«VI Съезд Российского фотобиологического общества пос. Шепси, 15–22 сентября 2011 г. Материалы съезда Москва 2011 В настоящем сборнике представлены материалы VI съезда Российского фотобиологического общества. Сборник ...»

РОССИЙСКОЕ ФОТОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ОБЩЕСТВО

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

им. М.В. ЛОМОНОСОВА

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

РОССИЙСКИЙ ФОНД ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

МИНИСТЕРСТВА ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ

РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

АНАЛИТИЧЕСКИЙ ЦЕНТР МЕЖДУНАРОДНЫХ

НАУЧНО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ И ОБРАЗОВАТЕЛЬНЫХ ПРОГРАММ

VI Съезд Российского фотобиологического общества пос. Шепси, 15–22 сентября 2011 г.

Материалы съезда Москва 2011 В настоящем сборнике представлены материалы VI съезда Российского фотобиологического общества. Сборник предназначен для широкого круга биологов, химиков и физиков, интересующихся проблемами фотобиологии.

Ответственный редактор: д.ф.-м.н. И.И. Проскуряков Ответственный за выпуск: Г.В. Митенко ISBN 978-5-9562-0081-0 © ИФПБ РАН, © НИА-Природа, © Российское фотобиологичсекое общество ОбРащение к учаСтникаМ Дорогие коллеги!

Мы рады приветствовать вас на VI съезде Российского фотобиологического общества, который проводится в пансионате Маяк поселка Шепси Краснодарского края. Мы благодарны коллегам из Института химической физики РАН, впервые проложившим дорогу в это прекрасное место. Наш съезд проводится при поддержке Министерства образования и науки РФ и Российского фонда фундаментальных исследований. В организации съезда принял участие Аналитический центр международных научнотехнологических и образовательных программ (МНиОП).

Программа съезда включает следующие секции:

1) Первичные процессы фотосинтеза (организаторы:

В.А. Шувалов, В.В. Климов, И.И. Проскуряков);

2) Регуляция фотосинтеза (организаторы: А.Н. Тихонов, Б.Н. Иванов, И.Г. Стриж);

3) Фоторецепция (организаторы: М.А. Островский, В.А. Синещёков, М.С. Крицкий);

4) Биомедицинские приложения фотофизики и фотохимии (организаторы: А.П. Савицкий, Н.Н. Угарова, А.Я. Потапенко, В.А. Надточенко, Е.С. Высоцкий);

5) Биофотоника (организаторы: Ю.А. Владимиров, В.В. Тучин, А.А. Красновский, Н.М. Шахова, Е.В. Загайнова).

На съезде будут представлены 190 устных и стендовых докладов. Среди участников – 59 докторов наук и 86 кандидатов наук, 45 аспирантов и студентов. На нашем съезде будут коллеги из Азербайджана, Белоруссии, Литвы и Украины. Россия будет представлена 16 городами, включая Воронеж, Красноярск, Махачкалу, Москву, Нижний Новгород, Пущино, Ростов-на-Дону, Санкт-Петербург, Саратов, Сочи, Сыктывкар, Томск, Троицк, Ульяновск, Уфу и Якутск; Украина – 4 городами – Киевом, Дзержинском, Донецком и Черкассами. Такое количество участников свидетельствует о непрекращающемся интересе научного сообщества к фотобиологии и о том, что наша область науки активно развивается.

Мы приветствуем вас на VI съезде Российского фотобиологического общества в поселке Шепси и надеемся, что программа окажется интересной, а окружающая природа будет способствовать научным успехам.

От имени Оргкомитета съезда Президент Российского фотобиологического общества, профессор А.Ю. Семенов ОРГаниЗаЦиОннЫЙ кОМитет:

Сопредседатели:

А.Ю. Семёнов – Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ (НИИФХБ МГУ) В.А. Шувалов – Институт фундаментальных проблем биологии РАН (ИФПБ РАН) Ученый секретарь: Е.А. Котова. (НИИФХБ МГУ) Члены Оргкомитета:

Ю.А. Владимиров, Российский гос. медицинский университет Е.С. Высоцкий, Институт биофизики СО РАН Е.В. Загайнова, Нижегородская гос. медицинская академия Б.Н. Иванов, ИФПБ РАН В.В. Климов, ИФПБ РАН Л.А. Коппель, Биологический факультет МГУ А.А. Красновский, Институт биохимии РАН М.С. Крицкий, Институт биохимии РАН И.Р. Куклина, Аналитический центр МНиОП М.Д. Мамедов, НИИФХБ МГУ В.А. Надточенко, Институт проблем химической физики РАН М.А. Островский, Институт биохимической физики РАН А.Я. Потапенко, Российский государственный медицинский И.И. Проскуряков, ИФПБ РАН А.Б. Рубин, Биологический факультет МГУ А.П. Савицкий, Институт биохимии РАН В.А. Синещёков, Биологический факультет МГУ И.Г. Стриж, Биологический факультет МГУ А.Н. Тихонов, Физический факультет МГУ В.В. Тучин, Физический факультет СГУ Н.Н. Угарова, Химический факультет МГУ Н.М Шахова, Нижегородская государственная медицинская академия Секция ПеРВичнЫе ПРОЦеССЫ ФОтОСинтеЗа ВСтРаиВание каРОтинОиДОВ В ПиГМент-беЛкОВЫе кОМПЛекСЫ СеРнЫХ ФОтОСинтеЗиРуЮщиХ бактеРиЙ Carotenoid reconstitution into pigment-protein complexes from александр аШиХМин, Максим бОЛЬШакОВ, Зоя МаХнеВа, Институт фундаментальных проблем биологии РАН, Пущино, Московская область, 142290, Россия;

E-mail: [email protected]; Fax: +-496-3-305- В процессе фотосинтеза участвуют пигменты хлорофиллового ряда и каротиноиды, которые локализованы в пигмент-белковых комплексах (ПБК). Фотосинтезирующие бактерии, обладающие самым простым фотосинтетическим аппаратом, содержат, как правило, два светособирающих ПБК: периферийный (LH2) и прицентровой (LH1). Последний окружает реакционный центр, образуя ансамбль LH1-RC. Для изучения функций каротиноидов необходимо сравнить свойства образцов как с каротиноидами, так и без них. Однако бескаротиноидные мутанты содержат один тип светособирающего ПБК, который по ряду параметров отличается от контрольных ПБК. Использование ингибитора ДФА позволяет получить бескаротиноидные бактерии с сохранением полного набора светособирающих ПБК, которые не изменяют своих спектральных характеристик.

Объекты исследования – бактерии Allochromatium minutissimum (основной каротиноид родопин) и Ectothiorhodospira haloalkaliphila (ангидрородовибрин и спириллоксантин) со спириллоксантиновым путем биосинтеза каротиноидов. Они одни из немногих бактерий, у которых биосинтез каротиноидов может быть почти полностью подавлен ингибитором. Изучена возможность встраивания in vitro общих экстрактов каротиноидов из Alс. minutissimum, Ect. haloalkaliphila, Rps. rubrum в бескаротиноидные ПБК из данных бактерий. При использовании собственного экстракта каротиноидов удалось встроить 80–90% каротиноидов в оба комплекса.

В комплекс LH1 из Alc. minutissimum встраивался преимущественно спириллоксантин (89,%), а в комплекс LH2 – родопин (68,1%). Добиться встраивания спириллоксантина удалось только в небольшую фракцию комплекса LH2. При встраивании каротиноидов в ПБК из Ect. haloalkaliphila в обоих комплексах основными являются родопин (23%), спириллоксантин (26%) и ангидрородовибрин (24%).

Изучены спектральные и биохимические характеристики комплексов со встроенными каротиноидами (спектры поглощения, КД, флуоресценции и возбуждения флуоресценции, фотоустойчивость и термостабильность). По этим характеристикам изученные комплексы похожи на контрольные образцы, что свидетельствует о правильности встраивания каротиноидов в комплексы LH2 и LH1-RC. Исследован процесс восстановления биосинтеза каротиноидов (встраивание in vivo) у Ect. haloalkaliphila как в мембранах, так и в выделенных из них комплексах LH и LH1-RC. На первых стадиях преобладают каротиноиды из ранних этапов биосинтеза (фитоин, фитофлуин и -каротин), которые затем постепенно замещаются каротиноидами из более поздних этапов биосинтеза (ангидрородовибрин, спириллоксантин и родопин). Разные типы каротиноидов при встраивании в ПБК не изменяют спектральные характеристики полос поглощения БХл.

Работа выполнена при частичной поддержке госконтракта с Роснаукой №02.40.11.0293 и гранта президента РФ НШ-4525.2008.4.

РОЛЬ каРОтинОиДОВ В ПРОЦеССе ФОтООкиСЛениЯ Carotenoids role in the process of bacteriochlorophyll photooxidation in vivo Максим бОЛЬШакОВ, Зоя МаХнеВа, андрей МОСкаЛенкО Институт фундаментальных проблем биологии РАН, Пущино, Московская область, 142290, Россия;

E-mail: [email protected]; Fax: +-496-3-305- Institute of Basic Biological Problems, Russian Academy of Sciences, 142290 Pushchino, Moscow Region, Russia E-mail: [email protected] Каротиноиды в фотосинтезе выполняют несколько функций. Одна из них – это защита Бхл от окисления синглетным кислородом. Они тушат либо триплет Бхл, препятствуя образованию синглетного кислорода, либо сам синглетный кислород. При сравнении процесса фотовыцветания пигментов в клетках Alc. minutissimum с каротиноидами и без них на белом свету было установлен факт, который противоречил общепринятым представлениям о функциях каротиноидов: в присутствии каротиноидов облучение клеток белым светом приводило к резкому выцветанию полосы Бхл850 комплекса LH2 и образованию продукта окисления Бхл (698 нм). В бескаротиноидных образцах скорость фотовыцветания полосы Бхл850 резко снижалась и продукт окисления Бхл отсутствовал. Регистрация спектра действия этого процесса показала, что он совпадает со спектром поглощения каротиноидов (420–550 нм). Другие пигменты (Бхл или фоторецепторы, которые обнаружены в последнее время у фотосинтезирующих бактерий) не активировали фотоокисления Бхл. На этом основании был сделан вывод, что фотовыцветание (окисление) полосы Бхл связано с действием света на каротиноиды. Дальнейшая работа проводилась при освещении мембран Alc. minutissimum с разным содержанием каротиноидов сине-зеленым светом, который вырезали светофильтрами ЖС-4 и СЗС-22.

Изучены: а) влияние концентрации и состава каротиноидов в образце на фотоокисление Бхл850 и установлено, что процесс не идет только в бескаротиноидных образцах; б) гетерогенность комплексов LH2 по каротиноидному составу и показано, что в пределах одной популяции комплексов существуют пулы комплексов с разным содержанием каротиноидов или без каротиноидов;

в) влияние процесса фотовыцветания Бхл850 на структуру LH2 комплексов и выяснено, что окисление Бхл не влияет на целостность структуры комплексов LH2; г) продукт фотоокисления Бхл и он идентифицирован как 3 ацетил-хлорофилл; д) влияние ловушек синглетного кислорода на процесс фотоокисления Бхл и установлено, что они его замедляют или останавливают. Проведена серия экспериментов по восстановлению процесса фотовыцветания Бхл 850 в бескаротиноидных LH2 комплексах, путем встраивания в них каротиноидов.

Установлено, что они встраиваются избирательно (более подробно см. Ашихмин и др.). В образцах со встроенными каротиноидами полностью восстанавливался процесс фотоокисления Бхл. На основании совокупности полученных данных сделан вывод о том, что некоторые каротиноиды способны под действием света к образованию синглетного кислорода.

Работа выполнена при частичной поддержке госконтракта с Роснаукой №02.40.11.0293 и гранта президента РФ НШ-4525.2008.4, а также гранта РФФИ №09-04-00925а.

МутантнЫе РеакЦиОннЫе ЦентРЫ RBA. SPHAEROIDES С МОДиФиЦиРОВаннЫМ беЛкОВЫМ ОкРуЖениеМ Mutant reaction centers of Rba. sphaeroides with modified protein environment in Людмила ВаСиЛЬеВа, татьяна ФуФина, Мария ЛеОнОВа, Равиль ХатЫПОВ, Институт фундаментальных проблем биологии РАН, Пущино, Московская область, 142290, Россия;

E-mail: [email protected]; Fax: +-496-33-05-32;

В реакционных центрах (РЦ) фотосинтеза происходит превращение световой энергии в энергию химических связей. Квантовая эффективность преобразования света в РЦ на начальных этапах фотосинтеза составляет почти 100%.

