«Н.П.ИВАНОВ доктор ветеринарных наук, профессор, академик НАН РК К.А.ТУРГЕНБАЕВ доктор ветеринарных наук, профессор А.Н. КОЖАЕВ кандидат ветеринарных наук ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ ЖИВОТНЫХ Том 1 Общая эпизоотология Алматы, ...»

Консерванты и среды обогащения. Для сохранения жизнеспособности дизентерийных бактерий в случаях, когда посев фекалий на питательные среды нельзя произвести непосредственно после забора материала, последний подлежит консервированию.

Глицериновая смесь. Смешивают 2 л изотонического раствора хлорида натрия, 1 л глицерина и 20% раствор фосфата натрия (Na2HPО4) в таком количестве, чтобы довести рН смеси До 7,8 - 8 (ориентировочно на 3 л смеси берут см3 20% раствора Na2HPО4, хорошо выветренного). Стерилизуют текучим паром 3 дня подряд или 15 - 30 мин при 0,5 атм. После стерилизации РН должен быть 7,8.

Боратно-буферный раствор. Смешивают 57 г кристаллической буры, 84 г борной кислоты и 99 г хлорида натрия. На 100 мл дистиллированной воды берут 2 г этой смеси. Употребляют как консервант микробов семейства кишечных.

Фосфатная буферная смесь. На 1 л дистиллированной воды добавляют фосфат калия однозамещенного (КН2РО4) - 0,45 г, фосфата натрия двузамещенного выветренного (Na2HPО4) - 5,34 г. Разливают, стерилизуют 30 мин в автоклаве при 1 атм. Употребляют как консервант для патогенных микробов семейства кишечных.

Еще более эффективными являются среды, в которых патогенные кишечные бактерии не только сохраняются, но и размножаются, - так называемые среды обогащения. Большинство сред обогащения содержит желчь.

Желчный бульон. Свежую желчь крупного рогатого скота фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Рекомендуется предварительно ее нагревать текучим паром при 100°С в течение 1 ч, затем до фильтрования дать отстояться. Фильтрованную горячую желчь разливают по бутылям, стерилизуют текучим паром дня подряд до 30 минут. Перед приготовлением желчного бульона желчь декантируют с осадка, фильтруют через ватную пробку (не очень плотную), вставленную в воронку, или через фильтровальную бумагу и соединяют с бульоном рН 7,2 (можно фильтровать смесь), разливают по пробиркам, флаконам и стерилизуют текучим паром 3 дня по 30 минут. Применяют 10 – 20 % желчный бульон рН 7,5. Для разведения желчи можно употреблять вместо бульона изотонический раствор хлорида натрия.

Среда Рапопорта применяется для одновременного обогащения и дифференциации гемокультуры. К 10% желчному бульону добавляют 2 % глюкозы и 1% индикатора Андреде или 0,1% спиртового раствора (1,6 %) бромкрезолового пурпурного. Разливают по 50 см3 во флаконы, куда вставляют поплавки для обнаружения газообразования. Поплавками служат стеклянные трубочки длиной 60 - 70 мл и диаметром 8 мм, которые помещают во флаконы открытым концом вниз. После стерилизации жидкость должна заполнять все трубочки. При росте газообразующих бактерий в верхнем закрытом конце трубочки собирается образующийся газ. Стерилизуют 3 дня по 30 мин. При росте тифозных и паратифозных бактерий среда с индикатором Андреде краснеет, среда с бромкрезоловым пурпурным желтеет.

Среда Мюллера служит для накопления сальмонелл. В стерильные флаконы отвешивают по 4,5 г мела. Стерилизуют сухим жаром. Наливают 90 см3 бульона и стерилизуют 30 мин при 1 атм. К каждому флакону в асептических условиях добавляют 2 см3 раствора Люголя и 10 мл раствора гипосульфита натрия.

Раствор Люголя: дистиллированной воды 20 см3, йодида калия 20 г, йода 25 г.

После растворения долить дистиллированной водой до 100 мл. Раствор гипосульфита натрия: насыпают в мерный цилиндр 50 г гипосульфита натрия и добавляют дистиллированной воды до 100 см3, переливают в бутыль, стерилизуют текучим паром.

Среда Кауфмана также является средой накопления сальмонелл. К 500 см стерильной среды Мюллера добавляют 25 см3 стерильной желчи и 5 см3 0,1% водного раствора бриллиантового зеленого. Разливают по пробиркам с соблюдением правил асептики. Стерилизовать не нужно.

Бульон с бриллиантовым зеленым для сальмонелл (Киллиана). К 100 см стерильного питательного бульона (рН 6,7 - 6,9) непосредственно перед употреблением прибавляют 1 см3 0,1 % водного раствора бриллиантового зеленого.

Селенитовая среда является лучшей средой обогащения для патогенных энтеробактерий, особенно сальмонелл и дизентерийных микробов Зонне. Селенит натрия стимулирует рост патогенных бактерий и подавляет рост сопутствующей флоры. Среду готовят из однозамещенного кислого селенита натрия NaHSeO3 - 0,4%, пептона - 0,5%, фосфата натрия двузамещенного (безводного) Na2HPO4 - 0,7%, фосфата натрия однозамещенного (безводного) NaH2P04 - 0,3%, лактозы химически чистой - 0,4% и дистиллированной воды - до 100%.

Необходимо прежде всего подтитровать количественное соотношение в среде Na2HPO4 и NaH2P04, чтобы с использованными образцами пептона и кислого селенита натрия среда имела рН не выше 7,0. Такую предварительную подтитровку необходимо делать при смене серии каждого из четырех указанных компонентов среды. Когда такое соотношение устанавливается, к приготовленному раствору фосфатов добавляют пептон и лактозу, разливают по 50 см 3 во флаконы и стерилизуют текучим паром 2 дня по 30 мин или 112°С 30 мин. Отдельно на стерильной дистиллированной воде готовят 10 % раствор кислого селенита натрия. Перед началом работы на каждый флакон с 50 см3 основного раствора добавляют 2 см3 раствора кислого селенита натрия. Приготовленную среду разливают по 5 - 7 см3 в пробирки. Основной раствор среды может храниться при температуре от 4 до 10 °С 1 - 2 мес. Раствор кислого селенита натрия готовят ex tempore.

При использовании этой среды для исследования мочи, рвотных масс или промывных вод следует готовить среду с удвоенным количеством ингредиентов и исследуемый материал засевать в соотношении 1:1.

Большое значение имеет качество пептона. Хорошие результаты получают с пептонами чешского («Спофа») и венгерского («Г. Рихтер») производства.

Раствор Люголя: 100 мл дистиллированной воды, 20 г йодистого калия и 25 г йода.

Раствор гипосульфита, в измерительный цилиндр насыпают 50 г серноватистокислого натрия и добавляют дистиллированной воды до 100 см3, переливают в бутыль, стерилизуют текучим паром.

Среда Киллиана. К 100 см3 стерильного МПБ (рН 6,7 - 6,9, не выше 7,3) прибавляют 1 см3 0,1 %-го водного раствора бриллиантового зеленого и разливают по пробиркам.

Среды для выделения микробов семейства кишечных. Для выделения патогенных бактерий семейства кишечных применяют среды, которые позволяют их дифференцировать от постоянных обитателей кишечника - микробов, разлагающих лактозу. Это так называемые дифференциальные среды. Имеется несколько групп дифференциальных сред.

Среды первой группы содержат лишь лактозу и индикатор (среды с красным конго, бромкрезоловым пурпурным и др.). Они не обладают элективными свойствами для бактерий семейства кишечных. На них растут также грамположительные микробы и вульгарный протей.

Среды второй группы - так называемые элективные содержат дополнительные вещества (малахитовый зеленый, бриллиантовый зеленый, желчь, метиленовый синий), которые задерживают рост грамположительных микробов. Среди них наиболее широкое применение имеют среды Эндо и Левина. Первая применяется при исследованиях на сальмонеллы и патогенные серовары кишечной палочки, вторая - для выращивания всех энтеробактерий.

Среды третьей группы - селективные - содержат, кроме веществ, подавляющих рост кишечной палочки и других сопутствующих микробов, вещества, стимулирующие рост определенных патогенных энтеробактерий. Селективной средой для сальмонелл является висмут-сульфитная среда, для дизентерийных бактерий (кроме бактерий Григорьева - Шига) - среда Плоскирева. На последней хорошо растут также тифозные и паратифозные бактерии.

Дифференциальные среды.

Среда с красным конго по Аселю - Либерману. К 100 см3 расплавленного слабощелочного агара прибавляют 1 г лактозы и 2 см3 стерильного 10% водного раствора красного конго. Ярко-красную среду разливают в чашки. По другому рецепту на 100 см3 агара добавляют 10 мл 10% раствора лактозы и 5 см3 1,2% водного раствора красного конго, т. е. среда содержит 1% лактозы и 0,06% красного конго. Для выявления кишечной палочки, ферментирующей сахарозу, можно лактозу заменить сахарозой.

Бромкрезоловая среда. Готовят 1,2 % спиртовой раствор бромкрезолового пурпурного, отдельно готовят 2,6% спиртово-водный раствор (в равных частях) метиленового синего; после приготовления фильтруют отдельно каждый раствор. На 1000 см3 расплавленного питательного агара (рН 7,3 - 7,4) добавляют 7,5 см3 1,2% спиртового раствора бромкрезолового пурпурного, смешивают и приливают 2,5 см3 раствора метиленового синего, а затем добавляют 10 г лактозы, предварительно растворенной в дистиллированной воде и прокипяченной.

После этого среду стерилизуют дробно в аппарате Коха. Среда имеет синефиолетовый цвет. Можно готовить среду без синего красителя. На бромкрезоловой среде колонии кишечной палочки имеют зеленый цвет (без синего красителя - желтый), а колонии сальмонелл и шигелл сине-голубой.

Элективные среды. Среда Эндо. 100 мл обычного агара (рН 7,4) растапливают на водяной бане или в текучепаровом аппарате, охлаждают до 70°С и прибавляют 1 г химически чистой лактозы, предварительно растворенной в стерильной пробирке в небольшом количестве дистиллированной воды и прокипяченной.

В отдельных пробирках готовят: 1) 2 - 3 см3 спиртового насыщенного раствора основного фуксина; 2) 10 см3 10% водного раствора сульфита натрия (Na2SO3). В стерильную пробирку отмеривают 1 см3 раствора фуксина и прибавляют раствор сульфита натрия до обесцвечивания фуксина (бледно-розовый цвет). Приготовленную смесь вливают в растопленный агар, хорошо перемешивают (избегать образования пены) и разливают по чашкам. Горячий агар имеет бледно-розовый цвет, при застывании он становится бесцветным. Кишечная палочка при росте дает красные колонии с металлическим блеском, а сальмонеллы и шигеллы бесцветные.

Среда Левина (среда с эозином и метиленовым синим). К 100 см3 расплавленного агара с рН 7,2 - 7,4 (охлажденного до 70°С) добавляют: 1) 2 см3 0,5% водного раствора метиленового синего, предварительно подогретого на водяной бане; 2) 1,5 см3 2% водного раствора эозина (эозин-натрий бактериологический);

3) 2 г лактозы; 4) 0,2 г двухосновного фосфата калия (К2НРО4). Растворы красителей готовят на дистиллированной воде, стерилизуют в текучепаровом аппарате и сохраняют впрок. Лактозу и двухосновный фосфат калия перед прибавлением к агару растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды и кипятят.

Раствор лактозы и фосфата калия можно приготовить вместе: к смеси 50 г лактозы и 5 г К2НРО4 прибавляют при подогревании дистиллированную воду до см3. На каждые 100 см3 агара добавляют 4 см3 этого раствора. После добавления всех ингредиентов тщательно перемешивают среду, разливают в чашки Петри, подсушивают. Среда имеет фиолетовый цвет. Колонии патогенных бактерий на этой среде прозрачны, бесцветны или имеют розоватый оттенок. Кишечная палочка образует синие или черные колонии. Протей растет изолированными оранжевыми колониями. Среда изменяет цвет только вокруг колоний протея, вокруг же остальных она. Сохраняет свой цвет.

Селективные среды.

Таурохолевый агар Мак-Конки. В 1 л дистиллированной воды растворяют 20 г пептона, 5 г NaCl, 2,5 г таурохолата натрия, 10 г лактозы, 0,1 г нейтрального красного. Количество таурохолата натрия и нейтрального красного определяют экспериментально с каждой серией реагентов. Хайнес модифицировал эту среду, добавив вместо 1% лактозы 0,5% сахарозы и 0,5 % лактозы. Это дало возможность определять бактерии, ферментирующие также сахарозу.

