Работа выполнена в лаборатории молекулярной диагностики и геномной
дактилоскопии ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт
На правах рукописи
генетики и селекции промышленных микроорганизмов» (ФГУП «ГосНИИ генетика»).
Научный руководитель:
доктор биологических наук
, профессор ФГУП «ГосНИИ генетика», г. Москва Носиков Валерий Вячеславович
Официальные оппоненты:
Доктор биологических наук, профессор
ПУШКОВ АЛЕКСАНДР АЛЕКСЕЕВИЧ
Институт молекулярной генетики РАН, г. Москва Сломинский Петр Андреевич Доктор медицинских наук,ПОЛИМОРФНЫЕ МАРКЕРЫ РЯДА ГЕНОВ СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА И
ФГУ НИИ физико-химическойГЕНЕТИЧЕСКАЯ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТЬ К НЕБЛАГОПРИЯТНОМУ
медицины ФМБА, г. Москва Явелов Игорь СеменовичТЕЧЕНИЮ ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ СЕРДЦА У БОЛЬНЫХ, ПЕРЕНЕСШИХ
ОСТРЫЙ КОРОНАРНЫЙ СИНДРОМ.
Институт молекулярной биологииВедущая организация им. В.А. Энгельгардта РАН, г.Москва 03.01.03 – молекулярная биология
АВТОРЕФЕРАТ
Защита состоится « » декабря 2011 г. в 14 часов на заседании Диссертационного диссертации на соискание ученой степени совета Д.217.013.01 при ФГУП «Государственный научно-исследовательский кандидата биологических наук институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: 117545, Москва, 1-й Дорожный проезд, д. 1.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИ генетика».
Реферат разослан « » ноября 2011 г.
Москва –
Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук Т. Л. Воюшина компонентами системы гемостаза, с неблагоприятным исходом у больных,
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
перенесших острый коронарный синдром. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
Актуальность проблемы.
Ишемическая болезнь сердца (ИБС) — полигенное, многофакторное 1. Определить аллели и генотипы полиморфных маркеров генов, кодирующих заболевание, являющееся наиболее частой причиной смерти среди мужчин старше 45 факторы свертывания крови V (F5) и VII (F7), белок С (PROC), лет и женщин старше 65 лет во многих странах Европы, в том числе и в России. тромбомодулин (THBD) и ингибитор активатора плазминогена типа Больной, перенесший обострение ИБС, попадает в группу высокого риска повторения (PLANH1).
эпизода обострения. Предотвращение этих заболеваний представляет одну из 2. Провести сравнительный анализ времени дожития до конечных точек у основных задач, как практической медицины, так и медицинской науки (Оганов и больных, перенесших острый коронарный синдром, - носителей различных соавт., 2008). генотипов полиморфных маркеров выбранных генов-кандидатов для Известно, что сердечно-сосудистые патологии – многофакторные заболевания выявления вклада генетических факторов в развитие неблагоприятных с многочисленными звеньями патогенеза. Для таких заболеваний характерен сложный исходов.
механизм формирования фенотипа, в основе которого лежит взаимодействие Научная новизна работы.
• генетических факторов с факторами внешней среды. При этом для каждого В данной работе впервые исследована ассоциация полиморфных маркеров конкретного заболевания можно выделить группу, так называемых, генов-кандидатов, Arg506Gln и G5393A гена F5, Arg353Gln гена F7, С(–2676)Т гена PROC, продукты которых могут быть прямо или косвенно вовлечены в развитие данной Ala455Val гена THBD и 4G(–675)5G гена PLANH1 с развитием острого патологии (Goldbourt et al., 1994). коронарного синдрома.
Генетическую предрасположенность к тому или иному заболеванию чаще • Обнаружена ассоциация полиморфного маркера G5393A гена F5 с всего изучают по принципу “случай-контроль”. Однако для многих исследований повышенным риском развития неблагоприятного исхода в группе женщин, этого типа достаточно сложно бывает подобрать правильную контрольную группу, перенесших острый коронарный синдром. Установлено, что носительство поскольку, во-первых, невозможно бывает выявить доклинические формы проявления генотипов GA и AA полиморфного маркера G5393A гена F5 независимо связано заболевания, а во-вторых, учитывать всех умерших к моменту начала обследования. с наступлением таких неблагоприятных исходов как нефатальный и фатальный Этих недостатков лишены так называемые проспективные исследования, в которых инфаркт миокарда (ИМ), а также нефатальный и фатальный инсульт.
