. Например, некоторые нейроны головного мозга секретируют эндорфины и энкефалины, которые являются также составной частью, действующим началом лейкоцитарного интерферона, миелопептидов костного мозга, тимозина (гормона тимуса) и некоторых других гормонов. Некоторые гистогормоны (гистамин, серотонин), а также истинные гормоны (вазопрессин, окситоцин, норадреналин) одновременно являются нейромедиаторами. Соматотропин образуется и в гипофизе и в лимфоцитах Ацетилхолин, норадреналин, серотонин помимо нервных клеток образуются и в лимфоцитах. ИЛ- продуцируются преимущественно мононуклеарными фагоцитами. Его продуцентами также являются нейтрофилы, В-лимфоциты, естественные киллеры, клетки нейроглии, нейроны головного мозга, периферические симпатические нейроны, мозговое вещество надпочечников. (107,108,131, 132, 197).

Клетки. Лим оциты – клетки, ответственные за специфичность действия иммунной системы, а также за сохранение иммунологической памяти. С помощью специализированных популяций лимфоцитов организм способен различать «свое» и «чужое», распознавать чужеродные антигены, продуцировать антитела, а также осуществлять специфически направленные цитотоксические реакции. (30,169).

М фаги и моноциты – филогенетически наиболее древние клетки периферической крови макрофагами. Функции макрофагов разнообразны и не исчерпываются потребностями иммунной защиты организма. Впервые на защитную функцию макрофагов указал И.И. Мечников, открывший явление фагоцитоза (Нобелевская премия за 1908 г.). В настоящее время известна другая фундаментальная роль макрофагов – представление антигенов информацией лимфоцитам. Без этой функции макрофагов невозможно специфическое распознавание чужеродного антигена. Кроме того, макрофаги являются продуцентами многочисленных медиаторов иммунных реакций (простагландины, интерлейкины), а также факторов комплемента.

Клетки К и NК. К-клетки способны разрушать клетки-мишени, покрытые крайне малыми количествами IgG-антител. NK-клетки (естественные киллеры) также являются цитотоксическими клетками, осуществляющими цитотоксический эффект (главным образом против опухолевых клеток) без предварительной иммунизации и в отсутствие антител.

Другие клетки. Следует отметить тучные клетки и базофилы, играющие важную роль в реакциях воспаления и анафилактических реакциях, а также неспецифических иммунных реакциях. Гепатоциты, которые наряду с макрофагами являются продуцентами факторов комплемента.

высокомолекулярные белки, относящиеся к семейству иммуноглобулинов (Ig). У человека и большинства млекопитающих различают 5 классов иммуноглобулинов: A, D, E, G и M.

Антигенсвязыва щ мембранные рецепторы иммуноглобулиновой (для В-лимфоцитов) или неиммуноглобулиновой (для Т-лимфоцитов) природы. С помощью этих рецепторов клетка специфически распознает антиген. (130).

Антигенспецифические медиаторы, продуцируем Т-лим оцитпми. К этой синтезируемые лимфоцитами в процессе иммунного ответа.

иммунного ответа относятся лимфокины, монокины, фактор некроза гиперчувствительности немедленного типа (гистамин, серотонин, фактор комплемента. (203,213,232).

Все многоклеточные организмы обладают распознающими системами, Распознавание происходит на клеточной поверхности, где идет также широкий обмен ионов, метаболитов и биологических молекул. Одна такая система у позвоночных была изначально охарактеризована по способности отторгать кожный трансплантат и, в частности, у мышей она получила название Н-системы (Histocompatibiliti – тканевая совместимость). У мышей отдельные продукты Н-генов были исследованы с помощью антител (антисывороток), полученных от иммунизированных животных конгенных (отличающихся по одному Н-гену) или рекомбинатных линий, а также в клеточных реакциях, преимущественно в смешанной культуре лимфоцитов – СКЛ. Поскольку последняя является адекватной моделью распознавания рецепторов чужеродных клеток, то ее применяют в нескольких вариантах, в том числе и с использованием гомозиготных клеток от близкородственных особей. В настоящее время систему Н-генов исследуют с помощью моноклональных антител на молекулярном уровне. (28).

В зависимости от биологических отличий антигены и антитела обозначают как аутологичные (собственные), сингенные (отличие в пределах одной инбредной линии), аллогенные (отличия в пределах одного биологического вида) и ксеногенные (при межвидовых отличиях). В соответствии с этим трансплантацию тканей называют аутотрансплантацией, сингенной трансплантацией (прежний термин - изотрансплантация), аллотрансплантацией (гомотрансплантация) и ксенотрансплантацией (гетеротрансплантация). В точно таком же биологическом смысле применяются термины сингенные и аллогенные беременности, иммунизация или искусственный (пассивный) перенос лимфоцитов и антител.

Система Н-генов присуща всем млекопитающим, она определяет трансплантационными. У человека ее обозначают как систему HLA (Human Leukocyte Antigens), у шимпанзе – ChLA, у макак – RhLA, у собак – DLA, у крыс – Ag-В, у кроликов – RLA и т.д. Антигены, кодируемые этими генами, принадлежат к категории аллоантигенов, их собирательно именуют генами или антигенами МНС (Major Histocompatibiliti Complex – главный комплекс гистосовместимости). У различных видов животных найдено сходство в серологических свойствах, аминокислотном составе продуктов и гинетической организации МНС. (30,217,226).

В дальнейшем выяснилось, что те же антигены играют важнейшую роль не только в отторжении трансплантата или реакции трансплантата против хозяина – РТПХ, но и в регуляторных процессах внутри самого организма, который их распознает как аутоантигены или собственные генетические «опознавательные знаки». Функциональная активность МНСгенов и сочетание кодируемых ими антигенов определяет чувствительность или, напротив, устойчивость организма к ряду наследственных и приобретенных заболеваний. МНС-гены регулируют иммунный ответ организма в целом и взаимодействие всех типов клеток, участвующих в неиммунологические явления, как плодовитость, размеры органов и тела, репарация ДНК. МНС-антигены, расположенные на поверхностной мембране клетки, выполняют по отношению к этой клетке защитную роль, подобно тому как антитела или лимфоциты защищают целостный организм.

самораспознающих систем с целью предупреждения слияния различных организмов и защиты от паразитов и контагиозных опухолей.

Сегодня различают гены МНС и кодируемые ими гликопротеины – антигены трех классов. Гены I класса кодируют молекулы клеточной поверхности, часть из которых присуща всем клеткам организма (отсюда их значение в реакциях несовместимости при пересадках тканей и беременности), а другая – только гемопоэтическим клеткам (возможно, дифференцировочные антигены). Антигены I класса МНС выявляются преимущественно серологически, т.е. с помощью специфических антисывороток. Гены МНС, составляющие II класс, кодируют поверхностные молекулы лимфоцитов и макрофагов, они регулируют их кооперативные взаимоотношения и регулируют иммунный ответ на многие антигены.

Антигены II класса определяются клеточными и серологическими методами.

Гены III класса изучены мало, они определяют синтез ряда белков, участвующих в активации комплемента. (28,64,130).

Хотя разделение общего иммунного ответа организма на клеточный и гуморальный достаточно условное, мы здесь придерживаемся такой схемы исключительно для удобства изложения. Под клеточным иммунитетом подразумевают реакции гиперчувствительности замедленного типа – ГЗТ или клеточной сенсибилизации, связанные со специфическим взаимодействием тимусзависимых лимфоцитов (Т-лимфоцитов) с клетками – мишенями. Последними могут быть клетки аллотрансплантата, измененные собственные клетки, бактерии и др. Соответственно говорят о трансплантационном, противоопухолевом, антибактериальном клеточном иммунитете.

Предшественники Т-лимфоцита – стволовые Т-клетки возникают в желточном мешке, откуда затем мигрируют в печень и далее – в костный мозг эмбриона. Созревание этих стволовых элементов в зрелые Т-лимфоциты происходит в вилочковой железе (тимусе), откуда они затем выселяются в лимфатические узлы и другие периферические лимфоидные ткани.

Определение Т-лимфоцитов с помощью антител к их специфическим поверхностным молекулам (характерным для всех Т-клеток является 0- или Thy-I-антиген) показало, что в вилочковой железе их содержание составляет 100%, в крови – 70%, в лимфатических узлах до 60%, в селезенке – 35% и 0% в костном мозге.

В дальнейших экспериментах на мышцах было показано, что Тлимфоциты обладают разными свойствами – киллерной (Kill - убивать) и супрессорной активностью (Cantor H., Boyse E., 1975, 1977). Первые разрушают клетки-мишени, вторые осуществляют иммунорегуляторные функции. Дальнейший прогресс обозначился, когда было показано наличие Т-лимфоцитов – помощников или Т-хэлперов (help- помогать), которые дифференцировки В-лимфоцитов в антителобразующие клетки, а с другой – для созревания Т-киллеров и Т-супрессоров из соответствующих лимфоидных предшественников.

На поверхности хэлперных и супрессорных лимфоцитов были выявлены специфические активные участки – Fc-рецепторы, связывающие иммуноглобулины (Ig). Fc-рецептор к Ig класса М оказался присущим Тхэлперам, Fc-рецептор к Ig класса G – Т-супрессорам (Moretta L. Et., 1977).

Деление Т-лимфоцитов на Т-киллеры, Т-хэлперы (Тµ) и Т-супрессоров (Т ) оказалось очень полезным для понимания существа иммунорегуляторных процессов, хотя функции Тµ и Т -клеток нельзя сегодня окончательно охарактеризовать. Так, среди Т -клеток здоровых людей около 70% лимфоцитов обнаруживает цитотоксическую и естественную киллерную активность (Vanderbeeken Y., Yliegne M.P. et al., 1982).

предшественники которых образуются в эмбриональном периоде также в желточном мешке. Центральным органом В-иммунитета у птиц является сумка Фабрициуса (Bursa), а у млекопитающих, по-видимому, костный мозг.