Сухой бактоагар Плоскирева. В состав среды входят: 53,6% сухого питательного агара с желчными солями, 14,4 % цитрата натрия, 11 % гипосу льфита, 12 % лактозы, 3,7 % фосфата натрия, 0,03 - 0,06 % нейтрального красного, 0, % бриллиантового зеленого, 1,2% соды кальцинированной, 0,04 % йода, 3,7 % NaCl.

Сухой висмут-сульфит-агар. В состав среды входят: гидролизат рыбы или китовой муки, агар-агар, глюкоза, цитрат висмута, сульфит натрия, соль Мора, фосфат натрия, бриллиантовый зеленый, рН 7,6 - 7,8.

Среды Эндо, Левина, висмут-сульфит-агар и среда Плоскирева выпускаются в Советском Союзе в сухом виде. Каждую новую серию сухой среды, особенно среду Плоскирева, в лаборатории следует подтитровать. При маловыраженной задержке роста кишечной палочки на сухих элективных средах увеличивают дозировку порошка по сравнению с прописью на этикетке; при чрезмерном угнетении роста (стерильность посевов) уменьшают дозировку. На всех указанных средах (кроме висмут-сульфитной, на которой колонии тифозной палочки и других сальмонелл черного цвета) колонии сальмонелл и шигелл бесцветные;

колонии кишечной палочки окрашены в зависимости от индикатора среды: на среде Эндо - в красный цвет с металлическим блеском, на среде Левина - в синий цвет, на среде Плоскирева - в розовый цвет.

Среды для идентификации микробов семейства кишечных. Определение сахаролитических ферментов. Среды Гисса. В дистиллированную воду прибавляют 1% пептона и 0,5% хлорида натрия. Растворяют на огне, прибавляют 1 % индикатора Андреде или 0,1% спиртового (1,6%) раствора бромтимолового синего (можно бромкрезолового пурпурного), нагревают до 80°С и устанавливают рН 7,2. Затем среду кипятят 5 мин, фильтруют и доливают до первоначального объема дистиллированной водой. Добавляют 0,5 - 1% одного из углеводов, разливают по пробиркам с поплавками (длина 25 мм, диаметр 3 мм). Разлитая среда сразу не заполняет всего поплавка. Это достигается во время стерилизации, если уровень среды в пробирке не ниже 4/5 высоты поплавка. При изготовлении полужидких сред Гисса следует добавлять 1% углеводов, а также 0,4% агар-агара. Стерилизуют 3 дня текучим паром по 30 мин или при 0,5 атм 15 мин.

В готовых средах Гисса проверяют правильность изменения окраски индикатора. Для этого в одну пробирку со средой добавляют по каплям разведенную кислоту, в другую - разведенную щелочь, наблюдая за быстротой и степенью изменения цвета. В зависимости от цели исследования набор сред Гисса может быть различным. Сухую среду Гисса выпускают не жидкой, а полужидкой. При наличии газа наблюдаются пузырьки его или разрывы в толще агара. В сухих средах Гисса применяют индикатор ВР - смесь водного голубого и розоловой кислоты. В кислой среде он имеет синюю окраску, в щелочной - красную, при нейтральной реакции - бесцветен. Индикатор действует в пределах рН 4,5 - 8.

Среда для определения -галактозидазы. 1. О-Нитрофенил-р-Огалактопиранозид (ONPq) в количестве 1 г растворяют в 100 мл стерильной дистиллированной воды при слабом подогревании. Раствор хранят в холодильнике и используют по мере надобности. 2. Питательный агар Дагестанского института питательных.сред в количестве 1,3 г растворяют в 100 см3 дистиллированной воды, кипятят 1 - 2 мин, стерилизуют при 120°С 20 мин. Охлаждают агар до 45 С, добавляют 20 см3 раствора 1, стерильно разливают в агглютинационные пробирки. Среду можно сохранять в холодильнике 2 - 3 мес. Посев производят уколом до дна пробирки, которую затем помещают в термостат на 18 - 24 ч. При положительной реакции среда окрашивается в желтый цвет. Можно производить контрольный просмотр через 3 - 4 ч.

2% глицериновый агар с кислым фуксином для шигелл и сальмонелл (М. А.

Рапопорт, С. С. Меклер, Б. П. Кисельгоф). К питательной основе сред пестрого ряда рН 7,2 прибавляют 1,7% агар-агара, 1% насыщенного водного раствора кислого фуксина до ярко-розового цвета и 2% глицерина. Стерилизуют 30 мин при 120°С.

Среда с рамнозой для сальмонелл (по Биттеру). В 1 л дистиллированной воды растворяют 0,5 г Nа2НРO4, 1 г (NH4)2SO4 2 г цитрата натрия, 5 г хлорида натрия, 0,05 г пептона, 5 г рамнозы. Кипятят, фильтруют, стерилизуют текучим паром 2 дня по 30 мин. К суточной культуре на этой среде прибавляют несколько капель 1,5% спиртового раствора метилового красного. В зависимости от степени кислотности среда краснеет или остается желтой. S. typhimurium дает красное окрашивание, остальные сальмонеллы - желтое.

Среда Штерна для дифференциации сальмонелл. К 100 мл питательного бульона прибавляют смесь из 5 капель насыщенного спиртового раствора основного фуксина и 2 см3 свежеприготовленного 10% водного раствора сульфита натрия (NаSO3), 1 мл глицерина и 1 см3 0,25% раствора хризоидина на стерильной горячей воде. Среда пригодна в течение 8 - 14 сут. S. typhimurium дают на среде покраснение, паратифозные В среду не меняют.

Среда Кларка для определения интенсивности кислотообразования и способности кишечной палочки продуцировать ацетилметилкарбинол (реакция Фогеса - Проскауэра). К 80 мл дистиллированной воды добавляют 0,5 г пептона, 0, г глюкозы, 0,5 г К2НРO4, подогревают при помешивании в течение 20 мин.

Фильтруют через бумажный фильтр, охлаждают до 20°С и доводят объем до см3 дистиллированной водой. Разливают по 5 см3 в пробирки и стерилизуют дня по 30 мин.

Для определения кислотообразования после 4-суточного роста культуры в этой среде в нее прибавляют 3 - 5 капель 0,04% раствора метилового красного ( см3 1,6 % спиртового раствора метилового красного и 39 см3 спирта; раствор сохраняется неограниченное время). При сильном кислотообразовании получается красное окрашивание, при слабом - желтое.

Для определения ацетилметилкарбинола ставят реакцию Фогеса - Проскауэра. К 4 - 5-суточной культуре на среде Кларка прибавляют равный объем 10% водного раствора едкого кали и выдерживают при 37°С. Через 18 - 24 ч в результате образования ацетилметилкарбинола на глюкозе среда окрашивается в розовый Цвет с желтым оттенком (как эозин), что оценивается как положительный результат; отсутствие изменений в цвете среды рассматривают как отрицательный результат. Применение 20% раствора едкого кали позволяет оценивать результат через 4 ч.

Комбинированная среда Рессела. Среду Рессела можно готовить на любой основе - мясном или казеиновом переваре по Хоттингеру, но лучше на дрожжевом аутолизате. Дрожжевой аутолизат фильтруют, разводят дистиллированной водой пополам, другие полуфабрикаты разводят в зависимости от исходного общего азота в основном переваре. В окончательной среде Рессела общего азота должно быть не более 100 мг %. При невозможности определить содержание общего азота мясной перевар разводят в 5 - 6 раз, казеиновый – в 4 - 5 раз. К питательной основе прибавляют 0,5% химически чистого хлорида натрия, 1% агарагара, растворяют на огне, затем кипятят 5 - 10 мин. К 1 % расплавленному агару, профильтрованному и охлажденному до 50 - 60°С, прибавляют 4% индикатора Андреде, подогревают до 80°С, устанавливают рН 7,3 - 7,4. После этого добавляют 1 % лактозы и 0,1% глюкозы и разливают по 10 - 15 см3 в пробирки.

Стерилизуют текучим паром 3 дня по 20 мин. Следует скосить среду так, чтобы нижняя половина осталась в виде столбика, а верхняя имела скошенную поверхность. При небольшом количестве глюкозы (0,1%) ее сбраживание обнаруживается только в столбике, вследствие чего в нем изменяется цвет среды; сбраживание лактозы, которая содержится в большей концентрации (1%), происходит в столбике и в скошенной части, в результате чего вся среда изменяет свой цвет.

Комбинированная среда с мочевиной и углеводами (скошенный столбик по Равич-Биргер и Мешаловой). К сброженному казеиновому перевару, разведенному в 8 - 9 раз до содержания общего азота не более 90 - 100 мг %, прибавляют 1 % агар-агара, растапливают на огне, кипятят, фильтруют, доводят дистиллированной водой до первоначального объема. В фильтрованном агаре устанавливают рН 7,2, а затем добавляют 1 % лактозы, 0,1% глюкозы, 0,02 % соли Мора, 0,03 % гипосульфита и 1 % мочевины. Углеводы предварительно растворяют в небольшом количестве кипящей дистиллированной воды, в воду после некоторого охлаждения добавляют соль и мочевину. Затем в среду добавляют 4% комбинированного индикатора (100 см3 индикатора Андреде и 0,4 г тимолового синего в порошке). Среду разливают по 6 мл в стерильные пробирки, стерилизуют один раз текучим паром 15 мин, скашивают так, чтобы остался столбик. Как и в среде Рессела, расщепление глюкозы сопровождается покраснением только столбика, расщепление лактозы - покраснением всей среды. При разложении мочевины реакция становится резко щелочной и среда приобретает фиолетовый цвет, переходящий при слабом расщеплении в зеленоватый, при сильном - в синий.

Среду с мочевиной можно приготовить и из сухих сред: 1) в 100 см3 горячей дистиллированной воды растворяют 4 г сухого агара с лактозой, 0,5 г питательного агара, 0,1 г глюкозы, 0,02 г соли Мора, 0,03 г гипосульфита и 1 г мочевины. Нагревают до полного растворения, разливают по пробиркам и стерилизуют текучим паром 15 мин один раз; скашивают так, чтобы остался столбик; 2) к сухой среде Рессела прибавляют 1 % мочевины.

Трехсахарный агар с мочевиной (И. С. Олькенидкий). К 100 см3 питательного агара рН 7,2 - 7,4 прибавляют 1 г лактозы, 0,02 г соли Мора, 0,03 г гипосульфита, 1 г сахарозы, 0,1 г глюкозы, 1 г мочевины и 0,4 мл фенолового красного (0,4% раствор). Соль Мора и гипосульфит предварительно растворяют в дистиллированной воде. Углеводы и мочевину также растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды в колбе на водяной бане. Все ингредиенты хорошо перемешивают с агаром, а затем фильтруют через стерильную марлю и устанавливают рН 7,2 - 7,4. Добавляют индикатор и разливают в пробирки. Для приготовления раствора индикатора 0,1 г фенолового красного растворяют в см3 стерильной дистиллированной воды. Раствор можно хранить в холодном месте до 10 дней. Если феноловый красный щелочерастворимый, то 0,1 г его растирают в ступке с 5,7 см3 1/20 N раствора едкого натра. На 100 см3 среды добавляют 0,4 мл индикатора.

Среда Олькеницкого из сухого агара. 2,5 г сухого питательного агара расплавляют в 100 мл дистиллированной воды. В остуженный до 50 °С агар прибавляют все ингредиенты, указанные в рецептуре оригинальной среды (см. выше). Среду, разлитую в пробирки, стерилизуют текучим паром 3 дня по 20 мин и затем скашивают. Готовая среда должна быть бледно-розового цвета.

Среда с мочевиной (по Христенсену). 1. В 100 см3 дистиллированной воды растворяют: 1 г пептона, 5 г хлорида натрия, 1 г глюкозы, 2 г КН2РО4, 20 г мочевины, 6 мл фенолового красного (0,2% водного раствора) и устанавливают рН 6,8 - 6,9. Стерилизуют текучим паром 20 мин. 2. К 900 см3 дистиллированной воды добавляют 15 г агара и стерилизуют при 120°С 30 мин. Остужают до 40 С и смешивают со 100 см3 раствора 1. Разливают в стерильные пробирки и скашивают. Среду можно применять и жидкой, без агара.

Синтетическая лакмусовая сыворотка (лакмусс-мольке). Смешивают 0,05 г пептона высшего качества, 5 г хлорида натрия, 2 г цитрата натрия, 1 г сульфата аммония, 0,5 г фосфата натрия двузамещенного (Na2НРO4), 0,4, г химически чистой глюкозы, 20 г химически чистой лактозы. К смеси прибавляют 0,25 г азолитмина, а затем все растворяют в 1000 см3 дистиллированной воды.

Разливают в пробирки. Стерилизуют текучим паром 15 мин один раз.