осуществляется длительное наблюдение за большими группами лиц, входящих в • Обнаружена сочетанная ассоциация комбинации генотипов полиморфного группу риска, с регистрацией «конечных точек» исхода заболевания. маркера Arg353Gln гена F7 и Ala455Val гена THBD с повышенным риском Поскольку нарушения функции системы гемостаза, приводящие к развития неблагоприятного исхода в группе женщин, перенесших острый тромбообразованию, являются важным звеном в формировании патогенеза коронарный синдром.
ишемической болезни сердца (Сидоренко и соавт., 2008), гены, кодирующие белковые Практическая ценность работы. Выявление ассоциации полиморфных компоненты этой системы, можно рассматривать как гены-кандидаты, маркеров генов с развитием острого коронарного синдрома (ОКС) открывает новые ассоциированные с обострением ИБС, и эти гены совершенно необходимо включать в перспективы в выделении групп пациентов с высоким риском развития патологии.
проспективные исследования. Полученные данные об ассоциации полиморфных маркеров G5393A гена F5, Установление ассоциации гена с заболеванием и последующая оценка Arg353Gln гена F7 и Ala455Val гена THBD с повышенным риском развития индивидуального генетического риска имеют важное значение для разработки неблагоприятного исхода в группе женщин, перенесших эпизод обострения ИБС, дифференцированного подхода к профилактике и лечению данной патологии и ее позволяют внедрить генетическое тестирование больных ИБС для выделения лиц, осложнений в зависимости от наследственной предрасположенности конкретного имеющих максимальную предрасположенность к развитию неблагоприятных пациента. Подобные исследования позволяют точнее и надежнее оценивать исходов, и указывают на возможное направление разработки новых лекарственных генетический риск развития заболевания и прогнозировать его течение (Gibbons et al., средств.
2004). Апробация работы. Диссертационная работа была апробирована на заседании Секции молекулярной биологии Ученого Совета ФГУП «ГосНИИ генетика» Цель и задачи работы. Целью данной работы было изучение ассоциации октября 2011 г. Материалы работы были представлены на Х-ой ежегодной полиморфных маркеров генов-кандидатов, продукты которых являются белковыми 3 международной молодежной конференции ИБХФ РАН – ВУЗЫ «Биохимическая физика» (г. Москва, Россия, 8-10 ноября 2010 г); 79-ом съезде Европейского Таблица 1.
Атеросклеротического общества (г. Гетеборг, Швеция, 26-29 июня 2011); II-ой Характеристика группы больных, перенесших острый коронарный синдром.
международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых (г.
Донецк, Украина, 19-22 сентября 2011 г).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, включая 3 статьи, а также материалы конференций.
результаты и их обсуждение, выводы и список литературы. Материалы диссертации изложены на 127 страницах машинописного текста и содержат 8 таблиц и рисунков. В работе процитированы 185 зарубежных и 23 отечественных литературных источника.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1.1. Формирование групп больных. Характеристика и критерии включения.
В исследовании приняло участие 16 медицинских центров из семи городов России (Москва, Казань, Пермь, Челябинск, Ставрополь, Ростов-на-Дону, СанктИсследование ассоциации полиморфных маркеров ряда генов-кандидатов с Петербург), исследование проводилось с декабря 2004 г. по август 2010 г. В исследование включены больные (всего 1145 человек), поступившие в стационар в связи с развитием ОКС (Табл. 1). Больные, у которых в результате ОКС не сформировался инфаркт миокарда с зубцом Q, должны были поступить в стационар ОКС.
