На правах рукописи

Попрыгина Татьяна Дмитриевна

СИНТЕЗ, СТРУКТУРА И СВОЙСТВА ГИДРОКСИАПАТИТА,

КОМПОЗИТОВ И ПОКРЫТИЙ НА ЕГО ОСНОВЕ.

Специальность 02.00.01 – неорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата химических наук

Воронеж - 2012 1

Работа выполнена в Воронежской государственной медицинской академии им.Н.Н.Бурденко

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор Пономарева Наталия Ивановна

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Гидроксиапатит (ГА) Са10(РО4)6(ОН)2 является основным неорганическим компонентом костной и зубной ткани человека и животных, поэтому возрастающий интерес к материалам на основе ГА обусловлен возможностями их использования в репаративной медицине. В настоящее время известны различные способы синтеза ГА, однако как биологические, так и механические свойства чистых порошков оставляют желать лучшего. Уникальные свойства нативной костной ткани связаны с сочетанием в ней органических (белки коллагеновой природы, полисахариды и др.) и неорганических (ГА и примеси других кальцийфосфатных фаз) составляющих, поэтому представляется целесообразным развитие новых методов синтеза композитов ГА, позволяющих получать частицы, включенные в биополимерную матрицу. При этом возможно добиться как улучшения биосовместимости, так и увеличения твердости материалов. С другой стороны, свойства как самого ГА, так и композитов на его основе зависят от размера частиц, поэтому усилия многих исследователей направлены на получение нано-ГА, применение которого в качестве наполнителя прочных углеродистых имплантатов открывает широкие перспективы «оживления» инертных материалов-матриц в восстановительной хирургии. В этом случае представляет интерес также исследование резорбируемости кристаллов определенного состава, размера и морфологии в порах импрегнированного имплантата.

Нанесение гидроксиапатитовых покрытий на титановые имплантаты производится с целью улучшения биосовместимости и коррозионной стойкости материалов, применяемых в восстановительной хирургии и стоматологии и сопряжено с многочисленными трудностями: во—первых, все известные способы получения покрытий на титане требуют дорогостоящей аппаратуры или длительной многостадийной обработки, вовторых, толщина образующихся пленок мала, а адгезия кристаллов к поверхности титана неудовлетворительна, в результате чего пленки не выдерживают испытаний при стерилизации и перемешивании в модельных жидкостях организма, в-третьих, представляет сложность получение однородных по толщине слоев на изделиях сложной формы, применяемых для медицинских целей. Таким образом, актуальной проблемой является разработка новых способов получения кальцийфосфатных покрытий на поверхности титана и исследование их резорбируемости in vitro.

Цель работы: разработка новых методов экспресс-синтеза ГА, композитов и покрытий на его основе и изучение зависимости свойств от состава этих материалов.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Разработка новых способов экспресс-синтеза нанокристаллического ГА, отличающихся простотой исполнения.

2. Исследование возможности импрегнирования углеродистых имплантатов ГА и снижения его резорбируемости in vitro при различных значениях рН среды.

3. Получение композитов ГА с биополимерами, изучение зависимости твердости полученных материалов от их состава и условий синтеза.

4. Установление влияния избытка ионов кальция в растворе на состав и свойства образующихся композитов в системах «ГА – биополимер».

5. Формирование биоактивных покрытий на титане осаждением из растворов и исследование влияния неорганических (соли железа) и органических (биополимеры) добавок на целевые характеристики (резорбируемость, адгезия).

Научная новизна:

1. Доказано, что доминирующим фактором при синтезе кристаллов ГА стехиометрического состава из растворов является скорость смешения реагентов; предложено использование ализаринового красного в качестве нуклеатора; разработан способ синтеза нанокристаллического ГА в микроэмульсионных системах.

2. Получены экспериментальные данные о резорбируемости ГА в составе импрегнированных имплантатов в зависимости от состава, размера и морфологии кристаллов.

3. Исследованиями композитов ГА с биополимерами (хондроитинсульфат, желатин) установлено возрастание микротвердости с увеличением соотношения Ca/P. Обосновано преимущество хондроитинсульфата как реакционной среды и активного реагента по отношению к Ca 2+.

4. Разработан метод химического осаждения пленок карбоната кальция на титан и установлены закономерности изменения их состава до кальцийфосфатных фаз. Обнаружено положительное влияние примесей ионов Fe 2+ на характеристики пленок (адгезия, резорбируемость).

Практическая значимость результатов работы:

рекомендованы для создания материалов с пониженной резорбируемостью в кислой среде, применяемых в стоматологии и восстановительной хирургии.