Среды для определения протеолитических ферментов. Молоко. Свежее молоко доводят на огне до кипения и кипятят 5 мин. Оставляют в прохладном месте на сутки. Освобождают от верхнего жирного слоя. Вторично кипятят мин, оставляют на сутки, опять снимают верхний слой. Фильтруют 2 - 3 раза через плотную ватную пробку, нейтрализуют 10 % раствором карбоната натрия до рН 7,2, определяемого розоловой бумажкой или по потенциометру. Разливают и стерилизуют текучим паром 2 дня по 30 мин. Протеолиз в молоке выражается растворением сгустка казеина, образованного бактериями, свертывающими молоко. При сомнительном результате, чтобы определить свертывание молока, рекомендуется его прокипятить.

Молоко с лакмусом. Перед стерилизацией к молоку, приготовленному, как указано выше, прибавляют 5 – 10 % лакмусовой настойки и столько же 10 % раствора бикарбоната натрия, чтобы пена молока приняла синевато-фиолетовый оттенок. При кислотообразовании молоко становится розовым (до красного), при щелочеобразовании - сине-фиолетовым (до синего), Желатин. В мясную воду добавляют 1% пептона, 0,5% хлорида натрия и желатин, предварительно мелко раскрошенный. В холодное время года берут - 12% желатина, в теплое - 15 - 20%.

Питательный желатин можно приготовить и на готовом мясопептонном бульоне рН 8,0. Для ускорения растворения желатин следует поставить на огонь и нагреть до 40 - 50°С, постоянно помешивая стеклянной палочкой. После полного растворения устанавливают рН 7,1 - 7,3 и прогревают 1 ч текучим паром.

Дают отстояться и фильтруют через ткань или двойной складчатый фильтр. Стерилизуют текучим паром 2 дня по 20 мин. После стерилизации быстро охлаждают. Посев делают уколом. Протеолиз выражается разжижением плотного столбика желатина.

Среды для определения сероводорода. Среда Черномордика. К 1 л дистиллированной воды прибавляют 15 г пептона, 1 г лимонно-аммиачного железа, 1 г фосфата калия двузамещенного, 0,15 г гипосульфита и 5 г агара. Ингредиенты растворяют в кипящей воде, кипятят до полного растворения агара, затем разливают в пробирки и стерилизуют 30 мин при 0,5 атм. Дают застыть столбиком. Посев производят уколом в столбик. Почернение распространяется от укола.

Среда Кристенсена. 100 мл расплавленного 1% агара рН 7,2; 0,5 см3 10% водного раствора хлорида железа разливают стерильно в пробирки столбиком.

Засевают уколом.

Среды для определения способности утилизировать цитраты. Среда Козера. В 1 л дистиллированной воды растворяют 1,5 г фосфата натрий-аммония, 0, г сульфата магния, 3 г нейтрального цитрата натрия. Раствор разливают в пробирки по 5 см3 и стерилизуют 30 мин при 1 атм. Среда прозрачная. При росте цитратассимилирующих бактерий среда становится мутной. Кишечная палочка не растет.

СредаСиммонса. В 1 л раствора Козера растворяют 20 г агар-агара, устанавливают рН 7,2. Прибавляют 10 см3 1,5% спиртового раствора бромтимолового синего, фильтруют, разливают по пробиркам, стерилизуют 15 мин при 120°С и скашивают. Кишечная палочка не растет и не меняет цвета среды. Цитратассимилирующие бактерии хорошо растут, подщелачивают среду и вызывают окрашивание в синий цвет.

Среда с d-тартратом (сегнетовой солью) для дифференциации сальмонелл, особенно группы В. К 1 л воды добавляют 10 г пептона, 0,5 см 3 1/10 N раствора NaOH, 10 г d-тартрата (сегнетовой соли), 4 - 5 см3 1,5% спиртового раствора бромтимолового синего, устанавливают рН 7,4, разливают в стерильные пробирки по 5 см3, стерилизуют 15 - 20 мин при 0,5 атм. Цвет среды синий.

Среди сальмонелл группы В только S. paratyphi В не меняет цвета среды, у S. typhimurium этот признак вариабелен, прочие сальмонеллы изменяют цвет среды на зеленовато-желтый. Кроме изменения цвета среды, можно выявить расщепление d-тартрата при.добавлении 0,5 см3 насыщенного раствора ацетата свинца. В случае потребления d-тартрата среда обесцвечивается и осадка не образуется или он ничтожный. При отсутствии расщепления цвет среды не меняется и образуется обильный преципитат.

Среда с малонатом натрия. Дрожжевого экстракта 1 г, (NH4)2SO4 - 2 г, К2НРО4 - 0,6 г, КН2РО4 - 0,4 г, хлорида натрия 2 г, малоната натрия 3 г, глюкозы 0,25 г, дистиллированной воды 1000 см3, 0,2% водного раствора бромтимолового синего 12 мл. При подогревании растворяют в дистиллированной воде ингредиенты среды, фильтруют через бумажный фильтр и добавляют индикатор. Устанавливают рН 6,7. Среду разливают в стерильные пробирки по 2 - 3 см3 и стерилизуют при 121оС 15 мин.

Агар с фенилаланином. К 1 л дистиллированной воды добавляют 12 г агара и 9 г дрожжевого экстракта. Расплавляют на горелке, добавляют 1 г фенилаланина, 1 г Na2HPO4 и 5 г хлорида натрия, перемешивают, кипятят 5 мин и разливают в пробирки. Стерилизуют при 112°С 30 мин, сразу после стерилизации скашивают. На выросшую культуру по скошенной поверхности агара пускают - 5 капель 10% раствора хлорида железа: в случае образования фенилпирувиновой кислоты остается зеленый след.

Среды для определения декарбоксилаз аминокислот (по Бирреру Крушинской). Среда для определени.я лизиндекарбоксилазы: гидролизата казеина 0,5%, дрожжевого экстракта 0,3%, глюкозы 0,1%, L-лизина 0,5%, индикатора бромтимолового синего 4,5 см3 (0,1% раствора в 20% спирте), дистиллированной воды 100 см3; рН среды 6.

Среда для определения глутамико-декарбоксилазы: гидролизата казеина 0,5%, дрожжевого экстракта 0,3%, глюкозы 0,05%, L-глутаминовой кислоты (хлоргидрата) 0,5%, индикатора бромкрезолового синего (зеленого) 2,25 см (0,4% воднощелочного раствора), дистиллированной воды до 100 см3; рН среды 3,8. Обе среды разливают в пробирки по 3 см3 и стерилизуют текучим паром дня или при 0,5 атм 15 мин.

Вопросы для самопроверки:

1. Какие консерванты и среды обогащения используются при изготовлении питательных сред?

2. Какие питательные среды используют для выделения микробов кишечной группы?

3. Какие питательные среды применяют для идентификации бактерий кишечных группы?

4. Какие питательные среды используют для определения протеолитических ферментов, выделения сероводорода и активности декарбоксилаз?

Цель занятия:

Среда Борде - Жангу. 1. Приготовление картофельно-глицеринового бульона: 1 кг высококачественного очищенного картофеля нарезают ломтиками, заливают 2 л дистиллированной воды и варят на огне до мягкости или в автоклаве текучим паром 30 мин. К разварившемуся картофелю прибавляют 4% химически чистого глицерина, кипятят 5 мин, затем жидкость через марлю сливают с картофеля. Добавляют до прежнего объема горячую дистиллированную воду, пропуская ее через марлю с картофелем. Осадок в бульоне (крахмал) должен составлять приблизительно 1/3 объема. Стерилизуют 20 мин при 1 атм. Картофельный бульон можно заготовить впрок и хранить более полугода. 2. Отдельно готовят впрок 3% водный агар. Хранить можно неограниченное время. 3. К 1 части картофельного бульона прибавляют 3 части профильтрованного водного агара и химически чистого хлорида натрия из расчета 0,6% на все количество среды. Устанавливают рН 7,0 - 7,2. На открытом огне доводят до кипения. Не фильтруют.

Разливают по флаконам. Стерилизуют 20 мин при 1 атм или 3 дня текучим паром по 30 мин; рН готовой среды 7,0 - 7,2. В растопленную и охлажденную до 50°С среду добавляют 20 - 30% стерильной дефибринированной (можно и недефибринированной) бараньей, лошадиной или человеческой (отходы производства) крови. Тщательно смешивают и разливают в чашки Петри.

Казеиново-угольный агар (КУА), полусинтетическая среда на казеиновом гидролизате. На 1000 см3 дистиллированной воды добавляют в качестве источника азотистого питания казеиновый кислотный гидролизат из расчета, чтобы в готовой среде содержалось 150 - 170 мг % аминного азота; хлорид натрия из расчета концентрации в готовой среде 0,75 - 0,9%; КН2РО4 - 0,5 г, MgCl2 - 0,4 г или 2 см3 20% раствора, крахмал растворимый - 1,5 г, СаС12 - 0,01 или 1 см3 1% раствора, FeSO4 - 0,01 г или 1 см3 1% раствора, CuSO4 - 0,005 г, или 1 см3 0,5% раствора, цистеин или цистин - 0,03 г или 2 см3 1,5% раствора, дрожжевой диализат - 100 см3, агар-агар - 25 г, уголь активированный - 2 г.

Приготовление казеинового кислотного гидролизата, дрожжевого диализата и гидролизата. Казеиновый гидролизат и дистиллированную воду смешивают в эмалированной кастрюле или в стеклянной бутыли и нейтрализуют до рН 7, по бромтимоловому синему (зеленоватый цвет). Затем вносят навески хлорида натрия, КН2РО4, MgCl2. Крахмал предварительно растворяют в небольшом количестве горячей воды. Остальные соли, цистеин и дрожжевой диализат (гидролизат) добавляют в последовательности, указанной в прописи. Доводят объем жидкости дистиллированной водой до 1 л и вносят набухший агар-агар, предварительно промытый в течение нескольких часов под струей водопроводной воды.

Смесь подогревают до кипения (над пламенем горелки либо в автоклаве). Устанавливают рН 7,3, вносят активированный уголь и тщательно перемешивают.

Среду КУА разливают в пробирки и во флаконы, стерилизуют при 110°С 30 мин.

После стерилизации среду тщательно перемешивают, встряхивая до равномерного распределения угля. Пробирки до охлаждения размещают в наклонном положении для получения скошенной поверхности, среду из флаконов стерильно разливают в чашки Петри. Вторичное прогревание среды приводит к инактивации цистеина и поэтому не рекомендуется. Готовая среда должна быть черного цвета. Конденсационная вода не должна содержать частиц угля. Среда, разлитая в чашки Петри, при хранении в холодильнике годна в течение месяца. Выпускается сухая среда КУА.

Молочно-кровяной агар. К 1 л водопроводной воды добавляют 10 г хлорида натрия и 40 - 45 г сухого питательного агара, варят в автоклаве. К горячему агару добавляют равное количество молока (после отстаивания и снятия верхнего жирного слоя), подогревают до 65 - 70°С, перемешивают и оставляют в текучепаровом аппарате на 30 - 40 мин, после чего фильтруют в том же аппарате через несколько слоев марли. Фильтрованную среду (остается мутной) разливают по бутылям и стерилизуют при 0,5 атм 20 мин. Перед употреблением к расплавленному и остуженному агару добавляют 20 - 25 см3 дефибринированной крови любого происхождения.

Вопросы для самопроверки:

1. Харктеристика среды Борде-Жангу.

2. Приготовление казеиново-угольного агара.

3. Состав молочно-кровяного агара.

ознакомить слушателей с составом и приготовлением питаЦель занятия:

Сахарный бульон. Смешивают 1 л перевара Хоттингера и 2 л мясной воды, прибавляют 0,5% хлорида натрия, подогревают до 80 - 90°С, устанавливают рН 8,0, после чего кипятят 30 мин. Дают бульону отстояться в теплом месте 2 ч, фильтруют, разливают. В качестве питательной основы можно взять и бульон Мартена (рН 8,2); рекомендуется для стрептококка. Бульон стерилизуют при 0, атм 30 мин или 3 дня текучим паром по 30 мин. Приготовляют впрок 40% стерильный раствор глюкозы: в бутыль насыпают 40 г глюкозы и наливают до объема 100 см3 стерильную дистиллированную воду, стерилизуют 1 - 2 дня текучим паром по 30 мин и с соблюдением строжайших правил асептики прибавляют глюкозу к бульону с таким расчетом, чтобы содержание сахара в бульоне составляло 1 - 2%. Для проверки стерильности ставят в термостат при 37°С на 24 ч.

Для выращивания большинства кокков требуется создать условия, близкие к естественным в организме. Питательные среды должны поэтому содержать жидкости животного происхождения: кровь, сыворотку, желчь и др.