В-лимфоцит, получивший информацию об антигене от макрофага и одновременно от Т-хэлпера, стимулирующий его пролиферацию, претерпевает несколько последовательных делений и превращается в плазматическую клетку, синтезирующую антитела (Ig). Ig составляют 15% общего количества сывороточных белков, их молекулы обладают разными свойствами, а их продукция протекает с участием Т-хэлперов и Тсупрессоров. (30,222,229).

Взаимодействие гуморальных антител с антигеном – с аллогенными или ксеногенными клетками – проявляются in vitro в разных лабораторных феноменах. Антитела могут склеивать, агглютинировать антигенэритроциты, -лейкоциты, -спермии и т. д.; в таких случаях говорят о гемагглютининах, лейкоагглютининах, спермиоагглютининах и т.д. Широкое распространение получила также реакция непрямой агглютинации, когда к эритроцитам или нейтрофильным частицам (латекс, полиакриламидные бусы др.) присоединяют антиген, а затем добавляют антитела к нему, побуждающие склеиваться нейтральные частицы. Метод применяется для выявления растворимых антигенов, но обладает высокой чувствительностью.

Цитотоксический эффект регистрируется по числу погибших клеток после экспозиции сыворотки с антигеном (лимфоцитотоксины, спермоцитотоксины и др.), причем в отличие от клеточно-опосредованного лизиса он происходит только в присутствий комплемента. (147).

Иммунофлюоресцентные методы основаны на том, что антитела соединяют с флюоресцентным красителем (обычно изотиоционатом натрия), а затем экспонируют с объектом исследования, который связывает этот краситель, если антитела специфичны (авидны) к данному антигену.

агглютинацию, через промежуточную стадию, когда к исследуемому антигену (клетки ткани) присоединяют антитела, а затем добавляют сыворотку против этого антитела (анти-антитело) с красителем.

Метод преципитации основан на выпадении в осадок комплекса растворимого антигена с вводимыми в реакцию сывороточными антителами.

Вариант реакции в агаре удобен для характеристики антигенов (или антител) взаимодействия. Преципитация в агаре часто использовалась для изучения ауто- и алло-антигенов (в частности гамет), так как специфическую антисыворотку (сыворотку, полученную направленной иммунизацией животных исследуемым антигеном) можно абсорбировать разными тканями.

соответствующими антигенами в ткани, использованной для абсорбции. В таком случае говорят о наличии общих или перекрестных антигенов в клетках, использованных для иммунизации и последующей абсорбции.

иммуноглобулинов в жидкостях организма.

Сочетание в агаре лимфоцитов от животных, иммунизированных эритроцитами, с этими эритроцитами позволяет фиксировать зоны локального гемолиза и учитывать число антителообразующих клеток (АОК).

Поскольку взаимодействия антител с антигеном происходит только в присутствии комплемента, изучение антител можно проводить, исследуя потребление последнего в реакции связывания комплемента (РСК). Реакция оказывается положительной только в случае специфического взаимодействия исследуемых антител с известным антигеном (или наоборот).

распространение в последнее время, основан на взаимодействии исследуемого материала со стандартным для данной реакции комплексом антиген + антитело, меченного радиоактивным йодом - I или тимидином H. Снижение радиоактивности преципитата стандартного комплекса означает присутствие в исследуемом материале субстрата (антигена, антитела), способного взаимодействовать с компонентами данного комплекса. Метод имеет высокую разрешающую способность (выявляется 1нг исследуемого вещества). По чувствительности с радиоиммунологическим может конкурировать лишь иммуноферментный метод, основанный на взаимодействий комплекса антигена + антитело со стандартными антителами, меченными пероксидазой хрома. В случае образования специфического комплекса антитела реагента окрашиваются при добавлении соответствующего фермента. (28,208,215).

иммунологии. Это стало возможным после того, как G. Khler и C. Milstein (1975) открыли возможность гибридизации соматических клеток для получения стационарных клонов гибридных клеток или «гибридом», продуцирующих антитела узкой специфичности. С этой целью обычно используют гибрид В-клетки от животного, иммунизированного данным очищенным антигеном, с клеткой мышиной миеломы. Полученный гибрид синтезирует только антитела к исследуемому антигену (в организме синтез Ig данной специфичности непродолжителен). При длительном культивировании высокоспецифичных антител (цитировано по В.И. Говалло, 1987).

При электрофоретическом исследовании все сывороточные антитела оказываются в зоне -глобулинов. Позже эта фракция белков получила название иммуноглобулинов (Ig), что равнозначно понятию антитело (исключение составляют некоторые Ig – свободные цепи при лимфопролиферативных заболеваниях). Все Ig состоят из одной или нескольких основных структурных единиц, а каждая единица – из двух одинаковых тяжелых – Н (Heavy) и двух одинаковых легких L (Light) цепей.

Каждая цепь свернута в несколько компактных глобулярных «клубков» или доменов, состоящих примерно из 110 аминокислот (мол. масса 12500). Все полипептидные цепи Ig состоят из двух частей – концевой вариабельной (V) области, ответственной за индивидуальный идиотип, и концевой – константной (С) области, определяющей аллотип. V-области цепей обоих типов (H и L) соответствуют по своей величине одному домену. С-области Lцепей имеют сходные размеры, тогда как С-области Н-цепей в 2 – 4 раза длиннее. Ни одна из цепей не обладает активностью антитело, его активный центр, соединяющийся с антигеном, формируется двумя Н- и одной L-цепью.

При обработке антител протеолитическими ферментами они расщепляются на фрагменты (F). При папаиновой обработке молекула Ig расщепляется на три фрагмента (Poter R., 1959). Два из них, способные связываться с антигеном, называют Fab1 и Fab2 (antigen binding), а третий, соединяющийся с комплементом, Fc (constant). При расщеплении Ig пепсином происходит отщепление в другом месте молекулы, несущий оба Fab-фрагмента и обозначенной как F (ab )2, также способной связываться с антигеном. Fab-фрагменты называют моновалентным антителом, F (ab )2 двух валентным антителом. Мол. м. Fab-фрагментов – 45000.

Среди иммуноглобулинов различают пять классов – IgM, IgG, IgA, IgD и IgE, отличающихся по молекулярной массе, физико-химическим и биологическим свойствам. IgG составляет 70 – 80% иммуноглобулинов в сыворотке крови, их мол. м. 150 000 – 160 000, константа седиментации 7S. В электрофорезе различают относительно рано возникшие подвижные IgG1 и более поздние IgG2, IgG3 и IgG4, они соответственно составляют 60, 30,7 и 3% IgG. IgG – единственный класс антител, проникающих через плацентарный барьер (IgG1 и IgG3) и присутствующих в крови новорожденных. К этому классу относится также большинство противобактериальных и противовирусных антител, а также блокирующие антитела, определяющие феномен усиления. Концентрация IgG повышается также при некоторых аутоиммунных заболеваниях.

IgM составляет 5 – 10% сывороточных белков, мол. м. 900 000 – 1 000 000, константа седиментации 19S. Это относительно крупная молекула, построенная из 5 субъединиц аналогичных IgG. IgM первыми появляются после антигенной стимуляции или при развитии инфекции («антитела тревоги»), позднее они уступают месту IgG, которые продуцируются другими плазматическими клетками. Уровень IgМ заметно повышен при перинатальных инфекциях и острых инфекционных заболеваниях.

IgА в сыворотке встречаются в мономерной форме, он связывается с антигеном без участия комплемента и играет ключевую роль в невоспалительном удалении антигена. Катаболизм его комплексов с антигеном происходит в печени. Особое значение имеет димерный IgА, имеющий дополнительную полипептидную цепь. Такой секторный IgА (SIgA) присутствует в слезах, слюне, желчи, кишечном и желудочном соке, цервикальной слизи и других секретах репродуктивного тракта. Клетки, несущие IgА, составляют 70 – 90% всех плазматических клеток, присутствующих в слизистых оболочках здоровых людей. SIgA играет исключительно важную роль в создании местного иммунитета. В кишечнике он обезвреживает попавшие с пищей токсические вещества, в дыхательных путях препятствует инфицированию слизистых оболочек носоглотки, в репродуктивной системе создает заслон развитию инфекции.

IgD (мол.м. 172 000) продуцируют немногочисленные В-клетки толстого кишечника и костного мозга, синтез его происходит в 100 раз медленней IgМ. Число В-носителей IgD больше, чем его продуцентов. Еще медленнее синтезируется IgЕ, играющий важную роль в аллергических реакциях. (28,64,130,139,141).

Е.С. Воронин, А.М. Петров, М.М. Серых, Д.А. Девришов (2002), предполагают, что оплодотворяемость самок сельскохозяйственных воспроизводительных функций у производителей.

Сперма производителей содержит более чем 30 различных антигенов, образование аутоантител и вызывать соответствующую иммунопатологию.

Антитела, образующиеся к спермиям, приводят к бесплодию коров. Данные антитела можно выявить в реакции агглютинации. Чаще всего они относятся к IgG, реже к IgМ и IgА. (105, 109,147).

По мнению Л. Йегер (1986), обнаруживаемые антитела обладают различными свойствами, и выявляют их в реакциях агглютинации, иммобилизации и иммунофлюоресценции.

Лабораторные методы диагностики нарушений функции репродукции приведены в описании А.М. Земского, В.М. Земского, А.В. Караулова (1999);

П.С. Веревочкина, Н.Н. Едренина (1988); в описании Е.С. Воронина, А.М.

Петрова, М.М. Серых и др. (2002).

Тест агглютинации спермиев. Тест весьма чувствителен и поэтому требует постановки контролей, исключающих ложноположительные результаты за счет спонтанной реакции.

Существует две модификации теста.