Относительно просто организованные и хорошо изученные бактериальные РЦ представляют собой удобную модель для управления параметрами фотосинтетического электронного транспорта и исследования отдельных стадий этого процесса. Использование спектральных методов в сочетании с молекулярно-биологическими и биохимическими подходами открывает путь к пониманию механизмов, обеспечивающих высокую эффективность функционирования фотосинтетических РЦ. Реакционный центр пурпурной бактерии Rba. sphaeroides состоит из трех полипептидов и десяти кофакторов – 4-х молекул БХл a, 2-х молекул БФео a, 2-х молекул убихинона, атома негемового железа и молекулы каротиноида. Кофакторы РЦ образуют 2 цепи переноса электрона, но только одна и них, А-цепь, функционально активна. В бактериальном РЦ перенос электрона начинается после фото-возбуждения первичного донора электрона, димера бактериохлорофилла (БХл) Р, от которого электрон передается по А-цепи кофакторов с периферической на цитоплазматическую сторону мембраны. Белковое окружение первичного донора Р может оказывать влияние как на свойства димера БХл, так и на эффективность фотохимического разделения заряда. С помощью метода направленного мутагенеза, позволяющего локально изменять структуру белка, в РЦ Rba. sphaeroides были внесены аминокислотные замещения М210 Tyr-Leu, M19 Phe-Tyr, M182 His-Lue, L168 His-Leu, L153 His-Lue (Cys, Met, Tyr), L1 Ile-His и другие. Показано, что взаимодействие полярной ОН- группы Tyr M210 с заряженными молекулами БХл P+ и BA- ускоряет разделение зарядов между ними и стабилизирует состояние с разделенными зарядами P+BA-. Замещение гистидина L153, координирующего атом магния БХл ВA на аминокислотные остатки, не способные к лигандированию Mg, дестабилизируют РЦ, но феофитинизации ВA при этом не происходит. Двойная мутация H(L153)Y+H(M182)L приводит одновременно к замене молекулы БХл ВВ на молекулу БФео (ФВ) и к потере мономерного БХл ВA, и перенос электрона в таких РЦ идет только по В-цепи с образованием состояния с разделенными зарядами P+ФВ-. Замещение изолейцина L1 на гистидин в окружении БХл РА и ВВ влияет на взаимодействие этих хромофоров с белком, приводя в шести-координированию атома магния БХл ВВ и появлению ковалентной связи между БХл РА и L-субъединицей РЦ.

Работа выполнена при финансовой поддержке Федерального агентства по науке и инновациям Российской академии наук, программы «Молекулярная и клеточная биология», гранта Президента Российской Федерации (№ НШи РФФИ (грант 09-04-00109).

FTIR СПектРОСкОПиЯ РеакЦиОннЫХ ЦентРОВ CHlOROflExuS FTIR spectroscopy of reaction centers from Chloroflexus aurantiacus алексей ЗабеЛин, Валентина ШкуРОПатОВа, Владимир ШуВаЛОВ, Учреждение Российской академии наук Институт фундаментальных проблем биологии РАН, Пущино, Московская область, 142290, Россия;

E-mail: [email protected]; Fax: +(496)33-05-32;

Реакционные центры (РЦ) термофильной зеленой несерной бактерии Chloroflexus (Cfl.) aurantiacus сходны, но не идентичны, по фотохимическим свойствам с РЦ пурпурных бактерий, значительно отличаясь от них по пигментному и белковому составу. Поэтому сравнительные исследования РЦ Cfl. aurantiacus и пурпурных бактерий представляют большой интерес в связи с выяснением факторов, определяющих направленность и высокую эффективность процесса первичного разделения зарядов в бактериальном фотосинтезе.

Структура РЦ пурпурных бактерий с высоким разрешением была получена методом рентгеноструктурного анализа. Для РЦ Cfl. aurantiacus такие данные отсутствуют. Метод фотоиндуцированной дифференциальной инфракрасной спектроскопии с Фурье преобразованием (FTIR) позволяет наблюдать молекулярные изменения, связанные с фотоиндуцированным разделением зарядов между кофакторами РЦ.

В данной работе метод фотоиндуцированной дифференциальной FTIRспектроскопии применялся для исследования фотоокисления первичного донора электрона P с образованием состояния P+QA- и фотовосстановления бактериофеофитинового акцептора электрона HA в РЦ Cfl. aurantiacus. Анализ FTIR-спектров P+QA-/PQA и HA-/HA РЦ Cfl. aurantiacus проводится на основе сравнения с аналогичными хорошо охарактеризованными FTIR-спектрами РЦ Rhodobacter (Rba.) sphaeroides R-26. Присутствие специфического электронного перехода в совокупности с сопряженными колебательными (фазово-фононными) полосами в FTIR-спектре P+QA-/PQA РЦ Cfl. aurantiacus свидетельствует о том, что катион-радикал P+ в данных РЦ представляет собой гомодимер, состоящий из двух электронно-сопряженных молекул бактериохлорофилла а (PA и PB). Электронная организация димерного катион-радикала P+ в РЦ Cfl. aurantiacus характеризуется частичной делокализацией положительного заряда между молекулами PA и PB с некоторой асимметрией в распределении заряда в пользу PA. Показано, что FTIR-спектры HA-/HA РЦ Cfl. aurantiacus и Rba. sphaeroides R-26 демонстрируют как явные сходства, так и существенные различия в области валентных колебаний карбонильных групп. Полученные данные обсуждаются в рамках модели, предполагающей образование слабой водородной связи между глутамином L143 и 131-кето С=О группой бактериофеофитина HA в РЦ Cfl. aurantiacus как в нейтральном, так и в анион-радикальном состоянии.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант 10-04Министерства образования и науки Российской федерации, Президиума РАН (программы «Молекулярная и клеточная биология» и «Нанотехнологии и наноматериалы»), Гранта Президента РФ, НШ-3201.2010.4.

МиГРаЦиЯ ЭнеРГии В ГибРиДнЫХ кОМПЛекСаХ ПОЛуПРОВОДникОВЫХ нанОкРиСтаЛЛОВ и ВОДОРаСтВОРиМЫХ Energy migration in hybrid complexes of semiconductor nanocrystals Вадим ЗаГиДуЛЛин1, евгений МакСиМОВ1, Юрий бОРиСеВич2, Кафедра биофизики биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991, Москва, Россия E-mail: [email protected]; Tel: +-495-939-48-45;

Universidade de Sao Paulo, 14040901 – Ribeirao Preto, SP – Brasil.

Полупроводниковые нанокристаллы – квантовые точки (КТ) – обладают уникальными оптическими характеристиками, такими как большое сечение поглощения, исключительно высокая фотостабильность, широкий спектр поглощения и узкая полоса фотолюминесценции. Квантовый выход флуоресценции КТ достигает 0%, а их коэффициент экстинкции в десятки раз превышает коэффициенты экстинкции органических красителей [1,2]. Кроме того, положение максимума эмиссии КТ определяется их диаметром. Современные исследования показывают, что КТ могут быть использованы в качестве дополнительных светосборщиков для нативных пигмент-белковых комплексов, КТ обеспечивают высокую (до 90%) эффективность миграции энергии, коэффициенты усиления флуоресценции акцепторов при этом достигают 4–5 единиц [3,4].

Целью настоящей работы было исследование механизмов переноса энергии от КТ к водорастворимым порфиринам. Нами было показано, что квантовые точки и порфирины способны образовывать гибридные комплексы с эффективным переносом энергии. Перенос энергии от КТ позволяет значительно повысить поглощающую способность порфиринов в ультрафиолетовой и видимых областях спектра. В работе использовали отрицательно заряженные квантовые точки двух типов: CdSe/ZnS покрытые оболочкой и CdTe без оболочки, а так же два вида порфиринов: отрицательно заряженный TPPS4 и положительно заряженный TMPyP.

Для исследования миграции энергии записывались спектры стационарной флуоресценции, а так же измерялись характерные времена затухания флуоресценции, что, согласно теории Штерна-Фолмера позволяет различить статическое и динамическое тушение. Исходя из полученных значений констант динамического тушения были сделаны расчеты эффективного расстояния между донором и акцептором, согласно теории Фёрстера.

1. Олейников В.А., Суханова А.В. Набиев И.Р., Российские нанотехнологии, 200, 2(1–2), 2. Leatherade C.A., Woo W.K., Mikulec F.V., Bawendi M.G., J. Phys. Chem. B., 2002, 106,  3. Nabiev I., Rakovich A., Sukhanova A., Lukashev E., Zagidullin V., Pachenko V., Rakovich YP., Donegan J.F., Rubin A.B., Govorov A.O., Angew Chem Int Ed Eng, 2010, 49(40), 21 4. Максимов Е.Г., Гостев Т.С., Кузьминов Ф.И., Случанко Н.Н., Стадничук И.Н., Пащенко В.З., Рубин А.Б., Российские нанотехнологии, 2010, 5(№-8), 10 ОПтиМаЛЬнОе СОПРЯЖение СВетОСОбиРаЮщиХ Субантен В СуПеРантенне ФОтОСинтеЗиРуЮщеЙ ЗеЛенОЙ бактеРии Optimal interfacing of subantennae in superantenna of the green photosynthetic анастасия ЗОбОВа, андрей ЯкОВЛеВ, Владимир нОВОДеРеЖкин, НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ имени М.В. Ломоносова, Москва,119991, Россия;

E-mail: [email protected] ; [email protected].

Настоящая работа продолжает цикл исследований стратегии эффективного функционирования природных светособирающих антенн в соответствии с нашей концепцией жесткой оптимизации структуры фотосинтезирующего аппарата по функциональному критерию [1]. Проведенные исследования позволили разработать модели оптимального сопряжения однородных субантенн в неоднородных суперантеннах, что обеспечивает высокую эффективность функционирования всей суперантенны в целом [2,3]. Целенаправленный поиск в суперантенне фотосинтезирующих зеленых бактерий Chloroflexus (Cf.) aurantiacus теоретически предсказанных структурных факторов, оптимизирующих функционирование этой суперантенны [2], позволил разработать модель ориентации диполей БХл а-субантенны Б98 базовой пластинки хлоросомы, оптимально сопрягающей экстрамембранную хлоросомную БХл с-субантенну Б40 с мембранной БХл а-субантенной Б808-866, связанной с реакционными центрами Cf. aurantiacus. Модельные расчеты, проведенные для одиночной хлоросомы Cf. aurantiacus, показали, что в суперантенне Cf. aurantiacus оптимальное сопряжение однородных субантенн Б40, Б98 и Б808, достигающееся оптимизацией неизвестной ориентации диполей Qy-переходов БХл а субантенны Б98, приводит к устойчивой минимизации времени переноса энергии Б40Б98Б808. Полученные данные соответствуют теоретической модели оптимальной одноосной ориентации БХл а-диполей, хаотично ориентированных вокруг нормали к мембране с углом наклона к плоскости мембраны опт 54°. Найденная теоретически модель оптимальной ориентации диполей Qy-переходов молекул мономерного БХл а субантенны Б98 в суперантенне Cf. aurantiacus экспериментально подтверждена методом дифференциальной поляризационной абсорбционной спектроскопии с фемтосекундным разрешением. С помощью полученной нами теоретической зависимости стационарного значения параметра анизотропии поглощения от угла наклона диполей БХл а к плоскости мембраны при хаотичной ориентации этих диполей вокруг нормали к мембране было определено, что векторы дипольных моментов Qy-переходов БХл а субантенны Б98, хаотично ориентированные вокруг нормали к мембране, образуют с плоскостью мембраны угол = 54,°, то есть 35,3° – с нормалью к мембране, что хорошо соответствует теоретически предсказанному оптимальному значению опт 54°.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ.

1. З.Г. Фетисова, М.В. Фок. Молек. Биол., 1984, 18, 1651-1656.

2. А.В. Зобова, А.Г.Яковлев, А.С.Таисова, З. Г.Фетисова. Молек.Биол., 2009,43, 464-482.

3. А.В. Зобова, А.С. Таисова, З.Г. Фетисова. Доклады Акад. Наук, 2010, 433, 122-125.

иССЛеДОВание МетОДОМ ВР-ЭПР ВОЗМОЖнОСти ПРЯМОГО ЗаСеЛениЯ тРиПЛетнОГО СОСтОЯниЯ В иЗОЛиРОВаннЫХ Direct population of the triplet state of isolated carotenoids: TR-EPR investigation кЛенина и. б., МаХнеВа З. к., МОСкаЛенкО а.а., ПРОСкуРЯкОВ и. и.

Институт Фундаментальных Проблем Биологии РАН, Пущино, Московская область, 142290, Россия E-mail: [email protected]; Тел: +-926-883-66- Неотъемлемыми элементами любой фотосинтетической системы являются реакционный центр (РЦ), где происходит первичное разделение зарядов, и светособирающая антенна, служащая для более эффективного сбора энергии света. Трансмембранные белки антенны содержат молекулы хлорофиллов и каротиноидов (Кар). Энергия поглощенного кванта передаётся по цепи этих пигментов в РЦ.