Синтез композитов ГА с гетерополисахаридами и полипептидами при избытке Ca2+ открывает возможности получения материалов с заданным качественным и количественным составом и высокой твердостью.

Предложенный способ нанесения ГА на титан позволяет формировать покрытия контролируемого состава, морфологии, кристалличности и толщины при наличии хорошей адгезии, не требует дорогостоящего оборудования и может быть модифицирован для получения не только гидроксиапатитовых, но и других покрытий.

Положения, выносимые на защиту:

1. Способ осаждения кристаллического ГА в водном растворе или модельной жидкости организма (SBF) с обязательным капельным смешением реагентов и добавлением нуклеатора, позволяющий на несколько порядков сократить время процесса по сравнению с известными в таких системах.

Способ синтеза нанокристаллического ГА в микроэмульсионных системах.

2. Характер влияния размера кристаллов, фазового и элементного состава на резорбируемость ГА в составе импрегнированых углеродистых имплантатов в кислой и слабощелочной среде.

3. Зависимость состава и свойств композитов ГА с биополимерами от соотношения Са:Р в растворе и типа биополимера как основа получения композитов с высокой микротвердостью.

4. Новый способ осаждения карбонатных пленок на поверхности титана с их последующей трансформацией в фосфатные и гидроксиапатитовые и возможность моделирования резорбируемости покрытий.

Публикации и апробация работы.

По материалам диссертации поданы заявки на изобретения, получен патент, опубликовано 18 работ, из которых 8 статей в журналах, входящих в утвержденный ВАК РФ перечень научных изданий. Результаты исследований были доложены на III Всероссийской конференции «Физикохимические процессы в конденсированных средах и на межфазных границах» (Воронеж, 2006); Всероссийском совещании «Биокерамика в медицине» (Москва, 2006); III Всероссийской научно-методической конференции «Пути и формы совершенствования фармацевтического образования. Создание новых физиологически активных веществ» (Воронеж, 2007); VI Всероссийской конференции «Нелинейные процессы и проблемы самоорганизации в современном материаловедении (индустрия наносистем и материалы) » (Воронеж, 2007); IV Всероссийской научной конференции «Физико-химические процессы в конденсированных средах и на межфазных границах» (Воронеж, 2008); VII Всероссийской конференции «Нелинейные процессы и проблемы самоорганизации в современном материаловедении (индустрия наносистем и материалы) » (Воронеж, 2009), V Всероссийской конференции «Физико-химические процессы в конденсированных средах и на межфазных границах» (Воронеж, 2010); 66 региональной научной конференции по фармации и фармакологии (Пятигорск, 2011);

Структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов, списка литературы (205 наименований). Работа изложена на 157 стр., включая.. рисунков и..

таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В главе 1 рассматривается проблема получения материалов на основе ГА, применяемых в репаративной медицине. Рассмотрены известные способы синтеза ГА, композитов и пленок на его основе и показано, что простые в исполнении методы требуют длительного времени и не всегда обеспечивают требуемый уровень управления свойствами целевого продукта.

Отдельной задачей является синтез нанокристаллического ГА, необходимого для получения материалов с высокой биологической активностью, адгезией в пленочном состоянии, микротвердостью и пониженной резорбируемостью, требующейся при импрегнировании крупнопористых углеродистых имплантатов для восстановления больших участков костной ткани.

В главе 2 приведено детальное описание предложенных способов синтеза ГА в водном растворе, в модельной жидкости организма (SBF), а также в микроэмульсионной системе и получения соответствующих покрытий на титане. Обоснован выбор объектов (биополимеров, неорганических и органических добавок), определяющих состав и свойства нанокристаллов, композитов и пленок. Показано, что применяемый комплекс физико-химических методов исследования позволяет контролировать элементный (ЛРСМА: «INCA Energy-250»), фазовый (РФА:

«ДРОН-3М», «ДРОН-7») состав, структуру (ИКС: «Инфралюм ФТ-02», «Specord IR-75», «Bruker Equinox 55»), морфологию и размер частиц (СЭМ:

«JSM-6380 LV»; ПЭМ: «ЭМВ 100БР»; оптическая микроскопия: «МИКМЕДмикротвердость композитов по Виккерсу («ПМТ-3», «FISCHERSCOPE H100C»), толщину пленок («МИИ-10», «МИИ-4», «FISCHERSCOPE XDAL») и их адгезию (метод решетчатых надрезов (МРН), метод параллельных надрезов (МПН)). Рассмотрена целесообразность исследования резорбируемости полученных образцов в кислой и слабощелочной средах, имитирующих биологические жидкости.