Сывороточный агар. К расплавленному и охлажденному до 45°С агару рН 7,4 прибавляют 15 - 20% лошадиной или бычьей сыворотки, тщательно перемешивают, избегая образования пены, разливают по чашкам Петри. Можно прибавить к агару сыворотку, обработанную формалином; к нормальной сыворотке прибавляют 0,2% формалина, смешивают, прибавляют 0,2% аммиака и опять смешивают, после чего сыворотку разводят двумя объемами дистиллированной воды, стерилизуют текучим паром и разливают по пробиркам. К 3 частям агара прибавляют 1 часть формол-сыворотки (формол-сывороточный агар).

Гормональный агар Бейли. К 1 л дистиллированной воды добавляют 20 - г агара (предварительно увлажненного) и расплавляют при 1 атм 30 мин. Охлаждают до 40 - 50°С и добавляют по 250 г говяжьего мяса и бычьего сердца, тщательно освобожденных от жира и сухожилий и нарезанных кусочками. Смесь постепенно нагревают - 1 ч при 68°С, затем 35 - 40 мин при 80°С. Жидкость сливают с мяса и фильтруют через марлю (не через вату). Прибавляют 1 г пептона, г хлорида натрия. Пептон и NaCl надо заранее растворить в дистиллированной воде. Кипятят 15 мин, устанавливают рН 7,5. Дают агару отстояться и декантируют верхнюю часть с осадка или оставляют до следующего дня для застывания, затем отрезают прозрачную часть от осадка, расплавляют текучим паром 1 ч. Не фильтруют. Разливают и стерилизуют текучим паром 3 дня по 1 ч.

Бульон Левинталя. В бутыль помещают 100 г мяса, пропущенного через мясорубку, и 300 мл дистиллированной воды, прибавляют 10 см3 нормального раствора бикарбоната натрия (Na2CO3), хорошо перемешивают и ставят в термостат на 1 - 2 ч. Затем прибавляют 0,5 г панкреатина, растворенного в 20 - 30 мл воды с 2 мл нормального раствора бикарбоната натрия, 10 см3 хлороформа и оставляют в термостате на сутки, часто встряхивая. Отдельно готовят 0,8% буферный раствор фосфата натрия в дистиллированной воде, подкисляют хлористоводородной кислотой до рН 5,6 - 6,0.

Для приготовления бульона смешивают равные количества буферного раствора и мясной кашицы, кипятят, фильтруют, устанавливают рН 7,2 - 7,4, снова кипятят, разливают в пробирки или флаконы и стерилизуют 2 дня текучим паром по 30 мин. Пептон и хлорид натрия не прибавляют.

Кровяной агар Левинталя. К растопленному агару, приготовленному на мясном бульоне и охлажденному до 70°С, добавляют 10% дефибринированной крови. Тщательно перемешивают и ставят на огонь через асбестовую сетку, все время встряхивая. При образовании пены агар снимают с огня. Повторяют такое кипячение 3 раза. Дают немного отстояться для осаждения сгустков. Стерильно разливают отдельно прозрачную часть во флаконы для чашек и нижнюю часть с осадком в пробирки. Контроль стерильности проводят в термостате при 37°С - 48 ч.

Среда Чапмена - Бернса для дифференциации патогенных стафилококков от непатогенных. К 1 л мясопептонного агара прибавляют 3,3 см3 0,1% водного раствора кристаллического фиолетового и 5 г лактозы. Устанавливают рН 6,8.

Стерилизуют при 0,5 атм 30 мин. Патогенные стафилококки вырастают быстрее, чем непатогенные, и дают фиолетовые и оранжевые колонии.

Желточно-солевой агар Чистовича для стафилококка. В расплавленный и остуженный до 60°С мясопептонный aгар рН 7,2 с 10% хлорида натрия прибавляют 10 - 20% желточной взвеси. Желток асептически извлекают из яйца, взбалтывают с 200 мл изотонического раствора хлорида натрия. Смешивают тщательно агар с желточной взвесью, разливают в чашки Петри.

Молочно-солевой агар для стафилококка. К 100 см3 расплавленного и остуженного 6,5% солевого агара добавляют 10% стерильного молока. Тщательно перемешивают, разливают в чашки Петри. Чашки подсушивают 10 - 15 мин в термостате.

Шоколадный агар. К растопленному горячему 2% питательному агару с 0,5% глюкозы рН 7,4 прибавляют очень небольшими порциями при постоянном покачивании колбы с агаром 8% дефибринированной крови (можно пользоваться кровью любого животного). Агар слегка подогревают на слабом огне, не доводя до кипения. Перед разливкой в чашки к агару для подавления роста посторонней микрофлоры прибавляют водный раствор генцианового фиолетового в концентрации 1:50 000. При приготовлении шоколадного агара следует обращать особое внимание на правильный прогрев его: при слишком слабом прогреве агар будет иметь кирпично-красный цвет, при слишком сильном - темнокоричневый. Шоколадный агар должен иметь светло-коричневую окраску.

Желчно-кровяной агар Беленького - Поповой. Фильтруют 3% агар, приготовленный на любом бульоне, кроме дрожжевого. К 60% этого агара прибавляют 40% нативной профильтрованной желчи. Разливают во флаконы. Стерилизуют при 1 атм 30 мин. Для изготовления агара с кровью к этому желчному агару добавляют 5% дефибринированной крови. В дальнейшем поступают, как указано для обыкновенного агара с кровью. Среда является элективной для энтерококка.

Молоко с метиленовым синим для дифференциации стрептококков. К мл обезжиренного стерильного молока прибавляют 2 см3 1% водного раствора метиленового синего. Разливают по пробиркам.

Среда Гисса для кокков. Для менингококка, гонококка, пневмококка необходимо на 2 - 3 части готовой среды прибавить с соблюдением правил асептики 1 часть сыворотки.

Формол-сывороточный агар (среда Легру). К 500 см3 лошадиной сыворотки добавляют 1 мл формалина, имеющегося в продаже. Содержимое колбы смешивают и после выдерживания в течение 5 мин при комнатной температуре к смеси добавляют 1 см3 аммиака (22 °С по Боме) для нейтрализации остывшего формальдегида. Затем к обработанной таким образом сыворотке добавляют части стерильной дистиллированной воды. Содержимое колбы хорошо перемешивают и фильтруют через бумажные фильтры во флакон желаемой емкости.

Содержимое флаконов стерилизуют при 110°С 15 мин. Стерильную формолсыворотку можно хранить в лабораторных условиях неопределенно длительное время. Для изготовления питательной среды к предварительно растопленному и охлажденному до 56°С 3% агару добавляют 1/3 формалинизированной сыворотки. Смесь осторожно перемешивают (во избежание образования пузырей воздуха) и разливают в чашки Петри или пробирки для получения скошенного агара.

Эти питательные среды вполне пригодны для выделения менингококковых культур в первой генерации, дальнейшего поддержания штаммов, а также для диагностических целей.

Вопросы для самопроверки:

1. Какие питательные среды рекомендованы для выращивания кокков?

2. Какие элективные питательные среды применяются для кокков?

Цель занятия:

Среда Тароцци. Бычью печень или мясо (можно плаценту) нарезают мелкими кусочками и заливают троекратным количеством питательного бульона рН 7,4 - 7,6, кипятят 30 мин. Бульон фильтруют, а печень (мясо) промывают на сите водопроводной водой и просушивают фильтровальной бумагой, Распределяют по пробиркам по 3 - 4 г печени или мяса и по 7 - 8 мл бульона. Стерилизуют мин при 1 атм.

Полужидкий агар для строгих анаэробов и патогенных стрептококков (Тароцци). В бульон Мартена рН 7,2 - 7,4 (для стрептококков рН 7,6 - 7,8) с 0,3 глюкозы прибавляют 0,1% агар-агара. Разливают по 9 см3 в стерильные пробирки с кусочками вареного мяса, печени или стерильного мясного вареного фарша (отходы от мясной воды), стерилизуют при 120 °С 30 мин.

Полужидкий агар (Н. Н. Клодницкий). В мясопептонном бульоне растворяют 0,5% глюкозы и 0,1% агар-агара. Стерилизуют текучим паром 3 дня по мин. По Вейнбергу добавляют 0,2% глюкозы и 1% агар-агара.

Среда Виллиса - Хоббс. Смешивают 400 мл бульона Хоттингера, 4,8 г агара, 4,8 г лактозы и 1,3 см3 1% раствора нейтрального красного. Автоклавируют, охлаждают до 50 - 55°С и затем добавляют 15 см3 суспензии желтка (куриный желток, смешанный с равным объемом изотонического раствора хлорида натрия) и 60 см3 стерильного обезжиренного молока.

Агар для трубок Виньяля - Вейона. В бульоне Мартена растворяют 0,1% глюкозы, 2% агар-агара. Разливают в Узкие пробирки и стерилизуют 3 дня текучим паром; рН 7,4.

Кровяной агар (Цейсслера). 3% мясопептонный агар с 1 - 2% глюкозы рН 7,2 - 7,4 смешивают (при температуре 50°С) 15 - 20% свежей дефибринированной крови барана, рогатого скота или лошади. Разливают по чашкам Петри и подсушивают в термостате 20 - 30 мин. Выращивают в анаэробных условиях.

Пользуются также кровью кролика или морской свинки, взятой из сердца ех tempore, добавляя ее в количестве 5 – 7 %.

Железо-сульфитный агар (Вильсона - Блер). К 100 см3 3% мясопептонного агара с 1% глюкозы рН 7,4 при температуре 80°С прибавляют 10 см 20% раствора сульфита натрия (Na2S03) и 1 см3 8% раствора хлорида железа (FeCl2), приготовленного на стерильной дистиллированной воде. Раствор Na2SO стерилизуют 1 ч текучим паром. Среду не стерилизуют. Черные колонии образуют анаэробные бактерии и некоторые аэробы за счет восстановления сульфита натрия в сульфат нагрия, который, соединяясь с хлорным железом, образует черный осадок сульфида железа (FeS). При наличии Cl. periringens среда изменяется уже через 1 - 2 ч. Другие виды анаэробов образуют зеленовато-черные колонии через 6 - 18 ч По Б. И. Клейну (1943), сульфит натрия можно заменить гипо сульфитом натрия (Na2S2O3), а хлорид железа - сульфатом (FeS04).

Железо-сульфитное молоко (Робинзон, Стоваль). К 100 см3 обезжиренного молока прибавляют 10 см3 свежеприготовленного 20% раствора Na2S2O3 и 1 см 8% FeCl2. Среду готовят ex tempore и разливают в пробирки. И. Е. Демиховский (1954) получил хорошие результаты на молочной среде с железо-сульфитным комплексом только при применении кислого, свернувшегося молока, которое образует плотную массу, а также при добавлении к молоку 2% агар-агара.

Бульон Вейнберга для анаэробов. 1 кг бычьего сердца, пропущенного через мясорубку, заливают 1 л воды, медленно нагревают до кипения, охлаждают, снимают жир. Смешивают 400 г свиных желудков, 400 г печени, 40 г хлористоводородной кислоты, 4 л воды, подогретой до 50°С, оставляют при этой температуре на 18 - 24 ч, нагревают 10 мин при 100°С, декантируют, фильтруют, добавляют 0,2% двуосновного фосфата натрия, устанавливают рН 7,4.

Смешивают 1 л мясной воды из сердца быка и 2 л пептона, устанавливают рН 7,8 - 8,2, стерилизуют при 120°С 30 мин. Бульон разливают в пробирки и флаконы. К бульону в пробирках и флаконах добавляют кусочки вареной печени, наслаивают стерильное вазелиновое масло слоем 0,5 см и затем стерилизуют при 120°С 30 мин. Перед посевом к бульону добавляют 0,5% глюкозы.

Среда Блаурокка для бифидобактерий (в модификации Г. И. Гончаровой).

К 1 л печеночного бульона добавляют 10 г пептона, 10 г лактозы, 5 г хлорида натрия, 100 мг цистина, 750 мг агар-агара, 1 см3 твина-80; рН среды 7,4. Среду разливают во флаконы по 50 - 100 мл и стерилизуют дробно при 100°С 3 дня по мин или при 110°С (0,5 атм) 30 мин. Перед употреблением разливают в пробирки по 13 - 15 см3 и регенерируют кипячением в течение 40 - 45 мин. Засевают по 1 мл фекалий в разведениях от 10-7 до 10-11, так как при посеве малых разведений вырастают и другие микробы. Для приготовления печеночного бульона 500 г говяжьей печени кипятят в 1 л дистиллированной воды 2 ч. После фильтрации количество отвара доводят до 1 л дистиллированной водой.

Вопросы для самопроверки:

1. Какие питательные среды применяются для выращивания анаэробов?

2. Сколько агара необходимо добавлять в плотные и полужидкие питательные среды?