Прямое заселение триплетного состояния каротиноидов антенны представляется весьма маловероятным. При поглощении фотона, Кар переходит в возбуждённое синглетное состояние, время жизни которого (110 пс) слишком мало для протекания интеркомбинационной конверсии и, следовательно, образования триплетного состояния 3Кар.

Нами, методом ЭПР высокого временного разрешения, была проделана серия экспери-ментов по измерению фотоиндуцированных состояний различных каротиноидов, выделенных из антенного комплекса фототрофной бактерии A. minutissimum. Практически во всех образцах наблюдались (см. рисунок) характерные спектры ЭПР триплетного состояния, параметры которых позволили идентифицировать их как триплеты Кар.

По результатам анализа полученных спектров был сделан вывод о прямом заселении триплетных состояний каротиноидов по механизму синглет-триплетного деления возбуждения.

Авторы выражают благодарность фонду РФФИ (грант 09-04-00925) за финансовую поддержку.

ЭнеРГиЯ СВЯЗи ВОДЫ и ПеРОкСиДа ВОДОРОДа С МОЛекуЛОЙ Energy of interaction of water and hydrogen peroxide with chlorophyllide molecule, Геннадий кОМиССаРОВ1, антон ЛОбанОВ1, николай СМиРнОВ2, Учреждение Российской академии наук Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН, Москва, 119991, Россия;

E-male: [email protected]; [email protected] Российский федеральный ядерный центр Научно-исследовательский институт технической физики им. Е.И. Забабахина, Снежинск,4560, Россия Для протекания фотохимической реакции в гетерогенной системе (к таковой относится хлоропласт), необходимо предварительно связать (адсорбировать) субстрат реакции с пигментом. В концепции фотосинтеза, изложенной в [1], в качестве субстрата реакции, приводящей к выделению молекулярного кислорода и образованию протонов выступает не вода, а пероксид водорода (ПВ) экзо- и эндогенного происхождения. Для квантовохимических расчетов энергии связи как пероксида водорода, так и воды с пигментом, изменяющим свое агрегатное состояние (мономер, димер и тример) мы обратились к хлорофиллиду а (Хд), поскольку участие фитольного гидрофобного заместителя основного фотосинтетического пигмента хлорофилла в этом взаимодействии, как показали расчеты, несущественно. Расчеты были выполнены с использованием программы Gaussian 03 с набором базисных функций 6-31G** в DFT-приближении с применением обменно-корреляционного функционала PBE1PBE.

Наиболее предпочтительное место координации как молекулы ПВ, так и воды, расположено в окрестности центрального иона магния. Энергия связи при этом, как минимум на 40% больше по сравнению с иной локализацией.

В случае мономерного Хд для ПВ она составляет 1,19 ккал/моль, для воды – 19,42 ккал/моль.

На основании расчетов были определены наиболее термодинамически устойчивые конфигурации димеров и тримеров Хд, для которых были рассчитаны энергии связи с водой и ПВ, помещенными либо внутрь ассоциата, либо с внешней стороны одного из макроциклов. В первом варианте координации энергетически выгоднее взаимодействие с ПВ, – на 2,6 ккал/моль, тогда как во втором случае энергетический выигрыш незначителен, – около 0,1 ккал/моль.

Координация ПВ по внешнему положению тримера Хд предпочтительнее по сравнению со связыванием молекулы воды на 0,8 ккал/моль, а внутри тримера Хд – на 2,0 ккал/моль. Отметим, что связывание ПВ выгоднее и с менее стабильными ассоциатами Хд, в отдельных случаях на 4,0 ккал/моль.

Таким образом, степень ассоциации фотосинтетического пигмента существенна для связывания с ним молекул как ПВ, так и воды.

Работа выполнена при финансовой поддержке Международного научнотехнического центра (проект 3910).

1. Комиссаров Г.Г. Фотосинтез: физико-химический подход. М.: Едиториал УРСС, 2003. 224 с.

ЭЛектРОГеннЫе РеакЦии на ДОнОРнОЙ СтОРОне ФОтОСиСтеМЫ Electrogenic reactions on the donor side of photosystem куРаШОВ В.н., ПетРОВа и.О., МаМеДОВ М.Д., СеМёнОВ а.Ю.

НИИ Физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Ленинские горы 1, стр. 40, Россия E-mail: [email protected], тел: + (495) 939-31- Одной из наиболее актуальных проблем в изучении функционирования фотосистемы 2 (ФС 2) является выяснение механизма переноса зарядов на донорном участке фермента, включающем кластер Mn4Ca, его лигандное окружение и близлежащий тирозин YZ. Перспективным подходом в этих исследованиях является изучение механизма генерации трансмембранной разности электрических потенциалов (DY) комплексами ФС 2 в условиях однократного срабатывания фермента, что существенно облегчает интерпретацию наблюдаемых явлений по сравнению со стационарными процессами.

При добавлении экзогенного Mn2+ к препаратам ФС 2, лишенным марганцевого кластера было продемонстрировано наличие дополнительной электрогенной фазы, обусловленной восстановлением редокс-активного радикала тирозина (YZ·) от Mn. Обнаружено, что электрогенный характер восстановления тирозина YZ· не является специфичным для марганца, а имеет место и в случае искусственных доноров электронов, таких как 1,5-дифенилкарбазид, N,N,N’N’-тетраметилn-фенилендиамин и 2,6-дихлорфенолиндофенол. Наблюдаемый электрогенез был приписан векторному переносу электрона от границы белок-вода к YZ·.

В случае низкомолекулярных искусственных доноров электронов, таких как гидроксиламин и гидразин, также наблюдалось восстановление редоксактивного радикала тирозина, однако дополнительная электрогенная стадия отсутствовала. Это позволило предположить, что подобные соединения могут диффундировать через каналы на донорной стороне белка к марганец-связывающему сайту с последующим восстановлением YZ·.

ПеРВичнЫЙ ПеРенОС ЭЛектРОна В МутантнЫХ РеакЦиОннЫХ ЦентРаХ RHODOBACtER SPHAEROIDES С ЗаМещеннЫМи ЛиГанДаМи атОМОВ МаГниЯ МОнОМеРнЫХ бактеРиОХЛОРОФиЛЛОВ Primary electron transfer in Rhodobacter sphaeroides mutant reaction centers with substituted ligands to the Mg atoms of the monomer bacteriochlorophyll molecules Мария ЛеОнОВа, Людмила ВаСиЛЬеВа, антон ХМеЛЬниЦкиЙ, Институт фундаментальных проблем биологии РАН, Пущино, Московская обл., 1422990, Россия;

E-mail: [email protected]; Fax: 8(496) Фотосинтетический реакционный центр (РЦ) представляет собой трансмембранный пигмент-белковый комплекс, в котором протекает реакция преобразования световой энергии в энергию разделенных зарядов. РЦ пурпурной бактерии Rhodobacter (Rba.) sphaeroides состоит из трех белковых субъединиц и десяти кофакторов переноса электрона, в него также входят молекулы липидов и воды. Кофакторы образуют 2 псевдосимметричные ветви (А – активную, и В – неактивную). Перенос электрона представляет собой многоступенчатый процесс, на первом этапе которого происходит передача электрона от первичного донора, возбужденного димера БХл Р*, на первичный акцептор, мономерный БХл ВА, с образованием состояния с разделенными зарядами P+BA-. Известно, что белковое окружение кофакторов оказывает значительное влияние на направление и скорости электронного транспорта. Аминокислотный остаток His L153 служит лигандом к атому Mg БХл ВА. В данной работе исследованы мутантные РЦ Rba. sphaeroides, в которых, в результате замещения данной аминокислоты, произошли значительные изменения в структуре и функциональной активности. Замена гистидина L153 на тирозин приводит к дестабилизации РЦ и к уходу из комплекса молекулы БХл ВА. И как следствие – к 14-ти кратному снижению квантового выхода образования состояния с разделенными зарядами Р+QA-. Дополнительная мутация, замена гистидина М182 на лейцин, становится причиной появления БФео ФВ в сайте связывания БХл ВВ. Показано, что в РЦ с двойной мутацией электрон от первичного донора передается только на молекулу ФВ неактивной цепи кофакторов, и образуется состояние с разделенными зарядами P+ФВ-, которое за времена порядка 180 пс рекомбинирует в основное состояние.

Работа была поддержана грантом РФФИ (09-04-00109-а), Программой Президиума РАН МКБ, Грантом Президента РФ № НШ 3201.2010.4 и Министерством образования и науки РФ (ГК №02.40.11.0293).

ЭЛектРОГеннЫе РеакЦии В кОМПЛекСаХ ФОтОСиСтеМЫ Electrogenic reactions in photosystem II complexes М.Д. МаМеДОВ, В.н. куРаШОВ, и.О. ПетРОВа, а.Ю. СеМенОВ НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ 119992 Москва, Ленинские горы, Россия; email: [email protected] На протеолипосомах с помощью прямого электрометрического метода проведено систематическое исследование электрогенных реакций, связанных с переносом зарядов в комплексах фотосистемы 2 (ФС 2) из шпината. Показано, что основной вклад в генерацию трансмембранной разности электрических потенциалов обусловлен: (1) разделением зарядов между первичным донором электронов Р680 и хинонным акцептором QA; (2) восстановлением фотоокисленного Р680 от редокс-активного аминокислотного остатка тирозина YZ; (3) протонированием дважды восстановленного вторичного хинонного акцептора QB и (4) реакциями, обусловленными S1S2, S2S3 и S3S4S0 редокс-переходами комплекса окисления воды ФС 2.

Исследование быстрой кинетики генерации фотоэлектрического ответа в ядерных комплексах ФС 2, лишенных Mn4Ca кластера и трёх периферических белков, в присутствии искусственных доноров электронов, а также синтетических трехъядерных марганцевых комплексов продемонстрировало появление дополнительной более медленной фазы генерации мембранного потенциала.

Было заключено, что дополнительный электрогенез обусловлен векторным переносом электрона от границы белок-вода к фотоокисленному радикалу YZ.

МОЛекуЛЯРнО-ДинаМичеСкОе МОДеЛиРОВание ПРОЦеССОВ ПеРенОСа ЭЛектРОна В ФОтОСиСтеМе I ЦианОбактеРиЙ Molecular dynamic simulation of electron transfer in cyanobacterial Photosystem I Георгий МиЛанОВСкиЙ1, Дмитрий чеРеПанОВ2, алексей СеМенОВ Факультет биоинженерии и биоинформатики МГУ, Москва, E-mail: [email protected]; тел.: +-903-2-60- Институт физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН, Москва.

НИИ Физико-химической биологии им А.Н. Белозерского МГУ, Москва.

Кофакторы реакционных центров фотосистем (ФС) 1 и 2, необходимые для осуществления переноса электрона, гомологичны друг другу, однако их среднеточечные редокс-потенциалы отличаются более чем на 00 мВ. Можно предполагать, что разница в их свойствах обусловлена белковым окружением, однако детали этой зависимости до сих пор неясны. Недавно было показано, что у мутантных штаммов цианобактерий Synechocystis sp. PCC 6803 с точечными заменами метионинов M688PsaA и M688PsaВ на аспарагины (M688NPsaA и M668NPsaВ, соответственно) в ФС 1 перенос электронов идет преимущественно по ветви А из двух симметричных ветвей редокс-кофакторов [1]; при этом скорость первичных стадий разделения зарядов существенно замедляется по сравнению с диким типом. С другой стороны, недавно было продемонстрировано, что перенос электронов между димером хлорофилла Р00 и первичным хлорофильным акцептором А0 в ФС 1 из цианобактерии Synechocystis sp. PCC происходит за время короче 100 фс, т.е. в 10–100 раз быстрее, чем предполагалось ранее [2].

Для выяснения возможных механизмов, обуславливающих сверхбыстрое первичное разделение зарядов, выявления асимметрии этого процесса и влияния на него мутаций в ближайшем окружении хлорофилла А0, на основании трехмерной структуры ФС 1 дикого типа Synechococcus elongatus и мутантов M688NPsaA и M668NPsaВ впервые была построена полная молекулярно-динамическая модель, на которой симулировались процессы образования первичной (Р00+А0-) и вторичной (Р00+А1-) ион-радикальных пар. Было обнаружено, что внесение мутации M688NPsaA повышает по сравнению с диким типом энергию реорганизации системы в процессе разделения зарядов по ветви А, что может повлечь за собой повышение энергии активации реакции переноса электрона и тем самым объяснить ее замедление, наблюдаемое экспериментально. Было также продемонстрировано, что перенос электрона по ветвям редокс-кофакторов А и В существенно неравнозначен энергетически.