Макроскопический тест спермиоагглютинации по Kibr ick. После часового отстаивания эякулята при комнатной температуре клетки ресуспендируют до 40 млн/мл в 0,9%-ном растворе натрия хлорида, смешивают 1:1 с 10%-ным раствором желатина на натрия хлориде. К 0,3 мл сыворотки крови исследуемого животного (или ее разведений) добавляют равный объем эякулята на желатине, инкубируют 2 ч при 37 С и учитывают при отрицательной реакции определенную мутность суспензии, обусловленную взвесью изолированных клеток, а при положительной реакции выявляют различные фракции: осадок, хлопьевидный агглютинат и прозрачный супернатант. В контроле используют образцы тест-положительной и тестотрицательной сывороток.

Микроскопический тест спермиоагглютинации по Frankl in – Dukes и Sch m wi mer. Разводят эякулят до концентрации 60 млн/мл клеток, 0,025 мл тест-клеток смешивают с 0,25 мл инактивированной сыворотки крови животного (при 50 С 30 мин), после часовой инкубации при 37 С встряхивают и оценивают в фазовом контрасте на предметном стекле. При оценке реакции по методу Schill в 10 полях зрения подсчитывают процент агглютининов, при котором они имеют три варианта: головка – головка, хвост – хвост, смешанная форма.

Тест иммобилизации спермиев по Isojima и Lehmann. Разводят пробу эякулята до 60 млн/мл, при чем тест-реагентами являются 0, 25 мл инактивированной (см. выше) сыворотки + 0,025 мл взвеси клеток эякулята + 0,0025 мл комплемента (контроль – тест-система без комплемента).

Выполняют также контроль комплемента, для чего сыворотку больного заменяют на 0,25 мл изотонического раствора натрия хлорида. В процессе реакции смесь инкубируют 1 ч при 37 С, осадок ресуспендируют и учитывают реакцию в фазовом контрасте. При положительной реакции спермии утрачивают подвижность, как минимум, на 50%, в подобных случаях сыворотку титруют для определения титра. (28,173).

Метод непрямой иммунофлюоресценции по Coons и Kaplan. Каплю эякулята наносят на стекло, делают мазок и фиксируют ацетоном отмытые клетки эякулята, после чего обрабатывают его сывороткой крови животного (разведении 1:5 и т.д.), инкубируют 30 мин во влажной камере при 37 С, отмывают, обрабатывают далее ФИТЦ-меченой антисывороткой к гаммаглобулину человека, повторно инкубируют 30 мин, реакцию оценивают в флюоресцентном микроскопе. Специфическое свечение локализуется в различных участках клеток: акросома, постакросомная часть головы, хвост, промежуточная зона спермия. Ставят соответствующие контроли.

Для диагностики инфертильности коров можно использовать метод диагностики иммунного бесплодия коров, разработанный в ВНИИРЖ (г. Пушкин) в описании П.С. Веревочкина и Н.Н. Едренина (1988) (см. в разделе: Материалы и методы исследований).

Весь ход созревания половых клеток, оплодотворение, имплантация эмбриона и его дальнейшее развитие в организме матери отмечены активными иммунологическими процессами. Спермии являются потенциально аутоантигенными, нарушение целостности барьера, изолирующего их от клеток иммунной системы, ведет к развитию клеточного и гуморального иммунитета, что становится причиной последующей мужской стерильности. В эксперименте это хорошо иллюстрируется моделью ЭАО (Экспериментальный аллергический орхит) после иммунизации тестикулярными тканями или деструкции одного семенника, в клинике то же наблюдается при перевязке семявыносящего протока – вазэктомии. Стерильность возникает в результате поражения антителами именно фертильной популяции спермий. (30,102,103,104,108,175) Аутоантигены спермий, возникающие в ходе последовательной смены мембранных белков, весьма многочисленны. Гематотестикулярный барьер, состоящий из нескольких непроницаемых слоев сократимых миоидных клеток, базальной мембраны, клеток зародышевого эпителия и спермий, явился тем эволюционным приспособлением, которое предупредило прямой контакт гамет с клетками иммунной системы. В противном случае гаметы, как клетки с выраженными дифференцировочными антигенами и гаплоидным набором хромосом, были бы иммунологически распознаны и истреблены. Если бы гаметы не отличались по антигенному составу от соматических клеток, они бы утратили фертильность (М.М. Серых, О.Н.

Макурина, А.М. Петров и др. 2000).

Иммуногенность спермий определяется не только их собственными антигенами, но и белками, которые абсорбируются ими из семенной плазмы.

Среди последних особое значение имеет оболочечный антиген – SCA, близкий по специфичности к антигенам женского репродуктивного тракта.

Этот антиген называемый оболочечным, обволакивающим SCA (Spermatozoa Coating Antigen) или скафферрином, защищает спермии во время их миграции в женском репродуктивном тракте (Hekman A., R mke P., 1969).

Считают, что протективный эффект объясняется его сходством с антигенами цервикальной слизи и внутриматочной среды («антигенная мимикрия»

спермий). По антигенным характеристикам скафферрин близок к лактоферрину молока. Процесс утраты спермиями этого антигена в женском половом тракте называется капацитацией, что важно для оплодотворения.

Не только SCA, но и другие антигены семенной плазмы абсорбируются на поверхности спермий. Эти антигены продуцируются не столько семенниками, сколько в семенных пузырьках, простате и добавочных железах. Благодаря SCA спермии могут дольше сохраняться в матке. Тому же способствуют антикомплементарные и иммуносупрессорные факторы, присущие семенной плазме и, возможно, самим спермиям. Очевидно, спермии могут стимулировать синтез супрессорных лимфоцитов, по крайней мере иммунизация самок мышей спермиями вызывает ускоренный рост перевиваемой тератокарциномы (иммунизация ксеногенными фибробластами подавляет опухолевый рост). Максимальной иммуносупрессорной активностью обладают экстракты предстательной железы. (121,129,131,132,185,189).

сосредоточенными преимущественно в ПЗ (прозрачная оболочка яицеклетки).

Антитела к ПЗ подавляют пенетрацию спермий в яйцеклетку.

Предполагается, что на поверхности ПЗ имеются видоспецифические рецепторы к спермиям, которые нарушаются преципитатом антител.

Развивающаяся яйцеклетка содержит присущие только ей антигены, она, как и спермии, защищена от иммунных клеток организма фолликулярной жидкостью и наружными оболочками (преимущественно ПЗ).

Аутоантитела к антигенам ПЗ служат частой причиной женского бесплодия. Для исследования гуморальной сенсибилизации используют яйцеклетки свиней, имеющие много общих антигенов с яйцеклетками человека. Антигены яичников дают перекрестные реакции с антигенами других органов (селезенка, печень, почка) и эндокринных желез, поэтому иммунологическое повреждение яичников может наблюдаться при разных патологических состояниях (сахарный диабет, аддисонова болезнь, гипо- и гиперпаратиреоидоз).

Презиготический отбор спермий, который осуществляет яйцеклетка, по-видимому, имеет сугубо иммунологическую природу. Есть основания полагать, что эту функцию определяют гены локуса Т/t, аллели которого выражены на спермиях и яйцеклетки. Локус Т/t является эволюционным предшественником МНС-генов. Твердо установлено наличие на гаметах антигенов МНС I класса, присутствие антигенов МНС II класса окончательно не доказано. Возможно, что последние присутствуют в подпороговом количестве или замаскированы мукополисахаридами и сиаловыми кислотами, которые сами могут выступать как дифференцировочные антигены, они же снижают антигенность макромолекул антигенов МНС.

сопровождается массовым их фагоцитозом. Возможно, что такой процесс, развивающийся уже через несколько часов после контакта слизистой влагалища со спермой, является пусковым механизмом для миграции лимфоидных элементов их костного мозга в слизистую оболочку матки и для дифференцировки предшественников лимфоцитов-супресоров. Полноценный фагоцитоз спермий отсутствует, если в цервикальной слизи и маточной жидкости присутствуют антитела к спермиям (IgG и SIgA), которые препятствуют также последующей капацитации (сбрасывание SCA) спермиями. Активный местный синтез антител к спермиям отмечен у большинства бесплодных женщин (В.И. Говалло 1987).

Следствием всасывания продуктов разрушенных спермий и их фагоцитоза является увеличение лимфатических узлов, дренирующих матку.

Увеличение массы регионарных лимфатических узлов пропорционально степени МНС-антигенных отличий самца и самки, но оно имеет место и при сингенной беременности. Последнее служит доказательством того, что распознавание самкой антигенов самца является непременным условием развития беременности, даже если эти различия ограничены H – Y- и органо (ткане)- или трофобластспецифическими антигенами. В той же связи со степенью антигенных отличий находится интенсивность децидуальной распознавание фетальных аллоантигенов самцами и самками различно.

Последние, в частности, под действием аллоантигенов могут вырабатывать медиаторы, обеспечивающие усиленное образование эмбриональных тканей.

иммунизированного МНС-антигенами самца, бывает более многоплодной.

Процессы репродукции строго контролируются гонадотропными гормонами трех уровней: рилизинг-факторами (либеринами) гипоталамуса, фолликулостимулирующим и лютеинизирующим гормонами и пролактином прогестероном, вырабатываемых семенниками яичником, желтым телом, плацентой. Мишенью действия этих гормонов являются не только репродуктивные органы, но и иммунная система. На клетках вилочковой железы присутствуют рецепторы к андрогенам, эстрадиолу и прогестерону.

принципах отрицательной обратной связи, можно думать, что вилочковая железа, побуждающая гипоталамус к продукции РФ, угнетается конечным звеном гормонального кругооборота – стероидными гормонами (М.М.

Серых, В.В. Зайцев, Н.А. Кленова и др. 2004).