17.5.2.2.1.2.8 СРЕДЫ ДЛЯ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА ознакомить слушателей с составом и приготовлением питаЦель занятия:

тельных сред для микобактерий туберкулеза Среда Левенштейна-Йенсена. Для приготовления яичной питательной среды используют свежие куриные яйца, срок хранения которых не превышает суток. Яйца перед использованием тщательно моют в воде с мылом, смазывают спиртом. Допускается кратковременное фламбирование яиц да полного сгорания нанесенного на поверхность скорлупы спирта. Яйца разбивают стерильным пинцетом, содержимое выливают в стерильную посуду с бусами и хорошо встряхивают до гомогенного состояния.

Яичная масса, состоящая из 16 яиц и 6 желтков 2%-ный водный раствор малахитового зеленого Солевой раствор Глицерин Вода дистиллированная Приготовление среды. В колбу, содержащую 30 г картофельной муки, постепенно добавляют 600 см3 солевого раствора. Смесь нагревают в водной бане, постоянно взбалтывая до получения раствора вязкой консистенции. Затем к охлажденной смеси добавляют 1000 см3 яичной массы, хорошо размешивают и фильтруют через марлю, добавляют 20 см3 стерильного 2%-ного раствора малахитового зеленого. Смесь тщательно размешивают, доводят рН до 6,8-7, разливают по пробиркам по 4-5 см3 и проводят стерилизацию в наклонном положении при температуре 850С в течение 40 мин в день приготовления и 30 мин на следующий день. После стерилизации на дне пробирок со средой должно оставаться небольшое количество конденсационной жидкости. В случае ее отсутствия необходимо добавлять в каждую пробирку по 0,5 – 1 см3 солевого раствора или физиологического раствора. Для контроля стерильности пробирки со средой помещают в термостат при 370С на 1 суток. Готовые среды желательно использовать сразу. Допускается хранить питательные среды в холодильнике при 4 0С в течение 2-х недель, плотно обернув пачку из 20-30 пробирок в полиэтиленовую пленку.

Среда Международной лиги борьбы с туберкулезом (МIUT). Состав этой среды - среда Левенштейна-Йенсена без крахмала (картофельной муки). Пробки в пробирках герметизируют парафином, что позволяет хранить среды при 40С в течение 6 мес.

Среда Гельберга. Молоко ставят на сутки в холодильник, снимают сливки, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают по 110 см3 во флаконы и стерилизуют в автоклаве при 1 атм, в течение 10 мин. Обычно, после стерилизации в колбе остается 100 см3 молока.

Картофельный отвар готовят из расчета 1 кг очищенного картофеля на см водопроводной воды, кипятят в течение 15 мин, сливают после отстаивания верхний слой и фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Отвар разливают по 110 см3 во флаконы и стерилизуют в автоклаве, доведя давление до 1 атм и сразу отключают.

Яичная масса, состоящая из 6 яиц и 4 желтков Молоко Картофельный отвар Солевой раствор малахитового зеленого Солевой раствор готовят, внося ингредиенты по порядку до полного растворения предыдущего. Для лучшего растворения раствор допускается нагревать. Солевой раствор фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают по 110 см3 во флаконы и стерилизуют в автоклаве, как и картофельный отвар.

Глицерин Вода дистиллированная Приготовление среды. В посуду со стеклянными бусами вносят яичную массу, по 100 см3 молока, картофельного отвара, солевого раствора и 7,5 см3 раствора малахитового зеленого. Смесь тщательно размешивают, разливают по 4- см3 в пробирки и стерилизуют в наклонном положении дважды в течение 2-х суток по 40 мин. После стерилизации на дне пробирок со средой должно оставаться небольшое количество конденсационной жидкости. В случае ее отсутствия необходимо добавлять в каждую пробирку по 0,5 – 1 см3 солевого раствора или физиологического раствора. Для контроля стерильности пробирки со средой помещают в термостат при 370С на 1 сутки. Готовые среды желательно использовать сразу. Допускается хранить питательные среды в холодильнике при 4 0С в течение 2-х недель, плотно обернув пачку из 20-30 пробирок в полиэтиленовую пленку.

Среда Петраньяни. Питательную среду готовят по следующей прописи:

Молоко цельное Картофель средних размеров очищенный мелко нарезанный 2 клубня Яичная масса, состоящая из 8 яиц и 2 желтков Глицерин 2%-ный водный раствор малахитового зеленого Приготовление среды. В посуде со стеклянными бусами смешивают молоко, крахмал, пептон, нагревают в кипящей водяной бане 10 мин до сгущения и оставляют на 1 ч при 560С. Затем к охлажденной до 500С смеси прибавляют яичную массу, глицерин, стерильный раствор малахитового зеленого, тщательно перемешивают. Готовую смесь фильтруют через двойной марлевый фильтр, разливают по 4-6 см3 в пробирки, стерилизуют дважды в наклонном положении при 850С по 40 мин в течение 2-х суток.

Можно вместо малахитового зеленого прибавить смесь красителей. Готовят отдельно 0,2% растворы нейтрального красного и малахитового зеленого и смешивают равные объемы красителей. К 100 см3 среды прибавляют 4 см3 смеси красителей. Цвет среды розоватый. Кислотоустойчивые сапрофиты меняют цвет среды на лиловый. Вирулентные и авирулентные туберкулезные, микобактерии цвета виды не изменяют.

Среда «Новая» (Мордовского) готовят по следующей прописи:

Желточная масса, из 5-6 яиц 2%-ный водный раствор малахитовой зелени Солевой раствор Глицерин Вода дистиллированная Соли растворяют в подогретой дистиллированной воде в указанном порядке. Раствор разливают в колбы и стерилизуют в автоклаве, доводя давление до 1,5 атм. и сразу выключают.

Приготовление среды. Яйца разбивают в асептических условиях, отбирают желтки в колбу со стеклянными бусами, тщательно встряхивают, добавляют на 100 см3 массы 3-5 см3 2%-го стерильного раствора малахитового зеленого и см3 солевого раствора. Смесь хорошо размешивают, разливают по 4-6 см3 в стерильные пробирки и свертывают при 820С в течение 20 мин.

Глицерин Вода дистиллированная Все указанные ингредиенты растворяют в теплой дистиллированной воде и стерилизуют при 1 атм. в течение 20 мин.

Приготовление среды. В посуду с бусами выливают 12 цельных куриных яиц и встряхивают до образования однородной массы, добавляют 10 см3 2%-ного водного раствора малахитового зеленого и 300 см3 солевого раствора. Смесь фильтруют через двойной марлевый фильтр, разливают в пробирки по 4-6 см3 и стерилизуют в наклонном положении при 850С в течение 45 мин.

Среда Петрова. Для приготовления мясного настоя 500 г мясного говяжьего фарша смешивают с 500 см3 15%-ной глицериновой водой, и выдерживают 24 ч на холоде. Перед употреблением настой фильтруют.

Мясной настой Яичная смесь 1%-ный спиртовой раствор генцианвиолета Приготовление среды. Компоненты тщательно перемешивают, разливают по 4-6 см3 в пробирки и стерилизуют при 850С 45-60 мин, в последующие два дня при 750С в течение 45-60 мин. Готовую среду контролируют на стерильность, выдерживая в термостате 3-5 сутки.

Яично-картофельная среда Виноградова.Предварительно готовят картофельный отвар. В водопроводной воде отваривают очищенный картофель в соотношении 2:1 и варят при 1200С 1,5 ч. Горячий отвар фильтруют через марлю, вносят 1% пептона, 0,5% натрия хлорида, 5% глицерина. Смесь стерилизуют в автоклаве и используют по мере необходимости.

Приготовление среды. К 1 части картофельного отвара добавляют 2 части яичной смеси, перемешивают, разливают по 4-6 см3 в пробирки и нагревают в наклонном положении при 900С. Затем в каждую пробирку вносят 0,5-1 см МПБ с глицерином или картофельного отвара и повторно стерилизуют при 1000С два дня по 45 мин.

Среда Дорсе. Вымытые куриные яйца помещают на 10-15 мин в сосуд с этиловым спиртом, затем извлекают и обжигают над пламенем спиртовки, содержимое в стерильных условиях переносят в мерный стакан и доливают 10% дистиллированной воды. Смесь тщательно размешивают, фильтруют через стерильный марлевый фильтр, разливают по 4-6 см3 в пробирки и свертывают в наклонном положении при 70-750С в течение 60 мин. Контроль стерильности осуществляют, выдерживая среды в термостате в течение 3 суток.

Кислотные яичные среды предназначены для культивирования микобактерий из материалов, подвергнутых предпосевной обработке кислотами или щелочами. Например, для посева материала, обработанного щелочами рекомендуются среды №2a и №2b, для нейтральных и кислых инокулятов – среды №1а и №1b с меньшим содержанием соляной кислоты.

Кислотная яичная среда №1a (Zaher, Marks, 1977).

Яичная масса 1N раствор соляной кислоты 2%-ный раствор малахитового зеленого Калий фосфорнокислый двузамещенный, КН2РО4 6,3 г Глицерин Дистиллированная вода Указанные ингредиенты смешивают в последовательности после полного растворения предыдущего. Солевой раствор стерилизуют в автоклаве при 1100С в течение 15 мин.

Приготовление среды. К солевому раствору в асептических условиях приливают яичную массу, 1N раствор соляной кислоты, раствор малахитового зеленого и пенициллин. Смесь тщательно перемешивают, разливают по 4-6 см3 в пробирки и стерилизуют при 75-850С в течение 45 мин.

Кислотная яичная среда №1b.Готовится аналогично среде №1а, но вместо глицерина добавляют 7 г натрия пирувата.

Кислотная яичная среда №2а (Zaher, Marks, 1977).

Яичная масса 1N раствор соляной кислоты 2%-ный раствор малахитового зеленого Калий фосфорнокислый двузамещенный, КН2РО4 2,4 г Глицерин Дистиллированная вода Указанные ингредиенты смешивают в указанной последовательности, внося следующее, после полного растворения предыдущего. Солевой раствор стерилизуют в автоклаве при 1100С в течение 15 мин.

Приготовление среды. К солевому раствору в асептических условиях приливают яичную массу, 1N раствор соляной кислоты, раствор малахитового зеленого и пенициллин. Смесь тщательно перемешивают, разливают по 4-6 см3 в пробирки и стерилизуют при 75-850С в течение 45 мин.

Кислотная яичная среда №2. Среда готовится аналогично среде №1а, но вместо глицерина добавляют 7 г натрия пирувата.

Глицериновый МПБ. К мясопептонному бульону добавляют 5-10 % химически чистого глицерина, рН доводят до 7,2, стерилизуют при 110 0С.

Глицериновый МПА. К мясопептонному бульону добавляют 5-10 % химически чистого глицерина, агар-агар, рН доводят до 7,2, стерилизуют при 110 0С.

Кровяная среда. Непосредственно перед посевом цитратную кровь разводят стерильной дистиллированной водой 1:2 – 1:3, разливают по 3 см3 в стерильные пробирки и вносят для предотвращения пророста банальной микрофлоры, раствор пенициллина из расчета 2 Ед/см3.

Синтетическая среда Вишневского готовится по следующей прописи:

L-аспарагин Глицерин Дистиллированная вода Приготовление среды. Ингредиенты растворяют в указанной последовательности, внося следующее, после полного растворения предыдущего. Раствор подщелачивают до рН 6,8-7,2, фильтруют через бумажный фильтр, разливают в колбы и стерилизуют при 1200С в течение 30 мин.

Среда Данкина.Эта среда предназначена для культивирования микобактерий паратуберкулеза. На 4%-ном глицериновом бульоне выращивают 10-15 суток культуру M.phlei. Путем фильтрации через бумажный фильтр отделяют бактериальную массу, переносят в ступку с 10 см3 глицерина и 100 см3 печеночного экстракта по Дедляеву. Смесь кипятят в течение нескольких мин, отстаивают, к надосадочной жидкости прибавляют смесь из трех яиц и 1%-ного спиртового раствора генцианвиолета в количестве 2,5% к полученному объему смеси. Полученный раствор фильтруют через марлю, разливают по 4-6 см3 в пробирки и стерилизуют в наклонном положении при 80 0С трижды, каждый день по 60 мин.

Приготовление печеночного экстракта по Дедляеву: В 1000см3 воды помещают 400 г говяжей печени и автоклавируют текучим паром при 120 0С. Полученный отвар фильтруют через марлю, устанавливают рН 7, разливают в колбы и стерилизуют при 1000С по 20 мин в течение 3 суток.