В главе 3 представлены собственные результаты по разработке новых и оптимизации известных методов синтеза ГА, особенностям импрегнирования углеродистых имплантатов полученным гидроксиапатитом и исследования резорбируемости образцов с различным мольным соотношением Са:Р в слабощелочной и кислой среде.

В основу оптимизации синтеза были положены известные факты о механизме роста кристалла ГА, имеющем больше сходства с ростом кристаллов протеинов и вирусов, чем с формированием неорганических кристаллов: отдельные кластеры Са9(РО4)6 являются устойчивыми субъединицами роста, предпочитающими спиральную укладку с большим сопротивлением инкорпорирования (внедрения в объем). Поэтому при водных синтезах одномоментное смешение реагентов приводит к образованию аморфного фосфата кальция, который в дальнейшем претерпевает микрорасслаивание и в процессе частичного растворенияосаждения медленно превращается в ГА. Капельное добавление реагентов позволяет избежать первой стадии образования хаотичных ионных ассоциатов и их агрегатов, предоставляя время для организованной кластерной укладки, а введенные органические вещества частично связывают ионы кальция и являются молекулярными матрицами для направленной нуклеации.

Доказано, что при синтезе ГА в водном растворе согласно реакции 10Ca(NO3)2+6(NH4)2HPO4+8NH3+2H2OСа10(РО4)6(ОН)2+20NH4NO3 (1) обязательным является режим капельного добавления одного раствора к другому со скоростью менее 80 мкл/сек, с введением дополнительных количеств аммиака в систему при уменьшении pH раствора. На рис. представлено изменение мольного соотношения в зависимости от скорости добавления реагентов. При указанных условиях оптимальная скорость составляет 16 мкл/сек, что приводит к мольному соотношению Са:Р=1.67 в полученном ГА, дифрактограмма которого представлена на рис.2.

соотношение Са:Р в продукте В данном режиме достигнуто снижение времени синтеза ГА (24 часа вместо 28 суток). При одномоментном смешении всегда образуются кинетически предпочтительные прекурсоры ГА, находящиеся в аморфном состоянии (рис.3) и медленно превращающиеся в ГА.

Введение кристаллов ализаринового красного в качестве нуклеатора позволяет сократить время синтеза до 6 часов.

Проведение синтеза в плазмозаменителе (SBF, simulated body fluid) приводит к образованию карбонатгидроксиапатита типа А, более близкого по Са10(РО4)6(СО3)0.5x(ОН)2-x, где x 1,67. Введение избыточного количества ионов Са2+ придает положительный заряд грануле коллоидного ГА, увеличивая –потенциал и усиливая взаимодействие частиц [ mCa10(PO4)6(OH)2 · nCa2+ · 2(n-x)NO3-]2x+ с отрицательно заряженными в щелочной среде желатином и хондроитинсульфатом, находящимся в ионизированном состоянии. Способ считается биомиметическим, т.к. по принципу многослойной адсорбции заряженных слоев формируются раковины моллюсков и другие биологические объекты.

Наблюдается резкое увеличение твердости композитов «ГА / хондроитинсульфат» (до 23.9 кгс/мм2=234.22 Мн/м2) при введении избыточного ( 5ммоль по сравнению со стехиометрическим) количества растворимой соли кальция в соответствующие системы при синтезе. На микрофотографиях SEM видна кластерно-агрегатная структура, границы частиц достаточно четкие, средний размер агрегата 0.2мкм. Данные ИКС, ЛРСМА и гравиметрического анализа подтверждают увеличение количества органического полимера в составе композита (до 11.58 вес.% хондроитинсульфата, 0.35-0.4 ат% S, и т.д.) по сравнению с композитами без избытка кальция. Соотношение Са:Р изменяется в пределах 1.67-1.79, т.е.

всегда превышает стехиометрическое, характерное для ГА. На дифрактограммах отдельных образцов наряду с пиками ГА обнаруживаются рефлексы, соответствующие следам других фаз, например Са4Р2О9 с соотношением Са:Р=2.

Микротвердость композитов «ГА/желатин», полученных при добавлении избыточного количества солей кальция в соответствующие системы, изменяется более плавно по сравнению с композитами «ГА/хондроитинсульфат», достигая значения 12.44 кгс/мм2 (121.9 Мн/м2) при введении 8 ммоль избытка Са2+, далее изменяется незначительно. Композит образуется в виде трудновысыхающего геля, хорошо удерживающего воду.