не позднее 72 ч от момента начала заболевания и иметь хотя бы один из следующих депрессия сегмента ST крайней мере на 1 мм в двух соседних отведениях;
• инверсия зубца Т не менее 3 мм;
• транзиторный подъем сегмента ST;
• повышение уровня кардиоспецифических ферментов в крови (сердечная Идентификацию аллелей полиморфных маркеров проводили с помощью наступает после расщепления по остатку Arg в положении 306 (на этой стадии гибридизационно-флуоресцентного анализа (TaqMan® анализ) Как было показано в ряде работ, причиной устойчивости к действию активированного нами анализ выживаемости пациентов показал, что риск развития неблагоприятного белка С может быть однонуклеотидный полиморфизм G/A в положении 1691 в гене исхода после перенесенного острого коронарного синдрома не зависит от генотипов F5 (Bertina et al., 1994). Данному полиморфному маркеру, получившему название полиморфного маркера Arg506Gln гена F5. Эти результаты можно объяснить малым “Лейденовская мутация”, соответствует аминокислотная замена ArgGln в числом пациентов, носителей аллеля Gln, и отсутствием пациентов с генотипом положении 506 полипептидной цепи. Частота данной мутации составляет от 1 до 7% в Gln/Gln. Можно предположить, что носители данного генотипа не попали в нашу европейской популяции. Около 95% пациентов с устойчивостью к действию выборку по причине наступления неблагоприятного исхода еще до начала активированного белка С – это носители “Лейденовской мутации” (Tsongalis and исследования. У тех же носителей «Лейденовской» мутации, которые были включены Rezuke, 1997), однако, согласно недавно проведенным исследованиям, в европейкой в наше исследование, развитие неблагоприятных исходов связано с другими популяции имеется достаточно большой процент людей, устойчивых к действию патофизиологическими механизмами.
активированного белка С, у которых данная мутация не выявлена (Tosetto et al., 2004).
Накоплено большое количество данных по ассоциации “Лейденовской мутации” с венозными тромбозами (Tans et al., 2003). Однако работ, посвященных ассоциации данного полиморфного маркера с развитием артериальных тромбозов и других сердечно-сосудистых патологий, имеется значительно меньшее количество, а их результаты носят противоречивый характер (Ridker et al., 1995; Mannucci et al., 2010).
Кроме того, большинство работ до настоящего времени проводилось с использованием подхода «случай-контроль», который имеет определенные ограничения при формировании контрольных групп пациентов. Таким образом, основываясь на имеющихся результатах, можно сделать вывод о необходимости проведения длительного проспективного исследования для выяснения индивидуальной роли данного полиморфного маркера в патогенезе сердечноГенотип Число пациентов Частота, % сосудистых заболеваний.
Нами были определены частоты генотипов полиморфного маркера Arg506Gln гена F5 у всех пациентов (Табл. 2).
Частоты аллелей в изучаемой нами группе больных были близки к частотам, ассоциации полиморфного маркера G5393A гена F5 с риском развития НИ проводили наблюдаемым у европейцев. Среди исследуемых пациентов нами не было обнаружено с разделением пациентов на группы по половому признаку.
ни одного носителя «Лейденовской мутации» в гомозиготной форме. Проведенный Рис. 1. График Каплана-Майера. Доля неблагоприятных исходов у женщин носителей генотипов GG и GA+AA полиморфного маркера G5393A гена F5 в зависимости от времени, прошедшего после ОКС.
Анализ времени дожития до конечной точки у носителей различных генотипов полиморфного маркера G5393A гена F5 показал, что в группе женщин носителей генотипов GA и AA за период наблюдения чаще наблюдался неблагоприятный исход (фатальный и нефатальный ИМ, фатальный и нефатальный инсульт), чем в группе гомозиготных носителей аллеля G. Время дожития до конечной точки составило 42, месяцев (95% CI 38,0-47,5) против 49,5 месяцев (95% CI 45,1-53,9) (2 = 4.15 р = 0.045) (Рис. 1). В группе мужчин данной ассоциации обнаружено не было, у носителей разных генотипов частоты развития неблагоприятных исходов не отличались.
Таким образом, полученные нами данные об ассоциации полиморфного маркера G5393A гена F5 с риском развития НИ в группе женщин, перенесших ОКС, согласуются с данными европейских исследований и подтверждают важную роль полового диморфизма в патогенезе развития ИБС, а также свидетельствуют в пользу необходимости внедрения генетического тестирования больных ИБС для выявления лиц, имеющих максимальную предрасположенность к развитию неблагоприятных исходов.
1.2.3. Исследование ассоциации полиморфного маркера Arg353Gln гена F7 с неблагоприятных исходов у носителей генотипа Arg/Arg полиморфного маркера Фактор VII (проконвертин) представляет собой гликопротеин, зависимый от витамина К. Активная форма фактора VII – это сериновая протеаза, первый фермент в каскаде свёртывания крови по «внутреннему пути» (Долгов и Свирин, 2005).