Внешняя прозрачная зона (оболочка) – ПЗ яйцеклетки выполняет ряд важных биологических функций, из которых нужно отметить следующие: а) защита фолликулярных ооцитов; б) связывание спермиев в начальной стадии фертилизации; в) предупреждение полиспермии; г) осмотическая регуляция яйцеклетки и развивающегося эмбриона; д) ограничение и защита яйцеклетки и эмбриона в яйцеводе и матке; е) участие в начальных стадиях имплантации.

неочищенными экстрактами тканей яичника. Антитела, полученные в ксеногенной системе, взаимодействовали преимущественно с ПЗ, что было подтверждено в многочисленных экспериментах на животных и в наблюдениях на людях (Sacco A., 1977). Иммунизация очищенными экстрактами ПЗ мышей позволила получить антисыворотки с резко выраженным in vitro антифертильным действием (Tsunoda Y., 1977; Aitken R., Richardson D., 1980).

иммунизации тканями яичников или очищенными экстрактами ПЗ, имеют высокую межвидовую перекрестную активность. Это относится к антисывороткам, полученным от грызунов (Shivers C., 1977), свиней (Palm V.

et al., 1979; Tsunoda V., Sigie T., 1979), людей (Sacco A., 1977). Особо выраженные перекрестные антигены были найдены между ПЗ свиней и человека. F (ab )2-фрагменты сыворотки кроликов, иммунизированных экстрактами ПЗ свиньи или человека, после абсорбции сывороток соответственно человеческими или свиными тканями (клетками печени, плазмой крови, фолликулярной жидкостью) сходным образом реагировали затем в реакциях непрямой иммунофлюоресценции и преципитации (Sacco A., 1978). Эта работа дала новый стимул для клинико-иммунологической оценки роли антител к ПЗ у инфертильных женщин, поскольку получение в необходимом количестве яйцеклеток человека связано с техническими трудностями.

Очищенный антиген, полученный в растворимом состоянии ПЗ свиней и человека, оказался гликопротеином с мол.м. около 100 000. Из свиных яйцеклеток удалось получить его в лиофилизированном состоянии лишь 30 мг (Noda Y. et al., 1980). Другие исследователи считают, что тканеспецифическая иммуногенность ПЗ связана с тремя гликопротеинами с мол.м. от 40 000 до 120 000 (Yurewicz E. et al., 1983).

Были получены непрямые доказательства того, что антигены ПЗ обладают строгой тканевой и относительной видовой специфичностью.

После введения хомячкам меченных изотопами ксеногенных сывороток с антителами к ПЗ наибольшая концентрация и медленное выведение отмечалось именно в яичниках (Yanagimachi R. et al., 1976). Следствием такой пассивной иммунизации была преходящая инфертильность, не связанная с поражением других органов и изменением сексуального поведения животных. H. Hasebe и сооавт. (1983) исследовали кроличью антисыворотку к ПЗ свиней, которая после очистки на колонке с сефадексом содержала антитела в титре 1:64 000. Никакие солевые растворы из тканей и органов 50 свиней, 40 обезьян и 30 людей с этими антителами не взаимодействовали, исключая фолликулярные ткани и яйцеклетки. То же самое подтвердили с помощью моноклональных антител к ПЗ S. Isojima и соавт. (1983).

Видовая специфичность антигенов ПЗ была постулирована в ранней работе A. Sacco и C. Shivers (1973). Однако, в некоторых случаях тканевая специфичность превышает межвидовые отличия. Так перекрестные антигены, помимо ранее упомянутых у человека и свиньи, были показаны между ПЗ мышей, крыс и хомячков (Tsunoda Y., Chang M., 1976), мышей, хомячков, беличьих обезьян макак резус (Gwatkin R. et al., 1977), кроликов, коров, мартышек, макак и человека (Gwatkin R., Williams D., 1978), зеленых мартышек, яванских макак и человека (Вербицкий М.Ш. и др., 1980).

Несмотря на выраженные перекрестные реакции между антигенами ПЗ человека и свиньи, они не являются полностью тождественными. ПЗ человека содержит три различных антигена: один – специфичен только для ПЗ человека; другой – общий для ПЗ человека и свиньи; третий – связан с субстанциями крови (Takai I. et al., 1980). С помощью моноклональных антител было найдено два общих и несколько различных антигенов ПЗ свиней и человека (Kamado M. et al., 1983). М. Mori и соавт. (1982) отметили значительное снижение перекрестных реакций в иммунофлюоресценции после абсорбции человеческой антисыворотки к ПЗ аллогенными и свиными эритроцитами. Это объяснялось тем, что гемагглютинины сыворотки человека не реагировали с яйцеклетками свиней, но взаимодействовали с ПЗ человеческих яйцеклеток. Абсорбцию человеческой антисыворотки к ПЗ эритроцитами свиней рекомендовали как обязательное условие выявления антител к ПЗ в этой системе. Davies. M и соавт. (1982) нашли, что степень абсорбций неодинакова при использовании разных свиных эритроцитов, что указывает на наличие определенных аллоспецифических детерминант в ПЗ.

Антисыворотки к ПЗ человека могут быть загрязнены антителами к микробам.

При иммунизации свиными яйцеклетками могут быть получены антисыворотки, дающие выраженные реакции против свиных эритроцитов и почти не взаимодействующие с яйцеклетками человека (Sacco A., Moghissi K., 1979). Моноклональные антитела к свиной ПЗ, продуцируемые гибридомами, принадлежали к классам иммуноглобулинов и IgM и IgG2, и соответствующие антитела к ПЗ человека содержались только в фракции IgG (Isojima S. et al., 1983). Из сказанного следует, что оптимальным условием для обнаружения антигенов ПЗ человека является использование в иммунологических тестах человеческих яйцеклеток.

Очевидно, что на поверхности ПЗ существуют рецепторы к спермиям, обладающие видовой специфичностью. Экспозиция спермиев в растворимой фракции ПЗ снижает их способность прикрепляться к ПЗ и оплодотворять яйцеклетки (Gwatkin R., Williams D., 1977; Isojima S. et al., 1983). Спермии человека не прикрепляются к яйцеклеткам свиньи (Trounson A. et al., 1980), коровы (Gwatkin R., 1979) или человекообразных обезьян (Bedford M., 1977).

Эти высокоавидные рецепторы имеют белково-углеводную природу, их дальнейшее изучение важно для конструирования антифертильных вакцин.

1.8. Пути повышения резистентности животных Для нормального функционирования всех звеньев системы иммунитета и механизмов их регуляции, необходимы полноценное сбалансированное питание; соблюдение зоогигиенических условий содержания животных;

достаточная двигательная активность; закаливание; рациональный режим дня.

От качества питания и особенно от содержания в пище достаточного количества незаменимых аминокислот, полиненасыщенных жирных кислот, минеральных веществ, витаминов, ее калорийности, зависит величина иммунного ответа на инфекцию и другие генетически чужеродные агенты.

Пластические и энергетические компоненты пищи необходимы для обеспечения процессов пролиферации, дифференцировки клеток иммунной системы, синтеза антител, рецепторов иммуноактивных веществ, участвующих в иммунном ответе.

При несоблюдении правил гигиены у животных возможно за счет выделения потовых и сальных желез и скопления грязи создания условий для развития микроорганизмов, процессов гниения, расчесов кожи с нарушением механических и химических факторов защиты и открытием так называемых «ворот для инфекции».

В связи с тем, что иммунологические нарушения развиваются одновременно с нарушениями клеточного метаболизма и возникновением ряда патофизиологических процессов, которые нормализуются под влиянием неспецифических иммунокорректоров, в последние годы для уменьшения или устранения иммунологических расстройств все более широко используются препараты общего действия.

В качестве мишени неспецифических иммуномодуляторов могут быть стволовые клетки, В- и Т-клетки, клетки иммунологической памяти, иммуноглобулины различных классов. Некоторые препараты – нуклеинат натрия, тимусные производные (тималин, Т-активин), липополисахариды, миелопид (В-активин), риботан, левамизол (декарис), интерфероны, полиэлектролиты, могут влиять на все основные звенья иммунологической реактивности (специфические и неспецифические факторы).

Среди иммунокорректоров имеются стимуляторы антиинфекционной и антитоксической резистентности. В частности, интерферонстимулирующей активностью обладают витамины А, В, С, дибазол, левамизол, метилурацил, миелопид, нуклеинат натрия, тимусные препараты, риботан и др. Функцию натуральных киллеров и К-клеток активируют ацикловир, интерфероны, левамизол, нуклеинат натрия, полиэлектролиты, тимусные препараты и др. В наибольшей степени подвергаются стимуляции препаратами общего действия клетки с расстроенным метаболизмом.

Тесная взаимосвязь нервной, эндокринной и иммунной систем регуляции обусловливает иммуномодулирующее действие на различные звенья иммунной системы факторов и препаратов, повышающих общий тонус центральной нервной системы и регуляторную функцию эндокринных желез (достаточная двигательная активность, рациональный режим дня, закаливания; ультрафиолетовая, электромагнитное, лазерное излучения – в определенных дозах; препараты женьшеня, элеутерококка, лимонника, заманихи, расторопши, аралии, пантокрина и др.).

Эндокринная система является важнейшей системой регуляции иммунологического гомеостаза. Сами гормоны не могут индуцировать иммунный ответ, но могут его усилить или ослабить. Стимулирующее влияние на активность лимфоидных клеток в физиологических условиях оказывают гормоны щитовидной и поджелудочной желез, эпифиз;

тормозящее – гормоны надпочечников и половых желез.

животных. Различают иммунизацию активную – путем введения в организм вакцины или анатоксина, пассивную – при которой вводят иммунную сыворотку (серопрофилактика) или иммуноглобулины, а также пассивноактивную – когда вначале вводят иммунную сыворотку, а затем вакцину или анатоксин. Вакцинопрофилактика по сравнению с серопрофилактикой обеспечивает защиту на более длительный срок. Иммунизация сывороткой проводится в первую очередь животным, которым раньше не вводились вакцины в связи с наличием противопоказаний, а также больным, находящимся в тяжелом состоянии. (201,210,219,227).