На микрофотографиях различимы округлые частицы размером менее 50нм.

Типичные дифрактограммы показывают отдельные пики ГА (d = 3.42, 2.81, 2.79, 2.72, 2.60, 2.25, 1.95, 1.84 ) на фоне галодиффузионного рассеяния.

В тройной системе «ГА/хондроитинсульфат/желатин» максимальное значение твердости составило 26.75 кгс/мм2 (262.15 Мн/м2), что превышает твердость эпоксидных смол с отвердителями и приближается к твердости дентоксида, норакрила и других стоматологических материалов.

При избытке Са2+ ГА связывает большее количество биополимеров (таб.2), поэтому соответствующее изменение твердости объясняется изменением не только соотношения Са:Р, но и ГА: полимер. Оба органических компонента – хондроитинсульфат и желатин – способствуют увеличению твердости полученных материалов, однако по количеству атомов серы и азота, вошедших в состав композита, можно сделать заключение, что в большей степени увеличивается связывание кристаллами ГА хондроитинсульфата, а не желатина, чем и объясняется близость кривых 1 и 2 на рис.8. Как и во всех остальных образцах, содержащих желатин, в композитах обнаруживается большое количество аморфной фазы (РФА). ИКспектры обнаруживают наличие характерных мод колебаний функциональных групп (рис.9), средний размер частиц составляет 100нм (рис.10). В таблице 2 представлены характеристики соответствующих композитов.

«ГА/хондроитинсульфат/желатин», полученных при избытке иона кальция в микротвердость, Мн/м Рис.9. ИК-спектры (область 600- см-1) : 1 –ГА; 2 – желатин; 3- композит «ГА/хондроитинсульфат/желатин»;

4- хондроитинсульфат.

В главе 5 приведены результаты исследований нового способа химического осаждения кальцитных покрытий на поверхности титана с их последующей трансформацией в фосфатные и гидроксиапатитовые и рассмотрена возможность моделирования резорбируемости покрытий.

Для нанесения кальцийкарбонатного покрытия на титан использовали растворы нитрата кальция и гидрокарбоната натрия. Сразу после начала выделения углекислого газа поверхность металла приобретает матовый белесый оттенок, при дальнейшей выдержке пластин в реакционной смеси толщина покрытий быстро увеличивается, достигая 3.5 мкм за 5 мин осаждения при 25С, и практически не зависит от концентраций исходных растворов (в диапазоне концентраций 0.1М – 1М). Согласно данным РФА, образующийся на поверхности титана карбонат кальция кристаллизуется в виде кальцита (d = 3.035, 2.495, 2.285, 2.095, 1.913, 1.875 ). Методом SEM установлено, что после осаждения в течение 15 мин. кристаллы образуют агрегаты размером порядка 5 мкм.

В литературе не найдено соответствующего объяснения протекающих на поверхности титана процессов. Известно, что слабые (но концентрированные) кислоты способны растворять пассивирующую пленку, покрывающую поверхность титана, за счет образования ацидокомплексов H2[TiF6], H2[Ti(C2O4)3], и т.д. Однако нет доказательств, что углекислота может обладать подобным действием, т.к. комплексные карбонаты типа М2[Э(CO3)2], М[Э(CO3)2], М6[Э(CO3)5] описаны для немногих элементов (Э=Ве, Sc, Y, La, Th, Ce).

Известно также, что насыщенные растворы гидрокарбонатов способны реагировать с оксидом титана (TiO2) с образованием СаTiO3 (модификация перовскита), поэтому лучшая адгезия покрытия к металлической поверхности может достигаться за счет образования переходного слоя, состоящего из титаната кальция. Данные предположения имеют характер гипотез.

формирования фосфатов кальция согласно уравнениям реакций:

10СаСО3 + 6РО4 + 2ОН Са10(РО4)6(ОН)2 + 10СО32- (3) менее 3 мкм. Состав созревающих кристаллов (в условиях данного эксперимента) изменяется очень медленно, по прошествии 7 суток они все еще содержит фазы-прекурсоры ГА (СаСО3 и Сa3(PO4)2), которые со временем переходят в термодинамически более стабильный и наименее растворимый ГА. Соотношение Са:Р на 7, 14, 21, 30 сутки изменяется как 1.53±0.02, 1.64±0.03, 1.66±0.01, 1.67±0.01, соответственно. Сформированные покрытия представляют собой наноразмерный карбонатгидроксиапатит