Активация данного пути играет ключевую роль в процессе гемостаза, в связи с чем, Возможно, у носителей аллеля Gln понижен уровень удельной активности фактора Ген тромбомодулина расположен на хромосоме 20р11.2. Обнаружена VII в плазме крови, а также имеет место некоторое снижение его секреции, что было ассоциация нескольких полиморфных маркеров гена THBD с развитием сердечнообнаружено в ряде исследований (Ghaddar et al., 1998; Kathiresan et al., 2006). сосудистых заболеваний. Одним из них является полиморфный маркер С/Т в Частота генотипов полиморфного маркера Arg353Gln гена F7 у больных, перенесших Ala/Val в положении 455 полипептидной цепи. Данные об ассоциации этого Рис. 2. График Каплана-Майера. Доля неблагоприятных исходов у женщин носителей генотипов Arg/Arg и Arg/Gln+Gln/Gln полиморфного маркера Arg353Gln гена F7 в зависимости от времени, прошедшего после ОКС.
1.2.4. Исследование ассоциации полиморфного маркера Ala455Val гена неблагоприятного исхода после перенесенного острого коронарного синдрома не Тромбомодулин - интегральный гликопротеин мембран клеток, участвующий в связывании тромбина. Тромбомодулин является ключевым звеном серии реакций, регулирующих направление и скорость процессов гемостаза (Dittman and Majerus, 1990).
Полученные нами данные об отсутствии статистически значимой ассоциации маркеров генов, продукты которых участвуют в регуляции воспаления, с развитием генотипов полиморфного маркера Ala455Val гена THBD с риском развития НИ НИ (Благодатских и соавт., 2011).
согласуются с данными, полученными в ряде европейских проспективных Основываясь на этих данных, в проведенном нами многоцентровом исследований (Auro et al., 2007). Исходя из этого, можно сделать вывод о том, что проспективном исследовании был применен комплексный подход с использованием полиморфный маркер Ala455Val гена THBD не имеет индивидуального комбинаций генотипов исследуемых полиморфных маркеров. Поскольку тенденция к прогностического значения в оценке риска развития неблагоприятных исходов у изменению числа НИ в зависимости от генотипов как полиморфного маркера больных, перенесших обострение ИБС. Для проведения дальнейших исследований Arg353Gln гена F7, так и полиморфного маркера Ala455Val гена THBD наблюдалась наиболее целесообразен комплексный подход с использованием комбинации нами только в группе женщин, дальнейшее исследование проводили, учитывая эти генотипов других полиморфных маркеров гена THBD. результаты. Исследовалось две группы женщин. В первую были включены носители Рис.3. График Каплана-Майера. Доля неблагоприятных исходов у носителей различных генотипов полиморфного маркера Ala455Val гена THBD в зависимости от времени, прошедшего после ОКС.
1.2.5. Исследование сочетанной ассоциации полиморфного маркера Ala455Val гена THBD и полиморфного маркера Arg353Gln гена F7 с ОКС.
Важную прогностическую роль в проспективных исследованиях с использованием «конечных точек» может играть изучение совместного влияния комбинации генотипов нескольких полиморфных маркеров. Данный подход широко применяется как в современных зарубежных исследованиях (Auro et al., 2007), так и в России. Наши последние данные, полученные в результате длительного проспективного исследования на группе больных, перенесших обострение ИБС, выявили значительную сочетанную ассоциацию комбинаций генотипов полиморфных различных генотипов полиморфных маркеров Ala455Val гена THBD и Arg353Gln гена Частоты генотипов полиморфного маркера C(-2676)T гена PROC у больных, 1.2.6. Исследование ассоциации полиморфного маркера С(–2676)Т гена PROC с ОКС.
белок C выполняет функции антикоагулянта. Он инактивирует факторы свертывания Va и VIIIa путем их ограниченного протеолиза и таким образом подавляет гемостаза подтверждается множеством клинических наблюдений, свидетельствующих о том, что его наследственный дефицит ведет к развитию тромбозов различной степени тяжести уже в молодом возрасте (Folsom et al., 2002). Проведенный анализ выживаемости пациентов показал, что риск развития Также показано, что белок С вызывает увеличение концентрации тканевого активатора плазминогена, за счет нейтрализации его ингибитора. Таким образом, под действием белка С происходит сдвиг равновесия между тканевым активатором плазминогена и ингибитором активатора плазминогена типа 1 в сторону активатора, что приводит к увеличению фибринолитической активности крови (Сидоркина, 2001).