Были построены осцилляционные спектры системы в незаряженном состоянии, а также на промежуточных стадиях переноса электрона, которые согласуются со спектрами, наблюдаемыми при сверхбыстрой спектроскопии, и могут быть использованы для построения количественной модели переноса электрона в ФС 1.

1. Savitsky A., Gopta O., Mamedov M., Golbeck J.H., Tikhonov A., Mbius K., Semenov A. Appl Magn Reson, 2010, 3, 2. Shelaev I.V., Gostev F.E., Mamedov M.D., Sarkisov O.M., Nadtochenko V.A., Shuvalov V.A., Semenov A. Yu., Biochim. Biophys. Acta, 2010, 19(8), 1410.

тРиПЛетнОе СОСтОЯние ХЛОРОФиЛЛа d: ФОСФОРеЦенЦиЯ Chlorophyll d triplet state: phosphorescence and generation of singlet oxygen к. В. неВеРОВ1,2, С. СантабаРбаРа3, а.а. кРаСнОВСкиЙ1, Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН, 11901 Москва, Ленинский пр-т, [email protected] Биологический факультет МГУ имени М.В.Ломоносова, 119992 Москва, Воробьёвы Горы, д.1, стр.12.

Институт биофизики, Национальный Совет Научных Исследований,20133, у.

Челория 26, Милан, Италия Хлорофилл d (Хл d) – основной фотосинтетический пигмент антенных комплексов у одноклеточной цианобактерии Acariochloris marina. Хл d обнаружен также в реакционных центрах (РЦ) фотосистем 1 и 2 у этого организма, что указывает на особенности первичных фотосинтетических процессов в РЦ подобного типа. В то время, как фотофизические свойства Хл а в настоящее время хорошо изучены, многие фотофизические параметры Хл d, существенные для его фотохимической активности, ещё недостаточно исследованы.

В данной работе мы изучали триплетное состояние Хл d, которое заселяется в результате конверсии из синглетно-возбужденного состояния. Впервые была зарегистрирована и исследована низкотемпературная ( К) фосфоресценция, сопровождающая излучательную дезактивацию триплетно-возбуждённых молекул Хл d. Были получены данные об энергии триплетного состояния и его времени жизни в замороженных эфирных и водно-детергентных (2% Тритон Х 100) растворах Хл d. Главный максимум фосфоресценции при  К находился при 98 нм (полуширина пика 6 нм), что соответствует величине энергетического уровня триплетного состояния в 1,26 eV.

Нами было показано, что при комнатной температуре при освещении растворов Хл d также происходит эффективное заселение его триплетного состояния, что в аэробных условиях приводит к образованию синглетного молекулярного кислорода. Квантовый выход фотосенсибилизированной Хл d генерации синглетного кислорода составил в гексафторбензоле 65%. Это значение близко тем, что были получены ранее для Хл а и феофитина а в органических водно-детергентных средах, что позволяет предположить возможность активного участия триплетных молекул Хл d в фотоокислительных процессах, являющихся причиной фотоингибирования фотосинтетического аппарата у Хл dсодержащих организмов.

РекОнСтРукЦиЯ кОМПЛекСа ОкиСЛениЯ ВОДЫ В ЯДеРнЫХ кОМПЛекСаХ ФОтОСиСтеМЫ 2, ЛиШеннЫХ МаРГанЦа, IN VItRO In vitro reconstruction of the water-oxidizing complex in manganese-depleted core и.О. ПетРОВа, В.н. куРаШОВ, а.Ю. СеМенОВ, М.Д. МаМеДОВ 119991, г. Москва, ГСП-1, Ленинские горы МГУ 1, НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского E-mail: iopetrova1@gmail.com, Тел.: 89060 С помощью метода измерения переменной флуоресценции было исследовано функционирование ядерных комплексов фотосистемы 2 из шпината в растворе и в липосомах. Липидные везикулы готовились из фосфолипидов сои (азолектин) или смеси липидов тилакоидов шпината. По сравнению с интактными ядерными комплексами ФС 2, демонстрирующими две различные фазы флуоресценции, обозначаемые O-J и J-P, в случае препаратов, лишенных марганца в растворе и в протеолипосомах, наблюдалось полное подавление J-P фазы. Возрастание фазы J-P в присутствии экзогенного MnCl2 (4 Mn/RC) свидетельствует о частичном восстановлении кислород-выделяющей активности ФС 2. Фаза J-P, наблюдавшаяся в растворе, имела характерное время ~320 мс, а в препаратах ФС 2, встроенных в липосомы, эта фаза ускорялась до ~20 мс в случае азолектина и до ~9 мс в случае смеси тилакоидных липидов. Эти данные показывают, что липидное окружение увеличивает относительную скорость выделения кислорода. Отметим, что скорость выделения кислорода в образцах ФС 2 в растворе и в протеолипосомах составляла 60% и 0% по отношению к интактной ФС 2, соответственно. По-видимому, стимулирующее действие липидов на реконструкцию комплекса окисления воды основано на поддержании оптимальной структуры белка ФС 2.

ВЛиЯние аМинОкиСЛОтнЫХ ЗаМен к223е и к226е В беЛке PsbO ФОтОСиСтеМЫ 2 на СтабиЛЬнОСтЬ и ФункЦиОнаЛЬнуЮ актиВнОСтЬ ВОДООкиСЛЯЮщеГО кОМПЛекСа Effect of K223E and K226E amino acid substitutions in PsbO protein of the Photosystem II on the stability and functional activity of the water-oxidizing complex алексей ПиГОЛеВ, Дмитрий тиМОШеВСкиЙ, Вячеслав кЛиМОВ Институт фундаментальных проблем биологии РАН, Пущино, Московская область, 142290, Россия;

E-mail: [email protected] Основная роль белка PsbO в процессе окисления воды заключается в стабилизации Mn-кластера. Расположенный на донорной стороне ФС-2, PsbO закрывает неорганическое ядро водоокисляющего комплекса (ВОК) и ограничивает сайт окисления воды от внутритилакоидного пространства. В силу своего положения PsbO может регулировать доступ таких кофакторов как хлор, кальций, бикарбонат к ВОК и обеспечивать их удержание рядом с Mn-кластером.

Кроме того, PsbO может участвовать в отведении протонов из зоны реакции, формируя канал для удаления H+. Анализ структуры белка позволяет выделить ряд аминокислотных остатков, которые могут формировать гидрофильный канал, соединяющий люмен и ВОК. На люменальной стороне, в его формировании может принимать участие остатки Lys 223 и 226 последовательности LGAKPPK. Чтобы проверить данное предположение на основе клеток штамма DpsbO Chlamydomonas reinhardtii были созданы мутанты водорослей с заменой лизина на глутаминовую кислоту – К223Е и К226Е. Выявлено, что смена заряда в результате мутации К226Е приводит к нарушению стабильности белка и развитию DpsbO фенотипа (отсутствие фотоавтотрофного роста и фотосинтетической активности ФС-2). В случае с К223Е экспрессия белка нарушена не была. Клетки мутанта К223Е были способны к фотоавтотрофному росту и фотосинтетическому выделению кислорода. Однако, в сравнении с контролем скорость выделения кислорода и отношение Fv/Fm (характеризующего эффективность преобразования энергии в ФС-2) были снижены на 15–20 %. Также было увеличено время темновой релаксации переменной флуоресценции (Fv) в присутствии диурона, что указывает на нарушение в работе водоокисляющего комплекса (ВОК). В целом, исследование показывает важность аминокислотных остатков К223 и К226, расположенных на люменальной поверхности белка PsbO, для активности ВОК.

РаДикаЛЬнЫе ПаРЫ и тРиПЛетЫ РеакЦиОннЫХ ЦентРОВ и Radical pairs and triplets of reaction centers and light-harvesting antennae Институт фундаментальных проблем биологии РАН, Пущино, Московская область, 142290, Россия;

E-mail: [email protected]; Tel.: +8-496- В процессах передачи энергии в светособирающих антеннах и фотоиндуцированного переноса электрона в реакционных центрах фотосинтеза образуются и исчезают парамагнитные состояния молекул. Времена жизни таких состояний перекрывают по крайней мере 14 порядков, от 10-13 с до 10 с. Интервал 10-–10-3 с доступен для изучения с помощью метода ЭПР высокого временного разрешения (ВР-ЭПР). В докладе будет представлен обзор собственных и литературных данных по исследованию первичных процессов фотосинтеза указанным методом.

Возможности ВР-ЭПР иллюстрирует регистрация сигналов радикальной пары [P+I-] бактериальных реакционных центров, время жизни которой в условиях ЭПР эксперимента составляет около 30 нс. Спектральные свойства РП дают информацию о взаимодействиях составляющих ее молекул. Более простой объект исследования – это радикальная пара [P+QA-], время рекомбинации которой около 30 мс. Изучение ее спектров также дает информацию о взаимодействиях партнеров РП. Кроме того, с использованием возбуждения линейно-поляризованным светом (создание условий магнетофотоселекции) удается получить информацию о структурной организации этой радикальной пары.

Данное обстоятельство имеет достаточно принципиальное значение, поскольку позволяет подтвердить рентгеноструктурные данные об ориентации молекулы QA в бактериальных реакционных центрах.

Триплетные состояния хлорофилльных пигментов в процессе фотосинтеза возникают в процессах, приводящих к потерям энергии. Тем не менее, локализуясь на молекулах, участвующих в переносе энергии и электронов, они несут информацию о взаимодействиях этих молекул, их природе и, в конечном счете, о механизмах первичных процессов. Метод ВР-ЭПР играет в исследовании триплетных состояний особую роль. Кроме данных о природе молекул-носителей триплетов он в ряде случаев позволяет получить сведения о механизме заселения триплетного состояния. В докладе будет рассказано о результатах изучения триплетных состояний бактериальных реакционных центров, как в условиях прерванного переноса электрона, так и при нормальном функционировании электронного транспорта.

Будут приведены данные по изучению триплетных состояний РЦ фотосистемы 2, где генерация триплетов хлорофилла подавляется даже в условиях прерывания переноса электрона. Генерация данных состояний в фотосистеме 2 особенно нежелательна из-за высокой вероятности дальнейшего переноса энергии на молекулу кислорода с образованием синглетно-возбужденного кислорода. Будут также обсуждаться последние данные о прямом заселении триплетных состояний каротиноидов в светособирающих комплексах некоторых пурпурных бактерий – процесса, до последнего времени считавшегося запрещенным по спину.

Работа было поддержана грантами РФФИ 02-04-48850а, 05-04-49129а, 09-04-00925а.

аСиММетРиЯ ПеРВичнЫХ СтаДиЙ ПеРенОСа ЭЛектРОнОВ В кОМПЛекСаХ ФОтОСиСтеМЫ 1 иЗ ЦианОбактеРиЙ Asymmetry of the primary stages of electron transfer in Photosystem I complexes from алексей СеМенОВ1, иван ШеЛаеВ2, Федор ГОСтеВ2, Махир МаМеДОВ1, Олег СаРкиСОВ2, Владимир ШуВаЛОВ1, Джон ГОЛЬбек3, Виктор наДтОченкО НИИ физико-химической биологии им А.Н. Белозерского МГУ, Москва, Россия E-mail: [email protected] ; тел.: 495-939- Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН, Москва, Россия The Pennsylvania State University, University Park, PA, USA.

С помощью импульсной фемтосекундной спектрометрии исследован вопрос о степени асимметрии переноса электрона по ветвям редокс-кофакторов в реакционных центрах (РЦ) фотосистемы (ФС) 1. С этой целью во временном диапазоне от 20 фс до 200 пс было проведено сравнительное исследование дифференциальных кинетических спектров комплексов ФС 1, выделенных из цианобактерий Synechocystis sp. PCC 6803 дикого типа и из мутантных штаммов с точечными заменами аксиальных лигандов к первичному акцептору А0 (метионинов M688PsaA и M688PsaВ на лейцины в каждой из симметричных ветвей кофакторов А и В, обозначаемых далее как AML и BML).

Рассмотрение дифференциальных спектров при различных временных задержках относительно возбуждающего импульса показало, что структура Qy-полосы в комплексах ФС 1, выделенных из цианобактерий дикого типа и из мутанта BML имеет близкий мотив – на субпикосекундных временах наблюдается дублет двух пиков выцветания. Положение этих пиков совпадает с пиками поглощения первичного донора Р00 (около 03 нм) и первичного акцептора электронов А0 (около 690 нм). Ранее такая спектральная особенность была приписана нами сверхбыстрому (200 пс.

Полученные данные показывают, что аналогичные мутации по аксиальным лигандам к первичному акцептору А0 в симметричных ветвях редокс-кофакторов А и В неравнозначны. Таким образом, можно заключить, что перенос электронов в ФС 1 цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803 происходит преимущественно по цепи А.