антитоксические иммуноглобулины и сыворотки (противостолбнячную, противоботулиническую, противодифтерийную и др.), противомикробные сыворотки и иммуноглобулины (противогриппозный, противокоревой, антистафилококковый и др.), фаготерапию (стафилококковая инфекция, сальмонеллез).

Животных, общавшихся с больными инфекционной болезнью в эпизоотическом очаге, рассматривают как уже заразившихся и, следовательно, находящихся в инкубационном периоде болезни. Поэтому практически не разграничивается профилактическое и лечебное действие иммунных сывороток, которые, в связи с этим, называют лечебнопрофилактическими. (186,191,204,220,233).

В последние годы появились работы о возможности профилактики иммунодефицитов у новорожденных путем введения иммуномодуляторов беременным животным. Так, например, показана возможность предупреждения снижения иммунного статуса новорожденных телят, полученных от высокопродуктивных коров при промышленных способах содержания, путем инъекции беременным коровам за 1,5-2 месяца до родов Т- и В-активинов (В.Н. Денисенко, Е.С. Воронин, Г.Н. Печников, О.О.

Смоленская-Суворова, 1992), которые, по мнению авторов, проникают через плацентарный барьер коров и непосредственно воздействуют на лимфоидную ткань плода. В наших исследованиях (Т.А. Зудова, А.А. Зудов, А.М. Петров, М.М. Серых, 1999,2000) в условиях крупного свиноводческого хозяйства введение свиноматкам в конце беременности иммуномодулятора риботана и препарата полифага (комплекса бактериофагов против пастерелл, сальмонелл, кишечной палочки, стрептококков, стафилококков, клебсиел и протея), каждого в отдельности и в сочетании друг с другом, привело к повышению в крови новорожденных поросят количества лейкоцитов и лимфоцитов, показателей фагоцитарной активности, а также лизоцимной (по отношению к лизирующему микрококку) и бактерицидной (по отношению к кишечной палочке 0-20) активности сыворотки крови, особенно при совместном применении риботана и полифага. Эти более высокие показатели естественной резистентности у поросят опытных групп, по сравнению с контрольными, сохранялись до 15 дня жизни, а при введении риботана с полифагом также и опытным поросятам более ысокие показатели естественной резистентности у них имели место более продолжительное время.

Имеется сообщение (Р.М. Хаитов. «Здоровье», №1, 200, с. 40-45) о синтезе в Институте иммунологии РАМН уникального полимерного иммуномодулятора – полиоксидония и создании на его основе вакцин нового поколения. В частности, в Институте иммунологии создан препарат гриппол, в котором белки-антигены всех вариантов вируса гриппа соединены в одну молекулу с иммуномодулятором полиоксидонием. Гриппол вызывает мощный иммунный ответ организма на вирус гриппа. С использованием полиоксидония создана также вакцина против брюшного тифа, ведутся работы по созданию новых вакцин против туберкулеза, бруцеллеза, гепатита В и С, ряда других инфекции.

резистентности животных против эндо- и экзогенных чужеродных агентов являются полноценное питание, соблюдение правил гигиены, достаточная иммуномодуляторов и факторов, а также специфической активной и пассивной иммунизации.

осторожного использования иммуномодуляторов, особенно гормональных препаратов, для коррекции иммунного статуса организма, так как недостаточны и требуют дальнейших наблюдений и поисков более безопасных и эффективных методов иммунокоррекции. В частности, ведутся работы по созданию новых иммуномодуляторов-иммуностимуляторов и иммунодепрессантов, в том числе моноклональных антител против адгезивных молекул, отдельных цитокинов и их рецепторов. Цитокины и их антагонисты рассматриваются и как точки приложения, и как возможные источники новых препаратов для иммунокоррекции. Представляются перспективными работы по ингибированию экспрессии генов (цитокиновых и их рецепторов), интегрированию в геном регуляторных генов. Но при этом, по мнению ряда исследователей, остается в силе главная заповедь целесообразным завершить данный раздел. (2,11,16,31,33,40,123,137,140).

Исследования проводили в период с 2007 – 2011 гг., на кафедре акушерства, гинекологии и биотехники репродукции животных ФГОУ ВПО МГАВМиБ и в учебно – опытном хозяйстве «Бессоново» Воскресенского района Московской области.

Для экспериментальных исследований были подобраны три группы черно – пестрых коров в возрасте 4 – 5 лет.

1-я контрольная группа. Здоровые коровы – 10 голов с нормальной плодовитостью.

2-я опытная группа. Здоровые коровы – 10 голов, которые были бесплодными (яловыми) в течение 1,5 – 2-х лет.

3-я опытная группа. 10 голов коров, которые были бесплодными (яловыми) в течение 1,5 – 2-х лет. Животным данной группы трехкратно вводили иммуномодулятор миелопид (В-активин) в дозе по 8 мг сухого вещества на кг живой массы коров, разведенного в 5 мл физиологического раствора. Препарат вводили подкожно в область шеи на 5, 10, 15 сутки.

Коров контрольной и опытных групп осеменяли искусственно спермой быков производителей, закрепленных индивидуально за каждой коровой.

Для осеменения коров, оплодотворение которых не наступало после многократных осеменений, дополнительно использовали сперму заменяющих быков.

Половую охоту у коров выявляли по рефлексу неподвижности в стойловый период на прогулке, а летом – на пастбище. Осеменяли коров ректо-цервикальным способом в первую половую охоту после родов с нормальными признаками течки и охоты без патологии половых органов.

Сперму для искусственного осеменения коров всех трех групп получали из центральной станции искусственного осеменения животных (п. Быково Подольского района Московской области).

Кровь для исследований у подопытных животных брали из яремной вены утром до их кормления.

Влагалищную слизь для исследования брали с помощью ложки Панкова.

При анализе репродуктивной функции коров использовали данные первичной документации, учитывали продолжительность сервис – периода, продолжительность периода бесплодия (сут.), индекс осеменения.

Стельность у коров определяли через два месяца после плодотворного осеменения методом ректального исследования.

Определение количества Т- и В-лимфоцитов в периферической крови проводили по методу И.М. Карпуть, Л.М. Пивовар, И.З. Севрюк и др., 1992, в описании Е.С. Воронина, А.М. Петрова, М.М. Серых, Д.А., Девришов, 2002.

Определение субпопуляций лимфоцитов производили электронно – автоматическим методом с использованием французского аппарата «Культер» (Gen-S), способного производить дифференциальный подсчет лейкоцитов, включая Т-хэлперы и Т-супрессоры на основе VCS-технологии (изменение объема, радиочастотных параметров и лазерного светорассеивания).

Фагоцитарную активность нейтрофилов крови определяли по методу В.М. Бермана, Е.М. Славской, 1958, с использованием взвеси суточной культуры Е. coli шт. О. 20.

Количественное определение иммуноглобулинов G и M классов в сыворотке крови коров проводили методом радиальной иммунодиффузии по методу Манчини, 1965., в описании Ю.Н. Федорова, 1985.

Определение уровня иммуноглобулинов в маточной слизи и крови коров проводили по Г.Г. Козлову и Б.К. Акназарову, 1989.

Определение экономического ущерба от бесплодия коров проводили по методике И.Н. Никитина, 1997 и Е.В. Ильинского, М.В. Назарова и др., в описании В.И. Трухачева, В.Я. Никитина и др., 2008.

При этом определяли количество недополученных телят и молока, определяли их стоимость и экономическую эффективность использования миелопида.

При обработке цифрового материала определяли среднюю величину каждого показателя, ошибку средней величины и достоверность различий средних величин. Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием компьютерной программы «Microsoft Excel 2000, Statistica 6.0». Критерий достоверности определяли с помощью таблицы t – распределения по Стъюденту с учетом рекомендации Г.Ф. Лакина (1990) и В.А. Середина (2001).

В качестве показателей иммунитета исследуют в цельной крови общее количество лейкоцитов, в том числе лимфоцитов. Идентифицируют среди них Т- и В-лимфоциты, а в сыворотке крови определяют содержание иммуноглобулинов различных классов.

Кровь для исследования берут у крупного рогатого скота из яремной вены. Для получения цельной крови предварительно в пробирки вносят антикоагулянт — 100—200 ед. гепарина на10 мл крови.

Для получения сыворотки пробирки с кровью помещают в термостат (37 °С) на 30 мин, после чего сгусток отделяют с помощью спицы из нержавеющей стали. После этого пробирки с сывороткой крови устанавливают в штатив и помещают в холодильник (4 С) на 6-8 ч. В дальнейшем сыворотку переливают в пенициллиновые флаконы, закрывают пробками, хранят при температуре —20...—40 С до ее использования.

Визуальный метод подсчета лейкоцитов и определения Количество лейкоцитов подсчитывают в камере Горяева. Для этого в пробирку вносят 0,4 мл (0,38 мл) разводящей жидкости и 0,02 мл исследуемой крови. Получают разведение 1:20. В качестве разводящей жидкости используют 3%-ный раствор уксусной кислоты, подкрашенный метиленовым синим (уксусная кислота лизирует эритроциты, метиленовый синий окрашивает ядра лейкоцитов).

Перед заполнением камеры Горяева пробирку с разведенной кровью тщательно встряхивают. Чистое сухое покровное стекло притирают к камере до появления радужных колец. Каплю крови наносят к краю шлифовального стекла камеры. Поскольку лейкоцитов гораздо меньше, чем эритроцитов, и на большой квадрат их приходится 1—2, то для точности подсчет производится в 100 больших квадратах (1600 малых).