Картофельная среда Павловского.Белый картофель средних размеров очищают от кожуры, тщательно моют, вырезают все глазки и заливают 5%-ным раствором стерильной глицериновой воды на 1-2 ч. Затем картофель помещают в колбы и заливают 5%-ным стерильным водным раствором глицерина так, чтобы /3 картофеля оставалась над поверхностью жидкости и автоклавируют при атм. В течении 10 мин. Стерильность контролируют выдерживанием среды в термостате при 370С в течение 2 суток. Можно готовить среду в широких пробирках. Для этого в очищенном картофеле широким трубчатым сверлом, предварительно обтерев его спиртом, вырезают цилиндрические куски, разрезают их по диагонали обожженным ножом, опускают на 2 ч в 1% раствор бикарбоната натрия, а затем вымачивают 2 сут в 5 - 6% глицериновой воде и кладут в широкие пробирки или пробирки с перетяжкой; туда же наливают немного глицериновой воды и стерилизуют 20 мин при 120°С. Готовые пробирки укладывают в наклонном положении поверхностью картофеля, предназначенной для посева, вниз, для того чтобы сохранить ее влажной.

Жидкая полусинтетическая среда Школьниковой готовится по следующей прописи:

Ферментативный гидролизат казеина Глицерин Дистиллированная вода Среду разливают по колбам и стерилизуют автоклавированием при 1,5 атм.

В течение 30 мин. Перед употреблением к среде добавляют 10% плазмы крови.

РН среды обычно не подводят, она сохраняется в пределах 6,8-7.

Жидкая полусинтетическая среда Школьниковой для выделения L-форм микобактерий, модифицированная И.Р.Дорожковой:

L-аспарагин Глицерин Дистиллированная вода Ингредиенты растворяют в указанном порядке, полученный раствор разливают по 700 см3 и автоклавируют при 1200С в течение 30 мин. К 700 см3 горячего (45-500С) раствора приливают 100 см3 стерильного 200%-го раствора сахарозы, 100 см3 сыворотки крупного рогатого скота и разливают в пробирки по см3. Непосредственно перед посевом материала на поверхность среды добавляют антибиотики.

Среда Сотона предназначена для культивирования микобактерий с целью накопления бактериальной массы. Микобактерии, как правило растут на поверности жидкой питательной среды в виде пленки.

L-аспарагин Глицерин Дистиллированная вода Соли растворяют в указанной последовательности до полного растворения предыдущего. Допускается подогревать раствор для улучшения растворения.

Раствор подщелачивают несколькими каплями 30%-го раствора едкого натра или аммиака до рН 7,2, разливают по колбам и стерилизуют в автоклаве при атм. В течение 15 мин.

Среда Курской биофабрики предназначена для культивирования микобактерий с целью изготовления туберкулина.

L-Аспарагин Глицерин Дистиллированная вода Соли растворяют в указанной последовательности до полного растворения предыдущего. Допускается подогревать раствор для улучшения растворения.

Раствор подщелачивают несколькими каплями 30%-го раствора едкого натра или аммиака до рН 7,2, разливают по колбам и стерилизуют в автоклаве при атм. В течение 30 мин.

Вопросы для самопроверки:

1. Какие питательные среды применяются для выращивания микобактерий туберкулеза?

2. Что используют в качестве индикатора при выращивании микобактерий на среде Сотона, Петраньяни?

17.5.2.2.1.2.9 СРЕДЫ ДЛЯ ТУЛЯРЕМИЙНОГО МИКРОБА ознакомить слушателей с составом и приготовлением Цель занятия:

питательных сред для выращивания туляремийного Для приготовления сред можно пользоваться рыбным гидролизатом, изготовленным из свежей рыбы путем триптического переваривания. Хорошие результаты получены при использовании сухой среды Д с добавлением цистина и глюкозы. Кроме питательных сред из рыбного гидролизата, пользуются некоторыми мясными средами, в состав которых входит гидролизат печени, селезенки или мозга животных.

В целях сохранения в средах наибольшего количества витаминов, необходимых для выращивания возбудителя туляремии, гидролизаты печени и крови в отличие от общепринятой методики приготовляют без предварительной температурной обработки, т. е. из сырых продуктов. Для осаждения белковых и других веществ все гидролизаты перед приготовлением среды обрабатывают сульфатом аммония; рН среды 7,1 - 7,2. Среды стерилизуют при 120°С. Чувствительность рыбного агара, в том числе агара Д, можно значительно повысить добавлением к нему кроличьей или лошадиной дефибринированной или цитратной крови'. Кровь в количестве 10% добавляют к расплавленной и затем охлажденной до 40 - 45°С среде. Цвет среды при этом становится красным. Для получения большого выхода культуры к агаровым средам добавляют 0,1% цистина, 1% глюкозы и дрожжевого экстракта.

Свернутая желточная среда, предложенная Мак-Коем и Чепиным (желток 60%, изотонический раствор хлорида натрия 40%). Дистиллированную воду для изотонического раствора хлорида натрия необходимо подщелочить до рН 7, - 7,2 (зеленый цвет с бромтимоловым синим). В целях более надежной стерилизации свертывание производят при 80°С в течение 1 ч. При еще более высокой температуре происходит излишнее уплотнение среды, снижающее ее качество.

Чтобы улучшить качество желточной среды, к ней добавляют аутолизат пивных дрожжей перед свертыванием среды из расчета на 60% желтка, 20% аутолизата и 20% изотонического раствора хлорида натрия.

Агар на рыбно-дрожжевом гидролизате (О. С. Емельянова). К 100 см дистиллированной воды добавляют гидролизата свежей рыбы 20 см3, гидролизата желатина 10 см3, аутолизата дрожжей 2,5 см3, хлорида натрия 0,5 г, глюкозы г, цистина 0,1 г, агар-агара в зависимости от его качества от 1,5 до 2,5 г. После стерилизации в расплавленную среду, охлажденную до 45 °С, добавляют 10 % дефибринированной крови кролика, разливают в пробирки и скашивают либо разливают в чашки Петри.

Мартеновский дрожжевой агар: мартеновского бульона 930 см3, дрожжевого аутолизата 70 см3, глюкозы 10 г, цистина 1 г, хлорида калия 0,4 г, хлорида натрия 3 г, бикарбоната натрия 0,1 г, сульфата магния 0,3 г, двуосновного фосфата натрия 0,8 г, едкого натра 5% (раствор добавлять до рН 7,2 - 7,4), агар-агара 30 г.

Дрожжевой аутолизат готовят впрок по следующему рецепту. Пивные дрожжи отмывают от сусла водопроводной водой в высоких цилиндрах, воду сменяют 3 - 4 раза. Аутолиз проводят при 56 - 58°С в течение суток. За неимением специального термостата можно пользоваться водяной баней, а на ночь помещать дрожжи в термостат при 37°С. На следующий день аутолизат кипятят на открытом огне 20 мин, затем подщелачивают едким натром по лакмусу до слабощелочной реакции и разбавляют водой: на 1 часть аутолизата добавляют части воды. После этого аутолизат вновь кипятят 40 мин и фильтруют через бумажный фильтр. Прозрачный аутолизат стерилизуют 30 мин при 120°С. Простерилизованный аутолизат сохраняется длительный срок и используется для приготовления сред по мере надобности.

Полужидкая (коллоидная) среда Дрожевкиной: 10% куриных желтков и 90% стерильного изотонического раствора хлорида натрия. Среда не выдерживает стерилизации.

Полужидкие среды находят применение при выращивании вакцинной культуры. В состав сред входят гидролизаты свежей рыбы, печени или мяса - - 30%, гидролизат желатина - 10%, дрожжевой аутолизат - 1 - 5%, желатин хлорид натрия - 0,5%, глюкоза - 1%, цистин - 0,1%; рН среды 7,2 - 7,3. Все гидролизаты получают путем ферментативного переваривания при добавлении поджелудочной железы или панкреатина. Гидролиз ведут до получения аминного азота от 0,6 до 0,8%. Выращивание культуры производят глубинным методом с применением аэрации.

Вопросы для самопроверки:

1. Какие питательные среды применяются для выращивания туляремийного миркоба?

2. Какие особенности изготовления питательных сред для туляремийного микроба имеются с целью сохранения наибольшего количества витаминов?

ознакомить слушателей с составом и приготовлением питаЦель занятия:

Питательными средами для всей группы бруцелл служат обычный мясопептонный бульон и мясопептонный агар, рН сред 6,6 - 7,2. Вместо мяса можно применять коровью печень, богатую аминокислотами, необходимыми для роста бруцелл. Хороший рост получают на сухом питательном агаре Д. Однако наиболее эффективны среды, приготовленные на основе печеночного настоя, получаемого следующим образом. Фарш из свежей говяжьей печени заливают водой (1 л на 1 кг фарша), настаивают 3 ч при 25 - 30°С или 6 - 10 ч при 4 - 10°С, затем варят около 2 ч; после варки настой фильтруют через ватно-марлевый фильтр и стерилизуют при 115 - 120°С 20 мин. Для получения печеночного бульона настой разводят водой 1:1, добавляют 1% пептона и 0,5% хлорида натрия; при приготовлении печеночного агара дополнительно вносят 2 - 2,5% агар-агара; рН среды должен быть 7,1 - 7,2. Применимы и другие прописи печеночных питательных сред.

Мясо-печеночно-пептонный агар в пробирках (рН 6,6). Под пробку пробирок помещают полоски фильтровальной бумаги, пропитанные насыщенным раствором ацетата свинца; они служат для дифференциации бруцелл по выделению сероводорода. Обильное и длительное образование сероводорода характерно для Br. abortus bovis. Культуры Br. melitensis не образуют сероводорода.

Полужидкий агар: мясной воды 500 мл, дистиллированной воды 500 мл, натрия хлорида 5 г, пептона 2 г, агара 2 г. Стерилизуют 20 мин при 1,5 атм, рН 6,8 - 7,0.

К 100 мл расплавленного и остуженного до 45°С агара прибавляют 4 мл основного раствора тионина из такого расчета, чтобы получить разведение красителя 1:25 000; если применять фуксин, то надо прибавлять основной раствор из расчета разведения красителя 1:50000. Приготовление основного раствора: 0, г красителя растирают и растворяют в 20 мл спирта в ступке, постепенно добавляя до 80 мл дистиллированной воды. Сливают во флакон так, чтобы смылся весь краситель из ступки. Основные растворы 1:1000 в закрытом сосуде, помещенном в темное место, сохраняются долго. Агар с красителями разливают по мл в пробирки и проверяют на стерильность 2 сут в термостате. Среду используют для выделения бруцелл из бактериально загрязненного материала. Кроме того, по бактериостатическим свойствам можно дифференцировать виды бруцелл по разной их устойчивости к анилиновым красителям.

Имеются и другие питательные среды для выращивания бруцелл, приведенные в таблице 20.

Таблица 20 - Питательные среды для культивирования бруцелл Мясопептон- Печеночная вода 500, Мясопептонный Печеночная вода 500, Щелковского пептон ферментат. 5, Эритрит агар Готовая питательная ный и печеноч- сода двууглекислая 17, но-аминопеп- (20% р-р) Вопросы для самопроверки:

1. Какие питательные среды применяются для выращивания бруцелл?

2. Какие среды используют для дифференциации видов бруцелл?

3. Какие среды используют для дифференциации вакцинных и вирулентных штаммов бруцелл?

ознакомить слушателей с составом и приготовлением питаЦель занятия:

Водно-сывороточная среда. Водопроводную, колодезную, речную, нехлорированную или дистиллированную воду (рН 7,2 - 7,4) разливают в пробирки по 3 - 5 см3 и стерилизуют при 120°С 30 мин. Если исходная вода имеет кислую реакцию, то добавляют 4% раствор двузамещенного фосфата натрия или калия (Na2HPO4 или К2НРО4) до рН 7,2 - 7,4.

Пробирки с выпавшим после автоклавирования белым кристаллическим или аморфным осадком бракуют; в пробирках с прозрачным содержимым выборочно проверяют рН. Для посевов берут пробирки с рН 7,2 - 7,4. После этого в каждую пробирку добавляют в стерильных условиях инактивированную в течение 30 мин при 56°С кроличью или баранью сыворотку в количестве не менее капли на 1 см3 среды.

Среда для исследования воды на лептоспиры (В. И. Терских). К 300 мл исследуемой воды добавляют 10 см3 20% раствора фосфатно-буферной смеси (рН 7,2), 1 см3 желтка свежего куриного яйца и 1 см3 расплавленного слабощелочного мясопептонного агара. Смесь осторожно перемешивают и разливают по 20 см3 в чашки Петри.

Вопросы для самопроверки:

1. Какие питательные среды применяются для выращивания лептоспир?

2. Какие среды используют для исследования воды на наличие лептопир?