1. Shelaev I.V., Gostev F.E., Mamedov M.D., Sarkisov O.M., Nadtochenko V.A., Shuvalov V.A., Semenov A.Yu., Biochim. Biophys. Acta, 2010, 19, 1410.

ПОЛОСЫ ПеРенОСа ЗаРЯДа В СПектРаХ ПОГЛОщениЯ ХЛОРОФиЛЛОВ ПРи ВЗаиМОДеЙСтВии С акЦеПтОРаМи ЭЛектРОна IN VItRO и В ПРиРОДнОМ ФОтОСинтеЗе The charge transfer bands in chlorophyll absorption spectra at interaction with electron Институт фундаментальных проблем биологии РАН, г. Пущино, Московская обл., Россия, тел.: (496)3-3-18, Факс: (496)33-05-32, E-mail: [email protected] За последние годы в исследованиях структуры фотосинтетических реакционных центров (РЦ) и первичных фотореакций получены впечатляющие успехи [1]. Однако некоторые принципиально важные вопросы, в частности, поглощение с переносом заряда в хлорофилловых системах еще не выяснены окончательно, и для их решения используются различные подходы, в том числе физико-химическое моделирование [2].

В данном сообщении представлены результаты наших исследований комплексов с переносом заряда (КПЗ) природных (хлорофилл а, хлорофилл b, феофитин а, бактериохлорофилл а, бактериохлорофилл с) и синтетических (Zn-, Cd-, Fe-, Ni- феофитины, Mg – октаэтилпорфин, Zn - октаэтилхлорин) тетрапиррольных пигментов с тетрацианхинодиметаном (ТЦХ), тетрацианэтиленом (ТЦЭ) и другими акцепторами электрона, методами спектрофотометрии, флуориметрии, ЯМР. Рассмотрена также возможность протекания аналогичных процессов в природном фотосинтезе.

В растворах природных и синтетических тетрапиррольных пигментов (10-5М) в хлороформе при введении акцепторов (ТЦХ, ТЦЭ; 10-3М) и понижении температуры наблюдается образование КПЗ с появлением новых полос поглощения в области 1000–1500 нм. Положение полосы определяется выражением:

где: j1/2 – потенциал окисления пигмента, j1/2red – потенциал восстановох ления акцептора, Ер – энергия поляризации среды вокруг диполя.

В соответствии с (1) развиваются представления о том, что длинноволновые полосы поглощения в димерах пигментов (экситонное поглощение) in vitro (димеры по Евстигнееву в неполярных высушенных растворителях; ковалентно связанные димеры хлорофилл/хлорофилл, ковалентно связанные димеры хлорофилл/феофитин) и в димерных структурах в природном фотосинтезе (Р00 в РЦ фотосистемы 1, Р680 в РЦ фотосистемы 2, специальные пары в бактериальных РЦ) являются полосами переноса заряда, где одна молекула пигмента служит донором, а другая акцептором электрона в зависимости от стереоконфигурации и условий окружения. Расчетное время переноса заряда (электрона), соответствующее полосам поглощения 680–00 нм и 1000– 1500 нм, составляет 2–5 фемтосекунд. Не исключается также возможность образования в РЦ КПЗ большого радиуса (по Борисову) с вовлечением более двух сопряженных p-систем молекул пигментов.

1. T.J. Wydrzynski, K. Sato (Eds), Advances in Photosynthesis and Respiration. V. 22. Springer, Dordrecht, 2005.

2. Креславский В.Д., Садовникова Н.А., Оловянишникова Г.Д., Столовицкий Ю.М. Ж. физ. хим. 1993. Т. 6.

иДентиФикаЦиЯ ОСнОВнЫХ кОМПОнентОВ баЗОВОЙ ПЛаСтинки ХЛОРОСОМнОЙ СВетОСОбиРаЮщеЙ антеннЫ ЗеЛенЫХ анОкСиГеннЫХ ФОтОСинтеЗиРуЮщиХ бактеРиЙ Identification of main components of a baseplate of chlorosomal light-harvesting antenna of green anoxygenic photosynthetic bacteria belonging to the family Oscillochloridaceae александра таиСОВа1, анастасия ЗОбОВа1, евгений ЛукаШеВ2, наталия ФеДОРОВа1, Людмила баРатОВа1, Зоя ФетиСОВа НИИ физико-химической биологии им.А.Н. Белозерского, Биологический факультет, МГУ имени М.В.Ломоносова, 119991 Москва, Россия;

E-mail: [email protected]; Fax: +-495-939-31-81;

Известно, что у зеленых фотосинтетических аноксигенных бактерий семейств Chlorobiaceae и Chloroflexaceae базовая пластинка хлоросом представляет собой пигмент-белковый комплекс, в котором белок CsmA связан с бактериохлорофиллом а (БХл а). В нашей работе проведено изучение пигмент-белкового состава базовой пластинки хлоросом у представителей третьего семейства зеленых бактерий Oscillochloridaceae. Для этих целей мы использовали низкотемпературную флуоресцентную спектроскопию и электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ПААГ с ДДС натрия) подвергнутых щелочной обработке и нативных хлоросом, выделенных из клеток Oscillochloris trichoides. Следует отметить, что наличие в хлоросомах Osc. richoides БХл а было подтверждено с помощью ВЭЖХ. Показано, что щелочная обработка хлоросом Osc.trichoides приводила к исчезновению полосы БХл а в спектрах флуоресценции хлоросом, регистрируемых при температуре  К, но не оказывала существенного влияния на спектральные характеристики главного пигмента хлоросом БХл с как в спектрах поглощения, так и в спектрах флуоресценции подвергнутых щелочной обработке хлоросом. Анализ содержания пигментов в подвергнутых щелочной обработке хлоросомах подтвердил отсутствие в них БХл а. Кроме того, показано, что из всех белков, обнаруживаемых в хлоросомах Osc.trichoides с помощью электрофореза в ПААГ с ДДС натрия, щелочная обработка хлоросом приводила к исчезновению только CsmA белка (5. kDa). Проведенные эксперименты продемонстрировали четкую корреляцию между CsmA белком и хлоросомным БХл а-компонентом, поскольку одновременное селективное исчезновение из хлоросом Osc.trichoides и БХл акомпонента, и белка CsmA возможно только в случае локализации обоих компонентов в периферийной структуре хлоросомы, т.е. вне БХл с-структуры, а, значит, внутри базовой пластинки хлоросомы. Сделан вывод, что в хлоросомах Osc. trichoides CsmA белок ассоциирован с БХл а, и оба указанных компонента локализованы в базовой пластинке хлоросомы. Полученные результаты свидетельствуют о том, что антенна базовой пластинки хлоросом, представляющая из себя комплекс БХл а с ~6 kDa CsmA белком, является универсальным интерфейсом между БХл с субантенной хлоросомы и БХл а субантенной цитоплазматической мембраны у всех трех известных семейств зеленых аноксигенных фотосинтезирующих бактерий.

ОкиСЛитеЛЬнО-ВОССтанОВитеЛЬнОе ВЗаиМОДеЙСтВие Mn-бикаРбОнатнЫХ кОМПЛекСОВ С РеакЦиОннЫМи ЦентРаМи тиПа II иЗ анОкСиГеннЫХ ФОтОСинтеЗиРуЮщиХ бактеРиЙ Redox interaction of Mn-bicarbonate complexes with reaction centers type II from Василий теРентЬеВ, анатолий ШкуРОПатОВ, Валентина ШкуРОПатОВа, Институт фундаментальных проблем биологии РАН, Пущино (Россия).

E-mail: [email protected], тел.: 8-916-842-1-39, факс: 8-496-33-05- Фотосинтетическое образование O2 происходит в результате разложении H2O в водоокисляющем комплексе фотосистемы 2, содержащем неорганическое ядро (Mn-кластер), вопрос о путях эволюционного происхождения которого до сих пор не решен. Было предположено, что бактериальные предшественники первых О2-выделяющих организмов (в Архейский период) могли использовать в качестве доноров электронов Mn2+-бикарбонатные комплексы ([Mn(HCO3)2]), которые затем сформировали примитивный тетра-Mn-кластер на донорной стороне реакционного центра (РЦ) аноксигенных бактерий [1]. Исходя из этого, целью работы было изучить влияние [Mn(HCO3)2] на кинетику темнового ревосстановления фотоокисленного первичного донора электрона (Р+) РЦ типа II аноксигенных бактерий: Rhodobacter sphaeroides R-26, Chromatium minutissimum и Chloroflexus aurantiacus. О ревосстановлении Р+ судили по уменьшению амплитуды полосы выцветания при 865 нм или поглощения при 90 нм (для Ch. minutissimum) дифференциального спектра поглощения «свет–темнота».

В присутствии 0,5 мМ Mn2+ плюс 50 мМ HCO3- (pH 8,3), то есть при доминировании в растворе комплексов [Mn(HCO3)2] с редокс-потенциалом (Em) Mn2+= 0,52 В [2], было показано увеличение скорости ревосстановления Р+ (Em0,5 В) Rb. sphaeroides (время полуспада 1/2100 с) по сравнению с контролем, измеренным в отсутствие добавок (1/2445 с). Стимулирующий эффект пропадал при добавлении Mn2+ (Em(Mn2+aq)=1,18 В) или HCO3- к РЦ отдельно друг от друга, а также при замещении Mn2+ на Mg2+ или Ca2+, или замещении бикарбоната на формиат, оксалат или ацетат, свидетельствуя о специфичности редокс-взаимодействия [Mn(HCO3)2] с Р+. В отличие от Rb. sphaeroides, добавление 0,5 мМ Mn2+ плюс 50 мМ HCO3- к РЦ из Ch. minutissimum, содержащих субъединицу цитохрома, затрудняющего взаимодействие Mn2+ с P+, или к РЦ Cf. aurantiacus с Em0,4 В, не влияло на кинетику темнового ревосстановления P+. Полученные данные рассматриваются в качестве экспериментального подтверждения гипотезы о возможной ключевой роли Mn-бикарбонатных комплексов в эволюционном переходе от аноксигенного фотосинтеза к оксигенному.

1. Dismukes G. C., Klimov, V. V., Baranov, S. V., Kozlov, Y. N., Dasgupta, J., and Tyryshkin, A. (2001) Proc. Natl. Acad.

2. Kozlov Y.N., Zharmukhamedov S.K., Tikhonov K.G., Dasgupta J., Kazakova A.A., Dismukes G.C., and Klimov V.V.

(2004) Phys. Chem. Chem. Phys, 6, 4905.

иССЛеДОВание ПеРВичнЫХ СОбЫтиЙ В ФОтОЦикЛе бактеРиОРОДОПСине МетОДОМ ЭМиССиОннОЙ ик-ФуРЬе Studies of the primary events in bacteriorhodopsin’s photocycle Институт биофизики клетки РАН РАН, Пущино, Московская область, 142290, Россия;

E-mail: [email protected]; Fax: +-096-3-305-09;

Бактериородопсин (БР), интегральный белок пурпурных мембран Halobacterium salinarium функционирует как светозависимая протонная помпа [1–3]. Ретиналь, связанный в центре белка поглощает свет и изомеризуется из all-trans в 13-cis-конформацию. Серия конформационных изменений и перенос протона с последующим восстановлением структуры в all-trans конфигурацию сопровождается запасанием энергии в виде электрохимического потенциала. Механизм, посредством которого БР активируется вслед за поглощением кванта видимого света до сих пор остается все еще неизвестным. В частности, неизвестно когда и как первичные структурные и электронные изменения ретиналя запускают конформационные перестройки белка, которые впоследствии приводят к векторному переносу протона. Согласно основной гипотезе изменения белка происходят вследствие быстрой изомеризации ретиналя вокруг двойной С=С связи и изменения в опсине, вызванные перераспределением заряда в ретинале и его изомеризация запускаются независимо друг от друга, а их сопряжение осуществляется на более поздних стадиях фотоцикла. В то же время взаимодействия между отдельными колебательными модами ретиналя и опсина, в особенности на первичных стадиях фотоцикла из-за отсутствия соответствующей техники практически не изучены.

Ранее первичные процессы в бактериородопсине изучались в основном с использованием «pump-probe» tехники с пико- и фемтосекундным временным разрешением, которые не дают прямой информации о структуре БР. Впервые информация о структуре колебательно-возбужденного ретиналя была получена методом КАРС с фемто- и пикосекундным временным разрешением [4].

Однако Раман спектроскопия, в том числе и КАРС не позволяют проводить наблюдение за изменениями в структуре белковой матрицы БР и не детектируют ретиналь-белковое взаимодействие.

Наше сообщение посвящено использованию разрабатываемого нами метода эмиссионной ИК-Фурье спектроскопии в изучении фотофизических процессов в БР. Демонстрируется возможность метода в определении структуры фотовозбужденного ретиналя и его взаимодействии с белковым окружением, а также в наблюдении каналов распространения колебательной энергии на первичных стадиях фотоцикла БР.