Расчет производят по формуле где Х – количество лейкоцитов в 1 мкл крови;

А – количество лейкоцитов, подсчитанных в 100 больших квадратах;

4000 – множитель, приводящий результат к объему 1 мкл крови, так как объем одного малого квадрата составляет 1/4000 мкл;

20 – разведение крови;

1600 – количество малых квадратов.

П мер. В 100 больших квадратах (1600 малых) подсчитали лейкоцитов. Помня о том, что объем одного малого квадрата равен 1/ мм 3, а кровь разведена в 20 раз, подсчитывают количество лейкоцитов в мкл крови:

Практически (при условии соблюдения указанных правил разведения и подсчета) для получения действительного содержания лейкоцитов в 1 мкл достаточно полученную при подсчете сумму разделить пополам и умножить на 100.

подсчета форменных элементов белой крови на мазках. Мазки готовят температуре их по краю подписывают мягким простым карандашом и фиксируют 5 мин в метаноле или 20 мин в этаноле. Мазки окрашивают в течение 20-40 мин свежеприготовленным раствором красителя по Романовскому – Гимзе (2 – 3 капли основного раствора красителя на 1 мл воды), затем их промывают водой, сушат и исследуют под микроскопом масляная или глицериновая иммерсия, объектив Х90 окуляр Х7—10.

Дифференциацию клеток проводят сопоставляя форму, размер и окраску клеток с рисунками форменных элементов крови животных, приведенных в специальных цветных таблицах. Подсчитывают 100- клеток и определяют относительное содержание каждого типа клеток в процентах. Затем рассчитывают абсолютное содержание лимфоцитов крови по формуле:

где А – абсолютное количество лимфоцитов в крови, тыс/мкл;

О – относительное количество лимфоцитов, определенное по формуле, %;

X- количество лейкоцитов в крови, тыс/мкл.

Электронно-автоматический метод подсчета лейкоцитов и В последние годы разработаны и широко используются автоматические приборы для подсчета лейкоцитов и эритроцитов. В основе большинства из них лежит импульсивный принцип работы, основанный на разнице в электропроводимости частиц крови и используемый для разбавления жидкости. На этом принципе работают применяемые в России счетчики «Целлоскоп» (Швеция) и «Культер» ( Франция).

Кровяные тельца, взвешенные в физиологическом растворе, всасываются через микроотверстие (капиллярную апертуру) диаметром 100 мкм, с обеих сторон которой имеется по одному платиновому электроду. Скачкообразное повышение сопротивления, возникающие при прохождении частиц крови через капилляр, вызывает электрический импульс, амплитуда которого прямо подсчитываются в электронном устройстве и могут быть измерены.

Продолжительность аппаратов этого типа велика: весь процесс работы от введения образца крови до получения результата длится не более 20 с при ошибке ± 1-2%. Эти приборы постоянно совершенствуются, повышаются скорость и точность подсчета, воспроизводимость, упрощается использование. Счетчики можно применять отдельно или в комлекте с гемоглобинометром и электронным оборудованием, позволяющим одновлеменно с подсчетом кровяных клеток измерить объем одной клетки (эритроцита), гематокрит и некоторые другие показатели («Культер» модели ЗФ и S, «Целлоскоп-412»).

Для подсчета эритроцитов описанными счетчиками готовят большие разведения крови в физиологическом растворе (1:80000; 1:50000).

Точность разведения обеспечивается благодаря применению автоматических дозирующих аппаратов - дилюторов.

Другой принцип подсчета – сцинтилляционный фотографический, который заключается в том, что узкий пучок света проходит через стеклянную кювету и далее на оптическую систему, перед которой стоит непроницаемый экран.

Если через кювету проходит жидкость без частиц, то поток света задерживается экраном. Если в потоке жидкости попадаются частицы, то свет, отражаясь от них, рассеивается и огибает экран. Оптическая система фокусирует этот рассеянный свет, он проходит через диафрагму и фиксируется фотоэлементом. На таком принципе работает автоанализатор «Техникон» (Ирландия).

Подсчет лейкоцитов в современных счетчиках частиц производят по тому же принципу, что и эритроцитов. Предварительно кровь разводят и автоанализаторе «Техникон» в этом качестве используют раствор уксусной кислоты (разбавление происходит автоматически в соответствующем канале), в аппаратах «Культер» и «Целлюскоп»- сапонин или сапоглобин, который добавляют к разведенной (1:500, 1:700) в физиологическом растворе крови из расчета 6 капель на 20 мл разведения.

С каждым годом в новых анализаторах возрастает количество исследуемых параметров, сокращается время исследование проб крови.

Так, современный автоанализатор «Техникон Н-3» позволяет производить подсчет всех основных гемотологических параметров ( 25 показателей), дает возможность вывода лейкоцитарной формулы. Подсчет соотношения и «Техникон Н-3» составляет 100 анализов в 1 ч.

дифференциальный подсчет лейкоцитов на основе VCS-технологии светорассеивания), что исключает химическую обработку клеток, кроме лизиса эритроцитов.

Автоанализатор «Культер» (Gen-S) одновременно определяет до параметров крови, включая Т- хелперы и Т-супроссоры (СД4/СД8). Аппарат «Cobal Vega» (Швейцария) имеет возможность определять до гемотологических показателей, а если его обеспечить дополнительным блоком – до 36, включая и степень зрелости различных клеток.

метод проточной цитометрии.

Этот метод используется для анализа различных популяций клеток. Он оказался очень ценным при изучении лейкозов, аутоиммунных заболеваний и иммунодефицитных заболеваний. Технологически этот метод напоминает усложненный микроскоп, имеющий возможность быстрого количественного анализа множества свойств одиночных клеток, суспендированных в жидкой среде. В процессе исследования клетки проходят через специальную камеру, пересекая пучок света высокой интенсивности, со скоростью несколько тысяч в секунду. Каждая клетка, проходя через луч света, испускает рассеянные и флюоресцентные световые сигналы. Эти сигналы регистрируются при помощи светочувствительных датчиков (фотоэлектронные умножители и фотодиоды), усиливаются и при помощи аналогово-цифровых преобразователей переводятся в цифровые значения.

Для переработки и хранения информации используются компьютеры.

Высоко оценивая электронно-автоматические методы подсчета форменных элементов крови, включая систему компьютерного анализа клеточного изображения с классификацией клеток путем создания модели распознавания, тем не менее следует отменить, что пока еще нет такого прибора, который бы смог так точно произвести подсчет и оценку клеток крови, как это делает опытный морфолог визуально.

Определение Т-лимфоцитов методом спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана (E-POK) Принцип метода: Тимусзависимые Т-лимфоциты имеют рецепторы для эритроцитов барана, которые выступают, таким образом, специфическим маркером для их распознавания (E-POK: erythrocyte-розеткообразующие клетки).

Оборудование и аппаратура: центрифуга ЦЛК-1; холодильник бытовой;

термостат; микроскоп люминесцентный (МЛ-2 или другие типы); камера Горяева; счетчик клеток; автоматические пипетки или микропипетки;

пробирки силконированные или пластиковые; штатив для пробирок.

Реактивы: среда 199, раствор Хенкса, гепарин (готовят раствор из расчета акридинового оранжевого; 0,1% раствор эозина; 0,1% раствор трипанового синего на дистиллированной воде; гипак (изопак, верографин, уротраст);

фиколл-400 (полисахарид с молекулярной массой 400000 Д); эритроциты барана.

Ход определения. Вносят 10 мл крови в пластиковую пробирку с раствором гепарина (256 ЕД/мл) и осторожно перемешивают. Гепаринизированную кровь разводят фосфатным буфером (рН 7,4) в соотношении 1 : 2. 9 мл смеси осторожно наслаивают на раствор фиколл-гипак плотностью 1,077 г/мл ( частей 9% фиколла и 5 частей 33,9%-ного гипака плотностью 1,077 г/мл).

Пробирки центрифугируют 40 минут при 1500 об/мин.

В связи с тем, что могут использоваться разные системы центрифуг, необходимо применять такие режимы центрифугирования, чтобы сила разделения в интерфазе составила 400g. Значение центробежного ускорения G вычисляют по формуле:

Где n – число оборотов в мин; R – радиус от центра оси центрифуги до границы соприкосновения смеси фиколл-гипака с разделяемой суспензией, см.

После центрифугирования слой лимфоцитов осторожно пипеткой извлекают из интерфазы и дважды отмывают буферным раствором.

Концентрацию клеток доводят до 2 – 4 млн в 1 мл в среде 199*, содержащей 10%-ный раствор телячьей сыворотки.

жизнеспособность. Равные объемы 0,1%-ного раствора водного эозина на среде Хенкса или Рингера двойной концентрации без глюкозы и 0,1%-ного раствора трипанового синего на дистиллированной воде смешивают перед употреблением. 1 – 2 капли этой смеси добавляют к капле суспензии клеток и часть смеси переносят в камеру Горяева. Окрашенные (мертвые) клетки просчитывают на 100 клеток в поле зрения. При правильной обработке процент мертвых клеток не превышает 3.

Приготовление эритроцитов барана. Используют эритроциты одного животного или смесь, полученную от нескольких. Эритроциты можно хранить в течение 2 недели при 4 С в растворе Олсвера (глюкоза – 2,05, цитрат натрия – 0,8, хлорид натрия – 0,42 г, дистиллированная вода – мл), рН этого раствора устанавливают равным 6,1 с помощью 10%-ного раствора лимонной кислоты. Перед употреблением эритроциты барана 3 – раза отмывают фосфатным буфером и готовят 0,5%-ную (по объему) взвесь клеток.

Подготовка и учет реакции розеткообразрвания. Реакцию проводят по методу, описанному Jondal и соавт. В 1972. В пластиковые пробирки (от 2 до 5) вносят 0,1 мл взвеси лимфоцитов и добавляют равный объем 0,5%-ной взвеси эритроцитов барана. Соотношение эритроциты: лимфоциты не должно превышать 50 : 1. Инкубируют смесь в термостате 37 С в течение 10 мин. Затем пробы центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин (для ЦЛК-1) и оставляют на ночь в холодильнике при температуре 4 С.