17.5.2.2.1.2.12 СРЕДЫ ДЛЯ ДРОЖЖЕЙ И ГРИБОВ ознакомить слушателей с составом и приготовлением питаЦель занятия:

Среда Сабуро. Основой этой среды является дрожжевая вода. На 1 л водопроводной (недистиллированной)1 воды берут 80 г прессованных пекарских дрожжей (или 20 г сухих дрожжей), кипятят 15 мин, фильтруют через бумажный фильтр, разливают по флаконам и стерилизуют при 1 атм 20 мин. К 100 см 3 стерильной.дрожжевой воды добавляют 1% пептона, 2% агара, нагревают до растворения агара, затем добавляют 4% глюкозы (или мальтозы), 7 фильтруют, разливают в пробирки и стерилизуют при 0,5 атм 20 мин. После стерилизации среду в пробирках скашивают. Выращивание длится 48 ч при 22°С. Среду можно готовить и не на дрожжах, а на обычной 1 % пептонной воде.

Жидкая среда Сабуро отличается от описанной выше тем, что не содержит агар-агара. Среду разливают в колбы по 150 - 200 см3, стерилизуют так же, как описано выше. Эта среда употребляется главным образом для получения гемокультуры.

Пивное сусло-агар. Неохмеленное пивное сусло разводят водопроводной водой до содержания сахара 7 - 8° по Баллингу (измеряют сахарометром) и стерилизуют в бутылях при 110°С 10 мин. В таком виде сусло может сохраняться длительное время. Перед употреблением надосадочную жидкость осторожно сливают с осадка. В 1 л стерильного сусла добавляют 18 г агар-агара, нагревают до растворения агара и разливают среду в стерильные пробирки, стерилизуют при 110°С 10 мин. Жидкое сусло после сливания отстоявшейся жидкости с осадка разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при режиме, указанном для сусло-агара.

Рисовая среда Левиной (для быстрой идентификации Candida albicans). 20 г риса в зернах измельчают в ступке и заливают 500 см3 дистиллированной воды, стерилизуют текучим паром 45 мин. Укрывают тепло и оставляют для отстаивания, затем фильтруют через 4 слоя марли. Осадок не отжимают. 20 г агар-агара расплавляют на открытом огне или текучим паром в 500 см 3 дистиллированной воды, фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Фильтрат агара смешивают с фильтратом риса и добавляют дистиллированной воды до 1 л. Стерилизуют при 1 атм (120°С) 20 - 30 мин. Разливают в чашки Петри, на которые производят прямой посев материала. Чашки с посевом плотно завертывают в 2 слоя бумаги и выдерживают при комнатной температуре или при 30°С 18 ч. Результаты посева рассматривают под малым увеличением микроскопа непосредственно на чашке. Отмечают филаментацию, тип микроколоний (паукообразный, звездчатый, круглый и др.).

Кровяной агар: мясного экстракта 3 г, пептона 10 г, натрия хлористого 5 г, дистиллированной воды 1000 см3, агара 20 г. Среду стерилизуют в автоклаве при 1 атм 15 минут, устанавливают рН 7,8, фильтруют через вату и марлю в бутылки или другую посуду и вновь стерилизуют при 1 атм. 20 минут.

В расплавленный и охлажденный до 40° агар добавляют 1% стерильной глюкозы и 1% стерильной цельной крови, разливают в пробирки и скашивают.

Кровяной агар лучше готовить на настое из мозга и сердца.

На этой среде можно культивировать A. bovis, грибы Candida, С.

farciminosus и др.

Агар Литмана с бычьей желчью: пептона 10 г, глюкозы 10 г, бычьей желчи (обезвоженной) 15 г, кристаллвиолета 0,01 г, воды 1000 мл, агара 20 г. Среду стерилизуют в автоклаве при 1 атм. 15 минут, затем охлаждают до 45° и при необходимости добавляют антибиотики (если материал загрязнен). Разливают в чашки высоким слоем для предупреждения обезвоживания среды при длительном культивировании.

Среда пригодна для выделения дерматофитов, грибов группы Candida.

Кукурузный агар: кукурузной муки 40 г, воды 1000 мл, агара 20 г.

Всыпают кукурузную муку в 500 мл холодной воды и кипятят в течение часа. Фильтруют через марлю, растворяют агар в остальных 500 см3 воды, смешивают фильтрат кукурузной муки с агаром. Добавляют воды, чтобы получить 1000 мл, разливают в пробирки и стерилизуют при 1 атм 15 минут.

Морковно-картофельный агар: моркови 100 г, картофеля 100 г, желчи (обезвоженной) 3 см3, агара 9 г, воды 500 см3. Вымытую морковь и очищенный картофель пропускают через мясорубку, настаивают в течение часа в воде, кипятят 10 минут; фильтруют через вату, добавляют агар и стерилизуют 15 минут при 110°С. После стерилизации фильтруют через вату и марлю и добавляют бычьей желчи, разливают по колбам и пробиркам и стерилизуют при 110°С минут или текучим паром три дня подряд по 20 - 30 минут. Кукурузный и морковно-картофельный агар с желчью используют для развития хламидоспор и дифференциации видов Candida.

Мозговой агар (полужидкий): мясного экстракта 10 г, пептона 10 г, натрия хлористого 5 г, агара 2 г, дистиллированной воды 1000 мл. Среду кипятят и добавляют 2 г глюкозы; рН среды 7,8.

Приготовление мозга: телячий мозг, освобожденный от оболочек, режут небольшими кусочками, кладут их в колбы или в пробирки и стерилизуют в автоклаве при 1 атм. 20 минут. В таком виде мозг хранится.

Приготовление агара из мозга. 2 - 3 кусочка мозга помещают в пробирку, туда же добавляют небольшое количество порошка мрамора и заливают агаром слоем до 5 см. Стерилизуют в автоклаве при 1 атм. 20 минут.

Трихофитон-агар: свободного витамина казаминовой кислоты 2,5 г, декстрозы 40 г, калия фосфорнокислого основного 1,8 г, магнезии сернокислой 0, г, агара 15 г.

Ингредиенты растворяют в 1000 см3 дистиллированной воды, разливают в пробирки или колбы и автоклавируют в течение 12 минут при 121о.

К основной среде добавляют: инозитол - для Т. faviforme, A. schoenleinii, Т.

concentricum; инозитол или тиамин - для Т. crateriforme, T. gypseum, Т. rubrum;

тиамин - для Т. megnini и Т. equinum, никотиновую кислоту - для A. gallinae.

Трихофитон-агар: аммония азотнокислого 1,5 г, декстрозы 40 г, магнезии сернокислой 0,1 г, калия фосфорнокислого 1,8 г, агара 15 г, воды 1000 см3.

К среде добавляют гистидин для дифференциации Т. equinum, T. megnini и A. gallinae.

Xламидоспоровый агар: аммония фосфорнокислого одноосновного 1 г, калия фосфорнокислого одноосновного 1 г, биотина 5 мг, трипанблау 0.1 г, очищенного полисахарида 20 г, воды дистиллированной 1000 см3, агара 15 г. Стерилизуют при 121°С 15 минут, рН 5,1.

Чашки или пробирки с агаром засевают путем разреза агара, культивируют при 25°С от 2 до 4 дней.

Хламидоспоры С. albicans окрашиваются в голубоватый цвет, а мицелий остается бесцветным.

Этот метод посева позволяет проводить микроскопическое исследование через стекло положенное на агар.

Среда бисмут-глициноводрожжевая: дрожжевого экстракта 1 г, глицина 10 г, декстрозы 10 г, бисмута сернокислого (индикатор) 8 г, агара 20 г.

Сухую среду - 49 г заливают 1000 см3 дистиллированной воды и нагревают до полного растворения. Среда может содержать хлопья. Поэтому перед разливкой ее следует взболтать. Готовая среда не требует определения рН. Колонии Candida albicans черные металлического оттенка и без диффузии пигмента в среду; С. tropicalis с металлическим блеском и диффузией пигмента в среду.

Среда Чапека: глюкозы 3 г, натрия азотнокислого 0,2 г, калия фосфорнокислого одноосновного 0,1 г, магния сернокислого 0,05 г, калия хлористого 0, г, железа сернокислого 0,001 г, воды дистиллированной 100 мл. Для приготовления плотной среды добавляют 2 - 3% агар-агара и стерилизуют при давлении 0, атм. 20 минут.

Применяется для первичного выделения грибов из кормов, для выделения чистой культуры, для дифференциации и поддержания культур многих видов грибов.

Среда Ван - Итерсона: аммония азотнокислого 0,05 г, калия фосфорнокислого одноосновного 0,05 г, воды водопроводной 100 см3. Стерилизуют при давлении атм 20 минут. Применяется для выделения грибовцеллюлозоразрушителей (посев грубых кормов во влажную камеру).

Декстрозный агар (картофельная среда): очищенного картофеля 20 г, декстрозы 1,5 г, агар-агара 2,5 г, воды водопроводной 100 см3.

Очищенный картофель режут тонкими ломтиками, заливают водой и помещают на 40 минут в текучепаровой аппарат. Затем жидкость фильтруют через плотную ткань, добавляют к ней агар-агар. Смесь снова кипятят, фильтруют через слой марли с ватой, разливают по пробиркам и стерилизуют при давлении 0,5 атм. в течение 30 минут. рН среды 6,6 - 6,8. Применяется для культивирования грибов из рода Fusarium.

Подкисленный декстрозный агар. В каждую пробирку с декстрозным агаром добавляют после стерилизации или в момент разливки по чашкам по одной капле 25%-ного раствора молочной кислоты. Используется, как и предыдущая среда, для культивирования фузариев.

Среда Билай: сахарозы 0,1 г, глюкозы 0,1 г, калия фосфорнокислого одноосновного 1 г, калия азотнокислого 2 г, магния сернокислого 0,5 г, калия хлористого 0,5 г, железа сернокислого следы, крахмала растворимого 0,1 г, воды дистиллированной 1000 мл.

Среду разливают по 5 мл в пробирки и в каждую вставляют полоску фильтровальной бумаги. Четверть полоски погружают в раствор, стерилизуют при давлении 1 атм. 20 минут. На этой среде наблюдается обильное спорообразование видов фузариев. Кроме того, на ней возможно производить разделение и очистку культур.

Глюкозо-пептонная среда (Водена и Готье): глюкозы 3 г, пептона 1 г, воды водопроводной 100 см3.

Среду используют для накопления токсических веществ грибов родов Aspergillus, Penicillium.

Стерилизуют при давлении 0,5 атм. 30 минут.

Среда Чапека - Докса: азотнокислого калия 1 г, азотнокислого натрия 3 г, хлористого калия 0,5 г, сернокислой магнезии 0,5 г, сернокислого железа 0,015 г, дрожжевого экстракта 50 см3, воды водопроводной 1000 см3. Среду стерилизуют при температуре 120°С 30 минут. Перед посевом в среду добавляют стерильный 40%-ный раствор глюкозы с таким расчетом, чтобы окончательное содержание ее в среде было 4% Среду используют для накопления токсических веществ многих сапрофитных грибов.

Среда Ролена: сахарозы 5 г, калия фосфорнокислого одноосновного 0,1 г, магния сернокислого 0,1 г, меди сернокислой 0,007 г, азотнокислого аммония 0, г, воды дистиллированной 100 см3. Стерилизуют при давлении 0,5 атм. 20 минут.

Среда является наиболее благоприятной для накопления токсическ их веществ.

Сенной настой. Нарезанное кусочками сено (без цветов) помещают в колбу, заливают водопроводной водой в соотношении 1:2 по объему( закрывают ватной пробкой и кипятят в течение 20 минут. Затем колбу помещают в термостат (22 - 25°С) на трое суток для накопления в среде сенной палочки (Вас.

subtil'is), которая служит кормом для парамеций. После этого в полученную среду помещают каплю с парамециями. Культивируют парамеций при комнатной температуре, периодически (1 раз в месяц) пересевая в новую среду.

Молочная среда. Кипяченую воду оставляют на одни сутки для насыщения кислородом; на каждые 15 - 20 см3 добавляют 2 - 3 капли сырого снятого молока.

В среде развиваются молочнокислые бактерии, которыми питаются парамеции. - 2 раза в месяц в среду добавляют молоко.

Для выделения грибов дерматофитов в чистую культуру используют следующие питательные среды пораженные волосы, которые освобождают от корочек, измельчают на прокаленном над пламенем горелки стекле или в стерильной чашке Петри и петлей переносят на поверхность питательной среды - сусло-агар и агар Сабуро с глюкозой.

Вопросы для самопроверки 1. Питательные среды для дрожжей и грибов.

2. Основная характеристика питательных сред для дрожжей и грибов.

Лабораторные диагностические вирусологические исследования патологического материала обычно проводят по следующей схеме (рис. 4 ):

Микроскопия (световая, электронная, Заражение куриных эмбрионов, культуры Классификация инфекционных Рисунок 4 - Схема проведения вирусологических исследований Вопросы для самопроверки:

1. Схема проведения диагностических вирусологических исследований материала, взятого от животных подозрительных в заболевании.