Кроме того, активированный белок С участвует в регуляции воспалительного Эти данные свидетельствуют о том, что полиморфный маркер C(–2676)T гена процесса, ингибируя продукцию цитокинов макрофагами, а так же оказывает PROC не ассоциирован с развитием неблагоприятного исхода у больных, перенесших цитопротективный эффект (Mosnier et al., 2007). Эти данные подтверждают ОКС.
исключительно важную роль белка С в регуляции гемостаза.
В промоторной области, кодирующего белок С гена PROC, расположенного на хромосоме 2q13–q14, обнаружено несколько полиморфных маркеров: C(–1654)T, A(– 1641)G, A(–1476)T и C(–2676)T. Данных об ассоциации этих полиморфных маркеров Рис.5. График Каплана-Майера. Доля неблагоприятных исходов у носителей времени, прошедшего после ОКС.
1.2.7. Исследование ассоциации полиморфного маркера 4G(-675)5G гена PLANH1 с ОКС.
Ингибитор активатора плазминогена типа 1 (PAI-1) является главным физиологическим ингибитором активатора плазминогена тканевого типа (t-PA).
Биологическая система активатор плазминогена/плазмин является По данным, полученным разными исследователями, уровень PAI–1 примерно фибринолитической системой, основная функция которой - запуск защитных на 25% выше у носителей генотипа 4G/4G, по сравнению с носителями генотипа механизмов, предотвращающих образование тромба. Активность этой системы 5G/5G (Lane and Grant, 2000). В течение последних лет в большинстве исследований зависит от уровня специфичной протеазы, плазмина, который образуется из обнаружено наличие повышенного уровня PAI–1 в плазме крови у пациентов с ИБС, неактивного предшественника плазминогена под действием его активаторов. особенно у лиц, перенесших ИМ (Sabino et al., 2011).
Активация плазминогена, в свою очередь, регулируется посредством Отсутствие ассоциации генотипов полиморфного маркера 4G(-675)5G гена присутствующих в плазме крови специфичных ингибиторов активатора PLANH1 с развитием неблагоприятных исходов в группе больных ИБС, перенесших плазминогена. Наиболее значимым из таких ингибиторов является ингибитор острый коронарный синдром, согласуется с данными, полученными в активатора плазминогена типа 1 (Yamamoto et al., 2005). PAI-1 секретируется в кровь крупномасштабных исследованиях последних лет (Koch et al., 2010) и говорит об эндотелием сосудов и является ингибитором t-PA и урокиназы. Принято считать, что отсутствии индивидуальной прогностической значимости данного полиморфного повышенная концентрация PAI-1 ассоциирована с неблагоприятным течением маркера.
атеротромбоза (Sobel et al., 2003).
В гене PLANH1, кодирующем PAI-1, обнаружен полиморфный маркер 4G/5G в положении -675 (rs1799762). Данный полиморфный маркер расположен в промоторной области гена в районе участка связывания белка — активатора транскрипции и, по некоторым данным, у носителей аллеля 4G повышен риск Рис. 6. График Каплана-Майера. Доля неблагоприятных исходов у носителей различных генотипов полиморфного маркера 4G(-675)5G гена PLANH1 в зависимости от времени, прошедшего после ОКС.
Работы, обнаружившие ассоциацию данного полиморфного маркера и риска развития ИМ, в основном проводились на небольших группах (Corsetti et al., 2008) и, возможно, полученные ими результаты связаны с недостаточной величиной выборки.
Также, можно предположить, что аллель 4G является фактором риска развития ИМ только в молодом возрасте, в то время как средний возраст пациентов, исследуемых в нашей выборке, был старше 50 лет. Так, впервые ассоциация аллеля 4G гена PLANH с более высоким риском инфаркта миокарда была выявлена на шведской популяции у молодых мужчин (35 – 45 лет) (Ericsson et al., 1995), и в то же время, на больших группах пожилых пациентов ассоциация не наблюдалась. Об этом свидетельствует также достоверно более низкое число гомозиготных носителей аллеля 4G среди выживших пациентов, которые перенесли ИМ в возрасте до 35 лет (Rallidis et al., 2010). Кроме того, в нескольких более ранних работах не были обнаружены не только ассоциация данного полиморфного маркера с ИМ, но и его корреляция с уровнем PAI–1 (Doggen et al., 1999).
«