Подсчет клеток мы рекомендуем проводить в камере Горяева.

Существующий метод фиксации суспензии глютаровым альдегидом с последующим приготовлением мазков и просчетом розеток в окрашенных препаратах позволяет накапливать стекла и анализировать результаты реакции в другой, свободный от постановки или менее загруженный день.

Приготовление мазков для подсчета Т-лим оцитов. Предметные стекла необходимо пронумеровать на каждое исследуемое животное. Из приготовленной суспензии на предметном стекле делают мазки ( размазанные капли). Высушивают мазки на воздухе. Фиксируют на мостике метанолом в течение 7 – 10 мин, промывают дистиллированной водой, высушивают и окрашивают краской Романовского-Гимзы, через 30 мин промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой, укладывают в полиэтиленовый пакет и переносят в холодильник.

Краску Романовского-Гимзы готовят таким образом: к 10 мл фабричного раствора краски Романовского-Гимзы добавляют 90 мл дистиллированной воды нейтральной реакции. Краску готовят перед употреблением. Время окрашивания 10 мин.

Учет реакции проводят путем подсчета 100 (200) лимфоцитов под иммерсией микроскопа. Клетки, присоединившие 3 эритроцита барана и более, считают розеткообразующими лимфоцитами, остальные – нерозеткообразующими.

Абсолютное количество Т-лимфоцитов можно рассчитать, зная количество лейкоцитов в 1 л крови (а), процент лимфоцитов в крови (б) и процент розеткообразующих Т-лимфоцитов (в) по формуле абв/10000.

апример: в крови теленка содержание лейкоцитов составляет 8,7 10 9 /л, в лейкограмме процент лимфоцитов – 70; процент розеткообразующих Тлимфоцитов – 52, значит, абсолютное содержание Т-лимфоцитов у животных будет равно 3,1668 10 9 /л или 3,2 10 9 /л.

Для подсчета клеток в камере Горяева осадок клеток в извлеченных из холодильника пробирках осторожно ресуспендируют пастеровской пипеткой (несколько раз медленно набирают и выпускают клеточную взвесь) и добавляют 0,02 мл 0,01%-ного раствора в фосфатном буфере акридинового оранжевого. Этот краситель дает ярко-зеленую люминесценцию при возбуждении ультрафиолетом. Через 2 – 3 мин заполняют камеру Горяева и люминесцентном микроскопе. Это значительно облегчает и ускоряет процедуру подсчета ярко светящихся лимфоцитов, окруженных розоватыми эритроцитами.

Определение активных Т-лимфоцитов, образующих розетки с эритройитами барана (ЕА-РОК) выполняют так, как это описано для Е-РОК, за исключением сыворотки, которую при определении ЕА-РОК не добавляют в инкубационную среду, и длительной холодовой инкубации. После термостатирования 10 мин при 37 С и последующего центрифугирования при 1000 об/мин (для ЦЛК-1) в течение 5 мин проводят подсчет Т-активных лимфоцитов, способом, описанным выше для общих Т-клеток.

субпопуляций важное значение необходимо придавать хелперносупрессорному отношению. Определение соотношения лимфоцитов с хелперной и супрессорной функциями проводят в теофиллиновом тесте.

Принцип метода состоит в том, что в присутствии теофиллина Т-лимфоциты с супрессорной функцией теряют способность к Е-розеткообразованию.

Определение теофиллинчувствительности Т-клеток Принцип метода. Препараты, повышающие уровень внутриклеточного цАМФ (теофиллин, аденозин), ингибируют реакцию спонтанного розеткообразования между зрелыми Т-лимфоцитами и эритроцитами барана.

Ход определения. Используемые реактивы и оборудование аналогичны для описанного выше метода определения Т-активных лимфоцитов.

Исключение составляет теофиллин (химически чистое соединение), 0,3 М раствор которого на дистиллированной воде, подогретой до 60 С, готовят температуры теофиллин добавляют в инкубационную среду (без добавление сыворотки), термостатируют, центрифугируют и просчитывают клетки так теофиллинчувствительные Т-клетки, т.е. лимфоциты, утратившие способность к розеткообразованию под влиянием обработки теофиллином, и теофиллинустойчивые Т-клетки.

Определение В-клеток методом розеткообразования с Принцип метода. Тимуснезависимые В-лимфоциты имеют на своей мембране специфические детерминанты, позволяющие дифференцировать их от Т-лимфоцитов. Таким детерминантом является поверхностный (мембранный) иммуноглобулин класса М. Число лимфоцитов, несущих иммуноглобулины А, G, E или D, крайне незначительно ( A и G – 1 – 5%, D и E – 2 – 4%).

Чаще применяется метод выявления B- клеток по их способности образовывать розетки с эритроцитами барана, нагруженными антителами в среде комплемента. Такие эритроциты маркируют и Fc-, и C3-рецепторы Влимфоцитов.

Оборудование и реактивы те же, что и для метода определения Т-лимфоцитов.

Аналогично готовят и суспензию лимфоцитов.

Антисыворотку, содержащую антитела к эритроцитам, готовят путем иммунизации кролика эритроцитами барана или быка. Кролику в краевую вену уха вводят 3-5 мл 50%-ной суспензии эритроцитов. На 4 – 6-й день у него берут кровь и получают сыворотку, которая в этот период на высоте иммунного ответа преимущественно содержит антитела класса М.

Наилучший эффект бывает при работе с гамма-глобулиновой фракцией сыворотки, которую получают высаливанием в насыщенном растворе аммиака или риванола. Антисыворотку инактивируют и определяют ее гемолитический и агглютинационный титры.

Можно использовать и широко доступную гемолитическую сыворотку кролика.

Комплимент. Источником комплимента служат свежие сыворотки мыши.

Активность комплимента определяют в гемолитической системе.

Сенсибилизация эритроцитов. Смешивают равные объемы 1%-ной взвеси эритроцитов барана (предпочтительнее эритроциты быка) и антисыворотки к виду эритроцитов, используемых в реакции (или гемолитической сыворотки кролика) в субагглютинирующем разведении.

Смесь инкубируют 40 мин при 37 С, осторожно встряхивая каждые 10 мин.

После термостатирования эритроциты трижды отмывают фосфатным буфером до 10 мин при 1500 об/мин. Супернатант отбрасывают, а к осадку добавляют первоначальный объем фосфатного буфера и равный объем абсорбированной сыворотки мыши, содержащей комплимент в разведении 1:10.

Смесь помещают в термостат при 37 С на 30 мин. Вновь эритроциты трижды отмывают. При отмывании их центрифугируют осторожно при об/мин 5 мин, чтобы не вызвать агглютинации эритроцитов. Готовят 0,5%ную суспензию эритроцитов и просматривают под микроскопом. При наличии агглютинации эритроцитов суспензия не пригодна. Готовые эритроциты, нагруженные антителами и комплементом (ЕАС), можно хранить в холодильнике (4С) 4 – 5 дней.

Определение ЕАС-лимфоцитов. К 0,1 мл взвеси лимфоцитов добавляют 0,1 мл сенсибилизированных эритроцитов. Оптимальное соотношение эритроцитов к лимфоцитам равно 20 : 1. Смесь инкубируют 45 мин при 37 С, после чего пробирки помещают в лед. Подсчет В-клеток проводят описанным выше способом.

2.2.2. Определение фагоцитарной активности нейтрофилов (метод В.М.

Принцип метода. Метод основан на учете числа бактерий, захваченных нейтрофилами в процессе их совместного инкубирования в термостате.

Ход определения. В две стерильные центрифужные пробирки наливают по 0,2 мл 2%-ного раствора натрия цитрата и добавляют по 0,2 мл исследуемой крови. Пробирки с содержимым центрифугируют при скорости 1000 об/мин в течение 3—5 мин. После центрифугирования пробирки ставят на 10—15 мин в уплотнения лейкоцитарной пленки.

Пипеткой удаляют плазму и снимают лейкоцитарную пленку с небольшим количеством эритроцитов, общий объем сыворотки крови 0,1 мл. Добавляют равное количество микробной взвеси кишечной палочки в 0,85%-ном растворе натрия хлорида, содержащей по оптическому стандарту мутности 500 мл микробных тел в 1 мл. Пробирки помещают в термостат на 30 мин при 37 °С, периодически их встряхивая. Одновременно в термостат ставят для подсушивания чашки Петри с мясопептонным агаром, предварительно извлеченные из холодильника и находившиеся 14—20 мин при комнатной температуре.

Пробирки извлекают из термостата и центрифугируют 3—5 мин при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют, а к осадку добавляют тройной объем физиологического раствора, после чего пробирки вновь центрифугируют, надосадочную жидкость удаляют пастеровской пипеткой.

После встряхивания осадка его наносят в виде двух капель на поверхность подсушенного агара – по одной капле на край каждой половины чашки Петри.

Толстым стеклом с гладкими краями (можно использовать камеру Горяева), слегка подогретым, примерно до 37 °С, делают два мазка на поверхности агара, к одному из которых сразу же прикладывают слегка подогретое стекло и быстро снимают его пинцетом с агара. Чашку Петри со вторым мазком крови помещают в термостат при 37 °С на 1 ч, после чего к нему прикладывают второе, слегка подогретое предметное стекло.

Стекла с отпечатанными на них мазками фиксируют и сначала окрашивают течение 4 мин краской Май-Грюнвальда, а затем после смывания краски водой докрашивают в течение 55 мин краской Романовского—Гимзы (на 10 мл воды обычно вносят 15 капель краски).