17.5.3.1 ПРИГОТОВЛЕНИЕ СУСПЕНЗИИ ИЗ ПАТОЛОГИЧЕСКОГО

МАТЕРИАЛА ДЛЯ ВИРУСОЛОГИЧЕСКИХ

ИССЛЕДОВАНИЙ

Вирусологический материал тщательно измельчают ножницами, растирают в ступке пестиком с добавлением стерильного песка и суспензируют в 10-кратном объеме физиологического раствора, содержащего 50 ЕД/мл пенициллина, 250 мкг/мл стрептомицина и 50 ЕД/мл нистатина. Суспензию центрифугируют 10 минут при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость используют для следующего этапа дальнейших вирусологических исследований (фильтрация, микроскопия).

Фильтрация. Бактериальные фильтры состоят из различных материалов:

фарфоровые свечи Шамберлана – из каолина и кварцевого песка; фильтры Беркефельда – из инфузорной земли и асбеста; фильтры Мандлера – из инфузорной земли, асбеста и гипса; фильтровальные пластинки Зейтца – из минеральных силикатов волокнистой, гибкой структуры и асбеста.

Бактериальные фильтры изготовляют на заводах в специальных печах при определенном давлении и высокой температуре (нагрев до красного каления).

В зависимости от степени порозности фильтра различают их разные марки и номера.

Фильтры Шамберлана имеют девять разных степеней порозности;

обозначают их LI, L2,. L3, L4, L5, L6, L7, L8, L9, LII, LI3. Фильтры от LI до L крупнопористые, остальные - мелкопористые. Эти фильтры прочные, но хороши, пока новые; перед повторным использованием их необходимо очищать.

Фильтры Беркефельда имеют три степени порозности; обозначают их V, N и W. Величина пор у этих свечей различная: V (грубые) - 8 - 12 ; N (нормальные) - 5 - 7, W (плотные) - 3 - 4. В отличие от свечей Шамберлана у фильтров Беркефельда большая скорость фильтрации, но они более ломкие.

Свечи ГИКИ готовят на заводе из каолина шести разных степеней порозности. Их обозначение Ф-1,Ф-2, Ф-3, Ф-5, Ф-7 и Ф-11. Величина пор свечей ГИКИ в основном соответствует величине пор свечей Шамберлана (таблица 21).

Чем выше номер фильтра, тем меньше порозность свечи.

Определяют порозность фильтров по скорости фильтрации воды при разрежении воздуха в сосуде до 30 мм ртутного столба.

Таблица 21 - Размеры пор фильтров Свечей ГИКИ Свечей Шамберлана Свечей ГИКИ Свечей Шамберлана Асбестовые фильтры. (фильтры Зейтца) – полутвердые пластины или диски. Выпускают асбестовые фильтрующие пластины двух марок: Ф фильтрующие взвешенные частицы, пропускающие некоторые бактерии, и СФ стерилизующие пластинки. Диаметр пластинок 35 и 140 мм. Фильтры Зейтца по сравнению с другими фильтрами, имеют ряд преимуществ. Они просты в обращении, имеют малую адсорбционную способность при фильтрации вирусов, а также дешевы, что позволяет применять каждый раз новую пластинку.

Установка фильтров. Твердые фильтры перед использованием предварительно проверяют на целостность. Для этого на открытое отверстие свечи надевают резиновую трубку с резиновой грушей (шары Ричардсона).

Затем свечу погружают вертикально в стеклянный цилиндр с водой и, накачивая воздух в полость свечи, следят за появлением на всей поверхности свечи пузырьков воздуха. Если они возникают неравномерно при сравнительно малом давлении, свечу признают дефектной. В особых случаях свечи проверяют на задержку особо мелких микроорганизмов, например чудесной палочки (В.

prodigiosum) или бактерий холеры птиц (Pasteurella). В случае прохождения контрольных микроорганизмов фильтры не используются.

Пригодные к использованию фильтры монтируют в стеклянных сосудах Вакуум в резервуаре при фильтрации взвеси патологического материала создают специальным насосом. Степень разрежения воздуха определяют манометром. Разрежение воздуха не должно превышать 40 мм ртутного столба (в среднем 20 - 30мм).

Полутвердые фильтры (пластинки) закрепляются в колбах Уленгута или в специальных приборах, состоящих из металлических воронок с нижней опорной частью, заканчивающихся трубкой. Фильтровальные пластинки укладывают на металлическую сетку, размещенную на опорной части прибора, а затем винтами прикрепляют верхнюю часть воронки. Весь прибор с приемником стерилизуют в автоклаве при температуре 120° в течение 30 минут.

Мягкие, или градоколевые, фильтры используют для ультрафильтрации, то есть для задержки частиц от 300 m до 1. Ультрафильтры готовят из различных материалов (коллодия, агара и др.), однако наибольшее значение приобрели мембранные ультрафильтры, изготовляемые из нитроклетчатки, растворенной в эфирно-спиртовой смеси. Вируссодержащую жидкость через эти фильтры пропускают в специальном аппарате под сильным давлением.

Мембраны хранят только в воде и стерилизуют кипячением. Мягкие фильтры используют также и для определения коли-индекса. Для этого через мембраны в приборах Зейтца фильтруют соответствующие количества испытуемой воды, затем мембраны вынимают и помещают на среду Эндо. По числу выросших типичных красных колоний на фильтровальных кружках судят о количестве кишечных палочек в пропущенном через мембрану объеме воды. Сначала определяют коли-индекс, который переводят в коли-титр.

Фильтрация - не простое прохождение жидкости (взвеси, суспензии) через фильтр, а сложный физико-химический процесс.

Результат фильтрации зависит от ряда причин, из которых особое значение имеют: 1) величина частицы вируса; 2) величина пор фильтра; 3) электрозаряд фильтровальной свечи или пластины; 4) электрозаряд частиц вируса (обычно отрицательный); 5) рН фильтруемой среды; 6) вязкость среды и 7) продолжительность фильтрации.

При фильтрации большую роль играет явление адсорбции элементов фильтруемого материала. О значении адсорбции и электрозаряда взвешенных в жидкости частиц можно судить по следующим двум опытам с использованием пластинок Зейтца. В одном смонтированном приборе фильтруют водный раствор метиленовой сини, в другом - эозина в разведении 1:10000 каждый. Разрежение в приборе создают насосом Камовского. Через несколько минут после прекращения выкачивания воздуха в приборе, где фильтруется раствор метиленовой сини, накапливается бесцветная жидкость - вода. В другом приборе уже первые капли фильтрата, поступающего в приемник, интенсивно окрашены эозином.

Сущность опыта заключается в том, что основные краски (метиленовая синь и др.) - соли окрашенных катионов, а кислые краски (эозин и др.) - соли окрашенных анионов. Вещества фильтров (силикаты) вступают в реакцию с основными красками и обмениваются катионами, вследствие чего получаются нерастворимые силикаты красящих веществ. Обмен катионов происходит по схеме:

Хлорид щелочной земли легко растворяется и переходит в фильтрат, уступая место нерастворимому силикату метиленовой сини (посинение вещества фильтра). Аналогичный процесс обмена ионами наблюдается у ионов синтетических ионообменных смол, широко применяющихся в промышленности и в лабораторной практике для глубокой очистки химических веществ, обессоливания воды и других целей.

Следует указать, что не все фильтры обладают способностью обмениваться ионами, например, к таким фильтрам относятся коллоидные градоколевые мембраны. Обычные силикатные фильтры обладают отрицательным электрозарядом. Бактерии и вирусы имеют также отрицательный заряд, что способствует прохождению их через стенку фильтра. Частицы обратного электрического знака интенсивно адсорбируются фильтром.

О проведенной фильтрации делают запись, где отмечают условия подготовки фильтра и материала для фильтрации, результат испытания фильтра воздушным давлением, высоту фильтрационного давления, продолжительность фильтрации, результаты проверки фильтрата на бактерийную стерильность (высевы, заражение лабораторных животных).

Обезвреживание фильтров. Фильтровальные пластинки (к фильтрам Зейтца) после использования обеззараживают в автоклаве и больше не употребляют. Керамические фильтры сначала догружают в 3%-ный раствор фенола, обрабатывают 10%-ным раствором соляной кислоты. После этого фильтры продолжительно промывают в проточной н дистиллированной воде и высушивают в термостате. Более радикальный метод обеззараживания и очистки керамических фильтров («свечей») - прокаливание их в муфельной лечи с последующим промыванием дистиллированной водой.

Фильтрация бактериофага. Для изучения теории и техники фильтрации вирусов удачной моделью является вирус бактерий - бактериофаг. Для этого фильтруют через фильтр Зейтца взвесь бактерий с гомологичным фагом.

Наиболее удобно для этого использовать взвесь культуры коли и колифаг. При фильтрации необходимо строго соблюдать условия, изложенные выше.

Полученный фильтрат с целью уточнения его стерильности высевают на питательные среды. Одновременно ставят опыт для определения наличия фага в фильтрате путем установления его лидирующего действия на кишечную палочку. Фильтрат испытывают как в жидкой, так и на плотной питательных средах.

При испытании в жидкой среде засевают в две пробирки с МПБ суточную культуру бактерий коли, гомологичной бактериофагу. Затем в одну из пробирок вносят 3 - 4 капли испытуемого фильтрата, а другую оставляют для контроля.

Результат учитывают через 12 - 24 часа после нахождения пробирок в термостате. В контрольной пробирке отмечают нормальный рост культуры, в пробирке с фильтратом - значительное просветление, указывающее на лизис культуры. При достаточной силе фага лизис может быть установлен уже через - 5 часов роста культуры.

Для испытания фага на плотной питательной среде в чашке на подсушенной поверхности МПА растирают равномерно шпателем небольшое количество суточной культуры изучаемых бактерий. Затем в центре агаровой поверхности наносят большую каплю испытуемого фильтрата и, наклонив чашку, дают возможность стечь капле в одном направлении. Чашки помещают в термостат при температуре 37°, и, спустя 16 - 18 часов (во многих случаях раньше 16 часов), на месте стекания капли обычно выступают четко различимая полоса лизиса («дорожка») или многочисленные стерильные пятна.

Феномен «сползающей капли» фага особенно демонстративен в пробирке с МПА.

На поверхность засеянной молодой культуры бактерий (В.coli, Вас.anthracis или др.) в верхней части скошенного агара наносят каплю соответствующего фага. По следу сползающей капли фага (в вертикальном положении пробирки) при 37° после 16 - 18-часового инкубирования образуется прозрачная дорожка лизиса культуры с бордюром роста культуры по бокам дорожки.

Вопросы для самопроверки:

1. Сущность фильтрации вирусов.

2. Назвать фильтры, применяемые в вирусологии и рассказать как их подготовить к работе и очистить после работы.

3. Подготовка материала для фильтрации.

4. Проведение контроля качества фильтрации.

5. Определение концентрации вируса (бактериофага) в 1 мл полученного фильтрата.

17.5.3.2 МЕТОДЫ ЭЛЕКТРОННОЙ И ЛЮМИНЕСЦЕНТНОЙ

МИКРОСКОПИИ

ознакомиться с электронным и люминесцентным микроЦель занятия:

Целью различных видов микроскопии являются дальнейшее изучение морфологии различных вирусов и дифференциальная диагностика некоторых инфекционных болезней.

Электронная микроскопия. Для изучения вирусов в настоящее время все чаще прибегают к использованию электронного микроскопа.

В отличие от световых в электронных микроскопах изображение получается с помощью потока электронов. В принципе действия электронного микроскопа имеется много общего с оптическим микроскопом.

В электронном микроскопе использовано свойство электронов отклоняться в магнитном поле, подобно тому, как луч света преломляется линзами оптической системы светового микроскопа. В электронном микроскопе роль линз выполняет круговое магнитное поле (магнитные линзы), которое н фокусирует электронный пучок. Источником электронов служит нагреваемая электрическим током вольфрамовая нить. На пути пучка электронов находится анод. Между ним и раскаленной вольфрамовой нитью возникает мощное электрическое поле порядка 30000 - 50000 вольт, создающее ускорение электронов. В результате этого электроны получают большую скорость и, пролетая через отверстие анода, попадают в поле магнитного конденсора. Здесь пучок электронов концентрируется в одной точке на объекте.

Пучок электронов, прошедший через объект, фокусирует магнитная линза.

В этом случае изображение может быть в 200 раз больше. Далее изображение увеличивается промежуточным магнитным проектором, причем первое изображение получается примерно в 250 раз больше. Таким образом, общее увеличение достигает 50 000. Окончательно увеличенное изображение в 300 тыс. раз проецируют на флуоресцирующий экран или на фотографическую пластинку.