1. Oesterhelt D. аnd Stoeckenius W., Nature, 191, 233, 2. Lozier R. H., Bogomolni R. A., Stoeckenius W., Biophys. J., 195, 15, 3. Mathies R. A., Lin S. W., Ames J. B., Pollard W.T., Annu. Rev. Biophys. Chem., 1991, 20, 4. Atkinson G.H., Ujj L., Zhou Y., J.Phys. Chem. A., 200, 104, ВЛиЯние наПРаВЛеннЫХ МутаЦиЙ на СтРуктуРу ДиМеРа бактеРиОХЛОРОФиЛЛа РеакЦиОннОГО ЦентРа ПуРПуРнОЙ The effect of site directed mutations on the bacteriochlorophyll dimer structure in the reaction center of purple bacteria Rhodobacter sphaeroides татьяна ФуФина1, Людмила ВаСиЛЬеВа1, Равиль ХатЫПОВ1, азат ГабДуЛХакОВ2, татьяна ХМеЛЬниЦкаЯ1, Владимир ШуВаЛОВ Институт Фундаментальных Проблем Биологии РАН, Пущино, ул. Институтская, 2, Институт Белка РАН, Пущино, ул. Институтская, 4, Россия E.mail: [email protected] Фотосинтетические реакционные центры (РЦ) – это мембрансвязанные пигмент-белковые комплексы, в которых осуществляются первичные процессы преобразования световой энергии. РЦ пурпурной бактерии Rba. sphaeroides состоит из 10 кофакторов переноса электрона и трех белковых субъединиц (L, M, H). Кофакторы представлены димером бактериохлорофилла (БХл), который является первичным донором электрона (Р), двумя молекулами мономерных БХл (В), двумя молекулами бактериофеофитина (БФео), двумя хинонами, молекулой каротиноида и атомом негемового железа. Отличительной особенностью РЦ является наличие двусторонней оси симметрии, относительно которой расположены активная (А) и неактивная (В) ветви переноса электронов. Белковые субъединицы не только представляют собой остов, поддерживающий компоненты РЦ в определенной ориентации, но и принимают непосредственное участие в процессе переноса электрона Целью работы было исследование влияния аминокислотных замещений вблизи молекул первичного донора электрона на свойства РЦ Rbа. sphaeroides.

Методом сайт-направленного мутагенеза были получены РЦ Rbа.

sphaeroides с аминокислотными замещениями I(L1)H, I(L1)H+H(L13)L, L(M196)H; L(M196)H+H(M202)L, I(M206)H+H(M202)L. Было отмечено, что в генетически модифицированных РЦ наиболее выраженные изменения спектральных и фотохимических свойств произошли в области поглощения молекул БХл специальной пары.

Была исследована стабильность структуры димера бактериохлорофилла.

Установлено, что изменение положения лигандов атома магния молекул БХл Р может приводить к изменению положения молекул специальной пары относительно друг друга.

Для РЦ L(M196)H+H(M202)L и L(M196)Н получены кристаллы и определена трехмерная структура комплекса с разрешением 3,2 и 3,1, соответственно.

Работа проводилась при финансовой поддержке Федерального агентства по науке и инновациям Российской Академии Наук, программы «Молекулярная и клеточная биология», гранта Президента Российской Федерации № НШ-3201.2010.4, РФФИ 09-04-00109-а. Кристаллографическая часть работы выполнена при финансовой поддержке Российской академии наук и Программы “Молекулярная и клеточная биология” Президиума РАН.

ФеМтОСекунДнЫе ПРОЦеССЫ РаЗДеЛениЯ ЗаРЯДОВ В РеакЦиОннЫХ ЦентРаХ RBA. SPHAEROIDES С иЗМененнЫМ ПОтенЦиаЛОМ ПеРВичнОГО ДОнОРа ЭЛектРОна Processes of charge separation in reaction centers of Rba. sphaeroides with altered midpoint potential of the primary electron donor on a femtosecond scale антон ХМеЛЬниЦкиЙ, Равиль ХатЫПОВ, антон ХРиСтин, Мария ЛеОнОВа, Учреждение Российской академии наук Институт фундаментальных проблем биологии РАН, Пущино, Московская область, 142290, Россия;

E-mail: [email protected]; Fax: +(496)33-05- Методом фемтосекундной спектроскопии исследованы процессы разделения зарядов в четырех различных мутантных реакционных центрах (РЦ) пурпурных бактерий Rba. sphaeroides c увеличенным окислительно-восстановительным потенциалом первичного донора электрона P. Показано, что в РЦ мутанта с тремя аминокислотными заменами (M160LH/M19YH/L131LH) разделение зарядов отсутствует. В РЦ c одиночными заменами (M160LH, M19YH и L131LH) разделение зарядов происходит, но перенос электрона замедлен по сравнению с реакционными центрами дикого типа. Тем не менее, в дифференциальных спектрах РЦ данных мутантов наблюдается образование полосы поглощения анион-радикала мономерного бактериохлорофилла BA- за время затухания стимулированного излучения из P*. Это позволяет сделать вывод о том, что в мутантных РЦ, также как в РЦ дикого типа, молекула BA участвует в процессе переноса электрона на молекулу бактериофеофетина HA в качестве непосредственного интермедиата.

Работа выполнена при финансовой поддержке, Министерства образования и науки Российской федерации, Президиума РАН (программы «Молекулярная и клеточная биология» и «Нанотехнологии и наноматериалы»), Гранта Президента РФ, НШ-3201.2010.4.

ФОтООбРаЗОВание ОРГаничеСкиХ ПеРОкСиДОВ на ДОнОРнОЙ СтОРОне ФС2, не СОДеРЖащеЙ ВОДООкиСЛЯЮщеГО кОМПЛекСа Photoproduction of organic peroxides on the donor side of PS2 not containig андрей ХОРОбРЫХ1, Сергей ХОРОбРЫХ1,2, Денис ЯнЫкин1, борис иВанОВ1, Институт фундаментальных проблем биологии РАН, г. Пущино, Московской обл., 142290, Россия E-mail: [email protected]; Phone: (496) 3-24-48; Fax: (496)33-05- Science Research Center, Yamaguchi University, Yoshida 16-1, Yamaguchi 53-8515, Было изучено фотообразование органических пероксидов в фотосистеме 2 (ФС2) при помощи флуоресцентной пробы Spy-HP. Два типа пероксидов, липофильные и относительно гидрофильные были определены исходя из скорости окисления Spy-HP. Добавление ионов двухвалентного железа, который разлагает пероксиды в реакции Фентона, к препаратам ФС2 после освещения приводило к почти полному изчезновению пероксидов, в то время как каталаза не влияла на уровень пероксидов. Эти результаты подтверждают, что соединения, образующиеся в безмарганцевых препаратах ФС2 представляют собой органические пероксиды.Фотобразование пероксидов было существенно выше в препаратах ФС2 лишенных марганца. Экзогенные доноры электрона (дифенилкарбазида или ферроцианида калия), а также диурон – ингибитор переноса электрона между QA и вторичным QB хинонными акцепторами, почти полностью подавляли фотобразование пероксидов когда были добавлены к препаратам ФС2 до освещения. Экзогенный акцептор электронов, феррицианид калия, подавлял фотообразование пероксидов на 10–20%. Эти данные согласуются с нашими предыдущими результатами о поглощении кислорода на донорной стороне ФС2 и указывают на то, что органические пероксиды образуются донорной стороне ФС2 в результате образования органических радикалов при нарушении донорования электронов к P680.

Освещение (l> 600 нм, 1500 мкмоль фотонов м-2 с-1) безмарганцевых перпаратов ФС2 в течении 3 минут приводило к образованию примерно молекул пероксидов на один реакционый центр. Образование липофильных пероксидов насыщалось при интенсивности света 25 мкмоль фотонов м-2 с-1, что указывает на высокую эффективность этого процесса. Пероксиды, образующиеся на донорной стороне ФС2, вероятно в том числе и несколько видов липидных пероксидов, могут участвовать в фотоингибировании ФС2, в частности, просредством модификации белков продуктами их распада, таких как малоновый диальдегид.

ОбМен ХЛОРОФиЛЛОВ В ПРиРОДнЫХ ПиГМент-беЛкОВЫХ кОМПЛекСаХ и некОВаЛентнОе СВЯЗЫВание Chlorophyll exchange in natural pigment-protein complexes and non-covalent association of chlorophylls with the proteins Институт фундаментальных проблем биологии РАН, Пущино, Московская область, 142290, Россия;

E-mail: [email protected], Fax: +-096--331-34;

Проанализированы литературные данные экспериментов в которых показана возможность обмена экзогенно добавленных хлорофиллов к препаратам хлорофилл-белковых комплексов (ПБК) таких как ФС1, ФС2 и LH II. Сделан вывод и предположение о такой возможности не только в опытах с изолированными препаратами, но и в фотосинтезирующих организмах. Предполагается, что обмен возможен в условиях повреждения пигментов ферментными системами (хлорофиллазами, эстеразами) и фотохимическим окислительным стрессом, когда повреждение пигментов не затрагивает белковую часть комплексов преимущественно в условиях репарации комплексов.

Приводятся собственные данные, подтверждающие возможность обмена молекул хлорофилла в препаратах комплексов и показана ингибирующая роль каротиноидов в этом процессе на примере изолированного комплекса Д1-Д2-цит В559. После полной экстракции каротина из препаратов наблюдалось включение экзогенно добавленного бактериохлорофилла, либо обмен феофитинизированного хлорофилла на добавленный хлорофилл. Условия, такие как концентрация в среде детергентов, рН, ионная сила и природа буфера, способствовали интенсивности обмена. Приводятся данные, полученные модификацией препаратов глутаровым альдегидом и последующей экстракцией из них хлорофиллов. Обнаружено ингибирование экстракции органическими растворителями, мочевиной и детергентами и невозможность обмена хлорофиллов в таких препаратах. Такие комплексы плохо окрашивались белковым красителем Куммасси после их электрофореза в ПААГ, что могло быть следствием экранирования молекулами хлорофилла вакантных мест для красителя в структуре белков.

На основе собственных и литературных данных, предполагается, что генетические модификации белков путем замены аминокислот не способны создать условия для образования ковалентной связи хлорофиллов с белками. Кроме того, малая вероятность такой связи, подтверждается многочисленными мутациями с заменой аминокислот в процессе длительной эволюции фотосинтетических организмов. В случае образования такой связи из-за невозможности обмена поврежденных молекул хлорофилла на его нативные формы, организм вытеснялся отбором. Таким образом, проблема исследования феномена отсутствия ковалентной связи хлорофиллов с белками в природном фотосинтетическом аппарате становится особенно актуальной.

ФеМтОСекунДнаЯ ДинаМика ПеРВичнЫХ ПРОЦеССОВ Femtosecond dynamics of the primary processes in Photosystem иван ШеЛаеВ1, Феодор ГОСтеВ1, Маир МаМеДОВ2, Виктор наДтОченкО1, Олег СаРкиСОВ1, алексей СеМенОВ2, Владимир ШуВаЛОВ Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН, Москва,119991, Россия;

E-mail: [email protected]; Fax: +(499)13835 Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, Москва, 119991, Россия;

Институт фундаментальных проблем биологии РАН, Пущино, Московская область, 142290, Россия.

В последнее время процесс перенос электрона в фотосинтетическом комплексе фотосистема 1 (ФС1) изучается самым активным образом различными спектроскопическими методами, включая такой метод, как фемтосекундная абсорбционная спектроскопия. Однако, ранние стадии процесса переноса электрона в реакционном центре (РЦ) ФС1 крайне сложно выделить от мощного сигнала возбужденного антенного комплекса, который имеет место на тех же временах.

Фемтосекундные эксперименты были выполнены на установке, собранной в Институте химической физики РАН. Процессы разделения зарядов в ФС исследовались с помощью фемтосекундной абсорбционной спектроскопии методом «возбуждение-зондирование». При возбуждении импульсом длительностью 20 фс и несущей длиной волны 20 нм. преимущественно возбуждался первичный донор электрона – димер Р00, находящийся в реакционном центре. Это позволило получить спектр первой ион-радикальной пары P00+A0-A (где A0 – первичный Chl акцептор электрона, а A1 – вторичный филохинонный акцептор) с полосами выцветания 690 и 05 нм на задержке в 100 фс.

Вычитание дифференциальных спектров поглощения ФС1 с закрытым РЦ (состояние P00+A0A1) из дифференциальных спектров поглощения ФС1 с открытым РЦ (состояние P00A0A1) при тех же задержках позволило получить спектр первой ион-радикальной пары P00+A0- в чистом виде. Экспериментальные данные были проанализированы в предположении кинетической схемы:

Aнтенна* (P00*A0A1 P00+A0-A1) P00+A0A1Было обнаружено, что в условиях нашего эксперимента процесс переноса электрона в РЦ ФС1 имеет очень быструю компоненту (10-М). Т.о., радиационная токсичность, в отличие от химической, проявляется при низких концентрациях металлов и характеризуется эффективной активаций, предшествующей ингибированию свечения.