Мазки промывают водопроводной водой и высушивают на воздухе. Под микроскопом в обоих мазках определяют: процент фагоцитоза — количество фагоцитирующих нейтрофилов при подсчете 100 клеток; фагоцитарное число — среднее число микроорганизмов, фагоцитированных одним нейтрофилом.

Отдельно подсчитывают поглощенные живые (синие) и мертвые бактерии, находящиеся в стадии переваривания (фиолетовые, розовые, нередко разбухшие). Разница между процентом клеток, содержащих переваренные микроорганизмы, во втором и первом мазках составляет индекс переваривания. Подсчитывают микробную емкость крови путем умножения числа нейтрофилов, содержащихся в 1 мм крови, на фагоцитарное число, а также переваривающую способность крови, умножением этого же количества нейтрофилов на среднее число переваренных одним нейтрофилом бактерии.

Процент фагоцитоза, фагоцитарное число, фагоцитарная (микробная) емкость, индекс переваривания и переваривающая способность крови достаточно полно характеризуют фагоцитарную реакцию нейтрофилов крови.

2.3. Определение уровня иммуноглобулинов в маточной слизи коров (по Г.Г. Козлову и Б.К. Акназарову, 1989) Количественная оценка уровня иммуноглобулинов маточной слизи имеет определенное прогностическое значение, позволяет понять патогенез воспалительных заболеваний матки и характер иммунобиологической перестройки ее и организма коров целом на воздействие антигенных факторов (бактерии, вирусы и др. генетически чужеродные агенты).

За основу определения уровня иммуноглобулинов маточной слизи у коров принят метод радиальной иммунодиффузии по Манчини с соавторами (1965). Сущность метода состоит в том, что иммуноглобулины испытуемых моноспецифическая антисыворотка, образуя кольцо преципитации, деаметр которого прямопропорционален концентрации иммуноглобулина, содержащегося в испытуемой пробе.

Необходимые оборудование и реактивы. Стеклянные пластинки 9х см. П-образная рамка толщиной 1 мм, зажимы, микрошприц, трафарет для пробивания лунок, пробойник, чертежный измеритель, водяная баня, влажная камера (эксикатор), полулогарифмическая бумага, агар Дифко, веронал-мединаловый буфер с рН-8,6 (5,52 г веронала, 35,04 г мединала, дистиллированная вода – до 1 л), моноспецифические антисыворотки к отдельным классам иммуноглобулинов с известным рабочим разведением, стандартная сыворотка с известным содержанием иммуноглобулинов, 0,1%ный раствор амидо-черного (1 г амидо-черного, 100 мл ледяной уксусной кислоты, дистиллированной воды до 1 л. Через 12 ч краску профильтровать через бумажный фильтр) ; 2%-ный раствор уксусной кислоты для отмывания краски.

воспалительный экссудат матки. Их получают путем массажа матки и ее шейки при ректальном исследовании, а также рукой в стерильной полиэтиленовой перчатке из устья шейки матки в стерильные пробирки, пластмассовые емкости из под экзутера или стеклянные флаконы из под антибиотиков. При достаточных объеме и густоте полученные пробы маточного секрета гомогенизируют гомогенизатором типа 302 (ПНР) (можно использовать миксер) до получения жидкого гомогената. Полученный гомогенат разливают в пластмассовые пробирки с пробкой объемом 1 мл в нужных экземплярах и хранят при температуре 18 – 20 С. При исследовании иммуноглобулинов (G, M, A) приготовленный гомогенат используют неразведенным. В случаях плохой гемогенизации или невозможности гомогенизировать из-за малого объема полученные пробы маточного секрета перед постановкой РИД разбавляют стерильным 0,9%-ным раствором хлорида натрия или мединаловым буфером (рН=8,6) с расчетом 1:2 – 1:4.

Методика определения. Предварительно готовят пластинки из 3%ного агара, смешанного с антисывороткой. С этой целью используют 3%-ный агар «Дифко», приготовленный на мединаловом буфере, и антисыворотку с известным рабочим разведением. Для приготовления смеси антисыворотку, подогретую до температуры 55 С, тщательно смешивают с равным объемом (по 5 мл каждого реагента) расплавленного агара, охлажденного до температуры 55 С в бактериологических пробирках с отогнутыми краями, не допуская образования пузырей.

Для получения слоя агара с антисывороткой одинаковой толщины используют две фотопластинки размером 9х12 см, отмытые от эмульсии и обезжиренные. Между этими пластинками устанавливают П-образную рамку толщиной 1 мм с небольшим зазором между ними для более удобного заполнения смесью. Всю систему скрепляют зажимами.

Поддерживая рамку со стеклами в слегка наклонном состоянии, осторожно заливают смесь в пространство, образованное между двумя стеклами, избегая образования пузырей. Заполненную форму оставляют в вертикальном положении на 15 – 20 мин при комнатной температуре. После застывания смеси снимают зажимы и удаляют одну из пластинок скользящим движением по поверхности рамки. Затем в агаровом слое пробойником вырезают лунки диаметром 2 мм по трафарету на расстоянии 15 мм от друга.

разведения стандартной сыворотки по 1 мкл, а в остальные – исследуемые пробы маточной слизи. Пластинку в строго горизонтальном положении помещают во влажную камеру (эксикатор) и инкубируют в течение 24 ч (для IgG и IgA) или 48 ч (IgM). Учет результатов проводят в строго указанный срок.

Расчет результатов. При положительном результате реакции вокруг лунок появляются зоны преципитации в форме концентрических окружностей. По истечении указанного времени измеряют диаметры образовавшихся колец преципитации. Затем строят калибровочную кривую с использованием полулогарифмической бумаги, откладывая по линии абсцисс диаметры колец преципитации различных разведений стандартной сыворотки, а по линии ординат – концентрацию иммуноглобулинов, выраженную в мг/мл. Калибровочную кривую строят для каждой пластинки и каждого класса иммуноглобулинов отдельно; полученные точки должны располагаться на прямой линии, т.е. иметь линейную зависимость.

Количество иммуноглобулина в испытуемой пробе определяют путем сравнения диаметра кольца преципитата вокруг ее лунки с калибровочной кривой. При определении концентрации иммуноглобулинов в разведенных пробах найденные значения умножат на степень разведения исследуемых проб.

Измерять преципитационные кольца удобнее линейкой типа БерингВерке после окрашивания агаровых пластин. Стекла с агаром погружают на двое суток в буфер или физиологический раствор. В течение этого срока буфер или физиологический раствор трижды заменяют новой порцией. После отмывания от не участвующих в реакции веществ пластинки агара высушивают при комнатной температуре под фильтрованной бумагой.

Удалив последнюю, пластинки помещают в раствор амидо-черного на мин. Избыток краски отмывают раствором уксусной кислоты до тех пор, пока раствор не станет прозрачным.

2.4. Определение фагоцитарной активности нейтрофилов в маточной слизи коров (по Г.Г. Козлову и Б.К. Акназарову, 1989) неспецифический иммунный фактор местной защиты, как первая реакция организма на генетически чужеродные тела. Обнаружены также межвидовые различия фагоцитоза. Так, например, у кобыл лейкоциты скапливаются в строме матки, у свиней – в маточной жидкости, а у коров – в строме и маточной жидкости в равной мере (T. Frank et al., 1983).

Vandeplasche et al. (1979), известно, что нейтрофилы в первую очередь фагоцитируют грамположительные микроорганизмы и в меньшей мере – грамотрицательные.

Метод определения фагоцитарной активности лейкоцитов маточной нейтрофилами в процессе естественного фагоцитоза в полости матки животных. При этом оценивают захватывающую способность нейтрофилам по двум показателям: фагоцитарному индексу (количество бактерий, захваченных одним нейтрофилом) и проценту фагоцитоза (отношение нейтрофилов, участвующих в фагоцитозе, к общему числу подсчитанных).

маточной слизи коров состоит из следующих основных этапов: получение маточной слизи, приготовление мазков слизи и их окрашивание, подсчет числа нейтрофилов и захваченных бактерий, а также расчет полученных результатов.

При определении фагоцитарной активности нейтрофилов маточной слизи использовали метод, предложенный М.С. Покровской и М.С.

Макаровым (1942) в модификации П.А. Емельяненко (1980) для определения фагоцитарной активности лейкоцитов крови крупного рогатого скота.

биологический типа МБИ-6; обезжиренные чистые предметные стекла, градуированные, палочки стеклянные, пипетки градуированные, готовый краситель Романовского-Гимза (азур-эозиновая смесь), дистиллированная вода, абсолютный метиловый спирт (СН3ОН) (ХЧ), стерильный 0,85%-ный нейтральный раствор хлорида натрия, иммерсионное масло.

аналогичным способом, описанным в предыдущей методике. Содержимое шейки матки для приготовления мазков также собирают ватным тампоном, фиксированным корнцангом через влагалищное зеркало. Чистую пробу маточного секрета у коров можно получить с помощью универсального утеротома для биопсии и взятия маточной слизи, сконструированного нами.

Методика приготовления мазков слизи. Мазки из маточной слизи делают сразу же после ее получения. Техника приготовления мазков зависит от состояния пробы и способа ее получения. При жидкой консистенции полученной пробы мазки приготовляют путем легкого соприкосновения ее с поверхностью предметного стекла. От секрета вязкой консистенции и размазывания на предметное стекло с легким прикосновением и скользящим движением.

метиловым спиртом в течение 15 – 20 мин.

Методика окрашивания мазков и учета захватывающей способности Романовскому-Гимза (азур-эозиновая смесь). Рабочий раствор красителя ( капли красителя на 1 мл дистиллированной воды) готовят перед употреблением.

выдерживают в течение 20 – 30 мин, а затем 2 – 3 мин промывают водопроводной водой. После этого высушивают при комнатной температуре на воздухе. Окрашивать мазки можно также азур-эозином или по Поппенгейму.

Высушенные после окраски мазки просматривают под микроскопом с использованием иммерсионной системы.