Т.к. в качестве вторичных продуктов радиоактивного распада в водных средах могут образовываться перекисные соединения, рассмотрена их роль при изменении свечения бактерий в растворах радионуклидов. С помощью люминольного хемилюминесцентного метода показано, что содержание перекисей в растворах Am-241 превышает фоновое, а в растворах урана и трития – нет.

Выявлены сходства в кинетике люминесценции бактерий в присутствии Н2О и Am-241 – наличие периодов активации и ингибирования свечения. Т.о., перекисные соединения, вероятно, вносят вклад в воздействие Am-241 на свечение бактерий. Отсутствие перекисей в тритий-содержащих растворах указывает на важную роль и других процессов, увеличивающих ионизацию среды.

От МОЛекуЛЯРнЫХ РОтОРОВ ДО ФОтОДинаМичеСкОЙ теРаПии from molecular rotors to Photodynamic Therapy of cancer Department of Chemistry, Imperial College London, Exhibition Road, SW 2AZ, UK E-mail: [email protected]; URL: http://www3.imperial.ac.uk/people/ m.kuimova Вязкость является одним из основных параметров, определяющих скорость диффузионных процессов. Вязкость играет важную роль в таких клеточных процессах, как передача сигналов, массоперенос, включая направленную доставку соединений, обладающих физиологической активностью. Следует отметить, что в медицинских исследованиях была обнаружена зависимость между изменениями вязкости в клетках и заболеваниями организма. Несмотря на важность определения вязкости в такого рода системах, ее измерение на уровне единичной клетки представляет сложную задачу.

В докладе рассмотрен новый метод измерения вязкости в клетке с помощью флуоресцентных меток, – так называемых, “молекулярных роторов”.

Электронная структура “роторов” такова, что параметры их флуоресценции (время жизни, спектры) сильно зависят от вязкости окружающей среды [1–3].

С помощью этого метода нам удалось показать, что вязкость в разных областях клеточных органелл различна. Одним из наиболее важных результатов стало то, что в гидрофобных органеллах вязкость может достигать 100 сП, то есть, в 100 раз превышать значения в воде и в цитоплазме клетки [1–3]. Такая высокая клеточная вязкость оказывает заметное влияние на скорость диффузионно-контролируемых реакций в клетке и это было экспериментально показано на примере процессов образования и реакций синглетного кислорода O2(a1Dg) в клетках [4].

Показано, что клеточная вязкость значительно возрастает в процессе апоптоза клетки, вызванном облучением при фотодинамической терапии [2]. Увеличение вязкости влияет на кинетику образования и гибели синглетного кислорода в клетке и позволяет контролировать эффективность фотодинамической терапии в вязких средах [5]. В докладе также будет рассмотрено использование молекулярных роторов для двухфотонной фотодинамической терапии [6].

1. M. K. Kuimova, G. Yahioglu, J. A. Levitt, K. Suhling, J. Amer. Chem. Soc., 2008, 130, 66 2. M. K. Kuimova, et al, Nature Chem., 2009, 1, 3. J. A. Levitt, et al, J. Phys. Chem. C, 2009, 113, 4. M. K. Kuimova, G. Yahioglu, P. R. Ogilby, J. Amer. Chem. Soc., 2009, 131, 5. M. K. Kuimova, M. Balaz, H. L. Anderson, P. R. Ogilby, J. Amer. Chem. Soc., 2009, 131,  6. H. A. Collins, et al Nature Photonics, 2008, 2, 420-425;

МеХаниЗМЫ иММунОСуПРеССОРнОГО ДеЙСтВиЯ ПРОДуктОВ ФОтООкиСЛениЯ ПСОРаЛенОВ на РеакЦиЮ кОнтактнОЙ Mechanisms of the immunosuppressive action of psoralen photooxidation products алла кЯГОВа, Светлана ПаВЛОВа, Диана аЛбеГОВа, илья ПЯтниЦкиЙ, Людмила кОЗЫРЬ, наталия ВЛаСОВа, александр ПОтаПенкО Российский Государственный Медицинский Университет, Москва, ул. Островитянова 1, 1199, Россия;

Е-mail: [email protected]; FAX: +-495-246-1- Псораленовая фотохимиотерапия (ПУВА-терапия и фотоферез) успешно используются для лечения ряда кожных и аутоиммунных заболеваний, обусловленных гиперреактивностью Т-клеточного звена иммунитета. Предполагается, что терапевтический эффект псораленовой фотохимиотерапии основан на индукции специфической системной иммуносупрессии. Ранее нами было показано, что продукты фотоокисления псораленов (ФОП), образующихся в ходе фотохимических реакций типа IV, могут вносить вклад в иммуносупрессорное действие псораленовой фотохимиотерапии. Однако, иммунные механизмы супрессорного действия ФОП остались не ясными.

Механизмы иммуносупрессорного действия ФОП были изучены на модели реакции контактной гиперчувствительности (КЧ) к динитрофторбензолу (ДНФБ) у мышей. Показано, что внутривенное или пероральное введение ФОП через 24 часа после сенсибилизации мышей ДНФБ приводило к уменьшению абсолютного количества клеток в регионарных лимфоузлах (ЛУ) и снижению их пролиферативной активности, оцененной по включению радиоактивной метки 3Н-тимидина. Снижение пролиферативной активности лимфоузлов сопровождалось изменением цитокинового баланса: после перорального введения ФОП наблюдалось достоверное уменьшение секреции ИЛИЛ-4 и ИФН (на 38%, 54% и 52%, соответственно) и увеличение на 22% ИЛ-1 клетками регионарных лимфоузлов по сравнению с ДНФБ-сенсибилизированным контролем. Эффект ФОП при его внутривенной инъекции на цитокиновый профиль проявлялся слабее, чем при его пероральном введении.

Изменение цитокинового баланса может свидетельствовать о переключении Th1 и Th2 иммунных ответов в процессе развития КЧ на формирование Th1лимфоцитов при действии ФОП. В опытах по адоптивному переносу спленоцитов от ДНФБ-сенсибилизированных мышей доноров мышам-реципиентам, предварительно сенсибилизированных гаптенами ДНФБ или оксазолоном, обнаружено, что пероральное или внутривенное введение ФОП на афферентной стадии развития КЧ приводит к генерации клеток со специфическими супрессорными свойствами. Методом иммуномагнитной сепарации выявлено, что часть супрессорных клеток, генерированных при действии ФОП in vivo относятся к популяции CD4+-лимфоцитов.

Наши результаты доказывают, что продукты фотоокисления псораленов обладают иммунорегуляторными свойствами и механизмы их иммуносупрессорного действия в основных чертах совпадают с таковыми для ПУВА-терапии и фотофереза.

ВнутРиМОЛекуЛЯРнаЯ ДинаМика тРОМбина иЗ кРОВи чеЛОВека Светлана ЛОЗникОВа1, Дмитрий щеРбин1, александр СуХОДОЛа2, Институт биофизики и клеточной инженерии НАН Беларуси, г. Минск, 22002, Беларусь; ул. Академическая 2 E-mail: [email protected]; Fax: +35-1-284-23-59;

Институт физики им. Б.И. Степанова НАН Беларуси, г. Минск, 22002, Беларусь В настоящее время тромбин является объектом интенсивного изучения в различных областях биологии и медицины. Биологические свойства белков тесно связаны с их конформацией и внутримолекулярной динамикой (ВМД).

В то время как в Protein Data Bank имеется 3D структура тромбина, его ВМД практически остается неизученной.

В работе представлены результаты исследования медленной (миллисекундной) ВМД тромбина из крови человека в растворе методом триптофановой фосфоресценции при комнатной температуре (ТФКТ). Возможность анализа медленной ВМД методом ТФКТ базируется на существовании выраженной зависимости значений времени жизни () фосфоресценции от молекулярной подвижности окружения хромофора и соответствии длительности ТФКТ характерным временам низкочастотных флуктуаций структуры белка в местах локализации триптофанилов [1].

Нами впервые обнаружена способность к ТФКТ тромбина («Sigma», США). Показано, что спектр ТФКТ белка имеет характерный для других триптофаносодержащих объектов вид трезубца с максимумами в областях 41 нм, 445 нм и 465 нм. Кинетика затухания ТФКТ тромбина удовлетворительно аппроксимировалась суммой двух экспоненциальных компонентов с временами жизни быстрого 1 = 80,0±,2 мс, медленного 2 = 341,6±2,9 мс компонентов.

На основании рентгеноструктурных данных файл 1PPB Protein Data Bank с помощью программы «RasMol» проведен анализ особенностей локализации триптофановых остатков тромбина, идентифицированы триптофанилы, ответственные за ТФКТ белка.

Как известно, у подавляющего большинства белков в растворе миллисекундная ТФКТ не регистрируется [1]. Это объясняется эффективным динамическим тушением триптофановой фосфоресценции, обусловленным существованием в белках выраженных тепловых флуктуаций конструкционных элементов глобулы с миллисекундными характерными временами. Лишь в тех относительно редких случаях, когда медленная ВМД белков в растворе существенно заторможена, они проявляют способность к миллисекундной ТФКТ.

Выраженная способность тромбина к ТФКТ свидетельствует о том, что его медленная ВМД существенно ограничена по сравнению с большинством водорастворимых белков.

Таким образом, методом ТФКТ обнаружена высокая конформационная жесткость тромбина, существенно превышающая таковую большинства водорастворимых белков.

1. Reviews in Fluorescence 2008. Springer. 1st Edition. 2010. Vol. 5. P. 3-6.

ПРиМенение кОнЪЮГатОВ ЛЮЦиФеРаЗЫ СВетЛЯкОВ luCIOlA MINGRElICA С биОСПеЦиФичнЫМи беЛкаМи The application of luciola mingrelica firefly luciferase conjugates with biospecific Галина ЛОМакина, елена ВаСЬкОВа, наталья уГаРОВа Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова, Москва, 119992, Россия E-mail: lomakinagalina@ yahoo.com; факс: (495) 939-26- Разработан метод ковалентной модификации люциферазы Lиciola mingrelica через поверхностные SH-группы остатков цистеина фермента и NH2группы биоспецифичного белка с помощью гетеробифункционального сшивающего агента N-сукцинимидного эфира 3-(2-пиридилдитио)пропионата. Для конъюгации использованы ферменты с His6-tag на С-конце, отличающиеся количеством поверхностных SH-групп – люцифераза дикого типа (WT), содержащая три SH-группы, и ее термостабильный мутант 4TS с двумя SH-группами, у которого один из поверхностных остатков, а именно Cys146, играющий критическую роль в окислительной инактивации фермента, заменен на Ser.

Показано, что время реакции зависит от количества доступных SH-групп - отсутствие у мутанта 4TS остатка Cys146, наиболее удобного для модификации, привело к значительному увеличению времени реакции. Впервые получены активные и стабильные конъюгаты люциферазы с биоспецифичными белками - БСА и авидином из куриных яиц состава 1:1 и 1:2 с высоким выходом - по данным электрофоретического анализа доля немодифицированной люциферазы составляла менее 1%. Конъюгация привела к улучшению каталитических свойств фермента: Км по АТФ снизилась в 4 раза для BSA-4TS и не изменилась для Avi-4TS, Км по LH2 снизилась в 5 раз для Avi-4TS и возросла в 2,5 раза для BSA-4TS по сравнению с немодифицированным 4TS. Отмечено увеличение стабильности полученных конъюгатов.

Оптимизированы условия определения низких концентраций конъюгатов люциферазы – предел обнаружения фермента не зависел от степени его модификации и составил 10-13М. Достоинством полученных конъюгатов на основе термостабильного фермента является возможность их использования при повышенных температурах без потери активности, что значительно сокращает время анализа. Конъюгат BSA-4TS был успешно апробирован в конкурентном иммуноферментном анализе для определения микроколичеств альбумина в диапазоне концентраций 5–300 мкг/мл, требуемых для выявления микроальбуминурии, а конъюгат Avi-4TS – для детекции клеток Salmonella typhimorium с помощью биотинилированных антител с пределом обнаружения 105 КОЕ/мл.

иССЛеДОВание ХаРактеРиСтик МнОГОкОМПОнентнОЙ наДн:ФМн-ОкСиДОРеДуктаЗа-ЛЮЦиФеРаЗа иММОбиЛиЗОВаннОЙ СОВМеСтнО СО СтабиЛиЗатОРаМи ФеРМентОВ Characteristics of coupled enzymatic system NADH:FMN-oxidoreductase-luciferase co-immobilized into starch gel with substrates and stabilizers Виктория ЛОнШакОВа1, елена еСиМбекОВа2,1, Валентина кРатаСЮк1, Сибирский федеральный университет, Институт фундаментальной биологии и биотехнологии, 660041, Россия, г. Красноярск, пр. Свободный,  [email protected] Институт биофизики СО РАН, 660036, Россия, г. Красноярск, ул. Академгородок, [email protected] Для решения задач экологического мониторинга широко применяются методы с использованием реагентов, основанных на ферментах светящихся бактерий. Наиболее перспективным является препарат, представляющий собой включенную в крахмальный гель биферментную систему светящихся бактерий совместно с субстратами (миристиновым альдегидом и НАДН). Однако иммобилизованный реагент при хранении (~1 год при 4°С) теряет активность почти в 5 раз. Внесение в его состав специализированных добавок может привести к дополнительной стабилизации ферментов, что позволит улучшить характеристики многокомпонентного иммобилизованного реагента.

Цель данной работы – разработка многокомпонентного иммобилизованного реагента включающего биферментную систему светящихся бактерий НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза и ее субстраты, отличающегося высокой активностью и длительным сроком хранения при обеспечении высокой чувствительности к действию токсических веществ.

Варьировали содержание в реагенте стабилизаторов (дитиотрейтол (ДТТ), бычий сывороточный альбумин (БСА), меркаптоэтанол (МЭ). Реагент представляет собой высушенный диск диаметром 6– мм, сухой вес 1,5±0,2 мг.

Показано, что включение в состав иммобилизованного реагента стабилизаторов ферментов позволяет увеличить интенсивность свечения реагента. Наибольший эффект оказывает БСА. Включение его в состав реагента позволяет увеличить интенсивность свечения в 9 раз. При включении в состав реагента ДТТ или МЭ интенсивность свечения увеличивается в 1,5 раза. Однако наблюдалось изменение активности реагента после 6 месячного хранения при температуре 4°С. Стабилизирующий эффект проявлялся при добавлении БСА или ДТТ. МЭ видимого стабилизирующего действия не оказал. Также показано, что внесение в состав реагента стабилизаторов снижает его чувствительность к действию модельных токсических веществ (CuSO4 и бензохинон). Исключение составляет реагент, содержащий 1·10-4 М ДТТ, где остаточная интенсивность свечения в присутствии токсических веществ не отличалась от контрольной.

Таким образом, наибольший стабилизирующий эффект при сохранении чувствительности к действию токсических веществ наблюдается при внесении в иммобилизованный реагент 1·10-4 М ДТТ.

биОЛЮМинеСЦентнЫе РеПОРтеРЫ ДЛЯ ВиЗу аЛиЗаЦии иОМОЛекуЛЯРнЫХ ПРОЦеССОВ В ЖиВЫХ ОРГаниЗМаХ Институт Биофизики СО РАН, Академгородок 50, Красноярск, 660036, Россия E-mail: [email protected]; Fax: +-3912-43-34-00;

Биолюминесценция – излучение света живыми организмами в результате окисления различных субстратов специализированными клеточными ферментами. Сфера применения биолюминесценции среди неинвазивных имиджинговых технологий для мониторинга молекулярных процессов in vivo в живых организмах, в том числе в целых животных, интенсивно расширяется. Это происходит благодаря развитию высокочувствительной регистрирующей аппаратуры и уникальным свойствам биолюминесцентных репортеров, среди которых отсутствие токсичности (биолюминесценция – естественная функция живой клетки) и широчайший линейный диапазон регистрации. Основными биолюминесцентными репортерами, используемыми для биоимиджинга живых организмов, на сегодняшний день являются два типа совершенно различных по своей природе люцифераз, использующие различные субстраты: светлячковая и ее гомологи (~62 kDa) и Renilla люцифераза (~32 kDa). Перспективными репортерами также являются недавно клонированные гомологичные люциферазы из копепод Gaussia (~20 kDa) и Metridia (18–22 kDa), использующие целентеразин как субстрат подобно Renilla люциферазе. Сравнительный анализ свойств имеющихся на сегодняшний день биолюминесцентных репортеров показывает, что каждый из репортеров имеет существенные недостатки, ограничивающие дальнейшее развитие биолюминесцентных имиджинговых технологий живых объектов. Таким образом, дальнейшие задачи включают (1) совершенствование имеющихся репортеров методами белковой инженерии, (2) совершенствование биолюминесцентных субстратов, являющихся эмиттерами излучения, а также (3) получение совершенно новых биолюминесцентных репортеров из природных источников.

Одной из основных проблем для биолюминесцентных репортеров является неоптимальный спектр излучения, где большая часть излученных фотонов не попадает в «окно прозрачности» биологических тканей в районе ~650 нм. Особенно это актуально для «голубых» Renilla и копеподных люцифераз. Нами получены мутанты люцифераз из Renilla muelleri и Metridia longa со сдвигом эмиссионных спектров в красную область. При использовании модифицированного субстрата сдвиг спектра для мутантной Renilla muelleri люциферазы составил ~90 нм.

Анализ молекулярных данных по исследованным биолюминесцентным системам выявил, что удивительной особенность биолюминесценции является то, что это явление возникало много раз независимо в ходе эволюции (более 30 раз). Из имеющихся данных следует, что при этом, на роль биолюминесцентных белков рекрутировались самые различные ферменты из предковых биохимических путей. Несмотря на имеющееся разнообразие биолюминесцентных систем, исследовано, а тем более клонировано совсем немного биолюминесцентных белков. Таким образом, исследования новых биолюминесцентных систем очень перспективны для поиска и создания совершенно новых биолюминесцентных репортеров.

CОЗДание МетОДики СкРининГа аГентОВ С иСПОЛЬЗОВаниеМ кРаСнЫХ ФЛуОРеСЦиРуЮщиХ беЛкОВ Development of a technique of the screening of agents for photodynamic therapy of cancer using red fluorescent protein ирина МееРОВич, Виктория ЖеРДеВа, наталия каЗачкина, Учреждение Российской академии наук Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН, Москва, 11901, Россия; E-mail: [email protected]; Fax: +-495-954-2- Эффективность фотодинамического повреждения биологической ткани при фотодинамической терапии (ФДТ) определяется главным образом уровнем накопления фотосенсибилизатора (ФС), его локализацией в ткани и фотохимической активностью. Одной из проблем ФДТ является повышение селективности накопления ФС в опухоли. Для уменьшения побочных эффектов, вызванных накоплением ФС в ряде здоровых органов и тканей организма (печени, селезенке, почках, а также в коже), для каждого ФС определить оптимальные условия для проведения ФДТ, в частности, необходимо изучить динамику уровня накопления ФС в опухоли и нормальной ткани.

Опухолевые модели, созданные с использованием опухолевых клеток, экспрессирующих цветные флуоресцирующие белки (fluorescent proteins – FPs), позволяют исследовать развитие первичных опухолей и метастазов, а также ответ опухоли на лекарственную терапию в режиме реального времени [1]. Использование FP-меченых опухолей для целей ФДТ открывает дополнительные возможности при изучении механизма действия фотосенсибилизаторов и эффективности ФДТ.

В данной работе в качестве опухолевой модели использовались подкожно перевитые мышам линии BalbC/Nu опухолевые клетки меланомы mel Kor, экспрессирующие красный флуоресцирующий белок TurboRFP (mel Kor-TurboRFP [2]), используемые фотосенсибилизаторы характеризовались флуоресценцией в длинноволновой области спектра, например, бактериохлорин или производное фталоцианина “Тиосенс”, что позволяет изучать распределение ФС in vivo на большей глубине в организме лабораторного животного. При изучении фармакокинетики ФС у мышей с флуоресцирующими опухолями при помощи автоматизированной системы iBox (UVP, USA) были получены флуоресцентные изображения как флуоресцирующей опухоли, так и распределения ФС. Таким образом, что накопление липосомального “Тиосенса” в опухоли достигает максимума через сутки после внутривенного введения ФС, в этот момент этом удается достичь контраста накопления, равного 3. Было показано, что накопление трикалиевой соли бактериохлорина в опухоли является максимальным в течение нескольких часов после введения, однако не удается достичь значительного контраста накопления по сравнению с окружающими здоровыми тканями (например, контраст не превышает 1,5–1, как в случае внутрибрюшинного, так и в случае внутривенного введения ФС). Путем диффузной флуоресцентной томографии показано уменьшение объема опухоли после фотодинамического воздействия на опухоль mel Kor-TurboRFP, сенсибилизированной липосомальным “Тиосенсом”.

1. Hoffman, R.M., Journal of Biomedical Optics, 2005, 10(4), 41202.

2. I.G Meerovich, L.R. Arslanbaeva, M.M. Shigreva, D.V. Sokolova, O.S. Burova, N.V. Andronova, E.M Treshalina., A.Yu. Baryshnikov, and A.P. Savitsky, Proc. II International symposium Topical problems of biophotonics, Nizhny Novgorod, 2009, p. 63.

ВЛиЯние ПОЛиГиСтиДинОВОЙ ПОСЛеДОВатеЛЬнОСти на СВОЙСтВа ЛЮЦиФеРаЗЫ СВетЛЯкОВ l. MINGRElICA, СОДеРЖащеЙ ЗаМенЫ ОСтаткОВ ЦиСтеина His-tag impact on properties of l. mingrelica firefly luciferase Юлия МОДеСтОВа, Галина ЛОМакина, наталья уГаРОВа Химический факультет МГУ имени М.В. Ломоносова, Москва, 119992, Россия E-mail: [email protected]; Fax: +-495-939-26- Люцифераза светляков (EC 1.13.12.) – это фермент, катализирующий люминесцентную реакцию окисления D-люциферина светляков под действием кислорода воздуха. В состав молекулы люциферазы L. mingrelica входят свободных остатков цистеина, ни один из которых не принимает участия в ферментативном катализе. Инактивация люциферазы светляков является сложным процессом, первая стадия которого является быстрой и необратимой, вторая – медленной и частично обратимой. При этом стабильность фермента повышается при увеличении его концентрации, что характерно для олигомерных белков. Ранее было показано, что введение единичных замен Cys62Ser, Cys146Ser и Cys164Ser в молекулу рекомбинантной люциферазы, не содержащей полигистидиновую последовательность, приводит к стабилизации фермента на медленной стадии термоинактивации, предположительно за счет снятия эффекта окислительной инактивации, а также уменьшает концентрационную зависимость стабильности люциферазы [1].

На основе плазмиды pETL [2], содержащей ген люциферазы светляков Luciola mingrelica, несущей His6-последовательность на С-конце, были получены мутантные формы люциферазы, содержащие единичные замены Cys62Ser, Cys62Val, Cys146Ser и Cys164Ser. Были изучены физико-химические свойства исходной формы люциферазы с С-концевой His6-последовательностью и полученных на её основе мутантных форм. Показано, что введение полигистидиновой последовательности приводит к существенным изменениям процесса термоинактивации всех изученных форм люциферазы. Процесс инактивации люцифераз с С-концевой His6-последовательностью является одностадийным, причем kин мутантных ферментов совпадают в пределах погрешности с kин соответствующих мутантов, не содержащих His6-последовательности, наблюдаемой при повышенной концентрации фермента (10-6 М). Кроме того, за счет введения His6-последовательности происходит увеличение KmATP и KmLH исходной формы люциферазы, что может быть связано с тем, что подвижная His6-последовательность создает стерические препятствия при изменении взаимной ориентации доменов люциферазы, происходящем при взаимодействии фермента с субстратами.

Таким образом, введение С-концевой His6-последовательности оказывает существенное влияние на свойства исходной и мутантных люцифераз, в том числе на ход процесса олигомеризации фермента.

1. Modestova, Y.A., Lomakina G.Y., Ugarova N.N., Luminescence, 2010, 25, 161.

2. Koksharov M.I., Ugarova N.N., Photochem. Photobiol. Sci., 2011, DOI: 10.1039/c0PP00318b.

ОСОбеннОСти ФОтОбиОМОДиФикаЦии ШиРОкОПОЛОСнЫМ СВетОМ СеРДечнО-СОСуДиСтОЙ СиСтеМЫ кРЫС ПОСЛе иШеМии The features of photobiomodification produced by wide-band light in the rat cardiovascular system after myocardial ischemia and asphyxia Виктор МОнич1, анна баВРина1, Светлана МаЛинОВСкаЯ1, Валерий ЛаЗукин1, евгений ДРуЖинин2, Юрий СиЗОВ ГОУ ВПО Нижегородская Государственная Медицинская Академия, Н.Новгород, пл. Минина, 10/1, 603005, Россия;

E-mail: [email protected]; Fax: +-831-465-50-51;

ГУЗ Нижегородский областной онкологический диспансер, Н.Новгород, 603126, Россия;